DE60217958T2

DE60217958T2 - Pseudotypierung von hiv vektoren mit mokola virenhüllen

Info

Publication number: DE60217958T2
Application number: DE60217958T
Authority: DE
Inventors: Chamsy Sarkis; Yi He; Che Serguera; Noelle Dufour; Jacques Mallet
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2022-06-01
Also published as: CA2448947A1; US7749973B2; EP1392838A1; ATE353104T1; CA2448947C; WO2002097104A1; EP1392838B1; DE60217958D1; FR2825372B1; FR2825372A1; US20040120929A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Transfer von Genen in dem Nervensystem mit Hilfe von pseudotypisierten Viren und insbesondere mit Hilfe von pseudotypisierten unvollständigen (defekten) lentiviralen Vektoren mit einer Tollwut(Lyssa)-Virus-Hülle. Ziel der Erfindung ist es, eine Zellpopulation oder eine Zellsubpopulation des Nervensystems anzusteuern. In der vorliegenden Anmeldung werden Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben, die bestimmt sind für den selektiven Transfer von Ziel-Genen in speziellen Nervenzellen-Populationen, insbesondere in den Astrozyten, in vitro, ex vivo und in vivo, und darin wird auch ihre Verwendung bei der Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems und/oder des Augensystems beschrieben.
Der Transfer von Genen in dem Nervensystem hat viele Anwendungen auf dem experimentellen, therapeutischen Gebiet, dem Gebiet der Forschung und dgl. Dieser Transfer erlaubt somit die Durchführung von Studien auf dem Gebiet der Markierung, der Toxizität, der Qualität, des Aufbaus von pathologischen Modellen, der Restauration (Wiederherstellung) von Defiziten, der Expression von therapeutischen Produkten (wie z.B. Proteinen, RNAs und dgl.) und dgl.
In dem Stand der Technik sind bereits verschiedene Versuche zur Durchführung eines solchen Transfers unternommen worden, wie z.B. die Verwendung von viralen Vektoren (von Retrovirus, AAV (Adeno-assoziiertem Virus), Adenovirus und dgl.), die Injektion von Plasmiden, das Okulieren (Transplantieren) von Zellen, die Implantation von eingekapselten Zellen und dgl. Jeder dieser Versuche weist Vorteile und Nachteile auf in Bezug auf die Wirksamkeit, die Sicherheit, die industrielle Anwendbarkeit, die Selektivität, die Stabilität und dgl.
So ist die Verwendung von viralen Vektoren vorteilhaft in Bezug auf den Wirkungsgrad des Transfers, der an die natürlichen Eigenschaften einer Infektion mit diesen Viren gebunden ist. Unter den verwendeten Viren sind für den Anmelder insbesondere die Retroviren interessant.
In den ersten Stufen der Infektion führen die Retroviren ihre Nucleoproteinkörper in das Cytoplasma der Zielzelle ein. Darin entsteht dann die inverse Transkription des Virus-Genoms, während der Körper sich in einen Präintegrations-Komplex umwandelt. Der Komplex muss den Kern erreichen, um die Integration der Virus-DNA in die Chromosomen der Wirtszelle zu erlauben.
Zahlreiche retrovirale Vektoren, die von Onkoretroviren abgeleitet sind, ermöglichen die Integration eines Transgens in das Genom von Zielzellen, diese Vektoren sind jedoch nur in der Lage, während der Teilung in die Zellen einzudringen. Diese Einschränkung beschränkt ihre Verwendung auf den Gen-Transfer ex vivo oder auf Organe, deren Zellen mitotisch aktiv sind.
Eine Möglichkeit, dieses Hindernis zu umgehen, besteht darin, von Lentiviren abgeleitete Vektoren zu verwenden. Bei den Lentiviren handelt es sich um komplexe Retroviren, die sich in das Genom von nicht mitotisch aktiven Zellen integrieren können. Zu diesen Viren zählen insbesondere das Human-Immundefizit-Virus vom Typ 1 (HIV-1), das Human-Immundefizit-Virus vom Typ 2 (HIV-2), das Affen-Immundefizit-Virus (SIV), das Katzen-Immundefizit-Virus (FIV), das Rinder-Immundefizit-Virus (BIV), das VISNA-Maedi-Virus (VISNA), das Ziegen-Arthritis-Enzephalitis-Virus (CAEV) und das Pferde-Infektionsanämie-Virus (EIAV).
Was die Spezifität der Vektoren angeht, so lehrt der Stand der Technik, dass eine bevorzugte, wenn nicht gar spezifische Ansteuerung bestimmter Subpopulationen von Nervenzellen mit pseudotypisierten Vektoren möglich ist.
AURICCHIO et al. beschreiben in "IOVS", Band 42, Nr. 1, 15. März 2001, Seite S 125, die Verwendung von lentiviralen Vektoren, die mit der MOKOLA-Virus-Hülle pseudotypisiert worden sind, für den Transfer in Zellen des Netzhaut(Retina)-Pigment-Epithels nach einer subretinalen Injektion bei der Maus zum Zwecke der Netzhaut(Retina)-Gentherapie.
MOCHIZUKI et al. beschreiben im "JOURNAL OF VIROLOGY", Band 72, Nr. 11, November 1998, Seiten 8873–8883, die Herstellung von unvollständigen (defekten) lentiviralen Vektoren, die aus HIV-1 stammen, die mit den Hüllen-Proteinen G des Tollwut-Virus und des MOLOKA-Virus pseudotypisiert worden sind, in einer Zellkultur und die Durchführung einer Transduktion von HOS- und Ratten-2-Zellen. Die Möglichkeit der Transduktion von Astrozyten ist darin nicht erwähnt.
In WO 99/61 639 ist die Verwendung von unvollständigen (defekten) lentiviralen Vektoren, die von Humanimmundefizit-Viren vom Typ 1 (HIV-1) und vom Pferde-Infekt-Anämie-Virus (EIAV) abgeleitet sind, die mit dem Hüllenprotein G des Tollwut-Virus pseudotypisiert worden sind, zum Zwecke der Gentherapie beschrieben, und darin wird vermutet, dass der Tropismus der Pseudotypen identisch sein muss mit dem Tropismus, von dem die Hülle abgeleitet ist. Es wird darin angenommen, dass der Tropismus von Retroviren, die mit dem Tollwut-Protein pseudotypisiert worden sind, neuronal sein muss und darin sind die Astrozyten genannt, ohne dass jedoch genaue Angaben enthalten sind über die Zellen-Ansteuerung der Pseudotypen als Zielzellen der Vektoren.
K.A. MITROPHANOUS et al. beschreiben in "Gene therapy", Band 6, Nr. 11, 1999, Seiten 1808–1818, die Verwendung des unvollständigen (defekten) lentiviralen Vektors, der von dem Pferde-Infekt-Anämie-Virus (EIAV) abgeleitet ist, das mit dem Hüllenprotein G des Tollwutvirus pseudotypisiert worden ist, für den Gentransfer, ohne jedoch Angaben über die zelluläre Ansteuerung der Pseudotypen zu machen.
V. ZENNOU et al. zeigen in "NAT. BIOTECHNOL." 19(5), 2001, Seiten 446–450, dass die Insertion einer Flap-Sequenz in lentivirale Vektoren, die von HIV abgeleitet sind, die genetische Transduktion (Umwandlung) in den Nervenzellen ex vivo und in vivo in dem Ratten-Gehirn verbessert.
Es bleibt jedoch eine Nachfrage (Bedarf) in dem Stand der Technik für die Entwicklung von Vektoren für die Ansteuerung von Astrozyten, die eine eventuelle Therapie bestimmter Erkrankungen, wie z.B. der Parkinson-Krankheit, erlauben.
Die Nachteile, die mit der Verwendung der Retroviren verbunden sind, beruhen jedoch insbesondere auf dem Fehlen einer Spezifität, den potentiellen Risiken und den Herstellungsschwierigkeiten. Diese Nachteile haben bisher die Verwendung dieses Vektor-Typs für den Transfer von Genen in vivo eingeschränkt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Lösung dieses Problems und liefert neue Werkzeuge und lentivirale Vektoren, die mit MOKOLA-Virus-Hüllen pa seudotypisiert worden sind, für den selektiven Transfer von Genen in die Astrozyten des Zentralnervensystems in vivo, in vitro und ex vivo.
In der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein ähnlicher Vektor, der mit dem Protein G des Tollwut-Virus pseudotypisiert worden ist, beschrieben, der für den gleichen Zweck verwendet werden kann. Dieser Vektor ist lediglich zur Erläuterung der Erfindung beschrieben und ist nicht Teil der Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Pseudotypisierung von rekombinanten lentiviralen Vektoren durch eine MOKOLA-Virus-Hülle, welche die selektive Zellenansteuerung in vivo in den Glia-Zellen vom Astrozyten-Typ erlaubt. Diese pseudotypisierten viralen Vektoren sind verwendbar für den Transfer und die Expression in vivo von Nucleinsäure-Sequenzen im Innern von Astrozyten.
Generelle Struktur der Vektoren
Wie andere Retroviren besitzen die Lentiviren gag-, pol- und env-Gene, die von zwei LTR (langen terminalen Wiederholungs)-Sequenzen flankiert sind. Jedes dieser Gene codiert zahlreiche Proteine, die anfänglich in Form eines neuartigen Vorläufer-Peptids exprimiert werden. Das gag-Gen codiert die inneren Struktur-Proteine (Capside und Nucleocapside). Das pol-Gen codiert die inverse Transkriptase, die Integrase und die Protease. Das env-Gen codiert das virale Hüllen-Glycoprotein und enthält außerdem ein Element RRE (ein reverses Antwort-Element), das in cis verantwortlich ist für den Export der Virus-RNA aus dem Kern heraus. Die 5'-LTR- und 3'-LTR-Sequenzen dienen der Förderung der Transkription und der Polyadenylierung der Virus-RNA. Das LTR enthält jedoch alle anderen Sequenzen, die in cis reagieren, die erforderlich sind für die Virus-Replikation. Sequenzen, die für die inverse Transkription des Genoms (Bindungsstelle für den tRNA-Starter) und für die Einkapselung der Virus-RNA in Teilchen (Stelle Ψ) erforderlich sind, sind benachbart zu 5'-LTR angeordnet. Wenn die für die Einkapselung (oder das Verpacken) der Retrovirus-RNA in die infektiösen Virionen erforderlichen Sequenzen in dem Virus-Genom fehlen, wird die Genom-RNA nicht aktiv eingekapselt.
Die Herstellung von lentiviralen Vektoren für Gen-Transfer-Anwendungen ist beispielsweise beschrieben in den US-Patenten Nr. 5 665 577, 5 981 276 und 6 013 516, in dem Patent EP 0 386 882 oder in der Patentanmeldung WO 99/58 701.
Diese Vektoren enthalten ein unvollständiges (defektes) lentivirales Genom, d.h. in dem mindestens eines der Gene gag, pol und env inaktiviert oder deletiert (gelöscht) worden ist. Diese werden in einem Protein-Teilchen eingekapselt, das besteht aus lentiviralen Struktur-Proteinen und insbesondere in dem Hüllen-Glycoprotein.
Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen rekombinanten Lentiviren werden auf diese Weise genetisch modifiziert, sodass bestimmte Gene, die das native infektiöse Virus aufbauen, unterdrückt und ersetzt werden durch eine Nucleinsäure-Sequenz, die in die Ziel-Zellen eingeführt werden soll. Nach der Fusion des Virus mit der Zellmembran injiziert es seine Nucleinsäure in die Zelle, die nach der reversen Transkription in das Genom der Wirtszelle eingebaut werden kann. Das auf diese Weise transferierte genetische Material wird anschließend transkribiert und gegebenenfalls translatiert in Proteine im Innern der Wirtszelle.
Die erfindungsgemäßen Lentiviren können aus unterschiedlichen Serotypen, insbesondere aus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, VISNA, CAEV und EIAV hergestellt werden. Besonders bevorzugte Serotypen sind HIV, FIV und EIAV.
Pseudotypisierung
Wie weiter oben angegeben, beruht die Erfindung auf dem Nachweis von Eigenschaften zur Ansteuerung von pseudotypisierten Lentiviren mit speziellen Hüllen.
Der hier verwendete Ausdruck "Pseudotypisierung" bezeichnet ein rekombinantes Virus, das eine Hülle trägt, die von der Wild-Hülle verschieden ist, und das daher einen modifizierten Tropismus aufweist. Im Falle der pseudotypisierten Lentiviren handelt es sich um Lentiviren, die eine heterologe Hülle nicht-lentiviralen Ursprungs aufweisen, die beispielsweise aus einem anderen Virus oder aus einer Zelle stammt.
Die in dem Stand der Technik beschriebenen pseudotypisierten HIV-1-Vektoren enthalten das Hüllen-Glycoprotein des Virus der Stomatitis vesiculosa (VSV). Diese Hülle weist vorteilhafte Eigenschaften auf, wie z.B. eine Beständigkeit gegen Ultrazentrifugieren und einen sehr starken Tropismus. Im Gegensatz zu anderen Hüllen, wie z.B. denjenigen von klassischen Retroviren (von amphotropen und ekotropen Retroviren von MLV oder gp120 von HIV, aber auch anderen) ist das Glycoprotein von VSV nach der Ultrazentrifugierung nicht labil. Dies ermöglicht es, die Virus-Überstände einzuengen und hohe Infektionstiter zu erhalten. Diese Hülle ver leiht außerdem den Virionen einen sehr starken Tropismus, insbesondere in vitro, sie erlaubt die Infektion von sehr zahlreichen Zelltypen. Der Empfänger dieser Hülle wäre eine Phosphatidylserin-Einheit, die an der Oberfläche von zahlreichen unterschiedlichen Zellenarten vorliegt.
Eine spezielle Charakteristik, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben wird, besteht darin, dass man verwendet eine Hülle (das Glycoprotein) des Lyssa- bzw. Tollwut-Virus und insbesondere des Virus der Serengruppe des Tollwut-Virus: Rabies (PV) (C. Tuffereau, J. Benejean, D. Blondel, B. Kieffer, A. Flamand, "Lowaffinity nerve-growth factor receptor (P75NTR) can serve as a receptor for rabies virus", abgedruckt in "EMBO J.", 15. Dezember 1998; 17 (24): 7250–7259); Duvenhague (DUV), European bat Typ 1 (EB-1 ), European bat Typ 2 (EB-2), Lagos bat (LB), Mokola (MOK) (H. Bourhy, B. Kissi, N. Tordo, "Molecular diversity of the Lyssavirus genus.", abgedruckt in "Virology", Mai 1993; 194 (1): 70–81); (H. Badrane, C. Bahloul, P. Perrin, N. Tordo "Evidence of two Lyssavirus phylogroups with distinct pathogenicity and immunogenicity", abgedruckt in "J. Virol.", April 2001; 75 (7): 3268–3276), Kotonkan (KOT), Obodhiang (OBD) und Rochambeau (RBU) (A. J. Della-Porta, F. Brown, "The physico-chemical characterization of bovine ephemeral fever virus as a member of the family Rhabdoviridae", abgedruckt in "J. Gen. Virol.", Juli 1979; 44 (1): 99–112) oder jede Chimären-Zusammensetzung dieser Hüllen.
Im Unterschied zu VSV zeigt die vorliegende Erfindung, dass die Tollwut- und Mokola-Viren bei Tieren einen Tropismus aufweisen, der sehr spezifisch für das Nervensystem ist. Das Eintrittssystem dieser Viren hängt außerdem von spezifischen Rezeptoren ab. Für die Tollwut wurden mehrere Kandidaten als Rezeptoren vorgeschlagen: die Rezeptoren mit Acetylcholin (insbesondere Nicotin), die Moleküle NCAM (140 und 180 kDa) sowie die Rezeptoren mit niedriger Affinität für NGF (p75).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Anmeldung die Verwendung von Lentiviren, beispielsweise vom HIV-Typ, die mit einer Hülle vom Typ PV (Tollwut-Virus) oder vom Typ MOK (Mokola-Virus) pseudotypisiert worden sind.
Die vorliegende Anmeldung zeigt nämlich, dass dieser Hüllen-Typ eine Zellen-Ansteuerung, insbesondere die Ansteuerung der Glia-Zellen vom Astrozyten-Typ erlaubt.
Die Pseudotypen MOK und PV können außerdem wie VSV ultrazentrifugiert werden und erlauben somit die Konzentration der Flüssigkeitsüberstände. Sie erlauben außerdem auf überraschende Weise die Erzielung eines eingeschränkten Tropismus gegenüber VSV und somit die zelluläre Ansteuerung in vivo in der SNC. Es ist auch möglich, stabile Klone herzustellen ohne Induktionssystem für die Glycoproteine von PV und MOK. Diese stabilen Klone sind verwendbar für die Entwicklung von stabilen Einkapselungs-Linien, welche die Herstellung von lentiviralen Vektoren erlauben, die mit einer dieser beiden Hüllen pseudotypisiert worden sind.
Die vorliegende Erfindung beschreibt somit die Pseudotypisierung von lentiviralen Vektoren durch Lyssa-Virus-Hüllen (insbesondere PV und/oder MOK) für die spezifische Transduktion der Astrozyten.
Sie beschreibt auch die Verwendung dieser pseudotypisierten lentiviralen Vektoren für die Herstellung einer Zusammensetzung, die für den Transfer von Genen in die Astrozyten in vivo bestimmt ist. Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem verwendeten unvollständigen (defekten) Lentivirus um das Human-Immundefizit-Virus. Bei einer anderen besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung enthält das verwendete Lentivirus ein oder mehrere virale Proteine, die unter TAT und REV selektioniert worden sind.
Herstellung von rekombinanten pseudotypisierten lentiviralen Vektoren
Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen lentiviralen Vektoren können auf unterschiedliche Weise hergestellt werden durch vorübergehende Transfektion(en) in stabile Linien und/oder mittels eines Helfer-Virus.
Das in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Verfahren umfasst gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform die Kombination von mindestens drei Vektoren für die Herstellung eines rekombinanten Virions oder eines rekombinanten Retrovirus.
Ein erster Vektor liefert den lentiviralen Vektor, der virale Sequenzen aufweist, die in cis wirken und erforderlich sind für einen guten Ablauf des Virus-Zyklus. Diese Sequenzen enthalten eine oder mehrere LTRs des Lentivirus, eine Verpackungs-Psi-Sequenz lentiviralen Ursprungs, inverse Transkriptions-Signale, einen Promotor und/oder einen Verstärker und/oder Polyadenylierungs-Sequenzen. Der erste Vektor enthält außerdem eine Klonierungs-Stelle für eine heterologe Nucleinsäure-Sequenz, die in eine nicht-proliferative Zelle transferiert werden soll. In diesem Vek tor können die LTR außerdem modifiziert werden zur Verbesserung der Expression des Transgens oder der Sicherheit der Vektors. Auf diese Weise ist es möglich, beispielsweise die 3'-LTR-Sequenz durch Suppression der U3-Region zu modifizieren (WO 99/31 251). Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Vektor-Plasmid, das ein rekombinantes lentivirales Genom mit der Sequenz LTR-psi-RRE-flap-Promotor-tansgen-LTR enthält, welche die Expression der Vektor-RNA erlaubt, die in die Virionen eingekapselt wird. Das Transgen kann beispielsweise die folgenden trophischen Faktoren codieren: CNTF, NGF, NT3, NT4, FGF, PDGF und dgl., oder es kann Enzyme codieren, die eine unvollständige Stoffwechselaktivität restaurieren (wieder herstellen), wie z.B.: TH, AADC, GTPC, B-Glucuronidase und dgl. Das Transgen steht in der Regel unter der Kontrolle eines Transkriptions-Promotors, der gegenüber dem Transgen homolog oder heterolog sein kann, wie z.B. ein viraler, zellulärer, synthetischer Promotor und dgl. Der verwendete Promotor kann konstitutiv oder reguliert (induziert) sein, er kann schwach oder stark sein, er kann spezifisch für das Gewebe oder ubiquitär sein und dgl. In der Regel verwendet man einen viralen Promotor, wie z.B. CMV, LTR, TK und dgl. oder einen zellulären Promotor, wie z.B. PGK, Rho und dgl., Promotoren, die für Gewebe spezifisch sind, können auch dann verwendet werden, wenn die erfindungsgemäßen Vektoren bereits einen selektiven Expressionscharakter verleihen.
Ein zweiter Vektor der Trans-Komplementierung liefert eine Nucleinsäure, die ein lentivirales gag-Protein und ein lentivirales pol-Protein codiert. Diese beiden Proteine sind abgeleitet von einem Lentivirus und sie stammen vorzugsweise aus VIH. Der zweite Vektor ist frei von einer Einkapselungs-Sequenz, der Sequenz, die für eine Hülle codiert, und er ist zweckmäßig auch frei von lentiviralen LTRs. Deshalb werden die Sequenzen, welche die gag- und pol-Proteine codieren, zweckmäßig unter die Kontrolle eines heterologen Promotors gestellt, beispielsweise eines viralen, zellulären Promotors und dgl., der konstitutiv oder reguliert (induziert), schwach oder stark sein kann. Es handelt sich dabei vorzugsweise um ein transkomplementierendes Plasmid, das eine Sequenz CMV-Δpsi-gag-pol-Δenv-PolyA enthält. Dieses Plasmid erlaubt die Expression aller Proteine, die für die Bildung von leeren Virionen erforderlich sind, mit Ausnahme der Hüllen-Glycoproteine. Selbstverständlich können die gag- und pol-Gene auch von unterschiedlichen Plasmiden getragen werden.
Ein dritter Vektor liefert eine Nucleinsäure, welche die Herstellung des ausgewählten Hüllen Glycoproteins (env) erlaubt.
Diese Hülle kann ausgewählt werden unter den oben genannten Hüllen, sie kann insbesondere sein eine Rabdovirus-Hülle, besonders bevorzugt eine Lyssa-Virus-Hülle und ganz besonders bevorzugt eine MOK- oder PV-Hülle. Dieser Vektor ist frei von einer Einkapselungs-Sequenz, von Sequenzen, die gag oder pol codieren und zweckmäßig auch frei von lentiviralen LTRs.
Zweckmäßig enthalten die drei verwendeten Vektoren keine homologe Sequenz, die ausreicht, um eine Rekombination zu ermöglichen. Die codierenden Nucleinsäuren gag, pol und env können zweckmäßig cDNA sein, die nach konventionellen Verfahren herstellt sind aus Sequenzen von Virusgenen, die im Stand der Technik verfügbar sind, und auf der Basis der Angaben, wie sie in den weiter unten folgenden Beispielen enthalten sind.
Für die Herstellung von unvollständigen (defekten) rekombinanten Viren für die Replikation werden die weiter oben beschriebenen Vektoren in kompetente Zellen eingeführt und die darin gebildeten Viren werden geerntet. Die verwendeten Zellen können irgendeine kompetente Zelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle, beispielsweise eine nicht-pathogene tierische oder menschliche Zelle, sein. Beispielsweise können genannt werden die Zellen 293, Embryonen-Zellen, Fibroblaste, Muskelzellen und dgl.
In der vorliegenden Anmeldung wird somit ein Verfahren zur Herstellung eines pseudotypisierten defekten rekombinanten Lentivirus beschrieben, das die Transfektion einer Population von kompetenten Zellen mit einer Kombination von Vektoren, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, und die Gewinnung der gebildeten Viren umfasst.
In der vorliegenden Anmeldung wird auf diese Weise ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Lentiviren beschrieben, die in der Lage sind, die Expression in vivo eines Transgens in Human-Astrozyten zu ermöglichen, das die Transfektion von kompetenten Zellen umfasst:

a) durch ein Vektor-Plasmid, das eine Sequenz LTR-psi-RRE-flap-Promotortransgen-LTR(ΔU3),
b) durch ein trans-komplementierendes Plasmid, das eine Sequenz CMV-Δpsi-gag-pol-Δenv-PolyA umfasst, und
c) durch ein Hüllen-Plasmid, das eine Sequenz CMV-env-PolyA umfasst, wobei die Hülle eine Hülle des Mokola-Virus oder des Tollwut-Virus ist.

Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Lentiviren können auch aus einer Einkapselungs-Zelllinie hergestellt werden, die ein oder mehrere Proteine gag, pol und env bildet.
Bei einer speziellen Ausführungsform verwendet man eine Zelllinie, die das Protein env auf stabile Weise exprimiert (d.h. ausgehend von einer in ihrem Genom integrierten Sequenz). Im Gegensatz zu den lentiviralen Hüllen weisen nämlich die MOK- oder PV-Hüllen beispielsweise keine signifikante Toxizität für die Zellen auf und können auf stabile und konstitutive (oder regulierte bzw. induzierte) Weise in einer Zelllinie exprimiert werden.
Daher umfasst das in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Verfahren bei einer speziellen Ausführungsform die Transfektion von nur zwei Vektoren (dem lentiviralen Vektor und dem Transkomplementations-Vektor) in eine Zelllinie, welche das ausgewählte Protein env exprimiert. Die für die Herstellung einer Zelllinie verwendeten Zellen sind beispielsweise die oben genannten kompetenten Zellen. Eine solche Zelllinie ist auch in der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Bei einer anderen Ausführungsform exprimiert die verwendete Zelllinie auch die lentiviralen Proteine gag und pol. In diesem Fall umfasst das Verfahren einfach die Transfektion des lentiviralen Vektors.
Diesbezüglich ist es möglich, eine lentivirale Einkapselungs-Zelle zu verwenden, wie sie in der Patentanmeldung WO 99/58 701 beschrieben ist, in der die Gene gag und pol von HIV auf getrennten Konstrukten vorliegen.
Die gebildeten Lentiviren sind vorzugsweise abgeleitet von dem Virus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, VISNA, CAEV oder EIAV.
Die vorliegende Anmeldung zeigt auf überraschende Weise, dass die so erhaltenen pseudotypisierten lentiviralen Vektoren in der Lage sind, bestimmte Subpopulationen von Nervenzellen, insbesondere die Astrozyten, in vivo bevorzugt zu infizieren. Unter dem Ausdruck "bevorzugt" ist zu verstehen, dass die erfindungsgemäßen Viren die im Wesentlichen die Astrozyten ansteuern, aber dennoch in der Lage sind, auch andere Zelltypen, wie z.B. andere Glia-Zellen oder Nervenzellen zu transfektieren. Andere (weitere) Subpopulationen von Nervenzellen, die durch die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Vektoren angesteuert werden können, sind beispielsweise Mikroglia-Zellen, Endothel-Zellen oder Oligodendrozyten. Bei einer speziellen Anwendung, die den Transfer von Genen im Auge betrifft, erlauben die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Vektoren, die mit der Mokola-Hülle pseudotypisiert worden sind, einen selektiven Transfer in die Pigment-Epithel-Zellen.
Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Lentiviren können auch für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die bestimmt ist für die Behandlung einer Erkrankung des Nervensystems oder einer neurodegenerativen Erkrankung und insbesondere der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, der Chorea Huntington-Krankheit, der SLA oder SMA, von Augen-Degenerationserscheinungen oder auch Traumata des Zentralnervensystems (Hirnschlag, Epilepsie, Verletzungen des Rückenmarks und dgl.), von Erkrankungen, die das Zentralnervensystem angreifen (MPS und dgl.), Glioblastomen oder Astrozytomen oder von Stoffwechsel-Erkrankungen, die das Nervensystem angreifen (Mucopolysacharidosen, Charcot-Marie-Krankheit und dgl.).
Ein anderer Gegenstand, der in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, betrifft die kombinierte Verwendung von mehreren Lentiviren, die mit einer anderen Hülle von Lyssaviren pseudotypisiert worden sind, um eine Nucleinsäure in die Zellen des Nervensystems zu transferieren und darin zu exprimieren. Die kombinierte Verwendung kann umfassen die sequentielle Verabreichung von unterschiedlichen Viren oder eine gleichzeitige Verabreichung.
Wie oben angegeben, können die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Vektoren den Transport und die Expression von mehreren Nucleinsäuren in den Nervenzellen, wie z.B. von katalytischen Nucleinsäuren (Antisense, Ribozomen und dgl.), und Nucleinsäuren erlauben, die Wachstumsfaktoren, trophische Faktoren, Cytokine, Faktoren zur Stimulierung von Kolonien, Antikrebs-Mittel, Toxine, Enzyme, Neurotransmitter oder ihre Vorläufer und dgl. codieren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die den in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Lentivirus enthält, kann auf intrazerebralem oder systemischem Wege einem Patienten verabreicht werden unter Berücksichtigung des speziellen Tropismus der pseudotypisierten lentiviralen Vektoren, insbesondere für die Astrozyten. Es kann sich somit handeln um eine Verabreichung auf intrazerebralem, intrastriatalem, intravenösem, intraarteriellem Wege, in den Hohlraum unter der Netzhaut (Retina) und dgl. Bevorzugte Injektionsarten sind die intrazerebrale Injektion und die Injektion in den Hohlraum unter der Netzhaut (Retina). Für die Verwendung für den Transfer von Genen in dem Auge bevorzugt man insbesondere Viren, die mit einer Mokola-Hülle pseudotypisiert worden sind.
Die Zusammensetzung wird zweckmäßig in einer Menge von 10² bis 10⁹ Teilchen pro Dosis, in der Regel von 10³ bis 10⁸ Teilchen pro Dosis, verabreicht. Die Lentiviren können in jeder geeigneten Lösung, beispielsweise in einer Kochsalzlösung, in einer isotonischen, gepufferten Kochsalzlösung konditioniert werden, die gegebenenfalls assoziiert ist mit Stabilisierungsmitteln, wie z.B. isogenem Albumin oder irgendeinem anderen stabilisierenden Protein, Glycerin und dgl., sowie mit Adjuvans-Faktoren, wie Polypren oder DEAE-Dextran und dgl.
Weitere Vorteile der Erfindung werden in den folgenden Beispielen im Detail erläutert, die jedoch lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen.
Beschreibung der Zeichnungen
1 gibt die mittlere Intensität von GFP in den transduzierten Zellen an;
2 gibt den Prozentsatz der transduzierten Zellen an;
3 zeigt den Ablauf des Versuchs und die Immunantwort (CD4/CD8);
4: zeigt eine Angiographie der Augäpfel, in die unter die Netzhaut (Retina) ein Vektor injiziert worden ist, der von HIV-1 abgeleitet ist und das GFP unter der Kontrolle des Promotors CMV exprimiert. Auf der linken Seite ist der durch das Protein VSV-G pseudotypisierte Vektor angegeben und auf der rechten Seite ist der durch das Mokola-G-Protein pseudotypisierte Vektor angegeben;
5 zeigt das Pigmentepithel der Augäpfel, in die unter die Netzhaut (Retina) ein Vektor injiziert worden ist, der von HIV-1 abgeleitet ist und der GFP unter der Kontrolle des Promotors CMV exprimiert. (A) zeigt die Gesamtheit der transduzierten Zone, (B) zeigt den durch das Protein VSV-G pseudotypisierten Vektor; (C) zeigt den durch das Mokola-G-Protein pseudotypisierten Vektor. In der transduzierten Zone exprimieren 100 % der Zellen das GFP. Das hexagonale und zweikernige Aussehen der Zellen erlaubt die Bestätigung, dass es sich um das Pigment-Epithel handelt;
6 zeigt die Anti-GFP-Immunhistochemie auf feinen Netzhaut (Retina)-Schnitten. Mit dem durch VSV-G pseudotypisierten Vektor (A) werden markierte Zellen in der Photorezeptor-Schicht (Pfeile) nachgewiesen. Mit dem durch Mokola-G pseudotypisierten Vektor (B) werden nur die Pigment-Epithel-Zellen (ep) markiert.
Beispiele
1. Herstellung von pseudotypisierten Viren (VSV, MOK und PV)
Zur Herstellung der pseudotypisierten Viren wurden die Sequenz-Vektoren LTR-Ψ-RRE-flap-CMV-GFP-LTR oder LTR-Ψ-RRE-flap-PGK-GFP-LTR(ΔU3), das Transkomplementierungs-Plasmid Δ8,71 und die Hüllen-Plasmide CMV-VSV-G, CMV-MOK-G oder CMV-Rab-G verwendet.
Am Tage 0 wurden Behälter von 160 cm², die mit Zellen 293T mit einer geringen Konfluenz (etwa 50 %) gefüllt wurden, hergestellt.
Am Tage 1 wurde das Kulturmedium durch frisches Medium ersetzt und die Transfektion wurde mit den drei Plasmiden durchgeführt.
Am Tage 2 wurde das Medium erneut ausgetauscht.
Am Tage 3 wurde die überstehende Flüssigkeit gesammelt, dann mit der DNAse 15 min lang bei 37 °C behandelt. Anschließend wurde 5 min lang mit 3000 UpM zentrifugiert, um die Zellbruchstücke zu eliminieren und dann wurde 1 1/2 h lang bei 4 °C ultrazentrifugiert (Rotor SW28), dann in PBS1X resuspendiert. Die Rückstände wurden anschließend durch kurzes Zentrifugieren für 30 s mit 8000 UpM eliminiert. Die auf diese Weise gereinigte überstehende Flüssigkeit wurde anschließend portioniert und bei –80 °C gelagert.
Die Titration der Lagerbestände erfolgte durch ELISA-Bestimmung des Capsid-Proteins (p24). Sie ist ausgedrückt in Nanogramm Moleküle p24 pro Mikroliter überstehender Flüssigkeit.

Lagerbestände #1: CMV-GFP VSV: 78 ng p24/μl MOK: 19 ng p24/μl PV: 29 ng p24/μl
Lagerbestände #2: CMV-GFP VSV: 89 ng p24/μl MOK: 30 ng p24/μl PV: 64 ng p24/μl
Lagerbestände #3: PGK-GFP VSV: 30 ng p24/μl MOK: 56 ngp24/μl PV: 21 ng p24/μl

2. Transduktion von Zelllinien in vitro durch pseudotypisierte Viren
Die Transduktion von Nervenzellen wurde getestet anhand von sieben unterschiedlichen Zelllinien mit Vektoren, die eine CMV-GFP-Kassette enthielten. Die getesteten Zelllinien waren die folgenden:

– CHP212 und SKNSH: Human-Neuroblastome
– PC12: Ratten-Phäochromocytom
– Cath. a und Cath. b: catecholaminergische Maus-Zentral-Zelllinien, die durch SV40 transformiert worden waren
– Path. 1 und Path. 2: catecholaminergische Maus-Peripher-Zelllinien, die durch SV40 transformiert worden waren.

Eine Gesamtmenge von 100 000 Zellen wurde in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen eingeführt. Am folgenden Morgen wurden die Zellen mit dem Kulturmedium infiziert, das 20 ng Vektor-p24 in 200 μl Endlösung enthielt. Die Zellen wurden mit dem Virus die gesamte Nacht inkubiert. Am folgenden Morgen wurde das Medium gewechselt und durch ein frisches, Virus-freies Medium ersetzt. Die Zellen wurden voneinander getrennt und fixiert zur Durchführung einer Analyse in einem Durchfluss-Zytometer (FACS) 48 h nach der Entfernung der Viren.
Die Zellen SKNSH, CHP212 und PC12 wurden mit den Lagerbeständen (Vorratslösungen) #1 infiziert. Die Zellen Cath und Path wurden mit den Lagerbeständen (Vorratslösungen) #2 infiziert.
Die 1A, 1B, 1C und 2A, 2B, 2C zeigen eine sehr wirksame Transduktion durch die Pseudotypen VSV bei allen getesteten Zelllinien (in %). Die Intensitäts-Schwankungen zeigen die relative Aktivität des Promotors CMV in den getesteten verschiedenen Zelllinien (GFP X-Mittelwert).
Dagegen waren die Pseudotypen PV lediglich wirksam bei den Human-Zelllinien CHP212 und SKNSH (mehr als 10 %).
Die Pseudotypen MOK zeigen die Wirksamkeit bei den Zelllinien CHP212, SKSNH, Cath. b, Path. 1 und Path. 2.
Es ist somit klar, dass die Pseudotypen MOK und PV eine Wirts-Beschränkung aufwiesen, die bei VSV in den getesteten Zelllinien nicht vorhanden war.
3. In vivo-Transduktion in dem Gehirn einer C57B16-Maus
Für jeden Pseudotyp wurde 3 Mäusen C57B16 (8 Wochen alt) eine Injektion in das Striatum verabreicht. Eine Dosis von 20 ng p24 (Vektoren CMV-GFP) wurde in ein Volumen von 2 μl injiziert. Die verwendeten stereotaktischen Koordinaten im Verhältnis zu Lambda sind: A: +4,6; L: +2,2; V1: –3,5 (1 μl) und V2: –3,3 (1 μl). Die Geschwindigkeit der Injektion betrug 0,25 μl/min.
Eine Woche nach der Injektion wurden die Mäuse getötet. Die Gehirne von zwei Mäusen wurden perfundiert (PFA 4 %) und das dritte Gehirn wurde ohne Perfusion tiefgefroren. Die Gehirne wurden in Cryostaten in der Injektionszone (Dicke 20 μm) geschnitten.
Die Expression von GFP kann unter dem Fluoreszenzmikroskop direkt sichtbar gemacht werden. Der Phänotyp der transduzierten Zellen wird durch Immunmarkierung der Schnitte mit einem anti-GFAP-Antikörper für die Astrozyten, durch einen anti-NeuN-Antikörper für die Neuronen (Nenvenzellen) und durch einen anti-CNPase-Antikörper für die Oligodendrozyten bestimmt.
Die Analyse der Coexpression von GFP und der verwendeten verschiedenen Marker wurde mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Pseudotypen VSV unterschiedliche Zellpopulationen transduzieren, darunter die Astrozyten und die Neuronen (Nervenzellen). Im Falle der pseudotypisierten MOK-Lentiviren wurden dagegen Astrozyten spezifisch transduziert. Es scheinen sehr seltene Neuronen transduziert zu werden. Für die Pseudotypen PV wurden nur die Astrozyten transduziert.
Andererseits war die Menge der das GFP exprimierenden Zellen sehr groß bei den Pseudotypen VSV und MOK (mit vergleichbaren Größenordnungen), selbst wenn die Anzahl der transduzierten Zellen mit den Pseudotypen PV geringer zu sein scheint.
Um diese Ergebnisse der bevorzugten Ansteuerung der Astrozyten mit den unter Verwendung von MOK und PV hergestellten Pseudotypen zu bestätigen, wur den unter ähnlichen Bedingungen Injektionen mit den Vektoren PGK-GFP durchgeführt. Bei diesem Versuch wurde eine Dosis von 60 ng/p24 der Pseudotypen VSV und MOK in die Gehirne von C57B16-Mäusen injiziert.
Die Versuche einer doppelten Markierung mit einem Neuronen-Marker (NeuN) und einem Astrozyten-Marker (GFAP) zeigen einen neuartigen astrozytären Tropismus für die Pseudotypen MOK, während zahlreiche Neuronen mit den Pseudotypen VSV transduziert wurden, wodurch die Spezifität der Infektion der Astrozyten mit MOK bestätigt wurde.
In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der Phänotypisierung zusammengefasst.
4. Untersuchung der Immunreaktion (mehrfache Injektionen)
Dieser Versuch wurde durchgeführt mit dem Ziel, die Möglichkeit der Durchführung von wiederholten Injektionen bei verschiedenen Pseudotypen zu untersuchen. Mit dem gleichen Glycoprotein pseudotypisierte Vektoren wurden 2- bis 3-mal in das Gehirn von C57B16-Mäusen injiziert. Die Kombination von wiederholten Injektionen mit zwei unterschiedlichen Pseudotypen wurde auch durchgeführt, um die Überkreuz-Immun-Reaktionen zwischen den verschiedenen Pseudotypen zu testen.
Die Expression von GFP wurde durch Fluoreszenz direkt sichtbar gemacht. In allen Fällen war es möglich, GFP+ Zellen an der Stelle der letzten Injektion zu markieren, ein Anzeichen für eine geringe Immunreaktion.
Eine detailliertere Untersuchung der CTL-Reaktion (der Zellreaktion der Lymphozyten T) wurde mit Immunmarkern durchgeführt, die gegen die Antigene CD4 und CD8 gerichtet waren.
Wenn nur eine einzige Injektion durchgeführt wurde, war die CTL-Reaktion (CD4 und CD8) sehr gering, d.h. praktisch Null im Bereich der Kontrolltiere, denen nur eine Kochsalzlösung verabreicht worden war.
Wenn zwei aufeinanderfolgende Injektionen durchgeführt wurden, war die beobachtete Reaktion sehr mäßig (CD4 und CD8 waren höher als PBS), jedoch sehr viel niedriger als diejenige, die durch eine einfache Injektion beispielsweise des Adenovirus hervorgerufen wurde.
Wenn drei aufeinanderfolgende Injektionen durchgeführt wurden, waren die CD4- und CD8-Reaktionen verhältnismäßig stark. Die Vektoren wurden jedoch nicht vollständig neutralisiert, da man eine Expression im Bereich der Stelle der dritten Injektion fand.
Die CD4/CD8 (Lymphozyten T)-Reaktion kann hervorgerufen werden entweder durch den Vektor (insbesondere das Hüllen-Glycoprotein) oder durch die Expression des Transgens GFP.
Diese Versuche bestätigen das Fehlen einer Immunreaktion in vivo nach mehreren Injektionen und zeigen die Möglichkeit der Durchführung von derartigen wiederholten Injektionen in therapeutischen oder experimentellen Verfahren.
5. Tropismus der lentiviralen Vektoren, die von HIV-1 abgeleitet und durch VSV- oder Mokola-G pseudotypisiert worden sind, für die Netzhaut-Zellen
Die lentiviralen Vektoren, die von HIV-1 abgeleitet und durch VSV- oder Moko-Ia-G pseudotypisiert worden sind, wurden in den Hohlraum unter der Netzhaut einer ausgewachsenen Ratte (Stamm rdy) injiziert. Für jeden Pseudotyp wurden unterschiedliche Promotoren getestet, welche die Expression des Übertragungs-Gens Green Fluorescent Protein (GFP) erlauben: der Promotor CMV (ein ubiquitärer Virus-Promotor), der Promotor PGK (ein ubiquitärer Promotor des Gens des Kinase-Phosphoglycerats der Maus) und der Promotor Rho (ein Fragment von 2,2 Kilobasen des Promotors des Rhodopsin-Gens, ein Protein, das spezifisch in den Netzhaut-Zellen exprimiert wird). Eine Woche und drei Wochen nach den Injektionen wurde das GFP an einem lebenden Tier durch Angiographie nachgewiesen. Nach 4 Wochen wurde das Tier getötet und das GFP wurde auf zwei unterschiedliche Arten sichtbar gemacht: direkt in den Pigment-Epithelen der flach ausgelegten Netzhaut oder durch Immunhistochemie bei feinen Netzhaut-Schnitten. Diese Versuche erlaubten die Erzielung der folgenden Ergebnisse:

1. die beiden Pseudotypen erlaubten eine starke Expression von GFP im Bereich der Netzhaut, die mit dem Promotor CMV in vivo durch Angiographie nachweisbar war (4);
2. die beiden Pseudotypen erlaubten die Transduktion der Pigment-Epithel-Zellen mit einem hohen Wirkungsgrad. Etwa ein Viertel bis ein Drittel der Epithel-Oberfläche exprimierte das GFP. In der Transduktions-Zone exprimierten 100 % der Zellen das GFP. Dies ist bei den flach ausgelegten Pigment-Epithelzellen klar erkennbar (5);
3. durch Immunhistochemie war die Expression von GFP nachweisbar im Be reich der Photorezeptoren nach der Injektion unter die Netzhaut der durch das Protein VSV-G pseudotypisierten Vektoren (6a). Diese Expression war stärker mit dem spezifischen Promotor Rho als mit den ubiquitären Promotoren CMV und PGK. Dagegen wurde nach der Injektion der mit dem Protein Mokola-G pseudotypisierten Vektoren keine Expression von GFP im Bereich der Schicht der Photorezeptoren nachgewiesen, und dies unabhängig von dem für die Kontrolle der Expression von GFP verwendeten Promotor (6b).

Diese Versuche zeigen, dass die lentiviralen Vektoren, die von HIV-1 abgeleitet und durch die Mokola G-Hülle pseudotypisiert sind, eine spezifische Transduktion der Pigment-Epithelzellen der Netzhaut als Folge einer Injektion unter die Netzhaut erlauben.

Claims

Verwendung eines durch eine Mokola-Virushülle pseudotypisierten unvollständigen (defekten) Lentivirus für die Herstellung einer Zusammensetzung, die bestimmt ist für die selektive in vivo-Genübertragung in Astrozyten des Zentralnervensystems eines Individuums.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen eine katalytische Nucleinsäure oder eine Nucleinsäure ist, die einen Wachstumsfaktor, einen trophischen Faktor, ein Cytokin, einen Kolonien-Stimulierungs-Faktor, ein Antikrebsmittel, ein Toxin, ein Enzym oder einen Neurotransmitter oder einen Vorläufer davon codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das pseudotypisierte unvollständige (defekte) Lentivirus ein Lentivirus-Genom umfasst, das eine LTR-Psi-RRE-flap-Promotor-Transgen-LTR-Sequenz umfasst.
Verwendung eines Lentivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich dabei handelt um ein Human-Immundefizit-Virus vom Typ 1 (HIV-1 ), ein Human-Immundefizit-Virus vom Typ 2 (HIV-2), ein Affen-Immundefizit-Virus (SIV), ein Katzen-Immundefizit-Virus (FIV), ein Pferde-Infekt-Anämie-Virus (EIAV), ein Rinder-Immundefizit-Virus (BIV), ein VISNA-Maedl-Virus (VISNA) oder ein Ziegen-Arthritis-Enzephalitis-Virus (CAEV).
Verwendung eines pseudotypisierten Lentivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, die bestimmt ist für die Behandlung einer Erkrankung des Zentralnervensystems oder einer Erkrankung, die das Zentralnervensystem befällt.
Verwendung nach Anspruch 5 für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 6, in der die neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, SLA und SMA.
Verwendung nach Anspruch 5 für die Behandlung von Traumata des Zentralnervensystems.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Trauma ausgewählt wird aus der Gruppe Rückenmarkstrauma und Schlaganfall (Gehirnschlag).
Verwendung nach Anspruch 5 für die Behandlung von Stoffwechsel-Erkrankungen, die das Zentralnervensystem befallen.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der die Stoffwechsel-Erkrankung ausgewählt wird aus der Gruppe der Mucopolysaccharidosen und der Charcot-Marie-Krankheit.