PT778888E

PT778888E - Particulas semelhantes a retrovírus não infecciosas antigenicamente marcadas.

Info

Publication number: PT778888E
Application number: PT95927611T
Authority: PT
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1994-08-15
Filing date: 1995-08-15
Publication date: 2006-11-30
Also published as: JP2006020635A; US6025125A; US5889176A; CA2197446A1; EP0778888B1; US5866320A; ATE331026T1; EP0778888A1; JP3871708B2; AU3159995A; DE69535075D1; MX9701149A; WO1996005292A1; US5879925A; US5955342A; JPH10503933A; DE69535075T2; DK0778888T3; ES2268693T3; AU704309B2

Description

ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Partículas semelhantes a retrovírus não infecciosas antigenicamente marcadas"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da imunologia e refere-se particularmente a partículas semelhantes a retrovírus não infecciosas antigenicamente marcadas (por vezes denominadas pseudoviriões)

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 vírus da imunodeficiência humana é um retrovírus humano e é o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA). Desde que a SIDA foi reportada pela primeira vez nos EU em 1981, mais de 194 000 pessoas morreram de SIDA e mais de 330 000 casos de infecção por HIV foram reportados apenas nos EU. Em todo o mundo estima-se que mais de 14 milhões de pessoas foram infectadas com HIV.

Mais de 100 medicamentos relacionados com a SIDA estão em ensaios clínicos humanos ou esperam aprovação da FDA mas presentemente não existe cura para esta doença.

Existe portanto uma clara necessidade de preparações imunogénicas úteis como candidatos a vacinas, como antigénios em ensaios de diagnóstico e kits e para a produção de reagentes imunológicos para o diagnóstico do HIV e outras doenças e infecções retrovirais.

Preparações imunogénicas particulares da arte anterior incluem partículas semelhantes a HIV não infecciosas e não replicantes. Assim, os pedidos PCT WO 93/20220 publicado em 14 de Outubro, 1993, e WO 91/05860 publicado em 2 de Maio, 1990 (Whitehead Institute for Biomedical Research), ensinam construções compreendendo genomas de HIV possuindo uma alteração numa sequência nucleotídica que é crítica para a encapsidação do ARN genómico, e a produção de partículas de HIV imunogénicas e não infecciosas produzidas por expressão destas construções em células de mamífero. 2 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ Ο pedido PCT WO 91/07425 publicado em 30 de Maio, 1991 (Oncogen Limited Partnership) ensina partículas retrovirais não replicantes produzidas por co-expressão de proteínas retrovirais maduras estruturais do núcleo e do envelope de modo a que as proteínas retrovirais expressas se montam formando partículas retrovirais em desenvolvimento. Uma partícula semelhante a HIV não replicante particular foi feita por co-infecção de células hospedeiras de mamífero com um vírus vaccinia recombinante portador dos genes gag e protease de HIV-1 e um vírus vaccinia recombinante portador do gene env de HIV-1.

No pedido PCT publicado WO 91/05864 titulado pelo cessionário do presente pedido, descrevem-se partículas semelhantes a retrovírus não infecciosas e não replicantes particulares contendo pelo menos as proteínas gag, pol e env na sua conformação natural e codificadas por um genoma retroviral modificado deficiente em repetições terminais longas e contendo os genes gag, pol e env no seu arranjo genómico natural.

Como não existe vacina nem tratamento eficaz para a SIDA e como estas partículas semelhantes a HIV da arte anterior contêm muitas das proteínas de HIV nas suas conformações naturais, um hospedeiro com elas imunizado pode montar uma resposta imunitária imunologicamente indistinguível da infecção por HIV. O anti-soro anti-HIV inactivado por calor obtido a partir de pessoas infectadas com HIV e HIV inactivado estão presentemente disponíveis no comércio como componentes de muitos métodos de diagnóstico. Por questões de segurança, facilidade de manuseamento, transporte, armazenagem e utilização, pode ser preferível substituir estes anti-soros inactivados por calor e antigénios por HIV não infeccioso e anti-soros gerados por imunização com partículas de HIV não infecciosas como atrás descrito. Adicionalmente, os anti-soros gerados por imunização com estas partículas de HIV não infecciosas não requerem inactivação por calor para remover o HIV infeccioso. Contudo, devido à gravidade da infecção por HIV, é desejável ser-se capaz de distinguir entre HIV inactivado e partículas de HIV não infecciosas e não replicantes e anti-soros gerados por HIV virulento e 3 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ partículas de HIV não infecciosas e não replicantes. Assim, no desenvolvimento de candidatos para vacinas, preparações imunogénicas e métodos e kits de diagnóstico para a SIDA, seria útil proporcionar uma partícula semelhante a HIV imunologicamente, ou de outro modo, distinguível do HIV virulento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à capacidade de diferenciar entre infecção por HIV ou outro retrovírus, particularmente um retrovírus humano, e a imunização com uma preparação imunogénica. A presente invenção refere-se também à capacidade de diferenciar entre HIV virulento inactivado e partículas semelhantes a HIV não infecciosas e não replicantes. A presente invenção incorpora um marcador numa partícula semelhante a retrovírus não infecciosa.

Deste modo, num aspecto, a presente invenção proporciona uma partícula não infecciosa semelhante ao vírus da imunodeficiência humana (HIV), compreendendo uma montagem de (a) um produto do gene env; (b) um produto do gene pol; (c) um produto do gene gag; e (d) pelo menos um marcador antigénico que é retroviral mas não de HIV e que pode não ser retroviral e é capaz de produzir uma resposta imunitária. 0 pelo menos um marcador antigénico pode ter de cerca de 5 a cerca de 100 resíduos de aminoácido, particularmente de cerca de 10 a cerca de 75 resíduos de aminoácido. O marcador antigénico pode compreender pelo menos um epítopo antigénico de outro vírus. A invenção é ilustrada, numa concretização, por pelo menos um epítopo antigénico da proteína de revestimento do vírus do mosaico do tabaco (TMV), incluindo especificamente uma sequência de aminoácidos AFDTRNRIIEVEN (SEQ. ID NO: 1) ou uma sua porção, variação ou mutante capaz de eliciar anticorpos que reconhecem esta sequência, ou múltiplas cópias, especificamente de 1 a 4, desta sequência de aminoácidos. O marcador antigénico pode ser incorporado na montagem de produtos dos genes env, pol e gag de qualquer maneira conveniente. Numa concretização da invenção, a sequência 4 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ marcadora está contida no interior do produto do gene gag para formar um produto do gene gag híbrido possuindo as características de formação de partículas do produto do gene gag não modificado. A sequência marcadora pode se incluída no interior do produto do gene gag por inserção do marcador antigénico no produto do gene gag num local de inserção antigenicamente activo.

Numa concretização específica da invenção, o local de inserção pode estar localizado entre os resíduos de aminoácido 210 e 211 do produto do gene gag do isolado LAI de HIV-1 ou na localização correspondente noutros produtos de gene gag retrovirais. A sequência marcadora pode também ser proporcionada eliminando ou evitando a produção de uma sequência de aminoácidos que corresponde a um epítopo de uma proteína retroviral. Por exemplo, um tal epítopo pode compreender uma região imunodominante, gp41, que proporciona a função de ancoragem endógena. Quando esta função de ancoragem endógena é removida desta maneira, a função de ancoragem é proporcionada por uma sequência de âncora antigénica diferente. Alternativamente, a região imunodominante do produto do gene env pode ser modificada por substituição ou remoção de pelo menos um aminoácido para impedir substancialmente o reconhecimento da região imunodominante na mutação resultante por soros de hospedeiros infectados com retrovírus.

Nesta concretização da invenção, o retrovírus pode ser HIV-1 e a região imunodominante pode conter a sequência de aminoácidos LGIWGCSGKLIC (SEQ ID NO:27). As sequências de aminoácidos específicas de mutações que podem ser aqui proporcionadas incluem LGIWGCTGRKILC (SEQ ID NO:28), LGIWGCAFRLIC (SEQ ID NO:29) e LGIWGCTLELIC (SEQ ID NO:30).

Deste modo, noutro aspecto da presente invenção, proporciona-se uma partícula semelhante a retrovírus não infecciosa, compreendendo uma montagem de (a) um produto do gene env modificado em que a função de ancoragem endógena foi substituída por uma sequência de âncora diferente operativamente ligada ao produto do gene env para ancorar o 5 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ produto do gene env à partícula semelhante a retrovírus; (b) um produto do gene pol; e (c) um produto do gene gag. A sequência de âncora, que pode ser antigénica, pode ter entre cerca de 5 e cerca de 100 resíduos de aminoácido, preferivelmente cerca de 10 a cerca de 75 resíduos de aminoácido. A sequência de âncora pode compreender pelo menos uma porção de uma componente transmembranar de uma proteína que atravessa a membrana, particularmente uma glicoproteína. Esta glicoproteína pode ser qualquer glicoproteína conveniente, tal como uma proteína do vírus influenza, particularmente uma proteína do vírus influenza humano, ou uma proteína do vírus influenza aviário. A sequência de âncora pode incluir uma sequência de aminoácidos WILWISFAISCFLLCWLLGFIMW (SEQ ID NO:2) ou uma sua porção, variação ou mutante capazes de produzir anticorpos que reconhecem essa sequência, uma sequência de aminoácidos STVASSLALAIMIAGLSFWMCSNGSLQ (SEQ ID NO:3) ou uma sua porção, variação ou mutante capazes de produzir anticorpos que reconhecem essa sequência; ou uma sequência de aminoácidos WILWISFAISCFLLCVVCWGSSCGPAKKATLGATFAFDSKEEWCREKK EQWE (SEQ ID NO:4) ou uma sua porção, variação ou mutante capazes de produzir anticorpos que reconhecem essa sequência. A sequência de âncora preferivelmente é inserida no produto do gene env adjacente, e a montante, de locais de clivagem funcionais do produto do gene env. O local de inserção preferivelmente está localizado entre resíduos de aminoácido 507 e 508 do produto do gene env do isolado LAI de HIV-1 ou na localização correspondente de outros produtos de gene env retroviral. A partícula semelhante a retrovírus proporcionada de acordo com cada um dos aspectos da invenção preferivelmente é uma em que os produtos dos genes env, pol e gag correspondem aos produtos dos genes env, pol e gag de um retrovírus humano, particularmente HIV-1 ou HIV-2.

Especificamente, o retrovírus humano pode ser HIV-1 e o produto do gene env pode ser um produto do gene env de LAI, um produto do gene env de MN, um produto do gene env de um 6 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ isolado primário de HIV-1, ou um produto do gene env a estes antigenicamente equivalente. Os produtos dos genes gag e pol podem ser derivados de um isolado de HIV-1 diferente do isolado de HIV-1 do qual o produto do gene env é derivado. Em particular, nestas partículas, o produto do gene env pode ser derivado de um isolado primário de HIV-1. A presente invenção inclui também moléculas de ácido nucleico que codificam partículas semelhantes a retrovírus não infecciosas da invenção. Deste modo, noutro aspecto da invenção, proporciona-se uma molécula de ácido nucleico que codifica uma partícula semelhante a HIV não infecciosa, compreendendo um genoma de HIV modificado deficiente em repetições terminais longas e contendo os genes gag, pol e env no seu arranjo genómico natural e um segmento que codifica pelo menos um marcador antigénico que é retroviral mas não de HIV e que pode não ser retroviral. A molécula de ácido nucleico pode compreender uma molécula de ADN contendo os elementos genéticos característicos presentes num fragmento Saci to Xhol do genoma do isolado Ηΐν-Ι^. 0 genoma modificado também pode ser deficiente no local de ligação a iniciadores.

Numa concretização ilustrativa específica deste aspecto da invenção, a sequência que codifica o pelo menos um marcador antigénico é inserida no gene gag, especificamente no local PstI no nucleótido 1415 do gene gag do isolado LAI de HIV-1 ou na localização correspondente noutros genes gag retrovirais. Um segmento específico compreende de 1 a 4 cópias de uma sequência de ADN seleccionada do grupo que consiste em: (a) 5' GCATTCGACACTAGAAATAGAATAATAGAAGTTGAAAAT 3'; (SEQ ID NO:5); (b) 3' CGTAAGCTGTGATCTTTATCTTATTATCTTCAACTTTTA 5'; (SEQ ID NO: 6) e (c) sequências de ADN que hibridam com (a) ou (b) sob condições rigorosas, particularmente sequências que possuem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de (a) ou (b).

Podem ser empregues uma variedade de condições de hibridação para conseguir vários graus de selectividade de hibridação. Para um elevado grau de selectividade, utilizam-se condições rigorosas para formar as dúplices, tais como condições de baixa concentração de sais e/ou temperatura 7 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ elevada, tal como proporcionadas por NaCl de 0,02 M a 0,15 M a temperaturas entre cerca de 50°C e 70°C. Para algumas aplicações, são necessárias condições de hibridação menos rigorosas tais como 0,15 M a 0,9 M de sal, a temperaturas variando entre cerca de 20°C e 55°C. As condições de hibridação podem também ser tornadas mais rigorosas pela adição de quantidades crescentes de formamida, para desestabilizar a dúplex híbrida.

Em ainda outra concretização da presente invenção, proporciona-se uma molécula de ácido nucleico que codifica uma partícula semelhante a HIV não infecciosa, compreendendo um genoma de HIV modificado deficiente em repetições terminais longas e contendo os genes gag, pol e env no seu arranjo genómico natural com o gene env modificado para proporcionar um segmento que codifica uma sequência de âncora antigénica para ancorar o produto do gene env à partícula semelhante a retrovírus, pelo que o gene env modificado codifica um produto de gene env modificado em que a função de ancoragem endógena de env foi substituída pela sequência de âncora antigénica.

Numa concretização ilustrativa específica deste aspecto da invenção, o segmento que codifica a sequência do marcador antigénico é inserido no gene env, especificamente entre os nucleótidos 7777 e 7778 do gene env do isolado LAI de HIV ou na localização correspondente de outros genes env retrovirais. Um segmento específico que codifica a sequência de âncora inclui uma sequência de ADN seleccionada do grupo que consiste em: (a) 5' TGGATCCTGTGGATTCCTTTGCCATATCATGCTTTTTGCTTTG TGTTGTTTTGCTGGGGTTCATCATGTGG 3'; (SEQ ID NO: 7); (b)

, 3' ACCTAGGACACCTAAAGGAAACGGTATAGTACGAAAAACGAAAC ACAACAAAACGACCCCAAGTAGTACACC 5'; (SEQ ID NO: 8); e (c) sequências de ADN que hibridam com (a) ou (b) sob condições rigorosas, particularmente sequências que possuem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com as sequências de (a) ou (b). 8 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

Outro segmento específico que codifica a sequência de âncora inclui uma sequência de ADN seleccionada do grupo que consiste em: (a) 5' TCAACAGTGGCAAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGATAGCTGGTC TATCTTTTTGGATGTGTTCCAATGGGTCATTGCAG 3' (SEQ ID NO: 9); (b) 3 ' AGTTGTCACCGTTCAAGGGATCGTGACCGTTAGTACTATCGACCA GATAGAAAAACCTACACAAGGTTACCCAGTAACGTC 5' (SEQ ID NO: 10) ; e (c) sequências de ADN que hibridam com (a) ou (b) sob condições rigorosas, particularmente sequências que possuem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com as sequências de (a) ou (b) . Um outro segmento específico que codifica a sequência de âncora inclui uma sequência de ADN seleccionada do grupo que consiste em: (a) 5' TGGATCCTGTGGATTTCCTTTGCCATATCATGCTTTT TGCTTTGTGTTGTTTGCTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAA AGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGATAGTAAAGAAGAGTGGTGC AGAGAGAAAAAAGAGÇAGTGGGAA 3' (SEQ ID NO: 11); (b) 3’ ACCTAGGACACCTAAAGGAAACGGTATAGTACGAAAAACGAA ACACAACAAACGACCCCAAGTAGTACACCCGGACGGTTTTTCCGTTGTAA TCCACGTTGTAAACGTAAACTATCATTTCTTCTCACCACGTCTCTCTTTT TTCTCGTCACCCTT 5' (seq id No: 12); e (c) sequências de ADN que hibridam com (a) ou (b) sob condições rigorosas, particularmente sequências que possuem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de (a) ou (b). A presente invenção inclui ainda, num aspecto adicional, uma composição imunogénica capaz de eliciar uma resposta imunitária específica do HIV e uma resposta imunitária específica contra um marcador não retroviral compreendendo a partículas semelhantes a retrovírus ou a molécula de ácido 9 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ nucleico aqui proporcionadas, e um seu transportador. Esta composição pode ser formulada para administração mucosa ou parentérica, pelas vias oral, anal, vaginal ou intranasal. A composição imunogénica pode compreender pelo menos um outro material imunológico ou imunoestimulante, especificamente um adjuvante, tal como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, QS21, Quil A, fosfato de cálcio, hidróxido de cálcio, hidróxido de zinco, um análogo glicolipídico, um éster de octadenilo de um aminoácido, um dipéptido de muracrilo, uma lipoproteína ou adjuvante incompleto de Freund.

Num aspecto adicional, a presente invenção pode ser empregue num método de imunização de um hospedeiro para produzir uma resposta imunitária específica para o HIV e uma resposta imunitária específica não retroviral contra um marcador antigénico, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade imuno-eficaz da composição imunogénica aqui proporcionada. A presente invenção pode também ser utilizada em procedimentos e kits de diagnóstico que utilizam estes materiais.

Especificamente, pode ser proporcionado um método de determinação da presença de anticorpos que reagem especificamente com antigénios de HIV numa amostra, compreendendo os passos de (a) contacto da amostra com a partícula semelhante a HIV não infecciosa aqui proporcionada para produzir complexos compreendendo as partículas semelhantes a HIV não infecciosas e quaisquer destes anticorpos presentes na amostra especificamente reactivos com as mesmas; e (b) determinação da produção dos complexos.

Adicionalmente, pode-se proporcionar um método de determinação da presença de antigénios de HIV numa amostra, compreendendo os passos de (a) imunização de um hospedeiro com a composição imunogénica aqui proporcionada para produzir anticorpos específicos dos antigénios de HIV; (b) contacto da amostra com os anticorpos específicos dos antigénios de HIV para produzir complexos compreendendo quaisquer antigénios de HIV na amostra e os anticorpos específicos dos antigénios de HIV; e (c) determinação da produção dos complexos. 10 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ A invenção pode ser empregue num kit de diagnóstico para a detecção da presença de antigénios de HIV numa amostra compreendendo (a) pelo menos um destes anticorpos específicos para antigénios de HIV como aqui descrito; (b) meios para o contacto do pelo menos um anticorpo com a amostra para produzir um complexo compreendendo quaisquer antigénios de HIV na amostra e os anticorpos específicos dos antigénios de HIV; e (c) meios para determinação da produção do complexo.

Adicionalmente, num outro aspecto da invenção, proporciona-se um método de identificação de um anti-soro gerado por imunização com a composição imunogénica aqui proporcionada, compreendendo a detecção de anticorpos no anti-soro específico para o marcador antigénico.

As vantagens da presente invenção incluem: • uma partícula imunogénica semelhante a HIV compreendendo os produtos dos genes gag, pol e env nas suas conformações naturais, tornada não infecciosa e não replicante; e • uma partícula imunogénica semelhante a HIV, imunologicamente distinguível de um retrovírus virulento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A presente invenção será mais bem entendia a partir da descrição que se segue com referência aos desenhos nos quais: A Figura 1 mostra um esquema de construção de um plasmídeo (pMTHIV-A) que codifica uma partícula semelhante a retrovírus de acordo com uma concretização da invenção; A Figura 2 mostra um esquema da construção de um plasmídeo (pMTHIVBRU) que codifica uma partícula semelhante a retrovírus de acordo com uma outra concretização da invenção; A Figura 3 mostra um esquema da construção de um plasmídeo (P83-19) que codifica uma partícula semelhante a retrovírus de acordo com uma outra concretização da invenção; 11 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ A Figura 4 mostra um esquema da construção de um plasmídeo (pSeBS-HA2) de acordo com uma concretização da invenção; A Figura 5 mostra um diagrama de fluxos para a mutagénese auxiliada por montagem de genes; A Figura 6 mostra um esquema da construção de um plasmídeo (pMTHIVHA2-701) que codifica um partícula semelhante a retrovírus contendo uma sequência de um marcador antigénico compreendendo uma porção da componente transmembranar da glicoproteína hemaglutinina de influenza humano de acordo com uma outra concretização da presente invenção; A Figura 7 mostra um esquema da construção de um plasmídeo (pMTHIVmHA2) que codifica uma partícula semelhante a retrovírus contendo um marcador que não é de ocorrência natural de acordo com uma outra concretização da invenção; A Figura 8 mostra um esquema da construção de um plasmídeo (pMTHIVMNmHA2-5) que codifica uma partícula semelhante a retrovírus contendo um marcador que não é de ocorrência natural de acordo com ainda outra concretização da invenção; A Figura 9 mostra detalhes de um oligonucleótido que codifica um epítopo antigénico do vírus do mosaico do tabaco inserido no produto do gene gag de uma partícula semelhante a retrovírus não infecciosa e não replicante de acordo com outra concretização da invenção; A Figura 10 mostra um esquema da construção de plasmídeos que codificam partículas semelhantes a retrovírus possuindo epítopos antigénicos do vírus do mosaico do tabaco; A Figura 11 mostra uma análise Immunoblot de partículas semelhantes a retrovírus (pseudoviriões) antigenicamente marcadas da presente invenção; e A Figura 12 mostra uma análise Immunoblot de partículas semelhantes a retrovírus marcadas antigenicamente para 12 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ demonstrar a inclusão do marcador antigénico no produto do gene gag; A Figura 13 mostra a resposta imunitária em porquinhos-da-índia imunizados com partículas semelhantes a retrovírus, antigenicamente marcadas por inclusão da sequência de mHA2; A Figura 14 mostra a resposta imunitária em porquinhos-da-índia imunizados com partículas semelhantes a retrovírus antigenicamente marcadas por inclusão da sequência marcadora de TMV; A Figura 15 mostra a localização de uma região imunodominante na glicoproteína do envelope gpl20 de HIV-1 para modificação para proporcionar uma partícula semelhante a retrovírus não infecciosa antigenicamente distinguível do HIV-1; A Figura 16 mostra uma análise Immunoblot de partículas semelhantes a retrovírus contendo a glicoproteína do envelope gpl20 de um isolado primário, clínico, de HIV-1.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO É claramente evidente para um perito na especialidade, que as várias concretizações da presente invenção têm muitas aplicações nos campos da vacinação, diagnóstico, tratamento de infecções com HIV, e na produção de reagentes imunológicos. Uma outra discussão não limitante destas utilizações é adicionalmente apresentada adiante.

Com referência às Figuras 1 e 2, está ilustrada a construção de um vector pMTHIVBRU (designação ATCC 75852) contendo um genoma retroviral modificado deficiente em repetições terminais longas, local de ligação a iniciadores e uma sequência de encapsidação de ARN, e contendo os genes gag, pol e env no seu arranjo genómico natural. 0 gene pol de pMTHIVBRU foi modificado por deleção de uma sua porção para substancialmente remover as suas actividades de transcriptase inversa e integrase. Adicionalmente, nesta concretização particular ilustrada da invenção, foi inserido um oligonucleótido no gene pol eliminado para introduzir três 13 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ codões de terminação em três diferentes enquadramentos de leitura para evitar que as sequências de integrase remanescentes sejam tradução. O gene gag de pMTHIVBRU foi também modificado para substituir os dois resíduos de cisteína (Cys392 e Cys395 ) na primeira caixa Cys-His por serinas.

Assim, o plasmídeo pMTHIVBRU codifica uma partícula semelhante a HIV deficiente numa pluralidade de elementos necessários para a infecciosidade e/ou a replicação do HIV mas dispensáveis para a produção de partículas semelhantes a vírus. 0 plasmídeo pMTHIVBRU codifica uma partícula semelhante a HIV com uma proteína de envelope correspondente à do isolado HIV-Ilai· Com referência à Figura 3, é mostrado um plasmídeo p83-19 em que o envelope de LAI de pMTHIVBRU foi substancialmente substituído pela sequência de envelope de MN. Assim, o plasmídeo p83-19 codifica uma partícula semelhante a HIV deficiente numa pluralidade de elementos necessários para a infecciosidade e/ou a replicação de HIV mas dispensáveis para a produção de partículas semelhantes a vírus, e contém como produto do gene env substancialmente o envelope do isolado MN de HIV-1. A partícula semelhante a HIV pode conter outros produtos de env, particularmente de isolados clínicos de paciente infectados com HIV-1, tais como um isolado primário de HIV-1 dos grupos biológicos A, B, C, D, E e 0, incluindo o isolado específico bx08. O produto do gene env também pode ser uma quimera da proteína gpl20 de uma fonte e o restante de outra fonte, tal como MN/LAI, bx08/LAI e as quimeras grupo biológico/LAI.

Com referência às Figuras 4 a 6, ilustra-se a construção de um vector pMTHIVHA2-701 contendo um genoma de HIV modificado deficiente em repetições terminais longas, local de ligação a iniciadores e uma sequência de encapsidação de ARN, e contendo os genes gag, pol e env no seu arranjo genómico natural. O gene env em pMTHIVHA2-7 01 foi modificado para proporcionar um gene que codifica uma sequência de âncora diferente para ancorar o produto do gene env ao produto semelhante a retrovírus, pelo que o gene env modificado codifica um produto do gene env modificado em que a função de ancoragem endógena de env foi substituída pela sequência de 14 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ âncora diferente. Em partículas semelhantes a retrovírus codificadas por pMTHIVHA2-701, já não é expresso um epítopo de gp41 imunodominante (que proporciona a função de ancoragem endógena). Assim, estas partículas semelhantes a retrovírus são antigenicamente marcadas de uma maneira negativa pela ausência de uma sequência de aminoácidos correspondente a um epítopo de uma proteína retroviral. A sequência de âncora diferente pode ela própria ser antigénica para adicionalmente proporcionar um marcador antigénico positivo não retroviral ou retroviral mas não de HIV para as partículas semelhantes a retrovírus.

Nesta concretização particular ilustrada da invenção, uma sequência de 135 pb compreendendo um fragmento de ADN codificante e um codão de paragem do gene de HA2 do vírus influenza humano, foi inserida entre os nucleótidos 7777 (G) e 7778 (A) do gene do envelope de HIV-1LAi para impedir a síntese da glicoproteína transmembranar gp41 de HIV-Ilai· 0 plasmídeo pMTHIVHA2-701 codifica assim uma partícula semelhante a HIV em que a função de ancoragem da glicoproteína transmembranar gp41 foi substituída por uma sequência de âncora da proteína HA2 do vírus influenza humano e a proteína HA2 proporciona adicionalmente um marcador antigénico.

Com referência à Figura 7, ilustra-se o plasmídeo pMTHIVmHA2 que é similar a pMTHIVHA2-701 mas contém como sequência de marcador antigénico a substituir a função de ancoragem endógena de env, uma sequência de aminoácidos sem homologia com proteínas de ocorrência natural conhecidas.

Com referência à Figura 8, ilustra-se um vector pMTHIVMNmHA2-5 (designação ATCC 75853) contendo um genoma de HIV modificado deficiente em repetições terminais longas, local de ligação a iniciadores e uma sequência de encapsidação de ARN e contendo os genes gag, pol e env no seu arranjo genómico natural. 0 gene pol de pMTHIVMNmHA2-5 foi modificado por deleção de uma sua porção para remover substancialmente as suas actividades de transcriptase inversa e integrase. Adicionalmente, inseriu-se um oligonucleótido no gene pol eliminado para introduzir três codões de paragem em três diferentes enquadramentos de leitura para impedir que as restantes sequências de integrase sejam traduzidas. 0 gene gag 15 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ de pMTHIVMNmHA2-5 foi também modificado para substituir os dois resíduos de cisteína na primeira caixa Cys-His de gag por serinas. Em pMTHIVMNmHA2-5, a função de ancoragem endógena de env foi substituída por uma sequência de aminoácidos sem homologia conhecida com proteínas de ocorrência natural. As partículas semelhantes a HIV produzidas a partir de células Vero transfectadas com plasmídeo pMTHIVMNmHA2-5 foram purificadas e utilizadas para imunizar porquinhos-da-índia. Os anti-soros foram recolhidos e ensaiados por ELISA quanto a anticorpos anti-V3 (i.e. anti-envelope) e anticorpos anti-mHA2 (i.e. anti-marcador antigénico) como mostrado na Tabela 1. Estas experiências foram repetidas com outros porquinhos-da-índia e estendidas ao ensaio aos anticorpos anti-gag e os resultados obtidos estão mostrados na Figura 13. Estes resultados indicam que os produtos dos genes gag e env estão presentes substancialmente na sua conformação nativa e que o marcador antigénico é imunogénico.

Embora tenham sido descritas partículas semelhantes a retrovírus particulares em que a função de ancoragem endógena de env foi substituída pela sequência de âncora antigénica de proteínas naturais e não naturais particulares, é de notar que muitas variações, adaptações e modificações podem ser feitas aos meios particulares pelos quais a função de ancoragem endógena pode ser substituída sem afastamento á essência da invenção.

Com referência às Figuras 9 e 10, ilustram-se plasmídeos (pHIV-Tl; PHIV-T2 (designação ATCC 75851); pHIV-T3 e pHIV-T4) contendo entre uma e quatro cópias de uma sequência de ADN que codifica um epítopo antigénico de TMV. Nas concretizações particulares mostradas, o epítopo de TMV é inserido no gene gag de HIV para produzir um produto do gene gag híbrido, e os plasmídeos são deficientes na pluralidade de elementos necessários à infecciosidade e/ou à replicação de HIV mas dispensáveis para a produção de partículas semelhantes a vírus como atrás descrito. Foram produzidas linhas celulares estáveis utilizando os plasmídeos pHIV-Tl, pHIV-T2 (designação ATCC) , pHIV-T3 e pHIV-T4 (contendo 1, 2, 3 e 4 cópias do epítopo antigénico, respectivamente) que produzem partículas semelhantes a HIV contendo o marcador antigénico inserido na proteína gag. Estas partículas semelhantes a HIV foram 16 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ purificadas e a sua reactividade com anticorpos monoclonais anti-HIV (Figura 11) e anti-soro anti-marcador de TMV (Figura 12) foi determinada. Os resultados estão mostrados nas Figuras 11 e 12 e indicam que as partículas semelhantes a HIV contêm gpl20, gp41 e p24 substancialmente nas suas conformações naturais e que o marcador de TMV é capaz de ser reconhecido por anticorpos anti-marcador.

As partículas semelhantes a HIV purificadas produzidas pelo plasmídeo pHIV-T2 foram utilizadas para imunizar porquinhos-da-índia. Os anti-soros foram recolhidos e ensaiados por ELISA quanto a anticorpos anti-gag, anticorpos anti-V3 (i.e. anti-envelope) e anticorpos anti-TMV (i.e. anti-marcador antigénico) como mostrado na Figura 14. Estes resultados indicam que os produtos dos genes gag e env estão presentes substancialmente na sua conformação nativa e que o marcador antigénico é imunogénico.

Adicionalmente, foi realizado um ensaio de inibição da infecção virai com os soros de porquinho-da-índia originários destas imunizações. Formaram-se anticorpos neutralizantes, como mostrado na Tabela 2. A produção destes anticorpos neutralizantes indica a potencial utilidade das partículas semelhantes a retrovírus como candidatos a vacinas e em aplicações de diagnóstico.

Com referência à Figura 16, mostra-se uma análise Immunoblot de partículas semelhantes a retrovírus (pseudovirião) que expressam glicoproteínas do envelope do isolado clínico (primário) bx08. 0 HIV-1 bx08 é um isolado clínico do grupo biológico B isolado em França. Esta análise demonstra a expressão das glicoproteínas do envelope de isolados clínicos numa molécula contendo proteína gag de isolados não clínicos.

Embora sejam aqui descritas concretizações específicas das sequências marcadoras, que podem também ser uma sequência de âncora, é evidente que qualquer outra sequência de aminoácidos conveniente que proporcione a função marcadora e/ou de ancoragem pode ser aqui empregue, incluindo a ausência de uma sequência de aminoácidos que corresponde a um epítopo de uma proteína retroviral. A ausência de uma sequência de 17 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ aminoácidos correspondente a um epítopo de proteína retroviral pode envolver mutagénese de um ou mais aminoácidos de uma região imunodominante do produto do gene env, como mostrado na Tabela 3, para impedir substancialmente o reconhecimento da região imunodominante na mutação resultante por soros de hospedeiros com infecção retroviral. A sequência de aminoácidos que proporciona a função marcadora pode compreender uma sequência antigénica que não é de ocorrência natural que não tem homologia com proteínas conhecidas. Um exemplo desta sequência é uma sequência de HA2 mutante atrás descrita. Outros exemplos podem incluir regiões antigénicas de proteína não humana ou não mamífera, tais como organismos patogénicos ou comensais não humanos ou não mamíferos. Um exemplo de uma tal sequência é o TMV atrás descrito. É claramente evidente para um perito na especialidade, que as várias concretizações da presente invenção têm muitas aplicações nos campos da vacinação, diagnóstico, tratamento de infecções com HIV, e na produção de reagentes imunológicos. Uma discussão não limitante adicional destas utilizações é adicionalmente apresentada adiante.

Preparação de Vacina e Utilização

Demonstrou-se que uma preparação imunogénica de acordo com a invenção pode eliciar uma resposta imunitária. Uma possível utilização da presente invenção é, portanto, como base de uma potencial vacina contra doenças retrovirais incluindo SIDA e condições relacionadas com a SIDA. Num outro aspecto, a invenção proporciona assim uma vacina contra a SIDA e contra condições relacionadas com a SIDA, compreendendo uma composição imunogénica de acordo com a invenção.

As composições imunogénicas, adequadas para utilização como vacinas, podem ser preparadas a partir de partículas semelhantes a retrovírus não infecciosas como aqui revelado. A composição imunogénica elicia uma resposta imunitária que produz anticorpos que são antivirais. Se o indivíduo vacinado for provocado por um retrovírus, tal como HIV, os anticorpos ligam-se ao vírus e desse modo inactivam-no. 18 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

As vacinas podem ser preparadas na forma de injectáveis, na forma de soluções ou emulsões líquidas. As partículas semelhantes a retrovírus não infecciosas podem ser misturadas com excipientes farmaceuticamente aceitáveis que são compatíveis com as partículas semelhantes a retrovírus. Os excipientes podem incluir água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol e suas combinações. A vacina pode ainda conter substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH ou adjuvantes para potenciar a eficácia das vacinas. Os métodos para conseguir um efeito adjuvante para a vacina incluem a utilização de agentes, tais como hidróxido ou fosfato de alumínio (alúmen), vulgarmente utilizados na forma de solução de 0,05 a 0,1 porcento em solução salina tamponada com fosfato e outros adjuvantes, incluindo QS21 e adjuvante incompleto de Freund. As vacinas podem ser administradas parentericamente, por injecção subcutânea ou intramuscular. Alternativamente, as composições imunogénicas formadas de acordo com a presente invenção, podem ser formuladas e entregues de maneira a evocar uma resposta imunitária em superfícies mucosas. Assim, a composição imunogénica pode ser administrada a superfícies mucosas, por exemplo, pelas vias nasal ou oral (intragástrica) . Alternativamente, podem ser desejáveis outros modos de administração incluindo supositórios e formulações orais. Para supositórios, aglutinantes e transportadores podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos. As formulações orais podem incluir incipientes normalmente empregues, tais como qualidades farmacêuticas de sacarina, celulose e carbonato de magnésio. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustentada ou pós e contêm de 10 a 95% das partículas semelhantes a retrovírus da invenção.

As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade tal que sejam terapeuticamente eficazes, protectoras e imunogénicas. A quantidade a administrar depende do indivíduo a tratar, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, e para produzir uma resposta imunitária mediada por células. As quantidades precisas de ingrediente activo que é necessário administrar dependem da avaliação do médico. Contudo, as gamas de dosagem 19 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ adequadas são facilmente determináveis por um perito na especialidade e podem ser da ordem de microgramas das partículas semelhantes a retrovírus. Os regimes adequados para a administração inicial e para as doses de reforço são também variáveis, mas podem incluir uma administração inicial seguida por administrações subsequentes. Um exemplo de um programa de imunização é de pelo menos uma pré-imunização com uma partícula semelhante a retrovírus, de acordo com a presente invenção, seguida por pelo menos uma imunização secundária com um péptido sintético descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia Número 0 570 980, transmitido ao presente cessionário. A dosagem da vacina pode também depender da via de administração e variará também de acordo com a dimensão do hospedeiro.

As moléculas de ácido nucleico que codificam as partículas semelhantes a retrovírus da presente invenção podem também ser utilizadas directamente para imunização por administração das moléculas de ácido nucleico directamente, por exemplo por injecção a um hospedeiro. Os processos para a injecção directa de ADN a indivíduos de teste para imunização genética estão descritos, por exemplo, em Ulmer et al, 1993.

As moléculas de acordo com a invenção podem ainda ser úteis no tratamento (profilático ou curativo) de SIDA e condições relacionadas, actuando quer deslocando a ligação do vírus HIV às células humanas ou animais quer perturbando a organização tridimensional do vírus.

Um outro aspecto da invenção proporciona assim um método para a profilaxia ou tratamento de SIDA ou condições relacionadas, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição imunogénica de acordo com a invenção.

Imunoensaios

As partículas semelhantes a retrovírus da presente invenção são úteis como imunogénios, como antigénios em imunoensaios incluindo ensaios imunossorventes com enzimas ligadas (ELISA), RIA e outros ensaios de ligação de anticorpos sem enzimas ligadas, ou procedimentos conhecidos na especialidade para a detecção de anticorpos anti-retrovirais 20 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ para HIV (por exemplo, HIV) e antigénio retroviral (por exemplo, HIV) . Em ensaios ELISA, as partículas semelhantes a retrovírus são imobilizadas sobre uma superfície seleccionada, por exemplo uma superfície capaz de ligação de proteínas, tais como poços de uma placa de microtítulo de poliestireno. Após lavagem para remover as partículas semelhantes a retrovírus incompletamente adsorvidas, uma proteína não específica, tal como uma solução de albumina sérica bovina (BSA) ou caseína, que se sabe ser antigenicamente neutra em relação à amostra de teste, pode ser ligada à superfície seleccionada. Isto permite o bloqueio de locais de adsorção não específica sobre a superfície de imobilização e assim diminui o ruído de fundo causado por ligações não específicas de anti-soros sobre a superfície. A superfície de imobilização é então colocada em contacto com uma amostra, tal como materiais clínicos ou biológicos a testar, de uma maneira que origine a formação de complexos imunitários (antigénio/anticorpo). Isto pode incluir a diluição da amostra com diluentes, tais como soluções de BSA, gama-globulina bovina (BGG) e/ou solução salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween. A amostra é então deixada incubar durante de cerca de 2 a 4 horas, a temperaturas tais como na ordem de cerca de 25° a 37°C. Após a incubação, a superfície em contacto com a amostra é lavada para remover material que não formou imunocomplexo. O procedimento de lavagem pode incluir a lavagem com uma solução, tal como PBS/Tween, ou um tampão de borato.

Após a formação de imunocomplexos específicos entre a amostra de teste e as partículas semelhantes a retrovírus ligadas, e a subsequente lavagem, pode ser determinada a ocorrência, e mesmo a quantidade, de formação de imunocomplexos submetendo o imunocomplexo a um segundo anticorpo possuindo especificidade para o primeiro anticorpo. Se a amostra de teste é de origem humana, o segundo anticorpo é um anticorpo possuindo especificidade para imunoglobulinas humanas e em geral IgG. Para proporcionar meios de detecção, o segundo anticorpo pode ter uma actividade associada, tal como uma actividade enzimática que irá gerar, por exemplo, o desenvolvimento de uma cor, por incubação com um substrato cromogénico apropriado. A quantificação pode então ser 21 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ conseguida medindo ο grau de produção de cor utilizando, por exemplo, um espectrofotómetro no espectro do visivel.

Numa concretização em diagnóstico onde é desejável identificar anticorpos que reconhecem uma pluralidade de isolados de HIV, uma pluralidade de partículas semelhantes a retrovírus imunologicamente distintas da presente invenção são imobilizadas na superfície seleccionada. Alternativamente, quando os anticorpos anti-HIV reconhecem epítopos que são altamente conservados entre vários isolados de HIV (por exemplo, epítopo de células a.B de gag ou gp41) podem ser imobilizadas uma única ou um número limitado de partículas semelhantes a retrovírus. Numa outra concretização em diagnóstico onde é desejável identificar especificamente anticorpos que reconhecem um único isolado de HIV (por exemplo, LAI, MN, SF2 ou HXB2) pode ser imobilizada uma única partícula semelhante a retrovírus particular da presente invenção. Esta outra concretização em diagnóstico tem particular utilidade nos campos da medicina, ensaios clínicos, ciência legal e forense, onde pode ser crítico determinar o isolado particular de HIV que foi responsável pela geração de uma resposta imunitária incluindo uma reposta de anticorpos.

Numa outra concretização em diagnóstico, pode ser desejável identificar especificamente retrovírus imunologicamente distintos, por exemplo, isolados de HIV que pertencem a diferentes grupos biológicos. Os isolados de HIV imunologicamente distintos podem incluir por exemplo, LAI, MN, SF2, HXB2 ou um isolado primário de HIV-1. Nesta concretização em diagnóstico, uma partícula semelhante a retrovírus particular da presente invenção é útil para gerar anticorpos incluindo anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente estes isolados de HIV imunologicamente distintos.

Entenda-se que pode ser utilizada uma mistura de partículas semelhantes a retrovírus imunologicamente distintas quer como imunogénio, por exemplo, numa vacina, quer como agente de diagnóstico. Pode haver circunstâncias onde se utiliza uma mistura de partículas semelhantes a retrovírus para proporcionar protecção e/ou diagnóstico cruzados entre 22 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ isolados. Neste caso, a mistura de imunogénios é vulgarmente referida como uma preparação de "cocktail". A presente invenção, vantajosamente, proporciona partículas semelhantes a retrovírus compreendendo produtos dos genes gag, pol e env substancialmente nas suas conformações naturais. Estas partículas de retrovírus irão deste modo ser reconhecidas por anticorpos anti-HIV conformacionais (tais como anticorpos anti-env) que podem não reconhecer o antigénio de HIV numa forma desnaturada ou um péptido sintético correspondente a esse antigénio de HIV. As partículas semelhantes a retrovírus da invenção são portanto particularmente úteis como antigénios e como imunogénios na produção de anticorpos anti-retrovirais (incluindo anticorpos monoclonais) em concretizações de diagnóstico.

Em adição, a presença do marcador gera uma resposta imunitária específica cuja detecção pelos métodos descritos acima permite uma pronta distinção entre a imunização de um hospedeiro com as composições imunogénicas aqui proporcionadas e infecção material por um retrovírus virulento. A capacidade de efectuar este diagnóstico e esta diferenciação tem utilidade vantajosa nos campos da epidemiologia, ensaios clínicos, ciência forense e imunologia.

Outras Utilizações

As moléculas que se ligam às partículas semelhantes a retrovírus nas quais se baseia a invenção, particularmente anticorpos, moléculas relacionadas com anticorpos e seus análogos estruturais, têm também uma possível utilização como agentes no tratamento e diagnóstico da SIDA e condições relacionadas.

Variantes de anticorpos (incluindo variantes de local de ligação ao antigénio), tais como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos revestidos e anticorpos manipulados, que são específicos para as partículas semelhantes a retrovírus da invenção, estão incluídos no âmbito da invenção. 23 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

Os anticorpos e outras moléculas que se ligam às partículas semelhantes a retrovírus da presente invenção podem ser utilizados para fins terapêuticos (profilácticos e curativos) e de diagnóstico, de várias maneiras diferentes, incluindo as seguintes:

Para imunização passiva por administração adequada de anticorpos, possivelmente anticorpos humanizados, a pacientes infectados com HIV.

Para activar, complemento ou medear citotoxicidade celular dependente anticorpos (ADCC) utilizando anticorpos da subclasse ou isotipo adequados (possivelmente obtidos por manipulação apropriada do anticorpo) para conseguirem realizar a função desejada.

Para a entrega direccionada de toxinas ou outros agentes, por exemplo, utilizando imunotoxinas constituídas por conjugados de anticorpo e uma porção citotóxica, para ligação directa ou indirecta a proteínas de HIV expostas na superfície celular de células infectadas com HIV (por exemplo, gpl20).

Para a entrega direccionada de materiais altamente imunogénicos na superfície de células infectadas com HIV, conduzindo à possível ablação destas células quer pelo sistema imunitário humoral quer celular do hospedeiro.

Para a detecção de HIV, utilizando uma variedade de técnicas de imunoensaio.

Assim, ainda numa outra concretização em diagnóstico, as composições imunogénicas da presente invenção (individualmente, ou na forma de misturas incluindo preparações de cocktail) são úteis para a produção de anticorpos específicos para antigénios de HIV (incluindo anticorpos monoclonais) que podem ser utilizados para detectar HIV ou antigénios, ou neutralizar HIV em amostras incluindo amostras biológicas. 24 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

Numa concretização em diagnóstico alternativa, as partículas semelhantes a retrovirus da presente invenção podem ser utilizadas para estimular especificamente células T especificas de HIV em amostras biológicas de, por exemplo, indivíduos infectados com HIV, para diagnóstico ou terapia.

Depósitos Biológicos

Certos plasmídeos que codificam partículas semelhantes a retrovirus de acordo com aspectos da presente invenção, que são aqui descritos e referidos foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC) localizada em 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 20852, segundo os termos do Tratado de Budapeste e antes da apresentação do presente pedido de patente. As amostras dos plasmídeos depositados ficarão disponíveis ao público após a concessão de uma patente baseada neste pedido de patente dos Estados Unidos. A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada em âmbito pelos plasmídeos depositados, uma vez que a concretização depositada se destina apenas a ilustração da invenção. Quaisquer plasmídeos equivalentes ou similares que codifiquem partículas semelhantes a retrovirus similares ou equivalentes às descritas no presente pedido estão dentro do âmbito da invenção.

Sumário do Depósito

Plasmídeo Designação ATCC Data do Depósito pMTHIVBRU 75852 4 de Agosto, 1994 pMTHIVMNmHA2-5 75853 4 de Agosto, 1994 pHIV-T2 75851 4 de Agosto, 1994 A descrição anterior descreve genericamente a presente invenção. Pode-se ter um entendimento mais completo por referência aos Exemplos específicos que se seguem. Estes Exemplos são apresentados somente para fins de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da invenção. Embora tenham sido aqui empregues termos específicos, esses termos pretendem-se num sentido descritivo e não para fins de limitação. Os métodos imunológicos e de ADN recombinante podem 25 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ não estar explicitamente descritos no presente documento mas são bem do conhecimento dos peritos na especialidade.

EXEMPLOS

Os métodos de genética molecular, bioquímica das proteínas e imunologia utilizados mas não explicitamente descritos na presente descrição e nos EXEMPLOS estão amplamente relatados na literatura científica e fazem parte do conhecimento dos peritos na especialidade.

Exemplo 1:

Este Exemplo descreve a construção do plasmídeo pMTHIVBRU. 0 plasmídeo pMTHIVBRU foi construído como mostrado nas Figuras 1 e 2. Este plasmídeo é uma modificação do vector de expressão pMTHIVd25 descrito em Rovinski et al 1992 (as referências a literatura estão identificadas no final da presente descrição) e que contém uma deleção de encapsidação de ARN, e foi manipulado para conter uma série de mutações/deleções. Assim, uma mutação da caixa Cys-His incluía substituições de dois codões de cisteína (em SEQ ID NO:13) por dois codões de serina na primeira caixa Cys-His (SEQ ID NO:14) da proteína gag como mostrado na Figura 1. Isto foi realizado através de um método de mutagénese à base de PCR. Sintetizaram-se dois iniciadores: o iniciador a montante possuindo a sequência 5'-GGACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATG ACAAATAATCCACCTATCCCAGTAGGAG-3' (SEQ ID N0:15), compreendendo os nucleótidos 1507 a 1567 de HIV-1LAI, (toda a numeração de nucleótidos está de acordo com Wain-Hobson et al., 1985) com um local Spel na extremidade 5'; e o iniciador a jusante possuindo a sequência 5'CTCGGGCCCTGCAATTTCTGGCTATGTGCCCTTCTT TGCCACTATTGAAACTCTTAACAATC-3' (SEQ ID NO:16), que é o complemento inverso dos nucleótidos 2011 a 1953 com um local Apal na extremidade 5'. No iniciador a jusante, dois resíduos de adenosina que representam o complemento inverso dos nucleótidos 1963 e 1972 (Wain Hobson et al, 1985; Myers et al, 1990) foram alterados para timidina, resultando a substituição das duas cisteínas nas posições de aminoácido 392 e 395 do produto do gene gag por duas serinas (Figura 1) . Estes dois 26 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ iniciadores foram utilizados para amplificar o fragmento de ADN Spel-Apal (nucleótidos 1507 a 2006) de pMTHIV (Rovinski et al, 1992) que foi utilizado como molde. O fragmento Spel-Apal amplificado por PCR foi purificado por electroforese em gel de agarose e digerido com as enzimas de restrição Spel e Apal. Este fragmento foi utilizado para substituir o fragmento correspondente em pMTHIVd25 (Rovinski et al, 1992) . O plasmideo resultante foi denominado pMTHIV-A, que contém tanto a deleção da sequência de encapsidação de ARN como a mutação da caixa Cys-His.

De modo a eliminar a transcriptase inversa e a integrase, utilizaram-se dois locais de reconhecimento de Bali nos nucleótidos 2655 e 4587 de HIV-1LAi, (Figura 2) . O fragmento de 1,9 kpb entre os dois locais BA1I contêm sequências de ADN que codificam mais de 95% da transcriptase inversa e os primeiros 108 aminoácidos da integrase. O plasmideo pMTHIV-A foi digerido com Bali. Após a remoção do fragmento Bali de 1,9 kpb por electroforese em gel, a porção restante do plasmideo foi ligada a um oligonucleótido de cadeia dupla: 5'-GTATAAGTGAGTAGCGGCCGCAC-3' (apenas é mostrada uma cadeia - SEQ ID NO:17) que contém três codões de paragem nos três enquadramentos de leitura diferentes para impedir que o restante da sequência de integrase seja traduzido. O plasmideo resultante foi denominado pMTHIVBRU.

Exemplo 2:

Este Exemplo descreve a construção de plasmideos que codificam partículas semelhantes a HIV contendo âncoras de envelope antigenicamente marcadas. O plasmideo p83-19 foi construído a partir do vector de expressão pMTHIVBRU, como mostrado na Figura 3. Este plasmideo contém um gene de envelope híbrido que foi manipulado substituindo o ADN que codifica a maior parte de gpl20LAi, pelo ADN cognato que codifica gpl20MN- Isto foi conseguido substituindo um fragmento de ADN Kpnl/BglII (nucleótidos 6379 a 7668) de HIV-1LAi, pelo fragmento de ADN Kpnl /Bgll I (nucleótidos 6358 a 7641) de HIV-Imn. 27 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ Ο plasmídeo pMTHIVHA2-701 foi construído a partir de vectores de expressão pBTl (Alizon et al, 1984) e pMTHIVd25 (Rovinski et al, 1992), como mostrado nas Figuras 4 a 6. 0 vector pMTHIVHA2-701 contém uma sequência de 135 pb compreendendo um fragmento de ADN de codificação e um codão de paragem do gene de HA2 do vírus influenza humano (Min Jou et al, 1980), inserido entre os nucleótidos 7777(G) e 7778(A) do gene do envelope de HIV-1Lai (Wain-Hobson et al, 1985; Myers et al, 1990) . O codão de paragem foi inserido para impedir a síntese da glicoproteína transmembranar gp41 de HIV-1Lai· Um fragmento de ADN Sal I (nucleótido 5821)/BamHI (nucleótido 8522) de pBTl foi subclonado em pselect (Promega) para produzir pSeBS (Figura 4). Este último plasmídeo foi utilizado para a inserção dos 135 pb através de um procedimento denominado aqui 'mutagénese auxiliada por montagem de genes (GAAM)'. Um iniciador mutagénico, que foi desenhado para conter a sequência de 135 pb compreendendo um fragmento de ADN de codificação do gene de HA2 do vírus influenza humano (Min Jou et al, 1980), foi montado como se mostra na Figura 5. O oligonucleótido I é um 99mero contendo (de 3' para 5') 30 bases complementares aos nucleótidos 7748 a 7777 de HIV-1Lai (Wain-Hobson et al, 1985; Myers et al, 1990) e 69 bases que são complementares a sequências do gene de HA2 (Min Jou et al, 1980) que codificam os aminoácidos 180 a 202 da proteína HA2. O oligonucleótido II é um 96mero compreendendo (de 3' para 5') i) 60 bases complementares a sequências do gene de HA2 que codificam os aminoácidos 203 a 221 da proteína HA2 e contêm o codão de paragem de HA2 (Min Jou et al, 1980), ii) 6 bases (ATCATT - SEQ ID NO: 18) que definem mais dois codões de paragem, e iii) 30 bases complementares aos nucleótidos 7778 a 7807 de HIV-1LAI, (Wain-Hobson et al, 1985; Myers et al, 1990). O oligonucleótido III é um 30mero de ponte possuindo 15 nucleótidos complementares à extremidade 5' do oligonucleótido I e 15 nucleótidos complementares à extremidade 3' do oligonucleótido II. Dez picomoles dos oligonucleótidos I e II foram misturados com 20 picomoles do oligonucleótido III e fosforilados a 37°C durante 1,5 h em 20 μΐ de tampão de quinase (Tris 50 mM-HCl, pH 7,5, MgCl2 10 mM, KC1 10 mM, DTT 5 mM e ATP 0,5 mM) contendo 2 unidades de polinucleótido-quinase de T4. os oligonucleótidos foram hibridados por aquecimento da mistura a 95°C durante 5 min e subsequentemente arrefecimento lento até à temperatura 28 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ ambiente. A esta mistura adicionaram-se 3 μΐ de tampão de ligase lOx (Tris 0,5 M-HC1, pH 7,4, MgCl2 0-1 M, DTT 0,1 M, espermidina 10 mM e BSA a 1 mg/ml) , 3 jjI de ATP 10 mM e 5 unidades de ADN-ligase de T4, e a mistura de ligação foi incubada durante a noite a 16°C para completar a montagem do iniciador mutagénico (Figura 5). Este iniciador foi utilizado no procedimento de mutagénese sem mais purificação. A mutagénese foi realizada utilizando o sistema de mutagénese de locais alterados in vitro da Promega (Madison, WI) . O molde para a mutagénese consistia no plasmídeo pSeBS (Figura 4) que continha o fragmento de ADN SalI/BamHI de 2,7 kpb do gene de envelope de HIV-Ilai (nucleótidos 5821 a 8522) clonado no vector fagemidico pselect proporcionado no kit de mutagénese. Após o procedimento de mutagénese, identificaram-se os clones putativos por hibridação de colónias com uma sonda de oligonucleótido III marcada com 32P. Os clones positivos foram confirmados por sequenciação do ADN. Um destes clones, designado pSeBS-HA2, foi utilizado para a construção do vector final. Para isto, a inserção modificada SalI/BamHI de pSeBS-HA2 foi subclonada em pMTHIVd25-dSalI; este último é um plasmídeo derivado de pMTHIVd25 (Rovinski et al, 1992) por digestão parcial com Sall seguida por tratamento de Klenow para eliminar o local Sall no interior do esqueleto do plasmídeo. A construção de expressão final foi designada pMTHIVHA2-701.

Um vector de expressão, pMTHIVmHA2 (mostrado na Figura 7) contendo uma sequência de ADN heteróloga inserida entre os nucleótidos 7777 (G) e 7778 (A) do gene do envelope de HIV-1LAi (Rovinski et al, 1992; Wain-Hobson et al, 1985) foi manipulado como descrito atrás. Neste caso, uma sequência de 134 pb, compreendendo um fragmento de ADN de codificação do gene de HA2 do vírus influenza humano (Min Jou et al, 1990) e 68 nucleótidos que, quando fundidos às sequências de HA2, codificam uma sequência de aminoácidos sem homologia com proteínas de ocorrência natural conhecidas, foi inserida a jusante do nucleótido 7777 de HIV-1LAI (Figura 7) . A inserção resultou num desvio de enquadramento na tradução de sequências de codificação de HIV-1LAi, e a criação de um codão de paragem (TAG) para impedir a síntese da glicoproteína transmembranar 29 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ gp41 de HIV-1LAI. A construção de expressão final foi designada pMTHIVmHA2 (Figura 7). O plasmideo pMTHIVMNmHA2-5 foi construído a partir dos vectores de expressão p83-19 e pMTHIVmHA2 como mostrado na Figura 8. Este plasmideo foi desenhado para possuir todas as mutações de elementos necessários para a infecciosidade e/ou replicação de p83-19 e para conter a sequência da inserção de 134 pb de pMTHIVmHA2 (Figura 7) . Para este fim, o p83-19 foi digerido com BglII (nucleótido 7641) e Xhol (nucleótido 8944) para remover um fragmento de ADN de 127 6 pb que foi substituído pelo fragmento BglII/Xhol cognato de pMTHIVmHA2.

Exemplo 3:

Este Exemplo descreve a construção de plasmídeos que codificam partículas semelhantes a HIV contendo epítopos antigénicos de TMV.

Os plasmídeos pHIV-Tl, pHIV-T2, pHIV-T3 e pHIV-T4 representam versões modificadas da construção p83-19 na medida em que contêm, respectivamente, uma, duas, três ou quatro cópias de um oligonucleótido de cadeia dupla (Figuras 9, 10 e 11) compreendendo pelo menos um epítopo antigénico (Westhof et alr 1984; Trifilleff et al, 1991) da proteína de revestimento de TMV. A construção destes quatro vectores está ilustrada nas Figuras 9 e 10. Para manipular todas as construções, o plasmideo pMTHIV-A (Figura 1) foi primeiro digerido com SacII e Apal para isolar um fragmento de ADN de 1328 pb que foi depois subclonado em pBluescript (Stratagene). O plasmideo recombinante foi então digerido com PstI que cliva o ADN de HIV-1lai no nucleótido 1415 no interior do gene gag. Subsequentemente, uma, duas, três ou quatro cópias do oligonucleótido de cadeia dupla mostrado na Figura 9 (cadeia de codificação: SEQ ID NO:19, cadeia complementar: SEQ ID NO:20, aminoácidos codificados: SEQ ID NO:21) foram inseridas neste local de restrição. Finalmente, os plasmídeos recombinantes resultantes foram digeridos com SacII e Apal para libertar a inserção modificada que foi depois clonada na região cognata do plasmideo p83-19 (Figura 10). 30 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ A expressão de partículas semelhantes a retrovírus contendo ou o epítopo de mHA2 ou várias cópias do epítopo de TMV está representada na Figura 11. Células Vero foram crescidas até 80% da confluência e transfectadas com 20 pg de ADN plasmídico através do procedimento de transfinidade (BRL) com fosfato de cálcio. Analisaram-se os sobrenadantes das culturas quanto à expressão da proteína, 48 h após a transfecção. Os meios de cultura (10 ml) de células transfectadas com construções de expressão individuais foram recolhidos e clarificados por centrifugação a 2000 xg (sorvall RT 6000B; Dupont Company, Wilmington, Del.) durante 15 min a 4°C. As partículas semelhantes a retrovírus foram isoladas por ultracentrifugação. Suspenderam-se as partículas sedimentadas em 40 μΐ de TNE, misturaram-se com 10 μΐ de tampão de amostra de Laemmli 5x e mantiveram-se em ebulição durante 3 min. As proteínas virais foram então separadas por SDS-PAGE e foram transferidas para membranas Immobilon (Millipore, Bedford, Mass.). As membranas foram bloqueadas com tampão BLOTTO (PBS contendo 5% de leite magro seco instantâneo Carnation, 0,0001% p/vol de timerosal e 0,01% vol/vol de emulsão anti-espuma A) durante 2 h a 25 °C e depois incubaram-se com diluições apropriadas de anticorpos durante a noite a 4°C. Incubaram-se então os filtros com um anticorpo imunoglobulina G de cabra anti-ratinho conjugado com fosfatase alcalina (Promega, Madison, Wis.) e fizeram-se reagir com os substratos cromogénicos de fosfatase alcalina cloreto de tetrazólio nitroblue e sal 5-bromo-4-cloro-3-indolifosfato de p-toluidina (BRL). Utilizou-se um cocktail de anticorpos anti-gpl20, anti-gp41 e anti-p24 no Painel A. Utilizou-se uma mistura de anticorpos anti-gpl20 e anti-p24 no Painel B.

Os resultados mostrados na Figura 11 demonstram que as partículas semelhantes a HIV antigenicamente marcadas produzem gpl20, gp41 e p24 substancialmente nas suas conformações naturais.

Exemplo 4:

Este Exemplo descreve a imunogenicidade e a imunorreactividade de partículas semelhantes a HIV antigenicamente marcadas. 31 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

Um dos plasmídeos pHIV-Tl, pHIV-T2, pHIV-T3 ou pHIV-T4 (Figura 10) foi co-transfectado com o plasmídeo pSV2neo em células Vero, e estabeleceram-se linhas celulares estáveis que produzem partículas semelhantes a HIV. As partículas semelhantes a HIV foram purificadas, e a sua reactividade com soros imunes de porquinhos-da-india imunizados com um péptido correspondente ao marcador de TMV inserido no produto do gene gag foi determinada por análise Immunoblot. Para obter os soros imunes, os porquinhos-da-india foram imunizados com 100 yg de um péptido que consiste no marcador de TMV conjugado com KLH e adjuvado em adjuvante completo de Freund. Todos os animais receberam reforços três vezes com intervalos de 3 semanas com o mesmo péptido adjuvado em adjuvante incompleto de Freund. Recolheram-se os soros imunes duas semanas após os últimos reforços. Os resultados, apresentados na Figura 12, ilustram a reactividade dos soros imunes a várias formas do produto do gene gag presente nas várias partículas semelhantes a HIV e demonstram a antigenicidade do marcador de TMV no contexto de uma partícula semelhante a HIV-1 modificada.

Num estudo adicional, imunizaram-se porquinhos-da-índia com 10 yg de quantidades equivalentes a gag de p24 de partículas semelhantes a HIV contendo duas cópias da sequência marcadora de TMV (GAFDTRNRIIEVENGA, SEQ ID NO:21) e deram-se reforços com 5 yg das mesmas partículas semelhantes a HIV com intervalos de três semanas. As partículas semelhantes a HIV foram adjuvadas com adjuvante completo de Freund (e as doses de reforço foram adjuvadas com adjuvante incompleto de Freund) ou QS21. As amostras de soros foram recolhidas onze semanas após a primeira imunização e testadas quanto a reactividade por ELISA com péptidos correspondentes à sequência de aminoácidos contendo o epítopo neutralizante V3 de MN de HIV-1 (TRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC, SEQ ID NO:31), a sequência marcadora de TMV (AFDTRNRIIEVEN, SEQ ID NO:l) e a proteína p24 (gag) produzida a partir de uma fonte recombinante. Os resultados estão apresentados na Figura 14 e indicam que as partículas semelhantes a HIV contendo a sequência marcadora de TMV podem gerar uma resposta imunitária para produzir anticorpos que reconhecem especificamente p24 (gag), gpl20 (e especificamente o epítopo neutralizante V3) e a sequência marcadora de TMV. Os anti-soros de porquinho-da-índia foram testados quanto a neutralização do vírus 32 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ utilizando um ensaios de inibição da infecção virai como descrito por Skinner et al., 1988 . Os títulos de ponto final estão apresentados na Tabela 2 e indicam que os anticorpos produzidos por imunização com as partículas semelhantes a retrovírus que expressam a sequência marcadora de TMV são capazes de inibir a infecção celular pelo HIV. 0 plasmídeo pMTHIVMNmHA2-5 foi co-transfectado com o plasmídeo pSV2neo em células Vero e estabeleceu-se uma linha celular estável que produz partículas semelhantes a HIV. As partículas semelhantes a HIV foram então purificadas, e os porquinhos-da-índia foram imunizados com 10 pg de quantidades equivalente a gag de p24 de partículas semelhantes a HIV adjuvadas em adjuvante completo de Freund. Todos os animais receberam reforços três vezes com intervalos de 3 semanas com partículas semelhantes a HIV adjuvadas em adjuvante incompleto de Freund. Duas semanas após os últimos reforços, recolheram-se os soros imunes e ensaiaram-se por ELISA quanto a reactividades anti-V3 e anti-marcador mHA2. Os resultados, apresentados na Tabela 1 adiante, indicam que os porquinhos-da-índia imunizados com partículas semelhantes a HIV contendo o marcador mHA2 produziam anticorpos capazes de reconhecer péptidos que representam o marcador mHA2 (MHA-1) e domínios de neutralização da ansa V3 (CLTB56, CLTB71 e CLTB73).

Num outro estudo, imunizaram-se porquinhos-da-índia com 10pg de quantidades equivalentes a gag de p24 de partículas semelhantes a HIV contendo a sequência do marcador antigénico mHA2 e deram-se reforços três vezes com intervalos de três semanas com 5/jg das mesmas partículas semelhantes a HIV. As partículas semelhantes a HIV foram adjuvadas com adjuvante completo de Freund (e as doses de reforço foram adjuvadas com adjuvante incompleto de Freund), QS21 ou fosfato de alumínio (ALÚMEN). Recolheram-se amostras de soros dos animais onze semanas após a primeira imunização e testaram-se quanto a reactividade com péptidos correspondentes à sequência de aminoácidos contendo o epítopo neutralizante de V3 de HIV-1Mn (TRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC, SEQ ID NO:31), a sequência de mHA2 (GPAKKATLGATFAFDSKEEWCREKKEQWE, SEQ ID NO:22) e a proteína p24 (gag) produzida a partir de uma fonte recombinante. Os resultados estão apresentados na Figura 13 e indicam que as partículas semelhantes a HIV contendo a 33 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ sequência marcadora de mHA2 podem gerar anticorpos que reconhecem especificamente p24 (gag), gpl20 (e especificamente o epitopo neutralizante de V3) e a sequência marcadora de mHA2. Os anti-soros dos porquinhos-da-índia foram também testados quanto à sua capacidade para impedir a infecção por HIVmn como descrito por Skinner et al., 1988. Os títulos de ponto final estão apresentados na Tabela 2 e indicam que os anticorpos produzidos por imunização com as partículas semelhantes a retrovírus que expressam a sequência marcadora de mHA2 são capazes de inibir a infecção celular por HIV. Estes resultados, portanto, demonstram que o marcador mHA2 é imunogénico quando apresentado no contexto de uma partícula semelhante a HIV e que são também produzidos anticorpos contra os principais determinantes neutralizantes das ansas V3 de diferentes isolados de HIV.

Exemplo 5:

Este Exemplo descreve a produção de partículas semelhantes a HIV antigenicamente marcadas por mutações numa região imunodominante de gp41. 0 domínio transmembranar de gpl60 (gp41) contém uma região imunodominante contendo a sequência de aminoácidos LGIWGCSGKLIC (SEQ ID NO:28) e anticorpos que reconhecem esta sequência estão presentes em todos os indivíduos infectados com HIV-1. De facto, a detecção de anticorpos específicos para esta região imunodominante é utilizada para diagnóstico clínico de infecção por HIV-1. Estes anticorpos específicos para esta região imunodominante são utilizados para o diagnóstico clínico de infecção por HIV-1. Contudo, estes anticorpos geralmente não neutralizam o HIV-1. As partículas semelhantes a HIV antigenicamente distinguíveis do HIV-1 do tipo selvagem foram assim produzidas por mutagénese da região imunodominante. Os mutantes da região imunodominante que não são reconhecidos pelo soro de pacientes com infecção por HIV foram identificados através do reconhecimento de péptidos contendo a sequência mutante com estes soros como mostrado na Tabela 3. As mutações foram introduzidas por mutagénese específica do local utilizando um kit de um sistema de mutagénese in vitro Sculpture™ fabricado por Amersham Life

Science, Amersham International PLC. Um fragmento de ADN Sall 34 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

BamHI de ρ83-19 contendo a sequência de codificação do envelope foi subclonado em Ml3 e oligonucleótidos contendo ADN com as mutações especificas mostradas na Tabela 3 foram utilizados para produzir as mutações apropriadas na região imunodominante no interior de gp41 para produzir construções smIDR, clone 4 e clone 16. Cada uma das construções foi transfectada em células VERO para produzir partículas semelhantes a retrovírus por Immunoblotting. Estas partículas semelhantes a retrovírus foram analisadas quanto à expressão das glicoproteínas de envelope gpl20 e gpl60 e gp41. Todas estas glicoproteínas estavam presentes nas várias partículas semelhantes a retrovírus. Em particular, seleccionou-se o clone 4, possuindo as substituições de aminoácidos SGK -> AFR na região imunodominante de gp41.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

Em resumo desta descrição, a presente invenção proporciona certas partículas semelhantes a HIV não infecciosas, não replicantes, e moléculas de ácido nucleico que as codificam, por exemplo, na forma de preparações imunogénicas úteis para vacinação, a produção de anti-soros específicos de HIV e na formas de antigénios em métodos e kits de diagnóstico. As partículas semelhantes a HIV podem ter sido tornadas não infecciosas através de modificações nos produtos dos genes pol e/ou gag. Partículas semelhantes a HIV particulares contêm marcadores antigénicos não retrovirais. TABELA 1 A capacidade de partículas semelhantes a retrovírus contendo um marcador antigénico para gerar uma resposta imunitária específica a retrovírus e uma resposta imunitária específica a um marcador. PÉPTIDO SEQUÊNCIA ESPECI FICIDADE SEQ ID NO. TÍTULOS DE IgG EM ELISA1 GP542 GP543 GP544 MHA-1 GPAKKATLGATFAFDSKEEWCREKKEQWE Marcador mHA2 22 500 5000 2500 CLTB56 NKRKRIHIGPGRAFYTTKN V3(MN) 23 500 500 2500 CLTB71 NTRKSIYIGPGRAFHTTGR V3 (SF2) 24 500 2500 2500 CLTB73 NTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK V3(HXB2) 25 500 1000 2500 Irrelevante MKKTRFVLNSIALGLSVLSTSFVAQATLPSFVSEQNS não-HIV 26 100 100 100 1 Cada porquinho-da-india(GP542,GP543 e GP544) foi imunizado como descrito no Exemplo 4. 35 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ TABELA 2 PORQUINHO-DA-ÍNDIA MARCADOR POSITIVO ADJUVANTE TÍTULO ΑΝΤΙ-MN 776 mHA2 Alúmen - 777 mHA2 Alúmen 461 778 mHA2 Alúmen 279 779 mHA2 QS21 1395 780 mHA2 QS21 625 781 mHA2 QS21 625 1 TMV FIA 65 2 TMV FIA 50 3 TMV FIA 50 4 TMV QS21 50 5 TMV QS21 50 6 TMV QS21 286 TABELA 3

Construção Região imunodo- minante Sequência de aminoácidos Partículas semelhantes a virus Reconhecimento por soros de dadores HIV+ a gpl60 gpl20 p83-l9 Tipo selv. AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTA + + 60/60 smIDR Substituição conservativa AVERYLKDQQLLGIWGCTGRILCTTA + + 4/13 clone 4 Substituição AVERYLKDQQLLGIWGCAFRLICTTA + + 1/60 clone 16 - AVERYLKDQQLLGIWGCTLELICTTA + + 3/60 Notas: a 0 péptido LGIWGCSGKLIC (SEQ ID NO:27) ou suas versões modificadas que incorporam as alterações de aminoácidos apropriadas foram utilizados para pesquisar soros HIV-1+. Os resultados são expressos como o número de soros que reconhecem o péptido/número total de amostras pesquisadas.

REFERENCIAS 1. Rovinski, B., Haynes, J.R., Cao, S.X., James, 0., Sia, C., Zolla-Pazner, S., Matthews, T.J. e Klein, M. (1992) J. Virol., 66, 4003-4012. 2. Wain-Hobson, S., Sonigo, P., Danos, O., Col, S. e Alizon, M. (1985) Cell, 40, 9-17. 3. Myers, G., Berzofsky, J.A., Rabson, A.B., Smith, T.F. e Wong-Staal, F. (ed.) (1990) Human retroviruses and AIDS. 36 ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ

Theoretical Biology and Biophysics, Group T-10. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.Mex. 4. Alizon, M., Sonigo, P., Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Tiollais, P., Montagnier, L. e Wain-Hobson, S. (1984) Nature, 312, 757-780. 5. Min Jou, W., Verhoeyen, M., Devos, R., Saman, . E., Fang, R., Huylebroeck, D. e Fiers, W. (1980) Cell, 19, 683-696. 6. Westhof, E., Altschuh, D., Moras, D., Bloomer, A.C., Mondragon, A., Klug, A. e Van Regenmortel, M.H. (1984) Nature, 311, 123-126. 7. Trifilleff, E., Dubs, M.C. e Regenmertel, M.H.V. (1991) Mol. Immunol., 28, 889-896. 8. Ullmer, Current Opinion, Invest. Drugs, 1993, 2: 983- 989. 9. Skinner, M.A., A.J. Langlois, C.B. McDanal, J.S. McDougal, D.P. Bolognesi e T. J. Matthews, 1988, J. Virol. 62: 4195-4200 .

Lisboa

Claims

ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Partícula semelhante ao vírus da imunodeficiência humana (HIV), não infecciosa, compreendendo uma montagem de: (a) um produto do gene env de HIV; (b) um produto do gene pol de HIV; e (c) um produto do gene gag de HIV; e caracterizada por: (d) pelo menos um marcador antigénico que é retroviral mas não de HIV e é capaz de produzir uma resposta imunitária.
2. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 1, em que o referido pelo menos um marcador antigénico não é retroviral.
3. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um marcador antigénico está contido no interior do produto do gene gag para formar um produto de gene gag híbrido possuindo as características de formação de partículas do produto do gene gag não modificado.
4. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 3, em que o referido pelo menos um marcador antigénico é inserido no produto do gene gag num local de inserção antigenicamente activo.
5. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 4, em que o referido local de inserção está localizado entre os resíduos de aminoácido 210 e 211 do produto do gene gag do isolado LAI de HIV-1 ou na localização correspondente de outros produtos de genes gag retrovirais.
6. Partícula semelhante a vírus da imunodeficiência humana (HIV), não infecciosa, caracterizada por uma montagem de: (a) um produto do gene env de HIV modificado em que a função de ancoragem endógena foi substituída por uma sequência de âncora antigénica diferente, operativamente ligada ao produto do gene env para ancorar o referido produto do gene env à partícula semelhante a HIV; (b) um produto do gene pol de HIV; e ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ 2/5 (c) um produto do gene gag de HIV.
7. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 6, em que a sequência de âncora compreende pelo menos uma porção de uma componente transmembranar de uma proteína que atravessa a membrana.
8. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 7, em que a proteína que atravessa a membrana é uma glicoproteína.
9. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 6, em que a referida sequência de âncora é inserida no produto do gene env adjacente e a montante de locais de clivagem funcionais do produto do gene env.
10. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 9, em que a referida sequência de âncora é inserida entre os resíduos de aminoácido 507 e 508 do produto do gene env do isolado LAI de HIV-1 ou na localização correspondente de outros produtos de genes env de HIV.
11. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 10, em que o HIV é seleccionado do grupo que consiste em HIV-1 e HIV-2.
12. Partícula semelhante a HIV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que foi feita pelo menos uma modificação no produto do gene pol, para substancialmente eliminar a actividade de transcriptase inversa e a actividade de integrase do produto do gene pol.
13. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 12, em que a eliminação substancial de actividade de transcriptase inversa do produto do gene pol é efectuada através da deleção de pelo menos uma sua porção que contribui para a actividade de transcriptase inversa.
14. Partícula semelhante a HIV de acordo com a reivindicação 12, em que a eliminação substancial de actividade de integrase do produto do gene pol é efectuada por ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ 3/5 deleção de pelo menos uma sua porção que contribui para a actividade de integrase.
15. Molécula de ácido nucleico que codifica uma partícula semelhante a vírus da imunodeficiência humana (HIV), não infecciosa, caracterizada por: um genoma de HIV modificado deficiente em repetições terminais longas e contendo os genes gag, pol e env de HIV no seu arranjo genómico natural e um segmento que codifica pelo menos um marcador antigénico que é retroviral mas não de HIV e é capaz de produzir uma resposta imunitária.
16. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 15, em que o referido pelo menos um marcador antigénico não é retroviral.
17. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 15, em que o segmento que codifica o pelo menos um marcador antigénico está contido no interior do gene gag para proporcionar um gene gag modificado que codifica um produto do gene gag híbrido possuindo as características de formação de partículas de um produto do gene gag não modificado.
18. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17, em que o segmento que codifica o pelo menos um marcador antigénico está inserido no gene gag para proporcionar o marcador antigénico num local de inserção antigenicamente activo no produto do gene gag híbrido.
19. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18, em que o segmento que codifica o pelo menos um marcador antigénico está inserido num local de inserção, localizado no local PstI no nucleótido 1415 do gene gag do isolado LAI de HIV-1 ou na localização correspondente de outros genes gag de HIV.
20. Molécula de ácido nucleico que codifica uma partícula semelhante a vírus da imunodeficiência humana (HIV), não infecciosa, caracterizada por: um genoma de HIV modificado deficiente em repetições terminais longas e contendo os genes gag, pol e env de HIV, modificado ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ 4/5 para proporcionar um segmento que codifica uma sequência de âncora antigénica para ancorar o produto do gene env à partícula semelhante a HIV, pelo que o gene env modificado codifica um produto do gene env modificado em que a função de ancoragem endógena de env foi substituída pela sequência de âncora antigénica.
21. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, em que o segmento que codifica a sequência de âncora codifica pelo menos uma porção de uma componente transmembranar de uma proteína que atravessa a membrana.
22. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína que atravessa a membrana é uma glicoproteína.
23. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, em que o segmento que codifica a sequência de âncora está localizado no gene env adjacente e a montante de nucleótidos que codificam locais de clivagem funcionais do produto do gene env.
24. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 23, em que o referido segmento que codifica a sequência de âncora está localizada entre os nucleótidos 7777 e 7778 do gene env do isolado LAI de HIV-1 ou na localização correspondente de outros genes env de HIV.
25. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 24, em que o referido genoma de HIV modificado é deficiente num local de ligação a iniciadores.
26. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, em que o HIV é seleccionado do grupo que consiste em HIV-1 e HIV-2.
27. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 26, em que pelo menos um codão no gene pol foi mutado para substancialmente eliminar a actividade de transcriptase inversa e a actividade de integrase do produto do gene pol. ΕΡ Ο 778 888 /ΡΤ 5/5
28. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27, em que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma molécula de ADN contendo os elementos genéticos caracteristicos presentes num fragmento de Saci (678) a Xhol (8944) do genoma do isolado LAI de HIV-1.
29. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 28 sem um local de ligação a iniciadores e/ou um sinal de encapsidação de ARN.
30. Composição imunogénica capaz de eliciar uma resposta imunitária especifica ao vírus da imunodeficiência humana (HIV) e uma resposta imunitária específica contra um marcador não retroviral, compreendendo a partícula semelhante a HIV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 29 e um seu transportador.
31. Método de identificação de um anti-soro gerado por imunização com a composição imunogénica de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por: detecção de anticorpos específicos para o referido marcador antigénico no referido anti-soro. Lisboa,