ES2225550T3 - Derivados de difenil cetoaldehida con actividad anti-vih. - Google Patents

Abstract

El uso de un compuesto seleccionado de xenalamina, ácido xenálico y xenaldial, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por VIH.

Description

Derivados de difenil cetoaldehída con actividad anti-VIH.

La presente invención se refiere al tratamiento de infecciones virales. Más particularmente, la invención se refiere al uso de moléculas conocidas por su actividad antiviral frente al virus de la gripe, para el tratamiento de infecciones causadas por el virus causante de la inmunodeficiencia humana (VIH).

El retrovirus VIH es el agente etiológico de una enfermedad compleja que induce la destrucción progresiva del sistema inmunitario (síndrome de inmunodeficiencia adquirida; SIDA) y la degeneración de los sistemas nerviosos central y periférico.

Los retrovirus difieren de los otros virus en dos aspectos del ciclo de replicación viral: 1) la transcripción inversa, que tiene como resultado la producción de una copia de ADNc bicatenario por parte del genoma de ARN viral, y 2) la integración del ADNc en el ADN del huésped. La integración es un procedimiento de varias etapas que comprende el ensamblaje de un complejo estable entre la integrasa y secuencias específica de ADN viral, el posterior procesamiento endonucleolítico para eliminar el dinucleótido terminal de cada extremo 3' del ADN viral y la cadena transferida en la que los extremos 3' del ADN viral están unidos de forma covalente al ADN de la célula. En la actualidad, el mecanismo de integración se ha estudiado extensamente con el objeto de desarrollar nuevos compuestos para usar en el tratamiento de las infecciones por VIH (1-6). De particular interés es el hallazgo de los inhibidores de la integrasa activos frente al VIH en cultivos celulares. A este respecto, Hazuda ha comunicado la identificación de nuevos inhibidores de la integrasa cuya actividad antiviral está directamente relacionada con su efecto sobre la integración (7).

Los derivados de cetoaldehído de difenilo son un grupo de moléculas conocidas por su actividad antiviral (8). En particular, se ha probado que los compuestos xenalamina (ácido p-(\alpha-etoxi-p-fenilfenacil-amino) benzoico) y xenaldial (dihidrato de 4-4'-bis-bifenilglioxal) son activos frente al virus de la gripe A-PR8 (9), el virus de la hepatitis MHV-3 y varias cepas de Arbovirus, Poxvirus, Nitavirus y Mixovirus.

Los inventores han llevado a cabo extensas búsquedas de nuevos compuestos con actividad inhibidora de la integrasa viral y han encontrado que algunos derivados de cetoaldehído de difenilo son capaces de reducir y, en algunos casos de incluso detener, el crecimiento del virus VIH en células infectadas cultivadas. Entre los diversos compuestos probados, se ha descubierto que la xenalamina, el xenaldial y el ácido xenálico mostraban una marcada actividad virucida y, en menor medida, una actividad inhibidora de la replicación viral in vitro. El compuesto xenaldial ha resultado ser particularmente eficaz.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere al uso de xenalamina, ácido xenálico y, preferentemente, xenaldial, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las infecciones por VIH.

En los cultivos in vitro usados para analizar la actividad de los compuestos, el xenaldial fue capaz de disminuir significativamente el contenido viral intra y extracelular. Más exactamente, se observó que el virus liberado por las células aparecía en el fluido 24 horas más tarde de los que lo hacía en los controles y que la cantidad de virus intracelular se redujo en comparación con el control en más de una unidad logarítmica hasta 72 horas tras la infección. Por consiguiente, el contenido en virus de los fluidos del cultivo se puede considerar comparable al del control, como consecuencia de la desactivación progresiva del compuesto. Sin embargo, se ha observado que otra administración de xenaldial 48 horas después de la infección, de nuevo redujo extraordinariamente la cantidad intra y extracelular de virus hasta 120 horas.

En general, los resultados experimentales confirman que el xenaldial es capaz de ejercer una acción virucida contra al virus VIH así como una actividad inhibidora del mecanismo de reproducción de dicho virus. Más particularmente, se ha probado que el xenaldial interfiere en las etapas intracelulares del ciclo biológico del virus. Aunque el mecanismo molecular todavía no se ha aclarado por completo, es muy probable que el efecto inhibidor ejercido por este fármaco sobre el crecimiento del VIH se deba a una actividad inhibidora sobre la integrasa. En cualquier caso, la invención no se limita al mecanismo de acción de los compuestos con actividad anti-VIH descrita en la presente memoria descrip-
tiva.

Con relación al ácido xenálico y la xenalamina, se encontró que ejercían una marcada actividad virucida sobre las partículas virales extracelulares, mientras que su efecto inhibidor sobre la replicación viral intracelular fue menor que el del xenaldial en las mismas condiciones experimentales.

Por tanto, el xenaldial, la xenalamina y el ácido xenálico pueden usarse en el tratamiento de las infecciones por VIH y los trastornos asociados, en particular SIDA. Además, pueden usarse en el tratamiento de los trastornos asociados con la infección por VIH, tales como el CRS ("complejo relacionado con el SIDA"), tanto sintomáticos como asintomáticos, o cuando se sospecha la exposición al virus VIH.

Para el uso en tratamientos, los compuestos se formularán de forma adecuada con excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables. Formas adecuadas de administración oral, parenteral o por inhalación serían, por ejemplo, cápsulas, polvos, gránulos, supositorios, soluciones, suspensiones, jarabes, emulsiones, soluciones inyectables, soluciones o suspensiones para pulverización. Las composiciones farmacéuticas se formularán de acuerdo con técnicas convencionales, como se describe, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., NY, EE.UU., XVII Ed.

Las dosis variarán en función de la gravedad de la enfermedad, el estado general y la edad del paciente, y normalmente variarán entre 1 y 1.000 mg de compuesto por kg de peso corporal, en dosis únicas o múltiples, preferentemente entre 1 y 100 mg/kg.

Los compuestos de la invención también pueden usarse en combinación con otros tratamientos anti-VIH disponibles en la actualidad. como ejemplo, inhibidores de la proteasa del VIH, tales como saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, inhibidores de la transcriptasa inversa, tanto nucleósidos como no nucleósidos, tales como azidotimidina, didesxicitidina y didesoxiinosina, u otros inhibidores de la integrasa (véase, por ejemplo, 10).

Por tanto, la invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas en forma de preparaciones combinadas, para el uso simultáneo, por separado o secuencial en el tratamiento de las infecciones producidas por el VIH, que comprenden un compuesto seleccionado del grupo formado por xenaldial, xenalamina y ácido xenálico, y al menos un agente anti-VIH seleccionado del grupo formado por inhibidores de la proteasa, inhibidores nucleosídicos o no nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores de la integrasa.

El siguiente ejemplo ilustra la invención más detalladamente.

Ejemplo 1 Materiales

Se usaron cultivos de linfoblastos en tubos fijos (inóculo de 200.000 células/ml) al 4º día del implante. Como medio de cultivo (TC) se usó un medio de lactoalbúmina enriquecido con medio con 20% de suero bovino descomplementado y, como medio de mantenimiento (TM), tras la infección de los cultivos, un medio 199 complementado con 1% de albúmina bovina cristalizada y 2% de suero bovino. A todos los medios se añadió penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml). Se llevaron a cabo diluciones virales sólo con el medio 199.

Fármacos

Xenalamina (ácido p-\alpha-etoxi-p-fenilffenacil-amino benzoico), ácido xenálico (ácido p-(4-bifenil.glioxilideno)-amino benzoico) a una dosis de 12,5 \mug; xenaldial (dihidrato de 4-4'-bis-bifenilglioxal) a una dosis de 25 \mug.

La dosis usada para cada fármaco es la dosis máxima tolerada por los cultivos, establecida en experimentos previos.

Los compuestos se disolvieron en Carbowax 200, calentando hasta 100ºC durante 15 minutos.

Esquema general del ensayo de actividad antiviral

A 9,9 ml de caldo de cultivo que contiene el virus en forma de una suspensión diluida a 10^{-1} se añadieron 0,10 ml de Carbowax con o sin quimioterapéuticos (xenaldial 2 mg, concentración final de 200 \mug/ml; xenalamina 23 mg, concentración final de 230 \mug/ml).

Las suspensiones resultantes se incubaron a 37ºC durante una hora en agitación continua.

Tras la incubación, para cada suspensión se llevó a cabo una dilución escalar log_{-10}en caldo. Posteriormente, las suspensiones se inocularon en cultivos de linfocitos (0,10 ml), en grupos de 8 tubos por dilución, para evaluar la DL_{50} para cada material probado.

Los resultados se exponen en la tabla (los números indicados son la media de 3 experimentos).

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La acción desactivadora del virus ejercida por los derivados de cetoaldehído de difenilo varia entre 1 y 1,5 U log_{10} y es ligeramente más evidente con xenaldial que con xenalamina. En las condiciones experimentales usadas, ya se observan reducciones marcadas del título viral (1 Ulog_{10}) y de la DL_{50} tras la exposición durante 1 hora a 37ºC (en comparación con las suspensiones control).

La tabla pone de manifiesto que el virus es muy poco sensible in vitro a la acción desactivadora directa de los compuestos probados.

La reducción de la actividad patogénica del virus tras la exposición a los compuestos es la siguiente (expresada en % de los valores logarítmicos en comparación con los controles):

xenaldial: título viral bajo 42,8%;

xenaldial: título viral alto 8,3;

xenalamina: título viral bajo 28,5%;

xenalamina: título viral alto 8,3%.

Procedimiento

El siguiente procedimiento se usó para evaluar la curva de crecimiento viral en presencia de los compuestos probados: los cultivos se infectaron con 1 ml de fluido viral que contenía una dosis citopatogénica, para obtener una proporción célula/DL_{50} de aproximadamente 1:1. Una hora después de la infección a 36ºC y de repetidos lavados con la solución salina equilibrada de Hanks, el fluido viral se sustituyó por TM en los grupos control y por TM + fármaco en los cultivos probados.

A intervalos de tiempo se extrajeron alícuotas de tres cultivos, se lavaron con solución de Hanks, después se les añadió 1 ml de TM y se congelaron a -30ºC.

Al final del experimento, los fluidos de los cultivos se descongelaron y volvieron a congelar dos veces, mezclando cada alícuota, después se titularon simultáneamente con los correspondientes fluidos separados antes de congelar.

Resultados

Los resultados se representan en las figuras 1-4, donde:

Figura 1: curva de crecimiento viral en presencia de xenalamina, añadida a los cultivos 1 h después de la infección a una dosis de 12,5 \mug/ml;

Figura 2: curva de crecimiento viral en presencia de ácido xenálico, añadido a los cultivos 1 h después de la infección a una dosis de 12,5 \mug/ml;

Figura 3: curva de crecimiento viral en presencia de xenaldial, añadido a los cultivos 1 h después de la infección a una dosis de 25 \mug/ml;

Figura 4: curva de crecimiento viral en presencia de xenaldial, añadido a los cultivos 1 h y 48 horas después de la infección a una dosis de 25 \mug/ml.

Los gráficos muestran:

- en los cultivos tratados con xenalamina, un retraso de aproximadamente 24 horas en la aparición del virus en los fluidos;

- en los cultivos tratados con xenaldial, cambios significativos en el contenido viral intra y extracelular; la cantidad de virus intracelular es menor que la del control en más de 1 U log hasta 72 horas; después, la reducción disminuye de forma progresiva hasta que desaparece al final del experimento. El virus liberado por las células aparece en los fluidos con un retraso de 24 horas en comparación con los controles. Cuando a las 48 horas de la infección el medio se sustituye por 1 ml de TM que contiene 25 \mug/ml de xenaldial, se observa una reducción de la cantidad viral intra y extracelular hasta 120 horas en comparación con los controles.

Ejemplo 2

La actividad inhibidora del HTLV IIB de xenaldial se probó en cultivos de linfocitos. El % de inhibición viral se determinó por medio de PCR, según el siguiente procedimiento:

Preparación de ADN

Se extrajo ADN de 5x10^{4} linfocitos usando 400 \mul de lisado e incubando a 56ºC/60' y a 92ºC/15'. A continuación, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se guardó a 4ºC.

Sonda

El oligonucleótido SK19 (41 bases, correspondientes a la secuencia interna del ADN proviral amplificado) se sintetizó, se disolvió en agua a una concentración final de 20 \mum y se marcó en 5' con polinucleótido quinasa y ^{32}P-ATP.

PCR

Reactivos: polimerasa Taq 5U/\mul, desoxinucleótidos (10 mM pH 7,0), KCl 2M, Tris-Cl 1 M pH 8,3, MgCl_{2} 1M, gelatina, cebadores 15 \muM, sonda 15 \muM, ^{32}P-ATP, polinucleótido quinasa 10U/\mul, ADN 1-3 \mug, EDTA 0,25M, proteinasa K 10 mg/ml, SDS 10%, acetato amónico 2M, SSC 20x, TRIS-borato-EDTA 10x, TRIS-acetato-EDTA 10x, tampón de carga 6x (azul de bromofenol 0,25%, xilen-cianol 0,25%, sacarosa al 40%, TRIS 10 mM pH 8,0), mezcla de lisado (proteinasa K 60 \mug/ml, NP-40 0,5%, Tween 20 0,5%, TRIS 5mM pH 8,3, MgCl_{2} 1,25 mM, KCl 50
mM);

Preparación de los reactivos: Nucleótidos: 125 \mul de cada nucleótido 10 mM se diluyeron a 1 ml con H_{2}O (concentración final 1,25 mM); tampón 10x: KCl 2M: 250 \mul, TrisHCl 1M pH 8,3: 100 \mul, MgCl_{2}1M: 20 \mul, gelatina: 10 mg, diluidos a 1 ml con H_{2}O;

Par de oligonucleótidos: se sintetizaron los oligonucleótidos SK38 y 39, se purificaron y se disolvieron en una concentración de 200-300 \muM.

Reacción: tampón de mezcla 10x, nucleótidos (1,25 mM), oligonucleótidos cebadores SK38 y SK39 15 \muM, lisado, polimerasa Taq 5 U/\mul; desnaturalización 90ºC/60', renaturalización 55ºC/30', polimerización 72ºC/30'; repetición del ciclo 30 veces.

Los resultados se exponen en las siguientes tablas:

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Bibliografía

1. Characterization of HIV-1-Integrase Inhibitors, M. S. T. HANSEN y col., The Salk Inst. For Biological Studies, La Jolla, CA.

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4. A Novel Inducible system To Study HIV-1 Vpr Function, Y. ZHOU y L. RATNER, Washington Univ. Sch. OF Med., St. Louis, MO.

5. Functional Implications of the Interaction of HIV-1-Vpr with a Fission Yeast Orthologue (Rhp23) of the Human Nucleotide Excision Repair Gene HHR23A, R. T. ELDER, y col., Children's Mem. Inst. For Ed. And Res., Northwestern Univ. Med. Sch. Chicago, IL.

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8. Chemoterapia 9, 1964, 6: 341-358.

9. Lorenzutti, G. y col.: Studio comparativo di alcuni derivati chetoaldeici in rapporto alla loro azione inattivante in vitro sul virus Influenzale A-PR8 Boll. Soc. ital. Biol. Sper. 40: 1221 (1964).

10. Science, 2000, Vol. 287: 646-650.

Claims (5)

1. El uso de un compuesto seleccionado de xenalamina, ácido xenálico y xenaldial, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por VIH.

2. El uso de xenaldial según la reivindicación 1.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, para la profilaxis o el tratamiento del SIDA y de las enfermedades relacionadas.

4. Composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de un compuesto según la reivindicación 1 junto con un agente anti-VIH diferente.

5. Composiciones según la reivindicación 4, en las que el agente anti-VIH se selecciona de entre inhibidores de la proteasa, inhibidores de la transcriptasa inversa e inhibidores de la integrasa.