JPH06500469A - アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるヘルペス科ウイルスの感染抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるヘルペス科ウィルスの感染抑制発明の 背景 本発明は、ウィルスゲノムの生命領域に相補的である、抗ウイルス物質として機 能するアンチセンス・オリゴマーに関する。 本発明はまた、ウィルスによる宿主細胞の感染後にそのウィルスの複製を妨害す る方法、及びウィルス複製を妨害するうえで有用であるアンチセンスオリゴマー に関する。 ウィルスの複製時には、ウィルス遺伝子は通常段階的に活性化され、発現される 。ヘルペス科のウィルスなどの複製では、遺伝子は３つの相で発現される。■相 ではおよそ５つの遺伝子が発現する。これらの遺伝子は天然で通常調節的であり 、「α−遺伝子」と呼ばれる。発現される第２の組みの遺伝子は、「β−遺伝子 」と呼ばれ、その機能は核酸代謝及びウィルスＤＮＡの合成又は複製に影響を与 えるタンパク質を作成することにある。第３の組みの遺伝子、即ちγ−遺伝子は 、ウィルスの構造タンパク質の合成を制御する約３０から４０個の遺伝子を含有 する。このγ−遺伝子はウィルスＤＮＡの合成開始後に誘発される。ウィルス感 染及び複製の通常の経過では、感染された細胞が「殺傷され」るが、それは完全 に殺傷される場合もあり、あるいはそれ自身の遺伝子が分裂又は発現できないた めに構成的に「殺傷」される場合もある。ウィルス後残菌の産生を予防し、及び ／又は産生されるウィルス後残菌の数を最小限に抑えるためには、ウィルス後残 菌が産生される前の段階でウィルス複製の過程を中断するべきである。感染の直 後には、ウィルス成分はウィルス後残菌を産生ずるために感染細胞の代謝プログ ラムを作り直すので、その時点で細胞は、来るべき死滅が予定されることになる 。 特定の標的核酸配列、特に特定のメツセンジャーＲＮＡと相補的であり、かっそ れと結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用すれば、特定の遺伝子を不 活化するための手段が提供されることが示唆されている［ｆｅｉｎｔｒａｕｂの 「＾ｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ＤＮＡ、サイエンティフィック・アメ リカン、　４０−４６頁（１９９０年１月）」を参照のことコ。１型単純ヘルペ スウイルス（Ｈ３Ｖ−１）の特定のスプライス結合ｍＲＮＡと相補的である、ウ ィルス複製を特異的に抑制するアンチセンスオリゴマーを使用することが報告さ れている［ＫｕｌｋａらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、 　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８６　：６８６８−６８７２（１９８９年９月）］。 発明の要約 本発明は、ウィルスゲノムの生命領域に相補的である、抗ウイルス物質として機 能するアンチセンス・オリゴマーに関する。このような生命領域は、ウィルス複 製に必須である核酸配列を含有しており、それは１つ又はそれ以上の必須遺伝子 に含有されている。従って、本発明は１つの態様として、このような生命領域又 はそのｍＲＮＡ転写物と相補的なオリゴマーであって、その標的配列とハイブリ ダイズさせた場合にウィルスＤＮＡの合成又は複製を抑制又は妨害するオリゴマ ーを目的とするものである。その標的配列としては、ウィルスＤＮＡの合成又は 複製にとって必須である遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部を含有しているものが好 ましい態様である。適当な標的配列は、その遺伝子の５°−末端翻訳開始又は３ ゛−末端ポリアデニル化シグナルの配列又はその近傍配列を含有する。 本発明はまた、ウィルスが宿主細胞を感染した後にそのウィルスの複製を妨害す る方法をも目的とする。さらに、本発明はこのようなウィルスの複製を妨害及び ／又は抑制するうえで有用であるオリゴマーも目的とする。本発明の方法では、 ウィルスゲノムの生命領域又はそのｍＲＮＡ転写物を含有する標的配列と相補的 であるオリゴマーと、該ウィルス又はウィルスＤＮＡ又はその周囲とを接触させ る。所望により、各オリゴマーがそれぞれ異なる標的配列と相補的である２つ又 はそれ以上のオリゴマーを使用することもできる。その標的配列は同じ遺伝子又 は異なる遺伝子の部分であってもよい。 本発明は１つの態様として、ウィルスＤＮＡの合成及び／又は複製に必須である 遺伝子のメツセンジャーＲＮＡ配列と相補的でありかつハイブリダイズし、該遺 伝子の発現又は機能を妨害する量のオリゴマーに、細胞又はその発育環境を接触 させることを特徴とする、宿主細胞のウィルス感染後におけるウィルスの複製を 妨害するための方法を提供するものである。 本発明の好ましい態様を挙げれば、本発明の方法はヘルペスウィルス科、特にヒ トヘルペスウィルス、殊に単純ヘルペスウィルスに由来する感染時のウィルス複 製を妨害するうえで特に有用である。従って、本発明は、ヒトヘルペスウィルス 、殊に単純ヘルペスウィルスの複製を抑制又は妨害する方法であって、ウィルス ＤＮＡの合成又は複製に必須な核酸標的配列に相補的でありかつその標的配列と 選択的にハイブリダイズすることのできるオリゴマーとウィルスのウィルスＤＮ Ａ又はそれによる感染細胞を接触させることを特徴とする方法、をも目的とする ものである。単純ヘルペスウィルスでは、標的配列は必須のβ−遺伝子のｒｓＲ ＮＡｍＲＮＡ転写物るものが好ましい。適当なβ−遺伝子には、ＵＬ５、ＵＬ８ 、ＵＬ９、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ４２、及びＵＬ５２がある。標 的配列を選別するうえで適当であるこれらの遺伝子中の領域は、５゛−翻訳開始 又は３゛−ポリアデニル化シグナルの配列、又はそれらの近傍配列を含有してい る。 本発明が基礎としているものは、ウィルスの複製にとって必須であるポリペプチ ドのβ−グループをコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物に必須であるオリゴマー は、単純ヘルペスウィルスのウィルス複製を減少させ、及び／又は抑制するうえ で特に有効である、という別の要因の中で１つの好ましい態様としての本発明者 らの知見である。 本発明は別の態様として、ヘルペスウィルス科のウィルスによって感染された生 物を本発明のアンチセンスオリゴマー及び本発明の方法を使用することにより処 置する方法を提供する。 定　義 本明細書に使用している以下の用語は、特に明記しない限り次の意味を有してい る： 「ヌクレオシド」なる用語はヌクレオシド塩基位を包含するものであり、それと 相互変換可能に使用される。 「ヌクレオチド」なる用語は、リン酸基、５炭糖及び窒素含有塩基から構成され る核酸のサブユニットを意味する。ＲＮＡでは、５炭糖はリボースである。ＤＮ Ａでは２−デオキシリボースである。この用語はこのようなサブユニットの同族 体も包含する。 「ヌクレオチドマルチマー」なる用語は、ホスホジエステル結合によって連結さ れたヌクレオチドの鎖、又はその同族体を意味する。 「オリゴヌクレオチド」は、一般に約３から約１００のヌクレオチド長を有する ヌクレオチドマルチマーであるが、１００以上の長さのヌクレオチドである場合 もある。それは普通、ヌクレオチドモノマーから合成されると考えられる。 「デオキシリボオリゴヌクレオチド」は、デオキシリポヌクレオチドモノマーか ら構成されるオリゴヌクレオチドである。 「ポリヌクレオチド」は、一般に約１００以上の長さのヌクレオチドのヌクレオ チドマルチマーである。これは普通、生物起源であり、又は酵素的手段によって 入手される。 「ヌクレオチドマルチマープローブ」は、第２のヌクレオチドマルチマー、通常 はポリヌクレオチドに含有される標的ヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオ チド配列を有するヌクレオチドマルチマーである。プローブとしては、標的配列 内の対応塩基と完全に相補的なものを選択するのが普通である。しかし、１つ又 はそれ以上のプローブ中のヌクレオチドが標的配列内の対応塩基と相補的でない ものが適当であり、又はそのほうが望ましい場合もある。 「非−ヌクレオチドモノマー単位」は、オリゴマーのハイブリダイゼーションに は有意に関与しないモノマー単位を意味する。このようなモノマー単位は例えば 、ヌクレオチドとの有意な水素結合に関与してはならず、要すれば、架橋結合ア ルキル化、挿入及びキレート化剤などの、標的配列とオリゴマーとのハイブリダ イゼーション後に相互作用できるグループを挙げることができる。 「ヌクレオチド／非−ヌクレオチドポリマー」は、ヌクレオチド及び非−ヌクレ オチドモノマー単位から構成されるポリマーを意味する。 「オリゴヌクレオチド／非−ヌクレオチドマルチマー」は、一般に１００ヌクレ オチドよりも少ない合成起源のマルチマーであるが、２００ヌクレオチドを過剰 に含有することもでき、かつまた１つ又はそれ以上の非−ヌクレオチドモノマー 単位を含有している。 「モノマー単位」は、本発明のヌクレオチド試剤又は非−ヌクレオチド試剤のい ずれかの単位であって、その試剤がポリマーの形成に役立つものをいう。 「ハイブリッド」は、相補的な塩基間のワトソンークリック塩基対合による２つ のヌクレオチドマルチマー間で生成される複合体である。 「オリゴマー」なる用語は、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオチ ド・アルキル−及びアリール−ホスホネート同族体、オリゴヌクレオチドのホス ホロチオエート同族体、オリゴヌクレオチドのホスホアミデート同族体、中性リ ン酸エステルオリゴヌクレオチド同族体、例えばホスホトリエステル及び他のオ リゴヌクレオチド同族体及び修飾オリゴヌクレオチドを意味し、これにはヌクレ オチド／非−ヌクレオチドポリマーも包含される。この用語にはさらに、モノマ ー単位間にある１つ又はそれ以上のホスホン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）基結 合がホルムアセタール結合又はカルバメート結合などの非−ホスホン酸結合で！ き換えられているヌクレオチド／非−ヌクレオチドポリマーも包含される。 「アルキル−又はアリール−ホスホネートオリゴマー」なる用語は、少な（とも １つのアルキル−又はアリール−ホスホネート結合がホスホジエステル結合と置 き換わっているヌクレオシド間（又はモノマー間）リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ）基結合を有するヌクレオチドオリゴマー（又はヌクレオチド／非−ヌクレオチ ドポリマー）を意味する。 「メチルホスホネートオリゴマー（又はＭＰ−オリゴマー）」なる用語は、少な くとも１つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレ オシド間結合と置き換わっているヌクレオシド間（又はモノマー間）リン基結合 を有するヌクレオチドオリゴマー（又はヌクレオチド／非−ヌクレオチドポリマ ー）を意味する。 本明細書に記載している種々のオリゴマー配列の中において、例えばＡ　Ｉ）　 Ａなどの「ｐ」はリン酸ンエステル結合を表し、例えばＣｐＣなどの「２」は、 メチルホスホネート結合を表す。他の配列の中には、リンジエステル結合のタイ プを示すためにｐ又は且のいずれも使用せずに記載しているものもある。この場 合、ＡＴＣなどのＡはＡの３°−炭素とＴの５゛炭素との間のリン酸ンエステル 結合を示しており、ＡＴＣ又は匝などのΔは、Ａの３′−炭素とＴ又は工の５゛ −炭素との間のメチルホスホネート結合を示している。 「アンチセンスオリゴマー」なる用語は、ＤＮＡ二重鎖の「センス」鎖及び、そ の配列から合成されるｍＲＮＡ転写物と相補的であるオリゴマーを意味する。 ＤＮＡ二重鎖は、一方が「センス」鎖と、他方が「アンチセンス」鎖と呼ばれる ２つの相補的なりＮＡ鎖から構成される。メツセンジャーＲＮＡ転写物は、アン チセンスＤＮＡ鎖を鋳型として使用して合成されるので、センス鎖にとって（Ｔ がＡに置き換わっているが）相同的である。 ウィルスゲノム又はウィルスＤＮＡの「生命領域」なる用語は、ウィルスの複製 にとって必須であるため、その配列が欠失し、又は非機能的に変化した場合には そのウィルスが複製できなくなるような核酸配列を意味する。 「脱ブロッキング条件」なる用語は、リポース又はデオキシリポース基の５゛− ○Ｈ基からブロッキング（又は保護）基を除去するために使用する条件を説明す るものである。 「脱保護条件」なる用語は、ヌクレオシド塩基から保護基を除去するために使用 する条件を説明するものである。 「直列（ｔａｎｄｅｍ）オリゴヌクレオチド」又は「直列オリゴマー」なる用語 は、標的核酸配列の５゛又は３°配列と相補的であり、かつ標的配列と相補的な オリゴマーと同時ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はオリゴマーを意味 する。直列オリゴマーは、標的核酸配列の二次構造を減少させるなどによって、 標的配列をこのようなオリゴマーに、より接近させ易くするのに役立ち、これら のオリゴマーと標的オリゴマーとのハイブリダイゼーションを改善することがで きる。 二重鎖（例えば、２本鎖核酸ＤＮＡ：ＤＮＡ、又はＲＮＡ：ＤＮＡ）の融解温度 、又は「Ｔｌ１ｌＪは、らせん構造の半分が喪失する温度と規定される。 発明の詳細な説明 本発明は、抗ウイルス物質として有用であるアンチセンスオリゴマーであって、 ウィルスの複製にとって必須の遺伝子の標的核酸配列又は該遺伝子のウィルスメ ツセンジャーＲＮＡ転写物と相補的な（かつそれらとハイブリダイズする）オリ ゴマー、及びウィルス感染後の宿主細胞のウィルス複製を妨害するための、この ようなアンチセンスオリゴマーを使用する方法に関する。 好ましい標的配列 一般には、ウィルスのゲノムの生命領域を含有する標的核酸配列が好ましい。 これらの標的配列は、「利用できる」、即ち相補的オリゴマーが標的配列とハイ ブリダイズできる状態にある、ウィルスＤＮＡの複製のために必須の遺伝子又は そのｍＲＮＡ転写物の部分を含有することができる。従って、これらの標的配列 は１本鎖であり、二次構造及び結合タンパク賃を相対的に含有していないものが 好ましい。 好ましい標的配列には、ＤＮＡの複製のために「必須」である遺伝子のｍＲＮＡ 転写物が包含される。さらに、少ない数でしか存在しないｍＲＮＡ転写物は、こ のアンチセンス療法にとって特に有益な標的配列を含有している。使用するｍＲ ＮＡ転写物が少なければ少ないほど、より低い濃度のオリゴマーが、具体的な遺 伝子由来の高いパーセンテイジの１ＩＲＮＡとハイブリダイズでき、かつその機 能を妨害できる。 大量に存在する１ＲＮＡをコードしている特定の遺伝子は、その■ＲＮＡの機能 が部分的にしかブロックされない場合にはハイブリダイズされていないｍＲＮＡ がウィルスの正常の複製サイクルを進行させかねないので、それ程好ましいと言 えない標的配列を含有する。さらに、１ＲＮＡの同等画分をブロックするために は、比例的に大量のオリゴマーが必要とされるであろう。 ＤＮＡ複製の初期の段階で発現される必須遺伝子が好ましいが、ウィルスによる 感染によって細胞が、死に「委ねられた」後のものでもよい。初期の段階でＤＮ Ａ複製をブロックすれば、機能的なウィルス粒子が作成されることは殆どない。 細胞が既に死に「委ねられた」ならば、機能的なウィルス粒子が作成されるか、 されないかで細胞は死亡し、死亡後には、宿主生物の免疫系によって処理される ことになる。これらの細胞には、ウィルス感染によって分裂できず、及び／又は 自身の遺伝子を発現できない細胞が包含される。細胞が死に委ねられる前にウィ ルスＤＮＡの複製をブロックすれば、細胞内のウィルスＤＮＡは破壊されず、ウ ィルスＤＮＡの複製が以後に再開される場合がある。 適当な標的配列には、５゛−末端翻訳開始又は３°−末端ポリアデニル化シグナ ルの、又はそれらの近傍の配列がある。 好ましい標的配列には、比較的高い局所Ｇ−Ｃ塩基含量を有するものがある。 比較的高い局所Ｇ−Ｃ含量を有する配列は、１つには相補的オリゴマーとよりし っかりとハイブリダイズし、また相当に高いＴ璽を示す傾向を有しているので、 好ましいものである。特に好ましい標的配列は、相補的オリゴマーと相補的であ り、ハイブリダイズする標的配列の両末端に高いＧ−Ｃ塩基含量を有しており、 これにより、オリゴマーの末端は標的配列とよりしっかりとハイブリダイズする ことこれらのオリゴマーはリポヌクレオシド又はデオキシリポヌクレオシドのい ずれかのモノマー単位を含有できるが、デオキシリポヌクレオシドモノマー単位 が好ましい。 オリゴマーは約６から約４０ヌクレオチドを含有するものが好ましく、より好ま しくは約１２から約２０ヌクレオチドを含有するものである。比較的大きな配列 との相補を望む場合には約２０以上のヌクレオチドを含有するオリゴマーが使用 できるが、ａ＋ＲＮＡなどの標的核酸の二次構造の発現と拮抗しつつ、安定性及 び細胞膜への輸送を最小限に抑えるためには比較的短い直列オリゴマーを使用す るほうが有利な場合がある。また、同じ遺伝子又は異なる遺伝子の一部でよい別 個の標的配列とそれぞれが相補的である１つ以上のオリゴマーを使用するのが有 利な場合もある。 本発明ではヌクレオチドオリゴマー（即ち、天然のヌクレオチドに存在するヌク レオシド間ホスホジエステル結合を含有するオリゴマー、及び他のオリゴヌクレ オチド同族体）を使用することができるが、好ましいオリゴマーは、オリゴヌク レオシド・アルキル及びアリール−ホスホネート同族体、ホスホロチオエートオ リゴヌクレオシド同族体、ホスホロ−アミデート同族体及びホスホトリエステル オリゴヌクレオチド同族体を含有するものである。しかし、特に好ましいものは 、２つのヌクレオシドに接触するホスホジエステル結合に代わってホスホネート 結合を含有しているオリゴヌクレオシド・アルキル−及びアリール−同族体であ る。このようなオリゴヌクレオシド・アルキル及びアリール−ホスホネート同族 体の製造法及び、予め選択された核酸配列の発現を抑制するためにそれらを使用 することは、米国特許第４．４６９，８６３号、第４．５１１，７１３号、第４ ．７５７，０５５号、第４，５０７．４３３号、及び第４．５９１．６１４号に 記載されている（これらを引用によって本明細書に包含させる）。特に好ましい クラスのホスホネート同族体はメチルホスホネートオリゴマーである。 このようなアルキル−及びアリール−ホスホネートオリゴマーは、オリゴマーを 細胞に取り込ませるのを最良にする非イオン性のリン骨格を有するものが有利で ある。また、このようなアルキル−及びアリール−ホスホネートオリゴマーのア ルキル−及びアリール−ホスホネートのモノマー間結合はヌクレアーゼに対して 好都合に耐性である。 オリゴマーがアルキル−又はアリール−ホスホネートオリゴマーを含有する場合 は、修飾リボシル部分を含有するヌクレオシドモノマー単位を組込むのに好都合 な場合がある。２°−０−アルキル−及び、特に２゛−０−メチル−リボシル部 分を有するヌクレオチド単位を、これらのアルキル又はアリールホスホネートオ リゴマー内に使用すると、そのオリゴマーと相補的な標的核酸配列とのハイブリ ダイゼーションを好適に改善させることができる。 メチルリン酸オリゴマー（ＭＰ−オリゴマー）を製造するための合成方法は、Ｌ ｅせる）。 好ましいものは、少なくとも１つのヌクレオシド間ホスホジエステル結合が３′ −５゛結合ヌクレオシド間メチルホスホニル（ＭＰ）基（即ち「メチル−ホスホ ネート」）と置き換わっているものである。このメチルホスホネート結合は、オ リゴヌクレオチドのホスホネート基に関してアイソスター（等配電子）である。 従って、これらのメチルホスホネートオリゴマー（ＭＰ−オリゴマー）は、核酸 分子の相補的ポリヌクレオチド又は１本鎖領域との相互作用に対して最小限の立 体的制限を提示するはずである。これらのＭＰ−オリゴマーは、メチルホスホニ ル基が天然に存在する核酸分子には見いだせないことから、種々のヌクレアーゼ 及びエステラーゼ活性による加水分解に対して比較的耐性であるはずである。特 定のＭＰ−オリゴマーはヌクレアーゼ加水分解に対して比較的耐性であり、培養 中の哺乳動物細胞に無傷の形態で取り込まれ、また細胞ＤＮＡ及びタンパク質合 成に対して特異的な阻害作用を発揮できることが見いだされている（米国特許第 ４．４６９．８６３号を参照のこと）。 要すれば、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）などの標識基、化学ルミネッセンス基 、架橋連結剤、アクリジンなどの挿入剤、アルキル化剤、又は分子はさみ様の０ −フェナントロリン−銅又はＥＤＴＡ−鉄などのウィルス核酸の標的化部分を開 裂できる基をＭＰ−才リゴマ−に導入することができる。 所望の核酸配列に特異的に結合するのに普通は十分である少なくとも約６個のヌ クレオシドを有しているＭＰ−才リゴマ−が好ましい。より好ましいものは、約 ６から約４０のヌクレオシドを有するＭＰ−才リゴマ−であり、約１０から約２ ５のヌクレオシドを有するＭＰ−オリゴマーが特に好ましい。製造の容易さ、ま た選択された配列に対する特異性、及び折りたたみとコイル化などのオリゴマー 内ヌクレオシド間相互作用を最小限に抑えることを理由として、約１２から２０ のヌクレオシドのＭＰ−オリゴマーが特に好ましい。 好ましいＭＰ−オリゴマーの１つのグループには、５′−ヌクレオシド間結合が ホスホジエステル結合であり、残りのヌクレオシド間結合がメチルホスホニル（ 又はメチルホスホネート）結合であるＭＰ−オリゴマーがある。ＭＰ−オリゴマ ーの５°−末端にホスホジエステル結合を有していれば、そのオリゴマーはキナ ーゼ標識化し、電気泳動することができる。 本発明の好ましい態様 本発明のアンチセンスオリゴマー及び方法を使用するのに特に適した治療対象に は、ヘルペスウィルス科のウィルスによる感染がある。ヘルペスウィルスの生物 学的性質は相当に異なっている。あるウィルスは広範な宿主細胞の範囲を有して おり、効率的に繁殖し、感染した細胞を迅速に破壊してしまう（ＨＳＶ−１、Ｈ ＳＶ−２）。別のウィルスとして、狭い宿主細胞範囲を有するものもある。これ らのヘルペスウィルスの広在性は、繁殖する宿主内に潜在的に保持され得ること を意味する。ウィルスが自身を永続させるメカニズムは、専用のウィルス遺伝子 の機能、及び適当な細胞との関連性を反映しているようである。一般に、ヘルペ スウィルスに起因する感染は持続的であることが見いだされている。本発明のア ンチセンスオリゴマーを使用する治療が有望であると思われるヘルペスウィルス には、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、バリセラーシス ターウィルス、エプスタイン−パールウィルス、サイトメガロウィルス及びヒト ヘルペスウィルス６及び７などのヒトヘルペスウィルス１から７などがある。 １つの好ましい態様では、本発明は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、特に１型 （ＨＳＶ−１）に対する抗ウイルス物質として有用であるアンチセンスオリゴマ ー、及びＨＳＶ−１を抑制し、及び／又はその複製を妨害することによってＨＳ Ｖ−１感染を制御する方法を目的とする。 本発明によれば、「必須」遺伝子に相補的であるアンチセンスオリゴマーが提供 される。 ヘルペスウィルスでは、ウィルス遺伝子のおよそ半分が必須でない。即ち、それ らは切除することができ、又は少なくとも発現が減少しており、又はアンチセン スオリゴマーによって処置でき、ウィルス複製を行うことができないものである 。 これらのアンチセンスオリゴマーにとって好ましい標的配列は必須遺伝子を含有 するものであり、それは欠失又はその機能が傷付けられた場合には有意にウィル ス複製に、具体的にはＤＮＡの合成及び／又は複製に影響を与えるものである。 上述のように、好ましい標的配列には、コピーが少ない数でしか存在しないこの ような必須遺伝子のｍＲＮＡ転写物が包含される。このような理由から、本発明 者らは、Ｈ３Ｖ−１の必須β遺伝子がこれらのアンチセンスオリゴマーにとって 特に適切な標的配列を含有していることを見いだした。 Ｈ３Ｖ−１は約１５個のβ遺伝子を含有しており、そのうち少なくとも約８個は 必須であると報告されている。これらの必須β遺伝子は、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ ９、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ４２、及びＵＬ５２と命名される遺伝 子である。これらの遺伝子はウィルスＤＮＡの合成及び／又は複製にとって必須 である部分をコードしていると報告されている。これらの遺伝子のうち７個はウ ィルス起源依存性のＤＮＡ合成に必要であり、ウィルスＤＮＡのし成分に配置（ マツピング）していると報告されている。報告されているところによれば、これ ら７つの遺伝子は以下のように特定される。　見かけの分子量１４０．０００を 有するＤＮＡポリメラーゼ（ＵＬ３０）；　見かけの分子量１２４，０００を有 するＩＣＰ８と呼ばれる１本鎖の特異的ＤＮＡ結合性タンパク質（ＵＬ２９）： 　翻訳された分子量９４．０００を有するウィルスＤＮＡ合成起源と結合するタ ンパク質（ＵＬ９）；　分子量６２．０００を有する２本鎖ＤＮＡと結合するタ ンパク質（ＵＬ４２）；　並びに３つの付加的なタンパク質（ＵＬ５、予想分子 量９９゜０００；ＵＬ８、予想分子量ｓｏ、０００：及びＵＬ５２、予想分子量 １１４゜０００）。これら３つのタンパク質は各タンパク質が等モル比で存在す る複合体を形成し、それはプライマーゼ及びヘリカーゼとして機能する。ＵＬ５ によって特定されるタンパク質は個々にＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼとして機能す ると示されている。 上記の７つのタンパク質はすべて、細胞にトランスフェクトされたＤＮＡのＯｒ ｌ＋−依存性の増幅に必須のように思われる。このため、これら７つの遺伝子の １つのｍＲＮＡと相補的であるオリゴマーは特に好ましく、Ｈ３Ｖ−１に対する 特に適切な抗ウイルス物質である。 上記の７つの必須遺伝子のうち、好ましいものは、ＵＬ５、ＵＬ８及びＵＬ５２ と命名される遺伝子である。これらの遺伝子の１ＲＮＡ転写物は、本発明のアン チセンスオリゴマーを使用する抑制に特に影響されやすい標的配列を含有してい ると考えられる。 これらのアンチセンスオリゴマーが比較的利用しやすいこれら必須遺伝子の部分 は特に適切な標的配列を含有している。これら１ＲＮＡ転写物の５゛−末端翻訳 開始又は３′−末端ポリアデニル化シグナルの近傍配列は、アンチセンスオリゴ マーのハイブリダイゼーションによるウィルス機能の抑制に対して感受性である ことが証明されたことから、最も適切な標的配列を含有していると考えられる。 好ましい標的配列は、＠ＲＮＡの二次構造が相補的オリゴマーとのハイブリダイ ズ能を妨害しないようなこれらのｍＲＮＡ転写物の部分を含有している。 上記７つの遺伝子のｍＲＮＡ転写物における選択された領域と相補的であるアン チセンスオリゴマーの抗ウィルス活性について、ウィルス力価減少検定（実施例 Ａを参照のこと）及び直接プラーク検定（実施例Ｂ）を使用し検定し、抗ウィル ス活性を有することが見いだされた（以下の第２表、第３表及び第４表を参照の こと）。 本発明の理解を助けるために、一連の実験結果を説明する実施例を以下に記載す る。本発明を説明する以下の実施例は当然ながら本発明を特に限定するためのも のでな（、現在知られている、又は後に開発され得る本発明の改変も、当業者の 技術範囲に属すものであれば、以下に記載する請求の範囲における本発明の範囲 に包含されると考えられる。 標準的なホスホロ−アミダイトの化学［Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、らのＭ ｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍ。 １、１５４：２８７−３１３（１９８５）］を使用するバイオサーチ８７５０型 ＤＮＡ合成装置をその製造元の教示に従って使用し、ホスホネートジエステルオ リゴマーを製造する。 ５゛−ジメトキシトリチル保護基は合成の終了時に残し、Ｋ、　Ｍ、　Ｌｏら［ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾Ｃａｄ、　Ｓｅｉ、　、　Ｕ、　Ｓ＾、　８１　：２ ２８５−２２８９（１９８４）コに記載されているＳｅｐ　−Ｐａｋ”　Ｃｌ　 ８カートリツジにより精製できるようにした。この操作の間に、ジメトキシトリ チル保護基は除去された。 ンアミダイト・モノマーを使用してメチルホスホネート・オリゴマーを合成する 。 以下の改変を加えて製造元の教示に従い、バイオサーチ８７５０型ＤＮＡ合成装 置によって固相合成を行う・　「Ｇ」、及びｒＣＪモノマーを１　】アセトニト リル／ジクロロメタンに濃度１００ｍＭで溶解する。ｒＡＪ及びｒＴＪモノマー をアセトニトリルに濃度１００ｍＭで溶解する。脱保護（Ｄ　Ｅ　Ｂ　Ｌ　ＯＣ Ｋ）試薬＝ジクロロメタン中、２．５％ジクロロ酢酸。酸化（ＯＸＩＤＩＺＥＲ ）試薬＝２．５％水、２５％２．６−ルチジン、７２．５％テトラヒドロフラン 中、２５ｇ／Ｌヨード。ＣＡＰ　Ａ　＝アセトニトリル中、１０％無水酢酸。Ｃ ＡＰ　Ｂ＝ビピリジン中０．６２５％Ｎ、　Ｎ−ジメチルアミノピリジン。５゛ −ジメトキシトリチル保護基は合成の終了時点まで残しておき、以下に記載する ようにオリゴマーを精製し局くする。 粗製の保護メチルホスホネートオリゴマーを濃水酸化アンモニウムと室温で２時 間混合し、それを固相から取り外す。Ｅ　ｃｏｎｏ−カラム”　［Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ、リッチモンド、ＣＡ］を使用し、得られた溶液を支持体から排出させ、その 支持体を１＝１ア七トニトリル／水で５回洗浄した。溶出されたオリゴマーを室 温にて減圧下で蒸発乾固した。次いで、エチレンジアミン／エタノール／アセト ニトリル／水（５０：２３．５：２３．５：２．５）の溶液を室温にて６時間用 い、その保護基を塩基物から取り外した。次いで、得られた溶液を減圧下に蒸発 乾固した。 ５ｅｐ−Ｐａｋ”Ｃ１８カートリッジ［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／ｆａｔｅｒｓベッ ドフォード、ＭＡ］を使用し、５°−ジメトキシトリチル（トリチル）を含有す るオリゴマーを以下のようにして、トリチル化されていない失敗配列から精製し た・　そのカートリッジをアセトニトリル、１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモ ニウム（ＴＥＡＢ、ｐＨ７，５）中、５０％アセトニトリル、及び２５ｍＭＴＥ ＡＢで洗浄した。次いで、粗製のメチルホスホネートオリゴマーを少量の１：１ アセトニトリル／水に溶解した後、２５ｍＭＴＥＡＢにて終濃度５％アセトニト リルまで希釈した。次に、この溶液を上記のカートリッジに通した。そして、そ のカートリッジを２５１１ＭＴＥＡＢ中、１５−２０％アセトニトリルで洗浄し 、そのカートリッジから失敗配列を溶出させた。２５ｍＭ　ＴＥＡＢ、２％トリ フルオロ酢酸、及び２５ｓＭＴＥＡＢによってその順序で洗浄することにより、 カートリッジに結合したままのトリチル保持オリゴマーを脱トリチル化した。最 後に、トリチル選択されたオリゴマーを５０％アセトニトリル／水を用いて溶出 し、室温にて減圧下に蒸発乾固した。 以下のようにして、得られたメチルホスホネートオリゴマーを逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ クロマトグラフィーによってさらに精製した：　ハミルトンＰＲＰ−１カラム（ Ｒｅｎｏ、ＮＹ、１０４　７ｍｓ＋　ｉ、ｄ、Ｘ３Ｑ５ｍｓ長）を用いたベック マン系ゴールドＨＰＬＣを使用する。緩衝液Ａは、５０１Ｍ　トリエチルアンモ ニウム酢酸（ｐＨ７）であり、緩衝液Ｂは５ＱｍＭ）リエチルアンモニウム酢酸 （ｐＨ７）中、５０％アセトニトリルである。少量の１０−５０％アセトニトリ ル／水に溶解された試料をカラムに載せ、１００％緩衝液Ａにて２．５−：ｂ／ ／分で流した。次いで、０−７０％緩衝液Ｂの直線勾配を約２．５−３０ｍ／／ 分の流速で約３０−５０分間適用した。完全長のメチルホスホネートオリゴマー を含有する画分を採取し、減圧下に蒸発させ、それを５０％アセトニトリル／水 中に再懸濁した。 単純ヘルペスウィルス−１（ＨＳＶ−１）の特定の遺伝子の指定配列に相補的で あるオリゴマーを製造した。その配列は第１表及び第４表に記載している。 これらのオリゴマーのＨＳＶ−１複製抑制能をウィルス力価減少検定（実施例Ａ ）及び／又は直接プラーク検定（実施例Ｂ）に従って検定した。得られた結果を 以下の第２表、第３表、第４表及び第５表に示す。 ウィルス力価減少検定は、オリゴマーが一群の細胞によって産生されるウィルス の全収量を抑制するその抑制能を測定するものである。この試験は２つの工程に 分かれる。最初は、細胞の平板をウィルスで感染させるものであり、第２は、培 地中のオリゴマー又は培地のみを加え、そして第３には、ウィルスを１回から数 回複製させるために、得られた細胞をインキュベートするものである。次いで、 ウェルから細胞を収穫し、その収穫物を種々の希釈度で希釈して、新鮮な細胞の 単層を感染するのに使用する。プラーク形成によって測定され、見いだされるウ ィルス量は、初期の細胞から産生ずるウィルスの総量である。処置細胞及び非処 置細胞から産生されるウィルスの総量を比較すると、試験薬物によるウィルスの 抑制を測定することになる。得られた結果を以下の第２表、第３表、第４表（ｒ ＶＴＲＪ下）、及び第５表に示す。 単純ヘルペスウィルス−１（ＨＳＶ−１）の特定の遺伝子の指定配列に相補的で あるオリゴマーを製造した。その配列は第１表及び第４表に記載している。 これらのオリゴマーのＨＳＶ−１複製抑制能をウィルス力価減少検定（実施例Ａ ）及び／又は直接プラーク検定（実施例Ｂ）に従って検定した。得られた結果を 以下の第２表、第３表、第４表及び第５表に示す。 ウィルス力価減少検定は、オリゴマーが一群の細胞によって産生されるウィルス の全収量を抑制するその抑制能を測定するものである。この試験は２つの工程に 分かれる。最初は、細胞の平板をウィルスで感染させるものであり、第２は、培 地中のオリゴマー又は培地のみを加え、そして第３には、ウィルスを１回から数 回複製させるために、得られた細胞をインキュベートするものである。次いで、 ウェルから細胞を収穫し、その収穫物を種々の希釈度で希釈して、新鮮な細胞の 単層を感染するのに使用する。プラーク形成によって測定され、見いだされるウ ィルス量は、初期の細胞から産生ずるウィルスの総量である。処置細胞及び非処 置細胞から産生されるウィルスの総量を比較すると、試験薬物によるウィルスの 抑制を測定することになる。得られた結果を以下の第２表、第３表、第４表（ｒ ｖＴＲＪ下）、及び第５表に示す。 直接プラーク検定は、オリゴマーが感染及びウィルス複製を抑制する抑制能を測 定するものである。細胞の１画分のみを感染するに充分なウィルスによって細胞 を感染させる。次いで、オリゴマーを含有する重層又はオリゴマーを含有しない 重層を加える。この重層は、細胞から細胞へのウィルス伝播を限定するが、これ は細胞外液を介するものであり、直接の接触又は伸展によるものでない。次いで 、得られたプラークをカウントし、それらの大きさを観察すればよい。処置細胞 及び非処置細胞のプラーク数及び大きさを比較すれば、所望の情報を得ることが できる。得られた結果を第４表の「プラーク」の項に示す。 第１表 ００１５　ＵＬｊ　−１５−４３５’−Ｑニーｑ＾Ｈ−ｆｆｌ−へζ；−轟ｉ； ５ｉ−ｆｆｌ−３’００１３ＵＬａ−ｓ−ＯＬコ５’−ｅｆｆｌ−１ｆｆｉ−Ｇ ＪＪ−ズｆｆ１−ＨΔ；−コ１０（１２１ＵＬｊ　＋１−　＋１８　５’−Ｇ轟 Ｉ＋轟Ｉ；＋工１４轡量１ｍ・ｆｆｌ呻ζΔｌ−３１００２８ＵＬｊ　４１９− ＋３５　５　’−ＣＴＩＩＧ−Ｅ工；−Ｘ＋八ａ−Ｚ−Δｇ−へ１００４６ＵＬ １１５’−Ｃｆｆ−ＱＪ−９ｇｇ−轟ＩＱ−９Ｓ２１−工ΔＩ−コ１００４７　 ｕｕ　５’−ＧＫ−二−ｍ−働一瓢−Ｍ−】’０００フ　υＬ９　−５−　＋１ ３　５　’−（１；轟−一衰轟一＆＆！−勘−ＩΩ轟−ｇ−λ−３′００５６　 υＬ１５　−６　−　＋１２　５’−Ｃニス−へｇ−−轟轟轟一；ｂ１？づ≧２ ｌ−ＱＱ−３’００５４　υＬ２９　−５　−　＋１３　５’−０ｆｆ−ｆｆｌ Ω−ｆｆｌ−ＧｊＪ−！−！５−”００コ９　υＬ）Ｏ−３−＋１５　５’−Ｇ Ｑニーｇに；、−ｑｑ轟−ｈｈｈ−；Δニー；夏；−１’ｏ０１６ＵＬ４２−７ −＋ｉ１５’−Ｇ＆＆−ズ５３＝−９コ３；−為ココ；−ｃＳ；ｈ−ＡＧＪ２− ”００５２ＵＬ５２−２１−−４５１−１１ｆｉ−≦＆−＆Ω−；工；；−轟八 Ｑ−ＱΩ；へコ１００１９　ＵＬ５２　−３−４１５　５’−０％−ｆｇ−３− ｇ−２−ｍ−３’００５３　ＵＬ５２　＋１６−１コ　５　’−Ｗ−！−！Ｗ− Ｑ！；？ｆｆ１−Ｗ−コ“Ａ、　Ｃ，Ｃ又はτ−リン酸ジエステル結合Ａ、　Ｈ ，Ｑ又は！−メチルホスホネート結合Ｂ、ヂリＡ／グナルに対する相補性 オリゴマー番号　岨　位　置　配　列 ａｏｏｓ　ＵＬｊ　−３−＋１５　５’−τＨ−ｆｆｌ−ｆｆｌ−ｆｆｌ−人Δ Ｚ−ａみ−ゴ１０００６　ＵＬｊ　＋５−＄２２　５’−ＣＭ−ｆｆｌ＝ｆｆｌ −ｍ−！−（：ｍ−］’００２０ＵＬ５４１２−４２９５１為１に

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主細胞のウイルス感染後に該ウイルスの複製を妨害する方法であって、ウ イルスＤＮＡの複製に必須である遺伝子のｍＲＮＡ配列と相補的であり、かつそ れとハイブリダイズするオリゴマーの、該遺伝子の発現又は機能を妨害するに有 効な量を該細胞又はその発育環境に接触させることを特徴とする方法。 ２．該ウイルスがヘルペスウイルス科のウイルスである請求項１に記載の方法。 ３．該ウイルスが１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、バリ セラーゾスターウイルス、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイル ス、ヒトヘルペスウイルス６、及びヒトヘルペスウイルス７の中から選ばれる請 求項２に記載の方法。 ４．該ウイルスが単純ヘルペスウイルスを含有している請求項３に記載の方法。 ５．該遺伝子が必須β遺伝子を含有している請求項４に記載の方法。 ６．該遺伝子がＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ１５、ＵＬ９、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ ４２、及びＵＬ５２の中から選ばれる請求項５に記載の方法。 ７．該オリゴマーが該遺伝子の５′−末端翻訳開始又は３′−末端ポリアデニル 化シグナルの配列又はその近傍配列に相補的である請求項６に記載の方法。 ８．該遺伝子がＵＬ５、ＵＬ８、又はＵＬ５２の中から選ばれる請求項６に記載 の方法。 ９．該オリゴマーが該遺伝子の５′−末端翻訳開始又は３′−末端ポリアデニル 化シグナルの配列又はその近傍配列に相補的である請求項８に記載の方法。 １０．ウイルスゲノムの生命領域又はそのｍＲＮＡ転写物を含有する、標的配列 と相補的であるオリゴマーであって、該標的配列とハイブリダイズした際にウイ ルスＤＮＡの合成又は複製を抑制又は妨害するオリゴマー。 １１．アルキル−又はアリール−ホスホネートオリゴマーを含有する請求項１０ に記載のオリゴマー。 １２．メチルホスホネートオリゴマーを含有する請求項１１に記載のオリゴマ１ ３．該標的配列がウイルスＤＮＡの合成又は複製に必須である遺伝子のｍＲＮＡ 転写物の一部を含有している請求項１２に記載のオリゴマー。 １４．該標的配列が該遺伝子の５′−末端翻訳開始又は３′−末端ポリアデニル 化シグナルの配列又はその近傍配列である請求項１３に記載のオリゴマー。 １５．必須のＨＳＶ−１β遺伝子のｍＲＮＡ転写物の標的配列と相補的であるオ リゴマー。 １６．該β遺伝子がＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＬ３０、 ＵＬ４２、及びＵＬ５２の中から選ばれる請求項１５に記載のオリゴマー。 １７．アルキル−又はアリール−ホスホネートオリゴマーを含有する請求項１０ に記載のオリゴマー。 １８．該標的配列が該遺伝子の５′−末端翻訳開始又は３′−末端ポリアデニル 化シグナルの配列又はその近傍配列である請求項１６に記載のオリゴマー。 １９．該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーを含有する請求項１６に記 載のオリゴマー。 ２０．該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーを含有する請求項１９に記 載のオリゴマー。 ２１．該標的配列が該遺伝子の５′−末端翻訳開始又は３′−末端ポリアデニル 化シグナルの配列又はその近傍配列である請求項１９に記載のオリゴマー。 ２２．ウイルスのＤＮＡ合成又は複製を抑制又は妨害する方法であって、ウイル スゲノムの生命領域又はそのｍＲＮＡ転写物を含有する標的配列と相補的である オリゴマーに該ウイルス又はウイルスＤＮＡ又はそれらの環境を接触させること を特徴とする方法。 ２３．該生命領域がウイルスＤＮＡの合成又は複製に必須である遺伝子を含有し ている請求項２２に記載の方法。 ２４．該ウイルスがヘルペスウイルス科のウイルスである請求項２３に記載の方 法。 ２５．ヒトヘルペスウイルスの複製を抑制又は妨害する方法であって、ウイルス ＤＮＡの合成又は複製に必須である核酸標的配列と相補的である、該標的配列と 選択的にハイブリダイズできるオリゴマーに該ウイルス、ウイルスＤＮＡ又はそ れらに感染された細胞を接触させることを特徴とする方法。 ２６．該ヒトヘルペスウイルスか単純ヘルペスウイルスを含有し、該標的配列が 必須β遺伝子のｍＲＮＡ転写物を含有している請求項２５に記載の方法。 ２７．該遺伝子がＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＬ３０、Ｕ Ｌ４２、及びＵＬ５２の中から選ばれる請求項２６に記載の方法。 ２８．該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーを含有している請求項２７ に記載の方法。 ２９．該標的配列が５′−末端翻訳開始又は３′−末端ポリアデニル化シグナル の近傍にある請求項２７に記載のオリゴマー。 ３０．該遺伝子がＵＬ５、ＵＬ８、及びＵＬ５２の中から選ばれる請求項２７に 記載の方法。 ３１．該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーを含有している請求項３０ に記載の方法。 ３２．該標的配列が５′−末端翻訳開始又は３′−末端ポリアデニル化シグナル の近傍にある請求項３０に記載の方法。 ３３．該オリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーを含有している請求項３２ に記載の方法。 ３４．ヘルペスウイルス科のウイルスに感染された生物を処置する方法であって 、ＤＮＡ合成又は複製に必須の遺伝子又はそのｍＲＮＡ転写物を含有する標的配 列と相補的であるオリゴマーの治療学的有効量に該生物又はその細胞を接触させ ることを特徴とする方法。 ３５．該ウイルスが１型又は２型単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バール ウイルス、サイトメガロウイルス、バリセラーゾスターウイルス、ヒトヘルペス ウイルス６、及びヒトヘルペスウイルス７の中から選ばれる請求項３４に記載の 方法。 ３６．１型単純ヘルペスウイルスに感染された生物又はその細胞を処置する方法 であって、ウイルスＤＮＡの複製又は合成に必須の遺伝子又はそのｍＲＮＡ転写 物を含有する標的配列と充分に相補的であり選択的にハイブリダイズするオリゴ マーの治療学的有効量を該生物又はその細胞に投与することを特徴とする方法。 ３７．該遺伝子がＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＬ３０、Ｕ Ｌ４２、及びＵＬ５２の中から選ばれる請求項３６に記載の方法。 ３８．該オリゴマーがヌクレオシド間メチルホスホネート結合のみを含有してい る請求項３７に記載の方法。 ３９．該オリゴマーが約６から約３０のヌクレオシドを含有している請求項３８ に記載の方法。 ４０．ウイルスのＤＮＡ合成又は複製を抑制又は妨害する方法であって、各オリ ゴマーが異なる特異的標的配列とそれぞれ相補的であり、各標的配列がそれぞれ ウイルスゲノムの生命領域又はそのｍＲＮＡ転写物を含有している２つ又はそれ 以上のオリゴマーに該ウイルス又はウイルスＤＮＡを接触させることを特徴とす る方法。 ４１．各標的配列が必須遺伝子に相補的であるｍＲＮＡ転写物の一部を含有して いる請求項４０に記載の方法。 ４２．各標的配列が同じ必須遺伝子の一部を含有している請求項４１に記載の方 法。 ４３．３つ又はそれ以上のオリゴマーを用いる請求項４２に記載の方法。 ４４．各標的配列が異なる必須遺伝子の一部を含有している請求項４２に記載の 方法。 ４５．３つ又はそれ以上のオリゴマーを用いる請求項４４に記載の方法。 ４６．ヘルペスウイルス科のウイルスに感染された生物を処置する方法であって 、各オリゴマーが、ＤＮＡ合成に必須の遺伝子又はそのｍＲＮＡ転写物の一部を 含有する別個の標的配列とそれぞれ相補的である２つ又はそれ以上のオリゴマー の治療学的有効量に該生物又はその細胞を接触させることを特徴とする方法。 ４７．各標的配列が同じ必須遺伝子の一部を含有している請求項４６に記載の方 法。 ４８．３つ又はそれ以上のオリゴマーを使用する請求項４７に記載の方法。 ４９．各標的配列が異なる必須遺伝子の一部を含有している請求項４６に記載の 方法。 ５０．３つ又はそれ以上のオリゴマーを使用する請求項４７に記載の方法。