JP2003527419A - 抗ｈｉｖ活性を有する化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる感染症を治療するための、抗ウイルス活性を有する分子の使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、ウイルス感染症の治療に関する。より詳細には、本発明は、インフ
ルエンザ・ウイルスに対するその抗ウイルス活性が既知である分子を、ヒト免疫
不全症の原因であるウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる感染症の治療に
使用することに関する。

【０００２】 レトロウイルスＨＩＶは、免疫系の進行性破壊（後天的免疫不全症候群；ＡＩ
ＤＳ）ならびに中枢神経系および末梢神経系の変性を誘導する複合疾患の病因因
子である。

【０００３】 レトロウイルスは、１）ウイルスのＲＮＡゲノムより、二本鎖ｃＤＮＡコピー
の生成をもたらす逆転写、および２）宿主ＤＮＡ中へのｃＤＮＡの組み込みとい
う、ウイルス複製サイクルの２つの面で、それ以外のウイルスとは異なる。組み
込みは、インテグラーゼと特異的なウイルスＤＮＡ配列との安定な複合体の構築
、該ウイルスＤＮＡの各３’末端から末端のジヌクレオチドを除去を行う、引き
続いた鎖内のヌクレオチド結合分解的プロセシング、および該ウイルスＤＮＡの
３’末端の細胞ＤＮＡへの共有結合的な結合がなされる鎖移動を含んでなる、多
段階過程である。該組み込み機構は、現在、ＨＩＶ感染症の治療に使用される新
規な化合物を開発するため、広範囲に研究されている（１〜６）。細胞培養物中
におけるＨＩＶに対して活性であるインテグラーゼ阻害剤の発見は、特に興味深
い。これに関連して、Ｈａｚｕｄａは、その抗ウイルス活性が組み込みに対する
その作用に直接関連している、新規なインテグラーゼ阻害剤の特定を報告した（
７）。

【０００４】 ジフェニルケトアルデヒド誘導体は、その抗ウイルス活性が既知である、一群
の化合物である（８）。特に、キセナラミン（ｐ−（α−エトキシ−ｐ−フェニ
ルフェナシル−アミノ）安息香酸）およびキセナルジアール（４，４’−ビス−
ビフェニルグリオキサール・二水和物）の化合物は、Ａ−ＰＲ８ インフルエン
ザ・ウイルス（９）、ＭＨＶ−３ 肝炎ウイルス、ならびに種々のアルボウイル
ス、ポックスウイルス、ニタウイルスおよびミクソウイルスに対して活性である
ことが明らかにされた。

【０００５】 本発明者らは、ウイルスのインテグラーゼに対する阻害活性を有する新規な化
合物の広範な探索を実施し、そして、いくつかのジフェニルケトアルデヒド誘導
体が、培養された感染細胞におけるＨＩＶウイルスの増殖を低下させる、そして
場合によっては停止させることさえもできることを見出した。様々な試験した化
合物の中でも、キセナラミン、キセナルジアールおよびキセナル酸は、顕著な殺
ウイルス活性を示し、そして、それよりも低い程度であるものの、インビトロに
おいて、ウイルスの複製に対する阻害活性を示した。化合物キセナルジアールが
、特に効果的であることが判明した。

【０００６】 したがって、第一の形態において、本発明は、ＨＩＶ感染症の治療用の医薬品
を調製するための、キセナラミン、キセナル酸、および好ましくはキセナルジア
ールの使用に関する。

【０００７】 化合物の活性をアッセイするために使用されたインビトロ培養物において、キ
セナルジアールは、細胞内および細胞外のウイルス含有量を著しく減少させるこ
とができた。より正確には、細胞によって放出されたウイルスは、コントロール
と比較すると、２４時間の遅れで培養液中に現れること、また、細胞内のウイル
ス含有量は、コントロールと比較して、感染後７２時間までは、１対数単位以上
、抑制されることが観察された。その後、培養液中のウイルス含有量は、該化合
物の漸進的な分解の結果として、コントロールにおける値に匹敵してきたと考え
ることができる。しかし、感染の４８時間後の、キセナルジアールのさらなる投
与は、もう一度、細胞内および細胞外のウイルス量を、１２０時間まで顕著に低
下させることが観測されている。

【０００８】 全体から見て、該実験結果は、キセナルジアールは、ＨＩＶウイルスの複製機
構に対する阻害活性とともに、ＨＩＶウイルスに対する殺ウイルス作用を発揮し
得ることを確証している。より詳細には、キセナルジアールは、ウイルスの生物
学的サイクルの細胞内段階を妨害することが明らかにされた。この分子機構は未
だ完全には解明されていないものの、ＨＩＶの増殖に対する、この薬物によって
発揮される阻害効果は、多分、インテグラーゼに対する阻害活性に起因している
。とにかく、本発明は、本明細書中に開示される抗ＨＩＶ活性を有する該化合物
の作用機序では、拘束されない。

【０００９】 キセナル酸およびキセナラミンに関しては、細胞内のウイルス複製に対するそ
の阻害効果は、同じ実験条件下では、キセナルジアールの阻害効果よりも低いも
のの、それらは、細胞外のウイルス粒子に対して顕著な殺ウイルス活性を発揮す
ることは見出されている。

【００１０】 したがって、キセナルジアール、キセナラミンおよびキセナル酸は、ＨＩＶ感
染症および関連する症状、特に、ＡＩＤＳの治療において、使用することができ
る。さらには、それらは、症候性および無症候性の両方のＡＲＣ（「ＡＩＤＳ関
連症候群」）などのＨＩＶ感染関連症状の治療において、あるいは、ＨＩＶウイ
ルスとの接触が疑われる際にも、使用することができる。

【００１１】 治療における使用のため、化合物は、好適には、製薬学的に許容される賦形剤
および担体と処方される。経口投与、非経口投与または吸入投与に適合する剤形
は、例えば、カプセル、粉末剤、顆粒、坐薬、溶液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤
、注射液、噴霧用の溶液剤または懸濁剤である。該医薬組成物は、例えば、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、 ＮＹ、 米国、 第ＸＶＩＩ版）
に記載されるような、常法に従って調剤される。

【００１２】 投薬量は、該疾患の重篤度、患者の全般的な健康状態および年齢に依存して、
変化するものの、通常は、単回または多数回投薬において、体重１Ｋｇあたり化
合物１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲、好ましくは、１ｍｇ／Ｋｇ〜１００ｍｇ／
Ｋｇの範囲とされる。

【００１３】 本発明の化合物はまた、現在利用可能な、他の抗ＨＩＶ治療薬と併用すること
もできる。例として、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル
などの、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤；アジドチミジン、ジデオキシシチジンおよ
びジデオキシイノシンなどの、ヌクレオシド系または非ヌクレオシド系逆転写酵
素阻害剤、あるいは、他のインテグラーゼ阻害剤（例えば、１０を参照のこと）
。

【００１４】 したがって、本発明はまた、ＨＩＶ感染症の治療で、同時に、分離して、また
は順次に使用される、組み合わせ製剤の形態の、キセナルジアール、キセナラミ
ンおよびキセナル酸からなる群から選択される化合物と、プロテアーゼ阻害剤、
逆転写酵素のヌクレオシド系または非ヌクレオシド系阻害剤、インテグラーゼ阻
害剤からなる群から選択される少なくとも１つの抗ＨＩＶ剤とを含んでなる、医
薬組成物に関する。

【００１５】 下記の実施例は、本発明をより詳細に説明する。

【００１６】 実施例１ 材料 インプラントに由来する、４日目の静置チューブ内のリンパ芽球培養物（２０
０，０００細胞／ｍｌの接種）を使用した。２０％の脱補体処理した子ウシ血清
培地を添加したラクトアルブミン培地を、培養培地（ＴＣ）として使用し、また
、培養物を接種した後の維持培地（ＴＭ）として、１％のウシ結晶化アルブミン
および２％の子ウシ血清を補った１９９培地を使用した。すべての培地には、ペ
ニシリン（１００Ｕ．Ｉ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ
）を添加した。ウイルスの希釈は、１９９培地のみで行った。

【００１７】 薬物 キセナラミン（ｐ−（α−エトキシ−ｐ−フェニル−フェナシル）アミノ安息
香酸）と、キセナル酸（ｐ−（４−ビフェニル−グリオキシリデン）−アミノ安
息香酸）は、用量１２．５μｇ、キセナルジアール（４，４’−ビス−ジフェニ
ルグリオキサール水和物）は、用量２５μｇとした。

【００１８】 各薬物について使用された用量は、以前の実験において確定された、培養物に
許容される最大用量である。

【００１９】 該化合物を、カーボワックス２００中に、１００℃で１５分間加熱して、溶解
した。

【００２０】 抗ウイルス活性アッセイの一般的スキーム １０^-1に希釈された懸濁物の形態の、ウイルスを含有する９．９ｍｌの培養液
に、化学療法剤（２ｍｇのキセナルジアール、２００μｇ／ｍｌ最終濃度；２３
ｍｇのキセナラミン、２３０μｇ／ｍｌの最終濃度）を含む、または含まない、
０．１０ｍｌのカーボワックスを添加した。

【００２１】 得られた懸濁物は、反復して振とうしながら、３７℃で１時間インキュベーシ
ョンした。

【００２２】 インキュベーション後、それぞれの懸濁物について、培養液での段階的なｌｏ
ｇ₁₀希釈を行った。続いて、該懸濁物を、各希釈毎に８本のチューブからなる群
で、リンパ球培養物（０．１０ｍｌ）に接種し、それぞれの試験物についてのＬ
Ｄ₅₀を評価した。

【００２３】 結果を表に報告する（示される数字は、３回の実験の平均である）。

【００２４】

【表１】

【００２５】 ジフェニルケトアルデヒド誘導体が発揮するウイルス不活化作用は、１〜１．
５Ｕｌｏｇ₁₀の間で変化し、また、それは、キセナルジアールの方がキセナラミ
ンよりも若干明瞭である。使用した実験条件下では、（コントロール懸濁物と比
較して）、３７℃で１時間露呈した後において、既に、ウイルス力価（１Ｕｌｏ
ｇ₁₀）およびＬＤ₅₀の顕著な低下が認められる。

【００２６】 この表は、該ウイルスは、試験した化合物の直接的な不活化作用に対してイン
ビトロではあまり影響を受けないことが明らかになる。

【００２７】 該化合物に曝された際の、該ウイルスの病原活性の低下は次の通りである（コ
ントロールと比較して、対数値の％として表す）： キセナルジアール−低ウイルス力価 ４２．８％； キセナルジアール−高ウイルス力価 ８．３％； キセナラミン−低ウイルス力価 ２８．５％； キセナラミン−高ウイルス力価 ８．３％。

【００２８】 手順 被験化合物存在下におけるウイルス増殖曲線を評価するため、下記の手順を使
用した。培養物を、約１：１のＬＤ₅₀／細胞比を得るための、細胞病原性量を含
有する１ｍｌのウイルス液で感染させた。＋３６℃で感染後１時間経過した後、
ハンクス平衡塩生理的食塩水溶液で繰り返し洗浄し、ウイルス液を、コントロー
ル群ではＴＭで置き換え、試験培養物ではＴＭ＋薬物で置き換えた。

【００２９】 時間間隔毎に、３つの培養物からアリコートを採取し、ハンクス溶液で洗浄し
て、そして、１ｍｌのＴＭを加え、−３０℃で凍結した。

【００３０】 実験の終了後、培養液の解凍および再凍結を２回行い、各アリコートをプール
し、その後、凍結前に分離された対応する液と同時に力価を測定した。

【００３１】 結果 結果を図１〜４にプロットする。

【００３２】 図１：感染後１時間の培養物に、用量１２．５μｇ／ｍｌで添加した、キセナ
ラミン存在下におけるウイルス増殖曲線； 図２：感染後１時間の培養物に、用量１２．５μｇ／ｍｌで添加した、キセナ
ル酸存在下におけるウイルス増殖曲線； 図３：感染後１時間の培養物に、用量２５μｇ／ｍｌで添加した、キセナルジ
アール存在下におけるウイルス増殖曲線； 図４：感染後１時間および４８時間の培養物に、用量２５μｇ／ｍｌで添加し
た、キセナルジアール存在下におけるウイルス増殖曲線。

【００３３】 これらのプロットは下記のことを示している： ・キセナラミンで処理した培養物では、液中へのウイルスの出現が、約２４時
間遅れる； ・キセナルジアールで処理した培養物では、細胞内および細胞外のウイルス含
有量が著しく変化している。細胞内のウイルス量は、７２時間まで、コントロー
ルよりも、１Ｕｌｏｇを超えて低い；その後、その低下は、徐々に減少し、実験
終了時には消失する。細胞から放出されるウイルスは、コントロールと比較し、
２４時間遅れて、液中に出現する。感染の４８時間後に、培養培地を、２５μｇ
／ｍｌのキセナルジアールを含有する１ｍｌのＴＭで置換した際には、コントロ
ールと比較して、細胞内および細胞外のウイルス量の低下が、１２０時間まで認
められる。

【００３４】 実施例２ キセナルジアールのＨＴＬＶ IIIＢ阻害活性を、リンパ球の培養物において
試験した。％ウイルス阻害を、下記の手順に従ってＰＣＲによって決定した。

【００３５】 ＤＮＡ調製 ４００μｌの溶解液を使用し、ＤＮＡを５×１０⁴個のリンパ球から抽出し、
そして、５６℃／６０秒および９２℃／１５秒でインキュベーションした。その
後、混合物を室温で冷却し、４℃で保存した。

【００３６】 プローブ オリゴヌクレオチドＳＫ１９（４１塩基−増幅されたプロ・ウイルスＤＮＡの
内部配列に対応する）を合成し、２０μＭの最終濃度で水に溶解して、ポリヌク
レオチドキナーゼおよび³²Ｐ−ＡＴＰを用いて５’末端を標識した。

【００３７】 ＰＣＲ 試薬：Ｔａｑポリメラーゼ ５Ｕ／μｌ、デオキシヌクレオチド（１０ｍＭ
ｐＨ７．０）、ＫＣｌ ２Ｍ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １Ｍ ｐＨ８．３、ＭｇＣｌ₂ １Ｍ、ゼラチン、プライマー １５μＭ、プローブ １５μＭ、³²Ｐ−ＡＴＰ
、ポリヌクレオチドキナーゼ １０Ｕ／μｌ、ＤＮＡ １μｇ〜３μｇ、ＥＤＴ
Ａ ０．２５Ｍ、プロテイナーゼＫ １０ｍｇ／ｍｌ、ＳＤＳ １０％、酢酸ア
ンモニウム ２Ｍ、ＳＳＣ ２０×、ＴＲＩＳ−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ １０×、
ＴＲＩＳ−酢酸塩−ＥＤＴＡ １０×、ローディング緩衝液 ６×（ブルー・ブ
ロモフェノール ０．２５％、キシレンシアノール ０．２５％、スクロース
４０％、ＴＲＩＳ １０ｍＭ ｐＨ８．０）、溶解液混合物（プロテイナーゼＫ ６０μｇ／ｍｌ、ＮＰ−４０ ０．５％、ツイーン２０ ０．５％、ＴＲＩＳ ５ｍＭ ｐＨ８．３、ＭｇＣｌ₂ １．２５ｍＭ、ＫＣｌ ５０ｍＭ）； 試薬調製：ヌクレオチド：１２５μｌの各ヌクレオチド（１０ｍＭ）をＨ₂Ｏ
で１ｍｌに希釈した（最終濃度 １．２５ｍＭ）。緩衝液 １０×：ＫＣｌ（２
Ｍ）−２５０μｌ、ＴｒｉｓＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．３）−１００μｌ、ＭｇＣｌ ₂ （１Ｍ）−２０μｌ、ゼラチン−１０ｍｇを、Ｈ₂Ｏで１ｍｌに希釈した。

【００３８】 オリゴヌクレオチド対：オリゴヌクレオチドのＳＫ３８およびＳＫ３９を合成
し、精製して、２００μＭ〜３００μＭの濃度に溶解した。

【００３９】 反応：緩衝液 １０×、ヌクレオチド（１．２５ｍＭ）、１５μＭのオリゴヌ
クレオチドプライマーＳＫ３８およびＳＫ３９、溶解液、５Ｕ／μｌのＴａｑポ
リメラーゼを混合して、９０℃／６０秒の変性、５５℃／３０秒のアニーリング
、７２℃／３０秒の重合、該サイクルを３０回繰り返した。

【００４０】 結果を下記の表に報告する。

【００４１】

【表２】

【００４２】

【表３】

【００４３】参考文献

【００４４】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 感染後１時間の培養物に、用量１２．５μｇ／ｍｌで添加した、キセナラミン
存在下におけるウイルス増殖曲線を示す。

【図２】 感染後１時間の培養物に、用量１２．５μｇ／ｍｌで添加した、キセナル酸存
在下におけるウイルス増殖曲線を示す。

【図３】 感染後１時間の培養物に、用量２５μｇ／ｍｌで添加した、キセナルジアール
存在下におけるウイルス増殖曲線を示す。

【図４】 感染後１時間および４８時間の培養物に、用量２５μｇ／ｍｌで添加した、キ
セナルジアール存在下におけるウイルス増殖曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＩＶ感染症を治療するための医薬品を製造するための、キ
   セナラミン、キセナル酸およびキセナルジアールから選択される化合物の使用。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のキセナルジアールの使用。
3. 【請求項３】 ＡＩＤＳおよび関連疾患の予防または治療の用途の、請求項
   １または２に記載の使用。
4. 【請求項４】 有効量の請求項１に記載の化合物を、異なる抗ＨＩＶ剤とと
   もに含有してなる医薬組成物。
5. 【請求項５】 該抗ＨＩＶ剤が、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤お
   よびインテグラーゼ阻害剤から選択される、請求項４に記載の組成物。