SE466482B - Med mrna hybridiserbart antiviralt medel - Google Patents

Description

“'4ee 482 10 15 20 25 30 40 År 1978 rapporterade P.C. Zamecnik et al att en tridekamer oligodeoxinukleotid som är komplementär till de upprepade 3'- och 5'-ändstående nukleotiderna av Rous sarcoma-virus (RSV) är en effektiv inhibitor av syntesen av protein specificerad genom viralt RNA i vetebaserade cellfria system [Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 75, 285-288 (1978)] och i ett in vitro vävnadsodlings- system [ibid. 75, 280-284 (1978)]. Vad beträffar den första refe- rensen användes fortfarande det cellfria systemet såsom tidigare men en viss förbättring har iakttagits med avseende på använd- ning av ett DNA med en mindre molekylstruktur för inhiberíng av translation av protein. Enligt den andra referensen genomföres experiment med användning av tridekameren i ett vävnadsodlings- system för inhiberíng av replikatíon av virus och transformation av celler. DNA som användes i dessa referenser för inhiberíng av replikationen och transformationen är utvalt från ett annat område än ett specifikt kodningsområde och är ej önskvärd. Samma år rapporterade också N.D. Hastie et al att hybridisering av globin-mRNA till motsvarande cDNA visade sig specifikt inhibera translation av mRNA i ett cellfritt system [ibid. 75, 1217-1221 i (1978)]. Det nya i denna referens är endast att ett visst kod- ningsområdeäav DNA utväljes för inhiberíng av translationen genom hybridisering av mRNA. Emellertid genomfördes experimenten var- till hänvisas däri fortfarande i ett cellfritt system. Det har funnits ett behov av utvecklandet av mediciner baserade på denna teori ända sedan publikationen av dessa referenser år 1978. Hit- tills har emellertid inga referenser rapporterats som berör tillämpningen av denna teori praktiskt genom experiment in vivo.

I 'År 1983 publicerades en PCT-patentansökning avseende ett oligonukleotidbaserat terapeutiskt medel och förfaranden för framställning av detta (Molecular Biosystems Inc., internationellt publiceringsnummer WO 83/01451). Vad som beskrives i denna ansö- kan är emellertid endast ett påstående att (-9-sträng av DNA ut- vald i ett visst kodningsområde inhiberade SV 40-transformerad cell.

Fastän uttrycket "in vivo"'bfta användes i exempel 1 i denna referens är beskrivningarna vartill hänvisas däri med hän- syn till sammanhanget uppenbarligen sådana att de antyder expe- ríment i in vitro cellodlingssystem. Även om sådana experiment in vitro skulle bedömas såsom experiment in vivo saknar de kon- kreta betingelser därför och utgör ingenting annat än enbart en 10 15 20 25 30 35 466 4s2 uppgift om att önskvärda effekter förväntas uppträda. Denna referens föreslår ändock för första gången tillämpning av RNA-DNA-hybridiseringsteknik för en medicin men saknar ingående beskrivningar som möjliggör användning såsom mediciner och utgör ingenting annat än enbart en sammanfattning av kunskaperna som är manifesterade på detta stadium. I denna patentansökning anges sålunda ingenting utöver den tekniska nivån som beskrives i ovan angivna referenser.

Under ovannämnda omständigheter finns det ett stort behov av en helt ny typ av anti-viralt medel baserat på vidareutveck- lingen av teorin avseende inhibering av mRNA-translation av virus på basis av RNA-DNA-hybridiseringsteknik för åstadkomman- det av inhibering av utbredningen av virus in vivo.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är följaktligen tillhandahållande av ett medel för inhibering av utbredning av virus, som innefattar transport av den specifika oligo- eller polydeoxi-nukleotiden till stället infekterat medelst virus, vilket medel utgör en ny typ av ett anti-viralt medel innefat- tande en specifik oligo- eller polydeoxinukleotid, som uppvisar en DNA-sekvens som är identisk med ett parti av strukturen av DNA som är hybridiserbart vid ett mRNA bildat vid utbredningen av virus, vilken struktur kan hybridiseras till mRNA för inhibering av utbredningen av virus.

Föreliggande uppfinning förklaras närmare i följande be- skrivning i samband med de bifogade ritningarna, varpå fig¿_l är ett diagram som visar resultatet av experiment som visar den in- hiberande effekten av oligo-deoxinukleotiden (20 A) på de cyto- paumena effekterna av HSV-1; fig. 2 är ett diagram som visar re- sultatet av experiment som demonstrerar de inhiberande effekterna av oligodeoxinukleotiden (20 A) på utbredning av virus; fig 3 är ett diagram som visar effekten av viss kombination av oligodeoxinukleotider vid inhiberingen av multiplicering av virus och den patogena effekten därav i jämförelse med en enda oligo- deoxinukleotid som användes däri; fig. 4 är ett diagram som visar resultatet av experiment som utformats för pävisande av effektivi- É4e6 482 4 10 15 20 25 30 35 40 teten - in vivo (i ett levande djur) av det antivirala medlet enligt föreliggande uppfinning.

Enligt uppfinningen har det visat sig att när en oligo- deoxinukleotid eller polydeoxinukleotid,som är identisk med av- seende på DNA-sekvens med ett parti av strukturen av DNA,som är hybridiserbar med mRNA,som bildas vid utbredningen av virus, transporteras till platsen,där mRNA existeran kan strukturen hybridiseras med mRNA, varvid virusutbredningen inhiberas effek- tivt. Genom administreringav oligo- och polydeoxinukleotiderna till djur infekterade med ett virus har man enligt uppfinningen lyckats tillhandahålla eülanti-viralt medel som effektivt kan inhibera virusutbredningen in vivo. Föreliggande uppfinning är baserad på ovanstående upptäckt.

Som angivits tidigare var hybridiseringen av viralt eller globin-RNA till motsvarande DNA för inhibering av syntesen av protein känd genom ovan angivna referenser. Den övervägande an- delen av experímenten som hänför sig till detta har emellertid genomförts i ett cellfritt system varvid undantag dock är USA, 75, 280- 284) och referensen Molecular Biosystem Inc. (PCT, internationellt Zamecniks andra referens (Proc. Natl. Acad. Scii, publiceringsnummer WO 83/01451) vari inhibering av virusutbred- ningen i ett cellodlingssystem in vitro beskríves. I experimenten in vitro enligt Zamecnik utväljes emellertid DNA hnmiett område annat än ett specifikt kodningsområde för viruset. Med uttrycket "kodningsområde" avses här områden av virala gener som kodar» för (bestämmer aminosyrasekvensen av) virala proteiner och som "undergår'transkription genom ett RNA-polymeras för bildning av mRNA. Molecular Biosystem Inc.-referensen saknar däremot uppgif- ter om konkreta betingelser för experimenten. Föreliggande upp- finningâh°baserad på omfattande forskning och experiment såväl med system in vitro som in vivo med användning av specifika oligodeoxinukleotider eller polydeoxinukleotider utvalda från ett specifikt kodningsområde och det har nu för första gången blivit möjligt att utveckla teorin avseende inhibering av virus- utbredningen på basis av RNA-DNA:hybridiseringsteknik till en praktiskt användbar terapimetod varigenom användningen av oligo- deoxinukleotiderna eller polydeoxinukleotiderna möjliggöres så- som en medicin för inhibering av virusutbredningen. Föreliggande uppfinning skiljer sig följaktligen helt från teknikens stånd- punkt i två avseenden; utväljandet av DNA från eU:specifikt ie 10 15 20 25 30 35 ' 466 482 kodningsområde som kan hybridiseras till mRNA av virus och an- vändningen av en enkelsträngad deoxinukleotid uppvisande en kort kedjelängd såsom DNA utvalt ur det specifika kodningsområdet och skiljer sig också genom att ovannämnda två åtgärder har ut- vecklats till en praktiskt användbar metod genom mycket omfat- tande experiment in vivo.

Föreliggande uppfinning avser sålunda en farmaceutisk komposition, kännetecknad därav, att den väsentligen består av en effektiv anti-viral mängd av en oligodeoxinukleotid eller polydeoxinukleotid, som uppvisar en sekvens, som är identisk med ett parti av DNA, som är hybrídiserbart med budbärar-RNA hos herpes-virus, vilken oligodeoxinukleotid eller polydeoxi- nukleotid kan hybridiseras med budbärar-RNA:t; samt en farma- ceutiskt godtagbar bärare.

Enligt föreliggande uppfinning möjliggöres följaktligen inhibering av utbredningen av virus, genom att en eller flera oligodeoxinukleotider eller polydoxinukleotider transporteras till platsen för ett mRNA bildat vid utbredningen av virus, varvid oligodeoxinukleotiderna eller polydeoxinukleotiderna är identiska med avseende på DNA-sekvens med ett parti av struktu- ren av DNA hybrídiserbart till nämnda mRNA, vilken struktur kan hybridiseras till nämnda mRNA.

Enligt uppfinningen visade det sig först att när ett syn- tetiskt RNA såsom mRNA translateras i ett in vitro protein-syntes- system inhiberas proteinsyntesen genom en oligodeoxinukleotid som hybridiseras vid detta syntetiska RNA. (Se exempel 25 nedan).

Oligodeoxinukleotider som ej hybridiseras vid RNA inhibe- rade ej proteinsyntesen i detta system.

Sedan visade det sig enligt uppfinningen att oligodeoxi- nukleotider av (-)-sträng-sekvensen av a?globin-eller ß-globin- DNA inhiberar translationen av motsvarande mRNA. (Se exempel 26 nedan).

Såsom ett resultat av detta experiment visade det sig att mêglobin-DNA inhiberar specifikt translationen av Qéglobin-mRNA i in vitro-systemet. Vidare visade det sig att 5-globín-DNA in- hiberar specifikt translationen av ß-globin-mRNA i detta system.

När DNA som ej hybridiseras vid aæglobin-mRNA användes visade det sig dessutom att bildningen av Qêglobin ej inhiberades. På “~466 482 10 15 20 25 30 40 6 @-globin-bildningen ej av DNA som ej hybridiseras till 6-globin-mRNA. Det har vidare visat sig att ej endast DNA med en lång kedja utan även oligodeoxinukleotider uppvisar en stark inhíberande effekt i detta system på grund av hybridisering. liknande sätt inhiberades På basis av dessa experiment genomfördes ytterligare expe- riment avseende herpes simplex virus (HSV)-infektion. När DNA eller oligodeoxinukleotider som kan hybridiseras till den tidiga mRNA-mellanprodukten av HSV sattes till celler infekterade med detta virus visade det sig att antalet syncytia (ett placklik- nande hål som bildades av HSV på grund av sammansmältningen av infekterade celler) orsakade av HSV minskades avsevärt.

I detta experiment användes CaCl? och Ca-fosfat tillsam- mans med DNA för stimulering av penetrering av DNA in í celler.

I separata experiment visade det sig emellertid att olígodeoxi- nukleotiden kan tagas upp också i frånvaro av dessa kalciumsalter och sålunda inhiberar utbredningen av HSV och dess cytopatogena effekter. (Se exempel 7 nedan).

Av dessa experiment är det uppenbart att minus-strängen av DNA som hybridiseras till mRNA av HSV-1 inhiberar syncytium- bildning genom detta virus. Baserat på denna observation till- fördes enligt uppfinningen möss infekterade med HSV sådant DNA varvid det visade sig att sådant DNA kan användas såsom ett anti- viralt medel in vivo för behandling av virala sjukdomar.

Man bör härvid lägga märke till att det endast är den nega- s tiva strängen av DNA som är specifik för mRNA i den speciella virala genen, som användes såsom en effektiv komponent i medlet och förfarandet enligt uppfinningen. Biosyntesen av cellulärt protein programmerat genom andra typer av mRNA bör följaktligen ej påverkas genom användning av ovannämnda DNA.

Det finns två virusgrupper; DNA-virus (herpes simplex virus, adeno-virus, vaccinia-virus, etc) och RNA-virus (influ- ensa-virus, rhino-virus och polio-virus, etc). RNA-virus uppbär antingen enkelsträngat RNA eller/dubbelsträngat RNA som ett genom. Virus med enkelsträngat RNA klassificeras i sådana upp- bärande plus-strängat RNA och sådana uppbärande minus-strängat RNA såsom "genom".

Virala proteiner måste alltid syntetiserasgenmn translation av ett viralt mRNA som är ett plus-strängat RNA. Virus med ett dubbel-strängat DNA-genom bildar mRNA (plus-sträng) av sin minus- ”milt 10 15 20 25 30 35 40 466 482 7 strängade DNA-sträng. Vad beträffar dubbel-strängat RNA-virus bildas mRNA (plus-strängat) från minus-strängat RNA. Genomet av plus-strängat RNA-virus fungerar i sig såsom ett mRNA under det att minus-strängat RNA-virus använder sitt RNA såsom mall för bildningen av plus-strängat RNA (mRNA).

Enligt uppfinningen inhiberas translationen av ett viralt mRNA och sålunda syntesen av virala proteinen oberoende av meka- nismen av syntesen av mRNA,genom ett hybridiserande minus-strängat DNA. Fastän endast exempel anges vari herpes simplex virus (dubbel-strängat DNA-virus) och influensa-virus (enkel-strängat RNA-virus) används kan föreliggande uppfinning tillämpas för allmän inhibering av virusutbredning. Sålunda kan utbredning av virus, såsom influensa-virus, adeno-virus, leukemi-virus, dengue-virus, rabies-virus, hepatitis-virus, mässlings-virus, _ encefalitis-virus, parainfluensa-virus, rhino-virus, gula feber- Virus Och EB-virus inhiberas med medlet enligt föreliggande upp- finning.

Föreliggande uppfinning kan sålunda användas allmänt för förhindrande eller behandling av olika sjukdomar i djur och väx- ter orsakade av virus. Respektive farmaceutiska kompositioner är sålunda mycket användbara inom olika områden.

Enligt föreliggande uppfinning kan utbredningen av RNA- eller DNA-virus och de cytopatogena effekterna därav hejdas utan påverkan av värdceller. Vidare kan infektion av icke infekterade värdceller förhindras med medlet enligt uppfin- ningen. Enligt uppfinningen har det visat sig att oligodeoxi- nukleotider enbart som hybridiseras vid omedelbart, tidigt mRNA hos herpes simplex virus varken har effekt på normala icke infekterade njurceller från hamsterungar (BHK-celler) eller effekt på möss. Man har därför dragit den slutsatsen att oligodeoxinukleotiderna varken har skadlig effekt på normala celler och djur eller över huvud taget påverkar tillväxthastig- heten för dessa celler.

Negativt-strängade deoxinukleotider som användes enligt uppfinningen kan erhållas genom enzymatisk hydrolys av DNA, denaturering och efterföljande separation genom affinitetskroma- tografi. Alternativt kan syntetiska negativt-strängade oligode- oxinukleotider användas. Det är följaktligen uppenbart att de negativt-strängade deoxinukleotiderna som användes i experimen- ten som beskrives här kan erhållas med ett flertal metoder.

Vid kloning av RNA-virus-gen användes ibland omvänd “\4e6 482 10 15 Z0 25 30 40 transkriptas. I vissa fall kan viralt DNA ingående i infekterade celler och härstammande från RNA-virus-genomet användas. Såsom en kloningsbärare användes exempelvis lambda-fag (Charon-fag), eller plasmid pBR 322 kan användas såsom vektor. För erhållande av enkel-strängat (-)-DNA användes M 13-fag såsom vektor. Enligt föreliggande uppfinning kan klonat DNA från kodningsområdet i vilken som helst del av totalt viralt genom användas. Emellertid är tidiga eller ögonblickligu tidiga gener vars expression iakt- tages i tidiga stadier av infektion speciellt önskvärda för för- hindrande av virusutbredning och åtföljande cytopatogena effekter.

En rekombinant M 13-fag innehållande ett negativt-strängat, viralt DNA eller en rekombinant DNA-vektor innehållande dubbel- strängat viralt DNA kan bildas genom odling av stora mängder av E. coli som inhyser dessa vektorer eller E.coli infekterat med M 13-fag. Vektorer innehållande de virala generna isolerades och utsattes för restriktions-endonukleas för utskärande av de virala generna. Blandningen av de utskurna virala generna och vektor- DNA:t utsattes därefter för agarosgel-elektrofores eller Sephadex-kolonn-kromatografi Lör separation av virus-gen-DNA från vektor-DNA. Sålunda erhållna DNA-molekyler förkortades ge- nom partiell uppslutning med DNA-restriktonsendonukleas eller ultraljudbehandling. Kedjelängden av de virala DNA-fragmenten reglerades till någonstans mellan 9 och 100 nukleotider genom isolering av dessa DNA-strängar genom gel-elektrofores och Sephadex-kromatografi.

Man bör komma ihåg att det endast är den negativa strängen av viralt DNA som är effektiv för inhibering av viral. protein- syntes. När DNA från vektorer, såsom pBR 322 eller lambda-fag utgör den replikerande formen av M 13-fag är detta ett dubbel- strängat DNA. Detta dubbel-strängade DNA måste följaktligen överföras till enkel-strängat DNA följt av isolering av negativt- strängat DNA. För detta ändamål kan olika metoder användas.

Exempelvis denatureras DNA genom upphettning vid 1000C under 10 minuter och kyles snabbt.

Från en blandning av separerat negativt- och positivt- strängat DNA kan negativt-strängat DNA isoleras, exempelvis ge- nom affinitets-kromatografi. För detta ändamål framställes först det positivt-strängade DNA:t genom kloning i M 13-fag. Denna konjugeras därefter vid ett bärarmaterial för kromatografisk an- vändning. En blandning av negativt- och positivt-strängat DNA Hillman- 10 15 20 25 30 35 40 466 482 bringas därefter att passera genom kolonnen med konjugerat positivt DNA. Den negativa strängen av DNA binds vid denna kolonn under det att den positiva strängen av DNA passerar genom kolonnen. Den bundna negativa strängen av DNA elueras därefter ur kolonnen.

En alternativ metod för erhållande av den negativa strän- gen av DNA är kemisk syntes i form av oligo- eller polydeoxi- nukleotider genom en lämplig syntesmetod från organisk kemi.

För fallet herpes simplex-virus uppvisar exempelvis en av de ögonblickliga tidiga DNA-generna, Vmw 175, en dubbel-sträng bestående av ett plus-DNA (5'-ATG.GCG~TCG-GAG....) och ett minus- DNA (3'-TAC-CGC-AGC-CTC.....). Endast minus-DNA:t uppvisande en sekvens som börjar med TAC kan hybridiseras till ett mRNA av Vmw 175. Sålunda måste vilket som helst av DNA,som är identiskt med avseende på en partiell struktur med minus-DNA-strängen,ut- väljas och syntetiseras såsom en oligodeoxinukleotid. Influensa- virus-genomet innefattar hemagglutinin-genen och NS (non-struktu- rella) gener. Eftersom hemagglutinin-genen av olika serotyper av influensa-virus varierar med avseende på sin RNA-sekvens före- drages sekvensen av ett enkel-strängat DNA,som hybridiserar till mRNA av NS-generna,vid tillämpning av föreliggande uppfinning. (-)-sträng av DNA som hybridiserar till mRNA:t från NS-generna är mer önskvärd än sådan som hybridiserar till mRNA:t från hemagglutinin-genen,eftersom hemagglutinin-genen muterar mycket ofta och (-)-strängen av DNA,som hybridiserar till mRNA från hemagglutínin-genen av en enda stam av influensa-virus,ej kan korshybridiseras till mRNA:t från hemagglutinín-genen av en stam av influensa-virus av annan serotyp.

Ytterligare förklaring avseende NS-1-genen av influensa- virus ges exempelvis av Lamb et al, [Éell 21, 47 (1980)).

DNA-sekvensen som hybridiserar till ett mRNA från NS-1-gen är 5'-....ACT-TGA-CAC-AGT-GTT-GGA-ATC-CAT-----3'. Följaktligen kan hela eller en del av denna sekvens utväljas och syntetiseras.

Föreliggande uppfinning kan också tillämpas i samband med virus relaterat till fjäderfä- oeh kreatursindustrier, såsom Rous Sarcoma-virus. Inhiberandet av expression av en av generna gag., pol. och env. för detta virus bör exempelvis inhibera ut- bredningen av detta virus. Om exempelvis inhiberingen av ut- tryckandet av gagfgenen genom en hybridiserande DNA-molekyl är önskvärd kan en oligo- eller polydeoxinukleotid uppvisande en ö 466 482 10 15 20 25 40 10 del av sekvensen 5'-....AAT-CAT-CTT-TAT-GAC-GGC-TTC._...-3' väljas och syntetiseras, varvid man tar RNA-sekvensen av P_l9 i Ut- beaktande som är en del av gag.-genen.

Av ovanstående förklaringar är det uppenbart att i princip bör för inhiberingen av virusutbredning genom ett enkel-strängat minus-sträng-DNA effektivt enkel-strängat DNA utväljas som hybridiseras till ett mRNA av detta virus.

I allmänhet avses med uttrycket "oligodeoxinukleotid" en molekyl det att uppvisande ett mindre antal deoxinukleotidenheter under uttrycket "polydeoxinukleotid" indikerar en molekyl upp- visande ett större antal deoxínukleotid-enheter. Enligt förelig- gande uppfinning är exempelvis antalet nukleotid-enheter i Oligo- deoxinukleotiderna vanligen upp till 25. Deoxinukleotider upp- visande mer än ZS deoxinukleotid-enheter kan följaktligen enligt föreliggande uppfinning betecknas "polydeoxinukleotider".

De anti-virala medlen enligt föreliggande uppfinning inne- hållande oligo- och/eller polydeoxinukleotiden med en lämplig flytande bärare eller sådant utdrygningsmedel och eventuellt en eller flera hjälptillaitser framställes i form av flytande be- redningar, medel för injektion, suppositorier, etc enligt kända metoder. Vid recept kan önskvärda oligodeoxinukleotider och polydeoxinukleotider användas för sig eller i kombination med andra farmakologiskt aktiva beståndsdelar. I detta fall är det uppenbart att dessa andra beståndsdelar bör ej påverka den anti- virala aktiviteten av oligo- och polydeoxinukleotiderna ogynn- samt.

Oligo- och polydeoxinukleotiderna kan bearbetas om önsk- värt till beredningar för utvärtes bruk, såsom kräm, salva, vätska och plåster genom blandning av oligo- och polydeoxinukleo- tiden såsom den aktiva bestândsdelen med en lämplig inert bärare eller ett sådant utdrygningsmedel.

De flytande bärarna eller sådana utdrygningsmedel samt de eventuella hjälptillsatserna som användes i de anti-virala med- len enligt föreliggande uppfinning är konventionella sådana och kommersiellt tillgängliga.

Belysande för flytande bärare, utdrygningsmedel och hjälp- tillsatser som är användbara vid framställningen av anti-virala medel är exempelvis destillerat vatten för injektionsanvändning, fysiologisk saltlösning, vattenhaltig lösning av dextros, vege- tabila oljor för injektionsanvändning, propylenglykol, 10 15 20 25 30 35 466 482 11 polyetylenglykol och bensylalkohol (för injektioner och flytande beredningarj; vaselin, vegetabil olja, animaliskt fett och poly- etylenglykol (för beredningar för utvärtes bruk); och isotoniska medel, upplösningsfrämjande medel, stabiliseringsmedel, färg- medel, antiseptiska medel, smärtlindrande medel och liknande tillsatser (såsom konventionella hjälptillsatser vid farmaceu- tiska beredningar). För fallet injektionsberedningar kan den aktiva beståndsdelen lämpligen upplösas i steriliserade vätske- formiga bärare. Det är uppenbart att de olika, ovan nämnda fly- tande bärarna, utdrygníngsmedlen och hjälptillsatserna varken bör inhibera eller störa den anti-virala verkan av oligo- och polydeoxinukleotiderna.

Oligo- och polydeoxinukleotiderna enligt föreliggande upp- finning bearbetas med bärarna och utdrygningsmedlen vartill hän-Å visats ovan och eventuellt tillsammans med hjälptillsatser var- till hänvisats ovan enligt kända metoder. Injektionsberedningar och suppositorier kan vanligen innehålla 1-10 mg av oligo- och polydeoxinukleotiderna per ampull eller kapsel. För mänskliga patienter är denidagliga dosen cirka 0,1-1000 mg, företrädesvis 1-100 mg (från 10 till 20 pg/kg till 1000-2000 pg/kg kroppsvikt).' Den speciella dosen för varje patient beror emellertid på ett stort antal faktorer, exempelvis då effektiviteten av den spe- ciella oligo- eller polydeoxinukleotiden som användes, åldern, vikten, det allmänna hälsotillståndet, kön, diet, tidpunkten' och sättet för administrering, elimineringshastigheten, kombi- nationen med andra mediciner som användes samtidigt och svårig- hetsgraden av de speciella sjukdomarna för vilka terapin till- lämpas.

De anti-virala medlen enligt föreliggande uppfinning administreras intravenöst eller anbringas direkt på kroppspartiet hos en patient som infekterats med virus så att oligo- eller poly- deoxinukleotiden kan transporteras effektivt till det infekterade stället.

Föreliggande uppfinning förklaras närmare i följande exempel och referensexemepl. J Exempel 1-5 hänför sig till framställningen av oligo- och polydeoxinukleotiderna som användes enligt föreliggande uppfin- ning. "466 482 10 15 20 ZS 30 40 12 Exempel 1. Herpes simplex-virus DNA isolerades genom fenol- -kloroform-extraktion. Isolerat DNA uppslöts medelst restrik- tíonsenzymet BamHI.

Uppslutet DNA blandades därefter med pBR 322-plasmid-DNA, som först behandlats med BamHI, i närvaro av T 4-fag-ligas.

Erhållen blandning innehållande ligasbehandlade plasmider sattes till E. coli och bakterierna, som innehöll rekombinant- plasmiden, utvaldes genom inkubering av dessa på agarplattor innehållande ampicillin för bildning av kolonier och sållning av dessa med avseende på tetracyklin-känslighet. Bland de tetra- cyklín-känsliga kolonierna utvaldes sådana av bakterier uppvisan- de herpes simplex virus-DNA genom filterhybridíseringsmetoden ZP-märkt herpes-viralt DNA såsom probe. För erhållande av X 106-107 innehållande rekombinant-plasmiden i 2 ml TSB (tryptos-soja- med rekombinant-plasmid-DNA placerades 2 E. coli-celler lösning).

Det ympade mediet skakades i ett 20 ml provrör vid 37OC under cirka 15 timmar tills den optiska absorptionen (optisk den- OD)_bos odlingsmedíet vid 540 nm nått 0,5 (OD540 = 0,5).

Vid denna tidpunkt tillsattes kloramfenikol till en sitet = slutkoncent- ration av 100 pg/ml och inkubering fortsattes under 15 timmar.

Bakteriesuspensionen centrifugerades därefter och pelletten uppslammades på nytt i en buffert innehållande 25 % sackaros och 50 mM tris-HCl (pH 8,0). Suspensionen fick stå vid OOC under 5 minuter. Till denna suspension sattes 4 ml Triton X 100 och erhållen viskös lösning centrifugerades under 30 minuter vid OOC vid 30 000 g. Till ovanvätskan av denna lösning (8 ml) sattes mb 8 g CsCl, 1 ml av en lösning av etidiumbromid (5 pg etidiumbro- mid/ml). Blandningen centrifugerades ytterligare under 48 timmar vid 100 000 g. Den råa plasmidfraktionen som erhölls efter denna centrifugering blandades med 2 volymer isopropylalkohol och fick stå under några minuter. Det övre skíktet avlägsnades och lös- ningen innehållande DNA dialyserades mot 0,1 M tris-HCl och 10 mM EDTA (pH 8,0) över natten.

Den dialyserade lösningen koncentrerades och lösningen innehållande 200 pg DNA behandlades med en överskottsmängd av restriktionsenzym (BamHI). DNA-uppslutningen separerades genom agaros-elektrofores och DNA:t av herpes simplex-virus isolerades från gelen genom elektroelueringsmetoden. DNA:t uppslöts ytter- ligare partiellt genom DN:as och upphettades till 100°C under Wfllliw 10 15 20 25 30 35 40 466 482 .v 19 10 minuter följt av snabb kylning. Sålunda erhölls DNA uppvi- sande kedjelängder av 9-100 oligodeoxinukleotider.

Exempel 2. Replikationsformen av M 13-fag-DNA (dubbel-strängat DNA) skars av med BamHI. Detta uppslutna M 13-DNA blandades med herpes simplex virus-DNA som hade uppslutits med BamHI och iso- lerats såsom beskrivits ovan. De ligasbehandlades med T 4-fag- ligas. E. coli transfekterades med lígasbehandlat DNA i närvaro av CaClZ. De transfekterade bakterierna utbreddes på agar-plattor med användning av ytagar som innehöll IPTG (isopropy1-ß-D-tio- galaktopyranosid) och X-gal (en indikator). Rekombinant-M 13-fa- ger innehållande herpes simplex virus-DNA bildar färglösa fag- plack inom 24 timmar. M 13-fager utan någon isättning bildar blå plack. Följaktligen utvaldes färglösa fag-plack. För utväljande av rekombinant N 13-fag som innehåller (-)-sträng av HSV-DNA kon- trollerades fager med avseende på deras kapacitet att hybridi- seras med märkt (+)-HSV-DNA som syntetiserats kemiskt. På detta sätt utvaldes M 13-fager innehållande en del av (-)-strängen av HSV-DNA. önskvärd rekombinant M 13-fag ökades med avseende på 0 mängd och ett enkelsträngat DNA isolerades från denna fag. För ytterligare rening av enkelsträngat HSV-DNA kan M 13 fag-DNA avlägsnas ur denna blandning genom uppslutning med restriktions- enzym i närvaro av vissa oligodeoxinukleotider. Alternativt kan DNA-blandningen uppslutas partiellt utan rening med DN:as och oligodeoxinukleotider uppvisande kedjelängder mellan 9 och 100 kan isoleras. §xempel_§. En DNA-syntesmaskin (Applied Biosystem Company) an- vändes för syntetisering av minus-sträng-DNA av ögonblicklig tidig gen (Vmw 175 eller ICP 4) av herpes simplex-virus. I detta 4- exempel syntetiserades DNA-sekvensen 3'-CGC-AGC-CTC-TTG-TTC-GTC- GC-5' som hybridiserar med mRNA av Vmw 175. Denna deoxínukleotid är en eikosamer och betecknas hädanefter helt enkelt 20 A.

Exempel 4. En DNA-syntesmaskin (Applied Biosystem Company) an- vändes för syntetisering av minus-sträng-DNA av ögonblicklig tidig gen (Vmw 12) av herpes simplex-virus. I detta exempel syn- tetiserades DNA-sekvensen 3'-GCA'CCC-GGG-ACC-TTT-ACC~GC-5', som hybridiserar med mRNA av Vmw 12. Denna deoxinukleotid är en eikosamer och betecknas hädanefter helt enkelt 20 B.

Exempel 5. En DNA-syntesmaskin (Applied Biosystem Company) an- vändes för syntetisering av minus-sträng-DNA av NS 1-gen av in- fluensa-virus. I detta exempel syntetiserades DNA-sekvensen 1166 482 5 10 15 20 25 14 3'-CTA-AGT-TTG-TGA-CAC-AGT-TCA-5' som hybridiserar med mkNA av NS 1. Denna deoxinukleotid är en heneikosamer och betecknas hädanefter helt enkelt 20 C.

Exempel 6. Detta exempel hänför sig till ett experiment varmed det bekräftas att oligodeoxinukleotider inhiberar syntesen av virus-protein in vitro. M Tabell 1 belyser den inhiberande effekten av 20 A pä Vmw 175-bildning och motsvarande cytopatogen effekt (Syncytium- bildning) av HSV 1.

Tabell 1 20 A/brunn Relativa cytopatogena effekter (Syncytium) Relativa mängder av Vmw 175 ----- 1 1 55,6 pg 0,48 0,35 BHK-celler (1,5 x 105) utbreddes i varje brunn (1,5 cm diameter) i en Limbro-skiva och MEM med 10 % kalvserum tillsat- tes. Cellerna inkuberades därefter i en atmosfär innehållande 5 % CO, vid 36OC. Därefter infekterades cellerna med 5 moi HSV:]~ i närvaro eller frånvaro av 20 A. Efter 5 timmar avlägsnades me- _ diet. Cellerna bringades därefter i kontakt under 1 timme med 355-metionin (100 pCi/pl) och sådana med 20 A sprängdes och proteiner analyserades genom polyakrylamid-gel-elektrofores följt av autoradiografi. För utvärdering av den relativa cytopatQgena effekten var de experimentella betingelserna identiska med dem ovan förutom att antalet syncytia räknades 13 timmar efter infek- tionen. Ingen minskning av syntesen av cellulärt protein iakt-'f togs under dessa betingelser. _ Exempel 7. Detta exempel hänför sig till ett experiment varmed det bekräftades att oligodeoxinukleotiden togs upp av cellerna.

Detta experiment indikerar att den enkelsträngade oligo- deoxinukleotiden 20 A verkligen kan tränga in i odlade celler.

BHK-celler (njurceller från hamsterungar; 4,4 x 105 celler) in- fekterades med 7,6 x 104 PFU HSV-1/ml. Kontrollceller infektera- des ej men erhöll samma mängd odfingsmedium. Cellerna inkubera- des under 3 timmar i en C02-inkuberingsanordning gäd 37°C. Efter inkubationen utsattes cellerna för 7,66 p mol av P-märkt 20 A.

Efter exponeringen för märkt 20 A avlägsnades odlingsmediet och cellerna tvättades två gånger med 0,3 ml PBS.

Cellerna fick därefter stå under 30 minuter vid 36oC i en 111111111 10 15 20 25 30 ß 466 462 lösning innehållande 0,1 M NaCl, 33 PM ZnCl2, 3360 enheter nukleas S1 och 33,3 mM natriumacetatbuffert (pH 4,5).

Därefter tvättades cellerna två gånger med buffert som be- skrivits mæm.men utan nukleas S1. De tvättade cellerna spräng- des i 0,3 ml av en lösning innehållande 10 mM EDTA, 0,6 % natrium- dodecylsulfat och 10 mM tris-HCl-buffert (pH 7,5). Vid denna tid- punkt mättes TCA-olöslígt, nukleas S1-känsligt, radioaktivt 20 A.

Det visade sig att åtminstone 4,68 x 103 molekyler av 20 A hade tagits upp per cell under exponeringsperioden av 8 timmar. Den verkliga mängden är förmodligen 10 gånger högre än detta värde ZP-ändstående fosfat.

Följande exempel 8 belyser att 20 A har en inhiberande på grund av den snabba hydrolysen av 3 effekt på utbredningen av virus.

Exempel 8. Cirka 1,5 x 105 BHK-celler utbreddes i varje brunn (1,5 cm diameter) på en Limbro-skiva. Dessa celler inkuberades i 5 % 002 vid 3600 under 48 rimmar een infekreredee med Hsv-1 (7,6 X 104 PFU/mi) i 160 P1 MEM. Infektionen genomfördes under 3 timmar vid 36OC i 5 % C02. Efter infektionen anbringades 20 A på de infekterade cellerna. Efter 8 timmars exponering ändrades mediet till normalt MEM med 10 % kalvserum. 15 timmar efter in- fektionen tillvaratogs odlingsvätskan och virus-titern uppmättes.

Resultaten visas i tabell 2 nedan.

Tabell 2 Mängd 20 A/brunn Relativ mängd virus 0 100 0,112 pg 45 0,224 pg 35 Exempel 9-13 hänför sig till experiment varmed det bekräf- tas att oligodeoxinukleotiden inhiberar förstöring av djurceller genom virus in vitro.

Exempel 9 (a) Cirka 1,5 x 105 BHK-celler infördes i varje brunn (1,5 cm diameter) på en Limbro-skiva för cellodling. Cellerna inkubera- des under 47 timmar vid 36oC i 5 % C02 och ínfekterades därefter med 160 pi Hsv-1 (7,6 X 104 PFU/mi) under 3 timmer vid 36°c.

Till dessa infekterade celler sattes ett komplex av kalclumfosfat och 20 A i olika mängd. Kalciumkoncentrationen i mediet varierade från 1,36 mmol till 24,8 mmol beroende på koncentrationen av 20 A.

Komplexet framställdes såsom beskrivits av Ruddleš grupp "466 482 10 15 25 35 40 16 (Loíter et al, Proc. Nat. Acad. Sci. 79, 422, 1982). De infek- terade cellerna exponerades för 20 A under 8 timmar. Odlings- mediet avlägsnades därefter och ersattes med ett normalt odlings- medium utan 20 A och cellerna odlades under ytterligare 13 timmar. (b) Kontrollcellerna behandlades identiskt förutom tillsatsen av 20 A (Ca-fosfat-kontroll). (c) Såsom ytterligare en kontroll framställdes en infekterad odling som varken behandlades med Ca-fosfat eller 20 A (virus- kontroll). Vävnadsodlingscellerna framställda ovam (a), (b), (c), fixerades, färgades och antalet syncytia räknades.

Resultatet av detta experiment är visat i fig. 1, vari X- axeln (abskissan) betecknar mängden DNA uttryckt såsom pg tillsatt varje brunn (dvs "pg DNA/brunn") och Y-axeln (ordinatan) betecknar antalet syncytia uttryckt såsom procent (dvs "% syn- cytia-antal") som bildas i en cellodling i jämförelse maivärdet som erhållits för experimentet (c) för "virus-kontroll", varvid värdet i detta fall alltid sättes lika med 100 och varvid en kurva dragen genom en hel linje (a) (---) visar resultatet som erhållits iexperiment (a) under det att en kurva dragen genom en streckad linje (b) (--o--) visar resultatet som erhållits i experiment (b). Såsom framgår av fig. 1 inhíberades syncytium- bíldningen anmärkningsvärt genom 20 A. Kalciumfosfat eller kal- ciumklorid påverkade ej antalet syncytia.

Exempel 10. (a) Cirka 1,5 x 10 ä diameter) på en Limbro-skiva. Cellerna inkuberades vid 36°C un- der 47 timmar i 5 % C02. Till dessa celler sattes 160 pl HSV-1 (7,6 x 104 PPU/ml) och infektioner tilläts under 3 timmar vid 3606. Till dessa infekterade celler sattes olika mängder av 20 A i form av ett kalciumkloridkomplex med en slutlig kalciumjonkon- 5 BHK-celler placerades per brunn (1,5 cm centration av 4,55 mM. Behandlingen fortsattes under 8 timmar.

Cellerna inkuberades därefter under ytterligare 14 timmar. (b) En identisk odling såsom beskrivits ovan (a) framställdes dessutom förutom att en oligodeoxinukleotid som ej har något samband med HSV-1-sekvensen 5'-CAC~GAC-AGA-GGG-CGA-3' framställ- des och inkuberades. Alla andra betingelser var identiska med dem för fallet (a). (c) En likartad odling vari 20 A utelämnades framställdes och inkuberades under samma betingelser som ovan. Denna betecknas 10 15 20 ZS 35 40 466 482 17 här "virus-kontroll".

Cellerna som beskrivits ovan i (a), (b) och (c) fixerades, färgades och antalet syncytia räknades. Resultaten av detta experiment är visade i fig. 2, vari X-axeln (abskissan) beteck- nar mängden DNA uttryckt såsom pg tillsatt varje brunn (dvs "pg DNA/brunn") och Y-axeln (ordinatan) betecknar antalet syncytia uttryckt såsom procent (dvs "% antal 5yncytia") bildat i en cellodling i jämförelse med värdet som erhållits för fallet i experiment (c) för "virus-kontroll", varvid värdet i detta fall alltid anges vara 100 och varvid en kurva dragen genom en hel- dragen linje (a) (-'-) visar resultatet som erhållits i expe- riment (a) under det att en kurva dragen genom en streckad linje (b) (--o--) visar resultatet som erhållits i experiment (b).

Som framgår av fig. 2 uppvisar 20 A en inhiberande effekti på antalet syncytia som bildas genom HSV-1. Av detta experiment kan man draga den slutsatsen att 20 A ínhiberar syncytíum-bild- ningen i närvaro av 4,55 mM kalciumjon. Oligodeoxinukleotider som ej uppvisar något samband med de kända DNA-sekvenserna av herpes simplex-virus uppvisar ej någon inhiberande effekt. Av detta experiment är det uppenbart att minus-strängen av herpes simplex virus-DNA ínhiberar specifikt den cytopatogena effekten av herpes simplex-virus.

Exempel 11. I exempel 9 belyses effekten som uppnås med använd- ning av den syntetiska eikosameren 20 A relaterat till minus-- strängen av HSV-DNA. Detta experiment hänför sig till effektivi- teten av klonat herpes simplex-DNA. Med användning av pBR 322- vektor innehållande HSV-1-DNA (1,45 megadalton, erhållen genom uppslutning av HSV-1-DNA med BamHI) var det möjligt att inhibera syncytiumbildning genom HSV-1. I detta experiment utskars ej HSV-1-DNA från rekombinant-plasmiden. Den denaturerade och par- tiellt uppslutna rekombínant pBR 322 innehållande HSV-1-DNA (0,16 pg) placerades i varje brunn i Limbro-skivan såsom i exempel 9. Effekten undersöktes såsom beskrivits i exempel 9 och en inhiberíng av syncytium-bildning iakttogs. Såsom en kont- roll användes i detta experiment DNA av pBR 322 enbart. I detta kontrollexperiment påträffades ingen inhibering.

Exempel 12. Detta exempel belyser en synergistisk effekt av en blandning av olígodeoxinukleotiderna.

Cirka 1,5 x 105 BHK-celler utbreddes i varje brunn (1,5 cm diameter) i en Limbro-skiva. Cellerna inkuberades i 5 % C02 vid *466 402 ,8 10 15 20 25 30 s6°c under 47-48 timmar och infekrerades med Hsv-1 (7,0 X 104 PFU/ml) i 160 pl MEM. Infektion genomfördes under 3 timmar vid 3o°c 1 s 9 coz. blandning med 20 B (224:1) i ett lösningsmedel och 0,3 ml av denna lösning anbringades på cellerna i närvaro av 4,55 mM Efter infektionen löses 20 A enbart eller i kalciumjon. Exponeringen av dessa celler för 20 A och 20 B ge- nomfördes under 8 timmar. A Dessutom tilläts cellerna mottaga identiska behandlingar med dem som beskrivits ovan förutom att 20 A och 20 B var från- varande. Detta betecknas här såsom virus-kontroll.

Cellerna fixerades, färgades och antalet syncytia räknades.

Resultaten av dessa experiment är visade i fig. 3, vari X-axeln (abskissan) betecknar mängden DNA uttryckt såsom pg tillsatt varje brunn (dvs "pg DNA/brunn") och Y-axeln (ordinatan) beteck- nar antalet syncytia uttryckt såsom procent (dvs "% syncytia- antal") bildat i en cellodling i jämförelse med värdet som erhål- lits för fallet "virus-kontroll", varvid värdet i detta fall all- tid sättes till 100, och varvid en kurva dragen genom en heldra- gen linje betecknad "20 A" (-o-) visar att resultatet_erhållits med experimentet med användning av 20 A enbart under det att en kurva drageh genom en heldragen linje betecknad "20 A + 20 B (2Z4:1)" (---) visar att resultatet erhållits med experimentet med användning av en kombination av 20 A och 20 B i förhållandet 224:1. Såsom framgår av fig. 3 var observerad in vitro-effekt starkare när blandningen av 20 A och 20 B användes jämfört med fallet med användning av enbart 20 A. Av detta resultat kan man draga den slutsatsen att samtidig användning av minus-strängatDNA som motsvarar ett parti uppvisande en annan DNA-sekvens av minus- strängat DNA av herpes simplex-virus kan signifikant öka effek- tiviteten såsom anti-vírala medel.

Exempel 13. oligodeoxinukleotider av NS 1 på den cytopatogena effekten av influensa-virus. Undersökningsresultaten är visade i tabell 3 Detta exempel belyser effekten av (-)-strängade och undersökningsmetoden beskrives närmare nedan. f' Tabell 3 Oligodeoxinukleotider Relativt värde relaterat till (pg/ml) antalet levande celler 0 0,21 0,02 0,49 1,30 0,49 5,00 0,49' Whirl 10 15 20 25 30 35 40 466 482 19 Svinnjure-Kitazato (SKK)-celler (1,5 x 105/0,1 ml) odlades i MEM innehållande 5 % fetalt kalvserum och utbreddes i varje brunn (0,5 cm diameter) på en mikroplatta. Cellerna inkuberades under 24 timmar vid 3s,s°c 1 5 % coz-atmosfär 1 ovanstående medium. Mediet avlägsnades därefter och 100 pl av ett medium innehållande oligodeoxinukleotiden (20 C) sattes till varje brunn och cellerna inkuberades under 24 timmar i 5 % COz-atmos- fär. Lösningen avlägsnades därefter och 50 pl av ett medium inne- hållande 10 TCID50-enheter av influensa A sattes till varje brunn. Dessutom sattes 50 pg av odlingsmediet innehållande olika mängder av 20 C till varje brunn. Cellerna inkuberades ytterligare under 48 timmar. Mediet avlägsnades därefter och 100 pl Hanks lösning innehållande 0,1 % neutralt rött sattes till varje brunn och cellerna inkuberades under 1 timme vid 35,50C i en inkuba-' tionsanordning med 5 % C02. Lösningen avlägsnades därefter och cellerna tvättades med 10 pl 80-procentig etanol följt av till- satsen av 50 pl 0,1 N HCl. Det relativa antalet levande celler mättes genom optisk absorption vid 577 nm med ELISA. De levande cellerna tar upp nentralt.rött.nnder det att icke levande celler ej gör detta. Följaktligen gäller att ju högre den optiska den- siteten är desto högre är antalet levande celler.

Följande exempel 14-20 visar effektiviteten in vivo vid användning av olígodeoxinukleotiderna såsom ett anti-viralt medel. axemgei 14. cirka 1 X 104 Pau Hsv-1 (F-stam) 1 so P1 MEM-suspen- sion injícerades i de intracerebrala håligheterna hos tre veckor. gamla BALB/C-möss. Virussuspensionen innehöll olika mängder 20 A.

Dessutom injicerades 200 pl MEM-lösning innehållande 1 % peni- cillin, streptomycín och 2 mM glutaminsyra och olika mängder av 20 A dagligen under tre dagar i íntraperitoneala håligheter med början en dag efter injektionen med HSV-1. Den procentuella död- ligheten på den 7:de dagen beräknades. Resultatet av experimentet är visat i fig. 4, vari X-axeln (abskissan) betecknar mängden DNA uttryckt såsom pg injicerat i varje mus (dvs "pg DNA/mus") och Y-axeln (ordinatan) betecknar dödligheten uttryckt i procent i jämförelse med vad som erhållifs för fallet "kontroll" varvid möss erhöll injektion av samma lösning men utan 20 A och dödlig- heten för fallet "kontroll" alltid sattes till 100. Såsom är vi- sat i fig. 4 reducerades dödligheten beroende på mängden 20 A som administrerades.

Diagrammet indikerar dödligheten uttryckt i procent i \~4e6 482 10 15 ~~~~-20 25 20 jämförelse med gruppen av kontrollmöss som ej erhöll något 20 A.

Exempel 15. Cirka 1 X 104 PFU HSV-1 (F-stam) i 30 pl MEM-lös- ning innehållande olika mängder av 20 A injicerades i de intra- cerebrala håligheterna hos 3 veckor gamla BALB/C-möss. Dessutom injicerades 200 Pl av en lösning innehållande olika mängder av 20 A, 1 % intraperitonealt en gång per dag med början den första dagen penicillin och streptomycin, och 2 mM glutaminsyra efter injektionen_av HSV-1.

Behandlingen fortsattes under 6 dagar i följd. Dödligheten hos möss 64-68 timmar efter injektionen av HSV-1 undersöktes.

Resultaten anges i tabell 4.

Tabell 4 Dos Dödlighet hos möss 5/19 0,224 pg/mus 0/9 2,240 pg/mus 0/10 Såsom framgår av denna tabell dog i kontrollgruppen 5 möss av totalt 19 möss utan administrering av 20 A. Möss som erhöll antingen 0¿224 pg av 20 A eller 2,240 pg av 20 A dog däremot ej vid denna tidpunkt (totalt 19 möss behandlades i de två fallen).

Exempel 16. Cirka 5 X 104 PFU HSV-1 (F-stam) i 30 pl MEM-lös- ning innehållande olika mängder av 20 A injicerades i de intra- cerebrala håligheterna hos 3 veckor gamla BALB/C-möss. Dödlighe- ten hos mössen 64-68 timmar eller 71-78 timmar efter injektionen -undersöktes. Resultaten visas i tabell S.

Tabell 5 Dödlighet mellan 64 och 68 timmar Dödlighet mellan 71 och 78 timmar Dos -- 3/10 3/10 1,12 pg/mus 0/10 2/10 11,2 pg/mus 0/10 o/10 Såsom framgår av denna tabell dog 3 möss av totalt 10 möss i kontrollgruppen som ej erhöll 20 A. Dödligheten hos mössen i gruppen som mottog virus i närvaro av 20 A minskades däremot höggradigt.

Exempel 17. Cirka 5 x 104 PFU av HSV-1 (F-stam) i 30 pl MEM- lösning innehållande olika mängder 20 A injicerades i de intra- mi: 10 15 20 25 M 466 482 cerebrala haligheterna i 3 veckor gamla BALB/C-möss. Fran dagen efter injektion av 30 pl MEM-lösning innehållande en given mängd av 20 A injicerades dessutom 1 % penicillin och streptomycin och 2 mM glutaminsyra i de intracerebrala håligheterna.

Behandlingen fortsattes under 2 dagar och dödligheten hos mössen undersöktes vid olika perioder efter injektionen av virus.

Resultaten anges i tabell 6.

Tabell 6 Dos Mellan Dödlighet Mellan 64 och 68 h mellan 88 och 92 h 71 och 78 h ___. 1/10 3/10 7/10 1,12 pg/mus 0/20 2/20 5/20 Som framgår av denna tabell var dödligheten hos kontroll- mössen som ej mottog 20 A signifikant högre än bland sådana möss som mottog 20 A. Fastän effektiviteten av 20 A uppenbarligen minskar vid 88-92 h efter injektion,var dödligheten fortfarande högre bland kontrollmössen till och med under dessa betingelser.

Exempel 18. Cirka 1 X 106 PFU HSV-1 (F-stam) i 200 pl Mäklömüng innehållande 1,12 pg av 20 A injicerades i de peritoneala hålig- heterna hos 3 veckor gamla BALB/C-möss.

Dessutom injicerades cirka 3 eller 2 timmar före HSV-1- injektionen och en dag efter injektionen av HSV-1, 200 pl av MEM-lösning innehållande olika mängder av 20 A intraperitonealt i de infekterade mössen. Intraperitoneal injektion av 20 A fort- sattes under 2 dagar. Dödligheten vid 211 och 259 timmar efter injektionen av HSV-1 undersöktes. Resultaten är visade i tabell 7.

Tabell 7 Dos Dödlighet vid Dödlighet vid 211 h 259 h -- 1/10 2/10 0,224 pg/mus 0/10 0/10 Som framgår av denna tabell dog en av totalt 10 (vid 211 timmar efter injektionen) eller 2 av totalt 10 (vid 259 timmar efter injektionen) av mössen när 20 A ej administrerades. Nössen som erhöll 0,224 pg av 20 A dog däremot ej under identiska be- tingelser. 'f4e6 482 10 15 20 25 30 35 ZZ Exempel 19. Cornea hos 3 veckor gamla BALB/C-möss skadades genom skrapníng 5 gånger med en skarp injektionsnål. På denna skadade cornea administrerades 30 pl MEM-lösning innehållande 1 % penicillin, streptomycin och 2 mM glutaminsyra, 5 % kalv- serum och 3 x 104 PFU HSV-1 (F-stam). De behandlade mössen upp- delades i fyra grupper (A), (B), (C) och (D) såsom indikeras nedan och ögonen hos dessa möss undersöktes och resultaten regist- rerades genom fotografering.

(A) På corneal-membranet hos dessa möss droppades 10 pl MEM-lösning innehållande 22,4 pg av 20 A/ml 2 timmar före ad- ministreringen av HSV-1 (F-stam). Dessutom genomfördes denna behandling varje dag med början dagen efter HSV-1 (F-stam).

Dessa möss erhöll ndministreringen av dessutom droppar av en lösning inne- hållande cortisonacetat (2 mg/kg mus-kroppsvikt) 5 timmar före ínjektionen av HSV-1 (F-stam). Cortisonbehandlingen fortsattes också varannan dag. H (B) Mössen påfördes i ögonen 10 pl MEM-lösning innehål- lande 22,4 pg av 20 A/ml 2 HSV-1 (F-stam). Behandlingen med 20 A fortsattes varannan dag. timmar före admínístreringen av (C) Mössen erhöll 30 pl av en lösning innehållande corti- sonacetat (2 mg/kg kroppsvikt) såsom beskrivits i (A).

(D) Mössen erhöll på corneal-membranen 10 pl av MEM-lös- ning 2 timmar före HSV-1-behandling (F-stam). Från och med dagen efter HSV-1 (F-stam)-behandlingen fortsattes dessutom en likar- tad behandling med MEM-lösning varannan dag. du 0 Tillståndet hos ögonen och området som omger ögonen hos varje mus undersöktes med speciell uppmärksamhet på inflammation och tillslutna ögon med patologiska symptom. Undersökningen genomfördes den 4:e, 7:e eller 12:e dagen efter behandlingen.

Mössen tillhörande gruppen (A) och gruppen (B) hade betydligt mindre patologiska symptom hos ögonen och omgivande områden jäm- fört med sådana möss som tillhörde gruppen (C) och gruppen (D), som ej erhöll 20 A. X Man kan vidare draga den slutsatsen att effektiviteten av 20 A ej påverkades genom administreringen av cortison.

Följande exempel 20-22 belyser framställningen av olika typer av anti-virala medel enligt föreliggande uppfinning. 10 15 20 25 30 35 40 466 482 23 Exempel 20. En oligodeoxinukleotid identisk med 20 A erhållen i exempel 3 syntetiserades enligt triestermetoden (med använd- ning av en triester av motsvarande nukleotider i vätskefas).

Till 2 g av 20 A som syntetiserats sålunda sattes en isotonisk MEM-lösning till en slutlig volym av 1 liter lösning för injek- tion och lösningen satsades i ampuller för framställning av in- jektionsberedningarna. Denna injektionsberedning innehåller 2 mg 20 A per ml och administrerades subkutant i en dos av 1-5 ml, när ett symptom iakttogs,så nära det infekterade partiet som möjligt.

Exempel 21. i exempel 4 syntetiserades enligt triestermetoden. Till 10 g av En oligodeoxinukleotid identisk med 20 B erhållen sålunda syntetiserad 20 B sattes en isotonisk MEN-lösning till en slutvolym av 1 liter, som utgör en förrådslösning för en 1-procentig beredning av ögondroppar. Denna beredning av ögon- droppar anbringades flera gånger per dag i en dos av 2-3 droppar när ett symptom iakttogs.

Exempel 22. En oligodeoxinukleotid identisk med 20 A erhållen i exempel 3 syntetiserades enligt.triestermetoden. 1 g av så- lunda syntetiserad 20 A mals till ett fint pulver och 999 g av renat kakaosmör sättes därefter till det fina pulvret. Bland- ningen knådades i ett vattenbad vid 600C och formades därefter för bildning av suppositorier som var och en vägde 2 g.

Varje suppositorium innehåller 2 mg av 20 A och användes i enlighet med symptomet.

Följande exempel 23 och 24 belyser säkerheten av det anti-virala medlet enligt föreliggande uppfinning.

Exempel 23. När 20 A administrerades i en mängd av 100 pg/kg till BALB/C-möss intraperitonealt iakttogs ingen ändring hos försöksdjuret.

Exempel 24. Såsom ett test som bekräftar effekten som beskri- ves i föregående exempel genomfördes samma test såsom beskrives i exempel 19, förutom att HSV-1 ej användes. I detta test påträf- fas ingen skillnad mellan gruppen av testdjur vartill 20 A har administrerats och sådana vartill 20 A ej har administrerats.

Med hänsyn till föregående exempel är det uppenbart att de anti-virala medlen enligt föreliggande uppfinning är säkra i en effektiv dos av oligo- och polydeoxinukleotiderna.

Följande exempel innefattas för att índikera att in vitro- protein-syntes-systemet verkligen inhiberas genom hybridisering “'4ee 482 ' M 10 15 20 av mRNA med (-)-sträng-oligodeoxinukleotid. Dessa resultat be- kräftar den teoretiska grunden för föreliggande uppfínning¿ Exemgel ZS (Referensexempel 1) Detta exempel belyser inhiberíngen av polyfenylalanin- syntes beroende på poly-U genom oligodeoxiadenylsyra.

Reaktionsblandningen (40 P1) innehöll 140 pg poly-U, C14-fenylalanin (105 cpm, 300 PCi/umol, E. coli-extrakt (fram- ställt enligt Nirenberg och Mathaei, Proc. Nat. Acad. Scí., USA 47, 1588 (1901)), 15 mM Mg-acetat, 1 mN ATP, 1 mM kreatin- fosfat, 1 ng kreatinfosfokinas, 10 mM tris-HCl (pH 7,5) och olika mängder av oligodeoxiadenylsyra. Reaktíonsblandníngarna placerades i 1,5 ml Eppendorf-rör och inkuberades vid 37oC un- der 30 minuter. Mängden polyfenylalanin som syntetiserades mät- tes genom räkning av radioaktiviteten som är olöslig i varm (95°C) 10-procentig triklorättiksyra. Räkningen genomfördes i en vätske-scjntillationsrüknare. Den procentuella inhiberíngen beräknades i jämförelse med värdet av polyfenylalaninsyntesen i frånvaro av olígodeoxiadenylsyra. Resultaten visas i tabell 8.

“ Iabell 8 lnhibitor Dos Inhibering av (pg) polyfenylalanin-syntes (%) Kontroll - 0 Polydeoxíadenyl- syra 50 98 Oligodeoxiadenyl- syra (10 nukleotider) 100 88 Oligodeoxiadenyl- syra (9 nukleotider) 100 89 Olígodeoxiadenyl- syra (8 nukleotider) 100 15 Oligodeoxiadenyl- syra (7 nukleotider) 100 0 Såsom framgår av tabell 8 är polydeoxiadenylsyran som hybridiserar med polyuridylsyra en avsevärt starkare inhibítor av polyfenylalaninsyntes. Det framgår av denna tabell att oligodeoxiadenylsyra med en kedjelängd av mer än 9 nukleotider uppvisar stark inhibitoreffekt. 10 15 20 25 466 482 25 Exempel 26 (Referensexempel 2) Experimentet som beskrives nedan är en demonstration av att oligodeoxinukleotider kan inhibera eucaryot-mRNA-aktivitet genom bildning av hybrider med detta mRNA. Reaktionsblandningen (30 pl) innehåller 4,2 mM kalciumfosfat, 2 mM dimetyltiotreitol (DTT), 0,08 mM av varje aminosyra (förutom metionin), 6 mM kal- ciumacetat, 8 mM magnesiumacetat, 4,5 pg spermidin, 0,1 PCi 358-metionin och 10 pl av ett kanin-retikulocyt-extrakt fram- ställt enligt Jackson och Pelham (Europ. J. Bíochem. 67, 247-256, 1976). Inhibitorn löstes i 21 mM HEPES-lösning och sattes till reaktionsblandningen sasom beskrives i tabell 9.

Tabell_2 Inhibitor Dos % inhibering % inhibering (1 ) av q=globin- av ß-globin- fg syntes syntes Kontroll -- 0 0 Genom-DNA av Aéglobin 0,06 60 0 Genom-DNA av - Û-globin 0,06 0 65 Kalvtymus-DNA 0,06 10 10 15 oligodeoxi- nukleotíd av afglobin-genom-DNA 0,06 88 0 15 oligodeoxi- nukleotid av M 13 0,06 5 2 Som framgår av tabell 9 inhiberar (-)-strängat DNA av qfglobin specifikt ¿(-globin-syntesen under det att (-)-strängat DNA av ßeglobin inhiberar ß-globin-syntesen specifikt. Ingen signifikant inhibering iakttogs med kalv-tymus-DNA. Av dessa ob- servationer kan man draga den slutsatsen attDNA från eucaryot- gen (-stfln@)inhiberar specifikt syntesen av proteinet kodat genom dennagmh Oligodeoxinukleotiden med kedjelängden 15 mot- svarande den NH2-ändstående aminosyrasekvensen av qßglobín ínhi- berade syntesen av aëglobin. Denna observation indikerar att enkel-stflhgatlm (-sträng) med kedjelängden så kort som 15 är tillräcklig för den specifika inhiberingen av syntesen av respek- tive protein. Kontroll-olígonukleotiden (M 13-fag-DNA med kedje- längden 15 nukleotíder) visade ej någon signifikant inhiberande effekt. ~“'4ee 482 'M Det är uppenbart att föregående representativa exempel kan varieras inom ramen för föreliggande unsökan_süvä1 vad be- träffar virus-typerna och kodningsområdet av fackmannen för uppnående av väsentligen samma resultat. 5 Många variationer och modifikationer av uppfinningen är följaktligen möjliga och uppfinningen är följaktligen ej begrän- sad till de speciella utföringsformerna som beskrivits ovan.

Claims (10)

466 482 2.? Patentkrav

1. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d därav, att den väsentligen består av en effektiv anti-viral mängd av en oligodeoxinukleotid eller polydeoxinukleotid, som uppvisar en sekvens, som är identisk med ett parti av DNA, som är hybridiserbart med budbärar-RNA hos herpes-virus, vilken oligodeoxinukleotid eller polydeoxinukleotid kan hybridiseras med budbärar-RNA:t; samt en farmaceutiskt godtagbar bärare.

2. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att viruset utgöres av herpes simplex~virus.

3. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att viruset utgöres av herpes simplex-virus-1.

4. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att oligodeoxinukleotiden eller polydeoxinukleotiden är hybridiserbar med ögonblickligt, tidigt budbärar-RNA från herpes simplex-virus. _

5. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att oligodeoxinukleotiden eller polydeoxinukleotiden är hybridiserbar med en non-strukturell gen hos herpes-virus.

6. Komposition enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d därav, att den non-strukturella genen är ICP 4.

7. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att oligodeoxinukleotiden eller polydeoxinukleotiden har sekvensen 3'-CGC-AGC-CTC-TTG-TTC-GTC~GC-5'.

8. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att oligodeoxinukleotiden eller polydeoxinukleotiden har sekvensen 3'-GCA-CCC-GGG-ACC-TTT-ACC-GC-5'.

9. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att den föreligger i form av en injektionslösning, en lokal beredning eller en lösning av ögondroppar.

10. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innehåller en blandning av oligodeoxinukleoti- derna eller polydeoxinukleotiderna.