WO2003025166A1 - Procede de vaccination therapeutique, peptides mutes de la transcriptase inverse de vih et leur utilisation a des fins de vaccination et en diagnostic - Google Patents

Procede de vaccination therapeutique, peptides mutes de la transcriptase inverse de vih et leur utilisation a des fins de vaccination et en diagnostic Download PDF

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WO2003025166A1
WO2003025166A1 PCT/FR2001/002872 FR0102872W WO03025166A1 WO 2003025166 A1 WO2003025166 A1 WO 2003025166A1 FR 0102872 W FR0102872 W FR 0102872W WO 03025166 A1 WO03025166 A1 WO 03025166A1
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mutated
peptide
sequence
mutation
sequences
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PCT/FR2001/002872
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Brigitte Autran
I Assia Samr
Patrice Debre
Vincent Calvez
Christine Katlama
Gaby Haas
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Universite Pierre Et Marie Curie - Paris Vi
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Definitions

  • Therapeutic vaccination methods mutated HIV reverse transcriptase peptides and their use for vaccination and diagnostic purposes
  • the subject of the present invention is a treatment of infectious and tumor pathologies comprising a phase of treatment by anti-infectious and / or anti-tumor chemotherapy inducing resistance mutations and a phase of therapeutic vaccination directed against these resistance mutations and to the agents used. as part of this processing.
  • a more particular subject of the present invention is peptides of 8 to 80 amino acids of the HIV reverse transcriptase sequence and comprising at least one mutation relative to the wild-type sequence of this enzyme, mutation induced in response to treatments with nucleoside or non-nucleoside analogs of HIV reverse transcriptase.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition or vaccine based on these peptides, in order to induce a specific immune response of these mutated sequences and to reinforce or prolong the effectiveness of the treatments with nucleoside or non-nucleoside analogues of the HIV reverse transcriptase. .
  • the present invention also relates to epitopes derived from these peptide sequences in order to evaluate the specific immune response following the injection of a vaccine.
  • cytotoxic T lymphocytes are responsible for controlling the initial peak of viremia, low-noise viral replication during the asymptomatic phase of the disease, and the elimination of most viral variants .
  • the recognition of an infectious agent as a foreign supposes that the immune system recognizes certain specific foreign structures, the antigens, constituting the non-self, distinguishing them from the structures which belong to it, constituting the self.
  • the immune response actors involve:
  • lymphocytes which are the effector cells of the immune reaction. They include B and T lymphocytes subdivided into two subpopulations: CD4 + helper T cells (Th), coordinators of specific immune responses, and CD8 + cytotoxic T lymphocytes (CTLs). These CTLs are capable of recognizing and killing cells infected with viruses, in particular, before the virus buds on the surface of the cell and is released into the extracellular medium.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • These CTLs are capable of recognizing and killing cells infected with viruses, in particular, before the virus buds on the surface of the cell and is released into the extracellular medium.
  • the antigen presenting cells which capture the antigens, condition them and present them in immunogenic form to the T lymphocytes.
  • MHC molecules major histocompatibility complex which are expressed on the surface of cells and participate in the presentation of the antigen to lymphocytes.
  • MHC is called HLA (human leukocyte antigen).
  • class I molecules which are present on the surface of all nucleated cells in the body
  • class II molecules which are only expressed on the surface of cells presenting antigens.
  • Antigenic peptides of 8 to 10 amino acids bind in a niche of MHC class I molecules
  • peptides of 14-15 amino acids bind to MHC class I
  • Their binding is determined by the interaction forces established between the amino acids (essentially in the two terminal parts) of the antigenic peptide and those of the walls of the niche of HLA molecules.
  • HLA class I alleles More than 200 HLA class I alleles have now been defined within the three families of HLA class IA genes, B and C. Each HLA class I allele is significantly different in terms of the peptide niche, so the peptides that can s 'fix it are also different. There is therefore a strict specificity in the interaction between peptide and HLA class I molecule. This specificity explains why even a minor change in the sequence of the peptide presented as target may be sufficient to make this peptide incapable of binding to the HLA molecule class I. * receptors for the antigen which are fixed in the membrane of T lymphocytes
  • T lymphocyte specifically recognizes an antigen presented on the MHC.
  • the receptor for T lymphocytes is called TCR (T Cell Receptor). This receptor must recognize at the same time on the cell surface the antigenic peptide and the MHC molecule. It is said that recognition is restricted by the CMH.
  • CD markers (differentiation cluster) which are molecules whose presence on the cell membrane identifies a cell.
  • the Th carry the CD4 marker and are also called CD4 + and the CTLs which carry the marker
  • CD8 are called CD8 +.
  • CD8 + lymphocytes recognize their antigen on MHC class I; CD4 + lymphocytes on MHC class IL
  • the presentation of the antigenic sequences by the antigen presenting cells is one of the determining factors of the effectiveness of a vaccine. It can be amplified by certain natural or synthetic compounds, adjuvants, such as lipids (fatty acids, phospholipids, Freund's adjuvant), anionic copolymers, CpG units ... Other molecules such as cytokines (interleukins , interferons, TNF (tumor necrosis factors), TGF (transforming growth factors %) and chemokines are involved in the regulation of maturation, activation, proliferation and differentiation of cells of the immune system, and play a major role in the molecule of vaccine efficacy.
  • adjuvants such as lipids (fatty acids, phospholipids, Freund's adjuvant), anionic copolymers, CpG units ...
  • Other molecules such as cytokines (interleukins , interferons, TNF (tumor necrosis factors), TGF (transforming growth factors %) and chemokines are involved in the
  • HIV infection is an infection of the immune system in the sense that this virus electively infects CD4 + lymphocytes and antigen-presenting cells and gradually destroys the immune system, usually over 10 years.
  • the intensity and diversity of these CTL responses to HIV could be correlated with the control of viral replication, suggesting the crucial role played by these CTLs in these immune defenses.
  • CTL target HIV peptide sequences have been defined for the majority of HIV proteins. These targets differ depending on the individual, depending on the HLA class I molecules expressed on the surface of the cells of a given individual.
  • the escape of the virus from the control exerted by the immune system is the main cause of the ineffectiveness of these responses.
  • Viral variation in CTL epitopes may play a key role in the immune system's failure to contain the virus.
  • a single mutation in a defined epitope recognized by a CTL may indeed be sufficient to suppress CTL recognition, or to block the binding of the peptide to the class I molecule, or by altering residues essential for interactions with the TCR.
  • the sequence of the HIV Reverse Transcriptase enzyme being highly conserved between the different virus subtypes, it is a prime target for CTL-type immune responses: 80% of the patients tested exhibit a CTL response directed against reverse transcriptase corresponding to HIV-1.
  • HIV vaccines include recombinant VLH proteins, synthetic peptides, recombinant viral or bacterial vectors, naked DNA vaccines. More than 60 phase I clinical trials on thirty candidate specific type B vaccines for HIV, which is the most common subtype in the United States and Europe, have been carried out or are underway. Most of these trials have focused on the HIV envelope protein. However, the recombinant proteins tested rarely induce CD8 + CTLs which recognize and kill cells infected with HIV. In addition, type I HIV isolates exhibit a degree of intense genetic diversity in the viral envelope that can affect aspects of the life cycle such as infectivity, transmissibility or immunogenicity.
  • AIDS treatments use molecules capable of blocking one or more stages of the virus cycle without altering the proper functioning of the host cells.
  • the other structural proteins (the viral capsid and reverse transcriptase, in particular) as well as the regulatory proteins, which are more conserved than the viral envelope, are today the preferred targets of preventive vaccination strategies.
  • RT Reverse transcriptase
  • NRTI Non-hydrolyzable nucleoside analogs
  • AZT zidovudine
  • DDI didanosine
  • DDC zalcitabine
  • 3TC lamivudine
  • ABC abacavir
  • D4T stavudine
  • NRTI non-nucleoside inhibitors of the enzyme
  • HIV protease is the other main target of anti-retroviral treatments that use enzyme inhibitors such as Ritonavir,
  • NNRTI within one to twelve months of processing.
  • the accumulation of these mutations over time in patients treated with these drugs leads to the selection of multidrug-resistant viruses and leads to therapeutic failures.
  • HIV treated with at least one reverse transcriptase inhibitor in Western countries 50% of them maintain a detectable viremia and are considered to be in therapeutic failure. This is associated with the existence of at least one resistance mutation to these inhibitors and results in an increase in the viral load and a decrease in CD4 + T lymphocytes.
  • 10% of patients recently infected, but not yet treated are infected with new viral strains carrying mutations in resistance to antiretroviral treatment. Numerous studies have shown that subsequent antiviral therapies with molecules of the same class then have less effectiveness on these resistant viruses.
  • An alternative therapeutic strategy is now proposed in order to limit the toxicity and the cost of these long-term treatments.
  • the aim is to stimulate the immune responses to HIV in treated patients by combining these treatments with anti-HIV immunization by the available vaccine candidates in order to discontinue the treatments in the long term.
  • the Applicant has discovered a treatment for infectious and tumor pathologies comprising a phase of treatment with anti-infectious and / or anti-tumor chemotherapy inducing resistance mutations and a phase of therapeutic vaccination directed against these resistance mutations.
  • This immune response can therefore take place during these treatments, but seems incapable of ensuring the elimination of specific variants on its own. Amplification of the immunity directed against these mutations will make it possible to control the emergence of these variants of HIV and to maintain a lasting viral suppression under these treatments.
  • the administration of vaccines containing these mutated reverse transcriptase viral sequences, before or during the administration of NRTI or NNRTI treatments should make it possible to prevent, delay or reduce the appearance of mutated viruses capable of resisting these treatments.
  • This new type of therapeutic immunization thus aims to strengthen or prolong the effectiveness of antiretroviral treatments with NRTIs and / or NNRTIs. This can be secondarily applied to other mutations induced by other classes of antiretrovirals and can also be used in preventive vaccination.
  • the invention therefore consists in a treatment of infectious and / or tumor pathologies.
  • the invention also consists of the treatment agents used in the context of this treatment.
  • the subject of the invention is also the preparation of immunogens containing the mutations of resistance to NRTI and / or NNRTI.
  • the invention consists in the preparation of immunogens containing the resistance mutations to one or more NNRTIs used alone or in conjunction with one or more NRTIs.
  • the subject of the invention is also the peptides which are elements of immunogens.
  • Another subject of the invention is a pharmaceutical composition characterized in that it comprises at least one peptide as defined, dispersed in pharmaceutically acceptable excipients, this composition being used as a vaccine.
  • Another object of the invention is the determination of epitopes recognized by the
  • the method for treating infectious and / or tumor pathologies comprises a phase of treatment by anti-infectious and / or antitumour chemotherapy inducing resistance mutations and a phase of therapeutic vaccination directed against these resistance mutations.
  • the vaccination phase follows the chemotherapy treatment phase.
  • the present invention also relates to an agent for treating infectious and / or tumor pathologies which comprises at least two components:
  • the first component comprising a medicament intended for the treatment of infectious and or anti-tumor pathologies inducing resistance mutations
  • the second component comprising a vaccine directed against these resistance mutations, the two components being intended for simultaneous, separate or sequential use over time.
  • the present invention also relates to peptides of 8 to 80 amino acids of the HIV reverse transcriptase sequence comprising at least one mutation by substitution and / or by single or multiple insertion with respect to established reverse transcriptase sequences, in the absence of any treatment, mutation observed following treatment with NRTI and / or NNRTI, the peptides being characterized by the fact that they are capable of inducing a response mediated by T lymphocytes specific for this mutated sequence of HIV reverse transcriptase, with the exception of peptides of sequence Z r YVDDZ 2 , Z r YIDDZ 2 and Z r
  • YLDD-Z2 with Z x and Z 2 being at least any amino acid, these peptides having been observed following treatment with lamivudine alone (NRTI).
  • the subject of the invention is preferably peptides of 8 to 80 amino acids of the HIV reverse transcriptase sequence comprising at least one mutation by substitution and / or by single or multiple insertion with respect to the established sequences of the reverse transcriptase, in the absence of any treatment, mutation observed following treatment with NNRTI alone or following treatment combining NNRTI and NRTI, the peptides being characterized by the fact that they are capable of induce a response mediated by T lymphocytes specific for this mutated sequence of VLH reverse transcriptase.
  • the peptides according to the invention contain from 15 to 50 amino acids.
  • sequences of the peptides according to the invention can be preceded or followed by neutral amino acids which can dissolve or stabilize the peptides.
  • the peptides according to the invention are characterized by the sequences or parts of sequence comprising at least one of the following Mp mutation with Xn being an amino acid corresponding to that described in the Los Alamos database at the same position of the peptide sequence of HIV-1 reverse transcriptase, and n being the position of an amino acid described in the Los Alamos database in the sequence of HIV-1 reverse transcriptase, and with Mp being a mutated amino acid and p being the number of the mutation observed.
  • Ml (aa 6) can be mutated into K, G or S
  • M2 (aa 39) can be X39 or be mutated into A, K, N, P, M or S;
  • M3 (aa 41) can be X41 or be mutated to L; at least one of M2 and M3 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M2 (aa 39) can be mutated to A, K, N, P, M or S;
  • M3 (aa 41) can be X41 or be mutated to L;
  • Ml (aa 6) can be X6 or be mutated into K, G or S;
  • M2 (aa 39) can be X39 or be mutated to A, K, N, P, M or S;
  • M3 (aa 41) can be X41 or be mutated to L; at least one of Ml, M2 and M3 representing an amino acid carrying a mutation.
  • Ml (aa 6) can be X6 or be mutated into K, G or S;
  • M2 (aa 39) can be X39 or be mutated to A, K, N, P, M or S;
  • M3 (aa 41) can be X41 or be mutated to L; with Ml or M2 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M4 (aa 62) can be X62 or be mutated into V;
  • M5 (aa 65) can be X65 or be mutated to R;
  • M6 (aa 67) can be X67 or be mutated to N or G;
  • M7 (aa 68) can be X68 or be mutated to G or N;
  • M8 (aa 69) can be X69 or be mutated to D, N, S, A, or combined with multiple inserts like SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, or XXX;
  • M9 (aa 70) can be X70 or be mutated to R, N, E or S; M10 (aa 74) can be X74 or be mutated into V or I; Ml 1 (aa 75) can be X75 or be mutated to M, I, L or T;
  • M12 (aa 77) can be X77 or be mutated to L; at least one of M4 to Ml 2 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M4 (aa 62) can be X62 or be mutated to V
  • M5 (aa 65) can be X65 or be mutated to R
  • M6 (aa 67) can be X67 or be mutated to N or G;
  • M7 (aa 68) can be X68 or be mutated to G or N;
  • M8 (aa 69) can be X69 or be mutated to D, N, S, A, or combined with multiple inserts like SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, or XXX;
  • M9 (aa 70) can be X70 or be mutated to R, N, E or S;
  • M10 (aa 74) can be X74 or be mutated into V or I;
  • Mil (aa 75) can be X75 or mutated to M, I, L or T;
  • M12 (aa 77) can be X77 or be mutated to L; at least one of M4, M7 or M12 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M4 (aa 62) can be X62 or be mutated into V;
  • M5 (aa 65) can be X65 or be mutated to R;
  • M6 (aa 67) can be X67 or be mutated to N or G;
  • M7 (aa 68) can be X68 or be mutated to G or N;
  • M8 (aa 69) can be X69 or be mutated to D, N, S, A, or combined with multiple inserts like SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, or XXX;
  • M9 (aa 70) can be X70 or be mutated to R, N, E or S;
  • M10 (aa 74) can be X74 or be mutated into V or I;
  • Mil (aa 75) can be X75 or mutated to M, I, L or T;
  • M12 (aa 77) can be X77 or be mutated to L;
  • M13 (aa 88) can be X88 or be mutated to C;
  • M14 (aa 89) can be X89 or be mutated to G;
  • M15 (aa 90) can be X90 or be mutated to I;
  • M16 (aa 98) can be X98 or be mutated into G or S;
  • M17 (aa 100) can be X100 or be mutated to I;
  • M18 (aa 101) can be X101 or be mutated to E, Q, R, I or P;
  • M19 (aa 103) can be X103 or be mutated to N, Q, R, T or S;
  • M20 (aa 106) can be X106 or be mutated to A, I or L;
  • M21 (aa 108) can be X108 or be mutated to I;
  • M22 (aa 115) can be XI 15 or be mutated to F;
  • M23 (aa 116) can be XI 16 or be mutated to Y;
  • M24 (aa 119) can be XI 19 or be mutated to S; at least one of M4 to M24 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M4 (aa 62) can be X62 or be mutated to V;
  • M5 (aa 65) can be X65 or be mutated to R;
  • M6 (aa 67) can be X67 or be mutated to N or G;
  • M7 (aa 68) can be X68 or be mutated to G or N;
  • M8 (aa 69) can be X69 or be mutated to D, N, S, A, or combined with multiple inserts like SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, or XXX;
  • M9 (aa 70) can be X70 or be mutated to R, N, E or S;
  • M10 (aa 74) can be X74 or be mutated into V or I;
  • Ml 1 (aa 75) can be X75 or be mutated to M, I, L or T;
  • M12 (aa 77) can be X77 or be mutated to L;
  • M13 (aa 88) can be X88 or be mutated to C;
  • M14 (aa 89) can be X89 or be mutated to G;
  • Ml 5 (aa 90) can be X90 or be mutated to I;
  • Ml 6 (aa 98) can be X98 or be mutated to G or S;
  • M17 (aa 100) can be X100 or be mutated to I;
  • M18 (aa 101) can be X101 or be mutated to E, Q, R, I or P;
  • M19 (aa 103) can be X103 or be mutated to N, Q, R, T or S;
  • M20 (aa 106) can be X106 or be mutated to A, I or L;
  • M21 (aa 108) can be X108 or be mutated to I;
  • M22 (aa 115) can be XI 15 or be mutated to F;
  • M23 (aa 116) can be XI 16 or be mutated to Y;
  • M24 (aa 119) can be XI 19 or be mutated to S; at least one of M4, M7, M12 to M21, M23 or M24 representing an amino acid carrying a mutation.
  • Sequence F aa 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143
  • M25 (aa 138) can be XI 38 or be mutated into A, G, K or Q;
  • M26 (aa 139) can be X139 or be mutated to I, M or K;
  • M27 (aa 141) can be X141 or be mutated to E;
  • M28 (aa 151) can be X151 or be mutated to M;
  • M29 (aa 157) can be X157 or be mutated to S; at least one of M25 to M29 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M25 (aa 138) can be X138 or be mutated to A, G, K or Q;
  • M26 (aa 139) can be X139 or be mutated to I, M or K;
  • M27 (aa 141) can be X141 or be mutated to E;
  • M28 (aa 151) can be X151 or be mutated to M;
  • M29 (aa 157) can be X157 or be mutated to S; at least one of M25 to M28 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M31 (aa 178) can be X178 or be mutated to M, L, or F M32 (aa 179) can be X179 or be mutated to I, L, D or E;
  • M33 (aa 181) can be X181 or be mutated to C or I;
  • M34 (aa 184) can be X184 or be mutated to V, I or T;
  • M35 (aa 188) can be X188 or be mutated into L, C or H;
  • M36 (aa 189) can be XI 89 or be mutated to I;
  • M37 (aa 190) can be X190 or be mutated to A, S, E, Q or T; at least one of M30 to M37 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M30 (aa 172) can be X172 or be mutated to K;
  • M31 (aa 178) can be X178 or be mutated to M, L, or F
  • M32 (aa 179) can be X179 or be mutated to I, L, D or E;
  • M33 (aa 181) may be XI 81 or be mutated to C or I;
  • M34 (aa 184) can be XI 84 or be mutated to V, I or T;
  • M35 (aa 188) can be XI 88 or be mutated into L, C or H;
  • M36 (aa 189) can be XI 89 or be mutated to I;
  • M37 (aa 190) can be X190 or be mutated to A, S, E, Q or T; at least one of M30, M33, M35 to M37 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M30 (aa 172) may be X172 or be mutated to K;
  • M31 (aa 178) can be X178 or be mutated to M, L, or F;
  • M32 (aa 179) can be X179 or be mutated into I, L, D or E;
  • M33 (aa 181) can be X181 or be mutated to C or I;
  • M34 (aa 184) can be X184 or be mutated to V, I or T; at least one of M30 to M34 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M30 (aa 172) can be X172 or be mutated to K;
  • M31 (aa 178) can be X178 or be mutated to M, L, or F;
  • M32 (aa 179) can be X179 or be mutated into I, L, D or E;
  • M33 (aa 181) may be XI 81 or be mutated to C or I;
  • M34 (aa 184) can be XI 84 or be mutated to V, I or T; at least one of M30; M32 or M33 representing an amino acid carrying a mutation. Sequence I
  • M34 (aal84) can be XI 84 in which M35 (aa 188) can be X188 or be mutated in L, C or H; M36 (aa 189) can be XI 89 or be mutated to I;
  • M37 (aa 190) can be X190 or be mutated to A, S, E, Q or T; at least one of M34 to M37 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M34 (aal 84) can be XI 84 in which M35 (aa 188) can be X188 or be mutated into L, C or H;
  • M36 (aa 189) can be XI 89 or be mutated to I;
  • M37 (aa 190) can be X190 or be mutated to A, S, E, Q or T; at least one of M35 to M37 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M38 (aa 208) may be X208 or be mutated to Y;
  • M39 (aa 210) can be X210 or be mutated to W;
  • M40 (aa 211) can be X211 or mutated to K, A, E, N, D, G or Q;
  • M41 (aa 214) can be X214 or be mutated into L or F;
  • M42 (aa 215) can be X215 or be mutated to Y, F or C;
  • M43 (aa 219) can be X219 or be mutated to Q, E N, R, T or W;
  • M44 (aa 223) can be X223 or be mutated to Q;
  • M45 (aa 225) can be X225 or be mutated to H;
  • M46 (aa 227) can be X227 or be mutated to L;
  • M47 (aa 228) can be X228 or be mutated to R, H or F;
  • M48 (aa 233) can be X233 or be mutated to V or N;
  • M49 (aa 234) can be X234 or be mutated into I, H or P;
  • M50 (aa 236) can be X236 or be mutated to M, S or L;
  • M51 (aa 238) can be X238 or be mutated to T or S;
  • M52 (aa 240) can be X240 or be mutated to A, D or I; at least one of M38 to M52 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M38 (aa 208) can be X208 or be mutated to Y;
  • M39 (aa 210) can be X210 or be mutated to W;
  • M40 (aa 211) can be X211 or mutated to K, A, E, N, D, G or Q;
  • M41 (aa 214) can be X214 or be mutated into L or F;
  • M42 (aa 215) can be X215 or be mutated to Y, F or C;
  • M43 (aa 219) can be X219 or be mutated to Q, E N, R, T or W;
  • M44 (aa 223) can be X223 or be mutated to Q;
  • M45 (aa 225) can be X225 or be mutated to H;
  • M46 (aa 227) can be X227 or be mutated to L;
  • M47 (aa 228) can be X228 or be mutated to R, H or F;
  • M48 (aa 233) can be X233 or be mutated to V or N;
  • M49 (aa 234) can be X234 or be mutated into I, H or P;
  • M50 (aa 236) can be X236 or be mutated to M, S or L;
  • M51 (aa 238) can be X238 or be mutated to T or S;
  • M52 (aa 240) can be X240 or be mutated to A, D or I; at least one of M38, M40, M44 to M52 representing an amino acid carrying a mutation.
  • the peptides according to the invention are characterized by the following sequences or parts of sequence comprising at least one of the following Mp mutations:
  • G K 1 S K I in which M2 (aa 39- wt T) can be X39 or be mutated mainly in A, or in K, or N, or P, or M or S;
  • M2 (aa 39) can be mutated to A, K, N, P, M or S;
  • M3 (aa 41) can be X41 or be mutated to L;
  • Ml (aa 6) can be X6 or be mutated into K, G or S;
  • M2 (aa 39) can be X39 or be mutated to A, K, N, P, M or S;
  • M3 (aa 41) can be X41 or be mutated to L; with Ml or M2 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M4 (aa 62) can be X62 or be mutated to V
  • M5 (aa 65) can be X65 or be mutated to R
  • M6 (aa 67) can be X67 or be mutated to N or G
  • M7 (aa 68) can be X68 or be mutated to G or N
  • M8 (aa 69) can be X69 or be mutated to D, N, S, A, or combined with multiple inserts like SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, or XXX;
  • M9 (aa 70) can be X70 or be mutated to R, N, E or S; M10 (aa 74) can be X74 or be mutated into V or I; Ml 1 (aa 75) can be X75 or be mutated to M, I, L or T;
  • M12 (aa 77) can be X77 or be mutated to L; at least one of M4, M7 or M12 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M4 (aa 62) can be X62 or be mutated to V
  • M5 (aa 65) can be X65 or be mutated to R
  • M6 (aa 67) can be X67 or be mutated to N or G;
  • M7 (aa 68) can be X68 or be mutated to G or N;
  • M8 (aa 69) can be X69 or be mutated to D, N, S, A, or combined with multiple inserts like SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, or XXX;
  • M9 (aa 70) can be X70 or be mutated to R, N, E or S;
  • M10 (aa 74) can be X74 or be mutated into V or I;
  • Ml 1 (aa 75) can be X75 or be mutated to M, I, L or T;
  • M12 (aa 77) can be X77 or be mutated to L; M13 (aa 88) can be X88 or be mutated to C; M14 (aa 89) can be X89 or be mutated to G; Ml 5 (aa 90) can be X90 or be mutated to I; M16 (aa 98) can be X98 or be mutated into G or S; M17 (aa 100) can be X100 or be mutated to I;
  • M18 (aa 101) can be X101 or be mutated to E, Q, R, I or P;
  • M19 (aa 103) can be X103 or be mutated to N, Q, R, T or S;
  • M20 (aa 106) can be X106 or be mutated to A, I or L;
  • M21 (aa 108) can be X108 or be mutated to I;
  • M22 (aa 115) can be XI 15 or be mutated to F;
  • M23 (aa 116) can be XI 16 or be mutated to Y; M24 (aa 119) can be XI 19 or be mutated to S; at least one of M4, M7, M12 to M21, M23 or M24 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M25 (aa 138) can be XI 38 or be mutated into A, G, K or Q;
  • M26 (aa 139) can be X139 or be mutated to I, M or K;
  • M27 (aa 141) can be X141 or be mutated to E;
  • M28 (aa 151) can be X151 or be mutated to M;
  • M29 (aa 157) can be X157 or be mutated to S; at least one of M25 to M28 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M31 (aa 178- wt ⁇ I) can be X178 or be transferred mainly to M, L or F;
  • M33 (aa 181- wt ⁇ Y) can be XI 81 or be mainly transferred to C or to I;
  • M34 (aa 184- wt ⁇ M) can be XI 84 or be mainly transferred to V, or to I or
  • T; M35 (aa 188- wt ⁇ Y) can be X188 or be mainly transferred to L, or to C or
  • M37 (aa 190- wt ⁇ G) can be X190 or be transferred mainly to A, or to S, or
  • M30 (aa 172) can be X172 or be mutated to K;
  • M31 (aa 178) can be X178 or be mutated to M, L, or F
  • M32 (aa 179) can be X179 or be mutated into I, L, D or E;
  • M33 (aa 181) can be X181 or be mutated to C or I;
  • M34 (aa 184) can be XI 84 or be mutated to V, I or T;
  • M35 (aa 188) can be X188 or be mutated into L, C or H;
  • M36 (aa 189) can be XI 89 or be mutated to I;
  • M37 (aa 190) can be X190 or be mutated to A, S, E, Q or T; at least one of M30, M33, M35 to M37 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M33 (aa 181-wt ⁇ Y) can be X181 or be mutated mainly in C or in I;
  • T at least one of M30 to M34 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M30 (aa 172) can be X172 or be mutated to K;
  • M31 (aa 178) can be X178 or be mutated to M, L, or F;
  • M32 (aa 179) can be X179 or be mutated into I, L, D or E; M33 (aa 181) may be XI 81 or be mutated to C or I;
  • M34 (aa 184) can be XI 84 or be mutated to V, I or T; at least one of M30; M32 or M33 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M36 (aa 189- wt ⁇ V) can be XI 89 or be transferred mainly to I M37 (aa 190- wt ⁇ G) can be X190 or be transferred mainly to A, or S, or E, or Q or T; at least one of M34 to M37 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M34 (aal84) can be XI 84 in which M35 (aa 188) can be X188 or be mutated into L, C or H;
  • M36 (aa 189) can be XI 89 or be mutated to I; M37 (aa 190) can be X190 or be mutated to A, S, E, Q or T; at least one of M35 to M37 representing an amino acid carrying a mutation.
  • M38 (aa 208- wt ⁇ H) can be X208 or be transferred mainly in
  • M40 (aa 211- wt ⁇ R) can be X211 or be mutated mainly in K, or in A, or E, or N, or D, or G or Q;
  • M41 (aa 214- wt ⁇ F or L) can be X214 or be transferred mainly to L or
  • M42 (aa 215- wt ⁇ T) can be X215 or be mutated mainly in Y, or in F or C;
  • M43 (aa 219- wt ⁇ K) can be X219 or be transferred mainly to Q, or to E, or
  • M44 (aa 223- wt ⁇ K) can be X223 or be mainly transferred to Q;
  • M45 (aa 225- wt ⁇ P) can be X225 or be transferred mainly to H;
  • M46 (aa 227- wt ⁇ F) can be X227 or be mainly transferred to L;
  • M47 (aa 228- wt ⁇ L) can be X228 or be mutated mainly in R, or in H or F;
  • M48 (aa 233- wt ⁇ E) can be X233 or be mainly transferred to V, or in N M49 (aa 234- wt ⁇ L) can be X234 or be mainly transferred to I, or in H or
  • M50 (aa 236- wt ⁇ P) can be X236 or be transferred mainly to M, or to S or L;
  • M51 (aa 238- wt ⁇ K) can be X238 or be mainly transferred to T or S;
  • M52 (aa 240- wt ⁇ T) can be X240 or be transferred mainly to A, or to D or
  • M38 (aa 208) can be X208 or be mutated to Y;
  • M39 (aa 210) can be X210 or be mutated to W;
  • M40 (aa 211) can be X211 or mutated to K, A, E, N, D, G or Q; M41 (aa 214) can be X214 or be mutated into L or F;
  • M42 (aa 215) can be X215 or be mutated to Y, F or C;
  • M43 (aa 219) can be X219 or be mutated to Q, E N, R, T or W;
  • M44 (aa 223) can be X223 or be mutated to Q;
  • M45 (aa 225) can be X225 or be mutated to H; M46 (aa 227) can be X227 or be mutated to L;
  • M47 (aa 228) can be X228 or be mutated to R, H or F;
  • M48 (aa 233) can be X233 or be mutated to V or N;
  • M49 (aa 234) can be X234 or be mutated into I, H or P;
  • M50 (aa 236) can be X236 or be mutated to M, S or L;
  • M51 (aa 238) can be X238 or be mutated to T or S;
  • M52 (aa 240) can be X240 or be mutated to A, D or I; at least one of M38, M40, M44 to M52 representing an amino acid carrying a mutation. * K bis sequence:
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition based on at least one peptide, dispersed in pharmaceutically acceptable excipients, for their use as a vaccine.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may also comprise, in addition, immunomodulators such as cytokines or chemokines.
  • adjuvants such as lipids (fatty acids, phospholipids, incomplete adjuvant of
  • At least one peptide according to the invention is included in the composition of a lipopeptide or a lipoprotein.
  • a peptide according to the invention is included in the composition of a lipopeptide or a lipoprotein.
  • the peptide (s) according to the invention can be coupled to micro or nanoparticles made up of a polysaccharide nucleus and / or covered in particular with a lipid bilayer. They can also be coupled to one or more liposomes or one or more niosomes.
  • the peptide (s) according to the invention can be expressed in a recombinant virus, or a recombinant viral vector, or in an attenuated or inactivated virus.
  • the peptide (s) according to the invention can be expressed in a recombinant bacterium or in a recombinant bacterial vector.
  • the peptide (s) according to the invention can be expressed in an antigen presenting cell.
  • Another subject of the invention is a vaccine comprising at least one naked DNA or a naked RNA encoding at least one peptide according to the invention.
  • the agent for treating patients infected with HIV comprises at least two compositions, the first composition comprising at least one medicament from the NRTI and / or NNRTI family, and the second composition comprising at least one peptide according to the invention. These compositions are intended for a sequential application, separate or not in time or simultaneous.
  • the agent for treating patients infected with HIV comprises at least two compositions, the first composition comprising at least one medicament from the NNRTI family, and the second composition comprising at least one peptide according to the invention.
  • Another object of the invention is a method of preventing or treating an infection with the HIV virus.
  • This method consists in inducing a specific type T immune response in response to the administration of a vaccine according to the invention.
  • the mutation or mutations of the VTH virus are located in the reverse transcriptase enzyme.
  • Another subject of the invention is peptide sequences of 8 to 20 amino acids, recognized as epitopic sequences by T cells specific for the peptide sequences corresponding prior to vaccination, introduced to vaccination.
  • the epitopic sequences according to the invention are peptide sequences of 8 to 20 contiguous amino acids chosen from the peptide sequences from A to K having at least one Mp mutation.
  • these peptide sequences consist of 8 to 10 contiguous amino acids chosen from the peptide sequences from A to K having at least one Mp mutation.
  • the epitopic sequences according to the invention consist of 9 contiguous amino acids chosen from the peptide sequences from A to K having at least one Mp mutation.
  • the epitopic sequences possessing the stated characteristics can be used for the determination and the quantification of the T cells specific for these epitopic sequences.
  • the subject of the invention is also a diagnostic composition for determining the T cells specific for these epitopic sequences, characterized in that it comprises, inter alia, at least one epitopic sequence according to the invention.
  • the vaccines obtained according to the methods of the invention can be formulated as pharmaceutical compositions for subcutaneous, intramuscular, intra-dermal or intravenous administration. The techniques for administering this type of vaccine are abundantly described in the literature and are well known to those skilled in the art.
  • compositions according to the invention can be sterilized by conventional and known sterilization methods.
  • compositions according to the invention can be presented in all the forms usually used in diagnosis.
  • compositions according to the invention can in particular contain pharmaceutically acceptable substances such as pH stabilizers, buffering agents or for example sodium acetate, sodium chloride, potassium, calcium, lactate sodium or others in order to be in physiological conditions.
  • pharmaceutically acceptable substances such as pH stabilizers, buffering agents or for example sodium acetate, sodium chloride, potassium, calcium, lactate sodium or others in order to be in physiological conditions.
  • HIV-specific lines were generated by co-culture of PBMC (peripheral blood mononuclear cells) of patients and of autologous PHA-blasts.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PHA phytohemagglutinin
  • CTLs lines are cultured for at least 3 weeks in the presence of Interleukin 2 at 20 U / ml, added on the third day of culture and then every 3 days. These lines are tested for their cytotoxic activity after at least 3 weeks of culture against autologous B-EBV lines (B lymphocytes transformed by EBV) serving as targets.
  • Interleukin 2 at 20 U / ml
  • the target cells are autologous B-EBV lines infected with the various recombinant vaccinia viras expressing the pol gene or fragments of the pol gene of HIV-1, at a multiplicity of infection of 5 PFU (Plaque Forming Unit) / cell , 18h before the CTL test.
  • the non-recombinant wild vaccinia virus (Vac-WT) serves as a control.
  • the target cells are incubated in a pellet in the presence of Na2 ⁇ Cr ⁇ 4 (specific activity 2 mci / ml), at the concentration of 70 ⁇ ci / xlO ⁇ cells, for 2 h at 37 ° C.
  • the CTL responses are considered positive when more than 10% lysis is obtained. specific, this at least 2 successive effector / target ratios.
  • RT-1 1-143 and RT-2: 143-293 regions
  • Cytotoxic T responses were assessed using a chromium 51 release test.
  • the target cells were autologous B-EBV-lines infected with vaccinia viruses expressing different fragments of rt genes (RT-1: 1- 143 and RT-2: 143-293).
  • Resistance mutations were detected in proviral DNA using a LiPA HIV-1 RT test (Murex. Diagnostics SA, Châtillon, France). This test allows the simultaneous detection of “wild” type sequences and resistance mutations (41, 69, 70, 74, 184, 214 and 215) induced by nucleoside RT inhibitors (NRTI). From the DNA isolated from PBMCs, an amplification of the rt gene is carried out using biotinylated primers, the biotinylated DNA is then hybridized with specific oligonucleotide probes immobilized in parallel lines on a strip.
  • LiPA HIV-1 RT test Murex. Diagnostics SA, Châtillon, France. This test allows the simultaneous detection of “wild” type sequences and resistance mutations (41, 69, 70, 74, 184, 214 and 215) induced by nucleoside RT inhibitors (NRTI). From the DNA isolated from PBMCs, an amplification of the rt gene is carried out using
  • an ELISpot-IFN ⁇ test in which the PBMCs were incubated, without prior stimulation, with the peptide of interest was used.
  • the 96 wells of a Immobilon p type plate (Millipore, Molsheim, France) are covered for 18 h at 4 ° C with a monoclonal anti-IFN ⁇ (interferon ⁇ ) capture antibody (IgGl B-Bl at 1 ⁇ g / ml Diaclone, Besanarme, France). After 3 washes, the
  • PBMCs are added in triplicate at the concentration of 1x10 ⁇ and 5x10 ⁇ cells per well in the presence of 5 ⁇ g / ml of peptide or 0.5 ⁇ g / ml of PHA, used as a positive control or of medium alone used as a negative control.
  • the plates are then incubated for 40 h at 37 ° C. in a humid atmosphere at 5% CO 2, then washed, the biotinylated monoclonal anti-IFN ⁇ detection antibody (B-Gl at 0.2 ⁇ g / ml Diaclone,
  • Example No. 5 Cutting the sequence B (aa 30-50) into different peptides of length varying between 8 and 21 amino acids.
  • the peptide sequences are cut into peptides of 8 to 80 amino acids (aa) involving any part of the sequence covering at least one mutation, this for therapeutic or diagnostic applications.
  • Example No. 6 Detection of resistance mutations on pro viral PNA isolated from blood mononuclear cells (CMNS) of patient 201 # 5.
  • CMNS blood mononuclear cells
  • the resistance mutations were detected in the proviral DNA using a LiPA HIV-1-RT test (see example 3).
  • the LiPA test allows the definition of mutated amino acids from time to time within of a given sequence and not that of nucleic acid sequences.
  • the method for detecting resistance mutations in DNA is summarized in Figure 1.
  • the RT sequence of patient 201 # 5 is as follows:
  • the recognition of the mutation 41 (M> L) of RT by the CD8 cells producing IFN-gamma is studied in patient 201 # 5 treated with NRTI.
  • the mutation 41 had been detected on the proviral DNA isolated from these same CMNS (see example 6).
  • the recognition of wild-type and mutated peptides 33-41 was evaluated by
  • the recognition frequency of the mutated 33-41 peptide is 95 SFC / 10 6 CMNS and 3 SFC / 10 6 CMNS for the wild type 33-41 peptide.
  • a lipopeptide consists of a palmitic acid of formula C 16 H 32 O 2 or described in the text as C 15 H 3r COOH, of a lysine residue (amino acid basic added to the N-terminus of the peptide) and a peptide whose structure is chosen from the sequences described.
  • a lysine residue amino acid basic added to the N-terminus of the peptide
  • M2 (aa 39) can be X39 or be mutated into A, K, N, P, M or S;
  • M3 (aa 41) can be X41 or be mutated to L; at least one of M2 and M3 representing an amino acid carrying a mutation.
  • amino acid 50 which is an isoleucine (I).
  • the amino function of the lysine side chain is modified by a palmitic acid and the terminal amino acid C is amidated according to the following reactions: aa30-aa50-NH2 + lysine - »aa30-aa50-NH-CO-Lysine aa30- aa50 -NH-CO-Lysine + COOH-C 15 H 31 CONH2-aàa30-aa50 -NH-CO-Lysine-NH-CO-C 15 H 31
  • lysine can be added to the C-terminus of the peptide.
  • This structure is then purified and conditioned according to industrial processes meeting the conditions necessary for obtaining clinical batches before use for immunization in humans.

Abstract

La présente invention a pour objet un traitement des pathologies infectieuses et tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance et aux agents utilisés dans le cadre de ce traitement. La présente invention a plus particulièrement pour objet des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse du VIH et comportant au moins une mutation par rapport à la séquence sauvage de cette enzyme, mutation induite en réponse à des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH. La présente invention à également pour objet une composition pharmaceutique ou vaccin à base de ces peptides, afin d'induire une réponse immunitaire spécifique de ces séquences et de renforcer ou prolonger l'efficacité des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH. La présente invention à également pour objet des épitopes issus de ces séquences peptidiques afin d'évaluer la réponse immunitaire spécifique suite à l'injection d'un vaccin.

Description

Procédés de vaccination thérapeutique, peptides mutés de la transcriptase inverse de VIH et leur utilisation à des fins de vaccination et en diagnostic
La présente invention a pour objet un traitement des pathologies infectieuses et tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance et aux agents utilisés dans le cadre de ce traitement.
La présente invention a plus particulièrement pour objet des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse du VIH et comportant au moins une mutation par rapport à la séquence sauvage de cette enzyme, mutation induite en réponse à des traitements par des analogues nucléosidiques ou non- nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou vaccin à base de ces peptides, afin d'induire une réponse immunitaire spécifique de ces séquences mutées et de renforcer ou prolonger l'efficacité des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH. .
La présente invention a également pour objet des epitopes issus de ces séquences peptidiques afin d'évaluer la réponse immunitaire spécifique suite à l'injection d'un vaccin.
L'identification d'un vaccin efficace contre le VIH est capitale. Une immunisation effective serait efficace, abordable au niveau pécuniaire et constituerait une approche à long terme de cette infection. Cependant, l'obstacle le plus grand au développement de vaccins efficaces est la variabilité du VIH. Les données actuelles suggèrent que les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) sont responsables du contrôle du pic initial de la virémie, de la réplication virale à bas bruit lors de la phase asymptomatique de la maladie, et de l'élimination de la plupart des variants viraux.
La reconnaissance d'un agent infectieux comme étranger suppose que le système immunitaire reconnaisse certaines structures spécifiques étrangères, les antigènes, constituant le non-soi, en les distinguant des structures qui lui appartiennent, constituant le soi. Les acteurs de la réaction immunitaire impliquent :
* les lymphocytes qui sont les cellules effectrices de la réaction immunitaire. Ils comprennent les lymphocytes B et T subdivisés en deux sous-populations : les lymphocytes T CD4+ auxiliaires (Th), coordinateurs des réponses immunes spécifiques, et les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTLs). Ces CTLs sont capables de reconnaître et tuer des cellules infectées par des virus, notamment, avant que le virus ne bourgeonne à la surface de la cellule et ne soit libéré dans le milieu extracellulaire. * les cellules présentatrices d'antigènes qui capturent les antigènes, les conditionnent et les présentent sous forme immunogène aux lymphocytes T.
* les molécules du CMH (complexe majeur d'histocompatibilité) qui s'expriment à la surface des cellules et participent à la présentation de l'antigène aux lymphocytes. Chez l'homme, le CMH est appelé HLA (human leucocyte antigen). Il existe deux classes de molécules du CMH : les molécules de classe I qui sont présentes à la surface de toutes les cellules nucléées de l'organisme et les molécules de classe II qui ne s'expriment qu'à la surface des cellules présentatrices d'antigènes. Des peptides antigéniques de 8 à 10 acides aminés se fixent dans une niche des molécules du CMH de classe I, des peptides de 14-15 acides aminés se fixent au CMH de classe IL Leur fixation est déterminée par les forces d'interaction s'établissant entre les acides aminés (essentiellement dans les deux parties terminales) du peptide antigénique et ceux des parois de la niche des molécules HLA. Plus de 200 allèles HLA de classe I ont à présent été définis au sein des trois familles de gènes HLA de classe I A, B et C. Chaque allèle HLA de classe I est sensiblement différent au niveau de la niche peptidique, aussi les peptides pouvant s'y fixer sont également différents. Il existe donc une stricte spécificité dans l'interaction entre peptide et molécule HLA de classe I. Cette spécificité explique pourquoi même un changement mineur dans la séquence du peptide présenté comme cible peut être suffisant pour rendre ce peptide incapable de se fixer à la molécule HLA de classe I. * les récepteurs pour l'antigène qui sont fixés dans la membrane des lymphocytes T.
Grâce à ce récepteur, chaque lymphocyte T reconnaît spécifiquement un antigène présenté sur le CMH. Le récepteur pour les lymphocytes T est appelé TCR (T Cell Receptor). Ce récepteur doit reconnaître en même temps à la surface cellulaire le peptide antigénique et la molécule du CMH. On dit que la reconnaissance est restreinte par le CMH.
* les marqueurs CD (cluster de différentiation) qui sont des molécules dont la présence sur la membrane cellulaire identifie une cellule. Ainsi, les Th portent le marqueur CD4 et sont encore appelés CD4+ et les CTLs qui portent le marqueur
CD8 sont appelés CD8+. Les lymphocytes CD8+ reconnaissent leur antigène sur le CMH de classe I ; les lymphocytes CD4+ sur le CMH de classe IL
* La présentation des séquences antigéniques par les cellules présentatrices d'antigènes est un des facteurs déterminants de l'efficacité d'un vaccin. Elle peut être amplifiée par certains composés naturels ou de synthèse, les adjuvants, tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant de Freund), des copolymères anioniques, des motifs CpG... D'autres molécules telles que les cytokines (interleukines, interférons, TNF (tumor necrosis factors), TGF (transforming growth factors...) et chimiokines sont impliquées dans la régulation de la maturation, l'activation, la prolifération et la différentiation des cellules du système immunitaire, et jouent un rôle majeur dans la moléculation de l'efficacité vaccinale.
L'infection par le VIH est une infection du système immunitaire en ce sens que ce virus infecte électivement les lymphocytes CD4+ et les cellules présentatrices d'antigènes et détruit progressivement le système immunitaire, généralement en 10 ans. Certaines personnes infectées depuis plus de 20 ans et qui n'ont jamais été traitées par des thérapies antirétrovirales ont pourtant une charge virale très basse (ou sous la limite de détection) et présentent des réponses CTLs spécifiques du virus très importantes, dirigées contre des epitopes restreints aux molécules HLA de classe I. L'intensité et la diversité de ces réponses CTL au VIH ont pu être corrélées au contrôle de la réplication virale, suggérant le rôle capital joué par ces CTLs dans ces défenses immunes .
Les séquences peptidiques du VIH cibles des CTLs ont été définies pour la majorité des protéines du VIH. Ces cibles diffèrent selon les individus, en fonction des molécules HLA de classe I exprimées à la surface des cellules d'un individu donné.
L'échappement du virus au contrôle exercé par le système immunitaire est la cause principale de l'inefficacité de ces réponses. La variation virale dans les epitopes des CTLs pourrait jouer un rôle primordial dans l'échec du système immunitaire à contenir le virus. Une mutation unique dans un épitope défini reconnu par un CTL peut en effet suffire pour supprimer la reconnaissance CTL, ou pour bloquer la fixation du peptide sur la molécule de classe I, ou en altérant des résidus essentiels aux interactions avec le TCR. La séquence de l'enzyme Transcriptase Inverse du VIH étant hautement conservée entre les différents sous-types de virus, celle-ci est une cible privilégiée des réponses immunitaires de type CTL : 80 % des patients testés présentent une réponse CTL dirigée contre la transcriptase inverse correspondant à VIH-1.
Un grand nombre de vaccins contre le VIH ont été élaborés et testés. Ces vaccins incluent des protéines recombinantes du VLH, des peptides synthétiques, des vecteurs recombinants viraux ou bactériens, des vaccins de type ADN nu. Plus de 60 essais cliniques de phase I sur une trentaine de candidats vaccins spécifiques du type B du VIH qui est le sous-type le plus fréquent aux Etats-Unis et en Europe ont été réalisés ou sont en cours. La plupart de ces essais se sont focalisés sur la protéine d'enveloppe du VIH. Cependant, les protéines recombinantes testées induisent rarement des CTLs CD8+ qui reconnaissent et tuent les cellules infectées par VIH. De plus, les isolats du VIH de type I présentent un degré de diversité génétique intense au niveau de l'enveloppe virale qui peut influer sur certains aspects du cycle biologique comme l'infectivité, la transmissibilité ou l'immunogénicité. Les traitements du sida utilisent des molécules capables de bloquer une ou plusieurs étapes du cycle du virus sans altérer pour autant le bon fonctionnement des cellules de l'hôte. Les autres protéines structurales (la capside virale et la transcriptase inverse, notamment) ainsi que les protéines régulatrices, plus conservées que l'enveloppe virale, constituent aujourd'hui les cibles privilégiées des stratégies de vaccination préventive.
* La transcriptase inverse (RT pour reverse transcriptase), polymérase virale qui catalyse la synthèse d'ADN viral à partir du génome ARN est une cible de choix des traitements antirétro viraux. Des analogues non hydrolysables de nucléosides (NRTI) comme notamment l'AZT (zidovudine), DDI (didanosine), DDC (zalcitabine), 3TC (lamivudine), ABC (abacavir), D4T (stavudine) ... constituent la famille des inhibiteurs de la RT les plus utilisés à ce jour. Sous forme triphosphorylee, ils entrent en compétition avec les nucléosides naturels lors de la synthèse de l'ADN et entraînent la terminaison de son élongation. Une autre famille d'inhibiteurs de l'étape de transcription inverse, les inhibiteurs non nucléosidiques de l'enzyme (NNRTI), ne nécessite pas de phosphorylation pour être active et agit vraisemblablement par inhibition allostérique. Les plus connus sont la Névirapine, la Delavirdine ou l'Efavirenz.
* La protéase du VIH constitue l'autre cible principale des traitements anti- retroviraux qui utilisent des inhibiteurs de l'enzyme tels que le Ritonavir, le
Saquinavir, l'Indinavir...
Les thérapies antirétrovirales actuelles combinent généralement plusieurs classes et incluent un ou plusieurs inhibiteurs de transcriptase inverse. Cependant, ces traitements ne peuvent éradiquer le virus et la réplication résiduelle qui persiste au cours de ces traitements, même les plus actifs, permet la sélection au cours du temps de mutations dans le gène de la transcriptase inverse. Certaines de ces mutations confèrent au viras muté la capacité de résister à l'action inhibitrice de ces médicaments. Ainsi de nombreuses mutations affectent en particulier la séquence de la transcriptase inverse (incluant des changements dans le site actif de l'enzyme), favorisant ainsi l'émergence de virus variants résistants aux familles des NRTI ou des
NNRTI dans un délai de un à douze mois de traitement. L'accumulation de ces mutations au cours du temps chez des patients traités par ces médicaments aboutit à la sélection de virus multirésistants et conduit à des échecs thérapeutiques.
Il a été montré dans la demande de brevet WO99/51750 qu'un traitement à la Lamivudine induit des mutations ponctuelles dans le site catalytique de la transcriptase inverse de VIH. Cette mutation ponctuelle est située dans le site de reconnaissance du peptide par le TCR. En conséquence, les CTLs du patient traité qui reconnaissaient un épitope sauvage n'étaient plus capables de reconnaître un épitope muté. Les dernières estimations montrent que, sur les 85 % de patients atteints de
VIH traités par au moins un inhibiteur de transcriptase inverse dans les pays occidentaux, 50 % d'entre eux conservent une virémie détectable et sont considérés comme étant en échec thérapeutique. Ceci est associé à l'existence d'au moins une mutation de résistance à ces inhibiteurs et se traduit par une augmentation de la charge virale et une diminution des lymphocytes T CD4+. De plus, 10 % des patients récemment contaminés, mais non encore traités, le sont par de nouvelles souches virales porteuses des mutations de résistance aux traitements antirétro viraux. De nombreuses études ont montré que les thérapies antivirales ultérieures par des molécules de la même classe ont alors une efficacité moindre sur ces virus résistants. Une stratégie thérapeutique alternative est aujourd'hui proposée afin de limiter la toxicité et le coût de ces traitements au long cours. Il s'agit de stimuler les réponses immunitaires au VIH chez les patients traités en associant à ces traitements une immunisation anti-VIH par les candidats vaccins disponibles afin d'interrompre à terme les traitements. Des essais cliniques de phase I et II, utilisant des composés vaccinaux dirigés contre les séquences consensus de référence des virus non mutés, sont en cours.
La demanderesse a découvert un traitement des pathologies infectieuses et tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance.
La demanderesse a découvert plus particulièrement que certaines séquences de la transcriptase inverse sites de mutations ponctuelles et standardisées survenant au cours de divers traitements par des NRTI et/ou NNRTI, sont en fait capables de provoquer l'induction de CTLs spécifiques capables de reconnaître ces mutations. On a démontré ex vivo, par des méthodes de type ELISPOT, l'existence de cellules CD8+ (de l'ordre de 50 à 500 cellules spécifiques par million de cellules mononucléées sanguines) dirigées contre plusieurs mutations de la transcriptase inverse induites par les NRTI, telles que la mutation 41, 74, 184.... au sein des cellules mononucléées sanguines du sang périphérique de patients infectés, traités et porteurs de ces mutations. Cette réponse immune peut donc se mettre en place au cours de ces traitements mais semble incapable d'assurer à elle seule l'élimination des variants spécifiques. L'amplification de l'immunité dirigée contre ces mutations permettra de contrôler l'émergence de ces variants de VIH et de maintenir une suppression virale durable sous ces traitements. L'administration de vaccins contenant ces séquences virales mutées de la transcriptase inverse, avant ou au cours de l'administration de traitements par NRTI ou NNRTI devrait permettre de prévenir, retarder ou diminuer l'apparition de virus mutés capables de résister à ces traitements. Ce nouveau type d'immunisation thérapeutique vise ainsi à renforcer ou à prolonger l'efficacité des traitements antirétroviraux par les NRTI et/ou NNRTI. Ceci peut être secondairement appliqué à d'autres mutations induites par les autres classes d'antirétroviraux et peut également être utilisé en vaccination préventive. L'invention consiste donc en un traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales.
L'invention consiste également en les agents de traitement utilisés dans le cadre de ce traitement. L'invention a également pour objet la préparation d'immunogènes contenant les mutations de résistance aux NRTI et/ou NNRTI.
Plus particulièrement, l'invention consiste en la préparation d'immunogènes contenant les mutations de résistance à un ou des NNRTI utilisés seuls ou conjointement avec un ou des NRTI. L'invention a également pour objet les peptides éléments des immunogènes.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables, cette composition étant utilisée à titre de vaccin. Un autre objet de l'invention est la détermination d'épitopes reconnus par les
CTLs spécifiques des séquences peptidiques vaccinales introduites à la vaccination, utilisables à visée diagnostique.
Le procédé de traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales comporte une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou antitumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance. De préférence la phase de vaccination suit la phase de traitement par chimiothérapie.
La présente invention concerne également un agent de traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales qui comprend au moins deux composants :
- le premier composant comprenant un médicament destiné au traitement des pathologies infectieuses et ou anti-tumorales inducteur de mutations de résistance,
- le second composant comportant un vaccin dirigé contre ces mutations de résistance, les deux composants étant destinés à une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le temps.
La présente invention a également pour objet des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport aux séquences établies de la transcriptase inverse, en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NRTI et/ou NNRTI, les peptides étant caractérisés par le fait qu'ils sont capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifiques de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VIH, à l'exception des peptides de séquence ZrY-V-D-D-Z2, ZrY-I-D-D-Z2 et Zr
Y-L-D-D-Z2 avec Zx et Z2 étant au moins un acide aminé quelconque, ces peptides ayant été observés à la suite d'un traitement à la lamivudine seule (NRTI).
En particulier, l'invention a pour objet de préférence des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport aux séquences établies de la transcriptase inverse, en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NNRTI seuls ou à la suite d'un traitement combinant NNRTI et NRTI, les peptides étant caractérisés par le fait qu'ils sont capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifiques de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VLH.
De préférence, les peptides selon l'invention comportent de 15 à 50 acides aminés.
Les séquences des peptides selon l'invention peuvent être précédées ou suivies d'acides aminés neutres pouvant solubiliser ou stabiliser les peptides. Les peptides selon l'invention sont caractérisés par les séquences ou parties de séquence comportant au moins une des mutation Mp suivantes avec Xn étant un acide aminé correspondant à celui décrit dans la banque de données de Los Alamos à la même position de la séquence peptidique de la transcriptase inverse de VIH-1, et n étant la position d'un acide aminé décrit dans la banque de données de Los Alamos dans la séquence de la transcriptase inverse de VIH-1, et avec Mp étant un acide aminé muté et p étant le numéro de la mutation observée.
* Séquence A : aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
X X X X X Ml X X X X X X X X X dans laquelle Ml (aa 6) peut être muté en K, G ou S
* Séquence B : aa 30 3 1 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
X X X X X X X X X M2 X M3 X X X 45 46 47 48 49 50 X X X X X X dans laquelle M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L; l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M2 (aa 39) peut être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
* Séquence C aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
X X X X X Ml X X X X X X X X X
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
X X X X X X X X X X X X X X X
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
X X X X X X X X M2 X M3 X X X X
46 47 48 49 50 51
X X X X X X dans laquelle Ml (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S ;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41) peut être X41ou être muté en L ; l'un au moins de Ml, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, Ml (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S ;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41) peut être X41ou être muté en L ; avec Ml ou M2 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 aa
X X X X X X X X X M4 X X M5 X M6 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
M7 M8 M9 X X X M10 Mi l X M12 X X X X X
83 84 85 86 X X X X dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V; M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R; M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G; M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ; M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S; M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I; Ml 1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L; l'un au moins de M4 à Ml 2 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V; M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Mil (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L; l'un au moins de M4, M7 ou M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence E
51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 aa
X X X X X X X X X X X M4 X X M5 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 X M6 M7 M8 M9 X X X M10 Mil X M12 X X X
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 X X X X X X X M13 M14 M15 X X X X X
96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 1 10 X X M16 X M17 M18 X M19 X X M20 X M21 X X
1 1 1 1 12 1 13 1 14 115 116 1 17 1 18 119 120 121 122 123 124 125 X X X X M22 M23 X X M24 X X X X
126 127 128 X X X dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Mil (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être XI 15 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être XI 16 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être XI 19 ou être muté en S; l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Ml 1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
Ml 5 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
Ml 6 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être XI 15 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être XI 16 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être XI 19 ou être muté en S; l'un au moins de M4, M7, M12 à M21, M23 ou M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence F aa 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143
X X X X X X X X X M25 M26 X M27 X X
144 145 ι 6 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158
X X X X X X X M28 X X X X X M29 X 159 160 161 162 163 164 165 166 X X X X X X X X dans laquelle M25 (aa 138) peut être XI 38 ou être muté en A, G, K ou Q; M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K; M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ; M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M; M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ; l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention,
M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q; M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ; l'un au moins de M25 à M28 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence G
1 63 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 aa
X X X X X X X X X M30 X X X X X
178 179 180 181 182 183 184 185 1 86 187 188 189 190 191 192 M31 M32 X M33 X X M34 X X X M35 M36 M37 X X
193 194 195 196 197 198 199 X X X X X X X dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I; M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation. Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K; M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E; M33 (aa 181) peut être XI 81 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être XI 84 ou être muté en V, I ou T; M35 (aa 188) peut être XI 88 ou être muté en L, C ou H ; M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I; M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M30, M33, M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence H
169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 aa X X X M30 X X X X X M31 M32 X M33 X X
184 185 M34 X dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T; l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention,
M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F; M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être XI 81 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être XI 84 ou être muté en V, I ou T; l'un au moins de M30; M32 ou M33 représentant un acide aminé portant une mutation. Séquence I
184 1 85 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 M34 X X X M35 M36 M37 X X X X X X X X X dans laquelle M34 (aal84) peut être XI 84 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ; M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M34 (aal 84) peut être XI 84 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence J
aa 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 X X X X X X X X X M38 X M39 M40 X X
214 215 216 217 21 8 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 M41 M42 X X X M43 X X X M44 X M45 X M46 M47
229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 X X X X M48 M49 X M50 X M51 X M52 X X X
244 245 246 247 248 249 X X X X X X dans laquelle M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W; M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q; M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H; M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L; M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F; M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N; M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P; M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S; M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I; l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention,
M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F; M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L; M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S; M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I; l'un au moins de M38, M40, M44 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence K
324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 335 X X X X X X X X X M53 X X X X X
339 340 341 342 X X X X dans laquelle M53 (aa 333) peut être muté en E ou D; De préférence les peptides selon l'invention sont caractérisés par les séquences ou parties de séquence suivantes comportant au moins une des mutations Mp suivantes:
* Séquence A bis:
AA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15 P I S P I M1 T V P V K L K P G dans laquelle Ml (aa 6 - wt=E) peut être muté majoritairement en K, ou en G ou S ;
équιenoeB bis :
AA 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
K 1 K A L V E I C M2 E M3 E K E
45 46 47 48 49 50
G K 1 S K I dans laquelle M2 (aa 39- wt=T) peut être X39 ou être muté majoritairement en A, ou en K, ou N, ou P, ou M ou S;
M3 (aa 41- wt=M) peut être X41 ou être muté majoritairement en L; l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M2 (aa 39) peut être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
* Séquence C bis :
AA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
P 1 S P 1 Ml T V P v K L K P G
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
M D G P K V K Q W P L T E E K
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
1 K A L V E 1 C M2 E M3 E K E G
46 47 48 49 50 51
K 1 S K 1 G dans laquelle Ml (aa 6- wt=E) peut être muté majoritairement en K,ou en G ou S M2 (aa 39- wt=T) peut être X39 ou être muté majoritairement en A, ou en K, ou N, ou P, ou M ou S ;
M3 (aa 41- wt=M) peut être X41ou être muté majoritairement en L ; l'un au moins de Ml, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, Ml (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S ;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ; M3 (aa 41) peut être X41ou être muté en L ; avec Ml ou M2 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D bis :
AA 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67
E N P Y N T P V F M4 1 K M5 K M6
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
M7 M8 M9 W R K M10 Mil D M12 R E L N K
83 84 85 86
R T Q D
dans laquelle M4 (aa 62- wt=A) peut être X62 ou être muté majoritairement en V;
M5 (aa 65- wt=K) peut être X65 ou être muté majoritairement en R;
M6 (aa 67- wt=D) peut être X67 ou être muté majoritairement en N ou G;
M7 (aa 68- wt=S) peut être X68 ou être muté majoritairement en G ou N ;
M8 (aa 69- wt=T) peut être X69 ou être muté majoritairement en D, ou en N, ou S, ou A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS,
SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70- wt=K) peut être X70 ou être muté majoritairement en R, ou en N, ou E ou S;
M10 (aa 74- wt=L) peut être X74 ou être muté majoritairement en V ou en I; Ml 1 (aa 75- wt=V) peut être X75 ou être muté majoritairement en M, ou en I, ou L ou T;
M12 (aa 77- wt=F) peut être X77 ou être muté majoritairement en L; l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V; M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R; M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G; M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ; M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S; M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I; Ml 1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L; l'un au moins de M4, M7 ou M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence E bis :
51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
G P E N P Y N T P V F M4 I K M5
66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
K M6 M7 M8 M9 W R K M10 Mil D M12 R E L
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
N K R T Q D F M13 M14 M15 Q L G 1 P
96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110
H P M16 G M17 M18 K M19 K S M20 T M21 L D
111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125
V G D A M22 M23 S V M24 L D E D F R
126 127 128
K Y T dans laquelle M4 (aa 62- wt=A) peut être X62 ou être muté majoritairement en V; M5 (aa 65- wt=K) peut être X65 ou être muté majoritairement en R; M6 (aa 67- wt=D) peut être X67 ou être muté majoritairement en N ou en G; M7 (aa 68- wt=S) peut être X68 ou être muté majoritairement en G ou en N ;
M8 (aa 69- wt=T) peut être X69 ou être muté majoritairement en D, ou en N, ou S, ou A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ; M9 (aa 70- wt=K) peut être X70 ou être muté majoritairement en R, ou en N, ou E ou S;
M10 (aa 74- wt=L) peut être X74 ou être muté majoritairement en V ou en I;
Ml 1 (aa 75- wt=V) peut être X75 ou être muté majoritairement en M, ou en I, ou L ou T;
M12 (aa 77- wt=F) peut être X77 ou être muté majoritairement en L;
M13 (aa 88- wt=W) peut être X88 ou être muté majoritairement en C;
M14 (aa 89- wt=E) peut être X89 ou être muté majoritairement en G ;
M15 (aa 90- wt=V) peut être X90 ou être muté majoritairement en I; M16 (aa 98- wt=A) peut être X98 ou être muté majoritairement en S ou en G;
Ml 7 (aa 100- wt=L) peut être XI 00 ou être muté majoritairement en I;
M18 (aa 101- wt=K) peut être X101 ou être muté majoritairement en E, ou en Q, ou
R, ou I ou P;
M19 (aa 103- wt=K) peut être X103 ou être muté en N, majoritairement Q, ou en R, ou T ou S;
M20 (aa 106- wt=V) peut être X106 ou être muté majoritairement en A, ou en I ou
L;
M21 (aa 108- wt=V) peut être X108 ou être muté majoritairement en I;
M22 (aa 115- t=Y) peut être XI 15 ou être muté majoritairement en F; M23 (aa 116- wt=F) peut être XI 16 ou être muté majoritairement en Y;
M24 (aa 119- t=P) peut être XI 19 ou être muté majoritairement en S; l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V; M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Ml 1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L; M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C; M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ; Ml 5 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I; M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S; M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P; M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S; M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L; M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I; M22 (aa 115) peut être XI 15 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être XI 16 ou être muté en Y; M24 (aa 119) peut être XI 19 ou être muté en S; l'un au moins de M4, M7, M12 à M21, M23 ou M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence F bis : ιA 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 A F T 1 P S I N N M25 M26 P M27 I R
144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 Y Q Y N V L P M28 G W K G S M29 A
159 160 161 162 163 164 165 166 1 F Q S S M T K dans laquelle M25 (aa 138- wt=E) peut être X138 ou être muté majoritairement en
A, ou en G, ou K ou Q; M26 (aa 139- wt=T) peut être X139 ou être muté majoritairement en I, ou en M ou
K;
M27 (aa 141- wt=G) peut être X141 ou être muté majoritairement en E ;
M28 (aa 151- wt=Q) peut être X151 ou être muté majoritairement en M;
M29 (aa 157- wt=P) peut être X157 ou être muté majoritairement en S ; l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M25 (aa 138) peut être XI 38 ou être muté en A, G, K ou Q; M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K; M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ; M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M; M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ; l'un au moins de M25 à M28 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence G bis :
AA 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 S M T K I L E P F M30 K Q N P D
178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 M31 M32 I M33 Q Y M34 D D L M35 M36 M37 S D
193 194 195 196 197 198 199 L E I G Q H R dans laquelle M30 (aa 172- wt=R) peut être X172 ou être muté majoritairement en
K;
M31 (aa 178- wt≈I) peut être X178 ou être muté majoritairement en M, L ou en F; M32 (aa 179- wt=V) peut être X179 ou être muté majoritairement en I, ou en L, ou
D ou E;
M33 (aa 181- wt≈Y) peut être XI 81 ou être muté majoritairement en C ou en I;
M34 (aa 184- wt≈M) peut être XI 84 ou être muté majoritairement en V, ou en I ou
T; M35 (aa 188- wt≈Y) peut être X188 ou être muté majoritairement en L, ou en C ou
H ;
M36 (aa 189- wt=V) peut être XI 89 ou être muté majoritairement en I;
M37 (aa 190- wt≈G) peut être X190 ou être muté majoritairement en A, ou en S, ou
E, ou Q ou T; l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention,
M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être XI 84 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M30, M33, M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence H bis :
AA 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 E P F M30 K Q N P D M31 M32 I M33 Q Y
184 185 M34 D dans laquelle M30 (aa 172- wt=R) peut être X172 ou être muté majoritairement en
K;
M31 (aa 178- wt=I) peut être X178 ou être muté majoritairement en M, ou en L ;
M32 (aa 179- wt=V) peut être X179 ou être muté majoritairement en I, ou en L, ou D ou E;
M33 (aa 181- wt≈Y) peut être X181 ou être muté majoritairement en C ou en I;
M34 (aa 184- wt=M) peut être XI 84 ou être muté majoritairement en V, ou en I ou
T; l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention,
M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E; M33 (aa 181) peut être XI 81 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être XI 84 ou être muté en V, I ou T; l'un au moins de M30; M32 ou M33 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence I bis :
AA 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 M34 D D L M35 M36 M37 S D L E I G Q H
199 R dans laquelle M34 (aa 184- wt=M) peut être X184 ou être muté majoritairement en V, ou en I ou T; dans laquelle M35 (aa 188- wt≈Y) peut être X188 ou être muté majoritairement en L, ou en C ou H ;
M36 (aa 189- wt≈V) peut être XI 89 ou être muté majoritairement en I M37 (aa 190- wt≈G) peut être X190 ou être muté majoritairement en A, ou en S, ou E, ou Q ou T; l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M34 (aal84) peut être XI 84 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I; M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence J bis :
AA 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 R T K I E E L R Q M38 L M39 M40 W G
214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 M41 M42 T P D M43 K H Q M44 E M45 P M46 M47
229 230 23 1 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 W M G Y M48 M49 H M50 D M51 W M52 V Q P
244 245 246 247 248 249 I V L P E K dans laquelle M38 (aa 208- wt≈H) peut être X208 ou être muté majoritairement en
Y;
M39 (aa 210- wt=L) peut être X210 ou être muté majoritairement en W; M40 (aa 211- wt≈R) peut être X211 ou être muté majoritairement en K, ou en A, ou E, ou N, ou D, ou G ou Q;
M41 (aa 214- wt≈F ou L) peut être X214 ou être muté majoritairement en L ou en
F;
M42 (aa 215- wt≈T) peut être X215 ou être muté majoritairement en Y, ou en F ou C;
M43 (aa 219- wt≈K) peut être X219 ou être muté majoritairement en Q, ou en E, ou
N, ou R, ouT ou W; M44 (aa 223- wt≈K) peut être X223 ou être muté majoritairement en Q; M45 (aa 225- wt≈P) peut être X225 ou être muté majoritairement en H; M46 (aa 227- wt≈F) peut être X227 ou être muté majoritairement en L; M47 (aa 228- wt≈L) peut être X228 ou être muté majoritairement en R, ou en H ou F;
M48 (aa 233- wt≈E) peut être X233 ou être muté majoritairement en V, ou en N M49 (aa 234- wt≈L) peut être X234 ou être muté majoritairement en I, ou en H ou
P;
M50 (aa 236- wt≈P) peut être X236 ou être muté majoritairement en M, ou en S ou L;
M51 (aa 238- wt≈K) peut être X238 ou être muté majoritairement en T ou en S; M52 (aa 240- wt≈T) peut être X240 ou être muté majoritairement en A, ou en D ou
I; l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention,
M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q; M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H; M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L; M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S ;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I; l'un au moins de M38, M40, M44 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation. * Séquence K bis :
AA 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 D L I A E I Q K Q M53 Q G Q W T
339 340 341 342 Y Q I Y dans laquelle M53 (aa 333- wt≈G) peut être muté majoritairement en E ou en D.
L'invention porte également sur une composition pharmaceutique à base d'au moins un peptide, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables, pour leur utilisation à titre de vaccin.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut également comporter en plus, des immunomodulateurs tels que des cytokines ou des chimiokines.
On peut ajouter dans la composition pharmaceutique selon l'invention, des adjuvants tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant incomplet de
Freund notamment), des copolymères anioniques, des motifs CpG
Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins un peptide selon l'invention entre dans la composition d'un lipopeptide ou d'une lipoprotéine. En effet, l'association d'un peptide à une séquence d'acides gras ou de phospholipides permet d'observer une potentialisation de la réponse immunogene par rapport à celle entraînée par l'administration de l'antigène seul.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être couplés à des micro ou nano particules constituées d'un noyau polysaccharidique et/ou recouverts notamment d'une bicouche lipidique. Ils peuvent également être couplés à un ou des liposomes ou un ou des niosomes.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans un virus recombinant, ou un vecteur viral recombinant, ou dans un virus atténué ou inactivé. Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans une bactérie recombinante ou dans un vecteur bactérien recombinant.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans une cellule présentatrice d'antigène.
Un autre objet de l'invention est un vaccin comportant au moins un ADN nu ou un ARN nu codant au moins un peptide selon l'invention. Un autre objet de l'invention est que l'agent de traitement des malades infectés par le VIH, comporte au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NRTI et/ou NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide selon l'invention. Ces compositions sont destinées à une application séquentielle, séparée ou non dans le temps ou simultanée.
Préférentiellement, l'agent de traitement des malades infectés par le VIH, comporte au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est un procédé de prévention ou traitement d'une infection par le virus VIH. Ce procédé consiste en l'induction d'une réponse immunitaire de type T spécifique en réponse à l'administration d'un vaccin selon l'invention. De préférence, la ou les mutations du virus VTH se situent dans l'enzyme transcriptase inverse.
Un autre objet de l'invention est des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés, reconnues en tant que séquences épitopiques par les cellules T spécifiques des séquences peptidiques correspondant préalablement à la vaccination introduites à la vaccination. Les séquences épitopiques selon l'invention sont des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp. Préférentiellement, ces séquences peptidiques sont constituées de 8 à 10 acides aminés contigus choisis dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp. Plus préférentiellement, les séquences épitopiques selon l'invention sont constituées de 9 acides aminés contigus choisis dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp.
Les séquences épitopiques possédant les caractéristiques énoncées, sont utilisables pour la détermination et la quantification des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques.
L'invention a également pour objet une composition diagnostique de détermination des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques caractérisée par le fait qu'elle comprend, entre autres, au moins une séquence épitopique selon l'invention. Les vaccins obtenus selon les procédés de l'invention peuvent être formulés en tant que compositions pharmaceutiques pour une administration sous-cutanée, intramusculaire intra-dermale ou intra- veineuse. Les techniques d'administration de ce type de vaccins sont abondamment décrites dans la littérature et sont bien connues de l'homme du métier.
Des excipients acceptables au niveau pharmaceutique peuvent être ajoutés en fonction de la technique d'administration utilisée. On pourra en particulier ajouter des excipients aqueux telle qu'une solution saline tampon. Ces solutions sont stériles et dépourvues de substances toxiques ou pyrogènes. Les compositions selon l'invention peuvent être stérilisées par des méthodes de stérilisation conventionnelles et connues.
Selon le mode d'administration, les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes habituellement utilisées en diagnostic.
Les compositions selon l'invention peuvent en particulier contenir des substances acceptables au niveau pharmaceutique telles que des stabilisateurs de pH, des agents tampon ou par exemple de l'acétate de sodium, du chlorure de sodium, de potassium, de calcium, du lactate de sodium ou d'autres afin d'être dans des conditions physiologiques.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement.
Exemple 1 : Génération des lignées CTLs :
Les conséquences de mutations induites sous NRTI sur les réponses CTL spécifiques de la RT ont été étudiées. Un total de 66 échantillons sanguins provenant de
35 patients traités ou non en mono- ou bi -thérapie avec des NRTI, sans inhibiteur de protéase, a été collecté pendant 1 à 6 ans chaque année entre 1991 et 1996.
Pour analyser la reconnaissance des produits des gènes pol et rt du virus VLH- 1 , des lignées VIH-spécifiques ont été générées par co-culture des PBMC (peripheral blood mononuclear cells) de patients et de PHA-blastes autologues. Des PBMC stimulés avec de la PHA (phytohémagglutinine) à 2 μg/ml pendant 18h à 37 °C en atmosphère humide à 5 % de CO2 et irradiés à 5000 rads sont ajoutés à des PBMC autologues fraîchement décongelés à un ratio de 1 :5 et déposés dans des plaques de 24 puits à la concentration de 1x10^ /ml. Les lignées CTLs sont cultivées pendant au moins 3 semaines en présence dTnterleukine 2 à 20 U/ml, ajoutée au troisième jour de la culture et ensuite tous les 3 jours. Ces lignées sont testées pour leur activité cytotoxique après au moins 3 semaines de culture contre des lignées autologues B-EBV (Lymphocytes B transformés par l'EBV) servant de cibles.
On a mis en oeuvre le même procédé en ce qui concerne les mutations induites sous traitement aux NNRTI ou sous traitement conjoint aux NNRTI et NRTI.
Exemple 2 : Test CTL
L'activité CTL a été mesurée en utilisant un test de relargage de ^lchrome. Les cellules cibles sont des lignées B-EBV autologues infectées par les différents viras recombinants de la vaccine exprimant le gène pol ou des fragments du gène pol du VIH-1, à une multiplicité d'infection de 5 PFU (Plaque Forming Unit) / cellule, 18h avant le test CTL. Le virus de la vaccine sauvage non recombiné (Vac-WT) sert de contrôle. Les cellules cibles sont incubées en culot en présence de Na2^Crθ4 (activité spécifique 2mci/ml), à la concentration de 70 μci/xlO^ cellules, pendant 2 h à 37°C. La radioactivité mesurée est calculée selon la formule suivante : (relargage expérimental - relargage spontané / (relargage total - relargage spontané) X 100 = % de lyse spécifique. Les réponses CTL sont considérées comme positives lorsque l'on obtient plus de 10% de lyse spécifique, ceci à au moins 2 rapports effecteurs/ cibles successifs.
L'analyse de la reconnaissance des régions RT-1 : 1-143 et RT-2 : 143-293 s'est faite sur des lignées CTL spécifiques de Pol. Les réponses T cytotoxiques ont été évaluées en utilisant un test de relargage de chrome 51. Les cellules cibles étaient des lignées-B-EBV autologues infectées par des virus de la vaccine exprimant différents fragments de gènes de la rt (RT-1 : 1-143 et RT-2 : 143-293).
Exemple 3 : Détection des mutations de résistance :
Les mutations de résistance ont été détectées dans l'ADN proviral en utilisant un test LiPA VIH-1 RT (Murex. Diagnostics SA, Châtillon, France). Ce test permet la détection simultanée des séquences de type "sauvage" et des mutations de résistance (41, 69, 70, 74, 184, 214 et 215) induites par les inhibiteurs nucléosidiques de la RT (NRTI). À partir de l'ADN isolé des PBMC, une amplification du gène de la rt est réalisée en utilisant des amorces biotinylées, l'ADN biotinylé est ensuite hybride avec des sondes oligo-nucléotidiques spécifiques immobilisées en lignes parallèles sur une bandelette. L'addition de streptavidine marquée à la phosphatase alcaline entraîne une liaison de celle-ci avec les hybrides biotinylés formés qui conduit à la formation d'un précipité violet /brun. Les séquences sauvages et mutées de la rt localisées au niveau des différents codons peuvent être localisées au niveau de la même bandelette.
Exemple 4 : Test ELISpot
Pour la reconnaissance de peptides épitopiques, un test ELISpot-IFNγ où les PBMC étaient incubés, sans stimulation préalable, avec le peptide d'intérêt a été utilisé. Les 96 puits d'une plaque de type Immobilon p (Millipore, Molsheim, France) sont recouverts pendant 18h à 4°C avec un anticorps de capture anti-IFNγ (interféron γ) monoclonal (IgGl B-Bl à lμg/ml Diaclone, Besançon, France). Après 3 lavages, les
PBMC sont ajoutés en triplicata à la concentration de 1x10^ et 5x10^ cellules par puits en présence de 5 μg/ml de peptide ou de 0,5 μg/ml de PHA, utilisé comme témoin positif ou de milieu seul utilisé comme témoin négatif. Les plaques sont ensuite incubées pendant 40h à 37°C en atmosphère humide à 5 % de CO2, puis lavées, l'anticorps de détection anti-IFNγ monoclonal biotinylé (B-Gl à 0,2 μ.g/ml Diaclone,
Besançon, France) est ensuite ajouté et les plaques sont de nouveau incubées pendant 4h à 37°C. Après les lavages, la streptavidine marquée à la phosphatase alcaline (Amersham, Les Ulis, France) est ajoutée et la plaque est incubée pendant lh à 37°C. La plaque est ensuite lavée puis incubée avec du BCIP/NTP (Sigma, Aldrich, Saint Quentin, France), des spots violets apparaissent après 10 à 15 min. La plaque est lavée avec de l'eau pour arrêter la réaction. Les spots sont comptés à l'aide d'un lecteur ELISpot automatique. Le nombre de cellules T spécifiques répondeuses est calculé après soustraction des valeurs du contrôle négatif. La fréquence de cellules sécrétant de lTFNγ est rendue en SFC (Spot Forming Cells).
Exemple N°5 : Découpage de la séquence B (aa 30-50) en différents peptides de longueur variant entre 8 et 21 acides aminés. Les séquences peptidiques sont découpées en peptides de 8 à 80 acides aminés (aa) impliquant n'importe quelle partie de la séquence recouvrant au moins une mutation , ceci pour des applications thérapeutiques ou diagnostiques.
Pour la séquence peptidique 30-50 où M2 correspond à l'aa 39 muté (A) et M3 correspond à l'aa 41 muté (L):
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 8 aa: aa 32-39 32 33 34 35 36 37 38 39
K A L V E I C A aa 33-40 33 34 35 36 37 38 39 40
A L V E I C A E aa 34-41 34 35 36 37 38 39 40 41
L V E I C A E L aa 35-42 35 36 37 38 39 40 41 42
V E I C A E L E aa 36-43 36 37 38 39 40 41 42 43
E I C A E L E K aa 37-44 37 38 39 40 41 42 43 44
I C A E L E K E aa 38-45 38 39 40 41 42 43 44 45
C A E L E K E G aa 39-46 39 40 41 42 43 44 45 46
A E L E K E G K aa 40-47 40 41 42 43 44 45 46 47
E L E K E G K I aa 41-48 41 42 43 44 45 46 47 48
L E K E G K I S
* Séquences de 9 aa: aa 31-39 31 32 33 34 35 36 37 38 39 I K A L V E I C A aa 32-40 32 33 34 35 36 37 38 39 40
K A L V E I C A E aa 33-41 33 34 35 36 37 38 39 40 41
A L V E I C A E L aa 34-42 34 35 36 37 38 39 40 41 42
L V E l C A E L E aa 35-43 35 36 37 38 39 40 41 42 43
V E I C A E L E K aa 36-44 36 37 38 39 40 41 42 43 44
E I C A E L E K E aa 37-45 37 38 39 40 41 42 43 44 45
I C A E L E K E G aa 38-46 38 39 40 41 42 43 44 45 46
C A E L E K E G K aa 39-47 39 40 41 42 43 44 45 46 47
A E L E K E G K I aa 40-48 40 41 42 43 44 45 46 47 48
E L E K E G K I S aa 41-49 41 42 43 44 45 46 47 48 49
L E K E G K I S K
* Séquences de 10 aa: aa 30-39 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 K I K A L V E I C A aa 31-40 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 I K A L V E I C A E aa 32-41 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 K A L V E I C A E L aa 33-42 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 A L V E I C A E L E aa 34-43 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 L V E I C A E L E K aa 35-44 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 V E I C A E L E K E aa 36-45 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 E l C A E L E K E G aa 37-46 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 I C A E L E K E G K aa 38-47 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 C A E L E K E G K I
AA 39- 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 48
A E L E K E G K I S aa 40-49 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 E L E K E G K I S K aa 41-50 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 L E K E G K I S K I
* Séquences de 11 aa: aa 30-40 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 K I K A L V E I C A E aa 31-41 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 I K A L V E I C A E L aa 32-42 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 K A L V E I C A E L E aa 33-43 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 A L V E I C A E L E K aa 34-44 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 L V E I C A E L E K E aa 35-45 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 V E I C A E L E K E G aa 36-46 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 E l C A E L E K E G K aa 37-47 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 I C A E L E K E G K I aa 38-48 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 C A E L E K E G K I S aa 39-49 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 A E L E K E G K I S K aa 40-50 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 E L E K E G K I S K I * Séquences de 12 aa: aa 30-41 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 K I K A L V E I C A E L aa 31-42 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 I K A L V E I C A E L E aa 32-43 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 K A L V E I C A E L E K aa 33-44 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 A L V E I C A E L E K E aa 34-45 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 L V E I C A E L E K E G aa 35-46 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 V E I C A E L E K E G K aa 36-47 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 E l C A E L E K E G K I aa 37-48 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 I C A E L E K E G K I S aa 38-49 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 C A E L E K E G K I S K aa 39-50 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 13 aa: aa 30-42 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 K I K A L V E I C A E L E aa 31-43 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 I K A L V E I C A E L E K aa 32-44 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K A L V E I C A E L E K E aa 33-45 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 A L V E I C A E L E K E G aa 34-46 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 L V E I C A E L E K E G K aa 35-47 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 V E I C A E L E K E G K I aa 36-48 36 37 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 E I A E L E K E G K I S aa 37-49 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 I C A E L E K E G K I S K aa 38-50 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 14 aa: aa 30-43 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 K I K A L V E I C A E L E K aa 31-44 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 I K A L V E I C A E L E K E aa 32-45 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 K A L V E I C A E L E K E G aa 33-46 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 A L V E I C A E L E K E G K aa 34-47 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 L V E I C A E L E K E G K I aa 35-48 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 V E I C A E L E K E G K I S aa 36-49 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 E I C A E L E K E G K I S K aa 37-50 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 15 aa: aa 30-44 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K I K A L V E I C A E L E K E aa 31-45 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 I K A L V E I C A E L E K E G aa 32-46 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 K A L V E I C A E L E K E G K aa 33-47 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 A L V E I C A E L E K E G K I aa 34-48 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 L V E I C A E L E K E G K I S aa 35-49 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 V E I C A E L E K E G K I S K aa 36-50 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 16 aa: aa 30-45 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 K I K A L V E I C A E L E K E G aa 31-46 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 I K A L V E I C A E L E K E G K aa 32-47 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 K A L V E I C A E L E K E G K I aa 33-48 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 A L V E I C A E L E K E G K I S aa 34-49 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 L V E I C A E L E K E G K I S K aa 35-50 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 17 aa: aa 30-46 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 K I K A L V E I C A E L E K E G K aa 31-47 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 I K A L V E I C A E L E K E G K I aa 32-48 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 K A L V E I C A E L E K E G K I S aa33-49 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 A L V E I C A E L E K E G K I S K aa 34-50 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 18 aa: aa 30-47 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 K l K A L V E I C A E L E K E G K I aa 31-48 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 I K A L V E I C A E L E K E G K I S aa 32-49 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 K A L V E I C A E L E K E G K I S K aa 33-50 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 19 aa: aa 30-48 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S aa 31-49 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 I K A L V E I C A E L E K E G K I S K aa 32-50 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 20 aa: aa 30-49 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K aa 31-50 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 21 aa: aa 30-50 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
Exemple N°6 : Détection de mutations de résistance sur l'APN pro viral isolé des cellules mononucléées sanguines (CMNS) du patient 201#5.
Chez le patient 201#5 traité par NRTI, la détection des mutations de résistance s'est faite dans l'ADN proviral en utilisant un test LiPA VIH-l-RT (voir exemple 3). Le test LiPA permet la définition d'acides aminés mutés de façon ponctuelle au sein d'une séquence donnée et non celle de séquences d'acides nucléiques. La méthode de détection des mutations de résistance sur l'ADN est résumée dans la figure 1.
En utilisant ce test, nous avons détecté chez ce patient les mutations 41, 184 et 215. La séquence RT du prélèvement du patient 201#5 est ainsi :
Xx41(L)Xxl84(V)Xx215(Y ou F)Xx
Dans laquelle Xx représente une séquence de référence en acides aminés.
Exemple N°7 : Evaluation ex-vivo de l'immunogénicité de la mutation 41
(M>L) sur les CMNS du Patient 201#5
La reconnaissance de la mutation 41 (M>L) de la RT par les cellules CD8 productrices d'IFN-gamma est étudiée chez le patient 201#5 traité par NRTI. La mutation 41 avait été détectée sur l'ADN proviral isolé de ces mêmes CMNS( voir exemple 6). La reconnaissance des peptides 33-41 sauvage et muté a été évaluée par
ELISpot.
Figure imgf000039_0001
La fréquence de reconnaissance du peptide 33-41 muté est de 95 SFC / 106 CMNS et de 3 SFC / 106 CMNS pour le peptide 33-41 sauvage.
Exemple N°8 : Structure d'un lipopeptide
La structure générale d'un lipopeptide est décrite dans la figure 2 Un lipopeptide se compose d'un acide palmitique de formule C16H32O2 ou décrit dans le texte comme C15H3rCOOH, d'un résidu lysine (acide aminé basique ajouté à l'extrémité N-terminale du peptide) et d'un peptide dont la structure est choisie au sein des séquences décrites. Pour le peptide 30-50 (séquence B) :
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
K l K A L V E I C M2 E M3 E K E
45 46 47 48 49 50 G K I S K l dans lequel M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S; M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L; l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Exemple de Lipopeptide construit avec la séquence 30-50 incluant les mutations de résistance 39 et 41 induites par les NRTI
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
K l K A L V E I C A E L E K E
45 46 47 48 49 50
G K I S K I Ce peptide est noté sous la forme aa30-aa50 (aa50=I)
Dans cet exemple, l'ajout de la lysine se fait sur l'acide aminé 50 qui est une isoleucine (I). La fonction aminé de la chaîne latérale de la lysine est modifiée par un acide palmitique et l'acide aminé C terminal est amidaté selon les réactions suivantes : aa30-aa50-NH2 + lysine -» aa30-aa50-NH-CO-Lysine aa30-aa50 -NH-CO-Lysine + COOH-C15H31 CONH2-aàa30-aa50 -NH-CO-Lysine-NH-CO-C15H31
Cette structure varie selon les procédés industriels . Ainsi la lysine peut être ajoutée à l'extrémité C-terminale du peptide.
Cette structure est ensuite purifiée et conditionnée selon des procédés industriels répondant aux conditions nécessaires à l'obtention de lots cliniques avant utilisation pour immunisation chez l'homme.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de traitement de pathologies infectieuses et/ou tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inducteur de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance.
2. Agent de traitement des pathologies infectieuses ou tumorales comprenant au moins deux composants :
- le premier composant comprenant un médicament destiné au traitement des pathologies infectieuses et/ou anti-tumorale inducteur de mutations de résistance,
- le second composant comportant un vaccin dirigé contre ces mutations de résistance, les deux composants étant destinés à une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le temps.
3. Peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport à des séquences de référence de la transcriptase inverse établies en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NRTI et ou NNRTI dans des patients infectés par le VIH, les peptides étant capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifique de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VIH, à l'exception des peptides de séquence Zj-Y-V-D-D-Zj, ZrY- I-D-D-Z2 et ZrY-L-D-D-Z2 avec Zj et Z2 étant au moins un acide aminé quelconque.
4. Peptides selon la revendication 3, caractérisés par le fait qu'ils comportent de préférence de 15 à 50 acides aminés.
5. Peptides selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisés par le fait que leur séquence peptidique peut être précédée ou suivie par un ou des acides aminés neutres pour solubiliser ou stabiliser les peptides.
6. Peptides selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, de séquence ou partie de séquence suivante comportant au moins une mutation Mp : n
- avec X (qui sera écrit pour la commodité de ce qui suit : Xn) étant un acide aminé correspondant à celui décrit dans la banque de données de Los Alamos à la même position de la séquence peptidique de la transcriptase inverse de VLH-1 et n étant la position d'un acide aminé (aa) décrit dans la banque de données de Los Alamos dans la séquence de la transcriptase inverse de VIH-1.
- avec Mp étant un acide aminé muté et p étant le numéro de la mutation observée.
* Séquence A : aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
X X X X X Ml X X X X X X X X X dans laquelle Ml (aa 6) peut être muté en K, G ou S
* Séquence B: aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
X X X X X X X X X M2 X M3 X X X
45 46 47 48 49 50
X X X X X X dans laquelle M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L; l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence C aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
X X X X X Ml X X X X X X X X X
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
X X X X X X X X X X X X X X X
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
X X X X X X X X M2 X M3 X X X X
46 47 48 49 50 51
X X X X X X dans laquelle Ml (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S ;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41) peut être X41ou être muté en L ; l'un au moins de Ml, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence D
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 X X X X X X X X X M4 X X M5 X M6 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
M7 M8 M9 X X X M10 Mil X M12 X X X X X
83 84 85 86
X X X X dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ; M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S; M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I; Ml 1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T; M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L; l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence E
51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 aa
X X X X X X X X X X X M4 X X M5
66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
X M6 M7 M8 M9 X X X M10 Mil X M12 X X X
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
X X X X X X X M13 M14 M15 X X X X X
96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 11C
X X M16 X M17 M18 X M19 X X M20 X M21 X X
111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125
X X X X M22 M23 X X M24 X X X X
126 127 128
X X X dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V; M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R; M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G; M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ; M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ; M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S; M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I; Ml 1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T; M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L; M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C; M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ; M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I; M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S; M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I; M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P; M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S; M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L; M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I; M22 (aa 115) peut être XI 15 ou être muté en F; M23 (aa 116) peut être XI 16 ou être muté en Y; M24 (aa 119) peut être XI 19 ou être muté en S; l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence F aa 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 X X X X X X X X X M25 M26 X M27 X X
144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 X X X X X X X M28 X X X X X M29 X
159 160 161 162 163 164 165 166 X X X X X X X X dans laquelle M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ; l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence G 1 63 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 aa
X X X X X X X X X M30 X X X X X
178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 M31 M32 X M33 X X M34 X X X M35 M35 M37 X X
193 194 195 196 197 198 199 X X X X X X X dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être XI 84 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence H
169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 aa
X X X M30 X X X X X M31 M32 X M33 X X
184 185 M34 X dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être XI 84 ou être muté en V, I ou T; l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence I
aa 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 M34 X X X M35 M36 M37 X X X X X X X X X dans laquelle M34 (aal84) peut être XI 84
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ; M36 (aa 189) peut être XI 89 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T; l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence J aa 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 X X X X X X X X X M38 X M39 M40 X X
214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 M41 M42 X X X M43 X X X M44 X M45 X M46 M47
229 230 23 1 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 X X X X M48 M49 X M50 X M51 X M52 X X X
244 245 246 247 248 249 X X X X X X dans laquelle M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I; l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence K aa 324 325 326 327 328 329 330 33 1 332 333 334 335 336 337 338
X X X X X X X X X M53 X X X X X
339 340 341 342 X X X X dans laquelle M53 (aa 333) peut être muté en E ou D;
7. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide selon les revendications 3 à 6, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables.
8. Peptides selon l'une des revendications 3 à 6 ou composition selon la revendication 5, pour leur utilisation à titre de vaccin.
9. Vaccin caractérisé par le fait qu'il contient au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6.
10. Vaccin caractérisé par le fait qu'il contient au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6 auquel sont ajoutés des immunomodulateurs tels que des cytokines ou chimiokines.
11. Vaccin caractérisé par le fait qu'il contient au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6 auquel sont ajoutés des adjuvants tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant incomplet de Freund), des copolymères anioniques, des motifs CpG
12. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à un lipopeptide.
13. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à une lipoprotéine.
14. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à des micro ou nano particules (a définir).
15. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à un ou des liposomes.
16. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à un ou des niosomes.
17. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un virus recombinant.
18. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un virus atténué ou inactivé.
19. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un vecteur viral recombinant.
20. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans une bactérie recombinante.
21. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un vecteur bactérien recombinant.
22. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans une cellule présentatrice d'antigène.
23. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins un ADN nu codant au moins un peptide tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 3 à 6.
24. Agent de traitement des malades infectés par le VIH, comportant au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NRTI et/ou NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6, ces compositions étant destinées à une application séquentielle, séparée ou non dans le temps ou simultanée.
25. Procédé de prévention ou traitement d'une infection par le virus VIH consistant en l'induction d'une réponse immunitaire de type T spécifique en réponse à l'administration d'un vaccin tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 9 à 23.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé par le fait que la ou les mutations du virus VLH se situent dans l'enzyme transcriptase inverse.
27. Séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés, caractérisées par le fait qu'elles sont reconnues en tant que séquences épitopiques par les cellules T spécifiques des séquences peptidiques vaccinales introduites à la vaccination.
28. Séquences épitopiques selon la revendication 27, caractérisées par le fait qu'elles sont des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp.
29. Séquences épitopiques selon la revendication 27, caractérisées par le fait qu'elles sont des séquences peptidiques de 8 à 10 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp.
30. Séquences épitopiques selon la revendication 27, caractérisées par le fait qu'elles sont des séquences peptidiques de 9 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp
3 1 . Utilisation des séquences épitopiques selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, pour la détermination et la quantification des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques.
32. Composition diagnostique de détermination des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins une séquence épitopique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 27 à 30.
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