JP3264281B2 - Ｈｉｖパッケージング配列を含むベクター、パッケージング不全ｈｉｖベクター及びその使用 - Google Patents

Ｈｉｖパッケージング配列を含むベクター、パッケージング不全ｈｉｖベクター及びその使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、パッケージ不全HIVプロウイルスを含むベ
クターと、HIVパッケージ配列及び移入されるべき遺伝
子を含むベクターと、HIVパッケージ不全細胞系を製造
するためのパッケージ不全ベクターの使用と、前記ベク
ター及び細胞系の使用とに係わる。最も好ましくは、HI
VプロウイルスはHIV−１プロウイルスである。
ヒト免疫不全ウイルス（HIV−I,HTLV−III,LAVまたは
HTLV−III/LAVとも称される）は、後天性免疫不全症候
群（AIDS）及び関連疾患の病因物質である〔Barre−Sin
oussi et al.,Science 220:868−871（1983）;Gallo
et al.,Science 224:500−503（1984）;Levy et
al.,Science 225:840−842（1984）;Popovic et a
l.,Science 224:497−500（1984）;Sarngadharan et
al.,Science 224:506−508（1984）;Siegal et a
l.,N.Engl.J.Med.305:1439−1444（1981）〕。この疾患
は、長期の無症状期間の後に免疫系及び中枢神経系が次
第に変性することを特徴とする。ウイルス研究によっ
て、複製は高度に調節され、組織培養においてＴリンパ
球のCD4陽性ヘルパーサブセットの潜伏感染及び溶菌感
染の両方が生じることが示されている〔Zagury et a
l.,Science 231:850−853（1986）〕。更に感染患者に
おけるウイルス発現は、免疫応答の回避を可能とするよ
うに調節されるらしい。HIV−Ｉの調節及びゲノム編成
の分子研究は、それが多数の遺伝子をコードすることを
示している〔Ratner et al.,Nature 313:277−284
（1985）;Sanchez−Pescador et al.,Science 227:4
84−492（1985）;Muesing et al.,Nature 313:450−
457（1985）;Wain−Hobson et al.,Cell 40:9−17
（1985）〕。
他の霊長目免疫不全ウイルスHIV−２及びサル免疫不
全ウイルス（SIV）も、gag、pol、env、tat、rev及びne
fといった同じ構造及び調節遺伝子の多くを有している
〔Guyader,M.,et al.,Nature 326:662−669（1987）;
Chakrabarti,L.,et al.,Nature 328:543−547（198
7）、これらの文献は参照により本明細書の一部を構成
するものとする〕。
レトロウイルスは典型的には、３つの亜族、即ちオン
コウイルス（oncoviruses）、スプーマウイルス（spuma
viruses）及びレンチウイルス（lentiviruses）のいず
れかに属するものと分類される。オンコウイルスによる
感染は典型的には悪性疾患に関係する。かかるウイルス
は典型的には、gag、pol及びenv遺伝子を含む約8,000〜
10,000ヌクレオチドの（＋）鎖RNAゲノムと、末端繰返
し配列（LTR）とを含む一重鎖を有する。オンコウイル
スは一般に腫瘍遺伝子を含む。一般に、スプーマウイル
スはin vivoで病原性ではないが、組織培養において泡
沫状細胞変性を誘導すると考えられている。レンチウイ
ルスによる感染は通常は緩慢であり、長期の潜伏期間の
後に慢性衰弱性疾患を惹起する。これらのウイルスは、
gag、pol及びenv遺伝子のほかに、調節機能を有する多
数の遺伝子をも有する。
ヒト免疫不全遺伝子（HIV）は、やはりゆっくりと感
染し、レンチウイルスと共通の構造特性を有するが故
に、レンチウイルスと分類されている〔Hasse,A.T.,Nat
ure 322:130−136（1986）参照〕。
全ての既知のレトロウイルスは、ウイルスRNAのビリ
オン中へのパッケージング、ターゲット細胞への侵入、
DNAプロウイルスを形成するためのウイルスRNAの逆転
写、及びターゲット細胞ゲノムへのプロウイルスの安定
な組込みを含む複製サイクルの特性を有する〔Coffin,
J.,J.Gen.Virol.42:1−26（1979）〕。複製コンピテン
トプロウイルスは少なくとも、調節LTRと、コアタンパ
ク質、プロテアーゼ、逆転写酵素/RNase H/インテグラ
ーゼ及びエンベロープ糖タンパク質をそれぞれコードす
るgag、pro、pol及びenv遺伝子とを含む〔J.Gen.Virol.
42,上掲〕。LTRは、組込み、転写及びポリアデニル化に
重要なcis作用配列を含む。
HIVは、gag、pro、pol及びenv遺伝子をそれぞれ他の
レトロウイルスと同様に有する〔Haseltine,W.A.,Journ
al of Acquired Immune Deficiency Syndrome
１:217−240（1988）〕。HIVは更に、ウイルス複製を調
節する遺伝子も有する。HIV−１ゲノムはvif、vpr、ta
t、rev、vpu及びnefタンパク質をコードする〔Haseltin
e,W.A.,Journal of Acquired Immune Deficiency
Syndrome,上掲〕。更に、HIVのLTRは、組込み、転写及
びポリアデニル化に重要なcis作用配列を含む。他のcis
作用シグナルは、新規のHIV遺伝子産物の幾つかによるH
IV配列の調節を行なう、〔Haseltine,W.A.,Journal of
Acquired Immune Deficiency Syndrome,上掲;Sodr
oski et al.,Science 231:1549−1553（1986）;Arya
et al.,Science 229:69−73（1985）;Sodroski et
al.,Science 227:171−173（1985）;Sodroski et
al.,Nature 321:412−417（1986）;Feinberg et a
l.,Cell 46:807−817（1986）;Wong−Staal et al.,
AIDS Res.and Human Retroviruses ３:33−39（198
7）、これらの文献は全て参照により本明細書の一部を
構成するものとする〕。5'主要スプライス供与部位とga
g遺伝子開始コドンの間の領域は、これまでに配列決定
された種々のHIV−１株においては高度に保存それてい
る〔Myers,G.,et al.,Theoretical Biology and Bi
ophysics,（1988）〕。
上記遺伝子のほとんどは、ウイルス生活環に必要な産
物をコードしている。例えばtat遺伝子は、HIV複製及び
遺伝子発現に不可欠な14kDのタンパク質をコードしてい
る〔Rosen,C.A.,et al.,Nature 319:555−559（198
6）;Sodroski,J.et al.,Science 227:171−173（198
5）;Arya et al.,Science 229，上掲;Sodroski et
al.,Science 229,上掲；及びDayton,A.et al.,Cell
44:941−497（1986）、これらの文献は全て参照によ
り本明細書の一部を構成するものとする〕。複製に必要
な別の遺伝子はrev遺伝子である〔Sodroski,et al.,Na
ture 321:412−417（1986）、かかる文献は参照により
本明細書の一部を構成するものとする〕。
ある種のオンコウイルスにおいて、5'末端LTRとgag遺
伝子開始コドンの間に位置する、ウイルスRNAをビニオ
ン中に効率的にパッケージするのに必要なcis作用配列
が確認された〔Bender,M.A.,et al.,J.Virol 61:1639
−1464（1987）;Katz,R.A.,et al.,J.Virol 59:163−
167（1986）;Mann,R.,et al.,Cell 33:153−159（198
3）;Pugatsch,T.,et al.,Virology 128:505−511（19
83）;Watanabe,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.79:598
6−5990（1983）;Eglitis,M.A.,et al.,Bio Techniqu
es ６:608−614（1988）、これらの文献は参照により
本明細書の一部を構成するものとする〕。上記配列のほ
かに、gag遺伝子と重なり合う配列が、Moloneyネズミ白
血病ウイルスによるウイルスRNAのキャプシド包込み（e
ncapsidation）の効率に寄与することが判明した〔Ada
m,M.A.,et al.,J.Virol 62:3802−3806（1988）;Bend
er,M.,et al.,J.Virol 61:1639−1646（1987）〕。所
定のレトロウイルスを使用して、真核細胞において、in
vivo及びin vitroで、ターゲット細胞のゲノム中に
遺伝情報が安定に導入された〔Cornetta,K.,Progress
in Nucleic Acids Research and Molecular Biol
ogy 36:311−322（1989）;Gilboa,E.,Biotechniques
４:504−512（1986）;Joyner.A.,Nature 305:556−558
（1983）;Mann.R.,et al.,Cell 33:153−159（198
3）〕。所望の遺伝子及びパッケージ配列を含むベクタ
ーは、所定の細胞中に侵入し得るビリオンを生成するパ
ッケージシグナル欠失ウイルスによって取り込まれた。
ビリオン粒子中へのレンチウイルスRNA（例えばHIV RN
A）のパッケージングに必要なシグナルは同定されてい
ない。
HIV−１を理解することに多大な研究が費やされてい
るが、このレトロウイルスの生活環は完全には理解され
ていない。
更に、かかるウイルスに対するワクチンを開発するこ
とにも多大な研究が当てられているが、これまでに成功
したという報告はない。これは、一部にはウィルスの抗
原としての活性部位の保存の欠如のため、また一部には
ウイルスタンパク質の機能的に重要な領域及び／または
失活ウイルス粒子が免疫原性に乏しいためである。
HIV感染個体を治療するために提案された多数の方法
は、HIV感染細胞だけでなく非感染細胞にも影響を及ぼ
す。
従って、HIVタンパク質を産生するが、ウイルスRNAが
ビリオン中にパッケージされないために致死性ではない
プロウイルスを得ることは極めて有効である。このパッ
ケージ不全（package−defective）プロウイルスベクタ
ーを使用すると、ウイルスのパッケージ機構を調査し、
更にこのパッケージ機能を妨げる方法を開発するのに使
用し得るパッケージ不全細胞系を生成することができ
る。重要なことには、このようなパッケージ無効プロウ
イルスによって産生されるビリオンは、ワクチンに、ま
た所望の遺伝子を哺乳動物細胞に効率的に導入するため
の系として使用することができる。
HIVターゲット細胞を選択的に標的とし、そうして所
望の産物をかかる細胞に導入し得るベクターを入手し得
ることも有効である。
発明の要約 本発明者らは、機能的HIV遺伝子産物を発現するHIVゲ
ノムに対応する十分な数のヌクレオチド（HIVヌクレオ
チド）は含むが、ウイルスRNAをビリオン中に効率的に
パッケージするための5'主要スプライス供与部位とgag
遺伝子開始コドンの間のHIVゲノムのヌクレオチドに対
応する十分な数のヌクレオチド（HIVパッケージ配列）
は含まないベクターを見い出した。このHIVパッケージ
配列は、5'主要スプライス供与部位とgag遺伝子開始コ
ドンとの間の領域（ヌクレオチド301〜319）に対応して
いるのが好ましい。この配列は、5'主要スプライス供与
部位のすぐ下流で且つgag開始コドンの14塩基上流のセ
グメントに対応するのがより好ましい。１つの実施態様
においては、これは、配列AAAAATTTTGACTAGCGGAを有す
る19塩基のセグメントである。
このベクターを使用して、予め選択された細胞系を形
質転換し、HIVパッケージ不全細胞系を得ることができ
る。全体としてはHIV gag、pol及びenv産物を発現する
のに必要なHIVヌクレオチドを含むが、各ベクター単独
では、これら３種全ての産物を発現するのに必要なHIV
ヌクレオチドは含まない、少なくとも２つのベクターを
使用して細胞系を形質転換するのが好ましい。更に各ベ
クターは、HIV RNAを効率的にパッケージするための5'
主要スプライス供与部位とgag遺伝子の間のHIVゲノムの
ヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドは含ま
ない。各ベクターは、HIV遺伝子に対応するヌクレオチ
ドの下流にLTR配列に対応する配列を含まないのがより
好ましい。各ベクターは異なるマーカー遺伝子を含むの
が好ましい。形質転換細胞系はHIVビリオンを発現する
が、HIV RNAをかかるビリオン中にパッケージすること
はできない。従ってあかるビリオンは、ワクチンとして
または所望の遺伝子産物をHIVに感染し得る種々の細胞
系に移入する方法として、抗体を生産するのに使用する
ことができる。
第２のベクターは、予め選択された遺伝子と、HIV RN
AをパッケージするためのHIVパッケージ配列に対応する
十分な数のヌクレオチド（HIVパッケージ配列）とを含
んでおり、HIVパッケージ配列によってパッケージされ
るべき十分な数のHIV LTRヌクレオチド（HIV LTR配
列）に対応する配列が両側にフランキング配置されてお
り、HIVパッケージ配列及びHIV LTR配列は同じHIVゲノ
ムに対応している。このベクターをパッケージ不全ベク
ターと一緒に使用して、予め選択された所望の遺伝子を
移入することができる。或いは、ベクターをHIV感染細
胞に与え、産生されるHIVビリオンによってパッケージ
することができる。HIV感染細胞は個体中に存在し得
る。HIVパッケージ不全ベクターとヘルパーウイルスと
してのHIVウイルスとを一緒に使用する組合せも記載す
る。パッケージ配列は、5'主要スプライス供与部位から
gag遺伝子の最も5'側部分内の部位までの領域に位置し
ている。
図面の簡単な説明 図１は、5'主要スプライス供与部位（SD）及び本発明
の１つの実施態様を表わすベクターpHXB P1における欠
失部位を示す、5'末端LTRからgag開始コドンまでのHIV
ゲノムの概略図である。
図2a〜図2eは、本発明の種々の実施態様を表わすベク
ターの概略図である。図2aはパッケージ不全ベクターHX
BΔP1である。図2bはパッケージ不全ベクターHXBΔP1Δ
envである。図2cはパッケージ不全ベクターpSVIIIenv3
−２である。図2dはパッケージ完全ベクターHVB（SL−
３−Neo）である。図2eはパッケージ完全ベクターHVB
（SL3−Neo）である。
図３は、２つのパッケージ不全ベクターHXBΔP1Δenv
及びpSVIIIenv3−２を示す、１つの好ましい実施形態の
概略図である。
図４は、本発明の種々の実施形態を表わすベクターに
感染させたJurkat細胞の培養におけるp24レベルを示す
グラフである。
図5aは、pHXBΔP1を用いてトランスフェクトしたCOS
−１細胞由来の35S標識ウイルスタンパク質を、AIDS患
者血清を用いて免疫沈降したオートラジオグラムであ
る。
図5bは、正常HIV−１形態のビリオン粒子を示す、pHX
BΔP1を用いてトランスフェクトしたCOS−１細胞の電子
顕微鏡写真である。
図６は、トランスフェクトまたは疑似トランスフェク
トしたCOS−１細胞由来の上清に暴露したJurkatT細胞溶
解物または上清由来の標識ウイルスタンパク質の免疫沈
降のオートラジオグラムである。
図７は、RNAドットブロットテストである。
図８は、G418耐性Jurkat細胞の全DNAのサザンブロッ
トを示すオートラジオグラムである。
発明の詳細な説明 本発明者らは、HIVパッケージ不全性のベクター及び
細胞系を製造し得ることを見い出した。本発明者らは、
HIVウイルスにおける5'主要スプライス供与部位とgag遺
伝子開始コドンとの間の領域が、HIV RNAをビリオン中
にパッケージするのに必要な配列を含むことを見い出し
た。所望のHIV産物を発現するHIVゲノム由来の十分な数
のヌクレオチドには対応するが、HIV RNAを効率的にパ
ッケージするための5'主要スプライス供与部位とgag遺
伝子開始コドンの間の領域に対応する十分なヌクレオチ
ド（HIVパッケージ配列）には対応しないヌクレオチド
配列を含む、パッケージ不全HIVプロウイルスを含むベ
クターを製造することができる。
上記配列は、HIV−１、HIV−２及びサル免疫不全ウイ
ルス（SIV）のゲノムに対応しているのが好ましい〔Rat
ner et al.,Nature 313，上掲;Sanchez−Pescador
et al.,Science 227，上掲;Muesing et al.,Nature
313,上掲;Wain−Hobson et al.,Cell 40，上掲;Gu
yader,M.et al.,Nature 326，上掲（1987）;Chakraba
rti et al.,Nature 328，上掲（1987）；及びHirsc
h,V.,et al.,Cell 49:307−319（1987）、これらの文
献は全て参照により本明細書の一部を構成するものとす
る〕。
対応するなる表現は、実質的な変更を含まない（cons
ervative）付加、欠失及び置換が許されることを意味す
る。
ベクターは、5'主要スプライス供与部位のすぐ下流で
且つgag遺伝子開始コドンのちょうど上流にあるセグメ
ントに対応するHIVパッケージ配列を含まないのが好ま
しい。典型的にはベクターは、gag開始コドンの約14塩
基上流から２塩基上流に広がるヌクレオチド（例えば上
流の14塩基または上流の５塩基）を含み得るが、それで
も尚パッケージ不全性である。１つの実施形態において
は、ベクターは、5'主要スプライス供与部位の約９塩基
下流から始まりgag開始コドンの約14塩基上流まで続く
ヌクレオチド配列を含まない。除外される必要のある塩
基の数は大幅に変えることができ、HIV−１における19
塩基対の欠失、即ちAAAAATTTTGACTAGCGGAの欠失（ヌク
レオチド301〜319）は、パッケージ能力の損失をもたら
すのに十分である。しかしながら、この領域におけるよ
り小さい欠失でもパッケージ効率の損失をもたらし得
る。実際、この領域における約５塩基対ほどの小さな欠
失がパッケージ能力を排除し得ることが推定される。従
って特定の欠失のサイズは、本明細書に基づいて当業者
には容易に決定され得る。
ベクターは、機能的HIV遺伝子産物を発現するHIVゲノ
ムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドを
含むHIVヌクレオチドセグメントを含むべきであるが、
上述したように、ウイルスRNAをビリオン中に効率的に
パッケージし得る5'主要スプライス供与部位とgag遺伝
子開始コドンの間の領域に対応する十分な数のヌクレオ
チドを含むべきではない。HIVパッケージ不全細胞系を
構築するために上記ベクターを使用する際には、かかる
細胞系が感染性HIVを産生しないことが好ましい。上記
パッケージ不全ベクターによって形質転換された細胞系
は、細胞がパッケージ不全性であるがために感染性は低
いが、それでも一部のRNAはビリオン中にパッケージさ
れ得る。従って、ウイルスRNAの一部がビリオン中にパ
ッケージされたとしても、パッケージされたものが複製
コンピテントウイルスとならないように、HIVヌクレオ
チドセグメントはHIVゲノム全体には対応しないことが
好ましい。
好ましくは、各々がHIVゲノムの異なる部分を含む
が、ウイルスパッケージに必要な配列は含まない、少な
くとも２つの異なるベクターを得ることが望まれる。１
つの細胞を各ベクターを用いて同時トランスフェクトす
ることにより、細胞は全てのHIV構造タンパク質を発現
し、ビリオンを産生し得る。１つ好ましい実施態様にお
いては、ベクターはHIV LTRに対応する配列を含まず、
プロモーター領域及び／または別のゲノムのポリアデニ
ル化配列に対応する配列を含む。特定のプロモーター及
びポリアデニル化配列の選択は、特定の宿主細胞に基づ
いて容易に行なわれ得る。配列が対応しないLTRは3'末
端LTRであるのが好ましい。例えば図３を参照された
い。
１つの実施態様においては、１つのベクターが、HIV
タンパク質の発現を可能とする配列をenvの上流に含
み、第２ベクターが残りのタンパク質の発現を可能とす
る。例えば一方のベクターは、最も5'側の遺伝子産物を
発現するためにenv遺伝子配列に対応する十分な数のヌ
クレオチドに対応するHIVヌクレオチド配列を、gag開始
コドン上流に含む。他方のベクターは、gag遺伝子配列
の下流にあって機能的env遺伝子配列を含む十分な数の
ヌクレオチドに対応するHIVヌクレオチドセグメントを
含む。このようなベクターは、本明細書の開示（図３）
に基づいて当業者はかかるウイルス中の既知の制限エン
ドヌクレアーゼ部位を利用することにより、報告されて
いるHIVゲノム配列から化学的に合成することもできる
し、多数の入手可能なHIVプロウイルスから誘導するこ
ともできる。異なるマーカー遺伝子を各ベクターに付加
すること、即ち予め選択した細胞系を上記種々のベクタ
ーで同時トランスフェクトし、両マーカーを含む細胞を
探すことにより、２つのベクターで同時トランスフェク
トされた細胞系を得ることが好ましい。このような細胞
は、全てのHIVタンパク質を産生し得る。しかしなが
ら、ビリオンは産生されても、全ウイルス配列に対応す
るRNAはかかるビリオン中にパッケージされていない。
所望であれば、例えばgag−polベクター、env及びvif/v
puベクターなど、２つ以上のベクターを使用することも
できる。
例えば、機能的LTR（好ましくは5'未満LTRに対応する
もの）をもたらす5'未満にあるHIV LTRの十分な数のヌ
クレオチドに対応するヌクレオチドと、LTRの下流にrev
遺伝子及びenv遺伝子に対応するヌクレオチドと、配列
がもう１つのLTRに対応していない3'末端に、SV40ウイ
ルスに対応するポリアデニル化配列のようなポリアデニ
ル化配列に対応する配列とを含むベクターを得ることが
できる（例えば図３のpSVIIIenv3−２）。第２ベクター
は他のHIVまたはSIV遺伝子を含み、且つパッケージ配列
中の欠失及びenv遺伝子における欠失を含む。このベク
ターも3'末端LTRは含まず、ポリアデニル化配列を含
む。例えば、HIV RNAをパッケージするためのHIVパッケ
ージ配列に対応する十分な数のヌクレオチドは含まない
が、機能的gag及びpol産物を発現するHIV gag及びpol遺
伝子の十分な数のヌクレオチドに対応する十分な数のヌ
クレオチドに対応するヌクレオチドセグメントを含むベ
クターを得ることができる。このベクターは、機能的ta
t遺伝子に対応する十分な数のヌクレオチドをも含むの
が好ましい。ベクターは、機能的envタンパク質をコー
ドする十分な数のヌクレオチドは含まない。ベクター
は、vpr、vpu、vifなどの機能的遺伝子産物を発現する
他のHIV調節遺伝子に対応するヌクレオチドをも含むの
がより好ましい。他のベクターの組合せも好ましくなり
得る。例えば、１つのベクターは、機能的gag遺伝子に
対応するのに十分な数のヌクレオチドは含まないが、機
能的pol及びenv遺伝子に対応するのに十分な数のヌクレ
オチドを含み、他のベクターは、機能的polタンパク質
をコードするのに十分な数のヌクレオチドは含まず、別
の機能的HIVタンパク質などをコードするのに十分なヌ
クレオチドを含む。
本明細書において、十分な数のヌクレオチドなる表現
は、要求される機能的能力が失われない限りは、付加、
欠失及び置換が容認される。例えばHIV RNAをパッケー
ジし得る機能的能力と言えば、得られたベクターはHIV
RNAをパッケージし得る配列を有さねばならない。
HIV−１は、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク
質を用いて模造（pseudotype）し得る〔Lusso,P.,et a
l.,Science 247:848−851（1990）〕。その結果、異な
るレトロウイルス由来の機能的env遺伝子に対応する十
分な数のヌクレオチドを含むベクターを作製することが
できる。このベクターの5'末端LTRは、env遺伝子と同じ
ゲノムのものであるのが好ましい。envパッケージ不全
ベクターに代えてこのようなベクターを使用してビリオ
ンを製造することもできる。このような変更によって、
得られたベクター系はより広範な宿主に使用することが
できる。
実質的に任意の細胞系を使用することができるが、哺
乳動物細胞系、例えばCV−１、Hela、Raji、RD、SW480
またはCHO細胞系を使用するのが好ましい。
ウイルス細胞産物の産生を増大するため、5'末端LTR
とは異なるプロモーターを使用する。即ち、5'末端LTR
を、特定の細胞系においてその制御下に遺伝子を優先的
に発現するプロモーターと置き換えることができる。例
えばCMVプロモーターは、CV−１またはHela細胞におい
て遺伝子を優先的に発現させる。使用する特定のプロモ
ーターは、使用する特定の宿主細胞に基づいて当業者に
よって容易に決定され得る。
ウイルス細胞産物のレベルを増大するため、ベクター
にエンハンサー配列を付加してHIV LTR及び／またはプ
ロモーターを増強することができる。特定のエンハンサ
ー配列は、宿主細胞系に従って当業者によって容易に決
定され得る。
ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスのもののよう
な、HIV LTRに使用するウイルスエンハンサータンパク
質を発現するベクターを付加して、ウイルス産物または
細胞トランスアクチベータータンパク質のレベルを増大
することができる。細胞トランスアクチベータータンパ
ク質としては、NFκ−Ｂ、紫外光応答因子や、当業者に
はよく知られた他のＴ細胞活性化因子を挙げることがで
きる。
全体としては全HIVゲノムを含む一連のベクターを使
用することにより、HIVビリオンと同一であるが、但しH
IV RNAを含まないビリオンを産生する細胞系を製造する
ことができる。ビリオンはかかる細胞から容易に得るこ
とができる。例えば細胞を培養して上清を回収する。所
望の用途に従って、ビリオンを含む上清を使用すること
もできるし、かかるビリオンを標準的な方法によって上
清から分離することもできる。典型的には、これには密
度勾配遠心分離、過などが含まれる。
このような弱毒化ビリオンは、ワクチンを製造する上
でかなり有効である。このビリオンを使用してHIVビリ
オンに対する抗原応答を引き出すことができ、かかるビ
リオンは、ビリオン中にウイルスRNAを含まないこと以
外は実際のHIVビリオンと同一であるため、製造された
ワクチンは特に有効となり得る。
また、かかるビリオンを使用して該ビリオンに対する
抗体を産生させることができ、この抗体は、例えばビリ
オンをスクリーニングしたり、ビリオンに対するターゲ
ット系を開発するなど、種々の目的で使用することがで
きる。
更に、かかるHIVパッケージ不全細胞系は所望の遺伝
子、例えば異種遺伝子を哺乳動物細胞中に導入する手段
として極めて有効となり得る。
かかるビリオンは、所望の遺伝配列を、HIVに感染可
能なターゲット細胞中にパッケージするのに極めて効率
的な方法として使用し得る。これは、HIVウイルスのパ
ッケージヌクレオチド（HIVパッケージ領域）に対応す
る十分な数のヌクレオチドと、所定の遺伝子と、前記パ
ッケージ配列及び所定の遺伝子にフランキング配置す
る、パッケージング、逆転写、組込み及び遺伝子発現の
ためのLTR内及びその近傍に由来する十分な数の配列に
対応する配列とを含むヌクレオチドセグメントを含むベ
クターを調製することにより行われる。使用するパッケ
ージング領域は、少なくとも5'主要スプライス供与部位
とgag開始コドンのちょうど上流との間の領域に対応す
るのが好ましく、5'主要スプライス供与部位とgag遺伝
子内のBal Ｉ部位（HIV−１においては2202）との間の
領域に対応するのがより好ましい。
例えば、ターゲット細胞中でパッケージ、逆転写、組
込み及び発現される十分な数のHIV−１配列としては、L
TRのU3、Ｒ及びU5配列、パッケージ配列、並びに（逆転
写に必要とされる）LTRにフランキング配置する幾つか
の配列を挙げることができる。5'末端LTRからは、HIV−
１においては＋１から183まで伸びるＲ及びU5領域が含
まれる。逆転写及びパッケージングに必要な5'末端LTR
にフランキング配置する配列は183から約335まで伸びて
いる。理論に制約されるつもりはないが、本出願人ら
は、gag遺伝子由来の追加配列をベクター中に含める（B
al Ｉ部位，ヌクレオチド2202まで）とパッケージング
効率を増強すると考えている。含まれるべき3'末端LTR
由来の領域及びそのフランキング配列は約8645から約92
13（U3及びＲ領域）に伸びている。HIV−２またはSIVを
ベースとするベクターにおいても類似の領域が含まれ
る。
このベクターを使用してHIVパッケージ不全細胞の１
つをトランスフェクトする場合、ビリオン中にパッケー
ジされるのはこのベクター由来のヌクレオチド配列であ
る。かかる“HIVがパッケージされた”遺伝子は、HIVに
感染可能な細胞を標的とし得る。この形質転換方法は現
行の方法よりもはるかに効率的であると推定される。更
に、適当な遺伝子を選択することにより、HIV感染方法
をモニターすることもできる。
例えばベクターは、発現、逆転写及び組込みされるべ
きHIV−１、HIV−２またはSIVの5'及び3'の両末端LTRに
対応する十分な数のヌクレオチドと、パッケージされる
べきHIVパッケージ配列、例えば5'主要スプライス供与
部位とgag開始コドンのちょうど上流（例えばヌクレオ
チド381）の間のセグメントに対応する十分な数のヌク
レオチドとを含み得る。ベクターは更に、機能遺伝子
（例えば遺伝子セグメント）を産生するように移入され
ることが望まれる遺伝子の十分な数のヌクレオチドを含
む。遺伝子は任意の所望の遺伝子、例えばネオマイシン
ホルホトランスフェラーゼ（NeoR）とすることができ
る。“遺伝子”は、trans優性インヒビター、アンチセ
ンスRNA、触媒RNA（catalytic RNAs）または可溶性CD4
誘導体のような、HIVの複製または組込みに悪影響を及
ぼす産物を発現するのがより好ましい。このような遺伝
子によって、本発明のベクターを使用してHIVターゲッ
ト細胞を標的とすることができる。LTR配列自体もプロ
モーターとして作用し得るが、所望の遺伝子に対するプ
ロモーターを含むことが好ましい。実質的に任意のプロ
モーターを使用し得る。遺伝子が移入された宿主細胞中
での遺伝子の発現に容易にするプロモーターを使用する
ことが好ましい。好ましいプロモーターとしては、SL−
３、ネズミレトロウイルスLTRなどのウイルスプロモー
ターを挙げることができる。エンハンサー配列をベクタ
ー中に使用することも好ましい。また、遺伝子に対する
ポリアデニル化配列を含むことも好ましい。任意のポリ
アデニル化配列、例えばSV−40ポリアデニル化配列に対
応する配列を使用することができる。所望の遺伝子は本
発明のベクター中に、LTRに対してセンスまたはアンチ
センスのいずれかの方向で挿入することができる。ベク
ターは、複数の該当遺伝子を発現し得るよう１つ以上の
遺伝子または疑似配列を含み得る。
このベクターは、上述のパッケージ不全ベクターと一
緒に使用するのが好ましい。このような状況において
は、パッケージ効率を助長するためにパッケージ不全ベ
クターのゲノムに対応するベクター中にHIV LTRを使用
することが好ましい。しかしながら、パッケージ不全ウ
イルスと一緒に使用することに加えて、このベクター
は、遺伝子移入のためにヘルパーウイルスと一緒に使用
することもできる。例えば、AIDSに感染した個体を治療
するために遺伝子を送達したい場合は、このベクターを
その個体中に挿入すると、ベクターはその個体内で産生
されたHIVビリオン中に取り込まれる。これで、所望の
遺伝子を適当なターゲット細胞に送達するのが容易にな
る。即ちこれを使用して、ウイルス複製に不可欠なHIV
−１機能を阻害することを目的とされたtrans優性イン
ヒビター、アンチセンスRNA、触媒RNAまたは可溶性CD4
誘導体を送達することができる。上述のパッケージ不全
ベクターまたは感染個体においてHIVウイルスと組み合
わせたかかるパッケージ不全ベクターを使用することに
より、これらの材料を送達することもできる。
更に、細胞はHIV細胞タンパク質を発現するがRNAをパ
ッケージしないので、かかるHIVパッケージ不全細胞系
を使用して、in vivo及びin vitroの両系においてHIV生
活環の種々の段階を研究することができる。
本発明を以下の実施例によって更に説明する。かかる
実施例は、本発明を理解する上で助けとなるように与え
るものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
HIV−１の5'末端LTRとgag遺伝子との間の領域を図１
に示す。この図は、5'主要スプライス供与部位（SD）及
び後述するベクターpHXBΔP1中の欠失部位を示してい
る。この領域中の19塩基対の欠失は、Fisher,A.G.,et
al.,Nature 316:262−265（1985）のプラスミドpHXBc2
上に含まれる感染性HIV−１プロウイルスクローンにお
いて生成した。このプラスミドは更にSV40複製開始部を
含んでおり、COS−１細胞中で遺伝子を効率的に発現し
得る。Kunkel,T.A.,et al.,Methods in Enzymology
154,367−382（1987）に記載されている特定部位突然
変異誘発によって突然変異を生じさせ、DNA配列決定〔S
anger,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463−5467
（1977）〕によって配列を確認した。この突然変異プラ
スミドをpHXBΔP1と命名した。
更にenv遺伝子において、Bgl II部位間にフレーム外
欠失部（ヌクレオチド6620〜7199）を生成した。図2b参
照。SV40由来のポリアデニル化シグナルを、BamH I部位
（ヌクレオチド8053）から始まるpHXBΔP1プロウイルス
の3'末端と置き換えて、HXBΔP1Δenvを作製した。pSVI
IIenv3−２プラスミドは、SV40由来のポリアデニル化シ
グナルによってHIV−１ rev及びenv遺伝子をコードす
る。pSVIIIenv3−２プラスミドにおいては、HIV−１のr
ev及びenv遺伝子はHIV−1 LTRの制御下にある。このベ
クターの構築は既に記載されている〔Sodroski,et a
l.,Nature 321:412−417（1986）及びSodroski,et a
l.,Nature 322:470−474（1986）参照，これらの文献
は参照により本明細書の一部を構成するものとする〕。
使用したプラスミドの関連部分のマップを図２に示す。
HXBΔP1及びHXBΔP1Δenvベクターにおいては、HIV−１
遺伝子の位置を、前述の19塩基対の欠失部の位置（Δ19
bp）と一緒に示す。HXBΔP1Δenv及びpSVIIIenv3−２に
おいては、rev応答エレメント（RRE）及びSV40ポリアデ
ニル化シグナル（SV40 polyA）を示す。
COS−１細胞は、10％ウシ胎児血清（Gibco,Long Isl
an NY）及び抗生物質を補充したダルベッコ改良イーグ
ル培地DMEM（Hazelton Biologics,Lenexa）中に維持さ
れていた。Jurkat細胞は、10％ウシ胎児血清及び抗生物
質を含みRPMI 1640内で培養維持した。Jurkat細胞は、
感染の２週間前にB.M.Cyclin Ｉ及びII並びにヒト血清
を用いて、マイコプラズマに対する予防措置がとられて
いた。HXBc2（gag+、pro+、pol+、vif+、vpr-、vpu-、t
at+、rev+、env+、nef-）プロウイルスを全てのプラス
ミド及びベクター構築物に使用した。
ウイルスタンパク質発現及びビリオン産生における突
然変異の影響を評価するため、COS−１細胞をpHXBc2及
びpHXBΔP1プラスミドを用いてDEAE−デキストラン法
〔Lopata et al.,Nucl.Acids Res.12:5707−5717（1
984）;Queen and Baltimore,Cell 33:741−748（198
3）;Sodroski,J.,et al.,Science 231:1549−1553（1
986）、これらの文献は参照により本明細書の一部を構
成するものとする〕によってトランスフェクトした。ト
ランスフェクションの48時間後に35Sシステインを用い
て放射性標識したCOS−１細胞溶解物及び上清〔Sodrosk
i,J.,et al.,Science 231，上掲〕を19501 AIDS患者
血清を用いて沈澱させた。細胞溶解物中で検出されたウ
イルスタンパク質の合計レベルは、野生型HXBc2及びHIV
パッケージ不全HVBΔP1を含むベクターに匹敵してい
た。図5A参照。この図は、DNAなし（レーン１及び
４）、10μg pHXBc2（レーン２及び５）または10μg pH
XBΔP1（レーン３及び６）を用いてトランスフェクトし
た後のCOS細胞の溶解物（レーン１〜３）及び上清（レ
ーン４〜６）由来の35S標識ウイルスタンパク質を、195
01患者血清を用いて免疫沈降したものを示している。細
胞溶解物において検出された全ウイルスタンパク質レベ
ルは、HXBc2またはHXBΔP1のいずれかによってトランス
フェクトした細胞に匹敵した。COS−１細胞の上清から
沈降したウイルスタンパク質レベルは、HXBc2よりもHXB
ΔP1の方がわずかに低かった。pHXBΔP1を用いてトラン
スフェクトしたCOS−１細胞の上清において測定された
逆転写酵素（RT）活性量は、HXBc2ベクターを用いてト
ランスフェクトした細胞において測定されたものの60％
であった（データは示さない）。pHXBΔP1を用いてトラ
ンスフェクトしたCOS−１細胞を、トランスフェクトし
た48時間後に固定し、電子顕微鏡によって調査した。正
常HIV−１形態の出芽形態を含むウイルス粒子が認めら
れた。図5Bは、正常HIV−１形態のウイルス粒子を示
す、pHXBΔP1でトランスフェクトしたCOS−１細胞の電
子顕微鏡写真である。
HIV−１複製に及ぼすHXBΔP1突然変異の影響を評価す
るため、pHXBc2及びpHXBΔP1でトランスフェクトしたCO
S−１細胞由来の上清を過し（0.2μ）、RTを測定し
た。突然変異ウイルス及び野生型ウイルスの同量のRT活
性を含む上清をJurkatヒトＴリンパ球に加えた。Jurkat
培養液と疑似感染培養液を、培地を３日おきに替えなが
ら維持した。時間を置いて、Jurkat細胞のアリコートを
標識し、19501AIDS患者血清を用いて免疫沈降すること
によりHIV−Ｉタンパク質の発現を評価した。図６は、
疑似トランスフェクト（レーン１、４、10、13及び16）
したかまたはpHXBc2（レーン２、５、８、11、14及び1
7）もしくはpHXBΔP1（レーン３、６、９、12、15及び1
8）でトランスフェクトしたCOS−１細胞由来の上清に暴
露した、JurkatT細胞溶解物（レーン１〜３、７〜９及
び13〜15）または上清（レーン４〜６、10〜12及び16〜
18）由来の標識ウイルスタンパク質の免疫沈降を示す。
感染後７日目（レーン１〜６）、14日目（レーン７〜1
2）及び21日目（13〜18）にJurkat細胞を調査した。HXB
ΔP1に暴露したJurkat培養液は、野生型ウイルスpHXBc2
に暴露したものと比較して、ウイルスタンパク質産生に
おいて著しい遅延及びレベル低下を示した。HXBΔP1に
よってトランスフェクトしたヒトＴリンパ球におけるウ
イルス複製は、HXBc2によってトランスフェクトした細
胞と比較して著しい減衰が見られた。
上記培養液由来の上清を0.2μフィルターで過し、
等量の逆転写酵素活性を、12000×ｇ、20℃で１時間遠
心することによりペレット化した。ウイルスペレットを
バナジルリボヌクレオチドの存在下にNP40によって溶解
し、ウイルス希釈物をニトロセルロースフィルター上に
ドットブロットした。ドットブロットする前に試料の一
部を水酸化ナトリウムで処理した（5M,60℃で15分
間）。フィルターを、HIV−1 gag及びenv遺伝子配列か
らなるDNAプローブとハイブリダイズし、洗浄し、Mania
tis,T.,et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Ha
rbor Laboratory（1982）に既に記載されているように
オートラジオグラフ処理した。野生型HXBc2ウイルスに
対しては、1000逆転写酵素単位の過後上清をブロッテ
ィングした後にRNAに特異的なシグナルが検出され得る
（図示なし）。HXBΔP1に対しては、５×104逆転写酵素
単位の上清さえも検出可能なシグナルを与えなかった。
図７は、Jurkat培養液由来の過後の上清をブロッティ
ングした後に水酸化ナトリウム処理をしない（カラム
１）及びした（カラム２）RNAドットブロットである。
上清は、HXBΔP1においては５×104cpm（Ａ行）、HXBc
においては５×104cpm（Ｂ行）またはHXBc2においては
１×105cpm2（Ｃ行）の逆転写活性を含んでいた。これ
らの結果は、本発明のパッケージ不全ウイルスベクター
を用いてトランスフェクトした細胞においてウイルス特
異的RNAをビリオン中にパッケージングする効率が野生
型ウイルスの２％未満であることを示している。
上記結果は、HIV−１の5'末端LTRとgag遺伝子との間
の領域が、ウイルスRMAをビリオン中にパッケージング
するのに重要であることを示している。この領域内の突
然変異は、トランスフェクション後のタンパク質及びビ
リオン粒子を産生するプロウイルスの能力への影響は最
小であるが、ヒトCD4陽性リンパ球系におけるビリオンR
NAのレベルを著しく低下させ、ウイルス複製を減衰させ
る。HIV−１は、培養CD4陽性細胞中で無細胞伝播及び細
胞対細胞伝播によって複製し、後者は感染細胞と非感染
細胞の接触を含む〔Fisher,A.G.,et al.,Nature 316:
262−265（1985）;Sodroski,J.,et a.,Science 231:1
549−1553（1986）;Strebel,K.,et al.,Nature 328:7
28−730（1987）〕。
HIV−１パッケージ配列に基づくベクターを構築し
た。
pHVB（SL3−Neo）センス（pHVB（SL3−Neo））及びpH
VB（SL3−Neo）アンチセンス（PHVB（SL3−Neo））プラ
スミドは、SV40由来のポリアデニル化シグナルと一緒
に、SL3−３ネズミ白血病ウイルスLTRの制御下のneo遺
伝子のコーディング配列を含む。pHVB（SL3−Neo）セン
ス及びpHVB（SL3−Neo）アンチセンスプラスミドは、5'
及び3'末端の完全HIV−1 LTRと、5'末端LTR近傍のフラ
ンキングウイルス配列ヌクレオチド183〜381及び3'末端
LTRに隣接するヌクレオチド8504〜8661とを含む。HXBc2
プロウイルス（ヌクレオチド382〜8593）中の主要欠失
部の境界に、固有のBamH I部位を挿入し、SL3 LTR−Neo
転写単位を、HIV−1 LTRに対してセンス（pHXB（SL3−N
eo））またはアンチセンス（pHVB（SL3−Neo））の向き
でこの部位中にクローニングした。全てのプラスミドは
SV40複製開始部を含んでいた。図２参照。これらのベク
ターは、ウイルスRNAをパッケージするのに重要とな
る、欠失によって示した19塩基対の配列を含んでいる。
ベクターはHIV−１遺伝子産物を全くコードし得ない。
ベクターは、Ｔリンパ球において効率的なプロモーター
として機能するSL3−３ネズミレトロウイルスLTRがネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ（NeoR）遺伝子の発
現を促進する挿入物を含んでいる。Neo転写のためのポ
リアデニル化シグナルはSV40由来の配列によって与えら
れる。図２のプラスミド上の番号は、プロウイルス／挿
入物の境界を形成するHXBc2配列のヌクレオチドを示し
ている。SL3−３ネズミ白血病ウイルスLTRはSL3で示さ
れている。主要5'スプライス供与部位（SD）の位置及び
gag遺伝子開始コドン（gagATG）も図に示す。
50％集密COS−１細胞を、HXBΔP1＋HVB（SL3−Neo）
センス系;HXBΔP1＋HVB（SL3−Neo）アンチセンス;HVB
（SL3−Neo）センス＋pHXBΔP1Δenv＋pSVIIIenv3−２
系；及びHVB（SL3−Neo）アンチセンス＋pHXBΔP1Δenv
＋pSVIIIenv3−２系に対するプラスミドDNAを各々10μg
/ml使用し、リン酸カルシウム法〔Chen,c.,et al.,Mo
l.Cell.Biol.７:2745−2752（1987）〕によってトラン
スフェクトして組換えウイルスを生成した。トランスフ
ェクトした12時間後、COS−１細胞溶媒液中に、FCS及び
抗生物質を含むDMEMを入れた。トランスフェクション72
時間後に、COS−１上清を回収し、0.2μｍフィルター
（Millipore）で過した。COS−１上清中のp24レベル
を、p24ラジオイムノアッセイ（Dupont）によって決定
した。
ウイルスに感染されるべきJurkat細胞を６ウェル培養
プレート内に、１ウェル当たり2.5mlの完全培地中2.5×
105細胞で播種した。トランスフェクトしたCOS−１上清
の10倍までの段階的希釈液を各ウェルに与え、ウイルス
をJurkat細胞に37℃で４時間吸着させた。その後、Jurk
atをペレット化し、完全培地中に再懸濁させた。24時間
後、培地を、G418（Gibco,NY）を活性濃度0.8mg/mlで含
む完全培地で置き換え、細胞を24ウェル培地プレート中
に1.0×104細胞／ウェルで分配した。培地は４日ごとに
取り替えた。生存可能なG418耐性細胞集団を含む陽性ウ
ェルを同定し、感染の18日後に培養液中でカウントし
た。感染Jurkat細胞培地におけるp24レベルを、感染の
５、10及び20日後にラジオイムノアッセイによって測定
した。更に、感染Jurkat細胞によるシンシチウム形成レ
ベルを、感染の５〜20日後の培養液中で測定した。
G418耐性Jurkat細胞をクローニングするため、細胞を
リン酸緩衝塩類溶液中で洗浄し、培地100μｌ当たりの
生存可能細胞濃度が0.5となるまで希釈した。100μｌの
細胞懸濁液を、96ウェル培養プレートの各ウェル中に分
配した。単一細胞を含むウェルを位相差顕微鏡によって
同定し、個々の細胞を、0.8mg/ml G418を含む完全培地
中で107細胞まで増殖させた。
クローンからゲノムDNAを調製し、SacIを用いて消化
し、Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98:503−517（1975）に
よって既に記載されているようにサザンブロットした。
サザンブロットを、オリゴヌクレオチドを用いてランダ
ムプライミングすることにより標識したSL3 LTR、neo遺
伝子及びSV40ポリアデニル化配列を含む3.3kbのフラグ
メントとハイブリダイズした。サザンブロットを高緊縮
条件下で洗浄した。
pHXBΔP1プラスミド及びHIV−１ベクターを上述のご
とくCOS−１細胞中に同時トランスフェクトした。表１
は、トランスフェクションの３日後のトランスフェクト
細胞の上清中でHIV−１のgag p24タンパク質が検出可能
であることを示している。過したCOS−１上清を段階
的に希釈し、Jurkatリンパ球と一緒にインキュベート
し、G418耐性について選択した。生成されたG418耐性Ju
rkat細胞の数（表１）は、COS−１上清1ml当たり102〜1
05であり、HVB（SL3−Neo）アンチセンスベクターはHVB
（SL3−Neo）センスベクターよりも高い力価を与えた。
DNAを含まないもの、ベクターのみまたはpHXBΔP1プラ
スミドのみを用いてトランスフェクトしたCOS−１細胞
から誘導した上清と一緒にインキュベートしても、G418
耐性Jurkat細胞は生成されなかった。
HXBΔP1プロウイルスは完全には複製不全性でなかっ
た。従って、ウイルスp24抗原の産生及びシンシチウム
の形成を調査してG418耐性Jurkat細胞中の感染性ウイル
スの量を測定した。図４は、Jurkat培養液の上清中でHI
V−1 p24抗原が検出可能であったことを示している。シ
ンシチウム形成は肉眼で確認でき、かかる培養液中で経
時的に増加しており、これは、ターゲット細胞中でのHI
V−１エンベロープ糖タンパク質の発現を示すものであ
る。かかる培養液中の有意な細胞変性効果の誘導は、G4
18耐性Jurkat細胞のクローニングを困難にしており、更
に、複製コンピテントウイルスがターゲット細胞中に存
在することを示している。更に表２も参照されたい。
HXBΔP1プロウイルスに代えて、HIV−１タンパク質を
コードする上述の２つの他のプラスミドを使用した。pH
XBΔP1Δenvプラスミドは、その中のプロウイルスがenv
遺伝子中に欠失部を含み且つ3'末端LTRの代わりにSV40
由来のポリアデニル化シグナルを含むことを除き、pHXB
ΔP1プラスミドと同一である。pSVIIIenv3−２プラスミ
ドは、HIV−1 LTRの制御下にあるHIV−１のrev及びenv
の両遺伝子を、SV40由来のポリアデニル化シグナルによ
ってコードする。これら２つのプラスミドをpHXB（SL3
−Neo）センスまたはpHVB（SL3−Neo）アンチセンスプ
ラスミドと一緒にCOS−１細胞中に上述の方法によって
同時トランスフェクトすると、トランスフェクションの
３日後に上清中でp24gag抗原が検出され得る（表１）。
この上清をJurkatリンパ球と一緒にインキュベートし、
G418を用いてJurkat細胞を選択すると、組換えウイルス
レベルは、過後の上清1ml当たり104〜106コロニー形
成単位であることが判った。これらの実験において、実
験間で有意な差は認められず、３種の個別の実験におい
て、HVB（SL3−Neo）センスとHVB（SL3−Neo）アンチセ
ンスとでも有意な差は認められなかった。
上記G418耐性Jurkat細胞をクローニングし、DNAの単
離に使用した。ゲノムDNAをSac Iを用いて消化すると、
Sac Iはベクターを各HIV−1 LTRにおいて１度だけ切断
して3.3kbフラグメントを生成した。SL−3 LTR由来の配
列と、NeoR遺伝子のコーティング配列と、SV40ポリアデ
ニル化シグナルとを含むフラグメントをプローブとして
使用した。HVB（SL3−Neo）センス及びHVB（SL3−Neo）
アンチセンスの両ベクターから誘導したクローンは、対
照Jurkat細胞には見られない3.3kbの単一ハイブリダイ
ズバンドを示した。図８参照。これは、HVB（SL3−Ne
o）センス及びHVB（SL3−Neo）アンチセンス配列が、再
構成または組換えされずにG418耐性Jurkat細胞中にトラ
ンスフェクトされたことを示している。
細胞上清中においてp24gagタンパク質を測定し、最初
の感染から40日後までシンシチウムを評価した。調査し
た全てのクローンにおいて、シンシチウムは認められ
ず、p24抗原は検出不可能であった。表２参照。これ
は、かかるG418耐性Jurkat細胞中に複製コンピテントウ
イルスが存在しなかったことを示している。
上記結果は、パッケージ不全HXBΔP1プロウイルス
は、HIV−１ベクターをJurkatリンパ球に移入するのに
必要なtrans作用ウイルス機能を提供し得ることを示し
ている。ウイルスRNAをパッケージするのに重要である
と定義された配列を含むHIV−1 LTR及びそのフランキン
グ配列は、パッケージング、逆転写及び組込みを可能と
するのに十分であると考えられる。各々が3'末端LTRを
欠いた２つの個別のプラスミド上にtrans作用機能を与
えることにより、複製コンピテントウイルスの見掛けの
不在下にもベクター配列の移入が起こる。このヘルパー
ウイルス非含有物における組換えウイルスの力価は、恐
らくは複製コンピテントウイルスによる有意な細胞変性
効果の誘導のために、複製コンピテントウイルスの存在
下に認められるもと比較して向上していると思われる。
複製コンピテントウイルスの存在下にHVB（SL3−Neo）
アンチセンスベクターに対して認められる力価の方がHV
B（SL3−Neo）センスベクターと比較して高いのは、一
部には、ヘルパーウイルス複製におけるSL3プロモータ
ーからのアンチセンス方向読取り転写の抑制効果に関係
し得る。
本明細書に記載のHIV−１ベクターは、注目の個々の
遺伝子をHIV−１ターゲットとなり得る細胞中に導入す
る単純で効率的な手段を提供する。HIV−１は他のウイ
ルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて模造し得るこ
とを示す最近の知見のもとに、かかるベクターに対して
より多くの宿主が使用可能となっている。複数遺伝子産
物をコードする野生型HIV−１ゲノムの能力があれば、
かかるベクターは、ターゲット細胞中で注目の複数遺伝
子を発現するように容易に適合し得る。
上記開示のもとに当業者は、本発明の概念から離れる
ことなく、本発明の種々の変形態様及び本明細書に記載
の特定の実施態様からの派生態様を製造し得、本発明
は、請求項の範囲及び主旨によってのみ制限される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘイゼルテイン，ウイリアム・エイ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02140、ケンブリツジ、マウント・バー ノン・ストリート・24 (72)発明者 ポズナンスキイ，マーク アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02139、ケンブリツジ、フランクリン・ ストリート・422 (72)発明者 リバー，アンドリユー イギリス国、ピンナー・ミドルセツク ス・エイチ・エイ・52・ビー・エツク ス、キヤツトリンズ・レイン・102 (56)参考文献 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（1989）Ｖｏｌ．63, Ｎｏ．９，ｐ．4085−4087 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（1990）Ｖｏｌ．64, Ｎｏ．５，ｐ．1920−1926 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも一つの第１ベクター及び一つの
    第２ベクターからなる少なくとも２以上のベクター群で
    あって、 （ａ）第１ベクターはプロモーター及びポリアデニル配
    列に連結されたHIVgag蛋白質をコードする核酸を含み； （ｂ）第２ベクターはプロモーター及びポリアデニル化
    配列に連結されたHIV以外の機能性env遺伝子をコードす
    る核酸を含み； 該ベクター群は、組み合わされて発現するとHIVキャプ
    シドの周囲にHIV以外のエンベロープ蛋白質を含む模造
    ビリオンを形成し、HIVのgag、env及びpol蛋白質をコー
    ドする核酸を一のベクター上に含まず、5'主要スプライ
    ス供与体とHIVのRNAをパッケージするためのgagとの間
    のHIVパッケージング領域と称されるHIVゲノム核酸を含
    まず、組み合わされて発現したときに複製能を有するウ
    イルスを形成しないベクター群。
  2. 【請求項２】組み合わされて発現すると、HIVpol蛋白質
    を発現する、請求項１に記載のベクター群。
  3. 【請求項３】HIVpol蛋白質をコードする核酸が第１ベク
    ター上に存在する、請求項１に記載のベクター群。
  4. 【請求項４】プロモーター及びHIVのRNAをHIVウイルス
    粒子へとパッケージするHIVパッケージング配列に連結
    した異種の遺伝子を含む第３ベクターをさらに含む、請
    求項１に記載のベクター群。
  5. 【請求項５】HIVパッケージング配列が5'主要スプライ
    ス供与体とgag遺伝子との間に相当する配列である、請
    求項４に記載のベクター群。
  6. 【請求項６】少なくとも一つのベクターがレトロウイル
    スベクターである、請求項４に記載のベクター群。
  7. 【請求項７】HIVパッケージング配列が5'主要スプライ
    ス供与体の９塩基下流からgag転写開始コドンの約14塩
    基上流に続く領域に相当する、請求項４に記載のベクタ
    ー群。
  8. 【請求項８】HIVパッケージング配列がAAAAATTTTGACTAG
    CGGAに相当する、請求項４に記載のベクター群。
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