DE69829471T2 - Auf lentivirus basierende gentransfer-vektoren - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Viren als Vektoren, die beim Gentransfer von Nutzen sind, und insbesondere lentivirale Vektoren, die beim Gentransfer an sich nicht teilende und sich teilende Zellen von Nutzen sind.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Die Kapazitäten zum Einführen einer bestimmten fremden oder nativen Gensequenz in eine Säugerzelle und zum Steuern der Expression dieses Gens haben in den Fachgebieten der medizinischen und biologischen Forschung einen erheblichen Stellenwert. Derartige Kapazitäten stellen ein Mittel zum Studieren der Genregulation und zum Entwickeln einer therapeutischen Grundlage für die Behandlung von Erkrankungen bereit.
  • Das Einführen eines bestimmten fremden oder nativen Gens in eine Säugerwirtszelle wird durch Einführen einer Gensequenz in einen geeigneten Nukleinsäurevektor erleichtert. Eine Vielfalt von Verfahren ist entwickelt worden, die das Einführen eines solchen rekombinanten Vektors in eine gewünschte Wirtszelle gestatten können. Im Gegensatz zu Verfahren, die eine DNA-Transformation oder -Transfektion einschließen, kann die Verwendung von viralen Vektoren in der schnellen Einführung des rekombinanten Moleküls in eine große Vielfalt von Wirtszellen resultieren. Insbesondere sind virale Vektoren eingesetzt worden, um die Effizienz des Einführens eines rekombinanten Nukleinsäurevektors in Wirtszellen zu erhöhen. Viren, die als Vektoren für die Transduktion und Expression von exogenen Genen in Säugerzellen eingesetzt worden sind, beinhalten das SV40- Virus (siehe z. B. H. Okayama et al., Molec. Cell. Biol. 5, 1136–1142 (1985)); das bovine Papillomavirus (siehe z. B. D. DiMaio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4030–4034 (1982)); das Adenovirus (siehe z. B. J. E. Morin et al., Proc. Natl. Sci. USA 84, 4626 (1987)), das Adeno-assoziierte Virus (AAV; siehe z. B. N. Muzyczka et al., J. Clin. Invest. 94, 1351 (1994)); das Herpes-simplex-Virus (siehe z. B. A. I. Geller et al., Science 241, 1667 (1988)) und andere.
  • Auf Retroviren basierende Vektoren sind als Werkzeuge zum Erzielen eines stabilen, integrierten Gentransfers von fremden Genen in Säugerzellen besonders bevorzugt. Retroviren, die als Vektoren für die Einführung und Expression von exogenen Genen in Säugerzellen eingesetzt worden sind, beinhalten das Moloney-Maus-Sarkomavirus (T. Curran et al., J. Virol. 44, 674–682 (1982); A. Gazit et al., J. Virol. 60, 19–28 (1986)) und Maus-Leukämieviren (MuLV; A. D. Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1–24 (1992).
  • Anstrengungen, rekombinante Moleküle in Säugerzellen einzuführen, sind von der Unfähigkeit vieler Zellen, von den oben beschriebenen viralen oder retroviralen Vektoren infiziert zu werden, behindert worden. Einschränkungen von retroviralen Vektoren beispielsweise beinhalten eine relativ begrenzte Auswahl an Wirten, basierend teilweise auf dem Niveau der Expression des Membranproteins, das als der virale Rezeptor dient. M. P. Kavanaugh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7071–7075 (1994). Andere Einschränkungen beinhalten die Unfähigkeit, sich in sich nicht teilende Zellen (z. B. Neuronen, Hepatozyten, Muskelfasern, Blutbildungsstammzellen) zu integrieren, bescheidene mit derzeitigen Verpackungssystemen verfügbare Vektortiter und die Fragilität von Vektorpartikeln, die die Reinigung und Konzentration behindert.
  • Lentiviren sind eine Untergruppe von Retroviren, die sich nicht teilende Zellen infizieren können. L. Naldini et al. berichten von einem auf dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) basierenden lentiviralen Vektorsystem, das heterologe Gensequenzen in nichtproliferative HeLa-Zellen und Rattenfibroblasten als auch in humane primäre Makrophagen und terminal differenzierte Neuronen transduzieren kann. Science 272, 263–267 (1996). Die Verwendung eines derartigen Systems in Menschen erhebt jedoch ernste Sicherheitsbedenken aufgrund der Möglichkeit der Rekombination durch den Vektor in eine virulente und krankheitsverursachende Form.
  • Dementsprechend bleibt ein Bedarf an einem sicheren und effizienten lentiviralen Vektorsystem bestehen, das einen Gentransfer in einen weiten Bereich von sich teilenden und sich nicht teilenden Zellen vermitteln kann.
  • ZUSAMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf den Transfer von heterologen Gensequenzen in Zellen unter Verwendung von vom Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) abgeleiteten Vektoren für den Gentransfer.
  • Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor, das Folgendes umfasst:
    • (a) einen ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) gag und EIAV pol kodiert, wobei der Vektor (i) mindestens einen Defekt in mindestens einem Gen, das ein EIAV-Strukturprotein kodiert, enthält, (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält und (iii) das offene Leseraster S2 enthält; und
    • (b) einen zweiten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des EIAV-Genoms umfasst, wobei der Vektor (i) ein kompetentes Verpackungssignal enthält und (ii) eine multiple Klonierungsstelle enthält, in die ein heterologes Gen insertiert werden kann; und
    • (c) einen dritten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz eines Virus umfasst, wobei der dritte Vektor (i) ein Virenhüllprotein exprimiert und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält.
  • Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor, das Folgendes umfasst:
    • (a) einen ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) gag und EIAV pol kodiert, wobei der Vektor (i) mindestens einen Defekt in mindestens einem Gen, das ein EIAV-Strukturprotein kodiert, enthält, und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält;
    • (b) einen zweiten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des EIAV-Genoms umfasst, wobei der Vektor (i) ein kompetentes Verpackungssignal enthält und (ii) eine multiple Klonierungsstelle enthält, in die ein heterologes Gen insertiert werden kann, und (iii) eine partielle EIAV-gag-Sequenz enthält, die die Basenpaare 993 bis 1570 vom Plasmid pEC-lacZ, einem 8749 bp langen, vom EIAV abgeleiteten Plasmid, das das E. coli-lacZ-Reportergen exprimiert und zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (angeordnet an den bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle EIAV-gag-Sequenz (bp 993–1570), die lacZ-Kodierungssequenz (bp 2297–5437), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 5752–6073), eine Phage-fl-Region (bp 6163–6618), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 7057–7917) und einen ColE1-Replikationsursprung (bp 8062–8736) enthält, oder vom Plasmid pEC-puro, einem 6099 bp langen, vom EIAV abgeleiteten Plasmid, das das Puromycinresistenz-Gen exprimiert und zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570), die Puromycinresistenz-Gen-Kodiersequenz (bp 2334–2933), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 3102–3423), eine Phage-fl-Region (bp 3513–3968), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 4407–5267) und einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 5412–6086) enthält, umfasst; und
    • (c) einen dritten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz eines Virus umfasst, wobei der dritte Vektor (i) ein Virenhüllprotein exprimiert und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der zweite Vektor der oben erwähnten Expressionssysteme zur Expression mindestens eines EIAV-Strukturproteins unbrauchbar. In einem anderen Aspekt sind der erste Vektor, der zweite Vektor und der dritte Vektor cDNA-Klone von zumindest Teil des EIAV-Genoms. Die Erfindung stellt außerdem ein Vektorexpressionssystem bereit, wobei der erste Vektor ein gag-pol- Expressionsvektor ist und der Vektor einen Defekt im env-Gen enthält. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Defekt im env-Gen um eine Deletionsmutation. Alternativ enthalten der erste Vektor und der zweite Vektor jeweils einen Defekt im env-Gen. In einem alternativen Aspekt der Erfindung kodiert der dritte Vektor ein Hüllprotein, bei dem es sich nicht um ein EIAV-Hüllprotein handelt. Vorzugsweise exprimiert der dritte Vektor das G-Glykoprotein des vesikulären Stomatitisvirus. Vorzugsweise enthält der zweite Vektor ein heterologes Gen. Vorzugsweise kodiert das heterologe Gen ein Antigenprotein oder Antigenpeptid.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Plasmid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • (i) einem Plasmid und cDNA-Klon mit 12.170 Basenpaaren, der an den Basenpaaren 209–1072 eine chimäre CMV/EIAV-Verstärker-Promotorregion, die oberhalb der EIAV-tat-Kodierregionen (bp 1124–1210 und 5886–6026), der gag-Kodierregion (bp 1216–2676), der pol-Kodierregion (bp 2433–5874) und der ORF-S2-Kodierregion (bp 6037–6234) angeordnet ist, umfasst und außerdem eine partielle env-Kodierregion (bp 6063–7733), rev-Kodierregionen (bp 6188– 6288 und 7250–7654), ein BGH-Polyadenylationssignal (BGH = bovine growth hormone, Rinderwachstumshormon) (bp 7759–7973), eine Phage-fl-Region (bp 8037–8450), eine SV40-Early-Promotorregion und einen Replikationsursprung (bp 8514–8839), eine Neomycinresistenz-Kodierregion (bp 9685–9924), ein SV40-Polyadenylationssignal (bp 9685–9924), einen ColE1-Replikationsursprung (bp 10356–11029) und eine β-Lactamase-Kodierregion (Ampicillinresistenz-Kodierregion) (bp 11174–12035) umfasst;
    • (ii) einem von (i) oben abgeleiteten Plasmid, wobei die Nukleotide 902 bis 1077 deletiert sind;
    • (iii) einem 8749 bp langen Plasmid, das zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (angeordnet an den bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle EIAV-geg-Sequenz (bp 993–1570), die lacZ-Kodierungssequenz (bp 2297–5437), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 5752–6073), eine Phage-fl-Region (bp 6163–6618), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 7057–7917) und einen ColE1-Replikationsursprung (bp 8062–8736) enthält;
    • (iv) einem 6099 bp langen Plasmid, das zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570), die Puromycinresistenz-Gen-Kodiersequenz (bp 2334–2933), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 3102–3423), eine Phage-fl-Region (bp 3513–3968), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 4407–5267) und einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 5412–6086) enthält; und
    • (v) einem Plasmid mit 5679 Basenpaaren, das die CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregion (bp 1–795), eine chimäre Intronregion (bp 857–989), die VSV-G-Kodierregion (bp 1088–2633), eine Phage-fl-Region (bp 3093–3548), ein SV40-Late-Polyadenylationssignal (bp 2782–3003), einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 4992–5666) und eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 3987–4847) umfasst.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der erste Vektor der oben erwähnten Expressionssysteme aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (i) und (ii) oben ausgewählt und der zweite Vektor ist aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (iii) und (iv) oben ausgewählt und beim dritten Vektor handelt es sich um das Plasmid (v) oben.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein „In-vitro"-Verfahren zum Herstellen eines für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikels, das das Transfizieren einer Zelle mit einem Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor umfasst. Vorzugsweise ist die Zelle eine sich nicht teilende Zelle. Vorzugsweise enthält der zweite Vektor des Expressionssystems ein heterologes Gen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein infektiöses EIAV-Partikel, das aus dem oben beschriebenen Vektorexpressionssystem erhältlich ist und eine EIAV-Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Promotorsequenz und eine heterologe Gensequenz kodiert. Die Nukleinsäuresequenz ist beim Kodieren mindestens eines EIAV-Strukturproteins unbrauchbar, so dass das Viruspartikel für die Replikation unbrauchbar ist, und das Viruspartikel enthält weiterhin eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570).
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Zelle, die ein für die Replikation unbrauchbares lentivirales Partikel enthält, wobei das lentivirale Partikel in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen „In-vitro"-Verfahren hergestellt wird oder wobei das lentivirale Partikel ein infektiöses EIAV-Partikel wie oben beschrieben ist.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein „In-vitro"-Verfahren zum Liefern eines heterologen Gens an eine Zielzelle, das das Transfizieren der Zielzelle mit einem Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor wie oben beschrieben umfasst. Vorzugsweise ist die Zielzelle eine sich nicht teilende Zelle.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor wie oben beschrieben zur Verwendung als ein Arzneimittel.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein „In-vitro"-Verfahren zum Herstellen eines Lentivirusstocks, das Folgendes umfasst
    • (a) Transfizieren einer gegenüber Lentivirus toleranten Produzentenzelle mit einem Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor, wobei der zweite Vektor ein heterologes Gen umfasst;
    • (b) Züchten der Produzentenzelle unter Zellkulturbedingungen, die zum Ermöglichen der Produktion von für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikeln in der Zelle ausreichen; und
    • (c) Aufsammeln der für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikel aus der Produzentenzelle.
  • Vorzugsweise wird die Produzentenzelle in einem Zellkulturmedium gezüchtet und die für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikel werden aus dem Medium aufgesammelt.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein „In-vitro"-Verfahren zum Liefern eines heterologen Gens an eine Zielzelle, das das Infizieren der Zielzelle mit einem Lentivirus-Partikel wie oben beschrieben umfasst. Vorzugsweise ist die Zielzelle eine sich nicht teilende Zelle. Vorzugsweise handelt es sich bei der Zielzelle um eine Epithelzelle der menschlichen Atemwege.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Lentivirus- Partikel zur Verwendung als ein Arzneimittel.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, die ein für die Replikation unbrauchbares Lentivirus-Partikel in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein „In-vitro"-Verfahren zum Fertigen einer Verpackungszelle, das das Transfizieren einer gegenüber Lentivirus toleranten Zelle mit einem wie oben definierten ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des Equine-Infectious-Anemia-Virus-Genoms (EIAV-Genoms) umfasst, wobei der Vektor ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält, umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein „In-vitro"-Verfahren zum Fertigen einer Verpackungszelle, das das Transfizieren einer gegenüber Lentivirus toleranten Zelle mit einem ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des Equine-Infectious-Anemia-Virus-Genoms (EIAV-Genoms) umfasst, wobei der Vektor ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält, und weiterhin das Transfizieren der gegenüber Lentivirus toleranten Zelle mit einem wie im zweiten beschriebenen Expressionssystem definierten zweiten Vektor umfasst.
  • Vorzugsweise ist der Vektor ein gag-pol-Expressionsvektor. Vorzugsweise ist der Vektor aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (i) und (ii) oben ausgewählt. Vorzugsweise ist die gegenüber Lentivirus tolerante Zelle eine menschliche 293-Zelle.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Verpackungszelle, die eine gegenüber Lentivirus tolerante Wirtszelle umfasst, die einen wie im ersten beschriebenen Expressionssystem oben definierten ersten Vektor enthält und eine EIAV-Nukleinsäuresequenz umfasst, die mindestens ein EIAV-Strukturprotein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Verpackungssignal derart unbrauchbar ist, dass die Zelle selbst mindestens ein EIAV-Strukturprotein produzieren kann, aber keinen replikationskompetenten infektiösen Virus produzieren kann.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Verpackungszelle, die eine gegenüber Lentivirus tolerante Wirtszelle umfasst, die einen ersten Vektor enthält, der eine EIAV-Nukleinsäuresequenz umfasst, die mindestens ein EIAV-Strukturprotein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Verpackungssignal derart unbrauchbar ist, dass die Zelle selbst mindestens ein EIAV-Strukturprotein produzieren kann, aber keinen replikationskompetenten infektiösen Virus produzieren kann, wobei die Wirtszelle weiterhin einen wie im oben beschriebenen zweiten Expressionssystem definierten zweiten Vektor umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Verpackungszelle, die wie oben beschrieben ist und weiterhin einen wie oben definierten dritten Vektor umfasst.
  • Die vorhergehenden und andere Aspekte der Erfindung werden in den Zeichnungen hierin und der im Folgenden dargelegten Spezifikation detailliert erläutert.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHUNGEN
  • Es zeigen:
  • 1 ist eine schematische Darstellung von Plasmidkonstrukten, die zum Erzeugen von vom EIAV abgeleiteten Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es ist nur ein Teil jedes Plasmids bildlich dargestellt.
  • 2A ist eine schematische Darstellung des Plasmids pEV53.
  • 2B ist eine schematische Darstellung des Plasmids pEV53A.
  • 3 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pEC-lacZ.
  • 4 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pEC-puro.
  • 5 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pCI-VSV-G.
  • 6A beinhaltet vier fotografische Aufnahmen, die den Gentransfer zu sich teilenden (linke Spalte) und sich nicht teilenden (rechte Spalte) Zellen mittels MuLV- (obere Reihe) und EIAV-Vektoren (untere Reihe), wie in Beispiel 3 unten beschrieben, darstellen.
  • 6B ist eine graphische Darstellung der vergleichenden Effizienz des Gentransfers an sich teilende und sich nicht teilende Zellen mittels auf MuLV basierenden Vektoren (linkes Säulendiagrammpaar) und auf EIAV basierenden Vektoren (rechtes Säulendiagrammpaar). Ein erfolgreicher Gentransfer ist auf der y-Achse des Graphen als der Prozentanteil der infizierten Zellen, die blau gefärbt sind (d. h. X-ga1-positiv sind), wie unten beschrieben, dargestellt.
  • 6C ist eine graphische Darstellung der Fähigkeit von Aphidicolin, die Aufnahme von Bromdeoxyuridin (BrdU) in DNA in Zellen, die mittels auf MuLV basierenden Gentransfervektoren infiziert wurden, zu blockieren. Ein erfolgreicher Gentransfer ist auf der y-Achse des Graphen als der Prozentanteil der infizierten Zellen, die BrdU-positiv sind, wie in Beispiel 3 unten beschrieben, dargestellt.
  • 7 beinhaltet zwei Graphen, die die Fähigkeit des auf EIAV basierenden Vektors EC-lacZ, sich teilende und sich nicht teilende Zellen zu infizieren und Gene zu diesen zu transferieren, darstellen. Im linken Graph von 7 stellen leere Kreise nicht mit Aphidicolin behandelte menschliche CFT1-Zellen dar, während volle Kreise mit Aphidicolin behandelte menschliche CFT1-Zellen darstellen. Im rechten Graph von 7 stellen leere Dreiecke nicht mit Aphidicolin behandelte equine Hautzellen dar, während volle Dreiecke mit Aphidicolin behandelte equine Hautzellen darstellen. In beiden Graphen ist der Gentransfer auf der y-Achse als der Prozentanteil der infizierten Zellen, die X-ga1-positiv sind, dargestellt. In beiden Graphen ist die Dosierung des EC-lacZ-Vektors auf der x-Achse in Einheiten von μl Virus/ml Impfstoff dargestellt.
  • 8 ist eine Dosis-Ansprechkurve der Infektiosität von entweder nicht konzentrierten (nicht zentrifugierten) oder konzentrierten (zentrifugierten) EC-lacZ/VSV-G-pseudotypisierten Viruspartikeln. In 8 stellen leere Kreise konzentrierte Viruspartikel dar, während volle Kreise nicht konzentrierte Viruspartikel darstellen. Die Dosierung des EC-lacZ-Vektors ist auf der x-Achse in Einheiten von μl Virus/ml Impfstoff dargestellt, während die Infektiosität auf der y-Achse als der Prozentanteil der X-ga1-positiven Zellen dargestellt ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird nun hierin im Folgenden vollständiger mit Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in der bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt sind. Diese Erfindung kann jedoch in vielen verschiedenen Formen ausgedrückt werden und sollte nicht als auf die hierin dargelegten Ausführungsformen beschränkt verstanden werden. Vielmehr sind diese Ausführungsformen bereitgestellt, damit diese Offenbarung Fachmännern den Schutzumfang der Erfindung vollständig vermittelt.
  • I. Das Equine-Infectious-Anemia-Virusgenom
  • Das Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) ist ein Mitglied der Lentivirus-Gattung der Retrovirus-Familie. Das Wildtyp-EIVA-Virus weist ein dimerisches RNA-Genom auf (einzelsträngig, positive Polarität), das in ein sphärisch umhülltes Virion verpackt ist, das einen Nukleoproteinkern enthält. Die Replikation des Wildtyp-EIAV-Genoms erfolgt mittels Umkehrtranskription und Integrierung in das Genom der Wirtszelle. Das Genom enthält drei Gene, die die Strukturproteine gag, pol und env kodieren, und lange Wiederholungen (long terminal repeats, LTRs) an jedem Ende des integrierten viralen Genoms. Zusätzlich zu den gag-, pol- und env-Sequenzen, die allen Retroviren gemein sind, enthält das EIAV-Genom mehrere kurze offene Leseraster (open reading frames, ORFs). Diese kurzen ORFs werden aus mehrfach gespleißten mRNAs translatiert. ORF S1 kodiert den transkriptionellen Transaktivator tat. ORF S2 kodiert ein Protein, dessen Funktion unbekannt ist, und das ORF S3 scheint ein rev-Protein zu kodieren. Es wird vermutet, dass rev für die effiziente Expression von gag, pol und env erforderlich ist. rev agiert posttranskriptionell, indem es mit einer RNA-Sequenz wechselwirkt, die als das auf rev ansprechende Element (rev-responsive element, RRE) bekannt ist, das im EIAV im env-Gen angeordnet ist.
  • Das Wildtyp-Genom von EIAV enthält außerdem mehrere cis-agierende Sequenzen, einschließlich der R-Sequenz (kurze Wiederholung an jedem Ende des Genoms); der U5-Sequenz (einzigartiges Sequenzelement direkt hinter der R-Sequenz); der U3-Sequenz (einzigartiges Sequenzelement, das unterhalb der Strukturproteine angeordnet ist); Promotorelementen, die die Transkriptionsinitiation des integrierten Provirus steuern; eine Verpackungssequenz (hierin austauschbar als eine Verpackungsstelle oder ein Verpackungssignal bezeichnet) und eine 5'-Spleißdonorstelle.
  • II. EIAV-Vektoren der vorliegenden Erfindung
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung stellen ein Mittel zum Replizieren und Exprimieren heterologer Nukleinsäure, unabhängig vom Wirtszellkern, in einem weiten phylogenetischen Bereich von Wirtszellen bereit. Diese durch den Vektor vermittelte Aufnahme von heterologer Nukleinsäure in eine Wirtszelle wird als Transfektion oder Infizierung der Wirtszelle bezeichnet, wobei Infizierung die Verwendung von Viruspartikeln bedeutet und Transfektion die Verwendung von nackten Molekülen von Nukleinsäure bedeutet.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung gestatten außerdem die Aufnahme von heterologer Nukleinsäure in Viruspartikel, wodurch ein Mittel zur Amplifikation der Anzahl infizierter Wirtszellen, die darin heterologe Nukleinsäure enthalten, bereitgestellt wird. Die Aufnahme der heterologen Nukleinsäure erleichtert die Replikation der heterologen Nukleinsäure im viralen Partikel und die anschließende Produktion eines heterologen Proteins darin. Ein heterologes Protein ist hierin als ein Protein oder Fragment davon definiert, wobei das gesamte oder ein Teil des Proteins nicht von der Wirtszelle exprimiert wird. Eine Nukleinsäure oder Gensequenz wird als heterolog bezeichnet, wenn sie nicht natürlich im Wildtyp des viralen Vektors vorliegt, der zum Liefern des Gens in eine Zelle (z. B. das Wildtyp-EIAV-Genom) verwendet wird. Der Ausdruck Nukleinsäuresequenz oder Gensequenz, wie er hierin verwendet wird, soll sich auf ein Nukleinsäuremolekül (vorzugsweise DNA) beziehen. Derartige Gensequenzen können aus einer Vielfalt von Quellen abgeleitet werden, einschließlich DNA, cDNA, synthetischer DNA, RNA oder Kombinationen davon. Derartige Gensequenzen können genomische DNA umfassen, die natürlich vorkommende Introns enthalten kann oder nicht. Darüber hinaus kann solche genomische DNA in Verbindung mit Promotorsequenzen oder Polyadenylationssequenzen erhalten werden. Bei den Gensequenzen der vorliegenden Erfindung handelt es sich vorzugsweise um cDNA. Genomische oder cDNA kann auf eine Reihe von Wegen erhalten werden. Genomische DNA kann durch in der Technik wohl bekannte Mittel aus geeigneten Zellen extrahiert und gereinigt werden. Alternativ dazu kann mRNA aus einer Zelle isoliert und zum Herstellen von cDNA durch Umkehrtranskription oder andere Mittel verwendet werden.
  • Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, Vektoren zu erzeugen, die eine einzige Replikationsrunde im Vorgang der Lieferung eines Gens von Interesse an eine Zielzelle ausführen können. Ein Aspekt dieser Technologie ist ein Gentransfersystem, das den Transfer von viralen Genen an die Zielzelle ausschließt. Dies wird erreicht, indem virale Gene kodierende Expressionsvektoren physisch vom das Gen von Interesse kodierenden Vektor getrennt werden. Die separaten Expressionsvektoren werden in eine tolerante Zelle (z. B. eine „Produzentenzelle") transfiziert. Virale Genprodukte sind für die Produktion von Viruspartikeln erforderlich. In der vorliegenden Erfindung werden jedoch Gene, die für diese Gene kodieren, jedoch an Expressionsvektoren angeordnet, die unbrauchbare Verpackungssignale enthalten; dementsprechend werden die Gene, die für die Strukturproteine kodieren, nicht verpackt.
  • Die Ausdrücke „Strukturprotein" oder „EIAV-Strukturprotein", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf kodierte Proteine, die für die Einkapselung (z. B. Verpackung) des EIAV-Genoms benötigt werden, und beinhalten gag, pol und env.
  • Der Ausdruck „unbrauchbar", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die in Bezug auf entweder das Kodieren ihres Genprodukts oder das Dienen als eine Signalsequenz nicht funktionsfähig ist. Zur Veranschaulichung: Eine unbrauchbare env-Gensequenz wird das env-Protein nicht kodieren; ein unbrauchbares Verpackungssignal wird die Verpackung des Nukleinsäuremoleküls, an dem das unbrauchbare Signal angeordnet ist, nicht erleichtern. Nukleinsäuresequenzen können mit einem beliebigen in der Technik bekannten Mittel unbrauchbar gemacht werden, darunter durch Deletion von einem Teil der oder der gesamten Sequenz, Anordnen der Sequenz außerhalb des Rasters („out-of-frame") oder anderweitiges Blockieren der Sequenz.
  • Wie hierin verwendet, bedeuten die Ausdrücke „deletiert" oder „Deletion" entweder die komplette Deletion des spezifizierten Segments oder die Deletion eines ausreichenden Teils des spezifizierten Segments, so dass das Segment unwirksam oder funktionsunfähig gemacht wird, gemäß der Standardverwendung. Der Ausdruck „für die Replikation unbrauchbar", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass die Vektoren, die EIAV-Strukturproteine kodieren, nach der Transfektion der Vektoren nicht in der Zielzelle eingekapselt werden können. Die resultierenden Lentivirus-Partikel sind insofern für die Replikation unbrauchbar, als dass der verpackte Vektor nicht alle viralen Strukturproteine enthält, die für die Einkapselung erforderlich sind, wobei mindestens eines der erforderlichen Strukturproteine daraus deletiert worden ist, so dass der verpackte Vektor nicht dazu in der Lage ist, das gesamte virale Genom zu replizieren.
  • Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung werden vom EIAV abgeleitet. Native EIAV-Nukleinsäure kann aus mit dem Virus infizierten Zellen isoliert werden und es können daraus Vektoren hergestellt werden. Ein beispielhaftes Verfahren zur Herstellung von EIAV-Vektoren wird in S. T. Perry et al., J. Virol. 66, 4085–4097 (1992), geliefert. cDNA kann beispielsweise durch Umkehrtranskriptase aus EIAV-RNA unter Verwendung von in der Technik bekannter Ver fahren hergestellt werden. Doppelsträngige EIAV-cDNA kann dann hergestellt und in einen Klonierungsvektor, wie beispielsweise einen bakteriellen Klonierungsvektor, kloniert werden. Ein beliebiger Klonierungsvektor, wie beispielsweise bakterielle, Hefe- oder eukaryotische Vektoren, die Fachmännern bekannt sind und von diesen verwendet werden, kann eingesetzt werden. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise cDNA, die zumindest zu einem Teil des RNA-Genoms von EIAV komplementär ist. Ein Vektor kann ein heterologes cDNA-Molekül enthalten, das in menschliche oder Tierzellen eingeführt werden kann, um eine Transkription oder Expression des heterologen Moleküls zu erzielen. Die cDNA-Moleküle werden cDNA umfassen, die zumindest zu einem Teil eines EIAV-Genoms komplementär ist und einen Teil des RNA-Genoms umfasst, der zur Replikation des Genoms erforderlich ist, wobei das cDNA-Molekül unter die Transkriptionssteuerung einer in der Zelle funktionsfähigen Promotorsequenz gestellt wird.
  • Eine Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung kann einen Promotor eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs umfassen und wird dazu ausreichen, die Transkription einer distal angeordneten Sequenz (d. h. einer mit dem 5'-Ende der Promotorsequenz verknüpften Sequenz) in einer Zelle zu lenken. Die Promotorregion kann außerdem Steuerungselemente für die Verstärkung oder Hemmung der Transkription enthalten. Geeignete Promotoren sind der Immediate-Early-Promotor vom Cytomegaiovirus (pCMV), der LTR-Promotor (LTR = long terminal repeat, lange Wiederholung an den Enden) vom Rous-Sarkomavirus (pRSV) und die SP6-, T3- oder T7-Promotoren. Verstärkersequenzen oberhalb des Promotors oder Terminatorsequenzen unterhalb der Kodierregion können wahlweise in die Vektoren der vorliegenden Erfindung eingebunden werden, um die Expression zu erleichtern. Vektoren der vorliegenden Erfindung können außerdem zusätzliche Nukleinsäuresequenzen enthalten, wie beispielsweise eine Polyadenylationssequenz, eine Lokalisierungssequenz oder eine Signalsequenz, die dazu ausreichen, einer Zelle zu ermöglichen, das von der Nukleinsäure des Vektors exprimierte Protein effizient und effektiv zu verarbeiten. Beispiele bevorzugter Polyadenylationssequenzen sind die SV40-Early-Regian-Polyadenylationsstelle (C. V. Hall et al., J. Molec. App. Genet. 2, 101 (1983)) und die SV40-Late-Region-Polyadenylationsstelle (S. Carswell und J. C. Alwine, Mol. Cell. Biol. 9, 4248 (1989)). Derartige zusätzliche Sequenzen werden derart in den Vektor eingefügt, dass sie mit der Promotorsequenz operativ verknüpft sind, wenn eine Transkription erwünscht ist, oder zusätzlich dazu mit der Initiations- und Verarbeitungssequenz, wenn eine Translation und Verarbeitung erwünscht ist. Alternativ dazu können die eingefügten Sequenzen an einer beliebigen Position im Vektor angeordnet werden. Der Ausdruck „operativ verknüpft" wird verwendet, um eine Verknüpfung zwischen einer Gensequenz und einem Promotor oder einer anderen Regulations- oder Verarbeitungssequenz zu beschreiben, so dass die Transkription der Gensequenz von einer operativ verknüpften Promotorsequenz gelenkt wird, die Translation der Gensequenz von einer operativ verknüpften translationalen Regulationssequenz gelenkt wird und die posttranslationale Verarbeitung der Gensequenz von einer operativ verknüpften Verarbeitungssequenz gelenkt wird.
  • Standardtechniken zur Konstruktion der Vektoren der vorliegenden Erfindung sind Durchschnittsfachmännern wohl bekannt und können in Bezugsquellen wie Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989), gefunden werden. Eine Vielfalt von Strategien steht zum Ligieren von DNA-Fragmenten zur Verfügung, deren Auswahl von der Beschaffenheit der Termini der DNA-Fragmente abhängt und die vom erfahrenen Techniker einfach gemacht werden kann.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor drei Vektoren. Der erste Vektor umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) gag und EIAV pol kodiert, wobei der Vektor (i) mindestens einen Defekt in mindestens einem Gen, das ein EIAV-Strukturprotein kodiert, enthält, (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält und (iii) das offene Leseraster S2 enthält. Der zweite Vektor umfasst eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des EIAV-Genoms, wobei der Vektor (i) ein kompetentes Verpackungssignal enthält und (ii) eine multiple Klonierungsstelle enthält, in die ein heterologes Gen insertiert werden kann. Der dritte Vektor umfasst eine Nukleinsäuresequenz eines Virus, wobei der dritte Vektor (i) ein Virenhüllprotein exprimiert und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält.
  • In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor drei Vektoren, wobei der erste Vektor eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) gag und EIAV pol kodiert, wobei der Vektor (i) mindestens einen Defekt in mindestens einem Gen, das ein EIAV-Strukturprotein kodiert, enthält, und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält. Der zweite Vektor umfasst eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des EIAV-Genoms, wobei der Vektor (i) ein kompetentes Verpa ckungssignal enthält und (ii) eine multiple Klonierungsstelle enthält, in die ein heterologes Gen insertiert werden kann, und (iii) eine partielle EIAV-gag-Sequenz enthält, die die Basenpaare 993 bis 1570 vom Plasmid pEC-lacZ umfasst. Das Plasmid pEC-lacZ ist ein 8749 bp langes, vom EIAV abgeleitetes Plasmid, das das E. coli-lacZ-Reportergen exprimiert und zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (angeordnet an den bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle EIAV-gag-Sequenz (bp 993–1570), die lacZ-Kodierungssequenz (bp 2297–5437), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 5752–6073), eine Phage-fl-Region (bp 6163–6618), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 7057–7917) und einen ColE1-Replikationsursprung (bp 8062–8736) enthält. Alternativ dazu umfasst der zweite Vektor eine partielle EIAV-gag-Sequenz, die die Basenpaare 993 bis 1570 vom Plasmid pEC-puro umfasst. Das Plasmid pEC-puro ist ein 6099 bp langes, vom EIAV abgeleitetes Plasmid, das das Puromycinresistenz-Gen exprimiert und zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570), die Puromycinresistenz-Gen-Kodiersequenz (bp 2334–2933), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 3102–3423), eine Phage-fl-Region (bp 3513–3968), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 4407–5267) und einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 5412–6086) enthält. Der dritte Vektor umfasst eine Nukleinsäuresequenz eines Virus, wobei der dritte Vektor (i) ein Virenhüllprotein exprimiert und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist der erste Vektor ein gag/pol-Expresssionsvektor. gag/pol-Expressionsvektoren exprimieren EIAV-Proteine, die für das Zusammenfügen und Freigeben von viralen Partikeln aus Zellen erforderlich sind, und enthalten Gene, die die zusätzlichen Proteine rev und tat kodieren. Das offene Leseraster S2, das ein Protein kodiert, dessen Funktion unbekannt ist, kann zusätzlich in den ersten Vektor eingebunden werden. Der erste Vektor ist so konstruiert, dass er Mutationen enthält, die einen von Retroviren vermittelten Transfer von viralen Genen ausschließen. Derartige Mutationen können eine Deletion von Sequenzen im viralen env-Gen sein, wodurch die Möglichkeit der Erzeugung von replikationskompetentem EIAV ausgeschlossen wird, oder können Deletionen von bestimmten cis-agierenden Sequenzelementen am 3'-Ende des Genoms sein, die für die Umkehrtranskription und Integrierung von Viren erforderlich sind. Dementsprechend werden virale Gene aus diesem Konstrukt, selbst wenn sie in virale Partikel verpackt sind, nicht repliziert und es werden keine replikationskompetenten Wildtyp-Viren erzeugt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem ersten Vektor des Expressionssystems um das Plasmid pEV53, gezeigt in 2A. pEV53 ist ein Plasmid und cDNA-Klon mit 12.170 Basenpaaren (bp), der an den Basenpaaren 209–1072 eine chimäre CMV/EIAV-Verstärker-Promotorregion enthält, die oberhalb der EIAV-tat-Kodierregionen (bp 1124–1210 und 5886–6026), der gag-Kodierregion (bp 1216–2676), der pol-Kodierregion (bp 2433–5874) und der ORF-S2-Kodierregion (bp 6037–6234) angeordnet ist. Der Vektor enthält außerdem eine partielle env-Kodierregion (bp 6063–7733) und rev-Kodierregionen (bp 6188–6288 und 7250–7654). Das BGH-Polyadenylations signal (BGH = bovine growth hormone, Rinderwachstumshormon) (bp 7759–7973) wird bereitgestellt, wie auch eine Phage-fl-Region (bp 8037–8450), eine SV40-Early-Promotorregion und ein Replikationsursprung (bp 8514–8839), eine Neomycinresistenz-Kodierregion (bp 9685–9924), ein SV40-Polyadenylationssignal (bp 9685–9924), ein ColE1-Replikationsursprung (bp 10356–11029) und eine β-Lactamase-Kodierregion (Ampicillinresistenz-Kodierregion) (bp 11174–12035).
  • In einer mehr bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Expressionssystem um das Plasmid pEV53A, gezeigt in 2B. Das Plasmid pEV53A ist vom Plasmid pEV53 abgeleitet, wobei Modifikationen vorgenommen worden sind, um die Wahrscheinlichkeit eines von Retroviren vermittelten Transfers von viralen Genen weiter zu verringern, ohne die Expressionsniveaus von EIAV-Proteinen zu beeinträchtigen. Im Plasmid pEV53A sind alle EIAV-LTR-Sequenzen (LTR = long terminal repeat, lange Wiederholungen an den Enden), die Promotor-/Verstärkerelemente und cis-agierende Sequenzelemente enthalten, die für die Integrierung wichtig sind, und die tRNA-Primer-Bindungsstellensequenz zur Initiation der Umkehrtranskription aus dem pEV53 deletiert worden. pEV53A ist aus pEV53 durch Deletieren der Nukleotide 902 bis 1077 von pEV53 konstruiert worden.
  • Der zweite Vektor des Expressionssystems der vorliegenden Erfindung ist dazu konzipiert, als der Vektor für Gentransfer zu dienen, und enthält alle cis-agierenden Sequenzelemente, die zum Unterstützen der Umkehrtranskription (Replikation) des Vektor-Genoms erforderlich sind, sowie eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion von cDNAs, die heterologe Gene von Interesse kodieren. In der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Vektor, der das Gen von Interesse kodiert, um einen rekombinanten, vom EIAV abgeleiteten Vektor, der die genetische Information trägt, die in eine Zielzelle transduziert werden soll, zusammen mit cis-agierenden Sequenzen, die für die Verpackung und Integrierung des viralen Genoms erforderlich sind. Der zweite Vektor wird vorzugsweise einen Teil der gag-Kodiersequenz enthalten, da vermutet wird, dass bestimmte Teile der gag-Sequenz bei der Verpackung des EIAV-Genoms eine Rolle spielen. Darüber hinaus wird die in der LTR enthaltene 5'-Spleißdonorstelle vorzugsweise eine Mutation enthalten, die den Titer des produzierten Virus erhöht, wie z. B. in W. Tan et al., J. Virol. 70, 3645–3658 (1996), beschrieben.
  • Zwei Beispiele von bevorzugten zweiten Vektoren sind in den 3 und 4 bereitgestellt. 3 stellt den Plasmid und cDNA-Klon pEC-lacZ dar, ein 8749 bp langes, vom EIAV abgeleitetes Plasmid, das das E. coli-lacZ-Reportergen exprimiert. Das Plasmid enthält zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (angeordnet an den bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle EIAV-gag-Sequenz (bp 993–1570), die lacZ-Kodierungssequenz (bp 2297–5437), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 5752–6073), eine Phage-fl-Region (bp 6163–6618), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 7057–7917) und einen ColE1-Replikationsursprung (bp 8062–8736).
  • 4 stellt den Plasmid und cDNA-Klon pEC-puro dar, ein 6099 bp langes, vom EIAV abgeleitetes Plasmid, das das Puromycinresistenz-Gen exprimiert. Dieser Vektor enthält ebenfalls zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570), die Puromycinresistenz-Gen-Kodiersequenz (bp 2334–2933), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 3102–3423), eine Phage-fl-Region (bp 3513–3968), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 4407–5267) und einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 5412–6086).
  • Wie Fachmänner zu schätzen wissen werden, kann die Nukleotidsequenz der insertierten heterologen Gensequenz oder -sequenzen eine beliebige Nukleotidsequenz sein. Die insertierte heterologe Gensequenz kann beispielsweise eine Reportergensequenz oder eine selektierbare Markergensequenz sein. Eine Reportergensequenz, wie hierin verwendet, ist eine beliebige Gensequenz, die, wenn sie exprimiert wird, zur Produktion eines Proteins führt, dessen Vorliegen oder Aktivität überwacht werden kann. Beispiele geeigneter Reportergene beinhalten das Gen für Galaktokinase, beta-Galaktosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, beta-Laktamase, usw. Alternativ dazu kann die Reportergensequenz eine beliebige Gensequenz sein, deren Expression ein Genprodukt hervorbringt, das sich auf die Zellenphysiologie auswirkt. Heterologe Gensequenzen der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere Gensequenzen umfassen, die bereits über einen oder mehrere Promotoren oder eine oder mehrere Initiationssequenzen oder Verarbeitungssequenzen verfügen.
  • Eine selektierbare Markergensequenz ist eine beliebige Gensequenz, die ein Protein exprimieren kann, dessen Vorliegen es ermöglicht, eine Zelle, die es enthält, selektiv zu reproduzieren. Beispiele selektierbarer Markergene beinhalten Gensequenzen, die einem Wirt Resistenz gegenüber Antibiotika (z. B. Puromycin, Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin und dergleichen) verleihen können oder einem Wirt Resistenz gegenüber Aminosäure-Analoga verleihen können oder das Wachstum von Bakterien auf zusätzlichen Kohlenstoffquellen oder unter anderweitig unzulässigen Kulturbedingungen zulassen können. Eine Gensequenz kann sowohl ein Reportergen als auch eine selektierbare Markergensequenz sein. Die am meisten bevorzugten Reportergene der vorliegenden Erfindung sind das lacZ-Gen, das die beta-Galaktosidase-Aktivität von E. coli kodiert; und das Puromycinresistenz kodierende Gen.
  • Bevorzugte Reporter- oder selektierbare Markergensequenzen reichen dazu aus, die Erkennung oder Selektion des Vektors in normalen Zellen zu ermöglichen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Reportergensequenz ein Enzym oder anderes Protein kodieren, das normalerweise nicht in Säugerzellen vorliegt, und dessen Vorliegen kann folglich das Vorliegen des Vektors in einer solchen Zelle definitiv feststellen.
  • Die heterologe Gensequenz kann außerdem die Kodiersequenz eines erwünschten Produkts, wie beispielsweise eines geeigneten biologisch wirksamen Proteins oder Polypeptids, immunogenen oder antigenen Proteins oder Polypeptids oder eines therapeutisch wirksamen Proteins oder Polypeptids, umfassen. Alternativ dazu kann die heterologe Gensequenz eine Sequenz umfassen, die zu einer RNA-Sequenz, wie beispielsweise einer Antisense-RNA-Sequenz, komplementär ist, wobei die Antisense-Sequenz einer Person verabreicht werden kann, um die Expression eines komplementären Polynukleotids in den Zellen der Person zu inhibieren.
  • Die Expression des heterologen Gens kann ein immunogenes oder antigenes Protein oder Polypeptid liefern, um eine Antikörperreaktion zu erzielen, wobei die Antikörper aus einem Tier in einer Körperflüssigkeit, wie beispielsweise Blut, Serum oder Aszites, aufgesammelt werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung exprimiert der dritte Vektor des Expressionssystems für rekombinanten lentiviralen Vektor ein Virenhüllprotein. Ein derartiger Vektor wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die unter der Steuerung eines geeigneten Promotors ein virales Protein kodiert. Es ist möglich, den Wirtszellenbereich zu verändern, den die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung infizieren können, indem ein Hüllgen von einem anderen eng verwandten Virus eingesetzt wird. Anders ausgedrückt ist es möglich, den Wirtsbereich der EIAV-Vektoren der vorliegenden Erfindung zu erweitern, indem aus der Kapazität der Hüllproteine bestimmter Viren, die an der Einkapselung anderer Viren beteiligt sind, ausgenutzt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das G-Protein des vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G; siehe z. B. Rose und Gillione, J. Virol. 39, 519–528 (1981); Rose und Bergmann, Cell 30, 753–762 (1982)) oder ein Fragment oder Derivat davon das Hüllprotein, das vom dritten Vektor exprimiert wird. VSV-G bildet effizient pseudotypisierte Virione mit Genom- und Matrixkomponenten anderer Viren. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Pseudotyp" auf ein virales Partikel, das Nukleinsäure von einem Virus, aber das Hüllprotein von einem anderen Virus enthält. Im Allgemeinen weisen VSV-G-pseudotypisierte Vektoren einen sehr weiten Wirtsbereich auf und können durch Ultrazentrifugation auf Titer mit hoher Konzentration pelletiert werden (z. B. gemäß des Verfahrens von J. C. Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8033–8037 (1993)), während gleichzeitig hohe Infektiositätsniveaus beibehalten werden.
  • Ein veranschaulichendes und bevorzugtes Beispiel eines dritten Vektors der vorliegenden Erfindung ist in 5 gezeigt. Diese Figur stellt den Plasmid und cDNA-Klon pCI-VSV-G dar, einen bevorzugten Expressionsvektor für das Hüllglykoprotein VSV-G. Das Plasmid beinhaltet 5679 Basenpaare und enthält die CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregian (bp 1–795), eine chimäre Intronregion (bp 857–989), die VSV-G-Kodierregion (bp 1088–2633), eine Phage-fl-Region (bp 3093–3548), ein SV40-Late-Polyadenylationssignal (bp 2782–3003), einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 4992–5666) und eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 3987–4847).
  • In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung können infektiöse, für die Replikation unbrauchbare EIAV-Partikel gemäß den hierin offenbarten Verfahren in Kombination mit Fachmännern bekannten Techniken hergestellt werden. Das Verfahren beinhaltet das Transfizieren einer gegenüber Lentivirus toleranten Zelle mit dem Vektorexpressionssystem der vorliegenden Erfindung; das Herstellen der vom EIAV abgeleiteten Partikel in der transfizierten Zelle und das Aufsammeln der Viruspartikel aus der Zelle. Der Schritt des Transfizierens der gegenüber Lentivirus toleranten Zelle kann gemäß einem beliebigen geeigneten, Fachmännern bekannten Mittel durchgeführt werden. In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise das hierin beschriebene Expressionssystem mit drei Plasmiden verwendet, um vom EIAV abgeleitete retrovirale Partikel durch vorübergehende Transfektion zu erzeugen. Als ein anderes Beispiel kann die Aufnahme der Vektoren in die Zellen durch ein beliebiges geeignetes Mittel erzielt werden, wie beispielsweise durch Behandeln der Zellen mit DEAE-Dextran, Behandeln der RNA mit „LIPOFECTIN®" vor Zugabe zu den Zellen oder durch Elektroporation. Diese Techniken sind in der Technik wohl bekannt.
  • Der Schritt des Erleichterns der Produktion der infektiösen viralen Partikel in den Zellen kann ebenfalls unter Verwendung herkömmlicher Techniken durchgeführt werden, wie beispielsweise durch Zellkulturwachstumsstandardtechniken.
  • Der Schritt des Aufsammelns der infektiösen Viruspartikel kann ebenfalls unter Verwendung herkömmlicher Techniken durchgeführt werden. Die infektiösen Partikel können beispielsweise mittels Zelllyse oder Aufsammeln des Überstands der Zellkultur aufgesammelt werden, wie in der Technik bekannt ist. Wahlweise können die aufgesammelten Viruspartikel gereinigt werden, falls dies gewünscht wird. Geeignete Reinigungstechniken sind Fachmännern wohl bekannt.
  • Wenn dies vom erfahrenen Techniker gewünscht wird, können unter Verwendung der Vektoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung lentivirale Stocklösungen hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung viraler Stocklösungen sind in der Technik bekannt und werden z. B. von Y. Soneoka et al., Nucl. Acids Res. 23, 628–633 (1995), und N. R. Landau et al., J. Virol. 66, 5110–5113 (1992), dargelegt. In einem Verfahren zur Herstellung einer Stocklösung in der vorliegenden Erfindung werden gegenüber Lentivirus tolerante Zellen (hierin als Produzentenzellen bezeichnet) mit dem Vektorsystem der vorliegenden Erfindung transfiziert. Die Zellen werden dann unter geeigneten Zellkulturbedingungen gezüchtet und die lentiviralen Partikel entweder aus den Zellen selbst oder aus den Zellmedien aufgesammelt, wie oben beschrieben. Geeignete Produzentenzelllinien beinhalten unter anderem die humane embryonale Nierenzelllinie 293, die equine Hautzelllinie NBL-6 und die fötale Hundethymuszellline Cf2TH.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls bei der Herstellung stabiler Verpackungszellen (d. h. Zellen, die EIAV-Virusproteine stabil exprimieren, wobei die Zellen allein keine infektiösen Viruspartikel erzeugen können) von Nutzen. Verfahren zur Herstellung von Verpackungszellen, die Retrovirusproteine exprimieren, sind in der Technik bekannt und werden durch die beispielsweise in der US-Patentschrift 4,650,764 an Temin et al. dargelegten Verfahren veranschaulicht. Innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung wird eine Verpackungszelle eine gegenüber Lentivirus tolerante Wirtszelle umfassen, die eine EIAV-Nukleinsäuresequenz umfasst, die für mindestens ein EIAV-Strukturprotein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Verpackungssignal unbrauchbar ist, wodurch die Zelle selbst in die Lage versetzt wird, mindestens ein EIAV-Strukturprotein, jedoch nicht replikationskompetenten infektiösen Virus zu produzieren. In einer Ausführungsform ist die EIAV-Nukleinsäuresequenz ein EIAV-gag-pol-Expressionsvektor, wie beispielsweise pEV53. Eine Verpackungszelle kann durch Transfizieren einer gegenüber EIAV toleranten Wirtszelle (z. B. einer humanen embryonalen Nieren zelle 293) mit einer geeigneten EIAV-Nukleinsäuresequenz herstellt werden, wie oben gemäß bekannten Verfahren bereitgestellt. Die resultierende Verpackungszelle kann somit mindestens ein EIAV-Strukturprotein exprimieren und produzieren. Dadurch dass die EIAV-Nukleinsäuresequenz im Verpackungssignal jedoch unbrauchbar ist, kann die Zelle alleine keinen replikationskompetenten EIAV-Virus produzieren. Die Verpackungszelle kann dann mit anderen Nukleinsäuresequenzen (z. B. pEC-puro, pEC-lacZ oder pCI-VSV-G) transfiziert werden, die heterologe Gene von Interesse und ein entsprechendes Verpackungssignal enthalten können. Nachdem sie mit der zusätzlichen Sequenz bzw. den zusätzlichen Sequenzen transfiziert wurde, kann die Verpackungszelle somit dazu verwendet werden, Stocks von EIAV-Viren zu liefern, die heterologe Gene enthalten, wobei die Viren selbst jedoch replikationsinkompetent sind.
  • Pharmazeutische Formulierungen, wie beispielsweise Vakzine, der vorliegenden Erfindung umfassen eine immunogene Menge der wie hierin offenbarten infektiösen, für die Replikation unbrauchbaren Viruspartikel in Kombination mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Eine „immunogene Menge" ist eine Menge der infektiösen Viruspartikel, die dazu ausreicht, eine Immunreaktion im Subjekt hervorzurufen, an das die pharmazeutische Formulierung verabreicht wird. Eine Menge von etwa 103 bis etwa 107 Viruspartikel und vorzugsweise etwa 104 bis 106 Viruspartikel pro Dosis wird als geeignet angesehen, je nach Alter und Spezies des behandelten Subjekts und Immunogen, gegen das die Immunreaktion erwünscht ist. Beispielhafte pharmazeutisch unbedenkliche Träger beinhalten unter anderem steriles pyrogenfreies Wasser und sterile pyrogenfreie physiologische Kochsalzlösung. Subjekte, denen immunogene Mengen der infektiösen, für die Replikation unbrauchbaren Viruspartikel der vorliegenden Erfindung verabreicht werden können, beinhalten unter anderem menschliche und Tiersubjekte (z. B. Schwein, Rind, Hund, Pferd, Esel, Maus, Hamster, Affen).
  • Pharmazeutische Formulierungen der vorliegenden Erfindung beinhalten jene, die zur parenteralen (z. B. subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen und intraartikulären) oder oralen Verabreichung oder Verabreichung durch Inhalation geeignet sind. Alternativ dazu können pharmazeutische Formulierungen der vorliegenden Erfindung zur Verabreichung an die Schleimhäute eines Subjekts (z. B. intranasale Verabreichung) geeignet sein. Die Formulierungen können zweckmäßig in Einheitsdosenform und mittels eines beliebigen der in der Technik wohl bekannten Verfahren hergestellt werden.
  • Die Vektoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in In-vitro-Expressionssystemen von Nutzen, wobei die insertierten heterologen Gene, die am zweiten Vektor angeordnet sind, Proteine oder Peptide kodieren, die wünschenswerterweise in vitro produziert werden.
  • Die Vektoren, Verfahren und pharmazeutischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind darüber hinaus in einem Verfahren zur Verabreichung eines Proteins oder Peptids an ein Subjekt, das des gewünschten Proteins oder Peptids bedarf, von Nutzen, als ein Behandlungsverfahren oder anderweitig. In dieser Ausführungsform der Erfindung kodiert das heterologe Gen, das am zweiten Vektor der vorliegenden Erfindung angeordnet ist, das gewünschte Protein oder Peptid und es werden Helferzellen oder pharmazeutische Formulierungen, die die Helferzellen der vorlie genden Erfindung enthalten, an ein Subjekt verabreicht, das des gewünschten Proteins oder Peptids bedarf. Auf diese Weise kann somit das Protein oder Peptid in vivo im Subjekt produziert werden. Das Subjekt kann des Proteins oder Peptids bedürfen, weil es einen Mangel am Protein oder Peptid hat oder weil die Produktion des Proteins oder Peptids im Subjekt eine therapeutische Wirkung verleihen kann, als ein Behandlungsverfahren oder anderweitig und wie im Folgenden weiter erläutert.
  • III. Gentransfertechnologie
  • Die Gentransfertechnologie der vorliegenden Erfindung hat mehrere Anwendungen. Die direktesten Anwendungen liegen wahrscheinlich im Aufklären der Vorgänge von Peptiden und funktionsfähigen Domänen von Proteinen. Klonierte cDNA oder genomische Sequenzen für Proteine können in verschiedene Zelltypen in Kultur oder in vivo eingeführt werden, um zellspezifische Unterschiede bei der Verarbeitung und beim Zellschicksal zu studieren. Durch Stellen der Kodiersequenzen unter die Steuerung eines starken Promotors kann eine erhebliche Menge des gewünschten Proteins hergestellt werden. Weiterhin können die spezifischen Rückstände, die an der Proteinverarbeitung, intrazellulären Sortierung oder biologischen Aktivität beteiligt sind, durch Veränderung der diskreten Rückstände der Kodiersequenzen durch Mutation bestimmt werden.
  • Die Gentransfertechnologie der vorliegenden Erfindung kann auch zum Bereitstellen eines Mittels zur Steuerung der Expression eines Proteins und zur Bewertung von dessen Kapazität, zelluläre Ereignisse zu modulieren, angewendet werden. Einige Funktionen von Proteinen, wie beispielsweise ihre Rolle bei der Differenzierung, können in Gewebekultur studiert werden, wohingegen andere eine erneute Einführung in In-vivo-Systeme zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung erfordern werden, um Veränderungen der relevanten Eigenschaften zu überwachen.
  • Der Gentransfer stellt ein Mittel zum Studieren der Nukleinsäuresequenzen und zellulären Faktoren, die die Expression spezifischer Gene regulieren, bereit. Ein Ansatz zu einer solchen Studie würde darin bestehen, die zu studierenden Regulationselemente mit Reportergenen zu fusionieren und anschließend die Expression des Reportergens zu untersuchen.
  • Der Gentransfer weist außerdem potentiellen Nutzen beim Verstehen von Krankheitszuständen und beim Bereitstellen einer Therapie für diese auf. Es gibt eine Reihe Erbkrankheiten, bei denen defekte Gene bekannt sind und kloniert worden sind. In einigen Fällen ist die Funktion dieser klonierten Gene bekannt. Im Allgemeinen fallen die obigen Krankheitszustände in zwei Kategorien: Mangelzustände, für gewöhnlich an Enzymen, die im Allgemeinen auf überdeckte Weise ererbt werden, und unausgeglichene Zustände, an denen zumindest manchmal Regulations- oder Strukturproteine beteiligt sind, die auf dominante Weise ererbt werden. Bei Mangelkrankheitszuständen könnte der Gentransfer dazu verwendet werden, ein normales Gen in betroffene Gewebe zur Substitutionstherapie einzubringen als auch Tiermodelle der Krankheit unter Verwendung von Antisense-Mutationen zu erstellen. Bei unausgeglichenen Krankheitszuständen könnte der Gentransfer dazu verwendet werden, einen Krankheitszustand in einem Modellsystem zu erstellen, das dann bei Anstrengungen verwendet werden könnte, dem Krankheitszu stand entgegenzuwirken. Folglich ermöglichen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Behandlung genetischer Krankheiten. Wie hierin verwendet, wird ein Krankheitszustand durch teilweises oder vollkommenes Beheben des Mangels oder des Ungleichgewichts, der bzw. das die Krankheit verursacht oder verschlimmert, behandelt. Die Verwendung stellenspezifischer Integrierung von Nukleinsäuresequenzen zum Bewirken von Mutationen oder Korrigieren von Defekten ist ebenfalls möglich.
  • Blutbildungszellen, Lymphozyten, Gefäßendothelzellen, Respirationsepithel, Keratinozyten, Skelett- und Herzmuskelzellen, Neuronen und Krebszellen sind unter den vorgeschlagenen Zielen für einen therapeutischen Gentransfer, entweder ex vivo oder in vivo. Siehe z. B. A. D. Miller, Nature 357, 455–460 (1992); R. C. Mulligan, Science 260, 926–932 (1993). Diese Zellen und andere sind geeignete Zielzellen für die Vektoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Zusammenfassend können die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um entweder sich teilende Zellen oder sich nicht teilende Zellen stabil zu transfizieren und ein heterologes Gen stabil zu exprimieren. Bei Verwendung dieses Vektorsystems ist es jetzt möglich, Gene in sich teilende oder sich nicht teilende Zellen einzuführen, die Proteine kodieren, die sich auf die Physiologie der Zellen auswirken können. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können folglich in der Gentherapie für Krankheitszustände oder zur experimentellen Modifizierung der Zellphysiologie von Nutzen sein.
  • Nachdem die Erfindung nun beschrieben wurde, wird die selbige mit Bezugnahme auf bestimmte Beispiele veranschaulicht, die hierin nur zu Veranschaulichungszwecken enthalten sind und die Erfindung nicht einschränken sollen.
  • Beispiel 1
  • Plasmidkonstruktion
  • Das Elternplasmid für hierin beschriebene EIAV-Vektoren ist das Plasmid pER2.1, großzügigerweise von Dr. Fred Fuller von der North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA, bereitgestellt. Die Konstruktion des Klons pER2.1 wird in S. T. Perry et al., J. Virol. 66, 4085–4097 (1992), beschrieben. pER2.1 kodiert einen infektiösen DNA-Klon des Malmquist-Wyoming-Stamms von EIAV. Ein Sicherheitsaspekt dieses Klons besteht darin, dass der erzeugte Virus in seinem natürlichen equinen Wirt keine Krankheit verursacht. Außerdem bringt der Wildtyp-EIAV im Gegensatz zu von anderen Retroviren (z. B. Maus-Leukämievirus, Human Immunodeficiency Virus (HIV)) abgeleiteten Vektoren in menschlichen Zellen keine aktive Infektion hervor.
  • EIAV-gag/pol-Expressionsvektor (erster Vektor). Das Plasmid pEV53 (in 2A gezeigt) wurde dazu konzipiert, EIAV-Proteine zu exprimieren, die für das Zusammenfügen und Freigeben von viralen Partikeln aus Zellen erforderlich sind, und enthält Gene, die die von den gag- und pol-Genen kodierten Proteine und die zusätzlichen Proteine rev und tat kodieren. Das offene Leseraster S2, das ein Protein kodiert, dessen Funktion unbekannt ist, wurde ebenfalls eingebunden. pEV53 wurde so konstruiert, dass es Mutationen enthält, die einen von Retroviren vermittelten Transfer von viralen Genen ausschließen. Die Mutationen enthalten Sequenzdeletionen im viralen env-Gen (wodurch die Möglichkeit der Erzeugung von replikationskompetenten EIAV-Viruspartikeln ausgeschlossen wird) und eine Deletion von bestimmten cis-agierenden Sequenzelementen am 3'-Ende des Genoms, die für die Umkehrtranskription und Integrierung von Viren erforderlich sind. Deletionen werden eingebunden, so dass im unwahrscheinlichen Fall, dass virale Gene in die infektiösen Partikel verpackt werden, sie nicht repliziert werden (es werden z. B. keine replikationskompetenten Wildtyp-Vektoren erzeugt). Das Plasmid pEV53A, in 2B gezeigt, ist vom Plasmid pEV53 abgeleitet, unterscheidet sich von pEV53 jedoch darin, dass alle EIAV-LTR-Sequenzen (LTR = long terminal repeat, lange Wiederholungen an den Enden), die Promotor-/Verstärkerelemente und cis-agierende Sequenzelemente enthalten, die für die Integrierung wichtig sind, sowie die tRNA-Primer-Bindungsstellensequenz zur Initiation der Umkehrtranskription deletiert worden sind, indem die Nukleotide 902 bis 1077 von pEV53 entfernt wurden. Das Plasmid pEV53A wurde hergestellt, um die Wahrscheinlichkeit eines von Retroviren vermittelten Transfers von viralen Genen weiter zu verringern, ohne die Expressionsniveaus von EIAV-Proteinen zu beeinträchtigen.
  • Gentransfervektor (zweiter Vektor). Die Plasmide pEC-lacZ (in 3 gezeigt) und pEC-puro (in 4 gezeigt) wurden dazu konzipiert, als der Vektor für Gentransfer zu dienen, und enthalten alle cis-agierenden Sequenzelemente, die zum Unterstützen der Umkehrtranskription (z. B. Replikation) des Vektor-Genoms erforderlich sind, sowie eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion von cDNAs, die Gene von Interesse kodieren. Das Plasmid pEC-lacZ kodiert das beta-Galaktosidase-Reportergen lacZ, wohingegen das Plasmid pEC-puro das bei Puromycin-N-acetyltransferase dominante selektierbare Markergen puro kodiert.
  • Virenhüllgenexpressionsvektor (dritter Vektor). Das dritte Plasmid des hierin beschriebenen Expressionssystems ist das Plasmid pCI-VSV-G, in 5 gezeigt. Dieses Plasmid exprimiert ein Virenhüllgen, insbesondere das Gen des G-Glykoproteins des vesikulären Stomatitisvirus,
  • Beispiel 2
  • Herstellen und Prüfen von viralen Vektoren
  • EIAV-Vektoren wurden in Anlehnung an standardmäßige durch Calciumphosphat vermittelte Kotransfektion des gag-pol-Expressionsplasmids pEV53A, des env-Expressionsplasmids pCI-VSV-G und entweder des Expressionsvektorplasmids pEC-lacZ oder pEC-puro in Kulturen von menschlichen 293-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) hergestellt. 48 Stunden nach der Transfektion wurde das Kulturmedium von den Zellen geerntet und auf EIAV-Vektorproduktion geprüft. Die Gentransfereffizienz des pEC-puro-Vektors wurde über die Fähigkeit von Reihenverdünnungen des Vektors, Resistenz gegenüber dem Arzneimittel Puromycin zu verleihen, gemessen. In diesem Assay bringt eine infizierte Zelle eine arzneimittelresistente Kolonie von Zellen hervor, die dann gezählt werden können. Menschliche 293-Zellen wurden als Zielzellen verwendet. Aus sechs unabhängigen Versuchen wurde der durchschnittliche Titer des EC-puro-Vektors als 2 ± 1 × 105 koloniebildende Einheiten (KBE) pro ml bestimmt.
  • Die Gentransfereffizienz des EC-lacZ-Vektors wurde mittels Färben infizierter CFT1-Epithelzellen der menschlichen Atemwege mit X-ga1 (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA), einem Analogon von Galaktose, bestimmt. In diesem Assay nehmen Zellen, die das beta-Galaktosidase-Gen exprimieren, eine blaue Farbe an und der Prozentanteil blauer Zellen wird durch Zählen bestimmt. Der Titer des Virus wird durch Multiplizieren des Anteils gefärbter Zellen durch die Anzahl anfänglich infizierter Zellen bestimmt. Auf diese Weise wurde der Titer des EC-lacZ-Virus als etwa 5 ± 1 × 104 infektiöse Einheiten (n = 5) pro ml bestimmt.
  • Es wurden mehrere Kontrollversuche durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Expression des puro- und des lacZ-Gens tatsächlich von viralen Komponenten vermittelt wurde. Im ersten Versuch wurde für sowohl den EC-puro- als auch den EC-lacZ-Vektor gezeigt, dass sowohl der pEV53- oder pEV53A-Vektor als auch der pCI-VSV-G-Vektor für den Gentransfer erforderlich waren. Das Ergebnis ist mit dem Gentransfer und der vom Virus (und nicht freier DNA) vermittelten Expression konsistent. In einem zweiten Kontrollversuch, bei dem der lacZ-Vektor verwendet wurde, wurden Zellen direkt nach einer zwei Stunden währenden Infektion mit XGa1 gefärbt und es wurden keine blauen Zellen gefunden. Das Ergebnis ist mit Zeitaspekten der Umkehrtranskription, der Integrierung und der Genexpression konsistent, von denen bekannt ist, dass sie bei anderen Retroviren mindestens etwa 10 Stunden zum Abschluss benötigen.
  • Beispiel 3
  • Gentransfer an sich nicht teilende Zellen
  • EIAV kann sich nicht teilende, terminal differenzierte Zellen, wie beispielsweise Makrophagen und Epithelzellen der Atemwege, infizieren. Um diese Eigenschaft mit der vorliegenden Erfindung zu prüfen, wurden CFT1-Epithelzellen der menschlichen Atemwege (großzügigerweise von J. R. Yankaskas von der University of North Carolina in Chapel Hill, USA, bereitgestellt) wurden im Zellzyklus mit Aphidicolin (Calbiochem-Novabiochem Corp., LaJolla, Kalifornien, USA) gehalten und dann mit dem pEC-lacZ-Vektor infiziert. Als Kontrolle wurden Zellen parallel dazu mit dem LZ-Vektor infiziert, einem lacZ enthaltenden Retrovirusvektor, der vom Maus-Leukämievirus (MuLV) abgeleitet ist. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Kulturen mit X-ga1 auf beta-Galaktosidase-Aktivität gefärbt. In den mit Aphidicolin behandelten Kulturen lag Aphidicolin sowohl während als auch nach der Infektion vor.
  • Felder mit mikroskopischen Aufnahmen der gefärbten Zellen sind in 6A gezeigt. Der LZ-Vektor infizierte nicht mit Aphidicolin behandelte Zellen effizient (linkes oberes Feld). Wenn Zellen jedoch mittels Aphidicolin-Behandlung im Zellzyklus gehalten wurden, nahm die Gentransfereffizienz merklich ab (rechtes oberes Feld). Es wurde durch Zählen der seltenen blaugefärbten Zellen geschätzt, dass die relative Effizienz des Gentransfers an sich teilende Zellen oder sich nicht teilende Zellen für den LZ-Vektor etwa 100 zu 1 betrug (wie in 6B gezeigt, linkes Säulendiagrammpaar). Die Ergebnisse waren mit in Versuchen in anderen Laboratorien erhaltenen Ergebnissen konsistent. Siehe z. B. D. G. Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10, 4329–4342 (1990); P. F. Lewis und M. Emerman, J. Virol. 68, 510–516 (1994). Zum Zeitpunkt der Infektion wurden parallele Kulturen 2 Stunden lang mit Bromdeoxyuridin (BrdU) gepulst, um die Wirksamkeit des Aphidicolin-Blocks zu prüfen, und auf BrdU-Einbindung in DNA analysiert, wie in 6C gezeigt. Es wurde festgestellt, dass Aphidicolin die Einbindung von BrdU in DNA merklich reduzierte.
  • Im Gegensatz zu den mit dem LZ-Vektor erhaltenen Ergebnissen hatte die Aphidicolin-Behandlung keine signifikante Auswirkung auf den Prozentanteil menschlicher CFT1-Zellen, die vom EC-lacZ-Vektor infiziert wurden (siehe Ergebnisse in 6A, untere Felder, und 6B, rechtes Säulendiagrammpaar). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass EIAV-Vektoren sich nicht teilende Zellen effizient infizieren können. Im in 7 gezeigten Versuch beispielsweise wurde die equine Fibroblastenhautzellline NBL-6 etwa 10-mal leichter (bei einer gegebenen Virusmenge) infiziert, wenn Zellen mit Aphidicolin behandelt wurden, im Vergleich zu Zellen, die nicht mit Aphidicolin behandelt wurden.
  • Beispiel 4
  • Ultrazentrifugation von VSV-G-pseudotypisierten EIAV-Vektoren
  • Ein Vorteil von VSV-G-pseudotypisierten Vektoren besteht darin, dass die durch VSV-G hervorgebrachte erhöhte Stabilität eine Konzentration der Infektiosität durch Pelletieren in einer Ultrazentrifuge ermöglicht (siehe z. B. J. C. Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8033–8037 (1993)). Es wurde bestimmt, dass die Infektiosität von VSV-G-pseudotypisierten EIAV-Vektoren auch durch Pelletieren unter Verwendung von Zentrifugationstechniken wiederhergestellt werden kann. In diesem Versuch wurden 720 ml EC-lacZ enthaltenden Überstands aus einer Kotransfektion von 293-Zellen (zum Exprimieren des Plasmids pEV53 stabil modifiziert) mit 2 Plasmiden (pEC-lacZ/pCI-VSV-G) konzentriert, indem der Virus in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge pelletiert wurde. Das Pellet wurde in 0,36 ml 1 × Hank's Salzlösung (Hank's Balanced Salt Solution, HBSS, Kat. Nr. 14175, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA) suspendiert, um eine 2000-fache Konzentration der Viruspartikel zu erzielen. Die Infektiosität wurde bestimmt (siehe 8 zwecks einer Dosis-Ansprechkurve der Infektiosität) und es wurde festgestellt, dass der Titer sich um das etwa 1200-fache von 5 × 103 auf 6 × 108 erhöhte. Folglich war die Infektiositätsausbeute etwa 60%. Dieses Ergebnis veranschaulicht, dass die EIAV-Vektoren durch Pelletieren auf hohe Titer konzentriert werden können.
  • Beispiel 5
  • Verpackungszelllinie
  • Zwecks stabiler Verpackungszellen wurde die humane embryonale Nierenzelllinie 293 unter Verwendung einer Calcium-Transfektionsstandardmethode mit pEV53 transfiziert. Die Zellen wurden für die Expression von Neomycin unter Verwendung von G418 (Geneticin) (Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland, USA) ausgewählt. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt, expandiert und auf Virusproduktion nach dem Transfizieren mit pEC-puro und pCI-VSV-G geprüft. Klonale Verpackungszelllinien, die die höchste Vektorproduktion aufzeigten, wurden entweder zur Langzeitlagerung gefroren oder zur Analyse der Persistenz der Verpackungsfunktion in Kultur gehalten. Es wurde festgestellt, dass die Verpackungsfunktion mindestens einen Monat lang stabil war, was darauf hinweist, dass die vorliegende Erfindung bei der Herstellung von stabilen, auf EIAV basierenden Verpackungszelllinien von Nutzen und erfolgreich ist.
  • Obwohl die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen dieser beschrieben worden ist, versteht sich, dass die Erfindung zu weiterer Modifizierung geeignet ist und diese Anwendung etwaige Variationen, Verwendungen oder Adaptierungen der Erfindung abdecken soll, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung beinhalten, die in den Bereich bekannter und üblicher Praxis in der Technik, auf die sich die Erfindung bezieht, fallen und auf die die im Schutzumfang der angehängten Ansprüche dargelegten wesentlichen Merkmale angewendet werden können.

Claims (36)

  1. Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor, das Folgendes umfasst: (a) einen ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) gag und EIAV pol kodiert, wobei der Vektor (i) mindestens einen Defekt in mindestens einem Gen, das ein EIAV-Strukturprotein kodiert, enthält, (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält und (iii) das offene Leseraster S2 enthält; und (b) einen zweiten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des EIAV-Genoms umfasst, wobei der Vektor (i) ein kompetentes Verpackungssignal enthält und (ii) eine multiple Klonierungsstelle enthält, in die ein heterologes Gen insertiert werden kann; und (c) einen dritten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz eines Virus umfasst, wobei der dritte Vektor (i) ein Virenhüllprotein exprimiert und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält.
  2. Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor, das Folgendes umfasst: (a) einen ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die Equine-Infectious-Anemia-Virus (EIAV) gag und EIAV pol kodiert, wobei der Vektor (i) mindestens einen Defekt in mindestens einem Gen, das ein EIAV-Strukturprotein kodiert, enthält, und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält; (b) einen zweiten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des EIAV-Genoms umfasst, wobei der Vektor (i) ein kompetentes Verpackungssignal enthält und (ii) eine multiple Klonierungsstelle enthält, in die ein heterologes Gen insertiert werden kann; und (iii) eine partielle EIAV-gag-Sequenz enthält, die die Basenpaare 993 bis 1570 vom Plasmid pEC-lacZ, einem 8749 bp langen, vom EIAV abgeleiteten Plasmid, das das E. coli-lacZ-Reportergen exprimiert und zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (angeordnet an den bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle EIAV-gag-Sequenz (bp 993–1570), die lacZ-Kodierungssequenz (bp 2297–5437), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 5752–6073), eine Phage-fl-Region (bp 6163–6618), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 7057–7917) und einen ColE1-Replikationsursprung (bp 8062–8736) enthält, oder vom Plasmid pEC-puro, einem 6099 bp langen, vom EIAV abgeleiteten Plasmid, das das Puromycinresistenz-Gen exprimiert und zwei CPN-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570), die Puromycinresistenz-Gen-Kodiersequenz (bp 2334–2933), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 3102–3423), eine Phage-fl-Region (bp 3513–3968), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 4407–5267) und einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 5412–6086) enthält, umfasst; und (c) einen dritten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz eines Virus umfasst, wobei der dritte Vektor (i) ein Virenhüllprotein exprimiert und (ii) ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält.
  3. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der zweite Vektor zur Expression mindestens eines EIAV-Strukturproteins unbrauchbar ist.
  4. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Vektor, der zweite Vektor und der dritte Vektor cDNA-Klone von zumindest Teil des EIAV-Genoms sind.
  5. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Vektor ein gag-pol-Expressionsvektor ist und der Vektor einen Defekt im env-Gen enthält.
  6. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Defekt im env-Gen um eine Deletionsmutation handelt.
  7. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Vektor und der zweite Vektor jeweils einen Defekt im env-Gen enthalten.
  8. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der dritte Vektor ein Hüllprotein kodiert, bei dem es sich nicht um ein EIAV-Hüllprotein handelt.
  9. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der dritte Vektor das G-Glykoprotein des vesikulären Stomatitisvirus exprimiert.
  10. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der zweite Vektor ein heterologes Gen enthält.
  11. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 10, wobei das heterologe Gen ein Antigenprotein oder Antigenpeptid kodiert.
  12. Plasmid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Plasmid- und cDNA-Klon mit 12.170 Basenpaaren, der an den Basenpaaren 209–1072 eine chimäre CMV/EIAV-Verstärker-Promotorregion, die oberhalb der EIAV-tat-Kodierregionen (bp 1124–1210 und 5886–6026), der gag-Kodierregion (bp 1216–2676), der pol-Kodierregion (bp 2433–5874) und der ORF-S2-Kodierregion (bp 6037–6234) angeordnet ist, umfasst und außerdem eine partielle env-Kodierregion (bp 6063–7733), rev-Kodierregionen (bp 6188–6288 und 7250–7654), ein BGH-Polyadenylationssignal (BGH = bovine growth hormone, Rinderwachstumshormon) (bp 7759–7973), eine Phage-fl-Region (bp 8037–8450), eine SV40-Early-Promotorregion und einen SV40-Replikationsursprung (bp 8514–8839), eine Neomycinresistenz-Kodierregion (bp 9685–9924), ein SV40-Polyadenylationssignal (bp 9685–9924), einen ColE1-Replikationsursprung (bp 10356–11029) und eine β-Lactamase-Kodierregion (Ampicillinresistenz-Kodierregion) (bp 11174–12035) umfasst; (ii) einem von (i) oben abgeleiteten Plasmid, wobei die Nukleotide 902 bis 1077 deletiert sind; (iii) einem 8749 bp langen Plasmid, das zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (angeordnet an den bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle EIAV-gag-Sequenz (bp 993–1570), die lacZ-Kodierungssequenz (bp 2297–5437), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 5752–6073), eine Phage-fl-Region (bp 6163–6618), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 7057–7917) und einen ColE1-Replikationsursprung (bp 8062–8736) enthält; (iv) einem 6099 bp langen Plasmid, das zwei CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregionen (bp 1–734 und 1609–2224), R-U5-Sequenzdomänen aus der langen Wiederholung an den Enden (long terminal repeat, LTR) des EIAV (bp 735–849), eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570), die Puromycinresistenz-Gen-Kodiersequenz (bp 2334–2933), eine EIAV-LTR-Sequenz (bp 3102–3423), eine Phage-fl-Region (bp 3513–3968), eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 4407–5267) und einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 5412–6086) enthält; und (v) einem Plasmid mit 5679 Basenpaaren, das die CMV-Immediate-Early-Verstärker-Promotorregion (bp 1–795), eine chimäre Intronregion (bp 857–989), die VSV-G-Kodierregion (bp 1088–2063), eine Phage-fl-Region (bp 3093–3548), ein SV40-Late-Polyadenylationssignal (bp 2782–3003), einen ColE1-DNA-Replikationsursprung (bp 4992–5666) und eine Ampicillinresistenz-Kodierregion (bp 3987–4847) umfasst.
  13. Vektorexpressionssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Vektor aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (i) und (ii) des Anspruchs 12 ausgewählt ist, der zweite Vektor aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (iii) und (iv) des Anspruchs 12 ausgewählt ist und es sich beim dritten Vektor um das Plasmid (v) des Anspruchs 12 handelt.
  14. „In-vitro"-Verfahren zum Herstellen eines für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikels, das das Transfizieren einer Zelle mit einem Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zelle eine sich nicht teilende Zelle ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der zweite Vektor ein heterologes Gen enthält.
  17. Infektiöses EIAV-Partikel, das aus dem Vektorexpressionssystem nach Anspruch 2 erhältlich ist und eine EIAV-Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Promotorsequenz und eine heterologe Gensequenz kodiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz beim Kodieren mindestens eines EIAV-Strukturproteins unbrauchbar ist, so dass das Viruspartikel für die Replikation unbrauchbar ist, und wobei das Viruspartikel eine partielle gag-Sequenz aus EIAV (bp 993–1570) enthält.
  18. Zelle, die ein für die Replikation unbrauchbares lentivirales Partikel enthält, wobei das lentivirale Partikel in Übereinstimmung mit dem Verfahren eines beliebigen der Ansprüche 14 bis 16, wenn diese von Anspruch 2 abhängig sind, hergestellt wird oder wobei das lentivirale Partikel ein infektiöses EIAV-Partikel nach Anspruch 17 ist.
  19. „In-vitro"-Verfahren zum Liefern eines heterologen Gens an eine Zielzelle, das das Transfizieren der Zielzelle mit einem Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zielzelle eine sich nicht teilende Zelle ist.
  21. Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
  22. „In-vitro"-Verfahren zum Herstellen eines Lentivirusstocks, das Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer gegenüber Lentivirus toleranten Produzentenzelle mit einem Expressionssystem für rekombinanten lentiviralen Vektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der zweite Vektor ein heterologes Gen umfasst; (b) Züchten der Produzentenzelle unter Zellkulturbedingungen, die zum Ermöglichen der Produktion von für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikeln in der Zelle ausreichen; und (c) Aufsammeln der für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikel aus der Produzentenzelle.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Produzentenzelle in einem Zellkulturmedium gezüchtet wird und wobei die für die Replikation unbrauchbaren Lentivirus-Partikel aus dem Medium aufgesammelt werden.
  24. „In-vitro"-Verfahren zum Liefern eines heterologen Gens an eine Zielzelle, das das Infizieren der Zielzelle mit einem Lentivirus-Partikel nach Anspruch 17 umfasst.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Zielzelle eine sich nicht teilende Zelle ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei es sich bei der Zielzelle um eine Epithelzelle der menschlichen Atemwege handelt.
  27. Lentivirus-Partikel nach Anspruch 17 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
  28. Pharmazeutische Formulierung, die ein für die Replikation unbrauchbares Lentivirus-Partikel nach Anspruch 17 in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger umfasst.
  29. „In-vitro"-Verfahren zum Fertigen einer Verpackungszelle, das das Transfizieren einer gegenüber Lentivirus toleranten Zelle mit einem wie in Anspruch 1 definierten ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des Equine-Infectious-Anemia-Virus-Genoms (EIAV-Genoms) umfasst, wobei der Vektor ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält, umfasst.
  30. „In-vitro"-Verfahren zum Fertigen einer Verpackungszelle, das das Transfizieren einer gegenüber Lentivirus toleranten Zelle mit einem ersten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz von zumindest Teil des Equine-Infectious-Anemia-Virus-Genoms (EIAV-Genoms) umfasst, wobei der Vektor ein unbrauchbares Verpackungssignal enthält, und weiterhin das Transfizieren der gegenüber Lentivirus toleranten Zelle mit einem wie in Anspruch 2 definierten zweiten Vektor umfasst.
  31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei der Vektor ein gag-pol-Expressionsvektor ist.
  32. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 29 oder 31, wobei der Vektor aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (i) und (ii) des Anspruchs 12 ausgewählt ist.
  33. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 29 bis 32, wobei die gegenüber Lentivirus tolerante Zelle eine menschliche 293-Zelle ist.
  34. Verpackungszelle, die eine gegenüber Lentivirus tolerante Wirtszelle umfasst, die einen wie in Anspruch 1 definierten ersten Vektor enthält, der eine EIAV-Nukleinsäuresequenz umfasst, die mindestens ein EIAV-Strukturprotein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Verpackungssignal derart unbrauchbar ist, dass die Zelle selbst mindestens ein EIAV-Strukturprotein produzieren kann, aber keinen replikationskompetenten infektiösen Virus produzieren kann.
  35. Verpackungszelle, die eine gegenüber Lentivirus tolerante Wirtszelle umfasst, die einen ersten Vektor enthält, der eine EIAV-Nukleinsäuresequenz umfasst, die mindestens ein EIAV-Strukturprotein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Verpackungssignal derart unbrauchbar ist, dass die Zelle selbst mindestens ein EIAV-Strukturprotein produzieren kann, aber keinen replikationskompetenten infektiösen Virus produzieren kann, wobei die Wirtszelle weiterhin einen wie in Anspruch 2 definierten zweiten Vektor umfasst.
  36. Verpackungszelle nach Anspruch 34 oder 35, die weiterhin einen wie in Anspruch 1 oder 2 definierten dritten Vektor umfasst.
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