DE69632263T2

DE69632263T2 - Zusammensetzung und verfahren zur verleihung der resistivität gegen hiv superinfektion auf zellen

Info

Publication number: DE69632263T2
Application number: DE69632263T
Authority: DE
Inventors: Maurizio Federico; Paola Verani; Fulvio Mavilio; Giuliana Ferrari
Original assignee: MOLECULAR MEDICINE SpA; Istituto Superiore di Sanita ISS
Current assignee: MOLECULAR MEDICINE SpA; Istituto Superiore di Sanita ISS
Priority date: 1995-10-09
Filing date: 1996-10-08
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2016-10-09
Also published as: EP0859847B1; AU7331996A; EP0859847A1; DE69632263D1; US6429009B1; ITRM950667A0; JP3805371B2; ATE264915T1; JPH11514231A; IT1276215B1; WO1997013861A1; ES2220994T3; ITRM950667A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Verleihung der Widerstandsfähigkeit (Resistivität) gegen HIV Superinfektion.
Genauer gesagt umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung und ein Verfahren, um menschlichen Zellen, insbesondere T-Zellen Widerstandsfähigkeit gegen eine Superinfektion mit einem Retrovirus, speziell dem Human Immunodefiency Virus (HIV) zu verleihen.
Es wurden verschiedene experimentelle Strategien vorgeschlagen, die darauf abzielten, eine HIV-Replikation in vivo zu hemmen. Insoweit basierten die meisten auf immunotherapeutischen oder chemotherapeutischen Ansätzen, in welchen der Anti-HIV Mechanismus in seiner Wirkung genau bekannt ist. Wie auch immer, bei keinen der bislang vorgeschlagenen immunotherapeutischen und chemotherapeutischen Ansätze wurde nachgewiesen, dass sie eine resolute HIV-Therapie bewirken.
Das Ziel eines erst kürzlich entwickelten alternativen experimentellen Anti-HIV Plans war es, die durch die Induktion intrazellularer Immunisierung gegen HIV-Replikation resistente Target-zelle zurückzugeben. (Baltimore, Nature 335:395-396 (1988)). Die Hemmung der HIV-Superinfektion war tatsächlich nachgewiesen bei Zellen, die HIV-transdominante Proteine auspressen (Malim et al., J. Exp. Med. 176: 1197–1201 (1992); Green et al., Cell 58:215–223 (1989); Modesti et al., New. Biol. 3:759–768 (1991); Trono et al., Cell 59:113–120 (1989), Lisziewicz et al., Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, Gene Therapy (1993); Buchschacher et. al., Hum. Gene Ther. 3:391–397 (1992); Stevenson et al., Cell 83:483–486 (1989) und Liu et al., Gene Therapy 1:32–37 (1994)), HIV Genomgerichteten Ribozymen (Yu et al., Gene Therapy 1:1:3–26 (1994); Lorentzen et al., Virus Genes 5:17–23 (1991); Sioud et al., PNAS USA 88:7303–7307 (1991); Weerasinghe et al., J. Virol. 65:5531–5534 (1991) und Yamada et al., Gene Therapy 1:38–45 (1994)), tat/rev Ködern (Sullenger et al., Cell 63:601608 (1990); Sullenger et al., J. Virol. 65:6811–6816 (1991) und Smith et al., UCLA/UCI AIDS Symposium: Gene Therapy Approaches to Treatment of HIV infection (1993)) oder antisense RNA (Rhodes et al., J. Gen. Virol. 71:1965–1974 (1990); Rhodes et al., AIDS 5: 145–151 (1991); Sczakiel et al., J. Virol. 65:468-472 (1991); Joshi et al., J. Virol. 65:5524–5530 (1991) und Chatterjee et al., Science 258:1485–1488 (1992)). Darüber hinaus wurde eine wirksame anti-HIV intrazellulare Immunisierung durch Transfektion HIV-anfälliger Zellen mit DNA-Codierung für entweder einen anti-gp160 einkettigen Antikörper (Marasco et al., PNAS USA 90:7889–7893 (1993)) oder einem monoklonalen anti-rev einkettigen variablen Bereich (Duan et al., Abstract from the 1994 Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, Sept. 25-Oct. 1, 1994, MD USA).
Wie auch immer, die Verfahren des Standes der Technik leiden an den nachfolgenden Nachteilen. Viele der oben genannten Verfahren funktionieren in der Praxis nicht richtig aufgrund der Tatsache, das Anti-HIV Verbindungen, die fähig sind, einen einzelnen Schritt der HIV-Replikation zu erzielen, leicht das Auftreten von HIV resistenten Mutanten verursachen könnten. Dies ist ein sehr häufiges biologisches Ereignis in Anbetracht der außerordentlichen Fähigkeit von HIV zu mutieren, beispielsweise nachgewiesen durch die HIV Linien, die resistent gegenüber anti-retroviralen chemischen Verbindungen (d.h. AZT, ddl) sind und von AIDS-Patienten isoliert wurden, welche mit derartigen Medikamenten behandelt wurden. Konsequenterweise versuchen viele Forscher anti-HIV-Reagenten synthetisch herzustellen, welche fähig sind, auf verschiedene Schritte des HIV Lebenszyklus abzuzielen. Zusätzlich wurde bei einigen der beschriebenen Verfahren nachgewiesen, dass sie entweder schädlich für die Wirtszelle sind, oder schwierig innerhalb der klinischen Protokolle wirksam anzuwenden sind.
Die vorliegende Erfindung strebt danach, diese Nachteile der oben beschriebenen Verfahren zu überwinden. Die Urheber der Erfindung haben ein Verfahren entwickelt, menschlichen Zellen Widerstandsfähigkeit (Resistivität) zu verleihen, insbesondere gegenüber T-Zellen, gegenüber HIV Superinfektion, folgend einer dauerhaften Integration einer nicht infektiösen, nicht produzierenden HIV genomischen Variante in mindestens einige Zellkern-Genome. Um menschlichen Zellen Widerstandsfähigkeit gegenüber HIV Superinfektion zu verleihen, stellt diese Erfindung eine Verbindung bereit, um zur HIV intrazellularen Immunisierung während der AIDS Behandlung eingesetzt zu werden. Die Erfindung hat verschiedene Vorteile, einschließlich einer einfachen Handhabung, das Fehlern spontaner HIV Reversion nicht defekter Varianten von einem nicht produzierenden zu einem produzierenden Erscheinungsbild, und die Fähigkeit, eine gute Resistenz gegenüber Superinfektion zu verleihen.
Beweise, die durch in viro Experimente erzielt wurden zeigen an, dass die F12-HIV nicht defekte nicht produzierende Variantenausbildung verschiedene Stufen des Wildtyp HIV Superinfektion Lebenszyklus hemmen könnten. Tatsächlich haben die Urheber der Erfindung eine Blockierung der Wildtyp HIV Replikation gezeigt, jeder vor oder nach dessen eigenen Tetrotranskription, in Abhängigkeit von der F12-HIV-darstellenden getesteten Zellen. Darüber hinaus wurden keine Veränderungen oder Verschlechterungen der physiologischen Zellfunktionen in irgendeiner Zelle gezeigt, die das F12-HIV-Genom beherbergt.
„HIV" wird hier benutzt, um alle früheren und gegenwärtigen Bezeichnungen zu umfassen, die derartigen Viren zugeordnet sind, die impliziert werden als kausale Wirkstoffe für das acquired immunodeficiency syndrom (AIDS) und AIDS-related complex (ARC), so wie HIV, das heißt HIV-1 und HIV-2, und HTLV, das heißt HTLV-III. Mit „Superinfektion" ist das gemeint, was bei in der Fachwelt bekannt ist und von ihr verstanden wird, das heißt die Fähigkeit eines gegebenen Virus eine Zelle zu infizieren, die bereits von einem Virus infiziert ist. Mit „Resistivität" ist die Kapazität gemeint der Superinfektion durch einen Virus, insbesondere einen Retrovirus, speziell HIV, zu widerstehen. Mit „nicht defekt" ist gemeint, dass das Genom vollständig ist, wohingegen mit „nicht produzierender" gemeint ist, dass keine viralen Partikel produziert werden.
Die vorliegender Erfindung stellt eine Zusammenstellung bereit, enthaltend einen retroviralen rekombinanten Vektor, enthaltend ein Genom einer nicht defekten, nicht produzierenden HIV Variante, wobei das besagte Genom von dem vollständigen 3' end long terminal repeat (LTR) gelöscht wird und in Gegensinn-Orientierung (antisense orientation) bezüglich der Transkriptionsrichtung des Vektors eingesetzt ist, in ausreichender Mange um eine dauerhafte Integration des besagten Genoms in mindestens einige Kerngenome der menschlichen Zellen zu bewirken und eine Expression des besagten Genoms, um menschlichen Zellen Resistivität gegen HIV Superinfektion zu verleihen.
Vorzugsweise nimmt das nicht defekte, nicht produzierende HIV Varianten Genom mindestens 1 % des Zellkerngenoms auf. Bevorzugter nimmt das nicht defekte, nicht produzierende HIV Varianten Genom zwischen etwa 1 % und etwa 10 % des Zellkerngenoms auf. Vorzugsweise ist das nicht defekte, nicht produzierende HIV Varianten Genom das HIV F12 Genom. Es ist weiterhin bevorzugt, dass der 3' LTR des F12 Genoms vor der Einfügung in den retroviralen Vektor gelöscht wird und dass das Genom in den retroviralen Vektor in Gegensinn-Orientierung eingesetzt wird. Für die Zusammensetzung der Erfindung ist ein retroviraler Vektor, abgeleitet vom Moloney Mäuse-Leukämie-Virus (MoMLV) bevorzugt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert den Gebrauch eines retroviralen Vektors enthaltend ein nicht defektes, nicht produzierendes HIV Varianten Genom in ausreichender Menge, um eine dauerhafte Integration des nicht defekten, nicht produzierenden HIV Varianten Genoms in zumindest einige der Zellkerngenome, um in Kontakt mit dem besagten Vektor und der Expression der besagten nicht defekten, nicht produzierenden HIV Varianten Genoms in die Zelle zu kommen.
Vorzugsweise nimmt das nicht defekte, nicht produzierende HIV Varianten Genom mindestens 1 % des Zellkerngenoms auf. Bevorzugter nimmt das nicht defekte, nicht produzierende HIV Varianten Genom zwischen etwa 1 % und etwa 10 % des Zellkerngenoms auf. Vorzugsweise ist das nicht defekte, nicht produzierende HIV Varianten Genom das HIV F12 Genom. Es ist bevorzugt, dass der 3' LTR des F12 Genoms vor der Einfügung in den retroviralen Vektor gelöscht wird und dass das Genom in den retroviralen Vektor in Gegensinn- Orientierung eingesetzt wird. Für die Zusammensetzung der Erfindung ist ein retroviraler Vektor, abgeleitet vom Moloney Mäuse-Leukämie-Virus (MoMLV) bevorzugt.
Alternativ stellt die vorliegende Erfindung den Gebrauch einer Zusammensetzung bereit, enthaltend einen retroviralen Vektor eines nicht defekten, nicht produzierenden HIV Varianten Genoms, um zur Herstellung eines Medikaments zur AIDS Behandlung eingesetzt zu werden.
Ein angewandtes Verfahren der Erfindung ist es, menschlichen Zellen Resistivität gegen HIV Superinfektion verleihen, indem einem Menschen Zellen entnommen werden, die entnommenen Zellen mit der Zusammensetzung der Erfindung in ausreichender Menge, um eine dauerhafte Integration und Expression der nicht defekten, nicht produzierenden HIV Variante in mindestens einige der Zellkern-Genome zu erhalten, zu verbinden und die so behandelten Zellen dem Menschen, dem sie entnommen wurden, wieder zuzuführen. Derartige ex vivo Verfahren sind beschrieben in Ferrari G., Rossini S., Giavazzi R., Maggioni D., Nobili N., Soldati M., Ungers G., Mavilio F., Gilboa E., Bordignon C. „An in vivo modell of somatic cell gene therapy for human severe combined immunodefiency." Science 251:1363, 1991.
Obwohl theoretisch jedes Genom einer nicht defekten, nicht produzierenden HIV Variante in dem vorliegenden erfinderischen Verfahren verwendbar oder verwendbar übertragen sein könnte, bist] das Genom des F12-HIV [besonders geeignet](Dr. M. Federico, Laboratory of Virology, Istituto Superiore di Sanitá, Rome).
Das F12-HIV Varianten Genom, dessen Sequenz und Charakteristik in Carlini et al. J. Viral Disease 1:40–55 (1992) beschrieben ist, hier gänzlich verbunden, ist durch mehr als 50 Mutationen charakterisiert, von denen die meisten in den gag, pol and vif- Genen sind und welche in anderen HIV1-Arten nicht auftreten. Der Mechanismus der Resistenz gegen Superinfektion ist unbekannt, und es ist denkbar, das die Resistenz entweder durch die Expression eines einzelnen negativen trans-dominanten Gen Produkts oder, wahrscheinlicher, durch die begleitende Expression von mehr als einem solchen Produkt bewirkt wird. Der Austausch von homologen Fragmenten zwischen dem F12-HIV Varianten Genom und einer Wildform, einem infektiösen HIV-1 molekularen Klon, genannt pNL4-3 (Dr. M. Martin, AIDS Research and Reference Program, AIDS Program, NIAID, NIH), der aus Transfektion in HIV-sensitive menschliche Zellen erfolgt, zeigt an, dass es notwendig ist, mindestens 6 kb des Genoms zwischen den Bcl und Xho I Restriktionsstellen zu ersetzen und die pol, vif, vpr, vpu, tat, rev und env Gene einzuschließen, um den F12 Phänotypus von nicht produzierend in produzierend zu revertieren. Folglich ist das Risiko einer spontanen Reversion nicht defekter F12-HIV Varianten von replikationsunfähig zu replicationsfähig nennenswert gering. das Risiko ist in den bevorzugten F12-HIV Varianten-Gestaltungen weiter vermindert durch die Abwesenheit des vollständigen 3' LTR und der meisten der nef Gene, welche beide für eine Replikation erforderlich sind. Eine Zellpopulation , die homogen das F12 HIV Genom ausdrückt, würde jeglichen replikationsfähigen HIV Verseuchungsstoff durch die kollidierende Wirkung desselben F12-HIV blocken; dieses ist folgerichtig mit dem Ergebnis, das in HIV-1 superinfizierten HeLa CD4⁺ Zellen, die den F12-HIV Provirus in voller Länge ausdrücken, in einer über drei Monate angelegten dauerhaften CEMss Co-Kultur keine infektiöses HIV-1 - Abgabe beobachtet wurde.
Die Inaktivierung der F12 Gene, allein und in allen möglichen Kombinationen, entweder durch Mutagenese, dass heißt Insertion eines prämaturen Stop-Codons, oder durch Löschung, gefolgt von einer Transfektion der resultierenden Mutanten in HIV-permissive menschliche Zellen, kann durchgeführt werden um festzustellen, welche Mutationen es dem F12 Genom ermöglichen, Resistenz gegenüber Superinfektion zu verleihen. Alternativ kann jede einzelne Mutation in dem F12 Genom zu einer Wildform revertiert werden und die resultierenden Produkte in HIV-permissive menschliche Zellen tranfektiert werden. Derartige Verfahren würden die Identifikation derjenigen Gene ermöglichen, die für den Hemmungsmechanismus verantwortlich sind und nur diese Gene könnten in andere HIV Genome mutiert werden und dadurch den Einsatz anderer HIV Genome im Zusammenhang mit dem vorliegenden erfinderischen Verfahren ermöglichen.
Obwohl theoretisch jeder retrovirale Vektor geeignet ist oder geeignet übertragen werden kann, um in dem vorliegenden erfinderischen Verfahren verwendet zu werden, es sollte ein retroviraler Vektor benutzt werden, der die Expression des F12 Genoms auf einem ausreichend hohen Level erlaubt, um eine virale Hemmung, dass heißt Resistenz gegen Superinfektion zu bewirken. Darüber hinaus sollte der retrovirale Vektor ein selektives Gen ausdrücken, vorzugsweise das Gen, das Resistenz gegen das antibiotische G418 codiert. Beispiele retroviraler Vektoren umfassen N2, pLj, LXSN und NSV. Der retrovirale Vektor, der für den Einsatz in dem vorliegenden erfinderischen Verfahren bevorzugt wird, ist N2. Vektoren die vom Moloney Mäuse-Leukämie-Virus (MoMLV) abgeleitet sind (Dr. E. Gilboa, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, NY) sind besonders bevorzugt.
Es sollten Messungen durchgeführt werden, um jegliche Instabilität , verursacht durch die Präsenz zweier identischer, wiederholter Sequenzen, dass heißt die 5' und 3' LTRs, in dem Vektor zu vermeiden, Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die Streichung des 3' LTR, welches einen Teil des nef Gens des F12-HIV Genoms umfasst, vor der Insertion in den retroviralen Vektor.
Ebenfalls sollten Messungen durchgeführt werden, um jegliche transkriptionalen Interferenzen zu vermeiden, wie sie zwischen den LTRs von F12 und von dem retroviralen Vektor resultieren können. Eine bevorzugte Messung umfasst die Insertion des F12 Genoms, insbesondere des F12 Genoms von dem der 3'LTR gestrichen wurde, in den retroviralen Vektor in Gegensinn- Orientierung.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird die Zusammensetzung, umfassend einen wir oben beschriebenen retroviralen Vektor, enthaltend ein Genom von einer nicht defekten, nicht produzierenden HIV Variante, direkt einem Menschen verabreicht. Geeignete Wege der Verabreichung sind der Fachwelt bekannt. Ungeachtet dessen, welche Zusammensetzung und welches Verabreichungsverfahren verwendet wird, sollte der rekombinante retrovirale Vektor dem Menschen in ausreichender Menge verabreicht werden, um eine dauerhafte Integration und Expression des nicht defekten, nicht produzierenden HIV Varianten Genom in mindestens einige der Zellkerngenome des Menschen zu bewirken (siehe z.B. Ferrari et al., Science 25: 1363 (1991); Ferrari et al., Blood 80: 1120 (1992) und Mavillo et al., Blood 83: 1988 (1994) und das Protokoll fortgesetzt in Borneo et al., Human Gene Therapy 4: 513 (19939)).
Der retrovirale Vektor, enthaltend das nicht defekte, nicht produzierende HIV Varianten Genom kann hergestellt werden in einer geeigneten Zusammensetzung, um Zellen in vitro zu kontakten oder in Form von geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung in vito mit geeigneten Trägern oder Verdünnern, welche weiterhin pharmazeutisch akzeptiert werden können. Wo geeignet können die Vektoren in Präparate eingebracht werden, die eine feste, halbfeste, flüssige oder gasförmige Form aufweisen, wie Suppositorien, Injektionen, Inhalate und Aerosole, in den üblichen Arten für deren jeweiligen Verabreichungswegen. In der Fachwelt bekannte Mittel können eingesetzt werden, um die Freisetzung und Absorption der Zusammensetzung, bevor diese die gewünschten Zellen erreicht hat, zu verhindert oder um die zeitlich festgelegte Ausschüttung der Zusammensetzung zu gewährleisten. Es sollte eine pharmazeutisch akzeptable Form verwendet werden, welche die Zusammensetzung nicht beeinträchtigt. In pharmazeutischen Dosierungsformen kann die Zusammensetzung allein oder in geeigneten Verbindungen sowie in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Komponenten eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können über verschiedene Wege und zu verschiedenen Stellen im Körper verbracht werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass, obwohl mehr als ein Weg zur Verabreichung benutzt werden kann, ein besonderer Weg ein unmittelbareres und effektiveres Ergebnis liefern kann, als ein anderer Weg. Lokal oder systemische Verteilung kann durch Verabreichung erzielt werden, die Applikation oder Infusion der Zusammensetzung in Körperhöhlen, Inhalation oder Insufflation eines Aerosols umfasst oder durch parenterale Einleitung, umfassend intramuskuläre, intravenöse, peritonale, subkutane, intradermale sowie lokale Verabreichung.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann bereitgestellt werden in einheitlichen Dosierungsformen, worin jede Dosierungseinheit, z.B. ein Teelöffel, eine Tablette, eine Lösung oder ein Suppositorium eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung beinhaltet, allein oder in geeigneter Kombination mit anderen aktiven Wirkstoffen. Der Begriff „einheitliche Dosierungsform", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf physikalische diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für menschliche oder tierische Subjekte geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, allein oder in Kombination mit anderen aktiven Wirkstoffen beinhaltet, berechnet in einer Menge, die ausreicht, um den erwünschten Effekt zu erzielen, in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Diluent, Träger oder Vehiculum, wo geeignet. Die Spezifikationen für einheitliche Dosierungsformen hängen ab von der speziellen Pharmacodynamik des einzelnen zu behandelnden Individuums.
Folglich kann ein rekombinanter retroviraler Vektor, umfassend ein nicht defektes, nicht produzierendes HIV-1 Varianten Genom, einem Menschen verabreicht werden unter Nutzung jeglicher der vorgenannten Arten der Verabreichung oder alternativer, in der Fachwelt bekannter und für eine bestimmte Anwendung geeigneter Wege. Die Menge der verabreichten Vektoren sollte ausreichend sein, um eine dauerhafte Integration des nicht defekten, nicht produzierenden HIV Varianten Genoms in zumindest einige der Zellkerngenome in dem Menschen und Expression der nicht defekten, nicht produzierenden HIV Varianten Genome in diesen zu bewirken. Eine solche Integration kann beispielsweise überwacht werden durch den Nachweis der Genomintegration, z.B. unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion in Verbindung mit Sequenzierungen oder Southern Hybridisierungen.
Die vorliegende erfindungsgemäße Zusammensetzung kann eingesetzt werden, um eine intrazellulare Immunisierung zu bewirken sowie um eine initiale HIV-Infektion eines Individuums und dem Risiko einer solchen Infektion vorzubeugen oder nicht zuletzt zu verhindern. Sie kann auch in der therapeutischen Behandlung eines HIV + Individuums zur Hemmung oder, nicht zuletzt, zur Verlangsamung der Ausbreitung der Infektion und Vorbeugung oder, nicht zuletzt, der Verzögerung des Ausbruchs von AIDS oder ARC eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang kann die Zusammensetzung in Kombination mit anderen antiretroviralen Medikamenten, insbesondere anderen anti-HIV Behandlungen, verwendet werden, vorausgesetzt, dass diese nicht der Fähigkeit des nicht defekten, nicht produzierenden HIV Varianten Genoms entgegenwirken, dauerhaft in zumindest einige der Zellkerngenome im Menschen zu integrieren und sich selbst hierin auszudrücken. Es sollte erwähnt werden, dass die vorliegende Zusammensetzung auch Nutzen in vitro hat. Zum Beispiel könnte die Zusammensetzung genutzt werden, neben weiteren Aspekten betreffend F12 HIV hervorgerufene Hemmungen (dass heißt, in dem SCID Maus in vivo Modell oder in chronisch HIV infizierten Zellen) die Wirkungen von HIV codierten Proteinen auf die Physiologie von ex vivo Zellen (dass heißt, periphere Blutlymphozyten, Monozyten, Astrozyten) in der Abwesenheit viraler Replikation zu erforschen.
Die folgenden Beispiele helfen, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen und sind nicht dazu bestimmt, ihren Umfang zu begrenzen. Auf folgende Figuren wird Bezug genommen:
1 ist eine schematische grafische Darstellung der Sinn- (s) und Gegensinn (as) nef- und nef + N2/F12-HIV Konstrukts, beschrieben in Beispiel 1;
2 ist eine schematische grafische Darstellung der Regionen des N2/F12-HIV nef- (as) Genoms, bedeckt von Proben, verwendet in Beispiel 4;
3 ist eine schematische grafische Darstellung erwarteter RNA in Verpackungszellen (packaging cells), die mit N2/F12 nef- (S) und (as) transfiziert mit N2/F12-HIV nef- (S) und (as);
4I, 4II und 4III sind Southern Blots von Xho I digeriert (a) oder Eco RI digeriert (b) genomischer DNA von infizierten neo Zellpopulationen und von Eco RI digeriert (c) genomischer DANN von nef- (as) dauerhaft umgeformten Zellklonen.
5a und 5b sind grafische Darstellungen der Anzahlen an Ausschlägen gegenüber der Fluoreszenzintensität für F12-HIV nef- (as) exprimierende PA317 Klone Nrn. 2 bzw. 12;
6a – d sind FACS Analysen der Präsenz von intrazytoplastischem F12-HIV gag Protein in neo' CEMss Zellen nach cokultivierung mit entweder PA317 Klon Nr. 2 (6c) oder PA317 Klon Nr. 12 (6d). Uninfizierte CEMss Zellen (6a) und HUT-78/F12 Zellen (6b) dienen zur negativen bzw. positiven Kontrolle. Ebenfalls in den Figuren dargestellt sind Prozentgehalte positiver Zellen; 7a und 7b sind Southern Blots der Restriktion Enzym-digerierten genomischen DANN von neo' CEMss Zellen, überführt durch Cokultivierung mit „produzierendem" PA317 Klon Nr. 2 oder Nr. 12 und hybridisiert mit F12-HIV genomischem bzw. neo Proben;
8 ist ein Southern Blot der Hind III digerierten genomischen DANN von neo' CEMss und HUT-78 Zellen, überführt durch Cokultivierung mit „produzierendem" PA317 Klon Nr. 2 oder Nr. 12 und hybridisiert mit der neo Probe;
9a – d sind Northern Blots der polyA + RNA von F12 Zellen (Streifen 1), parentalen CEMss Zellen (Streifen 2), und N2/F12-HIV nef- (as) überführtem CEMss Klone 40 (Streifen 3), hybridisiert mit vollständigen (full-length) F12-HIV (9a), F12-HIV U3 LTR (9b), F12-HIV nef (9c) und F12-HIV env Proben (9d), dass heißt F12-HIV-spezifischen Proben;
10a – d sind Northern Blots der polyA + RNA von F12 Zellen (Streifen 1), CEMss Zellen, überführt mit einem double-promoter retroviralem Vektor pLj (Streifen 2, Korman et al., PNAS USA 84: 2150–2154 (1987)) und N2/F12-HIV nef- (as) überführtem CEMss Klone 40 (Streifen 3), hybridisiert mit neo (10a), U3-MLV (10b), R/U5-MLV (10c) und MLV (10d) N2-spezifische Proben.
11 ist das Ergebnis einer RIPA Analyse mit repräsentativen N2/F12-HIV nef-(as) überführten CEMss Klonen, durchgeführt mit entweder einer Mischung von HIV + oder HIV- Seren;
12a – c sind grafische Darstellungen der Anzahlen an Ausschlägen gegenüber der Fluoreszenzintensität, welche die FACS Analyse von anti-gag HIV-behandelten HUT78-F12 Zellen darstellen (12a, positive Kontrolle), uninfizierten PBLs (12b, negative Kontrolle) und frischen menschlichen PBLs, fünf Tage nach Abschluss der Cokultivierung mit P317 Klon Nr. 12 (12c); 13 ist eine grafische Darstellung von cpm/ml supernatanter Kultur × 10–3 gegenüber Tagen nach Infektion (p.i.);
13a ist eine grafische Darstellung der prozentualen Zelllebensfähigkeit gegenüber Tagen nach Infektion (p.i.) für repräsentative N2/F12-HIV nef- (as) CEMss überführte Klone, dass heißt 15, 40 und 41, superinfiziert mit 5 × 10³ TCID₅₀/10⁶ Zellen;
14 ist eine grafische Darstellung von cpm/ml supernatanter Kultur gegenüber Tagen nach Infektion (p.i.);
14a ist eine grafische Darstellung der prozentualen Zelllebensfähigkeit gegenüber Tagen nach Infektion (p.i.) für repräsentative N2/F12-HIV nef- las) CEMss überführte Klone, dass heißt 15, 40 und 41, superinfiziert mit 10⁵ TCID₅₀/10⁶ Zellen.
Alle Enzyme wurden gemäß den Herstellerempfehlungen verwendet. Der E. coli XL-1 Blue Stamm wurde verwendet, um die pUC-basierenden Plasmide zu verstärken, wohingegen der E. coli JM 109 Stamm eingesetzt wurde, um die pBR-basierenden Plasmide zu verstärken. Bakterielle Transformationen wurden gemäß den Bio-Rad's Protokollen (Richmond, CA) zur Elektroporation. Die Toter der amphotropen Retroviruspräparate wurden wie zuvor beschrieben als colony forming units (CFU)/ml auf NIH 3T3 Zellen analysiert (Federico et al., J. Gen. Virol. 74: 2099–21 10 (1993)). HTLV-IIIB und NL4-3 HIV-Stämme wurden aus den Supernatanten von gerade infizierten CEMss Zellen erlangt. HIV-Titer im Bereich von 1–3×10⁶ TCID₅₀/ml wurden durch Zählen der Anzahl an Synzyten gemessen, die auf C8166 Zellen fünf Tage nach Infektion mit serien-dilutierten Viruspräparaten gebildet wurden, wie beschrieben durch Frederico et al. (1995), siehe oben. HIV-Befreiung nach Superinfektion wurde durch umgekehrte Transkriptase (RT) Analyse überprüft (Rossi et al., Ann. NY Acad. Sci. 511 : 390–400 (1987)).
Beispiel 1: Konstruktion von sense und antisense N2/F12-HIV nef- und N2/F12-HIV nef + retroviralen Vektorkonstrukten.
Die gesamte (full-length) F12-HIV provirale DNA wurde, wie zuvor beschrieben, von einer HUT-78/F12 zellgenomischen Bibliothek geklont (Carlini et al., J. Viral Diseases 1:40–55 (1992)). Der N2 retrovirale Vektor wurde von E. Gilboa bereitgestellt (Keller et al., Nature 318: 149 (1985)). Vier verschiedene N2/F12-HIV Konstrukte wurden erzielt, wie in 1 gezeigt. 1 ist eine schematische grafische Darstellung der sense (s) und antisense (as) nef- und nef + N2/F12-HIV Konstrukte, einschließlich der relativen Positionen der 5' und 3' long terminal repeats, 5' LTR bzw. 3' LTR restriktive Enzymstellen, Neomycin resistente Markierungsgene (neo), und die Position der Nicleotidsequenz AACCAA (SEQ ID NO: 1) innerhalb des 5' LTR. Das Symbol „//" wird verwendet, um anzuzeigen, dass die gezeigten Konstruktpläne zum Zweck der Veranschaulichung der interessanten Bereiche verkürzt sind. N2/F12-HIV nef- stellt die Konstrukte dar, worin das F12-HIV Genom in die Xho I Stelle von N2 in der selben, dass heißt „sense" oder (s) oder gegenüberliegenden, dass heißt „antisense" oder (as), transkriptionalen Orientierung eingefügt wurde, im Anschluss an die Entfernung eines Teil des nef Gens. N2/F12-HIV nef+ stellt die Konstrukte dar, worin das F12-HIV Genom in die Xho I Stelle von N2 in derselben oder der gegenüberliegenden Orientierung eingefügt wurde, im Anschluss an die Entfernung eines Teils des 3' LTR und der negativen Regulatorelemente (NRE) des 5' LTR.
Um eine premature Polyadenylation der RNA, übertragen von der N2 5' LTR in den sense-Konstrukten zu verhindern, wurde eine Mutagenese unter Verwendung eines degenerierten Oligoprimer (5' GGCAAGCTTGGTTGAGGCTTAAGCAGT 3', SEQ ID NO: 3) durchgeführt, welche sowohl die übereinstimmende AATAAA /SEQ ID NO: 2), als auch die benachbarten Hind III Restriktionsseite umfasst, in „reverse" Orientierung und einem zweiten Primer, der die Sma I Seite in dem gegenüberliegenden Strang der 5' LTR U3 Region (5' ATGGATGACCCGGGGAGAAGAGAAAA 3', SEQ ID NO: 4) überschneidet. Um 1 ng pUC19, in das der F12-HIV 5' LTR subgeklont wurde zu verstärken, wurde eine DNA PCR durchgeführt. Das DNA PCR Produkt wurde mit Sma I/ Hind III digeriert und in ein pUC19/F12-HIV 5' LTR Olasmid eingefügt, bei dem sowohl die Hind III Seite des pUC Polylinker, durch Ligatur eines Hind III / Hind II-digerierten pUC10 Plasmids nach Umwandlung der vorstehenden 5' Hind II Enden und Wiedereinsetzung des 5' F12-HIV LTR, als auch der Sma I / Hind III Teil des nichtmutierten 5' LTR fehlen. Der Erfolg der Mutagenese wurde durch Sanger-Sequencing überprüft (Sequenase kit, UBS, Cleveland, OH).
Die N2/F12-HIV nef- Konstrukte wurden durch digerieren des gesamten F12-HIV Provirus (Carlini et al., siehe oben) mit Tha I erzielt, welches eine einzelne Seite in der Führungssequenz des F12/HIV erkennt, und Sma I, welches die U3 Region beider LTRs trennt. Das Tha I / Sma I digerierte F12-HIV Genom wurde dann mit dem mutagenisierten pUC19/F12 HIV 5' LTR ligiert, welches zuvor mit Kpn I, welches mit T4 DNA Polymerase blunt-ended (BBR, Mannheim, Deutschland) und dephosphoriliert ist. Um die Insertion des F12-HIV Genoms in die Xho I geklonte Seite von N2 zu ermöglichen, wurde eine Xho Seite an der gleichen Xba I Seite (nt 1) des F12-HIV Genoms hinzugefügt. Dann, nach Digestion mit Xho I, wurde das DNA- Fragment, enthaltend das F12-HIV Genom von nt 1 bis nt 8930, in die Xho- Seite des N2 Vektors eingeführt und sowohl die sense als auch die antisense Konstrukte wurden zurückgewonnen.
Die N2/F12-HIV nef+ Konstrukte wurden durch Digestion der pUC Polylinker Region des mutagenisierten F12-HIV 5' LTR erzielt, welches wie zuvor beschrieben subgeklont worden war (Carlini et al., siehe oben), mit Ava I welches das 5' LTR bei nts. 232 und 295 trennt, und Eco RI, um eine Ava I – Eco RI Fragment zur Wiedereinsetzung in einen Ava I- Eco RI digerierten pUC19 Vektor zu generieren. Folglich fehlte dem resultierenden 5' LTR nts 1–295 der U3 Region, welche mit den meisten der negativen Regulatorelemente (NRE) übereinstimmt (Lu et al., J. Virol. 64: 5226–5229 (1990)). Das 5' LTR Konstrukt wurde dann mit Xba I und Kpn I digeriert, am Kpn I blunt-ended und in ein Xba I-Bss HII digeriertes pUC19 (Sac I-Sac I) F12-HIV Genom eingefügt (Carlini et al., siehe oben), welches an dem Bss HII Ende blunt-ended war (Bss HII und Tha I erkennen gleiche, angrenzende Seiten in der Führungssequenz). Angrenzend zu den Xba I (nt 1) und Aat II (570 nts unterhalb des Sac I abgestumpften (truncated) F12-HIV 3' LTR in dem pUC 19 Vektor) Seiten wurden Not I Seiten erzeugt, um die Insertion des F12-HIV nef+ Genoms in den N2 Vektor zu ermöglichen. Eine zusätzliche Not I Seite wurde dann zur N2 Klonbildungsseite hinzugefügt. Die Not I- Not I Ligatur von N2 mit dem modifizierten (wie oben beschrieben) F12-HIV Genom generierte sowohl die sense als auch antisense Konstrukte.
Beispiel 2: Zellkultur und Transfizierungsverfahren
CEMss, HUT-78, H9/HTLV_IIIB und C8166 Zellen wurden in RPMI Medium ergänzt mit 10% Fetal Calf Serum (FCS) aufrechterhalten. HeLa, NIH 3T3, GP+E86 (Markowitz et al., J. Virol. 62; 1120–1124 (1988)) und PA317 (Miller et al., Mol. Vell. Biol. 6: 2895–2902 (1986)) Zellen wurden in Dulbecco's modified essential medium (MEM), ergänzt mit 10% FES aufrechterhalten. CEMss und HUT-78 Zellen wurden zur Selektion in Gegenwart von 1 mg/ml G418 (BIBCO BRL, Gaithersburg, MD, 50% of activity) gezüchtet, wobei sowohl Verpackungszellen (packaging cells) und NIH 3T3 Zellen in der Gegenwart von 0,5 mg/ml G418 gezüchtet wurden, mit einem Start der Selektion 48 Stunden nach den Infektionszyklen.
Das Zellklonen wurde durchgeführt durch Ansetzen von 96-Well Plates mit 0,5 Zellen / Well in Übereinstimmung mit dem Limiting-Dilution-Verfahren (Federico et al. (1995), siehe oben). Menschliche periphere Blutlymphozyten (periphal blood lymphocytes, PBLs), welche wie zuvor beschrieben erhalten wurden (Rossi et al., siehe oben), wurden mit Phytohämagglutinin (PHA) für 48 Stunden angeregt und dann in RPMI 1640, ergänzt mit 20% FCS und 50 U/ml rekombinantem menschlichen IL-2 (rhlL-2, Roche, Nutley, NJ) kultiviert.
Zell- Monolayer wurden durch das Kalziumphosphat Präzipationsverfahren (Wigler et al., Cell 16:758–777 (1979)) transfiziert. Kurz, 10 g Plasmid DNA wurden präzipitiert und den subkonfluierenden Kulturen in Schalen mit 10 cm Durchmesser zugegeben. Vier Stunden später wurde das Präzipitat entfernt und die Zellen wurden gewaschen und mit frischem, vollständigem Medium versehen. Zwei Tage später wurden die Supernatanten entfernt und als Retrovirus- Quelle verwendet.
Transiente Transfektionsversuche wurden mit HeLa, NIH 3T3 und PA317 Zellen durchgeführt, wobei jedes der vier verschiedenen N2/F12-HIV Konstrukte verwendet wurden und die intrazellulare Gegenwart des F12-HIV gag Proteins auf Zellen (10⁵) zwei Tage später beurteilt wurden. Zelltransfektion mit allein dem N2 Vektor wurde als eine negative Kontrolle eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt, welche das Aufkommen intrazytoplaschmischen F12-HIV gag Proteins (pg p24 HIV Protein / 10⁵ Zellen) in N2/F12-HIV- transfizierten Zellen 48 Stunden nach Transfektion und nach G418 Selektion liefert.
Tabelle I
Die Ergebnisse zeigen, dass die Modifikationen, die an dem F12-HIV Genom vorgenommen wurden, nicht der Expression des Genoms entgegen wirken. Tatsächlich wurden keine signifikanten Unterschiede in der Produktion von gag Proteinen unter den vier retroviralen Konstrukten verglichen mit dem vollständigen (full-length) F12-HIV Genom, eingebracht in das pUC 10 Plasmid beobachtet (Carlini et al., siehe oben). Signifikant höhere Aufkommen von gag Proteinen wurden in menschlichen Zellen, verglichen mit Mäusezellen beobachtet, sowohl 48 Stunden nach Transfektion, als auch nach G418 Selektion, vermutlich aufgrund der größeren Aktivität des HIV Promoters in Menschen verglichen mit Mäusen (Trone et al., EMBO 9: 4155–4160 (1990)). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt in dauerhaft transfizierten HeLa und NIH 3T3 Zellen, obwohl die Aufkommen an gag Proteinen höher war, verglichen mit den Aufkommen, die in den transient transfizierten Zellen beobachtet wurden (siehe Tabelle 1).
Beispiel 3: Retrovirale Konstrukte sind fähig, rekombinante retrovirale Partikel zu generieren.
Supernatanten von transfizierten GP+E86 und PA317 Zellen wurden verwendet, um subkonfluente Monolayer von PA317 - (einzelner Infektionszyklus) bzw. CEMss – (vier Infektionszyklen) Zellen zu infizieren, welche mit 8 mg/ml Polybrene (Sygma, St. Lois, MO) vorbehandelt wurden. Cokultivierungen wurden durchgeführt, um entweder CEMss Zellen oder menschliche PBLs mit dem amphotronischen Retrovirus, freigesetzt durch PA317 „producer" Zellklone, zu infizieren. Produzierende Zellen (10⁵) wurden in 1 ml Kultur mit entweder CEMss Zellen(10⁵) oder PBLs (10⁶) angesetzt. Nach 24 Stunden wurden PA317 Zellen entfernt, um die Produzierenden Zellen vollständig zu eliminieren, die Kultur- Plates wurden für CEMss alle 24 Stunden oder für OBLs alle 12 Stunden gewechselt G418- resistente (neo') PA317 Zellen wurden nach Infektion mit dem Supernatanten von transfizierten, ecotropischen GP+E86 Zellen zurückgewonnen. Außerdem resultierten F12-HIV exprimierende neo' menschliche CEMss Zellen von der Infektion mit dem Supernatant von transfizierten, amphotropischen PA317 Zellen.
Beispiel 4: Analyse von DNA, RNA und Proteinen der infizierten Zellen
Genomische DNA wurde mit Standardverfahren vorbereitet (Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Nolon, C., ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Die Gesamte DNA wurde mit dem Guanidin-Isothiocyanat Verfahren extrahiert (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294 11979)) und die Poly A + Fraktion wurde durch Separation mit Oligo-dT gekoppelten Dynabeads (Dynal, Oslo, Norway) erzielt. Southern und Northern Blots wurden wie beschrieben durchgeführt (Maniatis et al., siehe oben). Proben wurden radioaktiv mit ³²P bei einer spezifischen Aktivität von 0,5–2×10⁹ cpm/μg DNA unter Verwendung des Random Primer Verfahrens gelabeled und sind in 2 gezeigt, welche eine schematische grafische Darstellung der Regionen des N2/F12-HIV nef- las) Genoms ist, die von den Proben abgedeckt wurden. Die F12-HIV genomische Probe wurde durch Exzidieren des Provirus aus dem N2/F12-HIV nef- Konstrukts erzielt. Das vollständige (full-length) Tn5 bakterielle Transposon wurde wie die neo Probe verwendet. F12-HIV env und nef DNAs wurden erzielt nach Klonen von DNA-PCR Amplifikationsprodukten in die Eco RI Seite von pUC10 unter Verwendung von Eco RI tailed Oligo-Primer, welche den Start- und Stop-Codon jedes Gens überlappen. Die F12/HIV U3 LTR Probe wurde durch Xba I-Sma I Digestion des F12-HIV 5' LTR, geklont in dem pUC19, wiedergewonnen. Die N2-spezifischen Proben wurden nach N2 Digestion mit Nhe I und Sac I for die LTR-U3 Probe, Sma I und Spe I für die LTR-R/U5 Probe und Eco RI und Spe I für die N2 (packaging site) seitenspezifische Probe wiedergewonnen (siehe 2).
4I – III sind Southern Blots von Xho I- digerierten (a) oder Eco RI-digerierten (b) genomischen DNA von infizierten neo' Zellpopulationen und von Eco RI-digerierten (c) genomischen DNA von nef- las) dauerhaft überführten Zellklonen. In 4I und 4II sind in Streifen A und Streifen B DNA von neo' nef- (as) bzw. nef (s) überführten CEMss Zellen gezeigt, wohingegen DNA von neo' nef (as), nef- (s), nef + (as) bzw. nef + (s) infizierte Zellen in Streifen C–F gezeigt sind. In Figur III sind DNA von nef- (as) PA317 (2 und 12) und CEMss (40 und 41) Zellklone dargestellt. DNA von uninfizierten CEMss (C–) und von H9-HTLV_IIIB Zellen (C+) wurden als negative bzw. positive Kontrolle verwendet. Hind III- digerierte Phage- DNA wurde als molekularer Marker eingesetzt.
Der Southern Blot der Xho I- digerierten DNA von neo' CEMss Zellen, infiziert mit dem Supernatanten von N2/F12-HIV nef- (as) transfizierten PA317 Zellen, zeigte wie erwartet ein 9 kb Band (4I, Streifen A), da ja das vollständige F12-HIV Genom von dem Konstrukt durch Xho I Digestion entfernt wurde, und ein zusätzliches niedermolekulares Signal, wahrscheinlich hergeleitet von einer genomischen Umordnung. Im Gegensatz dazu wurden keine zusätzlichen Bänder in dem Xho I DNA Muster von neo' PA317 Zellen, infiziert mit den Supernatanten von nef- (as) transfizierten GP+E86 Zellen (4II, Streifen A) festgestellt, wohingegen ein unerwartetes Signal in PA317 festzustellen war (4II, Streifen C).
Der Southern Blot der Xho I. digerierten DNA von neo' CEMss Zellen, infiziert mit dem Supernatanten von PA317 Zellen, transfiziert mit den Supernatanten von N2/F12-HIV nef- (s) (4I, Streifen B) zeigten die Integration von drei verschiedenen F12-HIV spezifischen DNAs, höchstwahrscheinlich abstammend von den drei Hauptformen der F12-HIV RNA (dass heißt, unspliced, single- und double spliced – Formen, wie sie in 3 gezeigt sind, welches eine schema tische grafische Darstellung der erwarteten RNAs, übertragen in Verpackungszellen (packaging cells), transfiziert mit N2/F12-HIV nef- (s) und (as)) (Federico et al. (1989), siehe oben). Diese Daten wurden auch bestätigt durch die Eco RI Digestion (4II, Streifen B). Umgekehrt waren keine F12-HIV- spezifischen Signale in genomischen DNA von neo' PA317 Zellen, infiziert mit dem Supernatanten von transfizierten nef- (s) GP+E86 Zellen (4I, Streifen D) feststellbar, was eine sehr geringe Effizienz der Überführung einer F12-HIV Sequenz in diese Zellen anzeigt.
Versuche, CEMss Zellen nach Infektion mit nef + transfizierten PA317 Supernatanten und G418 Selektion wiederzugewinnen, waren nicht erfolgreich. Die Southern Blot Analyse von Xho I digerierter DNA von neo' PA317 Zellen offenbarte das Vorhandensein eines Singel- Bandes in den PA317 Zellen, infiziert durch die nef + (s) Retroviren (4I, Streifen E). Das molekulare Gewicht dieses Signals (etwa 3 kb) zeigt an, das nur double-spliced F12-HIV RNA Moleküle in den infektiösen rekombinanten Retroviren gepackt sind. Umgekehrt wurde kein Band entdeckt in den PA317 Zellen, infiziert mit den nef+ (as) Retroviren (4I, Streifen F).
Um die Wirkungsweise des N2/F12-HIV Konstrukts, durch retrovirale Infektionen in die Zellen überführt, zu beurteilen, wurden alle neo' Zellpopulationen auf eine Anhäufung von den F12-HIV- codierten gag Proteinen hin getestet. Interzellulares p24 Antigen in retroviral infizierten Zellen wurde durch Lysinzellen (10⁵) in 200 μl TNE (Tris-HCl 10mM, NaCl 100mM, EDTA 1mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) Puffer, enthaltend 0,1 % Triton X-100 (Sygma, St. Lois, MO) ermittelt. Nach 5 Minuten Inkubation auf Eis wurden die Zelllysate kurz zentrifugiert und die resultierenden Supernatanten wurden mittels ELISA-Antigen Capture Assay getestet (Abbot, North Chicago, IL).
HIV-befreite (HIV releated) Proteine wurden durch Radioimmunopräcipitationsanalyse (Radioimmunoprecipitation assay, RIPA, Frederico et al. (1995), siehe oben) ermittelt. Die Ergebnisse der RIPA Analyse von repräsentativen N2/F12-HIV nef- (as) überführten CEMss Klonen, durchgeführt mit ent weder einer Mixtur aus HIV + oder HIV- Serum sind in 11 gezeigt. Lysate von F12 und H9/HTLV_IIIB Zellen wurden als positive Kontrolle verwendet, wohingegen Lysate von N2 überführten CEMss Zellen als negative Kontrolle verwendet wurden. ¹⁴C gelabelte molekulare Marker und HIV Proteine, die mittels RIPA feststellbar sind, sind ebenfalls gekennzeichnet.
Im Hinblick auf die obigen Ergebnisse wurden nur nef- exprimierende Zellen mittels ELISA Analyse analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt, welche das intrazytoplasmische F12HIV gag Protein Aufkommen (ausgedrückt in Pikogramm gag Protein in 10⁵ neo' Zellpopulationen; Durchschnittswerte von vier verschiedenen Versuchen S.D.) für neo' Zellen, infiziert mit sense (s) oder antisense (as) N2/F12 rekombinanten Retroviren und die Anzahl von F12-HIV-exprimierenden Zellklonen aus den gesamt gezählten Zellklonen liefert.
Tabelle II
Die Ergebnisse zeigen, dass kein intrazytoplasmisches F12/HIV gag Protein in den durch nef- (s) Viren infizierte neo' PA317 Zellen festgestellt wurden. Obwohl zunächst ein geringer Gehalt an intrazytoplasmischem Protein in den neo' CEMss Zellen, die durch den nef- (s) amphotropischen Retrovirus festgestellt wurden, wurde kein intrazytoplasmisches Protein mit Zellpassagen festgestellt.
Im Gegensatz dazu waren höhere Konzentrationen des F12-HIV gag Proteins sowohl in PA317 als auch CEMss Zellen, die das nef- (as) Genom enthielten, feststellbar. Diese positiven Werte blieben über einen langen Zeitraum, dass heißt, über ein Jahr, stabil.
Um den Anteil an stabilen Zellen, die das F12-HIV Genom exprimieren, zu beurteilen, wurden die neo' PA317 und CEMss Zellen, die das nef- Genom in entweder der (s) oder (as) Orientierung integrieren, durch das Limiting Dilution Verfahren geklont. Wie in Tabelle II gezeigt, wurden keine F12-HIV exprimierenden nef- (s) Klone von entweder Pa317 oder CEMss Zellen isoliert, selbst wenn die ersteren anfänglich im dem ELSA Test positiv waren. Im Gegensatz dazu waren die PA317 Zellklone, die das nef- (as) Genom exprimieren ohne weiteres vorhanden (etwa 12%); überdies waren etwa 23% der CEMss Klone fähig die gag Proteine zu synthetisieren.
Beispiel 5: Fluoreszenz-aktivierende Zellsichtungsanalyse (Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis) der infizierten Zellen
CD4 Rezeptoren auf der Plasmamembran wurden durch indirekte Immunofluoreszenz ermittelt und mit Hilfe eines Zytoflorimeters wie von Taddeo et al. beschrieben (Virology 194: 441–452 (1993)) analysiert. Kurz, Zellen (10⁶) wurden mit der geeigneten Konzentration von Anti-CD4 monoklonalem Antikörper (mAb, Ortho Diagnostic, Raritan, NJ) in 100 μl phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, enthaltend 2,5% FCS, inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation auf Eis, wurden die Proben zweimal in PBS gewaschen und weiterhin für eine Stunde auf Eis mit 100 μl 1:2 Ziegen Anti-Maus (goat anti-mouse) IgG, konjugiert mit Fluoreszein Isothiozyanat (Ortho Diagnostic, Raritan, NJ) inkubiert. Nach drei Waschungen mit PBS wurden die Proben mit 2% v/v Formaldehyd-Lösung fixiert und mit einem Zytofluorimeter analysiert (FAC-scan, Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Intrazytoplasmische HIV gag-befreite (gag-related) Proteine wurden durch direkte Immunofluoreszenz ermittelt. Die Zellen (10⁶) wurden dreimal mit PBS-Puffer. ergänzt mit 2,5% FCS gewaschen und in 200 μl PBS-EDTA (10mM) resuspendiert. Eine PBS-Fomaldehyd- Lösung (2% v/v) wurde anschließend hinzugefügt und die Zellen wurden in 40 μl kalter PBS-EDTA resuspendiert. Anschließend wurde 400 μl kaltes Methanol tropfenweise hinzugefügt und die Zellen wurden auf Eis für weitere 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden anschließend dreimal gewaschen und für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einer Dilution von 1:50 KC57-RD1 (Coulter Corp., Hialcam, FL) anti-gag HIV mAb verbunden mit Phycoerithrin (PE) inkubiert. Zuletzt wurden die Zellen dreimal mit PBS-FCS Puffer gewaschen und mit einem Zytofluorimeter analysiert. Sowohl die nicht infizierten Zellen als auch die PE-konjugierten nichtspezifischen Mäuse- IgG1 Antikörper (Coulter Corp.) wurden als negative Kontrolle verwendet.
Supernatanten von 11 F12-HIV nef- (as) exprimierenden PA317 Klonen wurden titriert als cfu/ml auf NIH 3T3 Zellen. Die retroviralen Titer waren sehr niedrig und rangierten wie erwartet zwischen 4,6 × 10² bis 4 × 10⁴ cfu/ml bei gegebenem großen Maß des retroviralen Konstrukts, dass heißt etwa 1 1 kb.
DNA- Analysen der zwei PA317 Klone (Nrn. 2 und 12) welche die höchsten retroviralen Titer produzierten, zeigten an, dass das retrovirale Konstrukt vollständig in dem Gastgenom integriert (4III) und effizient übertragen war, wie durch die Northern Blot Analyse demonstriert. In den 5a und 5b ist die Intrazytoplasmische direkte Immunofluoreszenz des F12-HIV spezifischen gag Proteins gezeigt, welche grafische Darstellungen des Vollausschlags gegenüber des Fluoreszenzintensität für F12-HIV nef- (as)exprimierende PA317 Klone Nrn. 2 bzw. 12 sind. In beiden grafischen Darstellungen ist die Neigung von anti-gag HIV-behandelten PA317 Zellen als negative Kontrolle angezeigt. Wie in 5 gezeigt, waren beide Klone fähig, das F12-HIV Genom homogen zu exprimieren.
Beispiel 6: Molekulare Charakterisierung von überführten CEMss Zellen und menschlichen PBLs.
PA317 Zellen wurden mit CEMss Zellen und PHA- stimulierten frischen menschlichen PBLs cokultiviert, um das F12-HIV Genom in HIV-anfällige Zellen zu überführen. Vierundzwanzig Stunden nach den Cokultivierungen wurde G418 zu den CEMss Zellen gegeben und zwanzig Tage später wurde eine neo' Zellpopulation erzielt. Der Anteil von neo' Zellen, die intrazytoplasmisches F12-HIV gag Protein exprimieren wurde durch die FACS Analyse untersucht. Die Ergebnisse sind in den 6a – d gezeigt, welche die FACS Analyse der Gegenwart von intracytoplasmischem F12-HIV gag Protein in nicht infizierten CEMss Zellen (negative Kontrolle, 6a), HUT-78/F12 Zellen (positive Kontrolle, 6b), neo' CEMss Zellen nach Cokultivierung mit PA317 Klon Nr. 2 (6c) und neo' CEMss Zellen nach Cokultivierung mit PA317 Klon Nr. 12 (6d) darstellen. Die Anteile positiver Zellen für jede sind ebenfalls gezeigt. Wie in 6a – d gezeigt, exprimierten etwa 35% der neo' Zellen das F12-HIV Genom. Diese Daten wurden in HUT-78 Zellen wiederholt. Überdies exprimierten 36/60 gezählte CEMss Zellklone, dass heißt 55% das F12-HIV Genom, wie durch das HIV gagspezifische ELISA abgeschätzt wurde.
Southern Blots der Restriktion Enzym-digerierter genomischer DNA von neo' CEMss Zellen, überführt durch Cokultivierung mit „produzierenderm" PA317 Klone Nr. 2 oder Nr. 12 wurde mit F12-HIV oder neo spezifischen Proben hybridisiert, wie in 7a bzw. 7b gezeigt ist. Streifen 1 repräsentiert die DNA von N2 überführten CEMss Zellen, wohingegen Streifen 2 DNA von neo' Zellen, überführt durch nicht geklonte N2/F12-HIV nef- (as) Pa317 Zellen wiedergibt, Streifen 3 und 4 repräsentieren neo' CEMss Zellen nach Cokultivierung mit PA317 Klone Nr. 2 bzw. Nr. 12, Streifen 5 und 6 repräsentieren neo' HUT-78 Zellen nach Cokultivierung mit entweder PA317 Klon Nr. 2 oder Klon Nr. 12, und Streifen 7 repräsentiert PA317 Klon Nr. 12. Die genomische DNA wurde mit den angezeigten Restriktionsenzym digeriert und der molekulare DNA Marker war derselbe wie in 4I – III. Die Hybridisierungen zeigen an, dass das F12-HIV Genom vollständig integriert ist, ohne ersichtliche genomische Reformationen.
[0056] Um die Frequenz der Infektionsereignisse in CEMss Zellen abzuschätzen, wurde die Fähigkeit zur Klonbildung von neo' Zellen untersucht. Hind III- digerierte genomische DNA von neo' CEMss oder HUT-78 Zellen, überführt durch Cokultivierung mit „produzierendem" PA317 Klon Nr. 2 oder 12 wurde mit der neo' Probe, wie in 8 gezeigt, hybridisiert, welche ein Southern Blot derartiger Hybridisierungen ist. Beginnend von der N2 5' LTR Seite des N2/F12-HIV nef- (as) Konstrukts, liegt die erste von dem Hind III Enzym erkannte Seite in dem F12 env Gen, etwa 3 kb von dem N2 5' LTR Ende entfernt. Als Kontrollen wurden DNA von PA317 Klon Nr. 12 (positiv) und parentale CEMss Zellen (negativ) verwendet. Der molekulare Gewichtungsmarker (weight marker) war derselbe wie derjenige in den 4I – III. Die Hybridisierung der genomischen DNA mit der neo Probe zeigt, dass die T-Zellen überführten Kulturen größtenteils polyklonal waren, folglich ist die Möglichkeit ausgeschlossen, dass die neo' Zellpopulationen aus seltenen Infektionsereignissen stammen.
Vierzig CEMss Klone, die das F12-HIV nef- (as) Genome integrieren und exprimieren, wurden isoliert und kultiviert, um eine vergleichbare molekulare Charakterisierung durchzuführen. Das Eco RI Muster von zwei repräsentativen Klonen (Nrn. 40 und 41) ist in 4III gezeigt. Es wurden bei den CEMss Klonen (wie bei der Variation in den Integrationsseiten geschätzt) keine signifikanten Differenzen in HIV RNA oder Protein Mustern festgestellt.
Poly A + RNAs wurden mit entweder F12-HIV spezifischen Proben, dass heißt full-length, U3-LTR, nef und env, oder mit den in 3 gezeigten Proben, die verschiedene Regionen des N2 Vektors erkennen, hybridisiert. Die 9a–d sind Northern Blots von polyA + RNA von F12 Zellen (Streifen 1), parentalen CEMss Zellen (Streifen 2) und N2/F12-HIV nef- (as) überführte CEMss Klon 40 (Streifen 3), hybridisiert mit full-length F12-HIV (9a), F12-HIV U3 LTR (9b), F12-HIV nef (9c) und F12-HIV env Proben (9d), dass heißt F12-HIV-spezifische Proben. Die molekularen Gewichte der F12-HIV major RNA Sorte sind auf der linken Seite der Figuren angezeigt. Für jede der Northern Blots, die in 0 gezeigt sind, wurden 5 μg RNA in jeden Streifen des Gels eingebracht, das verwendet wurde, um den Blot zu generieren. Die F12-HIV nef- exprimierenden CEMss Klone exprimierten geringe Konzentrationen der double-spliced HIV RNAs, dass heißt, für das Ausführungsprotein spezifische Boten, wie in F12HIV exprimierenden HeLa CD4+ Klonen angezeigt (Federico et al. (1995), siehe oben). Im Gegensatz dazu wurden full-length und double-spliced RNAs sehr effizient übertragen. Das Duplikat war klar in den höheren molekularen Gewichten feststellbar, übereinstimmend mit den zwei full-length Kopien, angeregt in gegensätzlichen Orientierungen durch den F12-HIV und die MLV 5' LTRs. Diese Beobachtung wurde unterstützt durch des einzelne anstelle des doppelten Bandes bei etwa 11 kb, das durch Hybridisierung derselben polyA+ RNas mit einer Probe, welche die U3 Region des F12-HIV LTR überlappte, festgestellt wurde, welches nur von der DNA-Kette, die den N2 retroviralen Vektor codiert, übertragen sein konnte.
Die 10a – d sind Northern Blots von polyA + RNA von F12 Zellen (Streifen 1), CEMss Zellen übertragen mit einem doppelt angeregten retroviralen Vektor (Streifen 2, Korrnan et al., PNAS USA 84: 2150–2154 (1987)) und N2/F12-HIV nef- (as) überführtem CEMss Klone 40 (Streifen 3), hybridisiert mit neo (10a), U3-MLV (10b), R/US-MLV (10c) und MLV (10d) N2-spezifischen Proben. Die Molekulargewichte der Haupt-RNA- Sorte, die durch die pLj Vektoren in CEMss produziert wurden, sind auf der linken Seite des Northern Blots wiedergegeben. Die Hybridisierung der polyA + RNA mit Proben, die spezifisch sind für das neo Gen, die U3 und R-U5 Regionen des N2 LTR und die N2 Seite zeigten, dass single- und double-spliced Kopien, die durch das F12-HIV 5' LTR angeregt wurden, von jeder Probe erkant wurden, was anzeigt, dass diese RNA Sorten bis zur U3 Region des MLV 5' LTR übertragen wurden. Das einzelne hochmolekulare Band , das nach Hybridisierung mit der N2- spezifischen Probe erzielt wurde, welches notwendigerweise die N2 5' LTR- angeregte Kopie erkannte, zeigte an, dass unspliced F12-HIV RNA nicht derartige Sequenzen enthielten, was stattdessen ein splicing- Ereignis nahe legt, das nicht in den single- oder double-spliced F12-HIV RNAs vorkommt. Es wurden keine spliced RNAs durch das MLV 5' LTR übertragen. Tatsächlich wurden keine zusätzlichen RNA- Bänder neben dem Duplikat bei 10–11 kb und den single- und double-spliced F12-HIV mRNAs festgestellt, welche nur nach einer Film- Überbelichtung einfacher zu sehen sind. Entsprechend, wie in 9 gezeigt, wurde ein hochmolekulares Signal durch Hybridisierung von CEMss polyA + RNA mit der F12-HIV U3/LTR Probe festgestellt, die ausschließlich die N2 5' LTR- angeregten Kopien erkennt.
Das virale Proteinprofil, produziert von den N2/F12-HIV nef- (as) überführten CEMss Klonen war ähnlich den in F12-HIV- transfizierten HeLa CD4+ Klonen (Federico et al., (1995), siehe oben) erzielten. 14a ist eine grafische Darstellung von cpm/ml supernatanter Kultur × 10^–3 gegenüber Tagen nach Infektion (post infection, p.i.) und 14b ist eine grafische Darstellung des prozentualen Zelllebensfähigkeit gegenüber Tagen p.i. für repräsentative N2/F12-HIV nef- 9 (as) CEMss überführte Klone, dass heißt 15, 40 und 41, superinfiziert mit 10⁵ TCID₅₀/10⁶ Zellen. N2 überführte Zellen wurden als eine Kontrolle verwendet. Es wurde keine Spaltung des gp 160 env Glycoproteins festgestellt, wohingegen reduzierte Aufkommen von p55 und p25 gag Proteinen beobachtet wurden, im Vergleich zu Zellen die mit einem replikationsfähigen HIV infiziert waren. Mit Ausnahme von Klone 21 wurde in keinem F12-HIV nefexprimierenden CEMss Klon eine signifikante Reduktion von CD4 Expression festgestellt, wie in Tabelle III gezeigt.
Tabelle III
Das N2/F12-HIV nef- (as) Konstrukt wurde auch in frische menschliche periphere Blutlymphozyten (PBLs) überführt. Nach 24 Stunden Cokultivierung wurde die Überführungseffizienz wurde durch Analyse der intacytoplasmischen Extrakte mittels ELISA abgeschätzt. Das gag Protein wurde aus 10⁵ PBLs 5 Tage nach Abschluss der Kultivierung mit PA317 Konen Nrn. 2 und 12 in Mengen von 15 bzw. 39 pg erzielt. Entsprechend wurde durch FACS Analyse geschätzt, dass etwa 5% der PBLs erfolgreich durch die Cokulturen übertragen wurden, wie in 12a – c gezeigt. 12a – c sind grafische Darstellungen der Anzahlen natürlicher Größe gegenüber der Fluoreszenz- Intensität, die die FACS Analyse von anti-gag HIV behandelten HUT78-F12 Zellen (12a, positive Kontrolle), nicht infizierten PBLs (12b, negative Kontrolle) und frischen menschlichen PBLs fünf Tage nach Beendigung der Cokultivierung mit PA317 Klon Nr. 12 (12c) repräsentiert. Die prozentualen Anteile positiver Zellen sind 96%, 0,7% und 5,95%, in dieser Reihenfolge. Diese Daten werden gestützt durch die Southern Analyse der hochmolekularen DNA, extrahiert aus überführten PBLs.
Beispiel 7: Molekulare Charakterisierung überführter, mit HIV superinfizierter CEMss Klone
Fünfundzwanzig CEMss Klone wurden mit HIV-1 superinfiziert, entweder die HTLV_IIIB oder NL4-3 Art, bei einer Multiplizierung der Infektion (m.o.i.) von 5 × 103 oder 5 × 10⁵ TCID₅₀/10⁶ Zellen. Der zytopatische Effekt (c.p.e.) der HIV-1 Superinfektion wurde bewertet in Form der Syncytialformation und Zell- Lebensfähigkeit. Zusätzlich wurde die umgekehrte Transkriptase (RT) -Aktivität der Supernatanten gemessen.
Es wurde in keiner der HIV- superinfizierten CEMss Klone eine Syncytialformation festgestellt. Im Gegensatz dazu bildeten sowohl Wildtyp- CEMss als auch CEMss Zellen, die den N2 Vektor enthielten große Syncyten und starben ein paar Tage nach der HIV- Superinfektion ab. Die Kinetik sowohl der RT Aktivität, als auch der Zell- Lebensfähigkeit von drei repräsentativen CEMss Klonen sind in den 13 und 14 gezeigt.
13a ist eine grafische Darstellung von cpm/ml Supernatant- Kultur × 10^–3 gegenüber Tagen nach Infizierung (post infection, p.i.) und 13b ist eine grafische Darstellung der prozentualen Zell- Lebensfähigkeit gegenüber Tagen p.i. für repräsentative N2/F12-HIV nef- (as) CEMss überführte Klone, dass heißt 15, 40 und 41, superinfiziert mit 5 × 10³ TCID₅₀/10⁶ Zellen. Sowohl parentale CEMss als auch N2 überführte CEMss Zellen wurden als Kontrollen verwendet. 1^4 ist wie oben beschrieben.
Die Daten zeigen, dass die HIV Superinfizierung kein signifikantes Wachstum der F12-HIV exprimierenden Klone bewirkte, selbst bei einem höheren m.o.i. Die positiven Punkte, die in der RT Probe von Klon 15 bei einem höheren m.o.i festgestellt wurden, waren repräsentativ für die wenigen RT- positiven Stichproben von 5 aus 25 überführten CEMss Klonen, die bei demselben m.o.i. superinfiziert waren. Wie auch immer, in den verbleibenden CEMss Klonen wurden sehr niedrige oder negative RT- Werte festgestellt, ungeachtet des verwendeten m.o.i. und der Anzahl an Tagen nach Superinfizierung.
Folglich hemmte die Expression des F12-HIV Genoms stark die Replikation eines Wildtyp- superinfizierendem HIV, ohne Beeinflussung der CD4 HIV Rezeptor-Exposition. Die hemmende Eigenschaft war folglich auch dann erhalten, wenn das F12-HIV Genom, dessen nef Gene fehlten, in den N2 Vektor eingeführt wurde und durch rekombinante retrovirale Infektion überführt wurde (siehe auch Federico et al. (1995), siehe oben).
Alle hier zitierten Referenzen, einschließlich Patente, Patentanmeldungen, Zeitungsartikel und Bücher sind hierdurch in ihrer Gesamtheit durch Verweis eingeschlossen.
Wenn diese Erfindung hier auch mit einem Schwerpunkt auf einen oder mehrere bevorzugte Anwendungsformen beschrieben wurde, so ist es für die Fachwelt offensichtlich, dass Variationen angewendet werden können, einschließlich Variationen, die aus Fortschritten der Technik resultieren, und dass die Erfindung auf anderen Wegen praktiziert werden kann als speziell hier beschrieben. Demzufolge beinhaltet diese Erfindung all solche Variationen und Modifikationen, die von dem Geist und dem Anwendungsgebiet umfasst sind, wie von den nachfolgenden Ansprüchen definiert.
SEQUENCE LISTING

Claims

Zusammensetzung, unfassend einen retroviralen rekombinanten Vektor, enthaltend ein Genom von einer nicht-defekten, nicht produzierenden (nonproducer) HIV-Variante, wobei das besagte Genom von der gesamten 3-Enden-LTR (long terminal repeat) übergangen wird, und in einer antisense – Orientierung in Bezug auf die Transkriptionsrichtung des Vektors eingesetzt ist, in ausreichender Menge, um eine stabile Vereinigung des besagten Genoms mit mindestens einigen der nuklearen Genome der menschlichen Zellen und die Expression der besagten Genome zu bewirken, mit dem Ziel, die Resistivität gegen HIV-Superinfektion auf menschliche Zellen zu übertragen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das besagte nicht-defekte, nicht produzierende (nonproducer) HIV-Varianten-Genom sich mit mindestens 1 % der nuklearen Genome der menschlichen Zellen vereinigt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das besagte nicht-defekte, nicht produzierende (nonproducer) HIV-Varianten-Genom sich mit zwischen 1 % bis 10% der nuklearen Genome der menschlichen Zellen vereinigt.
Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die besagten menschlichen Zellen T-Zellen sind.
Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei das besagte Genom einer nicht-defekten, nicht produzierenden (nonproducer) HIV-Variante das des F12-HIV ist.
Zusammensetzung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der besagte retrovirale Vektor ein vom Moloney Murine Leukemia Virus abgeleiteter Vektor ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der besagte retrovirale Vektor der N2 Vektor ist.