JPH08500005A

JPH08500005A - 非感染性ｈｉｖ粒子およびその用途

Info

Publication number: JPH08500005A
Application number: JP5517453A
Authority: JP
Inventors: アルドヴィーニ，アンナ; エイ．ヤング，リチャード; マークビー．フェインバーグ，; ディディアートローノ，; デイビッドバルチモアー，
Original assignee: ホワイトヘッドインスティチュートフォーバイオメディカルリサーチ
Priority date: 1992-03-27
Filing date: 1993-03-10
Publication date: 1996-01-09
Also published as: WO1993020220A1; EP0633942A1; CA2117884A1; AU3799493A; AU678152B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ゲノムＲＮＡパッケージングに不可欠なヌクレオチド配列中に変更を有する変異体ＨＩＶゲノムを含んでなる構築物および哺乳細胞中でのこれらの構築物の発現により産生される非感染性でかつ免疫原性を有するＨＩＶ粒子に関する。非感染性でかつ免疫原性を有するＨＩＶ粒子を安定に産生する細胞系も含まれる。さらに、予防的、治療的に用いられるワクチン、診断試薬、および関連する諸方法についても記述される。

Description

【発明の詳細な説明】非感染性ＨＩＶ粒子およびその用途発明の背景ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、Ｔリンパ球の選択的感染と細胞死に起因する免疫抑制を特徴とする後天性免疫不全症候群（エイズ）の原因物質である［サリン（Sarin, P.）、Ann. Rev. Pharmacol. 28:411-428（1988）］。本疾患の臨床徴候として重症の免疫不全があるが、これは悪性腫瘍と日和見感染を伴うのが普通である。世界保健機関の最新の推計によると、全世界で人口２５０人あたり１人がＨＩＶに感染しているという。このウイルスの破壊的な作用および、ＨＩＶ感染者の死亡率の高さの故に、ＨＩＶ感染の防止（予防法）およびすでに感染している者の治療（治療法）の方法の開発を目指して多くの努力と時間と費用が費やされてきたが、今日までの進歩は限られたものでしかない。サルエイズモデル系の試験で、ＨＩＶワクチンの有効性の可能性が示唆されている。サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のホール（whole）の不活化粒子からなるワクチンは生存ウイルスまたは細胞関連ウイルスによるチャレンジに対して少なくとも部分的な保護をもたらすことがわかった［ラングロイスら（Langlois, A.J., et al.）、Science 255:292-293 (1992)；レグランドら（Le Grand, R., et al.）、Nature 355:684 (1992)；オステルハウスとブリース（Osterhaus,A ., and P. De Vries）、同上、pp. 684-685 ：クラナゲら（Cranage, M.P., et al.）、同上、pp. 685-686 ］。「ホールの不活化ＳＩＶ調製物はこれまでに実験動物試験で経験されているものとしては最も強力でかつ最も安定的な保護を誘導する」ことがわかっている［ラングロイス（Langlois）、1992、前掲］。ところが、安全性と免疫原性の兼合が、ホールの不活化ＨＩＶワクチンを得る上で大きな問題を引き起こしている。現在ヒトの免疫療法に使用されている死滅ＨＩＶは２つの別々の不活化プロトコルによって調製しなければならないが、それぞれのプロトコルはそれ自体でウイルスを完全に不活化できるものでなければならない。現在使われている物理的および化学的不活化処理法は、ウイルス粒子の部分的破壊によりワクチンの免疫原性が一部失われてしまう。ウイルス粒子構造をそのまま保存し、しかも粒子を完全に非感染性とする方法が開発されれば、ワクチン開発の大きな進歩となろう。ＨＩＶ感染に対抗する治療法開発の別のアプローチとして、ワクチン以外にも、Ｔ細胞の様々なＨＩＶ感染段階と感染細胞中のＨＩＶのライフサイクルを阻害する薬剤が示唆されている。ウイルス侵入、ＲＮＡゲノムの逆転写、及びウイルス遺伝子産物の発現に関して多くの情報が入手可能である。一方、ウイルスゲノムのパッケージング、ウイルス粒子の集合、及び感染細胞からの成熟ウイルス粒子の発芽については殆ど知られていない。ＨＩＶ研究と薬剤開発における障壁の一つは、生存ＨＩＶで汚染された試薬や生存ＨＩＶから作成された試薬を扱う研究者が感染の危険にさらされることである。従って、全く感染性がないＨＩＶ試薬を製造する手段があれば、研究者の危険防止に係る費用が削減され、薬剤開発とＨＩＶ研究に必要な装置や施設も削減できるであろう。発明の概要本発明は、ＨＩＶのＲＮＡゲノムをパッケージングするのに不可欠のヌクレオチド配列の変更を有し、哺乳類細胞中で発現されると非感染性の免疫原性ウイルス粒子を作り出す変異ＨＩＶゲノムからなるＨＩＶ変異構築物に関する。ＨＩＶ −１およびＨＩＶ−２ゲノムを基本要素とするＨＩＶ変異構築物も本発明に含まれる。本発明はさらに、上記ＨＩＶ変異構築物で安定にトランスフェクトされ、非感染性で免疫原性あるＨＩＶ粒子を安定的に作り出す、細胞系に関する。本発明には、タンパク質含有率と形態が感染性ＨＩＶ粒子と同様であって、免疫原性はあるが感染性がまったくないＨＩＶ粒子の製造方法も含まれる。これらの非感染性変異ＨＩＶ粒子はウイルスゲノムが不完全であることが示されている。本明細書で説明するこれらの変異ＨＩＶ粒子の製造は、免疫原性はあるが非感染性のウイルス粒子を基本要素とするワクチンおよび診断試薬を得る手段を提供する。非感染性のウイルス粒子の製造は、ホールのウイルスワクチンを製造する別の有利なウイルス不活化法（遺伝子不活化という）も提供する。上記ワクチンを用いて、ＨＩＶ感染の前または後で個体に抗ＨＩＶ反応を誘導し、該個体のウイルス抵抗性を強化することができる。非感染性ＨＩＶ変異粒子を含有するワクチンおよび試薬、ならびにＨＩＶの予防法および治療法も本発明に含まれる。さらに詳しくは、本発明は、Ｇａｇ前駆体のカルボキシル末端領域におけるΨ 部位というｃｉｓ作用ＲＮＡパッケージング部位のヌクレオチドの変更、およびＣｙｓＨｉｓボックスまたは亜鉛ナックル(zinc-knuckle)というシステイン含有量の多いモチーフのアミノ酸の変更、の結果起きるＲＮＡパッケージング欠損ＨＩＶ変異体に関する。さらに改良した非感染性ＨＩＶ粒子製造のためのＨＩＶ変異構築物について説明する。多重欠損ＨＩＶ変異体は、感染性の復帰の確率性が非常に低い非感染性ＨＩＶ粒子を作り出すと期待される。これらのものとしては、ＲＮＡパッケージング機能の両方に、すなわちｇｐ１６０エンベロープ前駆体タンパク質の切断部位とプライマー結合部位とに多重欠損を有するＨＩＶ変異体などが挙げられる。また、有利な抗原性を有する非感染ＨＩＶ粒子を製造することができる。ｇｐ１６０前駆体の切断を欠損するＨＩＶ変異体は、ＨＩＶ粒子表面上のｇｐ１２０抗原の保持量が増大していると予想される。異なるＨＩＶ株または単離株から得られた変異エンベロープ遺伝子を含有する変異体構築物を利用して、特定の目的に合わせたワクチンや診断試薬を得ることができる。変異体エンベロープ遺伝子を変異誘発法で操作して、ワクチンや診断試薬の抗原性を向上させることができる。図面の簡単な説明図１は、ＨＩＶ−１変異のダイアグラムである。ＡはＨＩＶ−１のΨ部位に影響する欠失の位置とサイズを示し（配列番号１）、Ｂは様々な点変異によってできるＨＩＶ−１のＧａｇのＣｙｓＨｉｓボックスのアミノ酸変化を示す（配列番号２−４）。図２Ａと２Ｂは、ＨＩＶ−１のヌクレオチド配列の一部（ヌクレオチド１３５１−１９８０；配列番号５）およびその部分配列から推定したアミノ酸配列（配列番号６）である。下向き矢印とボックスは、本明細書で説明するＨＩＶ−１のｇａｇの変異位置を示す。ヌクレオチドの位置は既報どおりである［ラトナーら（Ratner, L., et a l.）、Nature 313:277-284（1985）］。図３は、ＨＩＶ−１のｇａｇコード領域のダイアグラムであり、ヌクレオチド数も示している。開始コドン、ｐ１７とｐ２４とｐ１５の間の切断部位、およびｇａｇ終止コドンを示している。野生型とｂＣＡ２０（配列番号７）のヌクレオチドの違いを示している。上記２つのＨＩＶ−１ＣｙｓＨｉＳボックスのアミノ酸配列、およびｂＣＡ２０変異（配列番号８）を導入した介入配列のアミノ酸配列を以下に示す。図４は、ＨＩＶ−１変異体粒子中のＨＩＶタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す。図５は、ＨＩＶ−１変異体粒子中のＨＩＶのＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。図６は、ＨＩＶ−１変異体構築物のダイアグラムであり、（Ａ）はｐΔＰＡＣ１、（Ｂ）はｐΔＰＡＣ−Ｈｙｇｒｏである。図７は、ＨＩＶ−１変異体構築物ｐΔＰＡＣ２のダイアグラムである。図８は、ＨＩＶ−１変異体構築物ｐΔＰＡＣ３のダイアグラムである。図９は、ｐＲ７ｎｅｏのダイアグラムである。図１０は、ＨＴ４（Δ−ｄｈｆｒ）細胞の細胞質抽出物の免疫ブロット分析の結果を示す。図１１は、ＨＴ４（ΔＥ−ｄｈｆｒ）細胞の上清中のウイルスＲＮＡのノーザンスロットブロット分析の結果を示す。図１２は、ＨＴ４（Ｒ７−ｄｈｆｒ）、ＨＴ４（ＷＴ−ΔＥ−ｄｈｆｒ）、およびＨＴ４（ｂＣＡ２０−Δｄｈｆｒ）の電子顕微鏡観察の結果を示す。パネルＡはＨＴ４（Ｒ７−ｄｈｆｒ）、パネルＢはＨＴ４（ＷＴ−ΔＥ−ｄｈｆｒ）、パネルＣはＨＴ４（ｂＣＡ２０−ΔＥ−ｄｈｆｒ）である。パネルＡ、Ｂ、Ｃについては倍率３８，５００倍で、パネルＤの陰性対照については４，５００倍で写真を撮った。生物寄託本出願を裏付けるために、American Type Culture Collection, Rockville, M D に下記の寄託を行なっている（１９８９年１０月１３日および１９８９年１０月１６日）。すなわち、ｐＡ１４−１５ＨＸＢと命名されたＨＩＶ−１のＧａｇのＣｙｓＨｉｓボックス変異体（ＡＴＣＣ登録番号６８１２３）、プラスミドｂＣＡ２０−ｄｈｆｒと命名されたＨＩＶ −１のＧａｇ挿入断片変異体（ＡＴＣＣ登録番号４０６８２）、ｐＡ３ＨＸＢと命名されたＨＩＶ−１Ψ部位変異体（ＡＴＣＣ登録番号６８１２２）である。これらの寄託は、ブダペスト条約の条項に基づいてなされたものであり、米国特許が付与された時点でその入手に係るすべての制限は変更不能の形で撤廃されるものとする。発明の詳細な説明本発明は、ＨＩＶ中のＲＮＡパッケージング欠損が、野生型ＨＩＶ粒子と形態およびタンパク質含有率が似ていて、免疫原性はあるが完全に非感染性である変異体ウイルス粒子の生成をもたらしうることをことをはじめて明らかにした、本明細書で説明する研究に基づいてなされたものである。本明細書で説明するように、変異体ウイルス粒子は、組換えＤＮＡ技術を用いて変異体ＨＩＶゲノムを含有するプラスミドを構築し、得られたＨＩＶ変異体構築物を哺乳類細胞中で発現させることによって製造する。変異体ウイルス粒子は、製造され、培地中に細胞から放出されるので、これを採取することができる。ＨＩＶ変異体構築物を用いて、非感染性ＨＩＶ粒子を安定的に作り出す細胞系を製造することもできる。上記非感染性ＨＩＶ粒子を製造する方法について本明細書中で説明する。該方法は、ＨＩＶ感染の予防および治療のための改良不活化ワクチンならびにＨＩＶ診断試薬を得るための改良された方法を提供する。非感染性ＨＩＶ粒子、ＨＩＶ変異体構築物、および該粒子を作り出す細胞系、ならびに関連材料を製造する方法、ならびに商業的および医学的用途について以下に説明する。ＨＩＶ−１のＲＮＡパッケージング：Ψ部位変異体パッケージングステップの中心事象は、ヌクレオカプシドタンパク質とゲノムウイルスＲＮＡとを相互作用させてウイルスのコアを作成することである。本ステップは、ウイルスタンパク質の転写と翻訳の後、相互作用するウイルスタンパク質の全体が成熟粒子として細胞膜を貫通して放出される前に起きる。パッケージングステップは非常に特異的かつ効率の良いプロセスであり、その過程で、ウイルスタンパク質はゲノムＲＮＡと感染細胞中に存在する多くのスプライス済みウイルスＲＮＡや細胞ＲＮＡとを区別する。たとえば、スプライス済みｍＲＮＡを含有する粒子は欠陥をもつことになる。レトロウイルスは全長ゲノムＲＮＡを選択的にパッケージングするので、このＲＮＡにだけに存在してスプライス済みウイルスＲＮＡや細胞ＲＮＡには存在しない配列が、上記特異的なＲＮＡ−タンパク質相互作用に関与して感染性粒子の生成につながるに違いない。特定のパッケージングに必要なウイルスゲノム配列が数種のトリおよびネズミレトロウイルスにおいてマッピングされている。これらのｃｉｓ作用配列はΨ部位と呼び、ウイルスゲノムの５’末端付近の領域に位置することがわかっている。様々なレトロウイルス中のΨ部位の正確な境界は知られていないが、最初のスプライスドナー(splice donor)部位とＧａｇ翻訳開始部位の間の配列が野生型ＲＮＡパッケージングに不可欠であることが示されている［シャンクとリニアル（Shank, P.R. and M. Linial）、J. Viro l. 36 :450-456（1980）；マンとバルチモア（Mann, R. and D. Baltimore）、J . Virol . 54:401-407（1985）；リニアルら（Linial, M.et al.）、Cell 15:13 71-1381（1978）；コヤマ、ハラダ、カワイ（Koyamat, Harada F. and S. Kawai ）、J. Virol. 51:154-162（1984）；ワタナベとテミン（Watanabe, S. and H. M. Temin）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5980-5990（1982）；マンとバルチモア（Mann, R. and D. Baltimore）、J. Virol. 54:401-407（1985）］。ネズミ白血病の確定Ψ部位、脾臓壊死ウイルス、トリ肉腫ウイルスをガイドとして、最初のドナースプライス部位とＧａｇ開始コドンの間のこの部位がＨＩＶのパッケージングシグナルとして作用するかどうかを調べるために、ＨＩＶ−１ゲノム中の相同配列中に欠失変異体を構築した。ヌクレオチド２９３−３３１の３９ｂｐ欠失を有するｐＡ３ＨＸＢ（両端含む）とヌクレオチド２９３−３１３の２１ｂｐ欠失を有するｐＡ４ＨＸＢ（図２Ａ）という２つのΨ部位変異体構築物を構築した。そして、その発現により非感染性ＨＩＶ粒子が生成した。ｐＡ３ＨＸＢとｐＡ４ＨＸＢの構築については実施例２で説明する。ＨＩＶ−１のＲＮＡパッケージング：Ｇａｇ変異体トリとネズミのレトロウイルスの研究で、Ｇａｇ前駆体のカルボキシル末端はウイルスゲノムＲＮＡと相互作用を示しうることを示す証拠がある。とくに、本明細書でＣｙｓＨｉｓボックスと呼ぶシステインの豊富なモチーフは、ラウス肉腫ウイルスおよびモロニー白血病ウイルスにおけるＲＮＡパッケージングに不可欠であることが示されている［カーペルら（Karpel, R.L., et al.）、J. Biol. Chem. 262:4961-4967 (1987)；メリックとスパール（Meri c, C. and P.F. Spahr）、J. Virol. 60:450-459 (1986)；メリックら（Meric, C., et al.）、J. Virol. 62:3328-3333（1988）；メリックとゴッフ（Meric, C. and S.P. Goff）、J. Virol. 63:1558-1568（1989）；プラッツら（Prats, A.C., et al. ）、J. EMBO 7:1777-1783（1988）；ゴレリックら（Gorelick,R. J., et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8420-8424（1988）］。ＣｙｓＨｉｓボックスはすべてのレトロウイルスＧａｇ前駆体のカルボキシル末端に存在し、ＣｙｓＸ₂ＣｙｓＸ₃ＧｌｙＨｉｓＸ₄Ｃｙｓのコンセンサス配列を有する［ベルグ（Berg,J.）、Science 232:485-487（1986）］。このモチーフはネズミレトロウイルスでは１回、これまで研究されたその他のほとんどのレトロウイルスでは２回現われる。システインの豊富なモチーフが、様々な真核生物転写因子中に存在する「亜鉛フィンガー」モチーフとの類似性により核酸結合に関係している［エバンスとホレンベール（Evans, R.M. and S.M. Hollenberg）、Cell 52 :l-3（1988）；ベルグ（Berg）、1986、前掲］。レトロウイルスのヌクレオカプシドタンパク質中では、これらの配列もタンパク質同士の相互作用に何らかの役目を果たしているかも知れない。ＨＩＶの感染サイクルでは、ｇａｇ遺伝子がタンパク質前駆体Ｐｒ５５^gagとして発現され、このものがプロセシングと切断を受けて成熟ウイルスタンパク質ｐ１７、ｐ２４、ｐ１５になる。ｐ１５はさらに切断されてｐ９とｐ７になると考えられる［メルビスら（Mervis, R.J., et al.）、J. Virol. 62:3993-4002（ 1988）；ベロネーゼら（Veronese, F.D.M., et al.）、J. Virol. 62:795-801（ 1988）］。ｐ１５は極めて基本的な性質を有するが、このことはそれとウイルスＲＮＡとの関係を示唆するものである［ゲルダーブロムら（Gelderblom, H.R., et al.）、Virology 156:171-176（1987）］。ＨＩＶのｐ１５は長さがアミノ酸１２３個分あり、ｇａｇ遺伝子の３’末端によってコードされる（図２）。このものは他のレトロウイルスヌクレオカプシドタンパク質と非常に類似点が多い。これらの類似点としては、ｐ９領域において７つのアミノ酸によって分離されたＣｙｓＨｉｓボックスの２つのタンデムコピーがある（図１Ｂと図３参照）［コベイ（Covey, S.N. ）、Nucleic Acids Res. 14:623-633（1986）］。ＨＩＶゲノムのパッケージングにおいてＣｙｓＨｉｓボックス領域が果たす役割を調べるために、５つのＨＩＶ−１変異体を構築した（図１Ｂ、図３）。変異体構築物ｐＡ１４ＨＸＢとｐＡ１５ＨＸＢはそれぞれが単一のＣｙｓＨｉｓボックスの変更をコードする。すなわち、ｐＡ１４ＨＸＢは５’ＣｙｓＨｉｓボックス中のＣｙｓ₁およびＣｙｓ₃のチロシンへの置換をコードし（配列番号２）、ｐＡ１５ＨＸＢは３’ＣｙｓＨｉｓボックス中の対応する置換をコードする（配列番号３）。変異体構築物ｐＡ１４−１５ＨＸＢは両方のＣｙｓＨｉｓボックス中のＣｙｓ₁およびＣｙｓ₃のチロシンへの置換をコードする（配列番号４）。ｐΔＣＨ１−２ＨＸＢは両方のＣｙｓＨｉｓボックスの３５個のアミノ酸欠失とそれらの介入配列を有する変異体Ｇａｇタンパク質をコードする。変異体構築物ｂＣＡ２０（図３）は、５’ＣｙｓＨｉｓボックスのＣｙｓ₁₄ の直後の介入ペプチド配列へのＳｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ付加をコードする（配列番号８）ので、上記２つのＣｙｓＨｉｓボックスの間の距離が変化する。変異体構築物ｐＡ１４ＨＸＢ、ｐＡ１５ＨＸＢ、ｐＡ１４−１５ＨＸＢ、ｐ ΔＣＨ１−２ＨＸＢ、およびｂＣＡ２０はそれぞれ非感染性ＨＩＶ粒子を作り出すことがわかった。ｇａｇ変異体の構築については実施例で説明する。ＨＩＶ−１変異体粒子の製造ＲＮＡパッケージング変異の影響を見るため、ＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎臓）細胞を上記ＨＩＶ変異体構築物でトランスフェクトし、一時的に発現させた。この構築物は、ＳＶ４０の複製起点を有するベクターに保持させた変異ＨＩＶゲノムを有する。ＳＶ４０大型Ｔ抗原を発現するＣＯＳ細胞中で、これらのベクターは高いコピ一数で複製される。ＨＩＶはＣＤ４受容体を欠いているので通常はＣＯＳ細胞に感染しないが、ＨＩＶゲノムをこれらの細胞にトランスフェクトするとウイルスが高効率でできる。これらの細胞中のウイルス遺伝子産物の発現をモニターすることができ、上清中に放出されたウイルス粒子を採取して特性を調べることができる。ＨＩＶ構築物の発現によってできたウイルス粒子(virion)を本明細書では構築物と呼ぶが、ｐは頭に付けない。たとえば、Ａ３ＨＸＢ変異体ウイルス粒子はｐＡ３ＨＸＢ変異体構築物から製造される。トランスフェクトされた細胞中のウイルス遺伝子の発現は、ノーザンブロット分析およびウイルスタンパク質の代謝標識化と免疫沈降によってモニターした。ノーザンブロット分析で、変異体ＨＩＶ構築物ｐＡ３ＨＸＢ、ｐＡ４ＨＸＢ、ｐＡ１４ＨＸＢ、ｐＡ１５ＨＸＢおよびｐＡ１４−１５ＨＸＢでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に由来するウイルスＲＮＡのパターンは、野生型ＨＩＶ構築物ｐＨＸＢ２ｇｐｔでトランスフェクトされた細胞に由来するＲＮＡと同一であった。いずれの場合も、ＨＩＶ−１のＲＮＡの３つのクラスすべて、すなわち９．２ｋｂのゲノムＲＮＡ、ｅｎｖ遺伝子とｖｉｆ遺伝子をコードする４．３ｋｂのスプライス済みのｍＲＮＡ、および約２ｋｂの位置にあってｔａｔ−ＩＩＩとｒｅｖとｎｅｆのｍＲＮＡを含むヘテロなＲＮＡ、が存在した。したがって、これらのＨＩＶ−１変異はウイルスＲＮＡの発現に影響を及ぼさないようである。トランスフェクトされた上記ＣＯＳ細胞中で発現されたウイルスタンパク質の免疫沈降で、ＨＩＶ−１の主要構造タンパク質はすべて、野生型（ｐＨＸＢ２ｇｐｔ）または変異型（ｐＡ３ＨＸＢ、ｐＡ４ＨＸＢ、ｐＡ１４ＨＸＢ、ｐＡ１５ＨＸＢ、およびｐＡ１４−１５ＨＸＢ）のＨＩＶ−１構築物のいずれかでトランスフェクトされた細胞中に存在することが判明した。ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ２４、ｐ１７、およびｐ１５がトランスフェクトされた細胞すべてに存在することは、ＨＩＶ−１変異体がＧａｇおよびエンベロープ前駆体の合成とプロセシングに大きな変化を引き起こさないことを示している。生じたＨＩＶウイルス粒子の量を２つのアッセイで測定した。一つはウイルス関連ｐ２４カプシドタンパク質のレベルを測定することができるＥＬＩＳＡであり、もう一つはウイルス粒子と関連する逆転写酵素活性量を測定する酵素アッセイであった。ＣＯＳ細胞をＨＩＶ変異体構築物でトランスフェクトしたした後、ウイルス粒子をペレット化し、上記のようにして分析した。ｐ２４のＥＬＩＳＡと逆転写酵素アッセイの結果を表１に示す（詳細な説明の項の末尾）。プラスミドｐＨＸＢ２ＢＡＭｐ３を陰性対照としたが、このものは転写後欠損があるためウイルスを生じない。これらの結果から、野生型と変異体粒子の間には上記２種類のタンパク質の量に大きな差がないことが示され、上記一時的にトランスフェクトされた細胞によって同程度の量の野生型粒子と変異体粒子ができることがわかる。ＨＩＶ−１変異体ウイルス粒子の感染力野生型とパッケージング変異体ウイルス粒子の感染力を、ＨＩＶ感染に対して感受性のあるＨ９Ｔリンパ球で測定した。トランスフェクトされた細胞の上清をＨ９細胞に加えた後で経時実験を行ない、その際３種類のアッセイを行なった。３種類のアッセイは以下のものであった。１）感染細胞のパーセントを測定するためのマウス抗ｐ２４モノクローナル抗体による免疫蛍光染色（ＩＦ）、２）コアタンパク質ｐ２４の測定、３）感染Ｈ９細胞からのウイルス遊離量を測定するためのＨ９細胞の上清中の逆転写酵素の測定（ＲＴ）。サンプルは、感染後３、６、９、１２、１６、３０日目に採取した。表２に示すように、いずれのパッケージング変異体も感染後３０日目までは３つのアッセイのいずれにおいても陰性であった。ｐＨＸＢ２ｇｐｔ構築物から製造した野生型粒子だけがこれらのアッセイで陽性であった。これらのデータから、ＨＩＶパッケージング変異体粒子は完全に非感染性であることがわかる。変異体ウイルス粒子の生化学的組成と形態上記ノーザンブロット分析と免疫沈降分析により、変異体構築物および野生型構築物でトランスフェクトされた細胞中のウイルスＲＮＡとタンパク質の蓄積量には差がないことがわかった。さらにウエスタンブロット分析を行なって、変異体と野生型のウイルス粒子のウイルスタンパク質組成を比較した。ブロットはＨＩＶ陽性ヒト血清でプローブした。図４に示すように、Ψ部位変異体ウイルス粒子であるＡ３ＨＸＢとＡ４ＨＸＢ、およびｇａｇ変異体ウイルス粒子であるＡ１５ＨＸＢとＡ１４−１５ＨＸＢのタンパク質組成は野生型ＨＸＢ２ｇｐｔワクチン粒子のものと似ていた。この図に示していないが、Ａ１４ＨＸＢウイルス粒子からはＡｌ５ＨＸＢウイルス粒子と同様の結果が得られた。いずれの場合も、ウイルスタンパク質ｇｐ１２０、ｐ６６、ｐ５ｌ、ｇｐ４１、ｐ３１、およびｐ２４がほぼ同じ量比で観察された。次いで、Ψ部位変異体ウイルス粒子Ａ３ＨＸＢとｇａｇ変異体ウイルス粒子Ａ１４−１５ＨＸＢのＲＮＡ含有量をノーザンドットブロット分析によって調べた。図５に示すように、野生型ＨＸＢ２ｇｐｔウイルス粒子の場合と異なり、変異体粒子中にはゲノムＲＮＡは検出されなかった。これらのデータは、Ψ部位変異体とＣｙｓＨｉｓボックス変異体のどちらでも、野生型と比べて少なくとも１００倍のＲＮＡ含有率の低下があることを示すものである。変異体ＨＩＶ粒子の形態を電子顕微鏡で調べた。この分析で、ウイルスカプシドはＲＮＡパッケージングがなくても集合可能であることが示され、そしてｐ７^gag のＣｙｓＨｉｓボックス中の変異によりウイルス粒子集合に影響を及ぼさないで感染性を消失させることができることがわかった。標本を丹念に調べたところ、ほとんどの変異体粒子は野生型ウイルス粒子より電子密度が低いことがわかった。この形態的特徴は、ウイルスタンパク質前駆体のプロセシングを受けていない未熟粒子に特有のものである。ＲＮＡのこの欠損が、粒子成熟速度やプロセスされた前駆体の構造の縮合に影響を及ぼす可能性がある。ＨＩＶ変異体構築物の一層の改良さらに改良を進めるために、非感染性ウイルス粒子を生成する付加的なＨＩＶ −１変異体構築物を作成した。これらの改良は、変異体ウイルス粒子調製物の安全性と抗原性の点で長所があると思われる。多重欠損を有するＲＮＡパッケージング変異体は、感染性への復帰の確率が極めて低い非感染性ＨＩＶウイルス粒子を生じると思われる。Ψ部位とＧａｇＣｙｓＨｉｓ領域の両方に有効な変更を有する変異体構築物ｐΔＰＡＣ１とｐΔＰＡＣ−Ｈｙｇｒｏを作成した（図６）。これらの変更はそれぞれ単独で非感染性をもたらすので、全体としても有効であるといえる。パッケージング欠損に加えてその他のＨＩＶ機能欠損を誘導することで、復帰の危険性をさらに低下させることができる。エンベロープ前駆体ｇｐ１６０の切断部位の変異は非感染性を生ずることが示されている［マックキューンら（McCu ne, J.M., et al.）、Cell 53:55-67 (1988)］。Ψ部位とＧａｇＣｙｓＨｉｓボックス領域とｇｐ１６０切断部位に有効な変更を有する３重欠損ＨＩＶ変異体構築物ｐΔＰＡＣ２を作成した（配列番号９）（図７）。また、ＨＩＶゲノムの５’末端付近にあってｔＲＮＡプライマーがウイルスゲノムの逆転写を開始する部位であるプライマー結合部位を欠失させると、感染性を消失すると思われる［プラッツら（Prats, A.C., et al.）、J. EMBO. 7:1777-1783（1988）］。プライマー結合部位欠損の１例を図８に示した。本明細書で説明するＲＮＡパッケージングとｇｐ１６０切断とプライマー結合機能における有効変異のいかなる組み合わせを有する多欠損ＨＩＶ変異体構築物を作成することもできる。Ψ部位変異はｐＡ３ＨＸＢの３９ｂｐ欠失であることも可能であり、ｐＡ４ＨＸＢの２１ｂｐ欠失であることも可能である（図１Ａ）。ＧａｇのＣｙｓＨｉｓ変異により、ｐＡ１４ＨＸＢの場合と同様の５’ＣｙｓＨｉｓボックスの置換、ｐＡ１５ＨＸＢの場合のように３’ ＣｙｓＨｉｓボックスの置換、またはｐＡ１４−１５ＨＸＢの場合の両方のＣｙｓＨｉｓボックスの置換、またはｐΔＣＨ１−２ＨＸＢの場合のように一方または両方のＣｙｓＨｉｓボックスの欠失を引き起こしうる（図１Ｂ）。ｐΔＰＡＣ２の場合のようなＥｎｖｇｐ１６０切断部位の変異やプライマー結合部位の変異もさらに含ませることができる。４つの機能のすべてにおいて変異を有する多重欠損ＨＩＶ構築物の１例として、図８に示すｐΔＰＡＣ３が挙げられる。非感染性ＨＩＶ粒子の免疫原性の改良も可能である。ｇｐ１６０エンベロープ前駆体のｇｐ１２０およびｇｐ４１へのプロセシングをブロックするｇｐ１６０切断部位の変異は、濃縮ＨＩＶウイルス粒子調製の途中で見られるのが普通のｇｐ１２０抗原の「シェッディング（shedding）」を減少させるかもしれない。ｇｐ１６０のｇｐ４１部分は貫膜ぺプチドであり、ｇｐ１２０抗原のウイルス粒子表面への固定を強化する働きをしているのかもしれない。このｇｐ１２０抗原の保持増大は、ｇｐ１６０切断部位変異体で製造されるＨＩＶ粒子の免疫原性を改良すると思われる。ｐΔＰＡＣ３におけるｇｐ１６０切断部位変異はｇｐ１６０プロセシングと感染性の両方を欠損しているので、免疫原性が向上している可能性のある非感染性ウイルス粒子の製造に使うことができる。ワクチン中の非感染性ＨＩＶ粒子の免疫原性を改良するもう一つの手段は、ＨＩＶ変異体構築物を構築する際に、本明細書でｅｎｖ置換法と呼ぶストラテジーを利用するものである。エンベロープタンパク質はＨＩＶの表面抗原であり、ＨＩＶ単離物では最も変化しやすいタンパク質である。たとえば、異なる場所から単離したＨＩＶは様々なｅｎｖ遺伝子配列を含んでいる。多くの変異体ｅｎｖ遺伝子がクローン化され、配列が決定されており、米国厚生省国立衛生研究所（U. S. Department of Health and Human Services, ational lnstitutes of Health , National lnstitute of Allergy and lnfectious Diseases, 6003 Executive Boulevard, Bethesda, MD 20892）のエイズ研究試薬標準試薬計画（AIDS Resear ch and Reference Reagent Program）で入手可能である。ｅｎｖ置換法は、ＨＩＶ変異体構築物中の天然ｅｎｖ遺伝子を別のＨＩＶ株か単離株の変異体遺伝子と置換することで、特定の用途に合った非感染性ＨＩＶ粒子を得ることができる。たとえば、変異体粒子は、ある集団に蔓延しているＨＩＶ系統またはとくに毒性の強い系統に対抗するワクチン接種の目的に使うことができる。別の例では、たとえばエイズ症状の発症を予防するために、感染患者からウイルスを単離し、ｅｎｖ遺伝子をクローン化し、変異体構築物中のｅｎｖ遺伝子をクローン化配列と置換することによって、その患者の治療処理に使用する非感染性粒子を患者に感染した特定のＨＩＶ系統に合わせることができる。あるいは、様々なＥｎｖタンパク質を含有するＨＩＶ粒子を組み合わせることによってさらに広範囲の保護をもたらすワクチンを作成することができる。ｅｎｖ置換法は、様々なＨＩＶ系統を検出するうえでより特異的でより一般的なＨＩＶ診断試薬を得る場合にも有用である。抗原性や免疫原性の向上したＨＩＶ変異体粒子を製造する目的で、変異体ｅｎｖ遺伝子を天然遺伝子の突然変異誘発法によって操作することもできる。たとえば、Ｅｎｖグリコシル化部位を除去することができる。実施例で説明するように、ポリメラーゼ連鎖反応およびその他の組換えＤＮＡ技術を用いて、ＨＩＶ変異体構築物中でＥｎｖ置換を実施することができる。安定生産細胞系非感染性ＨＩＶ粒子を安定的に産生する哺乳類細胞系が作成された。これらの細胞系は、上記パッケージング欠損とその他の機能的欠損を有するＨＩＶ変異体構築物で培養細胞を安定にトランスフェクトすることによって製造することができる。安定にトランスフェクトする手順には、上記構築物導入済み細胞を選択するステップが含まれるので、トランスフェクトするＤＮＡはＧ４１８抵抗性の場合のｎｅｏ遺伝子やハイグロマイシン抵抗性の場合のｈｙｇｒｏなどの選択マーカーを含んでいるのが普通である。他の方法より改良された安定なトランスフェクトの選択法を本明細書で説明する。既報の方法では、選択マーカーを含有するＤＮＡを対象構築物を含有するＤＮＡと共トランスフェクシヨンさせるか、選択マーカーが対象のコード配列とは別のプロモーター（通常はベクター中にある）の支配下におかれている構築物をトランスフェクトする。本明細書で説明する選択法では、選択マーカーは対象のコード配列と同じプロモーター（この場合はＨＩＶＬＴＲ）から転写される。図９に、ｎｅｆ遺伝子が選択マーカー（ｎｅｏ）で置換されたＨＩＶ構築物ｐＲ７ｎｅｏを示す。ｐＲ７ｎｅｏで安定にトランスフェクトされた細胞系は野生型の感染性ＨＩＶウイルス粒子を生じるのて、ｎｅｆ遺伝子はＨＩＶの複製サイクルに不可欠でないと思われる。本選択法の利点は、選択マーカー発現が対象コード配列の発現の指標となること、および細胞ゲノム中への構築物の取り込みが、該コード配列と選択マーカーを含有する転写ユニットが細胞中で機能する程度のものであることである。したがって、本選択法は、選択マーカーの発現が必ずしも目的クローンの指標とならない従来法より信頼性が高い。ｐＲ７ｎｅｏ構築物は、安定産生細胞系の製造に使用したＨＩＶ変異体構築物の親ベクターである。安定産生細胞系を作るためのその他のＨＩＶ変異体構築物は、上記ＲＮＡパッケージング、Ｅｎｖｇｐ１６０切断部位、およびプライマー結合部位の欠失を組み合わせてｐＲ７ｎｅｏに導入操作することによって作成することができる。また、ｎｅｏ以外の選択マーカーを用いて、ｎｅｆ遺伝子を置換することができる。安定産生細胞系は、実施例に説明するようにしてＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＨ９細胞から作成された。３つのタイプの細胞系すべてが大量のＨＩＶ粒子を生じることがわかった。Ｈ９由来細胞系の場合、１細胞あたりの粒子生成量は生存ウイルス感染の場合より４０〜１００倍も高いことが観察された。これは製造コストの点でも大きな利点である。その他の細胞系を非感染性ＨＩＶ粒子の製造に使ってもよい。たとえば、ＦＤＡ認可細胞系は臨床試験の目的にはさらに便利かもしれない。非感染性ＨＩＶ粒子の免疫原性本明細書で説明するようにして製造した非感染性ＨＩＶ粒子は、そのＨＩＶ変異体粒子を適当なアジュバントと混合してマウスに注射すると抗体反応を誘導することが示された。これらの結果から、本発明によって提供される非感染性ＨＩＶ粒子は免疫原性があることかわかる。上記以外の商業用途および治療用途本発明は、野生型粒子とタンパク質組成および形態が似ていて免疫原性があるが完全に非感染性であるＨＩＶ変異体粒子を製造する手段を提供する。さらに、感染性への復帰の確率が非常に低くしかも免疫原性が向上していると思われるＨＩＶ変異体粒子の製造手段も提供される。本発明によって提供される非感染性ＨＩＶ粒子は、改良された抗ＨＩＶワクチンと診断試薬を得るために使うことができる。今では、ＨＩＶ関連ワクチン組成と診断試薬を、明細書で説明するようにしてＲＮＡパッケージングとその他の変異を有するＨＩＶ変異体構築物を哺乳類細胞中で発現させることによって得ることができる。これらの材料は、上記構築物を使用して一時的トランスフェクションを行なうか、構築物で安定にトランスフェクションすることにより安定産生細胞系を作成することによって製造することができる。安定産生細胞系の培養による非感染性ＨＩＶ粒子の製造は、生存ウイルス感染による場合と比べて、より安全、より迅速で、かつよりコスト効率が高いワクチンおよび診断試薬製造方法である。上記ＨＩＶ変異体構築物はＨＩＶ−１ゲノムを基本要素とするものであるが、ＨＩＶ−２ゲノムを基本要素とする構築物も同様の方法で作成することができる。最初のスプライス部位とＧａｇ開始コドンの間の領域に類似のΨ部位変異を起こすことができる。ＨＩＶ−２とＨＩＶ−１のＣｙｓＨｉｓボックス配列は同じであるので、一方または両方のＣｙｓＨｉｓボックスの最初の２つのシステインを同様にチロシン置換したり、ＣｙｓＨｉｓ領域全体を欠失させたりすると、非感染性ＨＩＶ−２粒子が生じると思われる。ＨＩＶ−２のＥｎｖ切断部位を確定し、これを明細書て説明するＨＩＶ−１変異と類似の方法で変更することができる。ＨＩＶ−２プライマー結合部位も確定させ、これを完全に欠損させることができる。ＨＩＶゲノムの有効変異、とくにＲＮＡパッケージングに不可欠の配列の変異による非感染性ＨＩＶ粒子の製造は、ホールのウイルスワクチン製造のためのＨＩＶウイルス不活化法を提供する。この遺伝子不活化方法は、加熱や化学的架橋や照射による不活化方法よりウイルス粒子構造や抗原表面への破壊度が低い。遺伝子不活化とその他の方法の一つを組み合わせることによって作成されるワクチンは、物理的または化学的不活化を２度受けるウイルス調製物より免疫原性が向上すると思われる。ｇｐ１２０表面抗原の保持を向上させることによって、およびｅｎｖ遺伝子を上記のようにしてヘテロｅｎｖ遺伝子と置換することによって、免疫原性をさらに向上させることができる。不活化ホールウイルス粒子またはその非感染性ウイルス粒子の抗原部分を含有するワクチンを作成することができる。該ワクチンは、食塩水などの適当な生理担体に保持させて投与することができる。該担体にはＢＣＧ（Mycobacterium bo vis bacillus Calmette-Guerin）などのアジュバントを含めることができる。非感染性ＨＩＶ粒子のホールのもの、またはそのタンパク質誘導体を含有する診断薬も作成することができる。タンパク質誘導体は、たとえば界面活性剤を含む緩衝液中でウイルス粒子を破壊することによって得ることができる。非感染性ＨＩＶ粒子およびそのタンパク質誘導体から作成した試薬は、現在診断方法に使用されている生存ウイルスや生存ウイルス誘導体の代わりに使うことができる。たとえば、血液サンプル中の抗ＨＩＶ抗体を検出する目的でＥＬＩＳＡやウエスタンブロットを実施してもよい。非感染性ＨＩＶ粒子およびタンパク質誘導体から作成した試薬は、より安全に、より容易に、より低コストで製造できる。上記のように、安定産生細胞系は生存ウイルスによる感染で得られるものより１細胞あたり最大４０〜１００倍の量のＨＩＶ粒子を産生する能力がある。また、安定産生細胞系を用いてサルのエイズ動物モデルにおける免疫治療試験や予防試験用の非感染性ＳＩＶ粒子を製造することができる。明細書で説明するＨＩＶ変異体に対応するＲＮＡパッケージング、Ｅｎｖｇｐ１６０切断およびプライマー結合部位変異を有するＳＩＶ変異体構築物もこの目的のために並行して作成された。また、安定産生細胞系は、ＨＩＶライフサイクルにおける感染後事象を研究するのに便利で安全なイン・ビトロモデル系を提供する。ＨＩＶが哺乳類細胞中で増殖する機構に関する知見が増大すれば、ＨＩＶの感染予防または抑制のための新しい療法の開発につながるかもしれない。さらに、安定産生細胞系は、感染細胞からのＨＩＶ粒子の生成を阻害する薬物を発見する安全かつ便利な方法を提供する。たとえば、上記薬剤はウイルス粒子の組み立て（assembly）または放出を阻害するかもしれない。ＨＩＶ抑制薬剤は感染個体における疾患の重篤度を和らげる目的で使うことができるであろう。実施例以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。細胞系とウイルスサルウイルス４０で形質転換したアフリカミドリザル細胞系ＣＯＳ−１が記載されている［グルズマン（Gluzman, Y.）、Cell 23:175-182 (1981)］。この細胞系はクホウリー（G. Khoury, National Institutes of Hea lth）から提供されたもので、American Type Culture Collection, Rockville, MDから入手可能である。ＣＯＳ−１を１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。Ｈ９およびＨ９−ＩＩＩＢＴリンパ球細胞系を既報［ポポビックら（Popovic, M., et al.）、Science 224:497-500（1984）］に従い培養した。培養上清をポアサイズ０．４５μｍのフィルター（Millipore Corp., Bedford, MA）で濾過した後、既報に従いウイルス感染と逆転写酵素アッセイを行なった［ポポビックら（Popovic, et al.）、1984、前掲：ダニエルら（Daniel, M.D., et al.）、Science 228:1201-1204（1985）］。ＨＩＶ−１ゲノムの変異誘発とプラスミド構築これらの試験に使用した親ＤＮＡは生物活性クローンｐＨＸＢ２ｇｔｐである［フィッシャーら（Fisher, A.G., et al.）、Nature（London）316:262-265 (1 985)］。ＳａｃＩ−ＳａｌＩの５．３キロ塩基対（ｋｂ）断片（ヌクレオチド３９から５３６６まで）をＭ１３ｍｐ１８にクローン化し、クンケルらのプロトコル［クンケルら（Kunkel, T.A., et al.）、Methods in Enzymology 154:367-38 2（1987）］に従い、１本鎖ＤＮＡ上でオリゴ介在部位特異的突然変異誘発を行なった。ＨＩＶ−１ゲノム中のヌクレオチド位置は既報に従い番号を付けた［ラトナーら（Ratner, L., et al.）、Nature 313 :277-284（1985）］。適当なゲノム配列セグメントを有する合成プライマーを用いる部位特異的突然変異誘発法により、ＨＩＶ−１ゲノムの欠失と置換を行なった。たとえば、下記オリゴマーを用いて、以下のΨ部位変異：Ａ３：ＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣ（配列番号１０）（ヌクレオチド２９３から３３１までの欠失に使用）、Ａ４：ＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣ（配列番号１１）（ヌクレオチド２９３から３１３までの欠失に使用）、および以下のｇａｇ変異：Ａ１４：ＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＣ（配列番号１２）（１５０８位と１５１７位におけるグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への変更）、Ａ１５：ＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＧＡＴＡＴＴＴＣＣＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＧ（配列番号１３）（１５７１位と１５８０位におけるＧのＡへの変更）を作成した。これらのプライマーを用いて、ｐＡ３ＨＸＢ、ｐＡ４ＨＸＢ、ｐＡ１４ＨＸＢ、ｐＡ１５ＨＸＢ、ｐＡ１４−１５ＨＸＢにおけるＲＮＡパッケージング変異を行なった。図８に示すように、ｐΔＣＨ１−２ＨＸＢ構築のためのＣｙｓＨｉｓボックスコード領域全体の欠失および１８ｂｐプライマー結合部位の欠失を適当なプライマーを用いて同様に実施した。上記変異の導入は、下記２つの特異的オリゴマーを用いて異なるＭ１３ｍｐ１８組換えＤＮＡの配列を決定することによって確認された。すなわち、Ａ５：ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＣ（配列番号１４）とＡ１６：ＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＡＡ（配列番号１５）である［アウスベルら（Ausubel, F.M., et al. ）、Current Protocol in Molecular Biology, Green Publishing Asso ciates and Wiley Interscience（1987）］。変異させたＭ１３ｍｐ１８組換えクローン由来のＢｓｓｈＩＩ／ＢａｌＩの１．９ｋｂＤＮＡ断片を用いて、すべての変異体を野生型プラスミドｐＨＸＢ２ｇｐｔに移した。Ｍ１３ｍｐ１８プラスミドから移した領域全体の配列を、２本鎖ＤＮＡ配列決定法［アウスベルら（Ausubel, F.M. et al）、1987、前掲］により決定し、目的の変異が存在することとそれ以外の変更が存在しないことを確認した。すべてのＤＮＡ操作は常法に従って行なった。図８に示したようなＥｎｖｇｐ１６０切断部位の変異がマックキューンらによって記載されている［マックキューンら（McCune, J.M., et al.）、Cell 53: 55-67 (1986)］。ｎｅｆ遺伝子の選択マーカーによる置換については、トロノらによって記載されている［トロノら（Trono, D., et al.）、Cell 59:113-120（1989）］。天然ｅｎｖ遺伝子の変異体遺伝子による置換は、変異体ＨＩＶゲノム配列を有するＤＮＡを鋳型とし、このものと増幅ＤＮＡをＨＩＶ構築物にクローン化するのに適した制限部位を有するプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって行なった。必要であれば、制限部位は部位特異的突然変異誘発法によってＨＩＶゲノム中に導入操作することができる。様々なＨＩＶの系統および単離株のＨＩＶゲノム配列を含有するＤＮＡをNati onal lnstitutes of Healthの保存部門から得ることができる。あるいは、ＨＩＶ感染患者からウイルスを単離し、ウイルスゲノムをクローン化することによって、得ることもできる。また、欠失グリコシル化部位をコードする遺伝子を含む変異ｅｎｖ遺伝子は部位特異的突然変異誘発法によって操作することができる。哺乳類細胞へのＨＩＶ構築物のトランスフェクショントランスフェクションの２４時間前に、１００ｍｍプレート１枚あたり１０⁶ 個の密度でＣＯＳ−１細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地にまき、５％ＣＯ₂中３７℃でインキュベートした。プレート１枚あたり１０μｇのプラスミドＤＮＡを用い、既報に従いトランスフェクションを行なった［チェンとオコヤマ（Chen, C. and H. Okoyama）、Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752（1987）］。ウイルス粒子をＲＮＡ分析に使用する場合は、セルドンらの方法［セルドンら（Seldon, R.F., et al.）、Mol. Cell. Biol. 6:3173-3179（1986）］に従いＣＯＳ細胞中でトランスフェクションを行なって、リン酸カルシウム形質転換で見られるサンプルのひどいＤＮＡ汚染を防止した。構築物中の選択マーカーによって付与された抗生物質抵抗性を有する安定なトランスフェクタントを選択することによって、安定産生細胞系を作成した。トランスフェクシヨンは、ＣａＰＯ₄またはエレクトロポーレーション法によって行なった。安定なトランスフェクタントは、死滅アッセイで求めた細胞系に適した濃度のＧ４１８またはハイグロマイシン（ギブコ社）を用いて選択した。一般に、１週間で８０％の細胞を死滅させる濃度を用いた。抵抗性クローンを採取し、プールし、抗生物質の存在下で培養した。プールされた安定産生細胞は、細胞集団が連続選択圧の下で精製されるのに伴い、ＨＩＶ粒子産生が増大した。抵抗性クローンは、プールしないで再びプレート培養するラウンドを数回繰り返すことによっても精製することができる。個々のクローンについては、最大ＨＩＶ産生量を調べることができる。ウイルスＲＮＡの分析トランスフェクションを受けた細胞中のＲＮＡを分析するために、トランスフェクション４８時間後にクイーンとバルチモアの高温フェノール法［クイーンとバルチモア（Queen, C. and D. Baltimore）、Cell 33:741-748 (1983)］によりＣＯＳ−１細胞からＲＮＡを抽出した。ノーザンブロット分析のために、レーン当たり１０μｇのＤＮａｓｅＩで処理した全細胞ＲＮＡを用いた。モック（mo ck）トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を陰性対照として用い、ＨＸＢ２ウイルスを慢性感染させたＨ９細胞から得た５μｇのＲＮＡを陽性対照とした。ＨＩＶ−１特異的プローブは³²Ｐ標識全長ウイルスＤＮＡであった。ウイルス粒子中のＲＮＡを分析するために、等量のｔＲＮＡの存在下で等量のｐ２４を含有する上清からＲＮＡを抽出した。ｔＲＮＡは、ＲＮＡの最終回収率をモニターするために用いた。ＲＮＡサンプルはｔＲＮＡと同濃度（１μｇ／ｍ１）で水中に再懸濁し、１、０．３、および０．１等量のＲＮＡをニトロセルロース膜上に負荷した。この場合、１等量は１８ｎｇのｐ２４を含有するＣＯＳ− １上清から得られるＲＮＡ量に相当する。既報［アウスベルら（Ausubel et al. ）、1987、前掲］に従い、ＲＮＡスロットブロット分析を行なった。ｐＨＸＢ２ｇｐｔ由来の３．８ｋｂのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩｇａｇ−ｐｏｌ断片をランダムプライミングにより³²Ｐで標識し、これをスロットブロットのプローブとして用いた。ウイルスタンパク質の分析トランスフェクトされた細胞中のタンパク質を分析するために、４８時間前に各プラスミド１０μｇでトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を５００μＣｉの³⁵Ｓメチオニンで４時間かけて標識した。陰性対照として、転写後欠損があるためにウイルスを産生しない［ファインベルグら（Feinberg ,M.B., et al.）、Cell 46 :807 (1986)］プラスミドｐＨＸＢ２Ｂａｍｐ３で細胞をトランスフェクトした。細胞溶解物を調製し、すべての公知のウイルス構造タンパク質と反応性があることが証明されているＨＩＶ−ｌ陽性ヒト血清［ファインベルグら（Fein berg et al.）、1986、前掲］を用いて、既報［ベロネーゼら（Veronese, F.D., et al.）、Cell 4 6: 807（1986)］に従い免疫沈降を行なった。免疫沈降させたタンパク質は１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて分離した［ラエムリ（Laemmli, U.K.）、Nature 227:680（1970）］。ＨＩＶ粒子中のタンパク質を分析するために、ＳＷ２７ローター中２７，０００ｒｐｍで３時間遠心分離することによってウイルスをペレット化した。逆転写酵素活性を測定する場合は、解離緩衝液（０．０１Ｍトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．３、０．２％トリトンＸ−１００、０．００１ＭＥＤＴＡ、０．００５Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．００６ＭＫＣＬ）に、タンパク質分折を行なう場合は、０．２％トリトンとラエムリ緩衝液にペレットを再懸濁した。ウエスタンブロット分析と放射免疫沈降（ＲＩＰ）は、ベロネーゼらの手順［ベロネーゼら（Veronese, F.D., et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5199-5202 （1985)］に従って実施した。組織培養上清またはペレット化ウイルスについて、ｐ２４分析を行なった。各変異体上清中のｐ２４ｇａｇタンパク質の量（ｎｇ／ｍｌ）をトランスフェクションの４８時間後に測定した。各トランスフェクションでは１０ｍｌの培地を重層した。デュポン社製ｐ２４ＥＬＩＳＡキットを用い、各上清の３種類の希釈液について分析した。２７，０００ｒｐｍで３時間遠心分離することにより、各変異体のトランスフェクションで得た３ｍｌのＣＯＳ−１上清を濃縮した後、ＲＴ活性を測定した。数字は上清ｌｍｌあたりのものであり、３回の実験の平均である。放射免疫沈降法による野生型と変異体型の粒子のタンパク質含有量の分析も行なった。感染力アッセイ４８時間トランスフェクションを行なったＣＯＳ−１細胞の濾過（０．４５μ ｍ、ミリポア）上清をＨ９細胞に感染させた。ｐ２４^gagタンパク質特異的ネズミモノクローナル抗体［ベロネーゼら（Veronese, F.D., et al.）、Proc. Natl . Acad. Sci. USA 82: 5199-5202（1985)］および陽性対照としてｈ９−ＨＩＶＩＩＩＢ細胞系を用いて免疫蛍光アッセイを行なった。ｐ２４ＥＬＩＳＡ（デュポン社）を用いて、ｐ２４アッセイを行なった。培養上清の濾過後に、逆転写酵素アッセイを行なった［ダニエルら（Daniel, M.D., et al.）、Science 228:12 01-1204 （1985)］。ｂＣＡ２０の構築と分析ＨＩＶ−１のｐ１５^gagの役目を調べるために、プラスミドＷ１３［キムら（K im, et al.）、J. Virol. 63:3708-3713（1989）］に変異を導入した。このプラスミドはＨＩＶ−ＨＸＢ２−ＤプロウイルスＤＮＡの感染性コピーを含有する［ショーら（Shaw et al.）、Science 226:1165-1171（1984)］。１５４９位に存在するユニークＡｐａＩ部位にヌクレオチド８個分の長さのＣｌａＩリンカーを挿入することによってＷ１３を改変した後、このＣｌａＩ部位をクレノウ断片で平滑化してＧａｇ読み取り枠を調節した。このようにして得られた変異構築物をｂＣＡ２０−Ｗ１３と呼ぶ。この変異は、１つ目のＣｙｓＨｉｓボックスの直後にある２個の残基、アルギニン−アラニンを４つのアミノ酸配列、セリン−イソロイシン−アラニン−メチオニンで置換する（図３）。したがって、アミノ酸配列と上記２つのＣｙｓＨｉｓボックスの間の介入配列の長さが変化する。上記変異の表現型発現を調べるために、ＣＯＳ細胞をｂＣＡ２０でトランスフェクトし、ｐ２４抗原の量と上清中に遊離した逆転写酵素活性を測定することによってウイルス粒子生成量を求めた（表３）。ｂＣＡ２０誘導ｐ２４活性と逆転写酵素活性はそれぞれ野生型の約４０％と３０％であった。このことは、ｂＣＡ２０中に存在する変異は、ウイルス粒子の遊離を少しだけ阻害したことを意味する。次いで、ＣＯＳ細胞上清を用いてＨ９細胞に感染させた後、ＨＩＶ感染者の血清を検出抗体として用いて、間接的免疫蛍光アッセイ［ホーら（Ho, D.D., et al.）、Scinece 226:451-453（1984)］を行なった。３週間後にも陽性細胞は認められなかった。この事実は、トランスフェクション後に生成した粒子は非感染性であることを示した。したがって、ｂＣａ２０変異はウイルス複製にとって致命的であると結論できる。ｂＣＡ２０に含まれるｐ１５^gag変異の影響をさらに調べるために、この変異体のＥｎｖ^-型を構成的に発現する細胞系を作成した。ＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物の発現は、Ｅｎｖの非存在下でもウイルス粒子を生成するのに十分である。このような細胞系は下記のようにして作成する。すなわち、ＨＴ４−６Ｃ細胞（その表面でＣＤ４分子を発現するＨｅＬａ細胞系）を、ｅｎｖ遺伝子中にｎｅｆ読み取り枠の替わりに翻訳読み取り枠のシフトと変異体ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有するｂＣＡ２０−Ｗ１３の改変型であるｂＣＡ２０−ΔＥ−ｄｈｆｒ構築物でトランスフェクトした。ＨＴ４− ６Ｃ細胞はチャセブロ氏［チャセブロとウエールリー（Chasebro, B. and Wehrl y, K.J.）、Virol. 62:3779-3788（1988)］から提供された。メトトレキセート抵抗性を有する細胞を選択し、クローン化し、ポリメラーゼ連鎖反応によりウイルスインテグラント（viral integrant）の存在を調べる分析を行なった。ＨＩＶ感染者の血清を検出抗体として用いる間接的免疫蛍光法も実施した。ＨＴ４（ｂＣＡ２０−ΔＥ−ｄｈｆｒ）中に見られた免疫蛍光は、野生型ｇａｇ配列を発現するＨＴ４（ＷＴ−ΔＥ−ｄｈｆｒ）で見られたものと似ていた。ｐ２４抗原と逆転写酵素活性も、これらの細胞系の上清中で測定した。野生型に対するｂＣＡ２０の活性の比率は、対応するＷ１３ウイルス構築物の一時的トランスフェクションで見られたものとほぼ同等であった（表３）。また、抗ｐ２４モノクローナル抗体（F. Veronese氏より提供されたもの）を検出抗体として用い、トロノおよび共同研究者による既報［トロノら（Trono, C., et al. ）、Cell, Octobe r6, 1989 ］に従い細胞質タンパク質のウエスタンブロット分析を行なった。ＨＴ４（ｂＣＡ２０−ΔＥ−ｄｈｆｒ）とＨＴ４（ＷＴ−ΔＥ−ｄｈｆｒ）は同様のパターンを示した（図１０）。したがって、ｂＣＡ２０中に存在する変異はＧａｇ前駆体の合成、切断、安定性に影響を及ぼさないと結論できる。ｂＣＡ２０に含まれる変異がウイルスＲＮＡのパッケージングに悪影響を及ぼしたかどうかを調べるために、ＨＴ４（ＷＴ−ΔＥ−ｄｈｆｒ）とＨＴ４（ｂＣＡ２０−ΔＥ−ｄｈｆｒ）細胞の上清のスロットブロット分析を行なった。すなわち、７００μｌの培地を３５μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム社）と混合し、７μ１の培地を３５μｌの１０ｍｇ／ｍｌｔＲＮＡ、３．５μｌの０．５ＭＥＤＴＡ、１７．５μｌの２０％ＳＤＳと混合し、３７℃で４５分インキュベートし、フェノールで抽出し、０．４ＭＮａＣｌ中でエタノール沈殿させた。ＲＮＡを２０μｌのＥＤＴＡ（ｍＭ）に再懸濁し、５０％ホルムアミド−１７％ホルムアルデヒド中で変性させ、５０℃で２０分加熱し、１２０μｌの１５ｘＳＳＣと混合し、スロットブロット装置による吸引でニトロセルロースに結合させた。次いで、Ｔ７ポリメラーゼで作成したＨＩＶ−１ゲノムの８４７５−８９００ヌクレオチドに相補的な［³²Ｐ］プローブを用いて、既報［トロノら（Trono, D., et al. ）、J. Virol. 62:2291-2299（19 88）］に従いハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを０．２ｘＳＳＣで６８℃で３回洗い、Ｘ線フィルムを感光させた。その結果、ＨＴ４（ｂＣＡ２０−ΔＥ−ｄｈｆｒ）の上清中に存在するウイルスＲＮＡの量は、対照細胞系であるＨＴ４（ＷＴ−ΔＥ−ｄｈｆｒ）と比べて劇的に低下したことがわかった（図１１）。したがって、ｂＣＡ２０変異はワクチンゲノムＲＮＡの粒子へのパッケージングを選択的に阻害したと結論された。両方の細胞系を電子顕微鏡でも調べて、ウイルスＲＮＡパッケージングの欠損が形態的な違いと相関しているかどうかを調べた（図１２）。ＨＴ４（ＷＴ−Δ Ｅ−ｄｈｆｒ）中に見られたウイルス粒子の形態は、同じウイルスのＥｎｖプラス複製適格型の感染を受けた細胞系であるＨＴ４（Ｒ７−ｄｈｆｒ）で見られたものと非常に似ていた。細胞から遊離した成熟粒子は、ウイルス脂質２重層（図１２、パネルＡ、パネルＢ）に囲まれた濃縮コアを含んでいた。一方、ＨＴ４（ｂＣＡ２０−ΔＥ−ｄｈｆｒ）から遊離した粒子では、２つの劇的な違いが見られた。まず、粒子の直径が対照で見られたものより約５０％大きかった。次に、電子密度の高い領域が膜に密着して並行に存在していたが、粒子の中心は電子透過性が大きかった（図１２、パネルＣ）。それでも、ｂＣＡ２０粒子の約１％は、野生型のものと似た形態をもっていたか、これはおそらく、細胞上清に関するＲＮＡハイブリダイゼーションの研究ですでに示唆されているようなｂＣＡ２０表現型のリークによるものであろう。これらの電子顕微鏡所見は、ｂＣＡ２０粒子中のウイルスＲＮＡをパッケージングができない現象が、直径の増大とウイルス成熟最終ステップを通常示す粒子内部成分の「コラプス(collapse)」の欠落とを伴うことを示している。この成熟阻害が主に粒子中にウイルスＲＮＡがないことによるのか、それとも異常なｐ１５^gagタンパク質の直接的な影響によるのかはまだ判明していない。ｂＣＡ２０のｐ１５^gag変異体プロウイルスでトランスフェクトされた細胞が産生したＨＩＶ−１ウイルス粒子は、サル免疫不全ウイルスＳＩＶｍａｃ［デルチャンブルら（Delchambre, M., et al.）、EMBO J. 8:2653-2660（1989)］のｐ５７^gag前駆体をコードする組換えバキュロウイルス発現ベクターで感染させたSpodoptera frugiperda昆虫細胞から遊離したウイルス様粒子と極めてよく似ていることは興味深い。これらの様々な状況で生成したＲＮＡマイナス粒子の形態的特徴を比較すると、成熟レトロウイルス粒子の構造形成と成熟にウイルスＲＮＡ自体が重要な役割を果たしていることが示唆される。要するに、ｐ１５^gagタンパク質の２つのＣｙｓＨｉｓボックスの間に変異を有するイン・ビトロ操作ＨＩＶ−１変異体ｂＣＡ２０の表現型に関する上記評価の結果、この領域はウイルス粒子中へのゲノムＲＮＡのパッケージングに不可欠であることが証明された。また、ｐ１５^gag領域によって生成したＲＮＡ欠損表現型は、電子顕微鏡で示されるような顕著な形態的異常と関連することが示された。重要なことは、これらの結果が、ウイルスゲノムを含まないＨＩＶ粒子の作成が可能であることを示すことである。このことは、無傷の、完全に免疫原性はあるが非感染性のウイルス粒子に基づくワクチンストラテジーの開発に大きな意味を持っている。均等物当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、また確認し得るであろう。そのような均等物は下記のクレームの範疇に含まれるものである。配列表（１）一般情報：（i）出願人：ホワイトヘッドインスティチュートフォーバイオメディカルリサーチ（ii）発明の名称：非感染性ＨＩＶ粒子およびその用途（iii）配列の数：１５（iv）連絡先住所：（A）宛名：ハミルトン，ブルック，スミスアンドレイノルズ，ピー．シー．（B）ストリート：ツーミリティアドライブ（C）市：レキシントン（D）州：マサチューセッツ（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号：02173 （v）コンピュータ可読フォーム：（A）媒体タイプ：フロッピーディスク（B）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（D）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０，バージョン＃１．２５（vi）現出願データ：（A）出願番号（B）出願日：１９９３年３月１０日（C）分類：（vii）先行出願データ：（A）出願番号：ＵＳ０７／８５９，３４６（B）出願日：１９９２年３月２７日（C）分類：（viii）代理人情報：（A）氏名：グラナハン，パトリシア（B）登録番号：32,227 （C）参照／ファイル番号： WHI89-10A PCT （ix）テレコミュニケーション情報：（A）電話番号：617-861-6240 （B）ファクシミリ： 617-861-9540 （C）テレックス： 951794 （２）配列番号１の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：５７個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：２本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：DNA（ゲノム）（xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：３９個のアミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：３９個のアミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：３９個のアミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：６３０個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ix）特徴：（A）物質名： CDS （B）存在位置：３．．５１８（D）他の情報：／生産物＝Gag （xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１７２個のアミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列：配列番号６：（２）配列番号７の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１８個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：２本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：DNA（ゲノム）（ix）特徴：（A）物質名：CDS （B）存在位置：３．．１７（xi）配列：配列番号７：（２）配列番号８の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：５個のアミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列：配列番号８：（２）配列番号９の情報：（i）配列の特徴（A）配列の長さ：１０個のアミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列：配列番号９：（２）配列番号１０の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：３９個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１０：（２）配列番号１１の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：４０個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１１：（２）配列番号１２の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：４０個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１２：（２）配列番号１３の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：４０個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１３：（２）配列番号１４の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１７個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１４：（２）配列番号１５の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１７個の塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１５：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年４月２９日【補正内容】請求の範囲１．野生型ＨＩＶのｇａｇ遺伝子のアミノ酸配列に変更があるＨＩＶ変異体ゲノムを含有する構築物であって、該変更が５’ＣｙｓＨｉｓボックス、３’ＣｙｓＨｉｓボックス、およびそれらの介入配列(intervening sequence)の欠失であり、その結果、非感染性ＨＩＶ粒子の産生をもたらす構築物。２．非感染性ＨＩＶ粒子を産生し、かつ野生型ＨＩＶゲノムの変更を含む構築物であって、該変更が、両端を含むヌクレオチド２９３−３３１のΨ部位における欠失、ｇａｇ遺伝子における３’ＣｙｓＨｉｓボックスの最初の二つのシステインのチロシンによる置換、およびｎｅｆ遺伝子のネオマイシン耐性遺伝子による置換からなる構築物。３．下記の群から選ばれる配列の変更をさらに含有する請求項２記載の構築物、ａ）エンベロープ前駆体切断部位をコードする配列、ｂ）プライマー結合部位、およびｃ）これらの組合せ。４．プライマー結合部位の変更が、図８に示すように、プライマー結合部位全体の１８塩基対の欠失である、請求項３記載の構築物。５．非感染性ＨＩＶ粒子を安定に産生する哺乳類細胞系であって、該非感染性ＨＩＶ粒子が下記のものよりなる群から選ばれるＨＩＶ変異体ゲノムでコードされている哺乳類細胞系、ａ）野生型ＨＩＶのｇａｇ遺伝子のアミノ酸配列中に、５’ＣｙｓＨｉｓボックス、３’ＣｙｓＨｉｓボックス、およびそれらの介入配列の欠失からなる変更があるＨＩＶ変異体ゲノム、ｂ）野生型ＨＩＶゲノムに、両端を含むヌクレオチド２９３−３３１のΨ部位における欠失、ｇａｇ遺伝子における３’ＣｙｓＨｉｓボックスの最初の二つのシステインのチロシンによる置換、およびｎｅｆ遺伝子のネオマイシン耐性遺伝子による置換からなる変更があるＨＩＶ変異体ゲノム。６．（ｂ）において、ＨＩＶ変異体ゲノムが下記のものより成る群から選ばれる配列の変更をさらに含有するものである請求項５記載の哺乳類細胞系、ａ）エンベロープ前駆体切断部位をコードする配列、ｂ）プライマ一結合部位、およびｃ）これらの組合せ。７．プライマー結合部位の変更が、図８に示すように、プライマー結合部位全体の１８塩基対の欠失である請求項５記載の哺乳類細胞系。８．下記の工程を含んでなる、非感染性ＨＩＶ粒子を安定に産生する細胞系の生産方法、ａ）次のものより成る群から選ばれる構築物を取得し、１）請求項１記載の構築物、２）請求項２記載の構築物、および３）請求項３記載の構築物、ｂ）該構築物で哺乳類細胞系をトランスフェクトし、ｃ）トランスフェクトされた該細胞から安定なトランスフェクタントを選択し、並びにｄ）該安定トランスフェクタントを収集する工程。９．下記の工程を含んでなる、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分の生産方法、ａ）次のものより成る群から選ばれる構築物を取得し、１）請求項１記載の構築物、２）請求項２記載の構築物、および３）請求項３記載の構築物、ｂ）該構築物で哺乳類細胞系をトランスフェクトし、およびｃ）該細胞系中の該構築物を発現させ、それにより非感染性ＨＩＶ粒子またはその抗原活性部分を生産する工程。 10．下記のものよりなる群から選ばれる細胞系を増殖させることを含んでなる、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分の生産方法、ａ）請求項５記載の細胞系、ｂ）請求項６記載の細胞系、およびｃ）請求項７記載の細胞系。 11．請求項９記載の方法により製造される非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分。 12．請求項10記載の方法により製造される非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分。 13．生理学的に許容される賦形剤(vehicle）中に、請求項９記載の方法により製造される、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分を含有してなるワクチン。 14．生理学的に許容される賦形剤(vehicle）中に、請求項10記載の方法により製造される、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分を含有してなるワクチン。 15．次のものよりなる群から選択される構築物により産生される、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらのタンパク質誘導体を含んでなる診断試薬、ａ）請求項１記載の構築物、ｂ）請求項２記載の構築物、およびｃ）請求項３記載の構築物。 16．下記の工程を含んでなる、哺乳類細胞による非感染性ＨＩＶウイルス粒子(virion)産生に影響を与える物質を発見する方法、ａ）次のものよりなる群から選択される構築物でトランスフェクトされ、該構築物が細胞系のゲノム中に安定に組み込まれ、該細胞系が非感染性ＨＩＶ粒子を安定に産生するようになった哺乳類細胞系を取得し、１）請求項１記載の構築物、２）請求項２記載の構築物、および３）請求項３記載の構築物、ｂ）該細胞系へ該物質を投与し、およびｃ）該投与細胞によるＨＩＶウイルス粒子の産生を測定し、該投与細胞による産生と非投与細胞による産生とを比較した場合の差により該物質が咄乳類細胞によるＨＩＶウイルス粒子の産生に影響を与えることが示される工程。 17．請求項16記載の方法により発見される物質。 18．啼乳類細胞による非感染性ＨＩＶウイルス粒子の産生を阻害する、請求項17 記載の物質。 19．下記の工程を含んでなる、ＨＩＶ感染細胞によるＨＩＶ粒子の産生を阻害する薬物を発見する方法、ａ）次のものよりなる群から選ばれる構築物でトランスフェクトされた啼乳類細胞系であって、該構築物がその細胞系のゲノム中に安定に組み込まれ、かつその細胞系が非感染性ＨＩＶ粒子を安定に産生するものを取得し、１）請求項１記載の構築物、２）請求項２記載の構築物、および３）請求項３記載の構築物、ｂ）該細胞系へ該薬物を投与し、およびｃ）該投与細胞によるＨＩＶ粒子産生を測定し、該投与細胞によるＨＩＶ粒子産生の不存在と非投与細胞によるＨＩＶ粒子産生の存在との比較により、該薬物がＨＩＶ感染細胞によるＨＩＶ粒子の産生を阻害することか分かる工程。 20．請求項19記載の方法により発見される薬物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 // Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 7055−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:92） (72)発明者ヤング，リチャードエイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01890 ウィンチェスター，ソーミィルブルックロード５ (72)発明者フェインバーグ，マークビー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94114 サンフランシスコ，ワースストリート 43Ａ (72)発明者トローノ，ディディアーアメリカ合衆国カリフォルニア 92075 ソラーナビーチ，デルコート 457 (72)発明者バルチモアー，デイビッドアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク，ヨークアベニュー 1230

Claims

【特許請求の範囲】１．ＲＮＡパッケージに不可欠な配列の変更を有するＨＩＶ変異体ゲノムを含んでなる構築物であって、該変更が非感染性ＨＩＶ粒子の産生をもたらす構築物。２．ＲＮＡパッケージに不可欠な該配列が次のものよりなる群から選択されるものである請求項１記載の構築物、ａ．Ψ部位、ｂ．二つのＣｙｓＨｉｓボックスおよびそれらの介入配列（intervening sequen ce）をコードするｇａｇ遺伝子の領域、およびｃ．これらの組み合わせ。３．該Ψ部位配列の変更が次のものよりなる群から選ばれるものである請求項２記載の構築物、ａ．両端を含み、ヌクレオチド２９３−３３１の欠失、及びｂ．両端を含み、ヌクレオチド２９３−３１３の欠失。４．ｐＡ３ＨＸＢおよびｐＡ４ＨＸＢよりなる群から選ばれる請求項３記載の構築物。５．ｇａｇ遺伝子の該領域の該変更が次のものよりなる群から選ばれるアミノ酸配列変更を生ずるものである。請求項２記載の構築物、ａ．５’ＣｙｓＨｉｓボックスの最初の二つのシステインのチロシンによる置換、ｂ．３’ＣｙｓＨｉｓボックスの最初の二つのシステインのチロシンによる置換、ｃ．両ＣｙｓＨｉｓボックスの最初の二つのシステインのチロシンによる置換、およびｄ．両ＣｙｓＨｉｓボックスおよびそれらの介入配列の欠失。６．次のものよりなる群から選ばれるものである、請求項５記載の構築物、ａ．ｐＡ１５ＨＸＢ，ｂ．ｐＡ１４ＨＸＢ，ｃ．ｐＡ１４−１５ＨＸＢ，およびｄ．ｐ△ＣＨ１−２ＨＸＢ。７．ｐ△ＰＡＣ１およびｐ△ＰＡＣ−Ｈｙｇｒｏよりなる群から選ばれるものである請求項２記載の構築物。８．次のものよりなる群から選ばれる配列の変更を更に含んでなるものである請求項２記載の構築物、ａ．エンベロープ前駆体切断部位をコードする配列、ｂ．プライマー結合部位、およびｃ．これらの組み合わせ。９．該プライマー結合部位の変更が、図８に示すように、プライマー結合部位全体の１８塩基対欠失である、請求項８記載の構築物。１０．ｐ△ＰＡＣ２およびｐ△ＰＡＣ３よりなる群から選ばれるものである請求項８記載の構築物。１１．ＳＶ４０の複製起点を更に含んでなる請求項２記載の構築物。１２．該ゲノムがｎｅｆ遺伝子の代わりに選択マーカーを更に含んでなる、請求項２記載の構築物。１３．該選択マーカーがｎｅｏおよびｈｙｇｒｏよりなる群から選ばれるものである請求項１２記載の構築物。１４．ｐＲ７ｎｅｏなる構築物。１５．変異体ＨＩＶｅｎｖ遺伝子を更に含んでなる請求項２記載の構築物。１６．非感染性の、遺伝的に不活化されたＨＩＶ粒子を安定に産生する哺乳類細胞系。１７．該細胞系のゲノム中に安定に組み込まれた変異体ＨＩＶゲノムを含んでなる細胞系であって、該ＨＩＶゲノムがウイルスＲＮＡパッケージングに不可欠な配列の変更を有し、該変更が非感染性ＨＩＶ粒子の産生をもたらすものである、請求項１６記載の細胞系。１８．下記の工程を含んでなる、非感染性ＨＩＶ粒子を安定に産生する細胞系の生産方法、ａ．請求項２記載の構築物を取得し、ｂ．該構築物により哺乳類細胞系をトランスフェクトし、ｃ．トランスフェクトされた該細胞から安定なトランスフェクタントを選択し、およびｄ．該安定トランスフェクタントを収集する工程。１９．該構築物が次のものよりなる群から選ばれる変更を更に含んでなるものである請求項１８記載の方法、ａ．ｎｅｆ遺伝子の代わりに選択マーカーの置換、ｂ．天然ｅｎｖ遺伝子の代わりに変異体ＨＩＶｅｎｖ遺伝子の置換、およびｃ．これらの組み合わせ。２０．下記の工程を含んでなる非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分を生産する方法、ａ．請求項２記載の構築物を取得し、ｂ．該構築物により哺乳類細胞系をトランスフェクトし、およびｃ．該細胞系において該構築物を発現させ、それにより非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分を生産する工程。２１．請求項１７記載の細胞系の増殖を含んでなる、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分の生産方法。２２．請求項２０記載の方法により生産される、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分。２３．請求項２１記載の方法により生産される、非感染性ＨＩＶウイルス粒子（ virion）またはそれらの抗原活性部分。２４．生理学的に許容される賦形剤（vehicle）中に、請求項２０記載の方法により生産される、非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらの抗原活性部分を含有してなるワクチン。２５．生理学的に許容される賦形剤（vehicle）中に、請求項２１記載の方法により製造される、非感染性ＨＩＶ−１ウイルス粒子またはそれらの抗原活性部分を含有してなるワクチノ。２６．非感染性ＨＩＶ粒子またはそれらのタンパク質誘導体を含んでなる診断試薬。２７．下記の工程を含んでなる、哺乳類細胞によるＨＩＶウイルス粒子産生に影響を与える物質を発見する方法、ａ．請求項１７記載の細胞系を取得し、ｂ．該細胞系へ該物質を投与し、およびｃ．該投与細胞によるＨＩＶウイルス粒子の産生を測定し、該投与細胞による産生と非投与細胞による産生とを比較した場合の差により該物質が啼乳類細胞によるＨＩＶウイルス粒子の産生に影響を与えることが示される工程。２８．請求項２７記載の方法により発見される物質。２９．哺乳類細胞によるＨＩＶウイルス粒子の産生を阻害する請求項２８記載の物質。