Verfahren zur Quantifizierung der antiviralen Wirkung antiviraler Wirkstoffe.
Beschreibung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Findung antiviraler Wirkstoffe, ein Verfahren zur Quantifizierung der antiviralen Wirksamkeit antiviraler Wirkstoffe, ein Verfahren zur Bestimmung von patientenspezifischen Resistenzen gegen antivirale Wirkstoffe, antivirale Wirkstoffe sowie einen besonders geeigneten replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektor zur Durchführung der vorstehenden Verfahren.
Technologischer Hintergrund der Erfindung
Die Entwicklung antiviraler Therapeutika verläuft in mehreren Schritten. Zunächst werden Virusproteine definiert, deren Hemmung die Virusvermehrung blockieren würde. In vielen Fällen werden anschließend, wenn möglich, diese Enzyme gentechnisch hergestellt und biochemisch angereichert und aufgereinigt . Es wird ein enzymatisches Testsystem entwickelt, in dem die Wirksamkeit zahlreicher chemischer Substanzen getestet wird. Substanzen, die die Enzymaktivität hemmen, werden, wenn möglich, anschließend auch auf ihre Wirksamkeit auf das Gesamtvirus untersucht. Dazu wird ein definierter Virusstamm in Gegenwart der zu testenden Substanzen auf Zellkultur angezüchtet und der
Grad der Virusvermehrung gemessen. Solche Untersuchungen sind Voraussetzung für weitere Analysen in komplizierteren und aufwendigeren Testsystemen, wie den Versuchstieren.
Es gibt mehrere wesentliche Nachteile der vorstehend beschriebenen phänotypischen Testung antiviraler Substanzen. Diese Nachteile liegen primär in den Eigenschaften der zu untersuchenden Viren begründet. Sie können deshalb wie folgt unterteilt werden: 1. Einige Viren haben ein hohes Infektionspotential und die
Kultivierung in Zellkultur setzt die Mitarbeiter einem hohen Infektionsrisiko aus. Deswegen sind zahlreiche und aufwendige Sicherheitsmaßnahmen notwendig, die den Prozess kostenintensiv machen. Dazu gehören alle Viren, die unter Sicherheitsbedingungen der Stufe 3 (z. B. das Humane Immunschwächevirus (HIV)) und 4 (z. B. Ebolavirus) gehandhabt werden. 2. Für andere Viren gibt es keine etablierten Zellkultursysteme, so daß funktioneile phänotypische Testungen der Viren in Zellkultur nicht möglich sind. Dazu gehören z. B. das Hepatitis-B-Virus (HBV) und das Hepatitis-C-Virus (HCV) . 3. Schließlich vermehren sich bestimmte Viren in Zellkultur sehr langsam und die Analyse der Virusvermehrung unter Einfluß einzelner Substanzen dauert mehrere Tage. Beispiele dafür sind das Zytomegalievirus (CMV) und das Epstein-Barr-Virus (EBV) .
Im Zusammenhang mit dem Auftreten von Resistenzen gegen antivirale Wirkstoffe, und der Untersuchung solcher Resistenzen ist folgendes anhand des lediglich beispielhaft erörterten HI-Virus zu erläutern. Die Infektion mit HIV führt zu einer progredienten Zerstörung des Immunsystems mit tödlichem Ausgang. In den vergangenen
Jahren wurden zahlreiche Medikamente zur Therapie einer HIV-Infektion entwickelt. Diese Substanzen hemmen die Virusvermehrung, sie können aber die Viren nicht vollständig aus dem infizierten Korper eliminieren und damit die Infizierten heilen. Die Medikamente, die zur Zeit verwendet werden, hemmen die Funktion der Reversen Transkriptase oder der Protease des HIV. Standard ist eine Kombinationstherapie aus zwei, meistens jedoch drei, vier oder sogar fünf Substanzen (S. Vella, "Antiretroviral therapy in adults" (State of the Art Lecture Ll. 6th
Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Chicago, III. 1999)). Wenn eine Behandlung mit anti-HIV-Medikamenten begonnen wird, muß sie lebenslang, und das heißt in der Regel für viele Jahre, angewendet werden. Allerdings können sich unter der Therapie
HIV-Mutanten entwickeln, die gegen eines oder mehrere der Medikamente resistent sind. Dies fuhrt dazu, daß sich HI-Viren trotz Therapie wieder vermehren und das Immunsystern des Infizierten weiter zerstören. Außerdem erhöht sich das Risiko einer Übertragung auf Uninfizierte aufgrund der erhöhten Viruskonzentration im Blut und m anderen Korperflussigkeiten. Schließlich können m diesen Fallen medikamentenresistente Viren bertragen werden, die therapeutisch schwer beherrschbar sind (T. Meyer und R. Arndt, "Pπmarresistenzen gegen Reverse-Transkπptase- und Protease-Inhibitoren", S. 29-32. in: Infektionsepidemiologische Forschung A/98, Hrsg. Robert-Koch-Institut, 1998 und L. Perπn, "Transmission of drug-resistant HIV (Abstract S35 und Vortrag) , βth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Chicago, 111.1999).
Da immer mehr Medikamente zur Behandlung von HlV-Infi- zierten zur Verfugung stehen, besteht die Möglichkeit, bei
einer Medikamentenresistenz den Infizierten mit Wirkstoffen zu behandeln, gegen die das Virus noch sensibel ist. Voraussetzung für eine optimale und wirtschaftlich vernünftige Anpassung der Therapie sind jedoch zum einen (1) der Nachweis, daß die Viren im Körper des Patienten tatsächlich resistent gegen die eingesetzten Medikamente ist, zum anderen (2), daß in Erfahrung gebracht wird, gegen welche Substanzen die Viren des Infizierten noch sensibel sind.
Aufgrund eines Mangels an leicht und rasch durchführbaren, aussagekräftigen und wirtschaftlichen Methoden zur Austestung des Resistenzprofils der HI-Viren von Infizierten wird die Therapieanpassung von den meisten Therapeuten bisher aufgrund von Surrogatmarkern mit begrenzter Aussagekraft und auf der Basis von empirischen Daten durchgeführt. Das heißt, eine konstante Zunahme der Virusmenge im Blut unter Therapie veranlaßt den Therapeuten dazu, mindestens zwei Medikamente aus der Kombinationstherapie durch andere Substanzen zu ersetzen. Daten aus in-vitro-Studien und Erfahrungswerte aus der Therapie von Infizierten leiten ihn in der Entscheidung, welche Medikamente wahrscheinlich noch wirksam sind, welche voraussichtlich nicht. Dieses Vorgehen führt dazu, daß die Diagnose einer Wirkstoffresistenz erst relativ spät, zum Teil erst Monate nach Resistenzentwicklung, erfolgt und mit einem bedeutenden diagnostischen Fehler behaftet ist. Da die Viren nicht gegen alle eingesetzten Medikamente in gleicher Weise resistent sein müssen (D. Havlir, N Helimann, C. Petropoulos et al., "Viral rebound in the presence of Indinavir without protease inihibitor resistance" (Abstract LB 12), 6th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Chicago, 111.
1999) , jedoch mehrere Medikamente gleichzeitig ausgetauscht werden, führt die empirische Therapieentscheidung außerdem dazu, daß möglicherweise noch wirksame Medikamente dem Patienten vorenthalten werden. In Anbetracht der Tatsache, daß die Zahl der Therapeutika mit unterschiedlichem Resistenzprofil sehr begrenzt ist und mindestens zwei Medikamente bei einem solchen Vorgehen gleichzeitig ersetzt werden, führt das empirische Vorgehen den Therapeuten rasch an die Grenzen seiner Möglichkeiten und gefährdet die optimale Behandlung des Patienten.
Schließlich kann das Umstellen der Therapie aufgrund von empirischen Daten eine weitere Resistenzentwicklung provozieren. Unter den behandelnden Ärzten setzt sich daher allmählich die Ansicht durch, daß eine Resistenz- testung die HIV-Therapie wesentlich verbessern würde (H. Fenner et al. "Konsens zur HIV-Resistenzbestimmung", und V. Miller "Resistenzentwicklung unter antiretroviralen Therapien bei HIV- 1-infizierten Patienten: Klinische Bedeutung" S. 21-26 in: Infektionsepidemiologische Forschung A/98. Hrsg. Robert-Koch-Institut, 1998 und B. Gazzard, "The clinical value of drug resistance testing" (Abstract S36 und Vortrag, 6th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Chicago. 111.1999).
Es wurden auch bei anderen Virusinfektionen, insbesondere bei verschiedenen Herpesvirus- und der Hepatitis-B-Virus- infektion unter antiviraler Therapie die Entstehung resistenter Viren beobachtet (M. Hirsch in "Field's Virology" . 3. Auflage. 1996; Ling et al . Hepatology 1996;24:711-713) .
Die bislang zur Verfügung stehenden Meßverfahren zur Resistenztestung basieren auf zwei unterschiedlichen
Prinzipien, die als phänotypische und genotypische Methoden bezeichnet werden (L. Gürtler "Methoden der phänotypischen und genotypischen HIV-Resistenzbestimmung" S. 16-20 und Tabelle S.3 in: Infektionsepidermiologische Forschung A/98. Hrsg. Robert-Koch-Institut. 1998). Bei der ersten phänotypischen Methode wird Virus aus Patientenplasma isoliert und auf primären mononukleären Spender- Blutzellen (PBMC) angezüchtet. Zur Austestung der Sensibilität wird Virus anschließend auf mononukleären Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von antiviralen Medikamenten kultiviert und die Virusvermehrung gemessen (A. J. Japour, 1993, Antimicrob. Agents and Chemotherapy Vol 37(5): 1095-1101). Vorausgesetzt, daß HI-Virus aus Patientenmaterial isoliert werden kann, kann diese Methode als der "goldene Standard" der Resistenzbestimmung eines definierten Virusisolats betrachtet werden. Vom Prinzip her ähnliche Verfahren sind auch für andere Viren, insbesondere für Herpesviren, etabliert. Bei einer anderen bisher zur Verfügung stehenden phänotypischen Resistenzbestimmungsmethode werden nach einer Reversen
Transkription und anschließender Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die Gene der Enzyme, die Ziele der antiviralen Medikamente darstellen, aus dem Plasma der Patienten vermehrt. Diese Gene werden anschließend in eine definierte provirale HIV-DNA eingesetzt, aus der die entsprechenden Genabschnitte vorher entfernt wurden. Die reko binanten DNA-Provirus-Plasmide werden in Bakterien vermehrt und anschließend in eukaryote Zellen transfiziert . In diesen Zellen werden innerhalb von einigen Tagen aus den rekombinierten DNA-Proviren infektiöse chimäre HI-Viren produziert. Daraufhin wird die Konzentration der Chimären Viren in Zellkultur bestimmt. Die Resistenz der chimären Viren wird anschließend in
Zellkultur auf Zellinien wie HeLa CD4+ oder MT4 in Anwesenheit oder Abwesenheit der Medikamente getestet. Diese Methode wird für die Bestimmung von Resistenzen gegen die HIV-Reverse Transkriptase (Kellam and Larder 1994 Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38(I):2330) und die Protease (K. Hertogs et al . "A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs" ,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998, 42 (2) : 269-276) eingesetzt. Die Ergebnisse der Einzelbestimmungen werden kombiniert um damit ein Resistenzprofil zu erstellen. Bei der genotypischen Methode wird der Genabschnitt der Enzyme, die Ziele der antiviralen Medikamente sind, mit Hilfe der PCR aus dem Patientenblut vermehrt und die Nukleotidsequenz durch Sequenzierverfahren bestimmt. Anschließend wird die Sequenz mit der von einem nicht resistenten Standardvirus verglichen. Die dabei beobachteten genetischen Veränderungen werden mit solchen verglichen, von denen man aus in-vitro-Analysen oder Patientenbeobachtungen weiß, daß sie mit einer Medikamentenresistenz assoziiert sind. Alternativ dazu werden die amplifizierten HIV-Sequenzen durch Hybridisierung mit mutationsspezifischen Sonden analysiert (Line-Probe-Assay) .
Alle zur Zeit zur Verfügung stehenden HIV-Resistenzmeßmethoden besitzen wesentliche Nachteile für einen routinemäßigen Einsatz (T. Fenner "Bedeutung der
Resistenzbesti mung für die antiretrovirale Therapie - Rationale der Kosten für phänotypische und genotypische Resistenzanalysen", S.33-35 und Tabelle auf S. 3, in:
Infektionsepidermiologische Forschung A/98, Hrsg. Robert-Koch-Institut, 1998) . Auch die phänotypischen Resistenztestmethoden für Herpesviren sind nicht routinemäßig einsetzbar. Im Einzelnen handelt es sich um folgende Nachteile. Zur ersten phänotypischen Methode ist diesbezüglich anzumerken: Eine Virusisolierung ist bei einem beträchtlichen Teil der HlV-Infizierten (und Herpesvirusinfizierten) nicht möglich. Einige Viren (z.B. HBV, HCV, Papillomviren) können in Zellkultur bisher nicht angezüchtet werden. Deshalb kann die Methode in vielen Fällen erst gar nicht durchgeführt werden. Darüber hinaus ist nicht sicher, ob die isolierten Viren für die Situation in Infizierten repräsentativ sind oder stattdessen nur eine Selektion besonderer Stämme darstellen. Die Durchführung der Methode dauert mehrere Monate. Dieser Zeitraum ist für die Optimierung der Behandlung ungünstig. Die Methode ist sehr personalaufwendig, deswegen sehr kostenintensiv. Sie kann für viele Viren nur in Sicherheitslaboratorien der Stufe 3 durchgeführt werden, was zusätzlich die Kosten erhöht und die Durchführung auf wenige Zentren beschränkt. Zur zweiten phänotypischen Methode ist anzumerken: Auch diese Methode ist zeit- und personalintensiv und benötigt für ihre Durchführung bis zu 3 Monate (L. Weitner "Erfahrungen mit Resistenzbestimmmungen in einer HlV-Schwerpunktpraxis" S.27-28 in: Infektionsepidemiologische Forschung A/98 Hrsg. Robert-Koch-Institut, 1998) . Auch bei dieser Methode werden infektiöse HI-Viren hergestellt und die Tests können deshalb nur in Sicherheitslaboratorien der Stufe 3 durchgeführt werden. Solche Laboratorien stehen nur in wenigen mikrobiologischen Instituten und bei einigen Firmen zur Verfügung. Die Kosten sind dementsprechend hoch, die Menge an Proben, die bearbeitet werden kann, ist
limitiert. Das Fazit hinsichtlich der phänotypischen Methoden lautet: Bei klinischem Verdacht auf eine Medikamentenresistenz sind phänotypische Resistenztest- ungen, wie sie derzeit zur Verfugung stehen, zu langwierig. Die Ergebnisse solcher Testungen können daher nur m seltenen Fallen als Entscheidungsgrundlage für eine Therapieumstellung dienen. Sie sind außerdem zu teuer. Zur genotypischen Methode ist anzumerken: Genotypische Resistenzmeßverfahren sind bedeutend schneller durch- zu- fuhren und erfordern keine Arbeiten mit infektiösem HIV. Der Nachteil dieser Methoden ist, daß sie nur Aussagen über bereits bekannte und definierte Mutationen zulassen. Es sind aber bei weitem nicht alle relevanten Mutationen bekannt. Außerdem ist eine Medikamentenresistenz häufig das Produkt einer Vielzahl von genetischen Mutationen, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung verstarken oder abschwachen können. Daraus ergibt sich, daß die genotypische Re- sistenzbeStimmung zum jetzigen Zeitpunkt die wirkliche Situation nur unzureichend genau widerspiegelt. Schließ- lieh müssen für jedes neu eingesetzte Medikament umfangreiche Vergleichsstudien mit der goldenen Standardmethode durchgeführt werden um alle möglichen Mutationen auch genotypisch zu charakterisieren. Die Aussagefahigkeit hinkt somit zwangsläufig immer einer neuen Therapie hinterher (V. Miller "Resistenzentwicklung unter antiretroviralen Therapien bei HIV-1-mfizierten Patienten: Klinische Bedeutung" S.21-26 in: Infektionsepidemiologische Forschung A/98, Hrsg. Robert-Koch-Institut, 1998) . Das mögliche Spektrum auftretender HIV-Resistenzen wird mit dieser Me- thode immer nur unvollständig erfaßt. Außerdem sind umfangreiche Vortests notwendig, bis ein genotypisches Meßverfahren für neu auf den Markt kommende Medikamente überhaupt einigermaßen verwertbare Ergebnisse liefern
kann. Die Ergebnisse sind nicht quantifizierbar, das heißt, es läßt sich nicht bestimmen, ob die genetischen Veränderungen eine 10-, 100- oder 1000-fache Resistenz darstellen. Außerdem lassen sich Wechselwirkungen der ein- zelnen Mutationen untereinander nicht erfassen.
Aus anderen Zusammenhängen, nämlich der Gentherapie, sind replikationsinkompetente oder attenuierte virale Vektoren, enthaltend alle erforderlichen genetischen Informationen zur Infektion einer Zelle mit einem Zielvirustypus, wobei der virale Vektor zusätzlich genetische Information zur Expression einer Markersubstanz in der infizierten Zelle enthält, bekannt. Hierbei dient die Expression der Markersubstanz dazu anzuzeigen, ob die in eine Zelle einzu- schleusende genetische Information auch tatsächlich eingebaut worden ist. Hierzu wird auf die Literaturstellen V.N. Kim et al . , J. Virol.:72, 811-816, 1998, und T. Dull et al., J. Virol.:72, 8463-8471, 1998, verwiesen.
Weiterhin sind replikationsinkompetente bzw. attenuierte virale Vektoren für eine Reihe von verschiedenen Viren bekannt: Hepadnaviren (Chaisomchit et al., Gene Ther. 4:1330-1340, 1997), Herpesviren (Wagstaff et al . , Gene Ther. 5:1566-1570, 1998), Adenoviren (He et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 96:2509-2514, 1997), Flaviviren (Hepa- titis-C-Virus, Kolykhalov et al., Science 277: 570-574, 1998), Paramyxoviren (Singh et al, J. Gen. Virol. 80:101-106,1999) und Papillomviren (Ohe et al . , Hu . Gene Ther. 6:325-333, 1995) .
Aus der Literaturstelle US-A-5, 837, 64 ist es bekannt, replikationsinkompetente oder attenuierte virale Vektoren im Rahmen von Resistenztestungen zu verwenden. Demgemäß
wird entweder die Transfektion mit einem Plasmid enthaltend alle Gene von HIV außer env sowie das Luziferase-Gen (Methode 1) oder gleichzeitig mit zwei Plasmiden, eines enthaltend HIV gag-pol, RRE und Luziferase-Gen und das andere enthaltend alle HIV-Gene außer env und gag-pol, (Methode 2) durchgeführt. In jedem Fall wird mit einem zusätzlichen Plasmid mit dem Gen für das Glykoprotein des Murinen Leukämievirus transfiziert . Im Ergebnis liegen alle HIV-Gene, auch Strukturproteingene und Regulatorpro- teingene, mit Ausnahme von env vor. Nachteilig bei Methode 1 ist, daß durch ein einfaches Rekombinationsereignis in den transfizierten Zellen ein infektiöses (chi äres) Virus mit allen HlV-wildtypischen Pathogenitätsfaktoren entstehen kann. Bei Methode 2 kann dies durch zwei Rekombinati- onsereignisse stattfinden. Hierzu wird ergänzend auf die Literaturstelle Reiprich et al., J. Virol. 1997, 71:3328-3331, verwiesen. Die vorstehend genannten Folgen von Rekombinationsereignissen erlauben in der Regel nicht ein Arbeiten unter der relativ geringen und insofern wenig aufwendigen Sicherheitsstufe 2. Daher ist ein beachtlicher Aufwand zur Durchführung der Resistenztestungen erforderlich. Dies wird noch dadurch verschärft, daß gemäß diesem Stand der Technik die Zellen, in denen das Luziferasegen exprimiert wird, immer noch Strukturprotein des Virus produzieren.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung liegt daher gegenüber dem vorstehend erläuterten Stand der Technik das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Testung (prospektiver) antiviraler Wirkstoffe oder zur Testung von Resistenzen gegen antivirale
Wirkstoffe anzugeben, welche unter niedrigen biologischen Sicherheitsanforderungen (z.B. Stufe 2) ausgeführt werden können und insofern mit geringeren Gesundheitsrisiken sowie Kosten durchführbar sind, welche mit verkürzter Unter- suchungszeit durchführbar sind und welche zuverlässige Ergebnisse liefern. Der Erfindung liegt weiterhin das technische Problem zugrunde, geeignete Mittel für solche Verfahren zur Verfügung zu stellen.
Grundzüge der Erfindung
Zur Lösung dieser technischen Probleme lehrt die Erfindung i) ein Verfahren zur Quantifizierung der antiviralen Wir- kung antiviraler Wirkstoffe mit den folgenden Verfahrenstufen: a) mit einem replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektor, enthaltend alle erforderlichen genetischen Informationen zur Infektion einer Zelle mit einem Zielvirustypus, wobei der virale Vektor zusätz- lieh genetische Information zur Expression einer Markersubstanz in der infizierten Zelle enthält und wobei zusätzlich zu einem viralen Gen zumindest eine weitere virale Sequenz derart verändert ist, daß in einer transdu- zierten Zelle keine Virusbestandteile oder keine potenti- eil pathogenen Viren gebildet werden können, insbesondere eine einen Pathogenitätsfaktor codierendes Gen des Zielvirustyps deletiert oder verändert ist, werden Zellen trans- duziert, b) vor und/oder während und/oder nach der Transduktion und/oder ggf. vor und/oder während und/oder nach Induktion der Vektor-DNA-Transkription wird ein pro- spektiver antiviraler Wirkstoff in einer definierten Dosis zu den Zellen gegeben, c) die Aktivität an exprimierter Markersubstanz wird quantitativ analysiert und eine
Reduktion, bezogen auf eine Aktivität an exprimierter Markersubstanz bei einer Transduktion und/oder Induktion ohne Zugabe antiviraler Wirkstoffe oder mit Zugabe einer definierten Dosis eines anderen antiviralen Wirkstoffs, bestimmt, ii) ein Verfahren zur Findung antiviraler Wirkstoffe mit den folgenden Verfahrenstufen: a) mit einem replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektor, enthaltend alle erforderlichen genetischen Informationen zur Infektion einer Zelle mit einem Zielvirustypus, wobei der virale Vektor zusätzlich genetische Information zur Expression einer Markersubstanz in der infizierten Zelle enthält und wobei zusätzlich zu einem viralen Gen zumindest eine weitere virale Sequenz derart verändert ist, daß in einer transduzierten Zelle keine Virusbestand- teile oder keine potentiell pathogenen Viren gebildet werden können, insbesondere eine einen Pathogenitätsfaktor codierendes Gen des Zielvirustyps deletiert oder verändert ist, werden Zellen transduziert, b) vor und/oder während und/oder nach der Transduktion und/oder ggf. vor und/oder während und/oder nach Induktion der Vektor-DNA-Transkription wird ein prospektiver antiviraler Wirkstoff in einer definierten Dosis zu den Zellen gegeben, c) die Aktivität an exprimierter Markersubstanz wird quantitativ analysiert und eine Reduktion, bezogen auf eine Aktivität an expri- mierter Markersubstanz bei einer Transduktion und/oder Induktion ohne Zugabe antiviraler Wirkstoffe oder mit Zugabe einer definierten Dosis eines anderen antiviralen Wirkstoffs, bestimmt, d) der prospektive antivirale Wirkstoff wird nach Maßgabe eines Vergleiches der in Stufe c) bestimmten Reduktion mit einer vorgegebenen Mindestreduktion, und ggf. Bewertung (unter Berücksichtigung von z.B. dosisabhängigen Nebenwirkungen) der für die Reduktion erforderlichen Dosis, selektiert oder verworfen, und iii)
ein Verfahren zur Bestimmung von patientenspezifischen Resistenzen mit den folgenden Verfahrenstufen: a) einem Patienten wird eine Probe mit Virus-RNA oder -DNA eines Virus, mit welchem der Patient infiziert ist, entnommen, b) aus der Virus-RNA bzw. DNA wird ein Fragment, dessen genetische Information für eine Virus-Funktion kodiert, die von einem antiviralen Wirkstoff gehemmt werden soll, amplifiziert und in einen replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektor, enthaltend alle erforderli- chen genetischen Informationen zur Infektion einer Zelle mit einem Zielvirustypus, wobei der virale Vektor zusätzlich genetische Information zur Expression einer Markersubstanz in der infizierten Zelle enthält und wobei zusätzlich zu einem viralen Gen zumindest eine weitere virale Sequenz derart verändert ist, daß in einer transdu- zierten Zelle keine Virusbestandteile oder keine potentiell pathogenen Viren gebildet werden können, insbesondere eine einen Pathogenitätsfaktor codierendes Gen des Zielvirustyps deletiert oder verändert ist, integriert, c) mit dem Produkt aus Stufe b) werden Zellen transduziert, d) vor und/oder während und/oder nach der Transduktion und/oder ggf. vor und/oder während und/oder nach Induktion der Vektor-DNA-Transkription wird der antivirale Wirkstoff in einer definierten Dosis zu den Zellen gegeben, e) die Ak- tivität an exprimierter Markersubstanz wird quantitativ analysiert und eine Reduktion, bezogen auf eine Aktivität an exprimierter Markersubstanz bei einer Transduktion und/oder Induktion durch einen replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektor entsprechend Stufe b) , welcher jedoch anstelle des Fragments aus Stufe b) ein entsprechendes, jedoch nicht resistenzbegründendes Fragment enthält, und bei Anwendung des antiviralen Wirkstoffes, bestimmt, f) die in Stufe e) ermittelte Reduktion
wird mit einer kritischen Reduktion verglichen, unterhalb derer Resistenz vorliegt.
Alternativ zum vorstehenden Resistenzbestimmungsverfahren lehrt die Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung von patientenspezifischen Resistenzen mit den folgenden Verfahrenstufen: a) einem Patienten wird eine Probe mit Virus-RNA oder -DNA eines Virus, mit welchem der Patient infiziert ist, entnommen, b) aus der Virus-RNA bzw. -DNA wird ein Fragment, dessen genetische Information für eine Virus-Funktion kodiert, die von einem antiviralen Wirkstoff gehemmt werden soll, amplifiziert und in einen replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektor, enthaltend alle erforderlichen genetischen Informationen zur Infektion einer Zelle mit einem Zielvirustypus, wobei der virale Vektor zusätzlich genetische Information zur Expression einer Markersubstanz in der infizierten Zelle enthält und wobei zusätzlich zu einem viralen Gen zumindest eine weitere virale Sequenz derart verändert ist, daß in einer transduzierten Zelle keine Virusbestandteile oder keine potentiell pathogenen Viren gebildet werden können, insbesondere eine einen Pathogenitätsfaktor codierendes Gen des Zielvirustyps deletiert oder verändert ist, integriert, c) mit dem Produkt aus Stufe b) werden Zellen transduziert, d) vor und/oder während und/oder nach der Transduktion und/oder ggf. vor und/oder während und/oder nach Induktion der Vektor-DNA-Transkription wird der antivirale Wirkstoff in einer definierten Dosisreihe zu den Zellen gegeben, e) die Aktivität an exprimierter Marker- Substanz wird für jede Dosis quantitativ analysiert und die für eine definierte Hemmung der Expression der Markersubstanz, beispielsweise 50% oder 90%, erforderliche Dosis bestimmt, f) die in Stufe e) bestimmte Dosis wird mit der
entsprechenden, für eine gleiche Hemmung erforderliche Dosis des gleichen antiviralen Wirkstoffes bei Einsatz eines Referenzkonstrukts verglichen. Ein Referenzkonstrukt kann beispielsweise aus einem respektiven Wildtyp herrüh- ren und oder auf einem entsprechenden, jedoch nicht resistenzbegründenden Fragment beruhen.
Weiterhin lehrt die Erfindung einen antiviralen Wirkstoff erhältlich durch die folgenden Verfahrensstufen: a) mit einem replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektor, enthaltend alle erforderlichen genetischen Informationen zur Infektion einer Zelle mit einem Zielvirustypus, wobei der virale Vektor zusätzlich genetische Information zur Expression einer Markersubstanz in der infizierten Zelle enthält und wobei zusätzlich zu einem viralen Gen zumindest eine weitere virale Sequenz derart verändert ist, daß in einer transduzierten Zelle keine Virusbestandteile oder keine potentiell pathogenen Viren gebildet werden können, insbesondere eine einen Pathogeni- tätsfaktor codierendes Gen des Zielvirustyps deletiert oder verändert ist, werden Zellen transduziert, b) vor, während und/oder nach der Transduktion und/oder ggf. vor, während und/oder nach Induktion der Vektor-DNA-Transkription wird ein prospektiver antiviraler Wirkstoff in einer definierten Dosis zu den Zellen gegeben, c) die Aktivität an exprimierter Markersubstanz wird quantitativ analysiert und eine Reduktion, bezogen auf eine Aktivität an exprimierter Markersubstanz bei einer Transduktion und/oder Induktion ohne Zugabe antiviraler Wirkstoffe oder mit Zu- gäbe einer definierten Dosis eines bekannten antiviralen Wirkstoffes, bestimmt, d) der prospektive antivirale Wirkstoff wird nach Maßgabe eines Vergleiches der in Stufe c) bestimmten Reduktion mit einer vorgegebenen
Mindestreduktion oder einer vorgegebenen Vergleichsreduktion (bezogen auf die Reduktion mit dem bekannten antiviralen Wirkstoff und unter weiterem Vergleich der jeweiligen Dosen) selektiert oder verworfen. Äquivalent hierzu ist ist die Bestimmung einer Mindestdosis des pro- spektiven antiviralen Wirkstoffs, die erforderlich ist, um eine vorgegebene Reduktion (bzw. Hemmung) gegenüber wirk- stoffreier Expression der Markersubstanz oder gegenüber Expression der Markersubstanz bei einer vorgegebenen Dosis eines bekannten antiviralen Wirkstoffes zu erreichen, wobei auch die respektiven Dosen (Mindestdosis und vorgegebene Dosis des bekannten Wirkstoffes) verglichen werden. In dieser Ausführungsform wird in Stufe b) eine Dosisreihe eingesetzt. Entsprechendes gilt im Falle des erfindungsge- mäßen Verfahrens zur Wirkstoffindung.
Die Erfindung lehrt auch ein Verfahren zur Herstellung eines viralen Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei a) in ein Ausgangskonstrukt, insbesondere ein Plas- mid, Cosmid, Minichromosom, Phage oder anderes Virusgenom, ein virales Genom inseriert wird, b) in dem Zielvirusgenom enthaltenden Konstrukt aus Stufe a) werden zumindest zwei für die virale Replikation notwendige Bestandteile (notwendiger Bestandteil meint hier und auch an entsprechenden anderen Stellen dieser Beschreibung insbesondere eines oder mehrere Strukturgene und/oder eines oder mehrere regulatorische Sequenzen) modifiziert oder daraus deletiert, im Falle von HIV wird insbesondere zusätzlich zu einem viralen Gen, beispielsweise env, zumindest eine einen Pa- thogenitätsfaktor codierende Sequenz aus der Gruppe bestehend aus "vif, vpr, tat, vpu und nef" und/oder zumindest eine für die Genexpression des Virus notwendige Sequenz, insbesondere im 3'U3-Bereich, deletiert oder verändert, c)
m das Produkt aus Stufe b) wird die genetische Information zur Expression der Markersubstanz inseriert, d) das Vektorkonstrukt aus Stufe c) wird m ein Vektorproduktionssystem eingebracht und darin expπmiert, e) optional wird ein m Stufe b) deletiertes Protein m trans über ein Konstrukt, insbesondere ein Plasmid, und/oder über eine Verpackungszellinie m Stufe d) eingeführt und f) der m Stufe d) bzw. e) erzeugte virale Vektor wird nach seiner Produktion mittels des Vektorproduktionssystems, ggf. nach Zeil-Kultivierung, isoliert. In diesem Zusammenhang ist beachtlich, daß mit lediglich einem, maximal 2 Konstrukten (z.B. Plasmide, Cosmide) gearbeitet wird, wahrend im Zusammenhang mit Gentherapie bekannte virale Vektoren unter Einsatz von zumindest 3 Plasmiden hergestellt werden. Die Erfindung umfaßt insofern auch einen auf diesem Wege herstellbaren viralen Vektor. Schließlich lehrt die Erfindung einen viralen Vektor gemäß Fig. 2a oder b, welcher im Rahmen der vorstehenden Verfahren besonders gut im Zusammenhang mit HIV einsetzbar ist.
Bezüglich Anwendungen im Bereich von HIV ist folgendes anzumerken. Vorteilhafterweise ist zusätzlich zu einem viralen Gen, beispielsweise env, zumindest eine einen Pa- thogenitatsfaktor codierende Sequenz aus der Gruppe beste- hend aus "vif, vpr, tat, vpu und nef" und/oder zumindest eine für die Genexpression des Virus notwendige Sequenz, insbesondere im 3 'U3-Bereιch, deletiert oder so verändert, daß die Funktionalitat des Expressionsprodukts bzw. die regulatorische Funktion, beispielsweise Promotorfunktion, verloren ist. Bevorzugterweise sind mehrere der Faktoren aus der Gruppe bestehend aus "vif, vpr, tat, vpu und nef", hochstvorzugsweise alle diese Faktoren, zugleich deletiert und/oder verändert. Vorzugsweise ist zusätzlich eine für
die Genexpression des Virus notwendige Sequenz (im LTR) verändert und/oder deletiert. Für beispielsweise eine De- letion kommt konkret der 400 Basen große Bereich in Frage, welcher durch die Schnittstellen PvuII und EcoRV im 3'U3-Bereich definierbar ist, in Betracht. Es versteht sich, daß aber auch beliebige andere Deletionen bzw. Veränderungen im LTR äquivalent sind, wenn dadurch die Genexpression des Virus hinreichend gestört ist.
Das Merkmal "genetische Information zur Expression der Markersubstanz" ist im Rahmen der Erfindung im weitesten Sinne zu verstehen. Beispielsweise kann einerseits im eigentlichen Sinne eine genetische Information eingebaut werden, die dazu führt, daß eine vorgegebene Substanz mit Reporterfunktion exprimiert wird. Die Markersubstanz kann aber auch ein viruseigenes Expressionsprodukt sein. Schließlich ist es möglich, direkt viruseigene DNA oder RNA nachzuweisen, welche dann insofern als Markersubstanz funktioniert, die, wie im vorstehenden Falle, gleichsam automatisch mit eingebaut werden bzw. sein kann. Denkbar ist auch ein Stoff, gegen den Antikörper sensitiv sind. Wesentlich ist im Rahmen der Erfindung lediglich, daß durch die Gestaltung des viralen Vektors so erfolgt, daß mit beliebigen Mitteln dessen Nachweis, direkt oder indi- rekt, gelingt, vorzugsweise quantitativ.
Als Konstrukt ist im Rahmen der Erfindung jedes molekularbiologische System bezeichnet, welches fremde Erbinformation aufnehmen und beinhalten kann.
Replikationsinkompetente oder attenuierte virale Vektoren zeichnen sich dadurch aus, daß die Vektoren zwar in der Lage sind, Zielzellen einmalig zu infizieren und ein
Markergen zu exprimieren, daß die virale Replikation jedoch unterdrückt oder zumindest stark gehemmt ist. Hierzu können beispielsweise Gene von Strukturproteinen (bei HIV das env-Gen) deletiert und in separaten Expressionsplasmi- den oder Verpackungszellinien in trans zur Verfügung gestellt werden. Außerdem können regulatorische Gene (bei HIV beispielsweise das tat-Gen) entfernt oder unterdrückt werden. Ebenso können alternativ oder ergänzend Gene für kritische Virulenzfaktoren (bei HIV beispielsweise das vif-Gen) entfernt oder unterdrückt werden. Als Zielvirustypus ist ein Virustyp bezeichnet, gegen welchen ein antiviraler Wirkstoff gerichtet ist oder gesucht wird. Die absoluten Werte der Mindestreduktion in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Wirkstoffindung können beliebig sein und mit der Zeit veränderlich. Die Mindestreduktion wird sich in der Regel an Werten orientieren, die mit bekannten Wirkstoffen erhalten werden. Demgegenüber sollte die Mindestreduktion zumindest gleich oder höher ausfallen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Resistenzbestimmung wird bevorzugt die Wirkstoffkonzentration ermittelt, die eine definierte Hemmung der Markergenexpression verursacht. Die definierte Hemmung beträgt beispielsweise 50 oder 90%. Es versteht sich, daß das relevante Fragment eines dem Patienten entnommenen Virus auf geeignete Weise amplifiziert werden muß. Es wird der Faktor ermittelt, um den die Wirkstoffkonzentration bei der Testung von patientenspezifischen Konstrukte, beispielsweise Polymerase-Ge- nen von Viren aus Patienten, höher ist als bei Kontrollkonstrukten. Dazu wird die Markergenexpression in Anwesenheit unterschiedlicher Wirkstoffkonzentrationen gemessen. Die eingesetzten Wirkstoffkonzentrationen sind Wirkstoffabhängig. Auch wenn insofern mit mehreren Meßwerten gearbeitet wird, so ist es möglich, allein mit einem
Meßwert eine Aussage über Empfindlichkeit oder Resistenz eines Virus zu machen.
Der Begriff der viralen Gene bezieht sich auf die viralen Strukturproteine. Der Begriff der Pathogenitatsfaktoren umfaßt im Rahmen der vorliegenden Beschreibung alle Faktoren, welche zum Aufbau eines intakten Virus erforderlich sind und/oder an der Pathogenese des Virus beteiligt ist. Für eine Genexpression des Virus notwendige Sequenzen sind beispielsweise regulatorische Regionen im LTR, welche unter dem Einfluß zellularer Regulatorproteine und/oder von Regulatorproteinen anderer Virentypen stehen.
Eine für die Genexpression des Virus notwendige Sequenz meint eine für die Genexpression m einer Zielzelle notwendige Sequenz.
Gegenüber der Literaturstelle US-A-5, 837, 464 weist die Erfindung als beachtlichen Vorteil auf, daß die Bildung infektiöser Viren bei der Vektorherstellung und m den Zielzellen geradezu ausgeschlossen ist. Insbesondere im Falle der Deletion im 3'U3-Bereιch des HIV-LTR wird ein selbst-maktivierender Vektor erhalten. Außerdem werden die akzessorischen Gene vif, vpr, vpu, tat und nef dele- tiert. Die entfernten Gensequenzen werden nicht durch ein separates Expressionsplasmid komplementiert, wie im Falle der besagten Literaturstelle. Deshalb werden auch zu keinem Zeitpunkt der Vektorherstellung die HIV-Proteine Vif, Vpr, Vpu, Tat und Nef gebildet. Im Gegensatz dazu sind m der oben genannten Literaturstelle diese Gene entweder auf dem Vektorplasmid vorhanden (Methode 1) oder werden durch ein separates Expressionsplasmid komplementiert (Methode 2) und exprimiert. Insofern in dieser Literaturstelle
dargestellte einzelne Plasmidstrukturen werden nur in Verbindung mit weiteren beschriebenen Plasmiden verwendet. Im Ergebnis läßt sich mit der vorliegenden Erfindung unter der Sicherheitstufe 2 arbeiten und die Testungen sind we- nig aufwendig und zügig durchführbar.
Mit der Erfindung werden im einzelnen die verschiedenen nachstehend erläuterte Vorteile erhalten. Die im Zusammenhang mit der Wirkstoffindung erhaltenen Vorteile sind die folgenden. Die Erfindung ermöglicht eine phänotypische funktioneile Testung der Wirksamkeit antiviraler Substanzen, ohne daß hochinfektiöse Viren verwendet werden müssen. Sie ermöglicht darüber hinaus eine Testung von antiviralen Substanzen auch bei solchen Viren, die nicht angezüchtet werden können und verkürzen die Testzeit bei Viren, die sich nur langsam vermehren. Im Vergleich zum eingangs erläuterten Stand der Technik ergibt sich aus der Erfindung i) eine niedrigere biologische Sicherheitsanforderungen, ii) die Möglichkeit, einen phänotypischen funk- tionellen Test der Wirksamkeit von Substanzen gegen Viren mit hohem biologischem Sicherheitsrisiko (Stufe 3 und 4) unter Sicherheitsbedingungen der Stufe 2 durchzuführen, iii) durch die geringen Sicherheitserfordernisse reduzierte Kosten, iv) die Möglichkeit einer phänotypischen Sub- stanztestung für Viren, die in Zellkultur nicht züchtbar sind, v) eine verkürzte Untersuchungszeit und vi) schnelle, einfache Testauswertung durch Verwendung eines Markergens. Im Zusammenhang mit der Testung auf Resistenzen erhaltenen Vorteile sind die folgenden. Die Erfindung er- möglicht eine phänotypische Virus-Resistenztestung mit hoher Aussagekraft, die innerhalb von nur zwei Wochen in Diagnostik-Laboratorien unter Sicherheitsbedingungen der Stufe 2 durchgeführt werden kann. Im Vergleich zu
genotypischen Methoden ist die Erfindung 1) zuverlässiger m ihrer Aussage (Erfassung von Wechselwirkungen einzelner Mutationen, quantifizierbar) , 11) auch für neue Substanzen rasch einsetzbar, ohne daß zunächst umfangreiche Verglei- ehe von genotypischen und phänotypischen Untersuchungen notwendig sind. Im Vergleich zu den anderen phänotypischen Methoden hat die Methode I) eine vergleichbar gute Aussagekraft, 11) eine deutlich reduzierte Untersuchungszeit (von bisher bis zu zwei bis drei Monaten auf 10 Arbeitsta- ge) , m) einen geringeren Arbeitsaufwand und damit geringere Personalkosten, IV) geringere biologische Sicherheitsanforderungen auch für Viren der Sicherheitsstufen 3 und 4; die Untersuchung kann deshalb m den meisten Infektionsdiagnostik-Laboratorien (Sicherheitsstufe 2) durchgeführt werden, v) ein deutlich reduziertes Infek- tionsrisiko für die Untersucher, selbst bei hochmfektio- sen Virenarten, vi) durch die geringeren
Sicherheitserfordernisse nochmals reduzierte Kosten und vn) die Erfindung kann eingesetzt werden wo andere phano- typische Methoden nicht zur Verfugung stehen weil das Virus sich m Zellkultur nicht anzuchten laßt (z.B. Hepatitis-B-Virus) . Die Erfindung erlaubt deshalb eine risikoarme, zuverlässige und ökonomische Testung der Resistenz von Viren, beisielsweise HIV, gegen alle bisher und zukunftig verfugbaren anti (retro) viralen Medikamente.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Grundkonzeption der Erfindung besteht m der
Verwendung von replikationsinkompetenten oder attenuierten viralen Vektoren zur Testung der Wirksamkeit antiviraler Substanzen und zur Analyse der Resistenz von Viren gegen
Virustatika. Bei den replikationsinkompetenten viralen Vektoren handelt es sich um virusähnliche Partikel, die alle für die Infektion einer Zelle notwendigen Virusbestandteile enthalten. Das Genom der replikationsinkompetenten viralen Vektoren ist jedoch unvollständig. Daher können replikationsinkompetente virale Vektoren Zielzellen zwar infizieren, im Gegensatz zu den urspünglichen Viren bilden sich in infizierten Zellen jedoch keine infektiösen Viruspartikel. Die Infektion der Zelle wird durch die Expression einer Markersubstanz, beispielsweise eines Markerproteins, festgestellt .
Replikationsinkompetente bzw. attenuierte Viren sind an sich für eine Vielzahl von verschiedenen Virenarten bekannt, wozu auf die im technologischen Hintergrund genannten Literaturstellen verwiesen wird. Diese bekannten Vektoren können ggf. unschwer mit genetischer Information zur Expression einer Markersubstanz modifiziert und im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Dies verdeutlicht, daß die Erfindung sich für praktische alle antiviralen Wirkstoffe bzw. im Zusammenhang mit praktisch allen viralen Erkrankungen nutzen läßt. Insbesondere kann die Erfindung im Zusammenhang mit Retroviren (HIV, murine Retroviren) , Hepadnaviren, Herpesviren, Adenoviren, Flaviviren, Paramyxoviren und Papillomviren eingesetzt werden durch Verwendung und ggf. Modifikation der respektiven bekannten replikationsinkompetenten bzw. attenuierten Vektoren.
Im Falle der Resistenztestung erfolgt diese mit Hilfe von replikationsinkompetenten viralen Vektoren. In diesem Verfahren wird, beispielsweise im Falle von HIV, mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion das Polymerase (Protease, Reverse Transkriptase, Integrase)- Gen von HIV aus dem Blutplasma, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten gewonnen. Dieses Gen wird in ein Vektorplasmid ligiert. Das Vektorplasmid enthält dann außer den für die
Replikation und Genexpression in z.B. E. coli notwendigen Genen und Antibiotika-Resistenzgenen eine Kassette, die Teile der Long-Terminal-Repeat-Regionen von HIV, das offene Leseraster für die HlV-gag- und Polymerase-Gene, das rev-Gen und das rev-responsive Element unter der
Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Außerdem enthält die Expressionskassette ein Markergen unter der Kontrolle eines zweiten Promotors. Die rekombinante Plasmid-DNA wird zusammen mit einem Plasmid, das außer den üblichen Teilen eines in E. coli replikationsfähigen Plasmids das
Glykoprotein des Vesikulären Stomatitis-Virus enthält, in eukaryote Zellen transfiziert . Dabei entstehen sogenannte retrovirale Pseudotypen, die die Hülle des Vesikulären Stomatitisvirus, die Polymerase-Gene und -Proteine der Patienten-Viren, die das Gag-Protein sowie die gag- und rev-Gene von einem HIV-Laborstamm und ein Markergen enthalten. Mit den retroviralen Pseudotypen werden anschließend eukaryote Zellen transduziert . Zellen, die transduziert sind, synthetisieren das Markerenzym. Die Anzahl der transduzierten Zellen kann durch die Aktivität dieses Enzyms mit Hilfe geeigneter Substrate nachgewiesen werden. In transduzierten Zellen werden keine infektiösen Viren gebildet. Werden bei der Produktion von retroviralen Pseudotypen HlV-Protease-Inhibitoren zugegeben, wird verhindert, daß sich infektiöse replikationsinkompetente Vektoren bilden. Es kommt nach anschließender Transduktion zu einer verringerten Anzahl an transduzierten Zellen. Werden bei der Transduktion Hemmstoffe der Reversen
Transkriptase zugesetzt, so wird die Synthese einer proviralen DNA und damit auch die weiteren Schritte der Infektion verhindert. Es kommt ebenfalls zu einer verringerten Anzahl transduzierter Zellen bzw. von Zellen, in denen die Aktivität des viralen Vektors direkt oder indirekt nachweisbar ist. Die Medikamente werden in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Für jeden getesteten Inhibitor und für jede Konzentration ergeben sich diskrete Meßwerte. Die Resistenz der Enzyme aus den Genen von Patienten-Virus wird mit der Sensibilität von HlV-Wildtypenzymen verglichen. Die Resistenz wird als Faktor gegenüber dem Normalwert angegeben. Resistenzen gegen nukleosidische (kompetitive) und nicht- nukleosidische (nicht-ko petitive) Reverse-Transkriptase- Inhibitoren sowie Protease- Inhibitoren können mit dieser Methode erfaßt werden.
Im folgenden werden nicht beschränkende, beispielhafte, zweckmäßige und/oder vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.
Die genetische Information zur Infektion der Zelle kann grundsätzlich jedem pathogenen Virus entstammen. Hierunter fallen insbesondere Human- tier- und planzenpathogene Vi- ren. Als Retroviren sind zu nennen: HIV-1, HIV-2, HIV-O, HTLV-I, HTLV-II, Katzenleukämievirus, Katzen-Immunschwächevirus, Affen-Immunschwächevirus, Bovines Immunschwächevirus und Equine Infectious Anemia Virus. In Frage kommende Herpesviren sind insbesondere: Herpes-Simplex Virus-1, -2, Varizelle-Zoster-Virus, Epstein-Barr Virus, Zytomegalievirus, Humanes Herpesvirus-6, -7, -8, Pferde- und Rinderherpesvirus, Schweineherpesvirus-1. Als Hepadnaviren sind zu nennen: Hepatitis-B- und Hepatitis-D-Virus.
Flaviviren sind beispielsweise: Hepatitis-C-Virus, Früh- sommermeningoenzephalitis-Virus, Gelbfieber- und Dengue- Viren. Pestiviren sind z.B.: Schweinepestvirus und Bovines Virusdiarrhoevirus . Unter die Gruppe der Adeno- und Pa- ramyxoviren fällt: Masern-, Mumps-, Respiratory-Syncytial, Parainfluenza, Staupe- und Rinderpestviren. Die Erfindung ist auch nutzbar im Rahmen von Papillomviren, Polyomviren, insbesondere JC-, BK- und SV40-Virus, Togaviren, insbesondere Röteinvirus, Eastern and Western Enzephalitis- Virus, Coronaviren, Picornaviren, insbesondere Enteroviren, Polioviren, Hepatitis-A-Virus, Rhinoviren, Maul- und Klauenseuchevirus, Rhabdoviren, insbesondere Tollwutvirus, Filoviren, insbesondere Marburg- und Ebolavirus, humanpa- thogene, geflügel-, pferde-, schweinepathogene Influenza- viren, Arenaviren, insbesondere Lymphochoriomeningitis-, Lassa-, Junin-, Machupo-, Guaranito-Virus, Bunyaviren, insbesondere Hantaviren, Rift-Valley-Fieber-Virus, La- Crosse-Virus, Sandfliegenfieber-Virus, Reoviren, insbesondere Rotaviren, Colorado-Zeckenfiebervirus, Caliciviren, insbesondere Hepatitis-E-Virus, Astroviren, Norwalk-Viren, Pockenviren, insbesondere Variolavirus, Molluscum-Conta- giosum-Virus, Vakzinia-Virus, Kuhpockenvirus, Parvoviren, insbesondere Parvovirus B19, Hunde-, Schweine- und Rinder- parvoviren, Afrikanisches Schweinepestvirus, Pferdepestvi- rus, Birnaviren, Bornavirus. Im Falle von Untersuchungen zu AIDS entstammt die genetischen Informationen zur Infektion der Zelle einem HI-Virus. Die genetische Information zur Infektion der Zelle kann eine Homologie im Bereich von 70 bis 100%, vorzugsweise 95 bis 100%, mit bekannten un- d/oder natürlichen entsprechenden Sequenzen aufweisen.
Als Markersubstanz kommen die verschiedensten Substanzen in Frage. Die Markersubstanz im engeren Sinne kann ein
Markerprotein der Gruppe bestehend aus "b-Galaktosidase, Sekretierte Alkalische Phosphatase, Grünes Fluoreszierendes Protein und Luciferase" sein. Die Detektion erfolgt m dem Fachmann gut geläufiger Weise nach Maßgabe der verwen- deten Markersubstanz. Ebenso ist es möglich, zur Quantifizierung der Transduktionsefflzient und/oder der viralen Genexpression ein Verfahren zum Nachweis viraler Nukleinsäuren oder Proteine zu verwenden. Schließlich ist es auch möglich, daß die Markersubstanz eine RNA ist, wobei es dann nicht darauf ankommt, ob die RNA eine Proteinexpression bewirkt oder "schweigt". Der Nachweis kann dann beispielsweise mittels m situ Hybridisierung mit einer anti-sense Riboprobe (RNA) erfolgen. Die damit sowie der Herstellung einer geeigneten anti-sense Riboprobe verbun- denen Technologien sind dem Fachmann gut bekannt und brauchen nicht naher erläutert zu werden.
Ein erfmdungsgemaßer viraler Vektor ist beispielsweise dadurch erhältlich, daß a) m ein Ausgangskonstrukt, ms- besondere ein Plasmid oder Cosmid, ein virales Genom inseriert wird, b) m dem Zielvirusgenom enthaltenden Konstrukt aus Stufe a) zumindest zwei für die virale Re- plikation notwendige Bestandteile modifiziert oder daraus deletiert werden, im Falle von HIV insbesondere zusatzlich zu einem viralen Gen, beispielsweise env, zumindest eine einen Pathogenitatsfaktor codierende Sequenz aus der Gruppe bestehend aus "vif, vpr, tat, vpu und nef" und/oder zumindest eine für die Genexpression des Virus notwendige Sequenz, insbesondere im 3 'U3-Bereιch, c) m das Produkt aus Stufe b) die genetische Information zur Expression der Markersubstanz inseriert wird, d) das Vektorkonstrukt aus Stufe c) m ein Vektorproduktionssystem eingebracht und darin exprimiert wird, e) optional ein m Stufe b)
deletiertes Protein in trans über ein Konstrukt, insbesondere ein Plasmid, oder eine Verpackungszellinie in Stufe d) eingeführt wird und f) der in Stufe d) bzw. e) erzeugte virale Vektor nach seiner Produktion mittels des Vektor- Produktionssystems, ggf. nach Zell-Kultivierung, isoliert wird. Das Vektorproduktionssystem bzw. -zellinie kann eine Verpackungszellinie sein. Eine Verpackungszellinie produziert bereits konstitutiv die für die Bildung der Viruspartikel notwendigen Virusbestandteile (im Falle von HIV das VSV-env-Gen bzw. den dadurch kodierten Bestandteil) . Die Isolierung kann darin bestehen, Zellkulturüber- stand abzunehmen.
Das Ausgangskonstrukt muß in der Lage sein, das virale Genom in geeigneten (Vektorproduktions-) Systemen (z.B. eukaryote Zellen oder Bakterien) zu exprimieren. Im Falle der Resistenztestung enthält das Vektorkonstrukt nach Stufe b) Teile von aus patientenspezifischen Virusgenomen gewonnenen Nukleinsäuresequenzen. Sofern für eine Infekti- onswirkung nötig, werden deletierte Proteine in trans wieder eingeführt. Dabei ist eine Pseudotypisierung möglich, das heißt, auch kompatible Proteine anderer Viren (bei HIV z.B. das Glykoprotein des Vesikulären Stomatitisvirus) können dabei Verwendung finden. Als Vektorproduktionssy- stem können Zellen mit einem zweiten (oder mit mehreren) Konstrukt bzw. Plasmid transfiziert werden oder es kann eine Verpackungszellinie verwendet werden, welche bereits konstitutiv eines oder mehrere Virusproteine exprimiert. Mit anderen Worten ausgedrückt, aus einem vollständigen infektiösem viralen Konstrukt bzw. Plasmid werden zunächst Teile herausgetrennt oder modifiziert, die für die Infektion und Replikation notwendig sind. Dann werden mittels eines zweiten Konstrukts bzw. Plas ids oder einer
Verpackungszellinie jene Bestandteile wieder ergänzt, welche für eine Infektion notwendig sind.
Grundsatzlich kann mit beliebigen Ausgangskonstrukten, Produktionszellmien, Klonierungsstrategien, Vektorsyste- men und/oder genetischen Informationen zu Markersubstanzen gearbeitet werden, solange dadurch ein erfmdungsgemaßer viraler Vektor entsteht.
Die Mindestreduktion betragt beispielsweise einen Faktor 0,5, vorzugsweise 0,2, hochstvorzugsweise 0,1, ldealerwei- se bis unter die Nachweisgrenze, bei einer vorgegebenen und von anderen Eigenschaften (z.B. Nebenwirkungen) des Wirkstoffes abhangigen Dosis. Stattdessen kann auch nach Maßgabe einer vorgegebenen Mindestreduktion die therapeutisch aktive Dosis eines getesten Wirkstoffes bestimmt werden. Dann wird die Dosis solange erhöht, bis die vorgegebene Mindestreduktion erreicht wird.
Grundsätzlich sind die viralen Vektoren, wie m den Literaturstellen V.N. Kim et al . , J. Vιrol.:72, 811-816, 1998, und T. Dull et al . , J. Vιrol.:72, 8463-8471, 1998, beschrieben, für die erfmdungsgemaßen Verfahren im Rahmen von HIV geeignet, sofern weitere erfmdungsgemaße Deletio- nen oder Veränderungen angebracht sind. Der erfmdungsgemaße virale Vektor gemäß Fig. 2 bzw. das erfindungsgemaße Herstellungsverfahren für einen viralen Vektor weist letztendlich die folgenden Vorteile auf. Die Transfektion mit maximal 2, anstatt 3 und mehr, Plasmiden ist leichter zu handhaben, besser standardisierbar, besser reproduzierbar und kostengünstiger. Erfindungsgemaße Konstrukte bzw. Plasmide enthaltend die Teile des viralen Genoms und die genetische Information zur Expression der Markersubstanz
führen zu einer um den Faktor 10 bis 100 höheren Transfek- tionseffizienz . Das Vektorgenom ist so konstruiert, daß ein Austausch von patientenspezifischen Virusgenomfragmenten über singuläre Restriktionsstellen möglich ist. Wenn eine Erkennungsrestriktionsstelle eingeführt wird, ist es zudem möglich den erfolgreichen Fragmentaustausch nach Insertion der patientenspezifischen Sequenz nachzuweisen (siehe auch Fig. 2a) .
Daher ist es im Allgemeinen bevorzugt, wenn das Ausgangs- konstrukt bzw. der virale Vektor eine singuläre Restriktionsstelle zum Austausch von Zielvirusgenom und, optional, eine Erkennungsrestriktionsstelle zur Ermöglichung des Nachweises des Austausches enthält.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1: ein Plasmid pGJl,
Figur 2a-b: ein Vektorplasmid pGJ3-lacZ-Kpn (a) und ein Vektorplasmid pGJ3-lacZ (b) ,
Figur 3: einen Medikamenten-Wirkungstest und
Figur 4: eine Resistenztestung replikationsinkompetenter retroviraler Vektoren.
Beispiel 1: Test der Wirksamkeit antiviraler Substanzen am Beispiel von HIV-1
A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al . , J. Virol .
1997; 71:7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3 '-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel entfernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen- Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHII und Aflll sowie mit Afllll und Xbal verdaut. Der 3 '-Teil des CMV- Promotors und der 5 '-Teil der R-Region aus dem HIV-LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/Afllll und Afllll/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekonstruierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHII und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJl (siehe Figur 1) erhalten. Durch rekombinante PCR wurden die zellulären Restse- quenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit PvuII und EcoRV wurde eine Deletion in der 3 ' -U-Region vorgenommen. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp718 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Durch Verdau mit Ndel und Mfel wurden das vif-, das vpr- und das tat-Gen ent- fernt. Anschließend wurde das E. coli lacZ-Gen unter Kontrolle des SFFV-Promotors in die
Esp3I-Restriktionsstelle hineinligiert . Dadurch erhielten wir Plasmid pGJ3-lacZ (Siehe Figur 2b) .
B) Die rekombinante Plasmid-DNA wurde zusammen mit einem weiteren Plasmid, das das Gen für das Glykoprotein des Vesikulären-Sto atitis-Virus unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält (Pietschmann et al. J. Virol. 1999; 73:2613-2621), durch die CaCl2 Methode (Soneoka et al. NucI . Acids Research 1995. Vol. 23. No .4.
628-633) in 293T-Zellen transfiziert . Die Zellen wurden für 8 h bei 37 °C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h inkubiert. Anschließend wurde mit
Natπum-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Medium entfernt und die Zellen für weitere 16 h m frischem Medium inkubiert. Dabei entstehen replikationsmkompe- tente Virus-Vektoren, die im Zellkulturuberstand nachweisbar sind. Definierte Volumina des vektorpartikelhaltigen Kulturuberstands wurden für die Transduktion von 293-Zellen verwendet. Die Transduktion der Zellen fuhrt zur Reversen Transkription und Inte- gration des Virusgenoms m das Zellgenom. Nach Transkription und Translation kommt es zur Synthese des Markerprotems b-Galaktosidase m diesen Zellen. Die Aktivität dieses Enzyms wurde mit Hilfe von X-Gal nachgewiesen.
C) Für die Austestung der Wirksamkeit der Virustatika wurden die zu testenden Substanzen zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugegeben. Protease-Inhibitoren wie Saqumavir, Indmavir, Ritonavir etc. wurden bei der Induktion der Vektor-DNA-Transkription und wahrend der Transduktion zugegeben. Dadurch wird verhindert, daß sich infektiöse retrovirale Virusvektoren bilden. Reverse Transkriptase-Inhibitoren wie AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC, Nevirapm etc. wurden bei der Transduktion zuge- setzt. Dadurch wird die Synthese einer proviralen DNA und damit auch die weiteren Schritte der Infektion verhindert. Die Hemmung der Expression des Markerprotems spiegelt die Hemmung der HIV-Enzymfunktion durch die Substanzen wider, wozu auf die Figur 3 verwiesen wird.
In der Figur 3 wurden Zellen mit dem replikationsinkompetenten HIV-Vektor pGJ3-lacZ m Gegenwart oder Abwesenheit der antiviralen Wirkstoffe Azidothymidme (AZT) , Nevirapm
(NVP) und Indmavir (IDV) transduziert. Die Figur 3 zeigt die Anzahl der Markergen-positiven Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Man erkennt, daß bei einer Testung eines (prospektiven) Wirkstoffes unmittelbar sogar eine quantitative Aussage über die Wirkung erhalten wird. Dies macht die Erfindung geeignet für das Screenen nach neuen Wirkstoffen und für eine qualitative und/oder quantitative Beurteilung aufgefundener Wirkstoffe.
Grundsätzlich ist es im Rahmen der Erfindung möglich, m A) mit anderen Ausgangskonstrukten bzw. -plasmiden, anderen Virusisolaten bzw. Provirus-Plasmiden, anderen Klonie- rungsstragegien, anderen Verpackungszellmien, anderen Vektorsystemen und/oder anderen Markersubstanzen und ande- ren Detektionssystemen zu arbeiten. Bezuglich B) sind andere Transfektionsmethoden und/oder andere Transfektions-, Induktions- und/oder Inkubationszeiten denkbar. Es können auch konstitutiv Virusprotem-exprimierende Zellen verwendet werden. Es können auch andere Produktionszeilen oder -Systeme verwendet werden. Es können auch andere Zielzellen eingesetzt werden. Zu C) ist bei Retroviren der Test auf z.B. Integrase-Inhibitoren eine mögliche Alternative.
Beispiel 2: Testung der Resistenz von Viren gegen antivirale Substanzen.
A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al . , J. Virol.
1997; 71:7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3 '-Teil des CMV-Promotors durch Restπktionsverdau mit Pmel und Ndel entfernt. Das HIV-1-Plasmιd pHXB2D (Gen- Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHII und Afllll sowie mit Afllll und Xbal verdaut. Der 3 '-Teil des CMV-
Promotors und der 5 '-Teil der R-Region aus dem HIV-LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/AflUI und AfHII/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekonstruierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, ver- daut mit BssHII und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wurden miteinander ligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJl (siehe Fig. 1) erhalten. Durch rekombinante PCR wurden die zellulären Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit PvuII und EcoRV wurde der durch diese Schnittstellen definierte Bereich aus der 3'-U3-Region entfernt. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp718 wurde das nef-Gen entfernt. Durch Verdau mit Ndel und Mfel wurden das vif-, das vpr- und das tat-Gen entfernt. Anschließend wurde das E. coli lacZ-Gen unter Kontrolle des SFFV-Promotors in die Esp3I-Restriktionsstelle hineinligiert . Dadurch erhielten wir Plasmid pGJ3-lacZ (Siehe Fig. 2b) . In die EcoRV-Schnittstelle wurde eine Kpnl-Schnittstelle inseriert, wodurch das Plasmid pGJ3-lacZ-Kpn erhalten wird (Fig. 2a) .
Aus Patienten-Plasma wurde Virus-RNA mit Hilfe des QIAa p Viral RNA Kits entsprechend den Angaben des Herstellers gewonnen.
Virale RNA wurde entweder mit dem Superscript II RT Kit (Life Technologies, Karlsruhe) oder mit dem Omniscript RT-Kit (QIAGEN, Düsseldorf) in c-DNA transkribiert. Ein ca. 2,2 kBp großes Fragment, das den Protease- und Reverse-Transkriptase-Teil des Polymerase-Gens von
HIV-1 enthält, wurde durch nested-PCR mit spezifischen Primern amplifiziert. Die äußeren Primer sind: outpr2 - cac tag aag aaa tga tga cagcat gtc ag,
outrt - cct gcc ctg ttt ctg ctg gaa taa ct. Die inneren Primer sind: outprl - aaa ttg cag ggc ccc tag gaa aaa ggg, inrt - tgc cat att cct gga cta cag tct act t. Die inneren Primern enthalten Apal bzw.
PshAI-Spaltstellen. Zur Amplifikation wurde die Pfu-Polymerase verwendet. Beide Amplifikationen wurden mit jeweils 30 Zyklen durchgeführt. Die amplifizierten Fragmente wurden über die Restriktionsenzymschnitt- stellen Apal und PshAI in das Plasmid pGJ3-lacZ-Kpn ligiert und in E.coli. Stamm DH5a, transformiert. Die transformierten Bakterien wurden entweder auf Selektiv-Agarplatten ausgestrichen oder in Flüssigmedium über Nacht vermehrt. Anschließend wurden entweder einzelne Bakterienklone oder unselektierte
Bakterien weiterverwendet. Aus den Bakterien wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe eines Qiagen-Plas id-Kits gewonnen. Die erfolgreiche Insertion der patientenspezifischen Virusfragmente kann über Restiktionsverdau mit Kpnl getestet werden, da die Schnittstelle nach der Entfernung des usprünglichen Fragments mit verschwindet.
Die rekombinante Plasmid-DNA wurde zusammen mit einem weiteren Plasmid, das das Gen für das Glykoprotein des Vesikulären-Stomatitis-Virus unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält (Pietschmann er al. J. Virol. 1999; 73:2613-2621), durch die CaCl- Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol, 23. No .4. 628-633) in 293T-Zellen transfiziert . Die Zellen wurden für 8 h bei 37 °C inkubiert, Medium gewechselt und für weitere 16 inkubiert. Anschließend wurde zur Induktion der Virusvektortranskription Natrium-Butyrat zugegeben und
damit für 8h inkubiert. Schließlich wurden die transfizierten Zellen mit frischem Medium weitere 16h kultiviert. Dabei entstehen replikationsinkompetente Vektoren, die im Zellkulturüberstand nachweisbar sind. Definierte Volumina des Virusvektor-haltigen
Kulturüberstands wurden für die Transduktion von 293-Zellen verwendet. Die Transduktion der Zellen führt zur Reversen Transkription und Integration des Virusgenoms in das Zellgenom. Nach Transkription und Translation kommt es zur Synthese des Reporterproteins, b-Galaktosidase, in diesen Zellen. Die Aktivität dieses Enzyms wurde mit Hilfe von X-Gal nachgewiesen.
Für die Austestung der Virusresistenz wurden die zu testenden Substanzen zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugegeben. Protease-Inhibitoren (PI) wie Saquinavir, Indinavir, Ritonavir etc. wurden bei der Induktion der Virusvektortranskription und während der Transduktion zugegeben. Dadurch wird verhindert, daß sich infektiöse retrovirale Pseudotypen bilden. Reverse
Transkriptase-Inhibitoren wie AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC, Nevirapin etc. wurden bei der Transduktion zugesetzt. Dadurch wird die Synthese einer proviralen DNA und damit auch die weiteren Schritte der Infektion verhindert. Die Medikamente wurden in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Für jeden getesteten Inhibitor und für jede Konzentration ergaben sich diskrete Meßwerte. Die Resistenz der Enzyme aus den Genen von Patienten-Virus wurde mit der Sensibilität von HlV-Wildtypenzymen verglichen, wozu auf die Figur 4 verwiesen wird.
In der Figur 4 wurden die HIV-Vektoren pGJ3-lacZ und pGJ3-lacZ-MDR in 293 Zellen transduziert. Der pGJ3-lacZ- MDR Vektor enthält eine Polymerase mit multiplen Resistenzen gegen verschiedene antivirale Substanzen. Beide Vektoren wurden in der Gegenwart oder Abwesenheit des nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitors AZT, des nicht-nukleosidischen RT-Inhibitors NVP oder des Protease-Inhibitors IDV getestet. Die Funktion der Virusenzyme wird durch die Expression des Markergens sichtbar gemacht. Die RT- und PR-Inhibitoren hemmen in konzentrationsabhängiger Weise die Funktion des Standard- HIV-Vektors pGJ3-lacZ. Die Funktion des Vektors pGJ3-lacZ- MDR wird nur in geringem Maße beeinträchtigt. Man erkennt also ohne weiteres, daß Reverse Transkriptase und Protease des HIV-Konstrukts pGJ3-lacZ-MDR resistent gegenüber den getesteten Substanzen sind.
In Stufe A) kann alternativ mit anderem Ausgangskonstrukt bzw. -plasmid, anderem Virus-Isolat bzw. Provirus-Plasmid, anderer Klonierungsstrategie, anderem Vektorsystem, anderer Verpackungszellinie und/oder anderer Markersubstanz und anderen Detektionssystemen gearbeitet werden. Bei B) kann mit anderem Patientenmaterial (z.B. Serum, Liquor, Gewebe usw.), anderem Fragment, z.B. einschließlich Integrase und/oder gag-Sequenzen, anderen Primern, anderen Enzymschnittstellen, anderer Aplifikationsmethode und/oder anderer DNA-Aufbereitung gearbeitet werden. In Falle von C) bestehen Alternativen in anderen Transfektionsmethoden. Es können für bestimmte Messungen auch Zellinien verwendet werden, die zuvor stabil mit dem VSV-Glykoprotein-Plasmid transfiziert wurden. Es können auch andere Produktionszellen oder -Systeme verwendet werden. Es können auch andere
Zielzellen verwendet werden. Für D) gilt: es ist möglich, alle anderen Reverse Transkriptase- und Protease-Hemmer zu testen, und auch Integrase-Inhibitoren zu testen, wenn das Vektorplasmid und das Amplifikat aus Patientenmateπal entsprechend genetisch modifiziert wird, und/oder andere Therapieansatze, z.B. Antisense-Methode oder intrazellular wirksame Antikörper zu untersuchen.