JPH08504103A

JPH08504103A - 新しいモチーフを用いた３重らせん複合体の形成

Info

Publication number: JPH08504103A
Application number: JP6514408A
Authority: JP
Inventors: アーノルド，ライル・ジョン，ジュニア; レイノルズ，マーク・アラン
Original assignee: ジンタ・インコーポレイテッド
Priority date: 1992-12-08
Filing date: 1993-12-08
Publication date: 1996-05-07
Also published as: EP0673260A4; EP0673260A1; AU684774B2; NZ259223A; WO1994013326A1; CA2151263A1; KR950704002A; IL107934A0; AU6654094A

Abstract

(57)【要約】新しいモチーフを用いる、３重らせんを形成させることにより核酸のターゲット配列の発現を認識し、検出しおよび／または阻害しまたは変更する方法。３重らせんは１本鎖または２本鎖のターゲット配列の場合に形成される。安定な３重らせん複合体はＲＮＡターゲットの翻訳を阻害することが示された。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称新しいモチーフを用いた３重らせん複合体の形成発明の背景本明細書で引用した刊行物および他の参考資料は本明細書の一部を構成する。本発明は３重らせん複合体の形成により、２本鎖または１本鎖核酸の特定配列の発現を検知し、認識しおよび／または阻害しもしくは変更する新しい方法に関する。フーグスティーン（Hoogsteen）水素結合により２本鎖ＤＮＡにおけるポリプリン領域に結合するホモピリミジンオリゴデオキシヌクレオチドによる３重らせん複合体の形成が報告されている［例えば、Moser,H.E.等、Science，238巻，64 5〜650頁（1987）およびPovsic,T.J.等、J.Am.Chem.Soc.，111巻，3059〜3061頁（1989）参照］。ホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、３重らせん形成により２重らせんＤＮＡの主溝における伸長したプリン配列を認識すると言われた。特異性はホモピリミジンオリゴヌクレオチドとワトソン−クリック２重鎖ＤＮＡのプリン鎖の間のフーグスティーン塩基対合により与えられると言われた。第３の鎖にシトシンとチミジンを含むＤＮＡ３重らせん複合体は弱酸性〜中性溶液（p Ｈ５.０〜６.５）で各々安定であると報告されているが、pＨを上げると解離すると報告されている。５−ブロモウラシル等のＴの修飾された塩基、５−メチルシトシン等のＣの修飾された塩基の第３の鎖への導入は、より高いpＨ範囲にわたって３重らせんの安定性を増すと報告されている。シトシン（Ｃ）がフーグスティーン型の対合に関与するためには、水素結合のためにピリミジン環のＮ−３で水素が利用できねばならないと考えられた。従ってシトシンはＮ−３でプロトン化されることが提案された。ＤＮＡは様々な多形性コンフォメーションを示すことが報告されており、そのようなコンフォメーションは生化学的なプロセスでは必須であるかも知れない。転写、翻訳および複製等の配列特異的タンパク質−ＤＮＡ結合および分子相互作用によるシグナルトランスダクションのモデュレーションはＤＮＡのコンフォメーションに依存すると信じられている［Wells,R.D.等、FASEB J，2巻，2939〜29 49頁（1988）参照］。ゲノムのクリティカルな領域に結合し、異常細胞の機能、複製、生存を選択的に阻止する治療薬を開発する可能性はエキサイティングなコンセプトである［De rvan,P.，Science，232巻，464〜471頁（1988）参照］。多くの実験室が、ＤＮＡと配列特異的に相互作用する分子のデザインおよび開発を追及している。そのような分子は外来の遺伝物質（ウイルス等）またゲノムＤＮＡの改変（ガン等）を含む病気の診断と治療に広範な関係を有すると提案されている。メチルホスホネート（「ＭＰ」）骨格を有するヌクレアーゼ耐性の非イオン性オリゴデオキシヌクレオチドが、可能性のある抗ガン、抗ウイルスおよび抗細菌剤として、インビトロおよびインビボで研究されている［Miller,P.S.等、Anti- Cancer Drug Design，2巻，117〜128頁（1987）参照］。これらのアナログの５' −３'結合したヌクレオシド間の結合は、核酸におけるホスホジエステル結合のコンフォメーションに近いと言われている。メチルホスホネートの場合、１つのアニオン性のホスホリル酸素のメチル置換により、ホスフェート骨格を中性にすることが提案されており、そのことは荷電したホスフェート基による鎖内および鎖間反撥を減少させると考えられる［Miller,P.S.等、Anti-Cancer Drug Design ,2巻，117〜128頁（1987）参照］。メチルホスホネート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオシドアナログは生きている細胞を貫通すると信じられ、グロビン合成および水泡性口内炎ウイルスタンパク質合成のmＲＮＡ翻訳を阻害し、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）複製の阻害においてプレmＲＮＡのスプライシングを阻害すると報告されている。ＭＰアナログによる阻害作用のメカニズムは相補的なＲＮＡおよび／またはＤＮＡとの安定な複合体の形成を含む。選択された１本鎖の外来の核酸配列に相補的な非イオン性のオリゴヌクレオシドアルキル−およびアリールホスホネートは、その核酸に結合するか、またはその核酸に干渉することにより、細胞中に存在する他の核酸の機能または発現を妨げることなく、その特定の核酸の機能または発現を選択的に阻害することができると報告されている［例えば、米国特許4,469,863号および同4,511,713号参照］。哺乳動物細胞により取り込まれてある状況においてヘルペスシンプレックスウイルス−１を含むウイルスタンパク質合成を阻害する、相補的なヌクレアーゼ耐性の非イオン性オリゴヌクレオシドメチルホスホネートの使用が米国特許第4,75 7,055号に記載されている。ウイルスＲＮＡの一部分に相補的なアンチセンスなオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオエートアナログを用いて、ウイルスmＲＮＡの転写とタンパク質への翻訳を阻害することが報告されている。アンチセンスなコンストラクトはウイルスmＲＮＡに結合することができ、細胞のリボソームがmＲＮＡに沿って動くことを妨害し、それによってmＲＮＡのタンパク質への翻訳を妨害すると考えられた［「翻訳停止」（translation arrest）または「リボソームハイブリダイゼーション停止」（ribosomal-hybridization arrest）と呼ばれる方法］。Yarochan 等、「AIDS Therapies」，Scientific American，110〜119頁（1988年10月）参照。ＨＴＬＶ−III複製および／または発現に必要なＨＴＬＶ−IIIゲノムの高度に保存された領域に相補的なオリゴヌクレオチドの投与による、ＨＴＬＶ−IIIによる細胞の感染の阻止は米国特許第4,806,463号に報告されている。そのオリゴヌクレオチドは、リバーストランスクリプターゼ活性（複製）およびウイルスタンパク質ｐ１５およびｐ２４（遺伝子発現）の製造によりアッセイされるウイルス複製および／または遺伝子発現に影響すると言われた。ヌクレオシド間メチルホスホネート結合を含む幾つかのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのＨＩＶで誘導される融合細胞形成および発現を阻害する能力は研究されている［Sarin等、Proc.Nat.Acad.Sci.（USA），85巻，7448〜7451 頁（1988）参照］。国際公開91/06626号は、逆にした極性のタンデムな配列を有すと言われ、２重らせんヌクレオチド２重鎖と伸長した３重らせんを形成するのに有用であると言われるオリゴヌクレオチドを記載する。逆にした極性は、エキソヌクレアーゼによる分解に対し、１本鎖オリゴヌクレオチドを安定化させると言われる。発明の要約本発明は３重らせん複合体の形成により、核酸の特定のターゲット配列の発現を選択的に検出し、認識しおよび／または阻害しまたは変更する方法に関する。一態様によればターゲット配列は１本鎖である。かくして一態様において本発明は、第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合させることによる３重らせん複合体の生成に関し、ターゲット配列はそれらの鎖のうちの１つであり、他鎖は場合により共有結合的に結合されたオリゴマーである。３重らせん複合体は、第１鎖を、ヌクレオシド配列が互いに実質的に同一でありそのうちの１つは第１鎖と十分に相補的でワトソン−クリック塩基対合によりそれと結合する第２および第３鎖に結合させることにより形成される。この態様の一別法によれば、第１鎖がターゲット配列である。あるいはターゲット配列は第２鎖または第３鎖のいずれかである。好ましくは第２および第３鎖は互いに平行に結合し、第１鎖に対しては逆平行に結合する。他の態様においては、第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合して３本鎖複合体を与えることによって、１本鎖のターゲット配列を有する核酸の発現を阻害しまたは変更する方法に関するものであり、それらの鎖のうちの１つはターゲット配列であり、他の鎖は場合により共有結合的に結合しているオリゴマーである。その方法は、第１鎖を、互いに実質的に同一であるヌクレオシド配列を有し、そのうちの１つは第１鎖に十分に相補的でワトソン−クリック塩基対合により第１鎖に結合できる第２および第３鎖と接触させることを含んでなる。好ましくは第２および第３鎖は互いに平行に結合し、第３鎖に対しては逆平行に結合する。更なる態様によれば本発明は、第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合することによる安定な３重らせん複合体を形成する方法に関し、それらの鎖のうちの１つは１本鎖ＲＮＡのターゲット配列であり、他の２つの鎖は場合により共有結合的に結合したオリゴマーであり、第２および第３鎖は同じ鎖極性を有し、実質的に同一のヌクレオシド配列を有し、かつターゲット配列に対し独立して実質的に相補的である。ＲＮＡターゲット配列は好ましくはプレmＲＮＡのmＲＮＡである。上記方法において、ターゲット配列は、第１、第２および第３鎖のいずれでもよいが通常は第１鎖である。好ましくは第２および第３鎖は互いに平行に結合し、第１鎖に対しては逆平行に結合する。好ましくは第１鎖は主にピリミジンヌクレオシドを含み、第２および第３鎖は主にプリンヌクレオシドを含む。或は、本発明の他の態様は、第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合することによる、１本鎖のターゲット配列を有する核酸の発現を阻害する方法に関し、それらの鎖のうちの１つはターゲット配列であり他の鎖は場合により共有結合的に結合しているオリゴマーである。この方法は第１鎖を、互いに平行であり互いに実質的に同一ヌクレオチド配列を有する第２および第３鎖と接触させることを含んでなり、第２鎖は第１鎖に対して十分に相補的であってワトソン−クリック塩基対合により第１鎖に結合すことができ、第３鎖は第２鎖および第１鎖と水素結合して３重らせん複合体を生ずる。好ましくはターゲット配列は第１鎖である。しかしながら所望によりターゲット配列は第２鎖または第３鎖のいずれかであり得る。第１鎖が主にピリミジン配列を含むことが特に好ましい。好ましい態様によれば本発明は、第１、第２および第３鎖のヌクレオシドの塩基の間の水素結合のブリッジングモチーフを用いる３重らせん複合体を形成する方法に関する。このブリッジングモチーフによれば、第２および第３鎖のヌクレオシドの塩基は互いに水素結合し、各々は第１鎖のヌクレオシドの塩基とも水素結合する。それ故好ましい態様によれば、１つの鎖がターゲット配列であり、他の２つの鎖が場合により共有結合的に結合している、第１、第２および第３鎖を結合することにより、１本鎖のターゲット配列を有する核酸を検出し、または認識する方法を提供する。この好ましい態様によれば第２鎖は第１鎖に対し十分相補的であってワトソン−クリック塩基対合により第１鎖に結合し、第３鎖は各ワトソン− クリック塩基対を認識することにより第１鎖および第２鎖の両方に結合する。１つの別法によればターゲット配列は第１鎖である。或はターゲット配列は第２または第３鎖のいずれかであってよい。好ましくは３重らせん複合体においては第２および第３鎖は互いに平行に結合し、第１鎖に対しては逆平行に結合する。本発明のブリッジングモチーフは２本鎖のターゲット配列を認識しまたは検出するのにも用いられると信じる。この別の態様によれば、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する２本鎖のターゲット配列を、そのターゲット配列を１つの鎖（センス鎖かアンチセンス鎖かのいずれか）のヌクレオシド配列と実質的に同一のヌクレオシド配列を有する第３鎖と接触させることにより、検出しまたは認識するものであり、第３鎖の塩基はターゲット配列の各鎖の対応する塩基に水素結合してトリプレットを生じ、多数のトリプレットが形成されて３重らせん複合体を生ずる。好ましい態様によれば１本鎖のターゲット配列の場合、第２および第３鎖を加える。第２鎖は、ワトソン−クリック塩基対合によりターゲット鎖に特異的に水素結合する。第３鎖の塩基は、対応するワトソン−クリック塩基対の両方の塩基と特異的に水素結合し、結合する。第３鎖塩基のワトソン−クリック塩基対の両方との水素結合により生成した三連構造（トライアッド）は「ブリッジングトライアッド」と名付ける。特に好ましい態様によれば、多数のブリッジングトライアッドを含んでなる３重らせん複合体は第３鎖を用いて形成され、その第３鎖は２本鎖のターゲット配列の２つの鎖の一つと同じ鎖極性を有し、ヌクレオシド配列に関し実質的に同一であり、１本鎖ターゲットの場合には第２鎖またはターゲット配列と同じ鎖極性を有し、ヌクレオシド配列に関して実質的に同じである。特に好ましい態様によれば、１本鎖ターゲット配列の場合、第３鎖は第２鎖と同じ鎖極性（すなわち第２鎖に平行である）とヌクレオシド配列を有する。本発明により用いるオリゴマーは、好ましくは中性の骨格を有するオリゴマーを含んでなる。好ましくはこれ等のオリゴマーは実質的に中性である。より好ましくは中性のオリゴマーを用いる。実質的に中性のメチルホスホネートオリゴマーが特に好ましい。特に好ましい態様によれば中性のメチルホスホネートオリゴマーを用いる。定義本明細書では特に断らない限り次の用語は次の意味を有する。「プリン」または「プリン塩基」の語は、天然に存在するアデニンおよびグアニン塩基のみならず、８位で置換された塩基、６位で改変されたグアニンのアナログまたはアデニンのアナログ、２−アミノプリンおよび９−デアザプリン等の９位で窒素を置換した炭素を有するプリンのアナログおよび他のプリンアナログ等のこれ等の塩基の改変物をも含む。「ヌクレオシド」の語はヌクレオシジル単位を含み、それと変換可能に用い、５炭糖と窒素含有塩基を含んでなる核酸のサブユニットを指す。その語はそれらの塩基としてＡ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵを有するこれらのヌクレオシジル単位のみならず、アナログおよびシュードイソシトシンおよびシュードウラシル等のピリミジン−５−ドナー／アクセプター塩基および他の改変された塩基（８−置換プリン等）を含む、天然に存在する塩基の改変形をも含む。ＲＮＡでは５炭糖はリボースであり、ＤＮＡでは２−デオキシリボースである。ヌクレオシドの語は、２'−Ｏ−アルキルリボース等の改変された糖を有するアナログをも含むこのようなサブユニットの他のアナログをも含む。「ホスホネート」の語は、基：（式中、Ｒは水素またはアルキル若しくはアリール基である。）を言う。適当なアルキルまたはアリール基は、ホスホネート結合を立体的に阻害しない、または互いに相互作用しないものを含む。ホスホネート基は「Ｒ」または「Ｓ」の配置で存在してよい。ホスホネート基はヌクレオシジル単位を接続するヌクレオシジル間ホスホラス基結合として用いてよい。「ホスホジエステル」または「ジエステル」の語は、基：を言い、ホスホジエステル基はヌクレオシジル単位を接続するヌクレオシジル間ホスホラス基として用いてもよい。「非ヌクレオシドモノマー単位」は、塩基、糖および／またはリン骨格が他の化学的部分により置換されているモノマー単位を言う。「ヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマー」はヌクレオシドおよび非ヌクレオシドモノマー単位より構成されるポリマーを言う。「オリゴヌクレオシド」または「オリゴマー」の語は、通常長さが約４〜約１００ヌクレオシドであるが、長さが約１００ヌクレオシド以上であってもよいヌクレオシド間結合により結合されたヌクレオシド鎖を言う。それらは通常ヌクレオシドモノマーから合成するが、酵素的手段により得てもよい。かくして「オリゴマー」の語は、ヌクレオシドモノマーを結合するヌクレオシジル間結合を有するオリゴヌクレオシド鎖を言い、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル−およびアリール−ホスホネートアナログ、アルキル−およびアリール−ホスホノチオエート、ホスホロチオエート、またはオリゴヌクレオチドのホスホロジチオエートアナログ、オリゴヌクレオチドのホスホールアミデートアナログ、ホスホトリエステル等の中性のホスフェートエステルオリゴヌクレオシドアナログおよび他のオリゴヌクレオシドアナログ、および改変されたオリゴヌクレオシドを含み、ヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーをも含む。その語は、モノマー単位間の１以上のホスホラス基結合を、ホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、サルファメート結合またはカーバメート結合等の非ホスホラス結合によって置き換えたヌクレオシド／ヌクレオチドポリマーを含む。それは糖およびホスホラス部分が置き換えられ、または改変された、モルホリノ塩基アナログまたはポリアミド塩基アナログ等の、ヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーをも含む。それは非ヌクレオシドの塩基、糖およびホスフェート骨格が非ヌクレオシド部分により置き換えられたか、非ヌクレオシド部分がヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーに挿入されているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーをも含む。場合によっては該非ヌクレオシド部分はターゲット配列と相互作用するか、またはターゲット細胞への吸収を変更する他の小さい分子を結合する働きをする。「アルキル−またはアリール−ホスホネートオリゴマー」の語は、少なくとも１つのアルキル−またはアリール−ホスホネートヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを言う。適当なアルキル−またはアリール−ホスホネート基は、ホスホネート結合を立体的に妨害せず、または互いに相互作用しないアルキル−またはアリール基を含む。好ましいアルキル基は、約１〜約６の炭素原子を有する低級アルキル基を含む。適当なアリール基は共役パイ電子系を有する少なくとも１つの環を有し、炭素環式アリールおよび複素環式アリールを含み、それらは場合により置換されていてもよく、好ましくは約１０個までの炭素を有する。「メチルホスホネートオリゴマー」（また「ＭＰ−オリゴマー」）は少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを言う。「中性オリゴマー」の語は、ヌクレオシドモノマー間に非イオン性のヌクレオシジル間結合（すなわち正また負のイオン性電荷を有しない結合）を有するオリゴマーを言い、アルキル−またはアリール−ホスホネート結合、アルキル−またはアリール−ホスホノチオエート、ホスホトリエステル結合等の中性のホスフェートエステル結合、特にエチルトリエステル結合等のヌクレオシジル間結合；およびサルファメート、モルホリノ、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよびカーバメート結合等の非リン含有のヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを含む。場合により中性のオリゴマーは、オリゴヌクレオシドまたはヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーと複合パートナーを含む第２の分子との間の複合体を含んでもよい。そのような複合パートナーは、インターカレーター、アルキル化剤、細胞表面レセプター用結合物質、親油剤、ソラレン等の光架橋剤を含む核酸改変基、および核酸の目標とした部分を除去できる基等を含んでもよい。そのような複合パートナーはオリゴマーの取込みを更に高め、オリゴマーとターゲット配列との相互作用を改変し、またはオリゴマーの薬物動態（pharmacokineti c）の分布を変えるかも知れない。必須の必要条件は、オリゴマー複合体が含むオリゴヌクレオシドまたはヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーが実質的に中性であるということである。オリゴマーに関し「実質的に中性」の語は、ヌクレオシドモノマー間のヌクレオシジル間結合の少なくとも約８０％がノニオン性結合であるこれらのオリゴマーを言う。「中性のアルキル−またはアリールホスホネートオリゴマー」の語は、少なくとも１つのアルキル−またはアリールホスホネート結合を含む中性のヌクレオシジル間結合を有する中性のオリゴマーを言う。「中性のメチルホスホネートオリゴマー」の語は、少なくとも１つのメチルホスホネート結合を含むヌクレオシジル間結合を有する中性のオリゴマーを言う。「トリプレット」また「トライアッド」の語は、ターゲット配列の一つの塩基（１本鎖なら）または複数の塩基（２本鎖なら）、第２鎖および第３鎖の一つの塩基（１本鎖のターゲット配列なら）または第３鎖の一つの塩基（２本鎖ターゲットなら）間の３つのヌクレオシドの塩基の水素結合した複合体を言う。幾つかの可能なブリッジしたトライアッドの例は図６に示されている。第２および第３オリゴマーのヌクレオシド配列に関して「実質的に同一」の語は、９０％以上の配列相同性を示す（すなわちオリゴマーは９０〜１００％相同である。）。図面の簡単な説明図１は、実施例２に記載したＲＮＡターゲット配列とメチルホスホネート第２および第３鎖の間の３重らせん複合体の生成を示す、非変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。図２は実施例１に記載したＲＮＡターゲットとメチルホスホネート第２および第３鎖の間の３重らせん複合体の生成を示す、非変性ポリポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。図３はＲＮＡターゲット配列とそれらの５'−末端に単一のジエステル結合を有するメチルホスホネート第２および第３鎖間の３重らせん複合体の生成を示す、非変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。図４は、それらの対応する完全に相補的なＲＮＡオリゴマー存在下でのメチルホスホネートオリゴマー配列２１００（──）、２１０１（−−−）、２１０２（─-─）および２１０６（------）についての熱変性プロフィールを示す。図５は、３本鎖を形成するメチルホスホネートオリゴマーによるタンパク質合成の配列特異的な阻害を示すタンパク質ゲルのオートラジオグラフを示す。図６は、本発明の方法により形成される、幾つかの可能なブリッジングトライアッドについての水素結合スキームを示す。図７は、実施例８に記載したのと同じヌクレオシド配列を有するジエステルオリゴマーと比較した、３本鎖を形成するメチルホスホネートオリゴマーによるタンパク質合成の配列特異的阻害を示す、タンパク質ゲルのオートラジオグラフを示す。図８は、実施例９に記載した２つのミスマッチを有するメチルホスホネートオリゴマーと比較した、ターゲット配列に相補性を有する３本鎖を形成するメチルホスホネートオリゴマーによるタンパク質合成の配列特異的阻害を示す、タンパク質ゲルのオートラジオグラフを示す。発明の詳細な記述一般的な方策配列特異的／遺伝子特異的な治療剤および診断剤としての特異的に合成されるオリゴマーの開発のためのアンチセンス戦略が今や薬品開発の主な方向である。タイプ１およびタイプ２として文献で一般的に知られた２つの一般的な種類の３本鎖モチーフがある。タイプ１は、２本鎖ＤＮＡの大きい溝に、２重鎖のホモプリン鎖に関して、平行な配位（orientation）で結合するポリピリミジン第３鎖として典型的に定義される。認識は、Ａ−Ｔダイアド（diad）におけるチミンとアデニン塩基との、およびＧ−Ｃダイアドにおけるプロトン化されたシトシンとグアノシン塩基とのフーグスティーン水素結合により達成される。他方タイプ２は、２重鎖のホモプリン鎖に、逆平行の配位で結合するポリプリン第３鎖として定義される。第３鎖のプリン塩基が、２重鎖ＤＮＡのプリン鎖中の同じ塩基に特異的に水素結合する（すなわち、Ａ対ＡおよびＧ対Ｇ）と一般的に考えられている。この特別のモチーフの場合、第２鎖と同じ塩基配列を含むが逆平行の配位である第３鎖が必要となる。すなわち第２および第３鎖は逆配位においては別の配列である。タイプ１およびタイプ２の３重鎖は２重鎖ＤＮＡのポリプリン鎖に関して逆向きに結合するので、骨格の極性の改変なしに２つのモチーフを混合できないと一般的に考えられた（すなわち５'→３'から３'→５'へのシフト）。従って交互のプリン−ピリミジン配列はトリプレットの生成を妨げると結論された。何故なら第３鎖における塩基の半分は古典的モチーフに反するであろうからである［例えば、Letai,A.G.，Palladino,M.A.，Fromm,E.，Rizzo,V．およびFresco,J.R.，「 Specificity in Formation of Triple-Stranded Nucleic Acid Helical complex es:Studies with Agarose-Linked Polynucleotide Affinity Columns」，Bioche mistry ，27巻，9108〜9112頁（1988）参照］。中性骨格アナログを用いて、我々は混合されたプリン−ピリミジン配列（交互のＧＴ、ＧＵおよびＣＡ）が生理学的pＨおよび以上（７.２〜８.２）で３重鎖複合体を形成できることを見い出した。これは上記した古典的議論に基づいては予期できないであろう。更に、第３鎖においてシトシンを有する古典的なバインディングモティーフはシトシンがプロトン化されていることを必要とする。従って約７.０以上のpＨ値で安定な３重鎖複合体を予期しないであろう。さらに主にプリンヌクレオシドのランダム配列（１６マー中に２個までのピリミジンを含むシークエンスを含む）を有するオリゴマーを用いる我々の実験は、主にピリミジンの１本鎖ターゲットと２：１の３本鎖複合体の明確な証拠を示す。２つの主にプリンのオリゴマー鎖が互いに逆平行に結合し、従ってオリゴマーが平行の向きで結合しているべきなら［これは古典的なpur−pur−pyrモチーフ（タイプ２）に反する］、そのような複合体は予言されないであろう。メチルホスホネート骨格が荷電していないという事実がこれらの「非古典的」トリプレットの結合エネルギー（および従って安定性）に寄与することを我々は信じる。我々のデータに矛盾せず、それを説明する「ブリッジング」パラレルモチーフのコンピューターモデルを我々は作った。このモチーフにおいては、第３鎖の骨格は、古典的モチーフ（タイプ１およびタイプ２）について認められた距離と比較して、２重鎖におけるピリミジンに富む鎖の骨格により接近している。３重らせんの２つの主にプリンの鎖が負に荷電しているなら、メチルホスホネートの場合のようにこれらの鎖の１つまたは両方が中性である場合に比べて、「ブリッジング」モチーフにおけるより、より大きい荷電反撥が予期されるであろう。かくして、我々の実験は、２つの主にプリンの鎖（第２および第３）が平行に結合している我々の提案した「ブリッジング」モチーフと矛盾せず、これを支持する。我々の実験が中性のオリゴマーを用いて行なわれたという事実がこの研究で認められた安定性に寄与しているかもしれない。そのことは上述のコンピューターモデリングと矛盾しない。ターゲット配列へ相補的なオリゴマーを結合させて２重鎖を与えることにより mＲＮＡのターゲット配列の翻訳が阻害されることが研究された。特に開始コドン近くのmＲＮＡ配列の部分が好ましいターゲットとして提案された。そのようなmＲＮＡターゲットとアンチセンスＤＮＡオリゴマー間に形成される２重鎖を用いる翻訳阻害実験は、これらの複合体は翻訳をブロックするのに十分安定でないことを示した。高いＴmを有する２重鎖を形成するＤＮＡオリゴマーでさえ、リボヌクレアーゼＨの不存在下では、多分リボソームにより、裸にされる。本発明の３重らせん複合体の生成はmＲＮＡのリボソーム翻訳を阻害することを我々は見い出した。本発明のモチーフを用いて核酸ターゲット配列を検出し、または認識する方法により、１本鎖またはある状況では２本鎖である核酸ターゲット配列との３重らせん複合体の生成を可能にする。本発明のモチーフによる３重らせん複合体の生成は、１本鎖のターゲット配列の場合特に有益である。好ましい態様によれば、本発明のモチーフを用い第１鎖がターゲット配列である場合、第２鎖はターゲット配列に実質的に相補的であり、ワトソン−クリック２重鎖を形成でき、第３鎖は第２鎖と実質的に同じヌクレオシド配列と向きを有する。このモチーフにより形成された３重らせん複合体は、以前に報告されたフーグスティーントリプレットモチーフと比較した場合、コンパクトな疎水性のコアを形成する。本発明のモチーフにより形成される３重らせん複合体は、ターゲットと第３鎖のヌクレオシド間結合基を互いの近くに有するので、中性骨格を有する第３鎖は安定性を促進し、結合親和性を高める点で有益である。１本鎖ターゲット配列に関し、中性のメチルホスホネートオリゴマーの２つの鎖（第２および第３鎖）および相補的な合成ＲＮＡオリゴマーの１つの鎖（第１鎖）が３重らせん複合体を形成することを見い出した。我々の実験によれば、その２つのメチルホスホネート鎖は平行な向きで結合する。「古典的な」トリプレットモチーフのいずれによっても３重らせん複合体を作らないであろうＡおよびＧヌクレオシドのランダム配列よりなるメチルホスホネートオリゴマーを用いた３重らせん生成を含む実験は、本発明のモチーフによるトライアッド生成の更なる証拠である。ターゲットの１本鎖ＲＮＡと２つのメチルホスホネートオリゴマーを結合させることにより形成されるこれらの３重らせん複合体は大きい親和力を有する（Ｔ m＞５０℃）。これらの３重らせん複合体の形成は、サブマイクロモル濃度で翻訳を劇的に阻害することが示された。３重らせん形成における配列制限アンチセンスコンテクストにおける３重らせん形成についての報告された方策は、第３鎖塩基が２重鎖の１つの塩基を読むことを提案する。特定のターゲットサイトでの３重らせん形成および３重らせん形成により実行可能な治療上のアンチセンス利用能力に関係するこれらの報告された方策は、ホモプリンまたはホモピリミジンのターゲット配列という一般的な要件により制限されている。プリンとピリミジンの混合物を有するターゲットを読むことができるために、読まれる鎖をスイッチングすることまたは第３鎖の極性を逆にする等の手段が提案されている。本発明の方法はピリミジンおよびプリン塩基の任意の配列を有するターゲット配列についての３重らせん複合体の形成を可能にする。本発明による３重らせん複合体は天然に存在する塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を含むオリゴマーを用いて形成できる。或は、安定性を増加させるために望ましいなら、２−アミノＡ（Ａについて）または５−メチルＣ等のいくつかの安定化用塩基を対応する天然に存在する塩基の代わりに用いてよい。これ等の塩基は、水素結合相互作用を増し、他の塩基で相互作用を堆積することにより、３重らせん複合体の安定性を増加させる。安定性が増加すると、効力を増加させる親和性定数が増加する。オリゴマー鎖ターゲット配列である鎖の外に用いる２本の鎖は、別のオリゴマー（「オリゴマー鎖」）を含み、または所望により共有結合的に結合していてよい。ある状況の下ではオリゴマーを共有結合することは、リボソーム翻訳の阻害を高めるかも知れないと信じられる。好ましい態様によればあるターゲット配列について使用してメッセンジャーＲＮＡターゲット配列への結合の安定性を改良するためには、オリゴマー鎖は互いに共有結合してもよい。好ましくはオリゴマー鎖は各々約４〜約４０のヌクレオシド、より好ましくは約６〜約３０のヌクレオシドを含む。約８〜約２０のヌクレオシドよりなるオリゴマー鎖が特に好ましい。選択されたヌクレオシド間結合を有するオリゴマー鎖は、当業者に知られた合成技術により便利に調製される。例えば、例えば商業的な装置、試薬およびプロトコールが、ホスホジエステルおよび幾つかの他のリン含有ヌクレオシド間結合を有するオリゴマーの合成に利用できる。Gait,M.J.，Oligonucleotide Synthes is:A Practical Approach （IRL Press 1984）；Cohen,JackS.，Oligodeoxynucle otides Antisense Inhibitors of Gene Expression （CRC Press，Boca Raton，F L， 1989）；およびOligonucleotides and Analogues:A Practical Approach（F .Eckstein編，1991）を参照せよ。非リン含有ヌクレオシド間結合を有するオリゴマーの調製は米国特許5,142,047号に記載されており、その開示は本明細書の一部を構成する。鎖の相補性第１鎖の各ヌクレオシドに相補的な対応するヌクレオシドを各々が有する（すなわち「正確な相補性」を有する）第２および第３鎖が好ましい。しかしながら第１鎖における各ヌクレオシドに対し相補性を欠く第２および第３鎖は以下のことを条件として本発明の範囲内に含まれる。すなわち第２鎖はターゲット配列に対し結合親和性を有し、かつ第３鎖が第２鎖に対して十分な結合親和性を有し、第２および第３鎖が共に第１鎖に結合して安定な３重らせん複合体を形成し、それによってターゲット配列を認識するか、或はその発現を阻害するものとする。そのような鎖を「実質的に相補性」である、または「実質的な相補性を有する」と言う。第２鎖および第３鎖はそれぞれ第１鎖に対して独立して実質的に相補的であるべきである。それらの鎖は、ターゲット配列の発現を禁止するために鎖間に十分なハイブリダイゼーションおよび水素結合が存在するよう、およびターゲット配列がmＲＮＡの一部分であるなら翻訳阻害が生ずるよう選択する。十分なハイブリダイゼーションおよび水素結合は塩基間の水素結合の強さおよび相補鎖の特異性に関連する。水素結合の強さは、ワトソン−クリックの塩基対合によって相補的な塩基に塩基対合する鎖中の塩基の数およびパーセントにより影響される。具体的には、鎖の相補性の塩基はゲノム内部の他の配列に対する非特異的結合を回避するよう十分な数があり、一方同時にゲノム内部の他の配列と長い鎖の部分間の非特異的結合を回避するよう十分少ない数であるべきである。第２または第３鎖の塩基配列が第１鎖の配列に１００％相補的である必要はないことは認識されるであろう。好ましくは配列は少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは９５％以上相補的であるべきである。オリゴマー鎖は１以上の非ヌクレオシドモノマー単位を場合により含んでもよい。そのような非ヌクレオシドモノマー単位は、係属中の米国特許出願07/565 ,307号（1990年8月9日出願）（公開されたＰＣＴ出願No.WO92/02532号も）に記載されたものを含み、その開示は本明細書の一部を構成する。問題の鎖は他の鎖に十分にハイブリダイゼーションしまた結合でき、ターゲット配列の正常な翻訳を阻害することによって等、ターゲット配列の発現を阻害しまたは妨げ、またはターゲット配列を特異的に認識さえすればよい。ターゲット配列の通常の翻訳の阻害は、ターゲット配列の発現生成物が、加えるオリゴマー鎖の不存在での結果であるより十分少ない量製造される場合に生じる。発現生成物はタンパク質である。タンパク質の製造における減少の測定は当業者によく知られており、そのような方法は、クロマトグラフィー、生化学的アッセイまたは免疫反応性による定量化を含む。好ましいターゲット配列並びに第２および第３鎖本発明の好ましい態様によれば、第１鎖が主にピリミジンの第１鎖であり、３重らせん複合体の形成により、１本鎖ターゲット配列の発現を阻害しまたは変更する方法が提供される。主にピリミジンとは、少なくとも約８０％ピリミジンヌクレオシドを含んでなるヌクレオシド配列を意味する。そのような場合、第２および第３鎖は主にプリン（約８０％以上のプリンヌクレオシド）鎖を含む。より好ましい態様によれば、ターゲット配列は第１鎖である。３重らせん複合体は、第１鎖を、好ましくは同じ鎖極性およびヌクレオシド配列よりなる第２および第３鎖と接触させることにより形成される。好ましくは第１鎖はターゲット配列であり、第２および第３鎖はオリゴマー、好ましくは実質的に中性のオリゴマーであり、より好ましくは実質的に中性のメチルホスホネートオリゴマーである。特に好ましい態様によれば、ターゲット配列は少なくとも約８５％ピリミジンのヌクレオシドを含む第１鎖であり、より好ましくは第１鎖は全てピリミジン配列を含む。そのような全てのピリミジンのターゲット配列を、全てプリンの相補性メチルホスフェートオリゴマーと接触させることにより（好ましくは１：２ターゲット：オリゴマーまたはそれ以上で）、比較的高いＴm（１μＭオリゴマー濃度で約４５℃または以上）を有する３重らせん複合体が形成される。これらの３重らせんはmＲＮＡターゲット配列の生物学的阻害を示すことが示された。ターゲット配列が第１鎖である場合、特に好ましいターゲット配列はＡＵＧコドンに隣接する主にピリミジンの配列を含む。相補的で実質的に中性のオリゴマーを用いて形成される３重らせん複合体が、それらのＴmのみより予言されるより生物学的プロセス（例えば翻訳）を阻害するのに有効であることを我々は見出した。類似のターゲットの場合、高いＴm複合体を形成するＤＮＡオリゴマーは翻訳の阻害において活性が小さくリボソームによって裸にされる。単一の負に荷電した骨格のオリゴマー（ＤＮＡオリゴマー等の）は、mＲＮＡを開裂するＲＮアーゼＨ活性が存在しない限り、無細胞アッセイにおける翻訳阻害に緩やかな影響（約２０〜８０％阻害）しか及ぼさないと報告されている［Ma her,L.J．およびDolnick,B.J.，Nucleic Acids Res.，16巻，3341〜3355頁（198 8）参照］。マイクロモル濃度で以前に報告された唯一の劇的な阻害は、長片のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ（＞５０塩基対）またはタンデムオリゴマーについてであった［Melton,D.A.，Proc.Natl,Acad.Sci（米国），82巻，144〜148 頁（1988）；Leibhaber等，J.Mol.Biol.，226巻，1〜13頁（1982）；Maher,L.J ．およびDolnick,B.J.，Nucleic Acids Res.，16巻，3341〜3355頁（1988）参照］。短い荷電したオリゴマーが翻訳を阻害する能力がないことの１つの説明は、リボソーム（翻訳機）に伴う２重鎖巻き戻し活性の存在である。リボソームの巻き戻し活性により認識されない修飾したオリゴマーとターゲットＲＮＡの非常に安定な複合体は立体的ブロッキングにより翻訳を阻害するのにより有効である。しかしながら修飾された骨格を有する多くのオリゴマーが小さい親和性でＲＮＡに結合する。実際、ＲＮＡターゲットおよびメチルホスホネートオリゴマー間に形成される２重鎖はＤＮＡターゲットを用いて形成されたそれより低いＴmを有する傾向がある。しかしながら、ＲＮＡターゲットと２つのメチルホスホネートで形成される３重らせん複合体が形成され大きい親和性（Ｔm＞５０℃）で結合することを我々は示した。これらのＲＮＡ−ＭＰ（１：２）３重らせん複合体は対応するＤＮＡ −ＭＰ（１：２）３重らせん複合体より安定であることが認められている。この観察は、多くのＤＮＡ：ＭＰ２重鎖が対応するＲＮＡ：ＭＰ２重鎖より実質的に安定であるという観察に照らすと特に驚くべきことである。本発明の一態様によれば、１本鎖ＲＮＡターゲット配列と、実質的に同一のメチルホスホネートの中性の改変されたオリゴマーを含む第２および第３鎖よりなる３重らせん複合体はサブマイクロモル濃度でＲＮＡターゲットの翻訳を劇的に阻止することができることを我々は示した。それらの新しいブリッジング構造と共にこれらの３重らせん複合体の大きい安定性により、阻害の程度および阻害が起こる投与量に関して、以前に報告された（２重鎖）複合体より、これらの複合体は有効である［例えば、Boizian,C.，Nucleic Acids Res.，19巻，1113〜1119頁（1991）；Maher Do lnick 上記参照］。細胞の巻き戻し活性に抵抗する本発明の３重らせん複合体は、それ自体でまたは開裂または架橋部分の添加により、病気または特別な核酸ターゲット配列の発現の阻害または変更が望ましい他の状態を引き起こす核酸配列の阻害に有用であることを証明できたと信じる。利用および投与本発明の一態様によれば、第１、第２および第３鎖を結合させ、本明細書に記載した３重らせん形成ガイドラインに従い１本の鎖を含む核酸の１本鎖のターゲット配列と３重らせんを形成させて、１本鎖核酸の特別なセグメントを検知しまたは認識する。オリゴマー鎖は場合により共有結合的に結合してもよい。検出可能にラベルしたオリゴマーをハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のために、例えば特別の１本鎖核酸配列の存在を検出するために用いてよい。本発明は、３本鎖らせん構造を形成する第１、第２および第３鎖を結合させることにより（１本鎖ターゲットはこれらの鎖の１つである）１本鎖核酸の選択したターゲット配列の発現または機能を阻害しまたは変更する方法をも提供する。３本鎖らせんの形成は、転写の阻害、エフェクター分子（タンパク質）の結合阻害等の様式により発現および／または機能を阻害するかも知れない。第２および第３鎖は鎖の極性（３重らせん複合体に結合された場合）およびヌクレオシド配列の両方において好ましくは同一である。本発明の方法によれば、大きい選択度を有する大きい親和性の複合体が形成される。誘導体化されたオリゴマー鎖を用いて、１つまたは両方の鎖を架橋（ソラレン）または開裂（ＥＤＴＡ）することにより、核酸中のターゲットサイトを検出しまたは位置付け、次に不可逆的に改変してもよい。開裂のためのターゲット部位の注意深い選択により、鎖の１つを、選択した核酸配列を特異的に開裂するための分子鋏みとして用いてよい。核酸セグメントまたはそのターゲット配列と反応させて、核酸を不可逆的に改変し、分解させ、かくしてその機能を不可逆的に阻害する、核酸反応性または修飾性の基を導入するためにオリゴマー鎖を誘導体化してもよい。これ等のオリゴマー鎖を用いて、特別の遺伝子または生きている細胞中のその遺伝子のターゲット配列の発現を不活性化若しくは阻害し、または変更させて、発現の選択的不活性化若しくは阻害または変更を可能にする。ターゲット配列はＤＮＡまたはプレＲＮＡ、mＲＮＡ等のＲＮＡまたはイニシエーターコドン、ポリアデニル化領域、mＲＮＡキャップサイトまたはスプライシングジャンクション等のＲＮＡ配列であってよい。これらの鎖は、欠点のあるまたは望ましくない生成物を生じ、または活性化されると好ましくない影響を生ずる遺伝子を永久に不活性化し、破壊するのに用いられる。本発明の他の態様は、特定の１本鎖核酸配列を検出するためのキットに関し、そのキットは第２および第３鎖を含んでなり、そのうち少なくとも１つは検出可能にラベルされており、１本鎖核酸のターゲット配列に十分に相補的であってそれらと３重らせん構造を形成するよう選択されている。本発明の方法に使用するオリゴマー鎖は、３重らせん複合体または他の形の転写される（transcribed）領域との安定な会合体を形成するので、これらの複合体は「アンチセンス」治療に有用である。ここに用いる「アンチセンス」治療は、特別なバインディングオリゴマーを用いて望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡ配列をインビトロまたはインビボで不活性化する一般的用語である。本発明の別の態様によればターゲット配列は２本鎖であってもよい。そのような場合には第２鎖は使用しない。２本鎖ターゲットの鎖の一つと好ましくは同じ極性を有し、ヌクレオシド配列において実質的に同一である相補的な第３鎖を加える。多くの病気と他の状態は望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡの存在により特徴付けられ、それらはある例では一本鎖の形であり、他の例では２本鎖の形である。これ等の病気または状態は、該分野で一般的に理解されているアンチセンス治療の原理を用いて治療することができる。アンチセンス治療は、相補性によりまたは任意な他の特異的な結合手段により、本発明の場合には本明細書に記載したバインディングモチーフによる３重らせん複合体の形成により、特別なＤＮＡまたはＲＮＡターゲット配列を目標に定めることを含む。本発明に使用するオリゴマーは単独で投与してもよく、オリゴマーの組合せを隣接するまたは遠いターゲットに対し、または上述の一般的なメカニズムを有するアンチセンスメカニズムの組み合わされた影響のために投与してもよい。治療的な応用においてはオリゴマーは全身的、局所的投与を含む様々な形式の投与のために製剤化できる。技術および製剤はRemington's Pharmaceutical Sci ence ，Mack Publishing Co.，イーストン、ペンシルバニア、最新版に見い出される。オリゴマーの活性成分を、投与の形式の性質および投与形によって充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、ディスインテグラント、界面活性剤、または潤滑剤を含む希釈剤または賦形剤等の担体と組み合わせる。典型的な投与形は、錠剤、粉剤、サスペンジョン、エマルジョンおよび溶液を含む液体製品、顆粒、カプセル、坐薬、並びリポソーム製品を含む注射用液体製品を含む。全身投与の場合、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下注射を含む注射が好ましい。注射の場合本発明に用いるオリゴマーは液体の溶液、特にハンク氏溶液またはリンガー氏溶液等の生理学的に相溶性のある緩衝液で製剤化する。さらにオリゴマーは固体の形に製剤化し使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥した形態も含む。全身投与は粘膜経由または皮膚経由手段によってもよく、または該化合物を経口的に投与することも可能である。粘膜経由または皮膚経由投与の場合、浸透されるべきバリアに適する浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は該分野で一般的に知られており、粘膜経由投与の場合、例えば胆汁酸塩およびフシジック酸（fusidic acid）誘導体を含む。さらに界面活性剤を浸透を促進するために用いてよい。粘膜経由投与は鼻スプレー（吸入による投与に適した製剤と同様）または坐薬の使用によってよい。経口投与の場合オリゴマーをカプセル、錠剤およびトニック等の従来の、または緩効性経口投与形に製剤化する。局所投与の場合、本発明に用いるオリゴマーを、該分野で一般的に知られているような軟膏、眼薬、ゲル、クリームに製剤化する。治療における使用の外に、本発明の方法を診断的に用いて、オリゴマーが特異的に結合するターゲットＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在または不存在を検出する。そのような診断的試験は３重らせん複合体によるハイブリダイゼーションにより行ない、従来の手段により次に検出する。例えばオリゴマーは放射性、蛍光性または色素ラベルを用いてラベルし、固体の担体に結合したラベルの存在を検出する。或は３重らせんの存在をそのような構造を特異的に認識する抗体により検出してもよい。プローブとしてそのようなオリゴマーを用いてアッセイを行なう手段は一般的に知られている。本発明の理解を助けるために一連の実験の結果を記載する次の実施例を含める。本発明に関する次の実施例は勿論本発明を具体的に限定するよう解すべきでなく、当業者の範囲内であろう、本発明の現在知られまたは後で開発されるそのような変形は、以下にクレームする本発明の範囲内にあると考えられる。実施例実施例１２本の全プリンメチルホスホネートオリゴヌクレオシドと１本の相補性全ピリミジンリボオリゴヌクレオシドによる３重らせん複合体の形成以下の３組の全メチルホスホネートオリゴヌクレオチド（"ＭＰオリゴマー"）および相補性リボヌクレオチド（"ＲＮＡオリゴマー"）について、それらの三重らせん複合体形成能を試験した。１０mＭリン酸ナトリウム、１０^-5ＭＥＤＴＡ（pＨ７）（ＰＥ７）中のＲＮＡオリゴマーのモル吸光係数ε₂₅₄を蛇毒ホスホジエステラーゼＩ（P-L Biochem ical、Milwaukee，WI）を用いる酵素消化により試験した。通常、０.２−０.３ＯＤ₂₅₄単位のＲＮＡオリゴマーを５０μlの緩衝液［１０mＭＴris−ＨＣl 、２mＭＭgＣl₂（pＨ８.２）］中で０.２単位のホスホジエステラーゼと２時間反応させた。ＲＮＡ非存在下で同じ方法でブランクを操作した。さらに真空（ Sp 衝液中に再懸濁させた。さらに２５４nmで消化ＲＮＡ試料の吸光度を測定し、ブランクの測定値を差し引いて補正した。通常トリプリケイトの消化したおよび未消化のＲＮＡオリゴマー試料の吸光度を平均し、それぞれＡ₂₅₄、_dijestおよびＡ₂₅₄、_origomerを求めた。消化物中の残基の濃度Ｃ_dijestを既知の配列とｐＨ７における以下のモノヌクレオチドの吸光係数（ε_254、Ｍ^-1cm^-1）：rＡ、１３, ６００；rＧ、１３,４００；rＣ、６３００およびrＵ、８６５０から計算した。さらにオリゴマー濃度Ｃ_oligomerをＣ_digest／（残基数）で計算し、モル吸光係数ε₂₅₄をε₂₅₄＝Ａ₂₅₄、_oligomer／Ｃ_oligomerに基づいて決定した。ここでＡ₂ ₅₄ 、_oligomerは光路長が１cmのキュベットを用いて測定した。本実施例中に述べたＲＮＡについて計算したε₂₅₄値は、以下の通りである。Ｒ３９、１１.１２×１０⁴；Ｒ２８９、１１.１２×１０⁴；Ｒ８４、１１.１５×１０⁴。２５％アセトニトリルを含むＰＥ７緩衝液中のＭＰオリゴマーのモル吸光係数 ε₂₅₄は以下の変更を除いてＲＮＡオリゴマーと同じ方法で決定した。化学的消化は、３７℃で４時間、１：９のピペリジン：水の溶液中で反応させることにより実施した。消化後、溶液を先に述べた方法で絶乾し、さらに１００μlの２５％アセトニトリル水溶液を３回加えながら共蒸発させた。Ａ₂₅₄、_digest値はＭＰオリゴマーを含まない偽消化物について測定した吸光度に対して補正を行った。Ｃ_digest、Ｃ_oligomerおよびε₂₅₄は、以下のモル吸光係数：Ａ、１３,６００；Ｇ、１３,０００；Ｃ、６３００；Ｔ、６８００をそれらのモノヌクレオチドに対して用いる以外は上記に従って決定した。本実施例において述べたＭＰオリゴマーについて計算したε₂₅₄値はＧ２１００、１６.６１×１０⁴；Ｇ２１０１、１８.４５×１０⁴；Ｇ２１０６、１７.２４×１０⁴である。（ａ）ＵＶ混合曲線分析：ＭＰオリゴマーとそれらの相補性ＲＮＡオリゴマー間の複合体形成の化学量論値は、各試料中に存在するＭＰオリゴマーのモル分率Ｘ_MP＝Ｃ_MP／（Ｃ_MP＋Ｃ_RNA）の関数としての２７０ｎｍにおける等モル鎖濃度の吸光度を比較することによって決定した。ＭＰオリゴマーおよび相補性ＲＮＡオリゴマーの溶液は、１０mＭリン酸カリウム、０.０３％カリウムザルコシレート、０.１mＭＥＤＴＡ（pＨ７.２）中で０から１.０までの異なる範囲のＸ_MP値で調製した。各溶液の総鎖濃度は２.４μＭであった。得られた溶液は、８０℃ に加熱後約４時間以上かけて４℃に冷却することによってアニーリングさせた。その後Ｐerkin−Ｅlmer Ｌambda ３分光光度計またはＣary Ｍodel ３Ｅ分光光度計を用い、１５℃でＡ₂₇₀値を測定した。各分光光度計にはＩＢＭ互換性パーソナルコンピュータに接続した可変温度調節器を取り付けた。１５℃におけるＡ₂₇₀ 対Ｘ_MPのプロットは、セット＃１とセット＃２についてはＸ_MP＝０.６７に１つの転移点を持つ二相性を示した。このことはＭＰオリゴマーＧ２１００およびＧ２１０１が最初にそれらの相補性ＲＮＡオリゴマーとともに２：１ＭＰ／ＲＮＡの３本鎖複合体を形成することを示した。セット＃３の１５℃におけるＡ₂₇₀対Ｘ_MPプロットはＸ_MP＝０.３３および０.６７に２つの転移点を持つ３相性を示した。したがって、ＭＰオリゴマーＧ２１０６は、その相補性ＲＮＡオリゴマーと２：１ＲＮＡ／ＭＰまたは２：１ＭＰ／ＲＮＡの２種類の異なる３本鎖複合体を形成することができるものと思われた。（ｂ）ゲルシフト分析：ＭＰオリゴマーＧ２１００とその相補性ＲＮＡオリゴマーＲ３９による３本鎖形成に関する証拠が、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られた。ＭＰ：ＲＮＡのモル比が１：１、２：１および３：１の溶液を、１０mＭリン酸カリウム、０.０３％カリウムサルコシレート、０.１m ＭＥＤＴＡ（pＨ７.２）および５０,０００cpmの³²Ｐ標識ＲＮＡを含有する１. ５mlのポリプロピレン製微量遠心チューブ内で調製した。各チューブ内のＲＮＡオリゴマー濃度は１０^-7Ｍ、１０^-8Ｍまたは１０^-9Ｍ（総量＝２０μl）であった。チューブを８０℃に加熱した後、約４時間以上かけて４℃に冷却した。次に５μlのアリコートを取り出し、氷冷した５μlの５０％グリセロール、１×ＴＢＥ緩衝液［９０mＭＴris−ホウ酸、２５mＭＥＤＴＡ２ナトリウム（pＨ８.２）］、０.１％ブロムフェノールブルーにて希釈した。ゲル電気泳動のために、１×ＴＢＥ緩衝液を含む１５％ポリアクリルアミド（５％ビスアクリルアミド）ゲル（厚さ０.５mm、幅２０cm、長さ３０cm）を下部リザーバーに１×ＴＢＥ緩衝液を入れたサブマリンゲル電気泳動装置（Hoeffer Scientific,Inc.，San Fra ncisco，CA，Model SE620）中に沈めた。下部リザーバー中の緩衝液を６℃に冷却後、試料を冷却したゲル上に注意深く載せた。電気泳動は５００Ｖ（１５０m Ａ）で９０分間行い、ゲル温度は６℃に維持した。次にゲルを切り出し、Ｂio− Ｒad Ｍodel５８３ゲル乾燥機（Richmond，CA）を用いて３ＭＭのブロッティング用ペーパーのシート上で乾燥させた。乾燥させたゲル上のバンドはＸＡＲ−５型フィルム（Eastman-Kodak）を用いるオートラジオグラフィによって可視化した。尚、ばく露時間は２−５時間とした。（ｉ）図１図１は、ＭＰオリゴマー配列２１００、それに対応する完全に相補的なＲＮＡオリゴマーおよびオートラジオグラフィによるバンドを可視化するための約５０ , ０００dpmの³²Ｐ標識ＲＮＡを含有する未変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。本実験において、ＭＰオリゴマーは５'末端で１つのリン酸ジエステル結合を持ち、したがって実施例１で述べた化合物とは僅かに異なっていた。ゲルは６℃で処理した。レーン１：ＭＰオリゴマー＝３×１０^-9Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-9Ｍ；レーン２：ＭＰオリゴマー＝３×１０^-8Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-8Ｍ；レーン３：ＭＰオリゴマー＝３×１０^-7Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-7Ｍ；レーン４：ＭＰオリゴマー＝２×１０^-9Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-9Ｍ；レーン５：ＭＰオリゴマー＝２×１０^-8Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-8Ｍ；レーン６：ＭＰオリゴマー＝２×１０^-7Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-7Ｍ；レーン７：ＭＰオリゴマー＝１×１０^-9Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-9Ｍ；レーン８：ＭＰオリゴマー＝１×１０^-8Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-8Ｍ；レーン９：ＭＰオリゴマー＝１×１０^-7Ｍ、ＲＮＡ＝１×１０^-7Ｍ。ａ＝３本鎖複合体に対応するバンド；ｂ＝２本鎖複合体に対応するバンド；ｃ＝１本鎖ＲＮＡに対応するバンド。オートラジオグラフ上の各レーン内に１本鎖ＲＮＡ（下側のバンド）、１：１ＭＰ：ＲＮＡ２本鎖（中間のバンド）および２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖（上側のバンド）に対応する３本の明瞭なバンドが認められた。ＭＰとＲＮＡを１：１のモル比で含有したレーンは、ほぼ等しい強さの上側および下側のバンドと非常にかすかな中間のバンドを示した。このことはこの上側のバンドが実際に２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖に対応し、１：１ＭＰ：ＲＮＡ２本鎖（中間のバンド）はその３本鎖よりかなり安定性が低いことを示した。ＭＰとＲＮＡを２：１および３：１のモル比で含有したレーンでは、明瞭な上側のバンドと非常にかすかな中間のバンドがみられ、下側のバンドは特に１０^-8Ｍ以上のＲＮＡを含有する試料ではほぼ完全に欠損していた。３本の明瞭なバンドが観察され、また下側のバンドが化学量論的に２：１および３：１で消失したことから、上側のバンドは２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖複合体に対応すると結論づけられた。さらに、それらの相対強度から、３本鎖複合体は２本鎖複合体よりかなり安定性が高いことが示唆された。（ｉｉ）図２ＭＰオリゴマーＧ２１００およびその相補性ＲＮＡオリゴマーＲ３９を用いたゲルシフト分析も３７℃で行った。図２は、得られた未変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。条件は、ゲルを３７℃で処理する以外は図１で述べたものと同じであった。ａ＝３本鎖複合体に対応するバンド；ｂ＝１本鎖ＲＮＡに対応するバンド。本オートラジオグラフ上に肉眼で認められる２本鎖複合体に対応するバンドがないことに注意されたい。本温度（３７℃）において、１：１ＭＰ：ＲＮＡ２本鎖複合体に対応する中間のバンドは欠損していたが、２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖複合体に対応する上側のバンドの相対強度は６℃で得られたデータと比べて基本的に変化がなかった。このことは、ＭＰオリゴマーＧ２１００とその相補性ＲＮＡオリゴマーＲ３９との間に形成された３本鎖複合体はその２本鎖複合体よりはるかに安定しており、３７℃では非常に遅いオフレイト（off−rate）を持つことを示唆した。今述べたタイプの同様なゲルシフト分析を、それぞれＭＰオリゴマーおよびＲＮＡオリゴマーＧ２１０１＆Ｒ２８９およびＧ２１０６＆Ｒ８４に対応するセット＃２およびセット＃３についても実施した。６℃で泳動したゲルもまた、各オリゴヌクレオチドセットによって２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖複合体が形成されることを証明した。またセット＃２でも、３７℃で泳動したゲルにおいて非常に明瞭な上側のバンド（２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖）が認められた。（ｉｉｉ）図３図３は未変成ポリアクリドアミドゲルのオートラジオグラフを示す。試料はＭＰオリゴマー配列２１００、２１０１および２１０６のいずれかとそれらに対応する完全に相補的なＲＮＡオリゴマーならびにオートラジオグラフィによってバンドを可視化するための約５０,０００dpmの³²Ｐ標識ＲＮＡを含有した。本実験ではＭＰオリゴマーの各々はそれらの５'末端に１つのリン酸ジエステル結合を含有し、従って実施例１で述べたオリゴマーとは組成がわずかに異なる。レーン１：１×１０^-8Ｍの配列２１００のみに対するＲＮＡ相補物；レーン２：３×１０^-8ＭのＭＰ配列２１００と１×１０^-8ＭのそのＲＮＡ相補物；レーン３：１× １０^-8ＭのＭＰ配列２１００と１×１０^-8ＭのそのＲＮＡ相補物；レーン４：１ ×１０^-8Ｍの配列２１０１のみに対するＲＮＡ相補物；レーン５：３×１０^-8ＭのＭＰ配列２１０１；レーン６：１×１０^-8ＭのＭＰ配列２１０１と１×１０^-8 ＭのそのＲＮＡ相補物；レーン７：１×１０^-8ＭのＭＰ配列２１０６のみに対するＲＮＡ相補物；レーン８：３×１０^-8ＭのＭＰ配列２１０６と１×１０^-8ＭのそのＲＮＡ相補物；レーン９：１×１０^-8ＭのＭＰ配列２１０６と１×１０^-8ＭのそのＲＮＡ相補物。ａ＝３本鎖複合体に対応するバンド；ｂ＝１本鎖ＲＮＡに対するバンド。（ｃ）熱変性プロフィール：２本のＭＰオリゴマーと１本の相補性ＲＮＡオリゴマーとの間に形成された３本鎖複合体の安定性を熱変性分析により試験した。分析を行うために溶液を以下の如く準備した。すなわち、１０mＭリン酸カリウム、０.１Ｍ塩化ナトリウム、０.０３％カリウムザルコシレート、０.１mＭＥＤＴＡ（pＨ７.２）中に２.４μＭＭＰオリゴマー、１.２μＭＲＮＡオリゴマー（２：１モル比ＭＰ：ＲＮＡ）を加え終量＝１mlとした。各溶液を８０℃に加熱し、約４時間かけて４℃に冷却した。さらに本溶液を水晶製キュベット（光路長１cm）に移し、ＩＢＭ互換性ＰＣコンピューターに接続した温度調節モジュールを装備したＶarian Ｍodel Ｃary ３Ｅ分光光度計にセットした。温度を０.５℃／分の速度で５℃から８０℃まで変化させ、２６０nm の吸光度を連続的に測定した。Ａ₂₆₀対温度のプロットは本実施例で述べたオリゴマーセットのそれぞれについて単一の一相性転移を示した。各複合体の半分が一本鎖に解離する融解温度（Ｔm）はセット＃１とセット＃２でそれそれ５２℃ および５６℃であった。したがって、ランダム化した（randomized）全プリンＭＰオリゴマーＧ２１０１によって形成された複合体は交互全プリンＭＰオリゴマーＧ２１００によって形成されたものに比べてより安定であった。ＭＰオリゴマー配列２１００（──）、２１０１（−−−）、２１０２（── -──）および２１０６（------）に対する熱変性プロフィールを、それらに対応する完全に相補的なＲＮＡ標的オリゴマーの存在下で求めた。２.４μＭＭＰオリゴマーと１.２μＭ相補性ＲＮＡオリゴマーの溶液を、２０mＭリン酸カリウム、０.１Ｍ塩化ナトリウム、０.０３％カリウムザルコシレート、０.１mＭＥＤＴＡ（pＨ７.２）（終量＝１ml）を用いて準備した。各溶液を８０℃に加熱後、約４時間以上かけて４℃まで徐々に冷却した。得られた溶液はＩＢＭ互換性ＰＣコンピューターに接続した温度調節６×６セルモジュールを備えたＶarian Ｍodel Ｃary ３ＥＵＶ／Ｖis分光光度計を用いて２６０nmの吸光度を温度の関数（ramp＝１．５℃／分）としてモニターした。温度による吸光度の増加は変性したオリゴマー鎖の数に比例する。Ｔmはオリゴマー鎖の５０％が変性した点と定義する。（ｄ）結論実施例１に示したデータは、アデニンとグアニンの５０：５０混合物を含有する全プリンＭＰオリゴマーがそれらの相補性ＲＮＡオリゴマーによって２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖複合体を形成することができることを示唆する。我々はこれら３本鎖複合体中の２本のＭＰオリゴマー鎖の極性を以下の如く推論できる。平行な配位（orientation）は第３の鎖の塩基のそれぞれが水素結合するのを可能にする。一方で、一部の塩基は逆平行な配位において水素結合することができる。例えば、ＭＰオリゴマーＧ２１００の２本鎖の逆平行な配位は第３の鎖の末端に１塩基の突出を必要とするであろう。ＭＰオリゴマ−Ｇ２１０１またはＭＰオリゴマーＧ２１０６のいずれかの２本鎖における逆平行配位は第３の鎖の末端に３塩基の“突出”を必要とするであろう。したがって、我々は逆平行な配置は、特にランダム化した（randomized）ＭＰオリゴマーＧ２１０１とＧ２１０６によって形成された３本鎖において、かなり安定性が低いものと予測する。事実、ゲルシフト分析は、これらのＭＰオリゴマーの各々がその相補性ＲＮＡオリゴマーによって２本鎖複合体よりはるかに安定な３本鎖複合体を形成することを示した。さらに、熱変性プロフィールは、ＭＰオリゴマーＧ２１０６がＭＰオリゴマーＧ２１０１より安定な３本鎖複合体を形成することを示した。これらの観察結果は今述べた各３本鎖複合体中の２本のＭＰオリゴマーが平行な配位で結合することを示唆する。実施例２メチルホスホテートオリゴマーおよび交互にプリンとピリミジンを含有する相補性ＲＮＡオリゴマーによる３本鎖複合体の形成以下のＭＰオリゴマーと相補性ＲＮＡオリゴマーを、実施例１に述べた方法に従ってＵＶ混合曲線分析により試験した。Ｇ２０１９とＧ２０１８のモル吸光係数ε₂₅₄（Ｍ^-1cm^-1）は、それぞれ１２. ０×１０⁴および１５．０１×１０⁴であった。Ｒ１３８およびＲ１３９のモル吸光係数はそれそれ１２.３×１０⁴および１１.４×１０⁴であった。セット＃４に対するＵＶ混合曲線分析は、１５℃でＸ_MP＝０.６７の単一の転移点を示し、単一の２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖複合体であることを示した。このことは、各鎖ともに交互にプリンとピリミジンを含有する２本のＭＰオリゴマーと１本の相補性ＲＮＡオリゴマーによって３本鎖複合体が形成される可能性があることを示している。またセット＃５に対するＵＶ混合曲線分析も１５℃で単一の転移点を示したが、この場合においてはＸ_MP＝０.３３で生じており、単一の２：１ＲＮＡ：ＭＰ３本鎖複合体であることを示唆した。このことは、各鎖とも交互にプリンとピリミジンを含む２本のＲＮＡオリゴマーと１本の相補性ＭＰオリゴマーによって３本鎖複合体が形成される可能性があることを示している。実施例２の結論として、交互にプリンとピリミジンを含有するＭＰオリゴマーは相補性ＲＮＡオリゴマーによって３本鎖を形成することができる。実施例３プリンとチミジンのランダムな混合物を含有するＭＰオリゴマーとその相補性ＲＮＡオリゴマー間の３本鎖複合体の形成以下のＭＰオリゴマーと相補性ＲＮＡオリゴマーのセットを、実施例１に述べた方法に従ってＵＶ混合曲線分析により試験した。Ｇ２１０２およびＲ２９１のモル吸光係数ε₂₅₄（Ｍ^-1cm^-1）はそれそれ１６. ８２×１０⁴および１１.３７×１０⁴であった。セット＃６に対するＵＶ混合曲線分析は、１５℃でＸ_MP＝０.６７の単一の転移点を示し、単一の２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖複合体であることを示唆した。このことは２本のＭＰオリゴマーと１本の相補ＲＮＡオリゴマーによって３本鎖複合体が形成される可能性を証明している。ここでＭＰオリゴマーはプリンとチミジンの混合物を含有する。実施例３に示したデータは、２：１ＭＰ：ＲＮＡ３本鎖において、２本のＭＰオリゴマー鎖が平行に配置していることのさらなる証拠を示す。第３の鎖の塩基のうち、逆平行配置において水素結合することができるものはかなり少ないであろう。実施例４主としてプリンに豊む配列を持ついくつかの異なったＭＰオリゴマーとそれらに対応するＲＮＡ標的間の３本鎖複合体の形成本実施例は、主としてプリン配列を持ついくつかの異なるオリゴマーとそれらに対応するＲＮＡ標的の間の３本鎖複合体を明らかにするために行ったゲルシフト試験について述べる。以下のメチルホスホネートオリゴマーとそれらの相補性ＲＮＡ標的のセットを実施例１で述べたものと同じゲルシフト試験において比較した。実施例１に示したプロトコールに従って求めたオリゴマーＧ２１０４およびＲ２９３のモル吸光係数ε₂₅₄（Ｍ^-1cm^-1）はそれぞれ１６.５１×１０⁴および１３.７８×１０⁴であった。１×１０^-5ＭＭＰオリゴマーと５×１０^-6ＭＲＮＡオリゴマー（２：１モル比）を含有する溶液を、１０mＭリン酸カリウム、０.０３％カリウムザルコシレート、０.１mＭＥＤＴＡ（pＨ７.２）と２５０,０００cpmの³²Ｐ標識ＲＮＡオリゴマー（約０.５pＭ）（総量＝５０μl）を入れた１.５m1のポリプロピレン製微量遠心チューブ中で調整した。本チューブを８０℃に加熱し、約４時間以上かけて４℃に冷却後、約４８時間４℃に保持した。次に５μ1のアリコートを氷冷した５μlの５０％グリセロール、ＩＸＴＢＥ緩衝液、０.１％ブロムフェノールブルーを含有する別々のチューブに加えた。その後これらの試料を実施例１に述べたプロトコールに従って。６℃で未変性ゲル電気泳動により分析した。さらに元の試料を３０℃で４時間平衡化した。次に５μlのアリコートを水浴槽内で３０℃に平衡化した５μlの５０％グリセロール、１×ＴＢＥ緩衝液、０.１％ブロムフェノールブルーを含有する別々のチューブに加えた。これらの試料は３０℃ で未変性ゲル電気泳動により分析した。６℃で泳動したゲルのオートジオグラフ試験は、本実施例において分析したオリゴマーのセットのそれぞれが主としてそれらのＲＮＡ標的と主に３本鎖複合体を形成することを証明した。しかしながら、オリゴマー２１０４に対応するレーンにおいて、２本鎖複合体に対応するかすかなバンドが認められた。３０℃で泳動したゲルのオートジオグラフは、オリゴマー２１００、２１０１および２１０２に対する主として３本鎖複合体を示した。オリゴマー２１０４とそのＲＮＡ標的で形成されたいかなる複合体も、３０℃でのゲル電気泳動中またはその前にほとんど解離した。オリゴマー２１０６とそのＲＮＡ標的で形成された３本鎖複合体はほとんど解離したが、依然としてゲル上に明瞭な上側のバンドとして認められた。いずれの場合にも３０℃で泳動したゲルにおいて２本鎖複合体に対応するバンドは明らかでなかった。両ゲルから得られた３重らせん複合体はおよび１本鎖ＲＮＡに対応するバンドの強度に基づいた各３重らせん複合体の安定性の相対的順序は以下の如く決定された。Ｇ２１０１：Ｒ２８９＞Ｇ２１００；Ｒ３９＞Ｇ２１０２：Ｒ２９１＞Ｇ２１０６：Ｒ８４＞Ｇ２１０４：Ｒ２９３本実施例において述べた３つの全プリンＭＰオリゴマーはいずれもそれらの標的ＲＮＡオリゴマーと３重らせん複合体を形成したが、相対的安定性は異なっていた。ＭＰオリゴマーＧ２１０２およびＧ２１０４の配列は、それらがそれぞれ２つのアデニンから置き換わった２つのチミジンまたは２つのグアニンから置き換わった２つのシチジンを含有すること以外は、Ｇ２１０１の配列とほぼ同じである。本実施例で説明したように、ＭＰオリゴマーＧ２１０１、Ｇ２１０２およびＧ２１０４のおのおのは、それらの標的ＲＮＡと３重らせん複合体を形成することができる。しかし、データは３重らせんの形成に関して、２つのアデニンの２つのチミジンへの置換がいくぶん不安定化を招き、２つのグアニンの２つのシチジンへの置換がさらに不安定化を招くことを示唆する。配列Ｇ２１０２およびＧ２１０４のそれぞれにおけるプリンのランダムな分布および２つのピリミジンの非対称の置換のために、逆平行なモチーフでは平行なモチーフより水素結合の相互作用が生じる可能性がかなり低いと思われることから、逆平行な３重らせん複合体は考えられない。したがって、本実施例は約１２％までのピリミジン（１６中２）を含有する全プリンＭＰオリゴマーを主として形成する３重らせん複合体中の平行な結合モチーフに対するさらなる証拠を示す。実施例５３重らせん複合体を形成する修飾されたオリゴヌクレオチドによる翻訳の阻害３重らせん複合体の形成によるｍＲＮＡの配列特異的な阻害を、以下の方法により明らかにした。交互ＡＧメチルホスホネート１６マーの標的部位を、標準的なクローニング法［Molecular Cloning Sambrook等（1989）CSH Laboratory Press］によりＴ７転写ベクターのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子［Gorman等，Mol．and Cell Bio.（1982）2巻：1044-1051頁］中の翻訳開始部位の５’側の直近にクローニングした。キャップ構造を持つmＲＮＡをＴ７ポリメラーゼにより転写し［Melton，D.A.等（1984）Nuc．Acids Res．12巻：7035-7 056頁］、β−グロビンＲＮＡをコントロールに用いて本翻訳阻害の特異性を証明した。内部網状赤血球溶血液、未標識のアミノ酸および翻訳用緩衝液は、Life Technologiesから得た。緩衝液中のＡＧ交互標的部位を含む反応あたり〜８０n gのＣＡＴmＲＮＡと反応あたり〜３０ngのグロビンＲＮＡの混合物、アミノ酸、３５−Ｓ−メチオニン（DuPont NEN，Boston，MA）およびウサギ網状赤血球溶血液を氷冷下で結合させ、標準翻訳混合物を形成した［Polayes,D.A.，（1991）Fo cus13巻：4頁］。本混合物を水または２０mＭ酢酸カリウムに溶解したメチルホスホネートオリゴマーを含有するチューブに等分し、混合物添加後の最終濃度が２５μＭ、３μ Ｍまたは０.３μＭとなるようにした。この翻訳反応を６０分間持続後、１.５μ ＭのＲＮアーゼＡを加え、反応を１５分間持続した。ゲル充填用緩衝液を加え、本試料を１０％アクリルアミド／トリシン緩衝プレキャスト蛋白ゲル（Novex，S an Diego，CA）中で電気泳動を行った。本ゲルを１０％酢酸４０％メタノール中で固定、乾燥し、Ｘ線フィルムを１２−７２時間ばく露した。得られたオートラジオグラフを図５に示す。上側のバンドは開始コドン近傍に交互ＣＵ１８nt部位を含む標的とするＣＡＴmＲＮＡの翻訳産物蛋白質である。下側のバンドは内部コントロールグロビンmＲＮＡ産物蛋白である。３本鎖を形成する交互ＡＧメチルホスホネートオリゴマーを添加することにより、ＣＡＴ遺伝子の翻訳は劇的に低下したが、グロビン遺伝子の翻訳は低下しなかった。本実施例は、３本鎖複合物が標的遺伝子の翻訳を特異的に阻止することができることを証明する。本阻害は同じ長さの未修飾ＤＮＡによってみられた阻害より大きい［Maher，LJおよびDolnick，BJ Nucleic Acids Res．（1988）16巻：3341-3355 頁］。実施例６３重らせん複合体を形成する修飾オリゴヌクレオチドによる逆転写の阻害逆転写の配列特異的な阻害は以下の方法によって証明した。３重らせんを形成するメチルホスホネート１６マー（ＭＰオリゴ２１００、２１０１または２１０２、配列は実施例４を参照）における標的部位を標準的クローニング法［Molecu lar Cloning Sambrook等（1989）CS Laboratory Press］により、Ｔ７ベクターのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子［Gorman 等，Mol.and Cell Bio.（1982）2巻：1044-1051頁］中の翻訳開始部位の５'直近にクローニングした。キャップ構造を持つmＲＮＡをＴ７ポリメラーゼを用いて転写した［Melton，D.A.等（1984）Nuc．Acids Res．12巻：7035-7056頁］。０. ５μgのＤＮＡプライマー（５'ＣＣＡＴＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＣ）を含む約１μ gのＲＮＡを２０mＭリン酸カリウム（pＨ７.２）、０.１mＭＥＤＴＡ、０.０３％ザルコシル、１００mＭＮａＣｌ中の１０μＭＭＰオリゴヌクレオチドに加えた。本混合物を７０℃に加熱し、４℃に冷却後、終夜インキュベートした。ＡＭＶ逆転写酵素（Promega biotech）を５０mＭ Tris、３mＭＭgＣｌおよび１m ＭのｄＮＴＰ₅および³⁵Ｓ dＡＴＰ（DuPont NEN，Boston，MA）と共に加えた。得られた混合物を３０−３７℃で１時間インキュベートした後、８.０％アクリルアミド／尿素ゲル［Morecular Cloning，Sambrook等（1989）CSH Laboratory Press］に加えた。本ゲルを１０％酢酸／１０％メタノールで固定後、乾燥させた。本ゲルをＸ線フィルムに３日間ばく露し、オートジオグラフを得た。通常、逆転写酵素は、加えられたＤＮＡオリゴマーのプライミング部位（ＭＰオリゴマーはプライマーとして作用しない）で始まり、ポリメラーゼがＲＮＡ鋳型の末端に達して終わるＲＮＡ鋳型によるＤＮＡコピーの作製を開始する（完全長産物）。ＭＰオリゴマーによるポリメラーゼの工程の阻害は、長さがプライミングオリゴマーとブロッキングオリゴマー間の距離に対応するトランケート転写物を生じるであろう。予測された−１０５ntの完全長産物がＭＰオリゴマーを加えなかった逆転写コントロールレーンにおいて観察された。ＭＰオリゴマー２１００、２１０１または２１０２をそれら各々の標的ＲＮＡを含有する反応に加えたとき、予測された −５０ntのトランケート断片が観察された。３重らせんを形成するオリゴマー２１００および２１０１は〜１０５nt断片の〜５０nt断片へのほぼ完全な変換をもたらし、逆転写酵素の特異的阻害が証明された。２１０２ＭＰオリゴマーは−１０５nt断片の〜５０nt断片への部分的な変換をもたらし、逆転写酵素の部分的阻害が証明された。実施例７オリゴリボヌクレオチドの調製実施例１から４に述べたオリゴリボヌクレオチドは以下の方法を用いて合成した。本オリゴリボヌクレオチドは５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−Ｏ−tert− ブチルジメチルシリル−３'−Ｏ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホラミジトヌクレオチド（MilliporeまたはPennisula Laoboratoriesより購入）を用いて合成した。本合成は、カップリング時間をより立体的に妨げられた２ '−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルＲＮＡモノマーが反応するのに適当な時間となるよう１２分まで延長した以外は、標準Milligenホスホラミジド法を用いる Milligen ８７５０自動ＤＮＡ合成装置によって１μＭのスケールで行った。合成はPennisula Laboratoriesから購入したコントロールポアガラスに結合した２ '−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルリボヌクレオシドで開始した。その他すべてのオリゴヌクレオチド合成試薬はMilligenの標準プロトコールに述べられた通りであった。合成後、本オリゴヌクレオチドは無菌、ＲＮアーゼ非存在条件下で取り扱った。水は０.５％ジエチルプロカーボネートで一夜処理後、オートクレーブで滅菌した。全てのガラス器は３００℃で少なくとも４時間乾熱処理した。本オリゴヌクレオチドは３／１水酸化アンモニウム／エタノールで支持体に結合したオリゴマーを５５℃、１５時間最初に処理することにより脱保護し、支持体から切り離した。さらに、本オリゴヌクレオチドを含有する上清をデカントし、蒸発乾固させた。得られた残渣をさらに室温で２４時間０.６m1のテトラヒドロフラン中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド（含水率５％以下）で処理した。本反応は２Ｍトリエチルアンモニュームアセテート水溶液（ｐＨ７）０.６mlを加えることによって停止させた。本反応混合物の脱塩は本溶液を滅菌水を用いてBio−Ｒa d １０ＤＧカラムを通過させることによって行った。さらに、脱塩を行ったオリゴヌクレオチドを乾燥させた。本オリゴヌクレオチドの精製は、標準的方法［Maniatis，T.等,Molecular Clo ning A Laboratory Manual ，184-185頁（Cold Spring Harbor 1982）を参照］を用いて、１５％１９／１ポリアクリルアミド／ビス・アクリルアミドおよび７Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって行った。本ゲルは幅２０cm、長さ４０cm、厚さ６mmであった。本オリゴリボヌクレオチド（６０ＯＤ単位）を１.２５％ブロムフェノールブルーを含有する２００μlの水に溶解し、ゲルに加えた。本ゲルを３００Ｖで一夜泳動した。産物のバンドはＵＶバックシャドーイングにより可視化して切り出し、本産物を０.５Ｍ酢酸ナトリウムで一夜溶出した。本産物はＷaters Ｃ１５Ｓep-Ｐak遠心を用いてメーカーの指示したプロトコールに従って脱塩した。さらに本産物をキナーゼで処理し、ＰＡＧＥにより分析を行った。実施例８３重らせん複合物を形成する修飾オリゴヌクレオチドによる翻訳の阻害３重らせん複合物の形成によるmＲＮＡの配列特異的な阻害は、以下の方法によって証明した。交互ＡＧメチルホスホネート１６マーにおける標的部位を、クロラムフェニコールアセチルトランフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子［Gormanら、Mol.and Cell Bio .（1982）2巻：1044-1051頁］の翻訳開始部位の３'側直近にクローニングし、標準クローニング法［Molecular-Cloning、Sambrook等（1989）CSH Laboratory Pr ess］によりＴ７転写ベクター（pＲＣ−ＣＭＶ，InVitrogen，San Diego，CA）のＨindIII／NotI部位に挿入した。鋳型（pＢＲ３２５，Life Technologies，Ga ithersberg，MD）を含有するＣＡＴを使用し、ＣＡＴをコードする領域を得た。キャップ構造を持つmＲＮＡはＴ７ポリメラーゼを用いて逆転写した［Melton,D.A.等（ 1984）Nuc．Acds Res.12巻：7035-70567頁］。（ＡＧ）₈標的部位を含有しない、トランケートＣＡＴ蛋白質およびβ−グロビンＲＮＡをコードしたコントロールのＣＡＴ配列を内部コントロールとして用い、本翻訳阻害の特異性を証明した。図７に示したようにＭＰ（ＡＧ）₈オリゴマーを本翻訳混合物に含有した。網状赤血球溶血液、未標識アミノ酸および翻訳用緩衝液はLife Technologies から得た。緩衝液中の翻訳反応あたり〜３０ngのＣＡＴ mＲＮＡと反応あたり〜３０ngのグロビンＲＮＡの混合物、アミノ酸、³⁵Ｓ−メチオニン（Dupont NEN， Boston，MA）および網状赤血球溶血液を氷冷下で混合し、標準翻訳混合物を形成させた［Polayes，D.A.，（1991）Focus 13巻：4頁］。この混合物を水に溶解したメチルホスホネートオリゴマーまたは水のみを含有するチューブに等分し、６８mＭ酢酸カリウム（２０mＭを添加、混合物中に４８mＭ）を含有する最終濃度の翻訳成分を得た。本混合物を添加後のオリゴマー濃度は、図７に示す如く、１ μＭ、０.１μＭ、または０.０１μＭであった。本翻訳反応を６０分間持続させた後、１.５μgのＲＮアーゼを加え、反応を１５分間継続した。ゲルローディング用緩衝液を加え、本試料を１０％ポリアクリルアミド／トリシン緩衝液プレキャスト蛋白質ゲル（Novex，San Diego，CA）中で電気泳動した。本ゲルを１０％酢酸４０％メタノールで固定、乾燥後、１２−７２時間Ｘ線フィルムをばく露した。得られたオートジオグラフを図７に示す。上側のバンドは、開始コドン近傍に交互ＣＵ１６nt部位を含有する標的とするＣＡＴ mＲＮＡの翻訳産物蛋白質である。中間のバンドは内部コントロールのグロビンmＲＮＡの蛋白質産物である。下側のバンドはＣＡＴコントロールの蛋白質産物である。３重らせんを形成する交互（ＡＧ）₈メチルホスホネートオリゴマーの添加はＣＡＴ遺伝子の翻訳の劇的な低下をもたらしたがグロビン遺伝子またはＣＡＴコントロールの翻訳は低下させなかった。本実施例は、本３重らせん複合体が標的遺伝子の翻訳を特異的に阻止することができたことを証明する。ＭＰ−（ＡＧ）₈はＣＡＴ（ＣＵ）₈mＲＮＡ標的からの蛋白質の翻訳を特異的に阻害するが、ＤＥ（ＡＧ）₈はＲＮアーゼＨの非存在下において試験したいかなる濃度においても阻害を示さない。ＲＮアーゼＨを陽性コントロールとして１レーンに加え、ＤＥ（ＡＧ）₈オリゴヌクレオチドが実際にＣＡＴ−（ＣＵ）₈mＲＮＡとハイブリダイズしていることを証明した。この結果はＲＮアーゼが３本鎖の基質に作用するとは思われないので３本鎖複合体よりむしろヘテロ２本鎖としてのＤＥ−（ＡＧ）₈の結合に一致する。実施例９３重らせん複合体を形成する（ＡＧ）が入り混じった配列を持つ修飾オリゴマーによる翻訳の阻害ＡＧが入り混じったメチルホスホネート１６マー（“（ＡＧ）−Ｓ１”；配列：５'−ＡＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡ−３'）のための標的部位をクローニングし、実施例８に述べたＴ７転写ベクター内に挿入した。キャップ構造を持つ mＲＮＡを実施例８に述べたように転写した。実施例８に述べたβ−グロビンとＣＡＴ（ＣＵ）₈ＲＮＡも本翻訳混合物において使用した。２つのアデニンを２つのチミジンに置換した他はＭＰ−（ＡＧ）−Ｓ１と同じ配列を持つＭＰオリゴマーを調製し、２塩基ミスマッチ（“２mm”）コントロールとして試験した。ＭＰ−（ＡＧ）−Ｓ１、２mmまたはＭＰ（ＡＧ）₈オリゴマーを、図８に示したように翻訳混合物中に含めた。翻訳反応を実施例８に述べた通りに行った。本蛋白質産物を実施例８に述べた通りに電気泳動によって分離し、フィルムをばく露した。得られたオートラジオグラフを図８に示す。上側のバンドはＣＡＴ−（ＣＵ） −Ｓ１標的mＲＮＡの翻訳産物である。下側のバンドはそれぞれβ−グロビンmＲＮＡ（内部コントロールとして含まれる）およびＣＡＴ（ＣＵ）₈mＲＮＡの蛋白質産物である。図８からわかるように、スクランブルＭＰ−（ＡＧ）−Ｓ１オリゴマーはそれに対応するＣＡＴ−（ＣＵ）−Ｓ１標的mＲＮＡの翻訳を阻害した。わずかにより弱いコントロールのバンドから明らかなように、ＭＰ−（ＡＧ） −Ｓ１も１０μＭにおいていくらかの非特異的阻害を生じた。２mmオリゴマーは試験したいかなる濃度においてもＣＡＴ−（ＣＵ）−Ｓ１蛋白質の合成を阻害せず、完全に相補的なＭＰオリゴマーによる配列特異的な阻害であることをさらに証明した。さらに、ＭＰ−（ＡＧ）−Ｓ１とＭＰ−（ＡＧ）₈のみが、それらの着目相補mＲＮＡ標的（それそれ、ＣＡＴ−（ＣＵ）−Ｓ１およびＣＡＴ−（ＣＵ）₈ ）を阻害した。実施例１０２本鎖ＤＮＡ標的と全プリンＭＰオリゴマーによる３本鎖の形成以下の実施例は、全プリンメチルホスホネ-トオリゴマーが２本鎖ＤＮＡ標的によって３本鎖複合体を形成することができることを証明する。本実施例で用いたＤＮＡ標的（配列＃２５６２）は相補的な３'および５'末端を持っている。これは本標的にヘアピン構造を形成させる。オリゴマーＮｏ . 本オリゴマーの熱変性分析によってヘアピン構造を確認した。したがって、実施例１に述べたように２５６２−１に関するＡ₂₆₀対温度のモニタリングは、７４ ℃のＴmを持つ単一の融解転移を示した。以下のメチルホスホネート（ＭＰ）オリゴマーがこのＤＮＡヘアピン配列にハイブリダイズする能力について検討した。これらのオリゴマーの各々を、１：１のモル比で標的オリゴマーＮo.２５６２ −１と混合、アニールさせ、実施例１に述べたように熱変性分析により分析した。２相性の融解転移が本ＤＮＡ標的にハイブリダイズした各オリゴマーにおいて観察された。別々に行ったＭＰオリゴマーおよびＤＮＡ標的を用いるコントロール実験に基づいて、最初の転移は３本鎖ＭＰ／ＤＮＡ複合体の変性に対応することが示されたが、第２の転移はＤＮＡのヘアピン構造の変性に対応することが示された。最初の転移から得られたＴmを以下にまとめる。本データは、逆平行および平行・ＭＰオリゴマーがともに２本鎖ＤＮＡヘアピン構造で３本鎖複合体を形成することができることを示す。Ｔm値は、平行なＡＧオリゴマー２３１８−１が逆平行ＡＧオリゴマー２３１７−１よりもよりしっかりとＤＮＡヘアピン構造と結合することを示唆する。実施例１１２本のメチルホスホネートオリゴマーと１本の相補性オリゴリボヌクレオシドによる３重らせん複合体の形成２：１ＭＰ：ＲＮＡオリゴマーによる３重らせんの形成を、Varlan Model Ca ry ３Ｅ分光光度計を用い、実施例１に述べたような熱変性法によって証明した。温度を０.５〜１℃／分の速度で５℃から８０℃または９０℃まで変化させた。典型的な３重らせんを形成するＭＰオリゴマーの配列およびそれらのＴＭを下の表に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１．第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合させることによって３重らせん複合体を形成させることにより１本鎖のターゲット配列を有する核酸を検出しまたは認識する方法であって、ターゲット配列はそれらの鎖のうちの一つであり、他の鎖は場合により共有結合的に結合したオリゴマーであり、該方法は第１鎖を、互いにヌクレオシド配列が実質的に同一であり、その一つは第１鎖と十分相補的であってワトソン−クリック塩基対合により第１鎖に結合する第２および第３鎖と結合させることを含んでなる方法。２．第１鎖がターゲット配列である請求の範囲第１項に記載の方法。３．３重らせん複合体において、第２鎖および第３鎖が互いに平行であり、第１鎖と逆平行である請求の範囲第２項に記載の方法。４．第２鎖が第１鎖にワトソン−クリック塩基対合により結合し、第３鎖は第１鎖および第２鎖の両方に水素結合し、結合して３重らせん複合体を生じる請求の範囲第３項に記載の方法。５．第２鎖がターゲット配列である請求の範囲第１項に記載の方法。６．第３鎖がターゲット配列である請求の範囲第１項に記載の方法。７．第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合させて３重らせん複合体を生じさせることにより１本鎖ターゲット配列を有する核酸の発現を阻害し、または変更する方法であって、それらの鎖の１つはターゲット配列であり、他の鎖は場合により共有結合的に結合したオリゴマーであり、該方法は、第１鎖を、互いに実質的に同一であるヌクレオシド配列を有し、そのうちの１つは第１鎖に十分相補的であり第１鎖にワトソン−クリック塩基対合により結合できる第２および第３鎖と接触させることを含んでなる方法。８．第１鎖がターゲット配列である請求の範囲第７項に記載の方法。９．３重らせん複合体において第２鎖および第３鎖が互いに平行であり、ターゲット配列に逆平行である請求の範囲第８項に記載の方法。１０．第２鎖がターゲット配列にワトソン−クリック塩基対合により結合し、第３鎖はターゲット配列と第２鎖の両方に水素結合して３重らせん複合体を生ずる請求の範囲第９項に記載の方法。１１．第２鎖がターゲット配列である請求の範囲第７項に記載の方法。１２．第３鎖がターゲット配列である請求の範囲第７項に記載の方法。１３．ターゲット配列が主にピリミジンヌクレオシド配列を含んでなる請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法。１４．オリゴマーが実質的に中性のオリゴマーである請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．実質的に中性のオリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．ターゲット配列が約８５％または以上ピリミジンヌクレオシドである請求の範囲第１４項に記載の方法。１７．第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合させることにより安定な３重らせん複合体を形成する方法であって、該鎖の１つは１本鎖のＲＮＡのターゲット配列であり、他の２つの鎖はオリゴマーであり、第２および第３鎖は同じ鎖極性を有し、実質的に同一のヌクレオシド配列を有し、ターゲット配列に独立して実質的に相補的である方法。１８．第１鎖が主にピリミジンヌクレオシドを含んでなり、第２および第３鎖は主にプリンヌクレオシドを含んでなる請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．第１鎖がターゲット配列である請求の範囲第１７項に記載の方法。２０．ターゲット配列が主にピリミジンターゲット配列を含んでなり、オリゴマーが主にプリンヌクレオシドを含んでなる請求の範囲第１９項に記載の方法。２１．オリゴマーが実質的に中性のオリゴマーである請求の範囲第２０項に記載の方法。２２．実質的に中性のオリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求の範囲第２１項に記載の方法。２３．３重らせん複合体においてオリゴマーが互いに平行に結合し、ターゲット配列に逆平行に結合する請求の範囲第１５〜１８項のいずれかに記載の方法。２４．オリゴマーのヌクレオシドの塩基が互いに、およびターゲット配列のヌクレオシドの塩基と、水素結合する請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．オリゴマーが実質的に中性のオリゴマーである請求の範囲第２４項に記載の方法。２６．実質的に中性のオリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求の範囲第２５項に記載の方法。２７．１本鎖のターゲット配列を有する核酸を検出し、認識する方法であって、該方法は第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合させることを含んでなり、該鎖の１つはターゲット配列であり、他の鎖は場合により共有結合していてもよいオリゴマーであり、第２鎖は第１鎖と十分に相補的であって第１鎖にワトソン−クリック塩基対合により結合し、第３鎖は各ワトソン−クリック塩基対の両塩基を認識することにより、第１鎖および第２鎖と水素結合しかつ結合し、それによって３重らせん複合体を形成する方法。２８．１本鎖の核酸の発現が阻害されまたは減少する請求の範囲第２７項に記載の方法。２９．第２および第３鎖が互いに平行であり、実質的に同一のヌクレオシド配列を有する請求の範囲第２７項に記載の方法。３０．オリゴマーが実質的に中性のオリゴマーである請求の範囲第２９項に記載の方法。３１．実質的に中性のオリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求の範囲第３０項に記載の方法。３２．センス鎖とアンチセンス鎖を有する２本鎖ターゲット配列を有する２本鎖核酸を検出しまたは認識する方法であって、該方法は、ターゲット配列を、ターゲット配列の１つの鎖のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオシド配列を有する第３鎖と接触させることを含んでなり、第３鎖の塩基はターゲット配列の各鎖の対応する塩基に水素結合してトリプレットを与え、多数のトリプレットが形成されて３重らせん複合体を生ずる方法。３３．１本鎖核酸の発現が阻害されまたは減少する請求の範囲第３２項に記載の方法。３４．第３鎖がセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに平行であり、いずれかと実質的に同一のヌクレオシド配列を有する請求の範囲第３３項に記載の方法。３５．第１鎖、第２鎖および第３鎖を結合して３重らせん複合体を形成することにより、１本鎖のターゲット配列を有する核酸の発現を阻害する方法であって、それらの鎖の１つはターゲット配列であり、他の鎖は場合により共有結合的に結合していてもよいオリゴマーであり、該方法は、第１鎖を、互いに平行であり互いに実質的に同一のヌクレオチド配列を有する第２および第３鎖と接触させることを含んでなり、第２鎖は第１鎖に十分に相補的であってターゲット配列にワトソン−クリック塩基対合により結合し、第３鎖は第２鎖および第１鎖と水素結合して３重らせん複合体を生ずる方法。３６．第１鎖が主にピリミジンヌクレオシド配列を含んでなる請求の範囲第３５項に記載の方法。３７．オリゴマーが実質的に中性のオリゴマーである請求の範囲第３５項または第３６項に記載の方法。３８．実質的に中性のオリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求の範囲第３７項に記載の方法。