JP3871708B2

JP3871708B2 - 抗原的に標識した非感染性レトロウィルス様粒子

Info

Publication number: JP3871708B2
Application number: JP50688396A
Authority: JP
Inventors: ロヴィンスキイ、ベンジャミン; カオ、シー−シアン; ヤウ、フェイ−ロン; パースソン、ロイ; エイチ．クライン、マイケル
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1994-08-15
Filing date: 1995-08-15
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2015-08-15
Also published as: AU3159995A; JPH10503933A; PT778888E; EP0778888B1; US5955342A; CA2197446A1; US5879925A; JP2006020635A; MX9701149A; AU704309B2; DK0778888T3; US5866320A; ATE331026T1; US5889176A; US6025125A; EP0778888A1; ES2268693T3; WO1996005292A1; DE69535075T2; DE69535075D1

Description

発明の属する技術分野
本発明は免疫学の分野に関するものであり、詳細には、抗原的に標識した非感染性レトロウィルス様粒子（シュードウィルス粒子（pseudovirion）と称される場合もある）に関する。
関連出願の引用
本願は、１９９４年８月１５日出願の米国特許出願０８／２９０１０５号の一部継続出願である。
発明の背景
ヒト免疫不全ウィルスはヒトレトロウィルスであり、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体である。１９８１年に米国でＡＩＤＳが最初に報告されて以来、１９４０００名を超える人がＡＩＤＳによって死亡し、米国のみで３３００００例を超えるＨＩＶ感染が報告されている。世界的には、１４００万人を超える人々がＨＩＶに感染していると推定されている。
１００種類を超えるＡＩＤＳ関連の医薬品がヒトでの治験中であるか、あるいはＦＤＡ承認を待っているが、現在この疾患に対する治療法はない。
従って、ワクチン候補剤として、診断アッセイおよびキットにおける抗原として有用な免疫原性製剤や、ＨＩＶその他のレトロウィルス性の疾患および感染の診断用の免疫試薬の登場が必要とされていることは明らかである。
特定の先行技術の免疫原性製剤には、非感染性非複製性ＨＩＶ様粒子などがある。そこで、１９９３年１０月１４日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９３／２０２２０号および１９９０年５月２日公開のＷＯ９１／０５８６０号（Whitehead Institute for Biomedical Research）では、ゲノムＲＮＡパッケージング（packaging）に必須のヌクレオチド配列に変化を有するＨＩＶゲノムを有してなる構造体と、哺乳動物細胞でのこれら構造体の発現によって得られる非感染性免疫原性ＨＩＶ粒子の製造が記載されている。
１９９１年５月３０日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９１／０７４２５号（Oncogen Limited Partnership）には、発現レトロウィルス蛋白が発生するレトロウィルス粒子中にアセンブリされるような形で成熟レトロウィルスコアおよびエンベロープ構造蛋白の同時発現（coexpression）によって得られる非複製性レトロウィルス粒子について記載されている。特定の非複製性ＨＩＶ−１様粒子は、ＨＩＶ−１gag遺伝子とプロテアーゼ遺伝子を有する組換えワクシニアウィルスとＨＩＶ−１env遺伝子を有する組換えワクシニアウィルスにより哺乳動物宿主細胞を同時に感染（coinfecting）させることで得られている。
本願譲受人の名前で公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／０５８６４号（本願の引用出願に含まれている）には、天然コンホメーションに少なくともgag、polおよびenvの蛋白を有し、長い末端反復を欠失しその天然ゲノム配置にgag、polおよびenv遺伝子を有する修飾レトロウィルスゲノムによってコードされた特定の非感染性非複製性レトロウィルス様粒子が記載されている。ＡＩＤＳに対してはワクチンも有効な治療法もなく、しかもそのような先行技術のＨＩＶ様粒子はその天然コンホメーションに多くのＨＩＶ蛋白を有することから、それによって免疫感作された宿主は、ＨＩＶによる感染とは免疫的に識別できない免疫応答を起こす可能性がある。現在は、ＨＩＶ感染者から得た熱失活抗ＨＩＶ抗血清と失活ＨＩＶが多くの診断法の成分として市販されている。安全性、取り扱い易さ、輸送、保管および使用のため、そのような熱失活抗血清および抗原を、上述のような非感染性ＨＩＶ粒子を用いた免疫感作によって生じる非感染性ＨＩＶおよび抗血清に切り換えることが好ましいと考えられる。さらに、これらの非感染性ＨＩＶ粒子を用いた免疫感作によって生じる抗血清は、熱失活による感染性ＨＩＶ除去を行う必要がない。しかしながら、ＨＩＶ感染は重大であることから、失活ＨＩＶとビルレントＨＩＶ粒子および非感染性非複製性ＨＩＶ粒子によって得られた非感染性非複製性ＨＩＶ粒子および抗血清とを区別できることが望ましい。そこで、ＡＩＤＳワクチン候補剤、免疫原性製剤ならびに診断法および診断キットの開発において、免疫的その他の方法でビルレントＨＩＶと識別可能なＨＩＶ様粒子を提供することは有用であると考えられる。
発明の概要
本発明は、ＨＩＶまたは別のレトロウィルス、特にヒトレトロウィルスによる感染と免疫原性製剤による免疫感作との間を識別する能力に関するものである。本発明はさらに、失活ビルレントＨＩＶ粒子と非感染性非複製性ＨＩＶ様粒子とを識別する能力に関するものでもある。本発明は、非感染性レトロウィルス様粒子にマーカーを組み込むものである。
従って１態様において、本発明は、（ａ）env遺伝子産物、（ｂ）pol遺伝子産物、（ｃ）gag遺伝子産物のアセンブリ、ならびに（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを含んでなる非感染性レトロウイルス様粒子を提供する。
少なくとも１個の抗原マーカーは約５〜約１００個のアミノ酸残基、特には約１０〜約７５のアミノ酸残基を有することができる。抗原マーカーは、別のウィルスからの抗原性エピトープを少なくとも１個有することができる。１実施態様において本発明は、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）コート蛋白からの少なくとも１個の抗原性エピトープ、具体的にはアミノ酸配列AFDTRNRIIEVEN（配列番号１）あるいはこの配列を認識する抗体を誘導することができる該配列の一部、変化体もしくは突然変異体またはそのようなアミノ酸配列の複数（具体的には１〜４個）のコピーなどによって説明される。
抗原マーカーは、いずれか簡便な方法で、env、polおよびgag遺伝子産物のアセンブリ中に組み込むことができる。本発明の１実施態様においては、マーカー配列をgag遺伝子産物内に持たせて、未修飾gag遺伝子産物の粒子形成性を有するハイブリッドgag遺伝子産物を形成する。マーカー配列は、抗原的に活性な挿入部位でgag遺伝子産物に抗原マーカーを挿入することでgag遺伝子産物中に入れることができる。
本発明の具体的な１実施態様においては、挿入部位は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物のアミノ酸残基２１０と２１１の間に位置する部位あるいは他のレトロウィルスgag遺伝子産物の相当する箇所とすることができる。
マーカー配列は、レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列の産生を欠失させるかあるいは防止することで得ることもできる。例えばそのようなエピトープは、内因性アンカー形成機能部分（function）を与える免疫優性領域ｇｐ４１を有することができる。そのような内因性アンカー形成機能部分をこのようにして除く場合、別の抗原性アンカー配列によってアンカー形成機能部分を与える。別法として、env遺伝子産物の免疫優性領域を、その領域からの少なくとも１個のアミノ酸を置換または除去することで修飾して、レトロウィルス感染宿主からの血清によって生じる突然変異において免疫優性領域の認識を実質的に防止することができる。
本発明のこの実施態様において、レトロウイルスをＨＩＶとすることができ、その免疫優性領域はアミノ酸配列LGIWGCSGKLIC（配列番号２７）を含むものとなる。そこにおいて、もたらされる変異の具体的なアミノ酸配列には、LGIWGCTGRKILC（配列番号２８）、LGIWGCAFRLIC（配列番号２９）およびLGIWGCTLELIC（配列番号３０）が含まれる。
従って、本発明の別の態様においては、（ａ）内因性のアンカー形成機能部分が、レトロウイルス様粒子に当該env遺伝子産物をアンカーする機能を果たすように当該env遺伝子産物に対して連結されている異種のアンカー配列により置換されてなる修飾env遺伝子産物、（ｂ）pol遺伝子産物、（ｃ）gag遺伝子産物のアセンブリを有してなる非感染性レトロウィルス様粒子が提供される。
アンカー配列は抗原性であることができ、約５〜約１００のアミノ酸残基、好ましくは約１０〜約７５のアミノ酸残基を有することができる。アンカー配列は、膜スパニング（spanning）蛋白のトランスメンブラン成分の一部、特には糖蛋白を少なくとも有することができる。そのような糖蛋白はインフルエンザウィルス蛋白、特にはヒトインフルエンザウィルス蛋白もしくはトリインフルエンザウィルス蛋白などの簡便な糖蛋白であることができる。
アンカー配列には、アミノ酸配列WILWISFAISCFLLCVVLLGFIMW（配列番号２）またはその配列を認識する抗体を産生する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体、アミノ酸配列STVASSLALAIMIAGLSFWMCSNGSLQ（配列番号３）またはその配列を認識する抗体を産生する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体、あるいはアミノ酸配列WILWISFAISCFLLCVVCWGSSCGPAKKATLGATFAFDSKEEWCREKKEQWE（配列番号４）またはその配列を認識する抗体を産生する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体などがあり得る。
好ましくは、アンカー配列は、env遺伝子産物の機能性開裂部位の上流で、かつ隣接させて、env遺伝子産物内に挿入されている。挿入部位は好ましくは、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のenv遺伝子産物のアミノ酸残基５０７および５０８の間あるいは他のレトロウィルスenv遺伝子産物の相当する箇所とする。
本発明のいずれかの態様に従って提供されるレトロウィルス様粒子は好ましくは、env、polおよびgag遺伝子産物がヒトレトロウィルスのenv、polおよびgag遺伝子産物に相当するもの、特にはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２とする。具体的には、ヒトレトロウィルスをＨＩＶ−１とすることができ、env遺伝子産物をＬＡＩenv遺伝子産物、ＭＮenv遺伝子産物、一次ＨＩＶ−１単離物からのenv遺伝子産物または抗原的にそれに等価なenv遺伝子産物とすることができる。gagおよびpol遺伝子産物は、env遺伝子産物を誘導するＨＩＶ−１単離物とは異なるＨＩＶ−１単離物から誘導することができる。特に、そのような粒子では、env遺伝子産物を一次ＨＩＶ−１単離物から誘導することができる。
本発明はさらに、本発明の非感染性レトロウィルス様粒子をコードする核酸分子をも含むものである。従って、本発明の別の態様においては、長い末端反復を欠失し、かつその天然ゲノム配置のgag、polおよびenv遺伝子ならびに非レトロウイルス性または非ＨＩＶウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片とを含んでいる修飾レトロウイルスゲノムからなる、非感染性レトロウイルス様粒子をコードする核酸分子が提供される。その核酸分子は、ＨＩＶ−１_LAI単離物のゲノムのSacIからXhoI断片に存在する特徴的な遺伝要素を有するＤＮＡ分子を有することができる。修飾ゲノムも、プライマー結合部位を欠失するものとすることができる。
本発明のこの態様の具体的な１実施態様例においては、少なくとも１個の抗原マーカーをコードした配列をgag遺伝子、具体的にはＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子のヌクレオチド１４１５におけるPatI部位または他のレトロウィルスgag遺伝子の相当する箇所に挿入する。一つの具体的部分は、

（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列のコピー１〜４個を有するものである。
各種ハイブリッド形成条件を用いて、ハイブリッド形成の選択性の程度を変化させることができる。選択性を高度なものとする場合、例えば約５０〜７０℃の温度で０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌという低塩濃度および／または高温条件のような厳しい条件を用いて、二本鎖を形成する。適用場面によっては、温度範囲約２０℃〜５５℃、塩濃度０．１５Ｍ〜０．９Ｍのように、ハイブリッド形成条件をそれほど厳しくする必要がない場合もある。加えるホルムアミドを増量することによってハイブリッド形成条件をより厳しくして、ハイブリッド二本鎖を不安定にすることもできる。
本発明のさらに別の態様においては、長い末端反復を欠失し、かつ天然ゲノム配置のgag、polおよびenv遺伝子を含んでなり、レトロウイルス様粒子にenv遺伝子産物をアンカーする機能を果たす抗原性アンカー配列をコードする断片をその内に擁する修飾env遺伝子を持ち、それによって、この修飾env遺伝子は、envの内因性アンカー機能を抗原性のアンカー配列により置き換えられている改変env遺伝子産物をコードしている、修飾レトロウイルスゲノムからなる非感染性レトロウイルス様粒子をコードする核酸分子を提供される。
本発明のこの態様の具体的な１実施態様例においては、抗原マーカー配列をコードした部分は、env遺伝子、具体的にはＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のenv遺伝子のヌクレオチド７７７７と７７７８との間または他のレトロウィルスenv遺伝子の相当する箇所に挿入する。アンカー配列をコードした一つの具体的部分は、

（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列などがある。
アンカー配列をコードした別の具体的部分は、

（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列などがある。アンカー配列をコードしたさらに別の具体的部分は、

（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列などがある。
本発明はさらに、別の態様において、本発明で提供されるレトロウィルス様粒子または核酸分子およびそれらに対する担体とを含む、レトロウィルス特異的免疫応答および非レトロウィルスマーカーに対する特異的免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物をも含むものである。そのような組成物は、粘膜投与または非経口投与用に製剤して、経口的、経肛門的、経膣的もしくは鼻腔内経路で投与することができる。その免疫原性組成物は、少なくとも１個の他の免疫原性物もしくは免疫刺激性物、具体的にはリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデニルエステル、ムラミルジペプチド、リポ蛋白または不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントを含むことができる。
さらに別の態様において、本発明には、宿主を免疫感作してレトロウィルス特異的免疫応答および抗原マーカーに対する特異的非レトロウィルス性免疫応答を起こす方法であって、宿主に対して本発明で提供される免疫原性組成物を免疫的に有効な量で投与する段階を有する方法が含まれる。
本発明はさらに、これら材料を利用する診断方法および診断キットをも含むものである。具体的には、本発明の別の態様においては、検体中のレトロウィルス抗原と特異的に反応する抗体の存在を確認する方法であって、（ａ）検体を本発明で提供される非感染性レトロウィルス様粒子と接触させて、非感染性レトロウィルス様粒子および該粒子との特異的反応性を有する検体中に存在するそのような抗体を有してなる錯体を生成する段階、ならびに（ｂ）該錯体の生成を確認する段階を有してなる方法が提供される。
本発明のさらに別の態様においては、検体中のレトロウィルス抗原の存在を確認する方法であって、（ａ）宿主を本発明で提供される免疫原性組成物で免疫感作してレトロウィルス性抗原特異的抗体を生成する段階、（ｂ）検体を前記レトロウィルス性抗原特異的抗体と接触させて、検体中のレトロウィルス抗原と前記レトロウィルス性抗原特異的抗体とを有してなる錯体を生成する段階、および（ｃ）該錯体の生成を確認する段階を有してなる方法が提供される。
本発明のさらに別の態様は、（ａ）本発明で提供されるそのような少なくとも１個のレトロウィルス性抗原特異的抗体、（ｂ）検体と該少なくとも１個の抗体とを接触させて検体中のレトロウィルス性抗原とレトロウィルス性抗原特異的抗体とを有してなる錯体を生成する手段、および（ｃ）該錯体の生成を確認する手段を有してなる、検体中のレトロウィルス性抗原の存在を検出するための診断キットを提供するものである。
さらに、本発明のさらに別の態様においては、本発明で提供される免疫原性組成物による免疫感作によって生じる抗血清を確認する方法であって、抗原マーカーに特異的な抗血清中の抗体を検出する段階を有してなる方法が提供される。
本発明の利点には、
−非感染性および非複製性となっている、天然コンホメーションにgag、polおよびenv遺伝子産物を有してなる免疫原性レトロウィルス様粒子、および
−ビルレントレトロウィルスと免疫的に識別可能な免疫原性レトロウィルス様粒子
などがある。
【図面の簡単な説明】
図面を参照しながら、以下の説明により、本発明についての理解を深めることができる。
図１は、本発明の１実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（pMTHIV-A）の構造図式である。
図２は、本発明の別の実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（pMTHIVBRU）の構造図式である。
図３は、本発明のさらに別の実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（p83-19）の構造図式である。
図４は、本発明の１実施態様によるプラスミド（pSeBS-HA2）の構造図式である。
図５は、遺伝子アセンブリを用いた突然変異誘発の工程系統図である。
図６は、本発明のさらに別の実施態様によるヒトインフルエンザヘマグルチニン糖蛋白のトランスメンブラン成分の一部を有する抗原マーカー配列を有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（pMTHIVHA2-701）の構造図式である。
図７は、本発明のさらに別の実施態様による非天然マーカーを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（pMTHIVmHA2）の構造図式である。
図８は、本発明のさらに別の実施態様による非天然マーカーを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（pMTHIVMNmHA2-5）の構造図式である。
図９は、本発明のさらに別の実施態様による非感染性非複製性レトロウィルス様粒子のgag遺伝子産物に挿入されたタバコモザイクウィルスからの抗原性エピトープをコードするオリゴヌクレオチドの詳細図である。
図１０は、タバコモザイクウィルスからの抗原性エピトープを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミドの構造図式である。
図１１は、本発明の抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子（シュードウィルス粒子）のイムノブロット分析を示す図である。
図１２は、抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子のイムノブロット分析を示して、gag遺伝子産物に抗原マーカーが含まれていることを示す図である。
図１３は、ｍＨＡ２配列を有することによって抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子で免疫感作したモルモットにおける免疫応答を示す図である。
図１４は、ＴＭＶマーカー配列を有することによって抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子で免疫感作したモルモットにおける免疫応答を示す図である。
図１５は、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０中の、ＨＩＶ−１と抗原的に識別できる非感染性レトロウィルス様粒子を提供する修飾を行う免疫優性領域の位置を示す図である。
図１６は、ＨＩＶ−１の臨床的一次単離物のエンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０を有するレトロウィルス様粒子のイムノブロット分析を示す図である。
発明の一般的説明
本発明の各種実施態様が予防接種、診断、ＨＩＶ感染治療、および免疫試薬生成の分野において多くの利用場面を有することは当業者には明らかである。そのような用途についての考察を以下に行うが、本発明はその記載内容に限定されるものではない。
図１および図２に関しては、長い末端反復、プライマー結合部位ならびにＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）配列を欠失する修飾レトロウイルスゲノムを有し、しかもその天然ゲノム配置にgag、polおよびenv遺伝子を有するベクターpMTHIVBRU（ＡＴＣＣ名称７５８５２）の構造が図示してある。pMTHIVBRUのpol遺伝子は、それの一部の欠失による修飾を受けて、それの逆転写酵素活性およびインテグラーゼ活性を実質的に失っている。さらに、本発明のこの特定の実施態様例においては、欠失pol遺伝子内にオリゴヌクレオチドが挿入されていることで、３つの異なる読み枠に３つの終止コドンを導入して、インテグラーゼの残りの配列が翻訳されるのを防ぐようになっている。pMTHIVBRUのgag遺伝子も修飾されて、最初のCys-Hisボックスにおける２つのシステイン残基（Cys³⁸⁷およびCys³⁹⁵）がセリンに置き換えられている。
そうして、プラスミドpMTHIVBRUは、ＨＩＶの感染性および／または複製に必要であるがウィルス様粒子生成に必須ではない複数の要素が欠失しているＨＩＶ様粒子をコードする。
プラスミドpMTHIVBRUは、ＨＩＶ−１_LAI単離物のものに相当するエンベロープ蛋白を有するＨＩＶ様粒子をコードする。図３に関しては、pMTHIVBRUのＬＡＩエンベロープが実質的にＭＮエンベロープ配列によって置き換わっているプラスミドｐ８３−１９が示してある。そうして、プラスミドｐ８３−１９は、ＨＩＶの感染性および／または複製に必要であるがウィルス様粒子生成に必須ではない複数の要素が欠失しているＨＩＶ様粒子をコードし、ＨＩＶ−１単離物ＭＮのエンベロープを実質的にenv遺伝子産物として有する。ＨＩＶ様粒子は、他のenv産物、特には特異的単離物ｂｘ０８などのクレード、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＯからの一次ＨＩＶ−１単離物などのＨＩＶ−１感染患者からの臨床的単離物からのものを有することができる。env遺伝子産物はさらに、ＭＮ／ＬＡＩ、ｂｘ０８／ＬＡＩおよびクレード−ＬＡＩキメラ（chimer）などのように、ある発生源からのｇｐ１２０蛋白と別の起源からの残りの部分とのキメラであることもできる。
図４〜６に関しては、長い末端反復を欠失している修飾ＨＩＶゲノム、プライマー結合部位およびＲＮＡパッケージング配列を有し、しかもその天然ゲノム配置にgag、polおよびenv遺伝子を有するベクターpMTHIVHA2-701の構造が図示してある。pMTHIVHA2-701のenv遺伝子は修飾されて、その中で異なったアンカー配列をコードする遺伝子を提供して、レトロウィルス様産物にenv遺伝子産物をアンカーすることで、修飾env遺伝子がenvの内因性アンカー形成機能部分がその異なったアンカー配列によって置換されている修飾env遺伝子産物をコードするようにしたものである。pMTHIVHA2-701によってコードされたレトロウィルス様粒子においては、ｇｐ４１の免疫優性エピトープ（内因性アンカー形成機能部分を提供するもの）は発現されなくなっている。そこで、そのようなレトロウィルス様粒子は、レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列がないことにより、陰性の形で抗原的に標識される。その異なったアンカー配列自体を抗原性として、レトロウィルス様粒子についての陽性の非レトロウィルス性または非ＨＩＶレトロウィルス性抗原マーカーを提供することができる。
本発明のこの特定の実施態様例においては、ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子からのコード化ＤＮＡ断片と終止コドンを有する１３５−ｂｐ配列が、ＨＩＶ−１_LAIエンベロープ遺伝子のヌクレオチド７７７７（Ｇ）と７７７８（Ａ）の間に挿入されて、ＨＩＶ−１_LAIｇｐ４１トランスメンブレン糖蛋白の合成を防止している。そうして、プラスミドpMTHUVHA2-701は、ｇｐ４１トランスメンブレン糖蛋白アンカー形成機能部分がヒトインフルエンザＨＡ２蛋白からのアンカー配列によって置換され、ＨＡ２蛋白がさらに抗原マーカーを提供するＨＩＶ様粒子をコードする。
図７に関しては、pMTHIVHA2-701と類似しているが、envの内因性アンカー形成機能部分に置換する抗原マーカー配列として、公知の天然蛋白とは相同性を持たないアミノ酸配列を有するプラスミドpMTHIVmHA2を図示している。
図８に関しては、長い末端反復、プライマー結合部位ならびにＲＮＡパッケージングを欠失している修飾ＨＩＶゲノムを有し、その天然配置にgag、polおよびenv遺伝子を有するベクターpMTHIVMNmHA2-5（ＡＴＣＣ名称７５８５３）を図示している。pMTHIVMNmHA2-5のpol遺伝子は、その一部の欠失によって修飾されて、その逆転写酵素活性およびインデグラーゼ活性を実質的に失っている。さらに、欠失pol遺伝子内にオリゴヌクレオチドを挿入して、３つの異なる読み枠に３つの終止コドンを導入して、インテグラーゼの残りの配列が翻訳されるのを防ぐようになっている。pMTHIVMNmHA2-5のgag遺伝子も修飾されて、gagの最初のCys-Hisボックスにおける２つのシステイン残基がセリンに置き換えられている。pMTHIVMNmHA2-5では、envの内因性アンカー形成機能部分は、天然蛋白と相同性を持つことが知られていないアミノ酸配列によって置換されている。プラスミドpMTHIVMNmHA2-5でトランスフェクションされたベロ細胞から産生されるＨＩＶ様粒子を精製して、モルモットの免疫感作に使用した。抗血清を回収し、表１に示したような抗Ｖ３（すなわち抗エンベロープ）抗体および抗ｍＨＡ２（すなわち抗抗原マーカー）抗体についてのＥＬＩＳＡによるアッセイを行った。これらの実験を、他のモルモットで繰り返し、抗gag抗体についてのアッセイにも拡大し、得られた結果を図１３に示してある。この結果は、gagおよびenv遺伝子産物が実質的にその生コンホメーションに存在すること、ならびに抗原マーカーが免疫原性であることを示している。
以上、envの内因性アンカー形成機能部分が特定の天然および非天然蛋白の抗原性アンカー配列によって置換された特定のレトロウィルス様粒子について説明したが、本発明の本質を逸脱しなければ、内因性アンカー形成機能部分を置換できる特定の手段に対して多くの変更、調節および改良を施すことができることは明らかである。
図９および１０に関しては、ＴＭＶからの抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配列のコピー１〜４個を有するプラスミド（pHIV-T1；pHIV-T2（ＡＴＣＣ名称７５８５１）；pHIV-T3およびpHIV-T4）を図示している。この図示した特定の実施態様では、ＨＩＶのgag遺伝子にＴＭＶエピトープが挿入されてハイブリッドのgag遺伝子産物を生成し、前述のようにプラスミドはＨＩＶの感染性および／または複製に必要であるがウィルス様粒子生成には必須ではない複数の要素が欠失している。プラスミドpHIV-T1、pHIV-T2（ＡＴＣＣ名称）、pHIV-T3およびpHIV-T4（それぞれ、１、２、３および４個の抗原エピトープコピーを有する）を用いて安定な細胞系を形成し、それによってgag蛋白に挿入された抗原マーカーを有するＨＩＶ様粒子を得た。これらのＨＩＶ様粒子を精製し、その抗ＨＩＶモノクローナル抗体（図１１）および抗ＴＭＶマーカー抗血清（図１２）との反応性を求めた。結果を図１１および図１２に示してある。その結果は、ＨＩＶ様粒子が、実質的にその天然コンホメーションにｇｐ１２０、ｇｐ４１およびｐ２４を有し、抗マーカー抗体がＴＭＶマーカーを認識することができることを示している。
プラスミドpHIV-T2によって産生された精製ＨＩＶ様粒子を用いて、モルモットの免疫感作を行った。抗血清を回収し、図１４に示したように、抗gag抗体抗Ｖ３（すなわち、抗エンベロープ）抗体および抗ＴＭＶ（すなわち抗抗原マーカー）抗体についてＥＬＩＳＡによるアッセイを行った。これらの結果は、gagおよびenv遺伝子産物が実質的にその生コンホメーションに存在し、抗原マーカーが免疫原性であることを示している。
さらに、これらの免疫感作から得られたモルモット血清について、ウィルス感染阻害アッセイを施した。表２に示したように、中和抗体を形成した。そのような中和抗体の形成は、ワクチン候補剤としておよび診断的利用場面でこのレトロウィルス様粒子が有用性を有することを示している。
図１６に関しては、臨床（一次）単離物ｂｘ０８からのエンベロープ糖蛋白を発現するレトロウィルス様粒子（シュードウィルス粒子）のイムノブロット分析を図示している。ＨＩＶ−１ｂｘ０８は、フランスで単離されたクレードＢからの臨床的単離物である。この分析は、非臨床単離物gag蛋白を有する分子における臨床単離物からのエンベロープ糖蛋白の発現を示している。
本明細書においては、アンカー配列でもあり得るマーカー配列の具体的実施態様について説明しているが、レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列不在など、マーカーおよび／またはアンカー形成機能部分を提供する他のいかなる簡便なアミノ酸配列も本発明に用いることができることは明らかである。レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列の不在は、表３に示したように、env遺伝子産物の免疫優性領域からの１以上のアミノ酸の突然変異誘発が関与することで、レトロウィルス感染宿主からの血清による得られた突然変異における免疫優性領域の認識が実質的に防止されると考えられる。マーカー機能部分を与えるアミノ酸配列は、公知の蛋白とは相同性を持たない非天然抗原配列を有するものとすることができる。そのような配列の例としては、上記の突然変異体ＨＡ２配列である。他の例には、非ヒトまたは非哺乳動物病原性または共生性微生物などの非ヒトまたは非哺乳動物蛋白の抗原性領域などがあり得る。そのような配列の例としては、前述のＴＭＶがある。
本発明の各種実施態様は、予防接種、診断、ＨＩＶ感染治療および免疫試薬生成の分野で多くの利用場面を有することは当業者には明らかである。そのような用途についての考察を以下に行うが、本発明はその記載に限定されるものではない。
ワクチンの製造および用途
本発明による免疫原性製剤が免疫応答を誘発し得ることは上記で示した。従って、本発明の用途で可能性のあるものとしては、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連状態を含めたレトロウィルス疾患に対するワクチンの基礎としてのものである。そこで別の態様において本発明は、本発明による免疫原性組成物を有してなるＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連状態に対するワクチンを提供するものである。
ワクチンとして使用するのに適した免疫原性組成物は、本願で開示のような非感染性レトロウィルス様粒子から得ることができる。免疫原性組成物は、抗ウィルス性の抗体を産生する免疫応答を誘発する。ワクチン形成者に対してＨＩＶなどのレトロウィルスによる攻撃があっても、抗体がウィルスに結合し、それによってウィルスが失活する。
ワクチンは注射剤として、すなわち液剤または乳剤として製剤することができる。非感染性レトロウィルス様粒子は、レトロウィルス様粒子と適合する医薬的に許容される賦形剤と混合することができる。賦形剤には、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびこれらを組み合わせたものなどがある。ワクチンにはさらに、湿展剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤あるいはアジュバントなどの補助物質を含有させて、ワクチンの有効性を高めることができる。ワクチンに対するアジュバント効果を得る方法には、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（アルム）などの試薬を使用し、一般的にはそれをリン酸緩衝生理食塩水と他のアジュバント（Ｑ８２１およびフロイント不完全アジュバントなど）の０．０５〜０．１％溶液として使用する方法などがある。ワクチンは、皮下注射または筋肉注射により、非経口的に投与することができる。別法として、本発明によって形成される免疫原性組成物を、粘膜表面で免疫応答を起こすような形で製剤・運搬することができる。そこで、免疫原性組成物を、例えば経鼻的または経口的（胃内）に粘膜に投与することができる。別法として、坐剤および経口投与製剤などの他の投与形態が望ましい場合がある。坐剤の場合、結合剤および担体には例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドなどがあり得る。経口製剤には、医薬用のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用されるインシピエント（incipient）などがあり得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉剤の形を取り、本発明のレトロウィルス様粒子を１０〜９５％で含有する。
ワクチンは、製剤に適合した方法と、治療上有効性、予防性かつ免疫原性を有する量で投与する。投与量は、例えば抗体を合成し細胞介在免疫応答を生じる免疫系の個人的能力など、治療を受ける患者によって決まる。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断によって決まるものである。しかしながら、好適な用量範囲は当業者には容易に決定できるものであり、μｇ単位のレトロウィルス様粒子になると考えられる。初回投与用量および補助投量についての好適な投与方法も変動し得るが、初回投与後に以降の投与を行う方法などがあり得る。免疫感作スケジュールの１例としては、本発明によるレトロウィルス様粒子で少なくとも１回の予備免疫感作を行ってから、本願の譲受人に譲渡された欧州特許公開番号０５７０９８０号に記載の合成ペプチドによって少なくとも１回免疫感作を行うものがある。ワクチンの用量も投与経路によって決まり得るものであり、宿主の大きさによっても変動する。
本発明のレトロウィルス様粒子をコードする核酸分子は、例えば宿主に対する注射による直接の核酸分子投与によって、免疫感作に直接用いることもできる。遺伝的免疫感作の被験者にＤＮＡを直接注射する方法は、例えばウルマーらの文献（Ulmer et al, 1993；本開示の最後に引用文献リストがあり、掲載の各引用文献については言及してあるのみで、それ以上の記載は行っていない）に記載されている。
本発明による分子にはさらに、ＨＩＶウィルスのヒト細胞もしくは動物細胞への結合に取って代わる作用を行うか、あるいはウィルスの３次元構成を攪乱することで、ＡＩＤＳもしくは関連状態の治療（予防的または治療的）での用途もあり得る。
そこで、本発明のさらに別の態様は、有効量の本発明による免疫原性組成物を投与する段階を有してなるＡＩＤＳまたは関連状態の予防方法または治療方法を提供するものである。
イムノアッセイ
本発明のレトロウィルス様粒子は、免疫原として、すなわち、酵素結合性免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合性抗体結合アッセイなどのイムノアッセイ、あるいは抗レトロウィルス（例：ＨＩＶ）ＨＩＶ抗体およびレトロウィルス抗原（例：ＨＩＶ）の検出に関して当業界で公知の方法における抗原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、レトロウィルス様粒子を、ポリスチレン微量力価測定プレート孔などの蛋白を結合する能力を有する表面などの所定の表面に固定化する。洗浄によって吸着が不完全なレトロウィルス様粒子を除去した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインの溶液などの被験検体に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的蛋白を所定の表面に結合させることができる。それにより、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断ができ、従ってその表面への抗血清の非特異的結合によって生じるバックグラウンドが低下する。
次に固定化表面を、免疫錯体（抗原／抗体）形成ができるような形で、試験対象の臨床検体または生物検体などの検体と接触させる。それには、検体をＢＳＡ溶液、ウシγ−グロブリン（ＢＧＧ）溶液および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの希釈剤で希釈する方法などがあり得る。次に検体を、約２５℃〜３７℃程度などの温度で約２〜４時間インキュベーションする。インキュベーション後、検体に接触した表面を洗浄して、免疫錯体形成していない材料を除去する。洗浄方法には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄する方法などがあり得る。
被験検体と結合したレトロウィルス様粒子との間で特異的免疫錯体を形成してから洗浄を行った後、免疫錯体形成が起こったか否かおよびその量も、第１の抗体に対する特異性を有する第２の抗体にその免疫錯体を曝露することで確認することができる。被験検体がヒト起源のものである場合、第２の抗体はヒト免疫グロブリン（一般にはＩｇＧと表記される）に対する特異性を有する抗体である。検出手段を提供するため、第２の抗体には、例えば適切な色原性基質とともにインキュベーションすることで発色する酵素活性などの活性を持たせることができる。次に、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて発色程度を測定することで、定量を行うことができる。
複数のＨＩＶ単離物を識別する抗体を確認することが望ましい診断の１実施態様においては、本発明の免疫的に区別される複数のレトロウィルス様粒子を所定の表面に固定化する。別法として、抗ＨＩＶ抗体が各種ＨＩＶ単離物中でかなり保存された（conserved）エピトープ（例：gagまたはｇｐ４１からのＢ細胞エピトープ）を認識する場合、単一または限られた数のレトロウィルス様粒子を固定化することができる。単一のＨＩＶ単離物（例：ＬＡＩ、ＭＮ、ＳＦ２またはＨＸＢ２）を認識する抗体を特異的に確認することが望ましい診断のさらに別の実施態様においては、本発明の単一の特定レトロウィルス様粒子を固定化することができる。その別の診断実施態様は、医学、臨床試験、法律および法科学という、抗体応答などの免疫応答を発生させた特定のＨＩＶ単離物を測定することが必須である分野において特に有用である。
さらに別の実施態様においては、異なったクレードに属するＨＩＶ単離物などの免疫的に区別されるレトロウィルスを特異的に確認することが望ましい場合がある。免疫的に区別されるＨＩＶ単離物に例えば、ＬＡＩ、ＭＮ、ＳＦ２、ＨＸＢ２または一次ＨＩＶ−１単離物などがある。この診断実施態様においては、本発明の特定のレトロウィルス様粒子は、免疫的に区別されるＨＩＶ単離物を特異的に認識するモノクローナル抗体などの抗体を生成する上で有用である。
免疫的に区別されるレトロウィルス様粒子の混合物を、ワクチンなどにおける免疫原としてあるいは診断試薬として用いることができることは明らかである。レトロウィルス様粒子の混合物を用いて交差単離物の保護および／または診断を行うような状況があり得る。その場合、免疫原の混合物は通常、「カクテル」製剤と称される。
本発明は、その利点として、天然コンホメーションに実質的にgag、polおよびenv遺伝子産物を有するレトロウィルス様粒子を提供する。そうして、そのようなレトロウィルス粒子は、変性形のＨＩＶ抗原またはそのようなＭＩＶ抗原に相当する合成ペプチドを認識することができないコンホメーションの抗ＨＩＶ抗体（例：抗env抗体）によって認識される。従って、本発明のレトロウィルス様粒子は、抗原としておよび診断実施態様における抗レトロウィルス抗体（モノクローナル抗体を含む）の形成での免疫原として特に有用である。
さらに、マーカーが存在することで、それに対する特異的免疫応答を発生させ、それを前述の方法によって検出することで、本発明で提供される免疫原性組成物による宿主の免疫感作とビルレントレトロウィルスによる実際の（material）感染とを容易に識別することができる。そのような診断および鑑別が可能であることは、疫学、臨床試験、法科学および免疫学の分野で非常に有用である。
他の用途
本発明の基礎となるレトロウィルス様粒子に結合する分子、特には抗体、抗体関連分子およびそれらの構造的類縁体も、ＡＩＤＳおよび関連状態の治療および診断に試薬として有用である可能性がある。
本発明のレトロウィルス様粒子に対して特異的であるキメラ抗体、人体に適応させた（humanized）抗体、合体させた（veneered）抗体および人為的に形成した（engineered）抗体などの抗体の変化したもの（抗原結合部位の変化したものを含む）は、本発明の範囲に含まれる。
本発明のレトロウィルス様粒子に結合する抗体および他の分子は、以下に記載のような多くの各種形態で治療（予防および治療）および診断目的に使用することができる。
−抗体（恐らくは人体に適応させた抗体）をＨＩＶ感染患者に対して適切に投与することにより受動感作を行う。
−好適なサブクラスまたはイソタイプ（恐らくは適切な抗体の形成によって得られる）の抗体を用いることで抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化、補足または媒介することにより、所望の機能を行うことができるようにする。
−例えば、抗体および細胞毒性部分の接合体を有するイムノトキシンを使用することで毒物その他の試薬を標的部分に運搬し、ＨＩＶ感染細胞（例：ｇｐ１２０）の細胞表面に露出したＨＩＶ蛋白に直接または間接的に結合させる。
−免疫原性の高い材料をＨＩＶ感染細胞の表面を標的として運搬し、宿主の体液または細胞の免疫系のいずれかによってそのような細胞の除去を行う。
−各種イムノアッセイ法を用いてＨＩＶの検出を行う。
そこで、さらに別の診断実施態様においては、本発明の免疫原性組成物（個別に、またはカクテル製剤などの混合物として）は、生体検体などの検体中のＨＩＶまたは抗原の検出またはＨＩＶの中和を行うのに使用することができるＨＩＶ抗原特異的抗体（モノクローナル抗体を含む）の形成に有用である。
別の診断実施態様においては、本発明のレトロウィルス様粒子を用いて、例えばＨＩＶ感染者から得た生体検体中のＨＩＶ特異的Ｔ細胞を特異的に刺激して診断または治療を行うのに使用することができる。
生物寄託
本明細書において記載・言及される本発明の各種態様によるレトロウィルス様粒子をコードするある種のプラスミドは、ブダペスト条約に従い、本願出願に先だって、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection(ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 20852）に寄託した。寄託プラスミドのサンプルは、本米国特許出願に基づく特許交付時に公表される。寄託した実施態様は、単に本発明の例とすることを意図したものであることから、本願で説明され特許請求される発明は、寄託したプラスミドに限定されるものではない。本願に記載のものと類似または等価なレトロウィルス様粒子をコードする等価もしくは類似のプラスミドは、本発明の範囲に含まれる。
寄託の要旨

上記の開示内容は、本発明の概要を説明するものであり、以下の具体的実施例を参照することで、本発明をより完全に理解することができる。これら実施例は、単に例示を目的としたものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書においては具体的な用語を使用しているが、そのような用語は説明のためのものであり、限定を目的としたものではない。免疫法および組換えＤＮＡ法は本開示に明瞭に記載されていない場合があるが、当業者の能力の範囲内に十分入るものである。
実施例
本開示および以下の実施例に明瞭には記載されていないが使用した分子遺伝学、蛋白生化学および免疫学の方法は、科学文献中に数多く報告されており、当業者の能力の範囲内のものである。
実施例１
本実施例は、プラスミドpMTHIVBRUの構造を説明するものである。
プラスミドpMTHIVBRUは、図１および図２に示したような構造を持っていた。このプラスミドは、ロビンスキーらの報告（Rovinski et al, 1992；この引用文献は、明細書末にある）に記載され、ＲＮＡパッケージング欠失を有し、一連の突然変異／欠失を有するよう形成した発現ベクターpMTHIVd25の修飾物である。そこで、Cys-Hisボックス突然変異においては、図１に示したように、gag蛋白の最初のCys-Hisボックス（配列番号１４）で、２個のコドン（配列番号１３中）が２個のセリンコドンによって置換されている。これは、ＰＣＲに基づく突然変異誘発法によって行った。２個のプライマーを合成し、上流プライマーは5'-GGACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACAAATAATCCACCTATCCCAGTAGGAG-3'（配列番号１５）の配列を持ち、５’末端にSpeI部位を有するＨＩＶ−１_LAIのヌクレオチド１５０７〜１５６７を有し（ヌクレオチドの番号付けは、ウェイン−ホブソンら（Wain-Hobson;1985）による）、下流のプライマーは5'CTCGGGCCCTGCAATTTCTGGCTATGTGCCCTTCTTTGCCACTATTGAAACTCTTAACAATC-3'（配列番号１６）の配列を持ち、５’末端にApaI部位を持つヌクレオチド２０１１〜１９５３の逆補体である。下流側プライマーでは、ヌクレオチド１９６３および１９７２（Wain Hobson et al., 1985; Myers et al., 1990）の逆補体を表す２個のアデノシン残基がチミジンに変わって、gag遺伝子産物のアミノ酸位置３９２および３９５の２個のシステインが２個のセリンによって置換されている（図１）。これら２つのプライマーを用いて、pMTHIVのSpeI-ApaI ＤＮＡ断片（ヌクレオチド１５０７〜２００８）（Rovinski et al., 1992）を増幅し、それを鋳型として用いた。ＰＣＲ増幅SpeI-ApaI断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、制限酵素SpeIおよびApaIで消化させた。この断片を用いて、pMTHIVd25の相当する断片を置換した（Rovinski et al. 1992）。得られたプラスミドはpMTHIV-Aと称し、ＲＮＡパッケージング配列欠失およびCys-Hisボックス突然変異の両方を有している。
逆転写酵素およびインテグラーゼの欠失を行うため、ＨＩＶ−１_LAIのヌクレオチド２６５５および４５８７の２個のBalI認識部位を用いた（図３）。その２個のBalI部位の間の１．９−ｋｂｐ断片は、逆転写酵素の９５％以上およびインテグラーゼの最初の１０％のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を有する。プラスミドpMTHIV-AをBalIで消化させた。ゲル電気泳動によって１．９−ｋｂｐBalI断片を除去した後、プラスミドの残りの部分を、３つの異なる読み枠に３個の終止コドンを有してインテグラーゼの残りの配列が翻訳されるのを防止する二本鎖オリゴヌクレオチド：5'-GTATAAGTGAGTAGCGGCCGCAC-3'（１本鎖のみを示した−配列番号１７）と連結した。得られたプラスミドは、pMTHIVBRUと名付けた。
実施例２
本実施例は、抗原的に標識されたエンベロープアンカーを有するＨＩＶ様粒子をコードするプラスミドの構造を説明するものである。
プラスミドｐ８３−１９を、図３に示したように、発現ベクターpMTHIVBRUから構成した。このプラスミドは、ｇｐ１２０_LAIのほとんどをコードするＤＮＡをｇｐ１２０_LAIをコードする同起源のＤＮＡで置換することで形成したハイブリッドエンベロープ遺伝子を有している。これは、ＨＩＶ−１_LAIからのKpnI/BalIIＤＮＡ断片（ヌクレオチド６３７９〜７６６８）をＨＩＶ−１_MNからのKpnI/BalIIＤＮＡ断片（ヌクレオチド６３５８〜７６４１）で置換することで行った。
図４〜６に示したように、プラスミドpMTHIVHA2-701を、発現ベクターpBT1（Alizon et al, 1984）およびpMTHIVd25（Rovinski et al, 1992）から構成した。pMTHIVHA2-701ベクターは、ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子（Min Jou et al, 1980）からのコード化ＤＮＡ断片と終止コドンとを有する１３５−ｂｐ配列を有し、ＨＩＶ−１_LAIエンベロープ遺伝子（Wain-Hobson et al, 1985; Myers et al, 1990）のヌクレオチド７７７７（Ｇ）および７７７８（Ａ）の間に挿入されている。停止コドンは、ＨＩＶ−１_LAIｇｐ４１トランスメンブラン糖蛋白の合成を防止するために挿入したものである。pBT1からのSalI（ヌクレオチド５８２１）／BamHI（ヌクレオチド８５２２）ＤＮＡ断片をpSelect（Promega）にサブクローニングして、pSeBsを得た（図４）。本願において「遺伝子アセンブリを用いる突然変異誘発（GAAM）」と称した方法により、後者のプラスミドを１３５−ｂｐの挿入に用いた。ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子からのコード化ＤＮＡ断片を有する１３５−ｂｐ配列を有するよう設計された突然変異誘発性プライマー（Min Jou et al, 1980）を、図５に示したようにアセンブリした。オリゴヌクレオチドＩはＨＩＶ−１_LAIのヌクレオチド７７４８〜７７７７（Wain-Hobson et al, 1985）と相補的な３０個の塩基とＨＡ２蛋白のアミノ酸１８０〜２０２をコードするＨＡ２遺伝子配列（Min Jou et al, 1980）と相補的な６９個の塩基を有する（３’から５’）９９マーである。オリゴヌクレオチドＩＩは、ｉ）ＨＡ２蛋白のアミノ酸２０３〜２２１をコードし、ＨＡ２終止コドンを有するＨＡ２遺伝子配列（Min Jou et al, 1980）と相補的な６０個の塩基、ｉｉ）さらに２個の終止コドンを決定する６個の塩基（ATCATT−配列番号１８）およびｉｉｉ）ＨＩＶ−１_LAIのヌクレオチド７７７８〜７８０７（Wain-Hobson et al, 1985）と相補的な３０個の塩基を有する（３’から５’）９６マーである。オリゴヌクレオチドＩＩＩは、オリゴヌクレオチドＩの５’末端と相補的な１５個のヌクレオチドとオリゴヌクレオチドＩＩの３’末端と相補的な１５個のヌクレオチドを有する架橋３０マーである。オリゴヌクレオチドＩおよびオリゴヌクレオチドＩＩ１０ｐｍｏｌを、オリゴヌクレオチドＩＩＩ２０ｐｍｏｌと混合し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２単位を含むキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＤＴＴおよび０．５ｍＭＡＴＰ）２０μＬ中で、３７℃で１．５時間リン酸化した。混合物を９５℃で５分間加熱し、次にゆっくり冷却して室温とすることで、オリゴヌクレオチドをアニーリングした。この混合物に、１０×リガーゼ緩衝液（０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０〜１ＭＭｇＣｌ₂、０．１ＭＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジンおよび１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ）３μＬ、１０ｍＭＡＴＰ３μＬおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ５単位を加え、得られた連結混合物を１６℃で終夜インキュベーションして、突然変異誘発性プライマーのアセンブリを完了させた（図５）。このプライマーをそれ以上精製せずに、突然変異誘発法に使用した。
突然変異誘発は、プロメガ（Promega；Madison, WI）の突然変異誘発系（Altered Sites in vitro Mutagenesis System）を用いて行った。突然変異誘発の鋳型は、突然変異キットで提供されるpSelectファーゲミド（phagemid）ベクターにクローニングされたＨＩＶ−１_LAIエンベロープ遺伝子（ヌクレオチド５８２１〜８５２２）の２．７−ｋｂｐSalI/BamHIＤＮＡ断片を有するpSeBSプラスミドから成るものであった（図４）。突然変異誘発法後、³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドＩＩＩプローブを用いたコロニーハイブリッド形成によって、推定されるクローンを確認した。陽性クローンを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。これらのクローンのうちの一つをpSeBS-HA2と称し、最終ベクターの構成に使用した。そのため、pSeBS-HA2からの修飾BalI/BamHI挿入物をpMTHIVd25-dSalIにサブクローニングした。後者は、SalIによる部分消化とそれに続くクレノウ処理によりプラスミド骨格中のSalI部位を除去することでpMTHIVd25（Rovinski et al, 1992）から誘導されたプラスミドである。最終発現構造は、pMTHIVHA2-701と称した。
ＨＩＶ−１_LAIエンベロープ遺伝子（Rovinski et al, 1992; Wain-Hobson et al, 1985）のヌクレオチド７７７７（Ｇ）および７７７８（Ａ）の間に挿入した異種ＤＮＡ配列を有する発現ベクターpMTHIVmHA2（図７に示してある）を上記のように形成した。この場合、ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子（Min Jou et al, 1990）からのコード化ＤＮＡ断片と、ＨＡ２配列に融合した場合に、公知の天然蛋白とは相同性を持たないアミノ酸配列をコードする６８個のヌクレオチドを有する１３４−ｂｐ配列を、ＨＩＶ−１_LAIのヌクレオチド７７７７の下流に挿入した（図７）。その挿入により、ＨＩＶ−１_LAIコード化配列のトランスロケーションにおけるフレームシフトと終止コドン（TAG）形成が生じて、ＨＩＶ−１_LAIのｇｐ４１トランスメンブラン糖蛋白の合成が防止された。最終発現構造は、pMTHIVmHA2と称した（図７）。
図８に示したように、発現ベクターp83-19およびpMTHIVmHA2からプラスミドpMTHIVMNmHA2-5を構成した。このプラスミドは、p83-19の感染性および／または複製に必要な要素の突然変異を全て有し、pMTHIVmHA2の１３４−ｂｐ挿入物配列を有するように設計した（図７）。そのために、p83-19をBalII（ヌクレオチド７６４１）およびXhoI（ヌクレオチド８９４４）によって消化させて、１２７６−ｂｐＤＮＡ断片を除去し、pMTHIVmHA2の同起源BalII/XhoI断片によって置換した。
実施例３
本実施例は、ＴＭＶからの抗原性エピトープを有するＨＩＶ様粒子をコードするプラスミドの構成について説明する。
プラスミドpHIV-T1、pHIV-T2、pHIV-T3およびpHIV-T4は、ＴＭＶコート蛋白からの少なくとも１個の抗原性エピトープ（Westhof et al, 1984; Trifilleff et al, 1991）を有してなる二本鎖オリゴヌクレオチド（図９、１０および１１）のコピーをそれぞれ１個、２個、３個または４個有するｐ８３−１９構造体の修飾版を表す。これら４つのベクターの構成は、図９および図１０に図示してある。全ての構造体を形成するには、プラスミドpMTHIV-A（図１）を最初にSacIIおよびApaIによって消化させて、１３２８−ｂｐＤＮＡ断片を単離し、それを次にpBluescript（Stratagene）にサブクローニングした。次にその組換えプラスミドを、gag遺伝子中のヌクレオチド１４１５でＨＩＶ−１_LAIＤＮＡを開裂させるPstIで消化させた。次に、図９に示した二本鎖オリゴヌクレオチド（コード化鎖：配列番号１９、相補鎖：配列番号２０、コードされたアミド酸：配列番号２１）の１個、２個、３個または４個のコピーのいずれかをこの制限部位に挿入した。最後に、得られた組換えプラスミドをSacIIおよびApaIによって消化させて、修飾挿入物を放出し、次にそれを、プラスミドｐ８３−１９の同起源領域にクローニングした（図１０）。
ｍＨＡ２エピトープまたはＴＭＶエピトープの各種コピーのいずれかを有するレトロウィルス様粒子の発現を図１１に示してある。ベロ細胞を集密度８０％まで成長させ、トランスフィニティ（transfinity）（ＢＲＬ）リン酸カルシウム法によりプラスミドＤＮＡ２０μｇでトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後に、培養上清について、蛋白発現を分析した。個々の発現構造体でトランスフェクションした細胞からの培地（１０ｍＬ）を回収し、４℃で１５分間の２０００×ｇでの遠心（sorvall RT 6000B；Dupont Company, Wilmington, Del.）を行って透明とした。超遠心によってレトロウィルス様粒子を単離した。ペレット化した粒子をＴＮＥ４０μＬに懸濁し、５×レムリ（Laemmli）サンプル緩衝液１０μＬと混和し、３分間沸騰させた。次に、ＳＤＳＰＡＧＥによってウィルス蛋白を分離し、イモビロン（Immobilon）膜（Millipore, Bedford, Mass.）に移した。膜をブロット（BLOTTO）緩衝液（カーネイション（Carnation）インスタント脱脂乾燥乳５％、チメロサール０．０００１％（重量／容量）および消泡剤Ａ乳剤０．０１％（容量／容量）を含むＰＢＳ）で２５℃にて２時間遮断し、抗体の適切な希釈液とともに４℃で終夜のインキュベーションを行った。次にフィルターを、アルカリ性ホスファターゼ（Promega, Madison, Wis.）に接合したヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体とインキュベーションし、アルカリ性ホスファターゼ色原性基質ニトロブルー（nitroblue）テトラゾリウムクロライドおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩（ＢＲＬ）と反応させた。パネル（Panel）Ａでは抗ｇｐ１２０、抗ｇｐ４１および抗ｐ２４の混合物を用い、パネルＢでは抗ｇｐ１２０および抗ｐ２４抗体の混合物を用いた。
図１１に示した結果は、抗原的に標識したＨＩＶ様粒子が、実質的にその天然コンホメーションにｇｐ１２０、ｇｐ４１およびｐ２４を形成することを示している。
実施例４
本実施例は、抗原的に標識したＨＩＶ様粒子の免疫原性および免疫反応性を説明するものである。
プラスミドpHIV-T1、pHIV-T2、pHIV-T3またはpHIV-T4のいずれか（図１０）を、プラスミドpSV2neoによりベロ細胞に同時トランスフェクションし、ＨＩＶ様粒子を産生する安定な細胞系を得た。ＨＩＶ様粒子を精製し、gag遺伝子産物に挿入されたＴＭＶマーカーに相当するペプチドで免疫感作したモルモットからの免疫血清に対するその反応性をイムノブロット分析によって測定した。免疫血清を得るため、ＫＬＨに接合したＴＭＶマーカーからなるペプチド１００μｇでモルモットを免疫感作し、完全フロイントアジュバント中でアジュバント（adjuvant）した。いずれの動物も、３週間間隔で３回、不完全フロイントアジュバントでアジュバントした同じペプチドで追加免疫した。最終追加免疫から２週間後に、免疫血清を回収した。図１２に示した結果は、各種ＨＩＶ様粒子に存在する各種形態のgag遺伝子産物に対する免疫血清の反応性を図示し、修飾ＨＩＶ−１様粒子に関するＴＭＶマーカーの抗原性を示したものである。
さらに別の試験で、gag１０μｇに等価な量のＨＩＶ様粒子でＴＭＶマーカー配列（GAFDTRNRIIEVENGA：配列番号２１）のコピー２個を有するものでモルモットを免疫感作し、３週間間隔で同じＨＩＶ様粒子５μｇで追加免疫した。ＨＩＶ様粒子を完全フロイントアジュバント（追加免疫用量は、不完全フロイントアジュバントでアジュバントした）またはＱＳ２１でアジュバントした。最初の免疫感作から１１週間後に血清検体を採り、ＨＩＶ−１ＭＮのＶ３中和エピトープ（TRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC：配列番号３１）、ＴＭＶマーカー配列（AFDTRNRIIEVEN：配列番号１）および組換え源から産生されたｐ２４（gag）蛋白を有するアミノ酸配列に相当するペプチドとの反応性を、ＥＬＩＳＡによって調べた。結果を図１４に示しているが、この結果は、ＴＭＶマーカー配列を有するＨＩＶ様粒子が免疫応答を生じて、ｐ２４（gag）、ｇｐ１２０（および特異的にＶ３中和エピトープ）およびＴＭＶマーカー配列を特異的に認識する抗体を産生することができることを示している。スキナーらの報告（Skinner et al., 1988）に記載の方法に従って、ウィルス感染阻害アッセイを用いて、モルモット抗血清についてのウィルス中和も調べた。表２に終点力価を示したが、この結果は、ＴＭＶマーカー配列を発現するレトロウィルス様粒子を用いる免疫感作によって産生される抗体がＨＩＶによる細胞感染を阻害することができることを示している。
プラスミドpMTHIVMNmHA2-5をプラスミドpSV2neoとともにベロ細胞に同時トランスフェクションし、ＨＩＶ様粒子を産生する安定な細胞系を得た。次に、ＨＩＶ様粒子を精製し、完全フロイントアジュバントでアジュバントしたgagＰ２４１０μｇに等価な量のＨＩＶ様粒子でモルモットを免疫感作した。いずれの動物も、３週間間隔で３回、不完全フロイントアジュバントでアジュバントしたＨＩＶ様粒子で追加免疫した。最終追加免疫から２週間後に、免疫血清を回収し、それについて、ＥＬＩＳＡによって抗Ｖ３および抗ｍＨＡ２マーカー反応性のアッセイを行った。以下の表１に示した結果は、ｍＨＡ２マーカーを有するＨＩＶ様粒子で免疫感作したモルモットが、ｍＨＡ２マーカー（ＭＨＡ−１）およびＶ３ループ中和ドメイン（ＣＬＴＢ５６、ＣＬＴＢ７１およびＣＬＴＢ７３）を表すペプチドを認識することができる抗体を産生したことを示している。
さらに別の試験で、gagｐ２４１０μｇに等価な量のＨＩＶ様粒子でｍＨＡ抗原マーカー配列を有するものでモルモットを免疫感作し、３週間間隔で３回、同じＨＩＶ様粒子５μｇで追加免疫した。ＨＩＶ様粒子を完全フロイントアジュバント（追加免疫用量は、不完全フロイントアジュバントでアジュバントした）、ＱＳ２１またはリン酸アルミニウム（ALUM）でアジュバントした。最初の免疫感作から１１週間後に動物から血清検体を採り、ＨＩＶ−１_MNのＶ３中和エピトープ（TRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC：配列番号３１）、ｍＨＡ２配列（GPAKKATLGATFAFDSKEEWCREKKEQWE：配列番号２２）および組換え源から産生されたｐ２４（gag）蛋白を有するアミノ酸配列に相当するペプチドとの反応性を、ＥＬＩＳＡによって調べた。結果を図１３に示しているが、この結果は、ｍＨＡ２マーカー配列を有するＨＩＶ様粒子が免疫応答を生じて、ｐ２４（gag）、ｇｐ１２０（具体的にはＶ３中和エピトープ）およびｍＨＡ２マーカー配列を特異的に認識する抗体を形成することができることを示している。スキナーらの報告（Skinner et al., 1988）に記載の方法に従って、モルモット抗血清について、ＨＩＶ_MNによる感染を防止する能力も調べた。表２に終点力価を示したが、この結果は、ｍＨＡ２マーカー配列を発現するレトロウィルス様粒子を用いる免疫感作によって産生される抗体がＨＩＶによる細胞感染を阻害することができることを示している。従ってこれらのデータは、ＨＩＶ様粒子に関して提供された場合に、ｍＨＡ２マーカーが免疫原性であり、各種ＨＩＶ単離物からのＶ３ループの主要中和決定基に対しても抗体が産生されることを示している。
実施例５
本実施例は、ｇｐ４１の免疫優性領域に対する突然変異によって抗体的に標識されたＨＩＶ様粒子の形成について説明するものである。
アミノ酸配列LGIWGCSGKLIC（配列番号２８）を有する免疫優性領域を有するｇｐ１６０（ｇｐ４１）のトランスメンブランドメインとこの配列を認識する抗体は全てのＨＩＶ−１感染者に存在する。実際、この免疫優性領域に特異的な抗体の検出が、ＨＩＶ−１感染の臨床診断に利用される。そのようなこの免疫優性領域に特異的な抗体はＨＩＶ−１感染の臨床診断に利用される。しかしながら、そのような抗体はＨＩＶ−１を中和しないのが普通である。そこで、免疫優性領域の突然変異誘発によって、野生型ＨＩＶ−１と抗原的に識別可能なＨＩＶ様粒子を形成した。ＨＩＶ感染患者からの血清によって認識されない免疫優性領域の突然変異体を、表３に示したような血清で突然変異体配列を有するペプチドを認識することによって確認した。アマシャム・ライフサイエンス（Amersham Life Science, Amersham International PLC）製造のスカルプチャー（Sculpture：登録商標）in vitro突然変異誘発系キットを用いる部位特異的突然変異誘発によって突然変異を導入した。エンベロープをコードする配列を有するｐ８３−１９からのSalI BamHIＤＮＡ断片をＫ１３にサブクローニングし、表３に示した突然変異を指定するＤＮＡを有するオリゴヌクレオチドを用いて、ｇｐ４１内の免疫優性領域に対して適切な突然変異を起こして、構造体ｓｍＩＤＲ、クローン４およびクローン１６を得た。これら構造体のそれぞれをベロ細胞にトランスフェクションし、イムノブロッティングによってレトロウィルス様粒子を得た。これらのレトロウィルス様粒子について、エンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０およびｇｐ１６０およびｇｐ４１の発現を分析した。これらの糖蛋白はいずれも、各種レトロウィルス様粒子に存在していた。特に、ｇｐ４１の免疫優性領域にアミノ酸置換ＳＧＫ→ＡＦＲを有するクローン４を選択した。
開示の要旨
本開示をまとめると、本発明は、例えば予防接種すなわちレトロウィルス特異的抗血清の形成に有用な免疫原性製剤ならびに診断法・診断キットにおける抗原としてのある種の非感染性非複製性レトロウィルス様粒子およびそれをコードする核酸分子を提供する。レトロウィルス様粒子は、polおよび／またはgag遺伝子産物に対する修飾によって非感染性になったと考えられる。特定のレトロウィルス様粒子は、非レトロウィルス性非抗原マーカーを有する。本発明の範囲内での改良は可能である。

引用文献
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3.Myers, G., Berzofsky, J.A., Rabson, A.B., Smith,T.F. and Wong-Staal, F.(ed.)(1990) Human retroviruses and AIDS. Theoretical Biology and Biophysics, Group T-10, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.Mex.
4.Alizon, M., Sonigo, P., Barre-Sinoussi,F., Chermann, J.C., Tiollais, P., Montagnier, L. and Wain-Hobson, S.(1984), Nature, 312, 757-780.
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6.Westhof, E., Altschuh, D., Moras, D., Bloomer, A.C., Mondragon, A., Klug, A. and Van Regenmortel, M.H.(1984) Nature, 311, 123-126.
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Claims

ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子であって、
前記粒子は、
（ａ）env遺伝子産物、
（ｂ）pol遺伝子産物、および
（ｃ）gag遺伝子産物のアセンブリを有し、かつ
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを有しており、
該gag遺伝子産物は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物の最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックス中の二つのシステイン残基Ｃｙｓ³⁹²とＣｙｓ³⁹⁵、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所の二つのシステイン残基のセリンによる置換を少なくとも有しているが、ＨＩＶの野生型gag遺伝子産物の粒子形成性を保持し；
該env遺伝子産物は、少なくとも、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物中のｇｐ１２０の部分を含んでおり；
該pol遺伝子産物は、その逆転写酵素ならびにインテグラーゼに相当する領域の一部が欠失し、ＨＩＶの野生型pol遺伝子産物の有する該逆転写酵素ならびにインテグラーゼの活性を失っており、
該少なくとも１個の抗原マーカーは、
ＨＩＶのｇｐ４１を置き換えるように、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のenv遺伝子産物中のアミノ酸残基５０７と５０８の間、あるいは他のＨＩＶのenv遺伝子産物中の相当する箇所に位置する挿入部位に挿入されている、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷ（配列番号２）、ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱ（配列番号３）、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＧＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥ（配列番号４）から選択される、非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性の抗原性アンカー配列であるか、あるいは、
抗原的に活性な挿入部位である、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物のアミノ酸残基２１０と２１１の間、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所に位置する挿入部位に挿入されている、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパク質由来の少なくとも１個の抗原性エピトープである
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子。
前記少なくとも１個の抗原マーカーは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパク質由来の、アミノ酸配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＦＶＥＮ（配列番号１）を含む、少なくとも１個の抗原性エピトープであり、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物のアミノ酸残基２１０と２１１の間、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所に位置する、抗原的に活性な挿入部位に挿入されており、そして、未修飾gag遺伝子産物の粒子形成性を保持するハイブリッドgag遺伝子産物を構成する
ことを特徴とする請求項１に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
前記少なくとも１個の抗原マーカーは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパク質由来の、アミノ酸配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＦＶＥＮ（配列番号１）を含む、抗原性エピトープの１〜４個のコピーであり、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物のアミノ酸残基２１０と２１１の間、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所に位置する、抗原的に活性な挿入部位に挿入されている
ことを特徴とする請求項２に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子であって、
前記粒子は、
（ａ）env遺伝子産物、
（ｂ）pol遺伝子産物、および
（ｃ）gag遺伝子産物のアセンブリを有し、かつ
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを有しており、
該gag遺伝子産物は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物の最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックス中の二つのシステイン残基Ｃｙｓ³⁹²とＣｙｓ³⁹⁵、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所の二つのシステイン残基のセリンによる置換を少なくとも有しているが、ＨＩＶの野生型gag遺伝子産物の粒子形成性を保持し；
該env遺伝子産物は、少なくとも、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物中のｇｐ１２０の部分を含んでおり；
ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物の野生型env遺伝子産物中のｇｐ４１部分のアミノ酸配列中に含まれている、部分アミノ酸配列ＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ（配列番号２７）、あるいは他のＨＩＶの対応する部分アミノ酸配列を、改変アミノ酸配列ＬＧＩＷＧＣＴＧＲＫＩＬＣ（配列番号２８）、ＬＧＩＷＧＣＡＦＲＬＩＣ（配列番号２９）またはＬＧＩＷＧＣＴＬＥＬＩＣ（配列番号３０）によって置き換え、その結果、該ＨＩＶの野生型env遺伝子産物の免疫優性領域である、ｇｐ４１に含まれているエピトープに相当する、前記アミノ酸配列ＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ（配列番号２７）を除去して、該少なくとも１個の抗原マーカーが、与えられている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子。
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子であって、
前記粒子は、
（ａ）修飾env遺伝子産物、
（ｂ）pol遺伝子産物、および
（ｃ）gag遺伝子産物のアセンブリを有し、かつ
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを有しており、
該gag遺伝子産物は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物の最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックス中の二つのシステイン残基Ｃｙｓ³⁹²とＣｙｓ³⁹⁵、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所の二つのシステイン残基のセリンによる置換を少なくとも有しているが、ＨＩＶの野生型gag遺伝子産物の粒子形成性を保持し；
該修飾env遺伝子産物中では、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷ（配列番号２）、ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱ（配列番号３）、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＧＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥ（配列番号４）から選択される、非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性の抗原性アンカー配列を、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物の内因性のアンカー形成機能を有するｇｐ４１を置き換えるように、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のenv遺伝子産物中のアミノ酸残基５０７と５０８の間、あるいは他のＨＩＶのenv遺伝子産物中の相当する箇所に位置する挿入部位に挿入して、少なくとも、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物のｇｐ１２０の部分に対して連結し；かつ
前記非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス由来の異種の抗原性アンカー配列による置換によって、該少なくとも１個の抗原マーカーが与えられている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子。
該ＨＩＶは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２から選択されている請求項１〜５のいずれかに記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
該ＨＩＶは、ＨＩＶ−１である請求項６に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
下記
（ａ）ＨＩＶのgag遺伝子産物のgag依存性ＲＮＡパッケージングを抑制する、
（ｂ）ＨＩＶのpol遺伝子産物の逆転写酵素活性を除去する、
（ｃ）ＨＩＶのpol遺伝子産物のインテグラーゼ活性を除去する、
（ｄ）ＨＩＶのpol遺伝子産物のＲＮアーゼＨ活性を除去する、
のうち、少なくとも１つの作用を果たすように、該polおよび／またはgag遺伝子産物に対して、少なくとも1つの更なる改変が施されている請求項１〜７のいずれかに記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
gag依存性ＲＮＡパッケージングの抑制が、ＨＩＶのgag遺伝子産物中のgag依存性ＲＮＡパッケージングに関与する少なくとも1個のアミノ酸残基の置換または欠失により果たされている請求項８に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
ＨＩＶのpol遺伝子産物の逆転写酵素活性の除去が、少なくともその逆転写酵素活性に関与する一部分の欠失により果たされている請求項８に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
ＨＩＶのpol遺伝子産物のインテグラーゼ活性の除去が、少なくともそのインテグラーゼ活性に関与する一部分の欠失により果たされている請求項８に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
ＨＩＶのpol遺伝子産物のＲＮアーゼＨ活性の除去が、少なくともそのＲＮアーゼＨ活性に関与する一部分の欠失により果たされている請求項８に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子であって、
前記核酸分子は、長い末端反復ならびにＲＮＡパッケージングシグナルを欠失し、かつ
（ａ）env遺伝子；
（ｂ）pol遺伝子；
（ｃ）gag遺伝子；ならびに
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶウイルス性の少なくとも1個の抗原マーカーをコードする断片
を含んでいる、ＨＩＶの修飾ウイルスゲノムを含んでなり、
該gag、polおよびenv遺伝子は、ＨＩＶのゲノムＲＮＡ中に存在する際の天然ゲノム配置で含まれており、
該gag遺伝子は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物の最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックス中の二つのシステイン残基Ｃｙｓ³⁹²とＣｙｓ³⁹⁵、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所の二つのシステイン残基のセリンによる置換を少なくとも有しているが、少なくとも、ＨＩＶの野生型gag遺伝子産物の粒子形成性を保持する該gag遺伝子産物部分をコードしており、
該env遺伝子は、少なくとも、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物のｇｐ１２０部分をコードしており、かつ
少なくとも1個の抗原マーカーをコードする断片は、
ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷ（配列番号２）、ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱ（配列番号３）、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＧＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥ（配列番号４）から選択される、非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性の抗原性アンカー配列をコードする断片であり、前記抗原性アンカー配列でＨＩＶのｇｐ４１を置き換えるように、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のenv遺伝子中のアミノ酸残基５０７と５０８をコードする二つのコドンの間、あるいは他のＨＩＶのenv遺伝子中の相当する箇所に位置する挿入部位に挿入して、前記env遺伝子中に含まれているか、あるいは、
タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパク質由来の少なくとも１個の抗原性エピトープをコードする断片であり、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子中のアミノ酸残基２１０と２１１をコードするコドンの間、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子中の相当する箇所に位置する挿入部位に挿入して、前記gag遺伝子中に含まれている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子。
少なくとも1個の抗原マーカーをコードする断片は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパク質由来の少なくとも１個の抗原性エピトープをコードする断片であり、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子中のアミノ酸残基２１０と２１１をコードするコドンの間、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子中の相当する箇所に位置する挿入部位に挿入されて、ＨＩＶの未修飾gag遺伝子産物の粒子形成性を保持するハイブリッドgag遺伝子産物をコードする修飾gag遺伝子とされている請求項１３に記載の核酸分子。
少なくとも1個の抗原マーカーをコードする断片は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパク質由来の、アミノ酸配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＦＶＥＮ（配列番号１）を含む、抗原性エピトープの１〜４個のコピーをコードする断片であり、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子中のアミノ酸残基２１０と２１１をコードするコドンの間、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子中の相当する箇所に位置する挿入部位に挿入されており、未修飾gag遺伝子産物中に、その抗原的に活性な挿入部位において、少なくとも１個の抗原マーカーが挿入されている、ハイブリッドgag遺伝子産物を与えている、請求項１４に記載の核酸分子。
ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子の核酸塩基１４１５のPstIサイト、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子中の相当する部位に位置する挿入部位において、前記タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コートタンパク質由来の抗原性エピトープの１〜４個のコピーをコードする断片が、該gag遺伝子中に挿入されている請求項１５に記載の核酸分子。
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子であって、
前記核酸分子は、長い末端反復ならびにＲＮＡパッケージングシグナルを欠失し、かつ
（ａ）修飾env遺伝子；
（ｂ）pol遺伝子；
（ｃ）gag遺伝子；ならびに
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶウイルス性の少なくとも1個の抗原マーカーをコードする断片
を含んでいる、ＨＩＶの修飾ウイルスゲノムを含んでなり、
該gag、polおよびenv遺伝子は、ＨＩＶのゲノムＲＮＡ中に存在する際の天然ゲノム配置で含まれており、
該gag遺伝子は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のgag遺伝子産物の最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックス中の二つのシステイン残基Ｃｙｓ³⁹²とＣｙｓ³⁹⁵、あるいは他のＨＩＶのgag遺伝子産物中の相当する箇所の二つのシステイン残基のセリンによる置換を少なくとも有しているが、少なくとも、ＨＩＶの野生型gag遺伝子産物の粒子形成性を保持する該gag遺伝子産物部分をコードしており、
該pol遺伝子は、その逆転写酵素ならびにインテグラーゼに相当する領域の一部が欠失し、ＨＩＶの野生型pol遺伝子産物の有する該逆転写酵素ならびにインテグラーゼの活性を失っている、該pol遺伝子産物の部分を少なくともコードしており、
少なくとも1個の抗原マーカーをコードする断片は、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷ（配列番号２）、ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱ（配列番号３）、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＧＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥ（配列番号４）から選択される、非レトロウイルスかつＨＩＶレトロウイルス由来の抗原性アンカー配列をコードする断片であり、かつ
該修飾env遺伝子は、少なくとも、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物のｇｐ１２０部分を保持し、また、少なくとも、野生型env遺伝子のｇｐ１２０のコード領域に対して、機能的に連結されている、非レトロウイルスかつ非ＨＩＶウイルス由来の抗原性アンカー配列をコードする断片を含んでおり、それによって、該修飾env遺伝子は、ｇｐ４１部分の内因性アンカー機能が、少なくとも、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物のｇｐ１２０部分に対して、該ＨＩＶ様粒子に該改変env遺伝子産物をアンカーするように機能的に連結されている、非レトロウイルスかつ非ＨＩＶウイルス由来の抗原性のアンカー配列により置き換えられている改変env遺伝子産物をコードしている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子。
非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の抗原性のアンカー配列による置換は、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物中のgp４１タンパク質のエピトープに対応する、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のｇｐ４１部分中に含まれている、アミノ酸配列ＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ（配列番号２７）、あるいは他のＨＩＶの対応するアミノ酸配列の欠失を引き起こす請求項１７に記載の核酸分子。
非レトロウイルスかつ非ＨＩＶウイルス由来のアンカー配列をコードする断片は、少なくとも、非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の膜スパニング蛋白のトランスメンブラン部分の一部である、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷ（配列番号２）、ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱ（配列番号３）、ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＧＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥ（配列番号４）から選択される抗原性アンカー配列をコードする請求項１７または１８に記載の核酸分子。
非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の膜スパニング蛋白が、インフルエンザウイルス由来の糖蛋白である請求項１９に記載の核酸分子。
アンカー配列をコードする断片は、ＨＩＶの野生型env遺伝子産物中のgp１２０タンパク質とgp４１タンパク質の間の機能性開裂部位をコードする核酸塩基の上流で、かつ隣接して、該修飾env遺伝子内に位置している請求項１７または１８に記載の核酸分子。
該ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のenv遺伝子の塩基７７７７と７７７８の間、あるいは他のＨＩＶのenv遺伝子中の相当する部位に、前記アンカー配列をコードする断片が位置している請求項２１に記載の核酸分子。
前記修飾レトロウイルスゲノムは、さらにプライマー結合部位を欠失している請求項１３〜２２のいずれかに記載の核酸分子。
前記修飾レトロウイルスゲノムは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２由来の修飾レトロウイルスゲノムである請求項１３〜２３のいずれかに記載の核酸分子。
前記修飾ＨＩＶウイルスゲノムは、ＨＩＶ−１由来の修飾ＨＩＶウイルスゲノムである請求項２４に記載の核酸分子。
下記
（ａ）ＨＩＶのgag遺伝子産物のgag依存性ＲＮＡパッケージングを抑制する、
（ｂ）ＨＩＶのpol遺伝子産物の逆転写酵素活性を除去する、
（ｃ）ＨＩＶのpol遺伝子産物のインテグラーゼ活性を除去する、
（ｄ）ＨＩＶのpol遺伝子産物のＲＮアーゼＨ活性を除去する、
のうち、少なくとも１つの作用を果たすように、該polまたはgag遺伝子中の少なくとも１つの更なる改変が施されている請求項１３〜２５のいずれかに記載の核酸分子。
前記修飾ＨＩＶウイルスゲノムは、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物の遺伝子のSacI（678）からXhoI（8944）断片中に存在する特徴的な遺伝子要素を保持する修飾ＤＮＡ分子である請求項１３〜２６のいずれかに記載の核酸分子。
前記修飾ＨＩＶウイルスゲノムは、プライマー結合部位および／またはＲＮＡパッケージングシグナルを欠く請求項１３〜２７のいずれかに記載の核酸分子。
請求項１〜１２のいずれかに記載するＨＩＶ様粒子、ならびに担体を含む、ＨＩＶ特異的な免疫反応ならびに非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルスマーカーに対して特異的な免疫反応を誘発することができる免疫原組成物。
抗血清中の、前記ＨＩＶ様粒子の抗原性マーカーに対する特異的な抗体を検出することを特徴とする、請求項２９に記載の免疫原組成物を用いる免疫感作により生成された抗血清の同定方法。