DE60038555T2

DE60038555T2 - Verpackungszelle

Info

Publication number: DE60038555T2
Application number: DE60038555T
Authority: DE
Inventors: Toshio Minato-ku KITAMURA; Sumiyo Minato-ku MORITA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-06-01
Filing date: 2000-06-01
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: EP1186655A4; US6995009B1; WO2000073423A1; DE60038555D1; AU4952500A; ATE391768T1; JP3904451B2; EP1186655A1; EP1186655B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Virus-produzierende Zelle (Verpackungszelle), die die Fähigkeit stabil beibehält, Viren in hohem Titer herzustellen, und die Verwendung einer solchen Zelle für die Herstellung von Viren.
HINTERGRUND
Retrovirale Vektoren sind in der Lage, Gene mit hoher Wirksamkeit und Stabilität in Wirtszellen zu übertragen. Daher werden sie bei Gentransfer-Verfahren für die Übertragung von Genen in Zellen auf vielen Gebieten einschließlich des Gebiets der Medizin verwendet. Die Erzeugung von retroviralen Vektoren wurde auf Grundlage der genetischen Struktur und des Lebenszyklus-Mechanismus der Retroviren entwickelt. Das fundamentale Prinzip besteht darin, das Gen von Interesse in einen retroviralen Vektor zu übertragen, der ein Verpackungssignal besitzt, dem aber alle die Strukturgene gag, pol und env fehlen, und dann darin, den retroviralen Vektor in eine Verpackungszelle einzubringen, die die Strukturgene gag, pol und env besitzt, der aber das Verpackungssignal fehlt. Dann wird ein Viruspartikel gebildet (d. h. verpackt), der die retrovirale Vektor-RNA enthält, und schließlich werden Retroviren in den Überstand einer Zellkultur produziert (Kitamura, T., International Journal of Hematology 67: 351–359 (1998)). Auf diese Weise hergestellte Retroviren können die Gene von Interesse effizient in Zellen übertragen. Gleichzeitig gilt, da ihnen die Strukturgene gag, pol und env fehlen, dass sie sich nur innerhalb der Verpackungszellen replizieren und sich in normalen Zellen nicht replizieren können. Daher ist es unwahrscheinlich, dass sich funktionelle Retroviren in den so hergestellten infizierten Zellen regenerieren.
Die Herstellung von Verpackungszellen mit solchen Eigenschaften wird in den internationalen Veröffentlichungen mit den Nummern WO90/02806 , WO94/19478 , WO96/34098 und so weiter offenbart. Im Hinblick auf die Infektionseffizienz und die Langzeit-Stabilität sind diese Verfahren im Fachgebiet jedoch nicht zufriedenstellend. Darüber hinaus ist es, um den Titer der Viren zu steigern, notwendig, die viralen Strukturproteine in großer Menge innerhalb der Verpackungszelle zu exprimieren. Im Fachgebiet werden Verpackungszellen benötigt, die ein große Menge an viralen Strukturproteinen exprimieren können und die eine begrenzte Verminderung des Titers der Viren aufweisen, die während der Passagen produziert werden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung einer 293T-Zelle für die Herstellung von Retroviren, wobei die Zelle (i) ein erstes Expressionskonstrukt enthält, das DNA umfasst, die stromabwärts eines EF1α-Promotor funktionell verknüpft ist und die die retroviralen Strukturproteine gag und pol codiert, und (ii) ein zweites Expressionskonstrukt enthält, das DNA umfasst, die stromabwärts eines EF1α-Promotor funktionell verknüpft ist und die das retrovirale Strukturprotein env codiert. Diese Zelle besitzt die Fähigkeit, infektiöse Viren in hohen Titern herzustellen. Darüber hinaus weisen diese Virus-produzierenden Zellen eine erhöhte Langzeit-Stabilität und Sicherheit auf. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Herstellung infektiöser Viren in hohen Titern unter Verwendung der Virus-produzierenden Zellen der vorliegenden Erfindung.
Um die vorstehend beschriebenen Aufgaben zu erreichen, suchten die genannten Erfinder zuerst nach einem Promotor, der in 293T-Zellen eine hohe Aktivität aufweist. Nach der Untersuchung der Stärke der Transkriptionsaktivität des SV40-Promotors, des SRα-Promotors, des EF1α-Promotors, des TK-Promotors, der MuLV-LTR und der CMV-LTR fanden die genannten Erfinder heraus, dass die durch den EF1α-Promotor und den CMV-Promotor angetriebenen Aktivitäten im Vergleich zu denen der anderen Promotoren bemerkenswert hoch waren. Dementsprechend wurde der Versuch unternommen, Verpackungszellen mit hoher Produktivität unter Verwendung des EF1α-Promotors zu konstruieren.
Spezifisch verwendeten die genannten Erfinder in den Verpackungskonstrukten nur die codierenden Sequenzen des gag-pol- und des env-Gens unter der Regulation des EF1α-Promotors, um die Expressionseffizienz dieser Gene, die die viralen Strukturproteine codieren, in den Verpackungszellen zu erhöhen. Um die Translationseffizienz der viralen Strukturproteine von den transkribierten mRNAs zu erhöhen, wurde darüber hinaus die Kozak-Konsensus-Sequenz (GCCACC) stromaufwärts der Translations-Initiations-Codons dieser Gene inseriert. Zusätzlich wurde ein Selektionsmarker-Resistenzgen über die IRES-Sequenz (interne Ribosomen-Eintrittsstelle) stromabwärts dieser Gene angehängt, so dass die Gene, die stromaufwärts und stromabwärts der IRES positioniert sind, von einer einzigen mRNA translatiert werden. Dies ermöglichte eine verlässliche Selektion der Zellen, die das inserierte Konstrukt exprimierten, durch den Selektionsmarker. Auf diese Weise wurden Zellen hergestellt, die eine überlegene Langzeit-Stabilität im Vergleich zu herkömmlichen Verpackungszellen aufweisen; dies erfolgte durch die getrennte Einbringung eines Konstrukts, das das Selektionsmarker-Resistenzgen enthielt, und eines Konstrukts, das das gag-pol- und das env-Gen enthielt.
Zusätzlich wurde eine Verbesserung der Sicherheit durch die Insertion der gag-pol- und env-Gene, die durch PCR-Amplifizierung nur der codierenden Regionen der viralen Strukturproteine produziert wurden, in das Konstrukt erreicht, wodurch die Möglichkeit des Auftretens von Wildtyp-Viren in den Verpackungszellen aufgrund von Rekombination eliminiert wurde.
Die genannten Erfinder untersuchten die Produktivität der Verpackungszellen, die auf diese Weise hergestellt worden waren, und fanden heraus, dass die Verpackungszellen Retroviren in hohem Titer herstellten. Sogar nach einer längeren Passage über 4 Monate behielten sie die Fähigkeit bei, Retroviren mit dem gleichen Spiegel des Titers wie zuvor herzustellen. Die Verpackungszellen dieser Erfindung sind nützlich zur Herstellung von Vektoren für die Genübertragung in einen lebenden Körper und können bevorzugt besonders für die Herstellung von retroviralen Vektoren in hohem Titer verwendet werden, die für die Gentherapie und ähnliches verwendet werden.
Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Herstellung einer Virus-produzierenden Zelle, die eine überlegene (höhere) Sicherheit aufweist und die die Fähigkeit beibehält, infektiöse Viren in hohem Titer sogar nach langfristigen Passagen herzustellen, sowie Verfahren für die Herstellung infektiöser Viren in hohem Titer unter Verwendung der Virus-produzierenden Zellen. Noch spezifischer stellt die Erfindung folgendes bereit:

(1) Eine 293T-Zelle für die Herstellung von Retroviren, wobei die Zelle (i) ein erstes Expressionskonstrukt enthält, das DNA umfasst, die stromabwärts eines EF1α-Promotors funktionell verknüpft ist und die die retroviralen Strukturproteine gag und pol codiert, und (ii) ein zweites Expressionskonstrukt enthält, das DNA umfasst, die stromabwärts eines EF1α-Promotors funktionell verknüpft ist und die das retrovirale Strukturprotein env codiert;
(2) die Zelle nach (1), wobei das env-Gen entweder aus einem ekotropischen Retrovirus oder aus einem amphotropischen Retrovirus stammt;
(3) die Zelle nach (1) oder (2), wobei die Kozak-Konsensus-Sequenz stromaufwärts von einem Translations-Initiations-Codon der DNA platziert ist, die die retroviralen Strukturproteine in dem Expressionskonstrukt codiert; (4) die Zelle nach einem von (1) bis (3), wobei die DNA, die die retroviralen Strukturproteine codiert, über die IRES-Sequenz an eine DNA gebunden ist, die einen Selektionsmarker codiert;
(5) die Zelle nach einem von (1) bis (4), wobei die DNA, die die retroviralen Strukturproteine codiert, im Wesentlichen frei ist von Virus-Genomabgeleiteter DNA mit Ausnahme der Protein-codierenden Region;
(6) die Zelle, die durch die Zugangs-Nrn. FERM BP-6737 oder FERM BP-6977 spezifiziert ist;
(7) ein Verfahren für die Herstellung eines Retrovirus, umfassend die Schritte: Einführen einer retroviralen Vektor-DNA, der mindestens eines der Gene fehlt, die die viralen Strukturproteine gag, pol und env codieren, in die Zelle nach einem von (1) bis (6);
(8) das Verfahren nach (7), wobei der retroviralen Vektor-DNA alle gag, pol und env codierenden Gene fehlen; und
(9) das Verfahren nach (7) oder (8), wobei ein fremdes Gen in die retroviralen Vektor-DNA eingeschlossen ist.

Die Verpackungszellen dieser Erfindung sind durch die Verwendung des EF1α-Promotors für die Expression der retroviralen Strukturproteine charakterisiert. Die genannten Erfinder suchten nach einem Promotor, der eine hohe Aktivität in Verpackungszellen aufweist. Als Ergebnis fanden sie heraus, dass der EF1α-Promotor eine besonders starke Aktivität unter denjenigen Promotoren besaß, für die eine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Verpackungszellen dieser Erfindung exprimieren die retroviralen Strukturproteine aufgrund der Verwendung des EF1α-Promotors sehr stark, was somit die Herstellung von Viruspartikeln in hohem Titer ermöglicht.
Die DNA, welche das/die retrovirale(n) Strukturprotein(e) codiert, wird unter der Regulation des EF1α-Promotors in einer Verpackungszelle exprimiert; dies erfolgt durch die Herstellung eines Expressionskonstrukts, in dem die DNA, die das/die retrovirale(n) Strukturprotein(e) codiert, stromabwärts des EF1α-Promotors funktionell verknüpft wird, und sie dann in die Zelle eingebracht wird. Der hierin verwendete Ausdruck „funktionell verknüpft" bedeutet, dass der EF1α-Promotor in der DNA in einer solchen Weise gebunden ist, dass seine Aktivierung die Expression der stromabwärts gelegenen DNA, welche die retroviralen Strukturproteine codiert, sicherstellt.
Die retroviralen Strukturproteine, die in den Zellen der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, sind gag, pol und env. Theoretisch ist es nicht notwendig, alle diese Proteine in den Verpackungszellen zu exprimieren, und es ist möglich, Gene, die einige dieser Proteine codieren, in der retroviralen Vektor-DNA zu platzieren. So ist es zum Beispiel möglich, dass die Verpackungszellen gag und pol exprimieren, während das env-Gen in die retrovirale Vektor-DNA platziert wird. In diesem Fall besteht jedoch die Möglichkeit, dass die Höhe der Expression des env-Proteins nicht die erforderliche Menge erreicht. Daher werden in den Zellen der vorliegenden Erfindung gag, pol und env durch die Verpackungszellen selber hergestellt.
Das Expressionskonstrukt der vorliegenden Erfindung wird in ein Konstrukt, das gag und pol exprimiert, und in ein Konstrukt, das env exprimiert, getrennt, die dann in die Zelle eingebracht werden. Auf diese Weise wird die Möglichkeit vermindert, dass selbst-replizierende Viren aufgrund der Rekombination von pol, gag und env hergestellt werden, die oft zwischen denjenigen Sequenzen auftritt, die sich in dem retroviralen Vektor befinden, und denjenigen, die sich in den Verpackungszellen befinden. Dies ist im Hinblick auf die Sicherheit wichtig, zum Beispiel wenn die durch diese Zeilen hergestellten Viren bei der Gentherapie verwendet werden. Im Hinblick auf Gag und Pol wird bevorzugt, dass diese als gag-pol in dem gleichen Konstrukt codiert werden. Der Grund dafür ist, dass bekannt ist, dass das Expressionsverhältnis zwischen pol und gag für die Herstellung von Viren in hohem Titer wichtig ist, und die alleinige Expression des Pol-Proteins in großen Mengen, die durch die Herstellung von getrennten Expressionskonstrukten für gag und pol auftreten kann, eine Toxizität gegenüber den Zellen verursacht.
Wenn es gewünscht wird, ist es möglich, Verpackungszellen unter Verwendung eines env-Gens herzustellen, das aus ekotropischen Retroviren (bezeichnet als ecoenv) oder aus amphotropischen Retroviren (bezeichnet als amphoenv) stammt. Verpackungszellen, die ecoenv besitzen, produzieren ekotropische Retroviren, wohingegen Verpackungszellen, die amphoenv besitzen, amphotropische Retroviren herstellen. Da ein ekotropisches Retrovirus eine Glycoprotein-Bindung für den ekotropischen Rezeptor aufweist, der nur auf der Oberfläche von Ratten- und Mäusezellen vorkommt, infiziert es nur Ratten- und Mäusezellen. Demgegenüber ist ein amphotropisches Retrovirus in der Lage, verschiedene Arten zu infizieren, wie z. B. Ratten, Mäuse, Menschen, Hühner, Hunde, Katzen usw. Ein Beispiel für ein Retrovirus, das bei der Gentherapie verwendet wird, ist ein amphoenv-Virus, das in der Lage ist, Menschen zu infizieren. Um neue Gene im Labor zu clonieren, ist es jedoch sicherer, Retroviren zu verwenden, die von Verpackungszellen hergestellt wurden, die das ecoenv-Gen tragen, und welche für Menschen nicht infektiös sind.
Es können verschiedene retrovirale env-Gene verwendet werden, wie z. B. env, das aus dem Rous-Sarkom-Virus (RSV) stammt (Landau, N. R. und Littman, D. R., J. Virology 5110–5113 (1992)). Darüber hinaus können andere Hüll-Proteine verwendet werden, die nicht aus Retroviren stammen. So ist es zum Beispiel möglich, das aus dem vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) stammende Protein G (VSV-G) zu verwenden (Ory, D. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11400–11406 (1996)).
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Kozak-Konsensus-Sequenz (GCCACC) stromaufwärts des Translations-Initiations-Codons (ATG) der retroviralen Strukturprotein-Gene innerhalb des Expressionskonstrukts platziert, um die Translationseffizienz der mRNA, die diese Proteine codiert, welche von den Expressionskonstrukten zur Expression der retroviralen Strukturproteine transkribiert werden, zu steigern (die Regel von Kozak besagt, dass vor dem Translations-Initiations-Codon ATG die Sequenz GCCACC mit hoher Wahrscheinlichkeit vorkommt).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung Verpackungszellen bereit, die Expressionskonstrukte enthalten, welche das/die virale(n) Strukturprotein(e) und gleichzeitig einen Selektionsmarker exprimieren; dies erfolgt durch eine funktionelle Verknüpfung der DNA, die das/die virale(n) Strukturprotein(e) codiert, mit dem Selektionsmarker mittels der IRES. Das/die virale(n) Strukturprotein(e) und der Selektionsmarker werden auf einem einzigen Molekül codiert, das in dem Expressionskonstrukt nach Aktivierung des EF1α-Promotors transkribiert wird. Somit wird/werden nicht nur das/die Protein(e), sondern auch der Selektionsmarker durch die Wirkung der IRES von dem RNA-Molekül translatiert. Dementsprechend ist eine verlässliche Selektion von Zellen, die das/die retrovirale(n) Strukturprotein(e) exprimieren, durch den Selektionsmarker aufgrund der Transformation mit dem Expressionskonstrukt möglich. Üblicherweise wurden die Verpackungszellen so hergestellt, indem ein Expressionskonstrukt, welches das Selektionsmarker-Resistenzgen trug, und ein Expressionskonstrukt, welches das gag-pol- und das env-Gen trug, in die Zellen eingebracht wurden. Daher waren die Zellen, die das Selektionsmarker-Resistenzgen enthielten, und diejenigen, die die viralen Strukturprotein-Gene enthielten, nicht immer miteinander vereinbar, was Probleme im Hinblick auf die Stabilität der Zellen verursachte. Die Verwendung der IRES-Sequenz ermöglicht die Herstellung von Verpackungszellen mit einer ausgezeichneten Langzeit-Stabilität.
Neben Blasticidin und Puromycin, die in den Beispielen beschrieben werden, können zum Beispiel auch Hygromycin, Diphtherie-Toxin, Neomycin und ähnliche als Selektionsmarker verwendet werden. Blastidicin und Puromycin werden jedoch bevorzugt, da sie rasch wirken und eine kürzere Zeit für die Selektion der Zellen im Vergleich zu anderen Arzneistoffen erfordern. Die Resistenzgene für Diphtherie-Toxin und Hygromycin werden in: „Bishai, W. R. et al., J. Bacteriol. 169: 1554–1563 (1987)", beziehungsweise in; „hygromycin: Yin, D. X. et al., Cancer Res. 55: 4922–4928 (1995) beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung Zellen bereit, die ein Expressionskonstrukt enthalten, in dem die DNA, die das/die retrovirale(n) Strukturprotein(e) unter der Regulation des EF1α-Promotors codiert, im Wesentlichen von derjenigen DNA frei ist, die nicht die Protein-codierenden Regionen umfasst. In den Verpackungszellen dieser Erfindung wird bevorzugt, die aus dem viralen Genom stammenden Sequenzen, die für die Expression der Strukturproteine nicht essentiell sind, so weit wie möglich zu entfernen. Dies erlaubt einem, das Risiko für das Auftreten von replikationsfähigen Retroviren (RCR) auf ein Minimum zu beschränken, und zwar, indem die Möglichkeit einer Rekombination zwischen der aus dem viralen Genom stammenden DNA und der retroviralen DNA in dem Expressionskonstrukt vermindert wird, nachdem die retrovirale Vektor-DNA in die Verpackungszellen, die die vorstehend erwähnten Expressionskonstrukte tragen, übertragen wurde. Dies wiederum ermöglicht eine Verbesserung der Sicherheit der Viruspartikel, die von den Verpackungszellen hergestellt werden.
DNA, die im Wesentlichen von anderer DNA als derjenigen der codierenden Regionen der retroviralen Strukturproteine frei ist, kann zum Beispiel durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der viralen genomischen DNA als Matrize und von Primern, die den codierenden Regionen der viralen Strukturproteine entsprechen, erhalten werden, wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird. Hierin bedeutet „im Wesentlichen frei von" anderer DNA als derjenigen der codierenden Regionen, dass andere DNA als diejenige der Protein-codierenden Region, die aus dem viralen Genom stammt, 30 oder weniger, bevorzugt 10 oder weniger, stärker bevorzugt 5 oder weniger und am stärksten bevorzugt 0 Basen beträgt.
Zum Beispiel können NIH3T3-Zellen (Maus-Fibroblasten), 293-Zellen (menschliche fötale Nierenzellen) (Graham, F. L., J. Gen. Virol. 36: 59–72 (1977)) und ähnliche ebenfalls als Wirtszellen für die Herstellung von Verpackungszellen verwendet werden.
Das Calciumphosphat-Verfahren, das Elektroporations-Verfahren und allgemeine Transfektionsverfahren mit Lipofectamin (GIBCO BRL), Fugene (Boehringer Mannheim) und ähnliche können verwendet werden, um die Expressionskonstrukte in die Zelle einzubringen. Als Selektionsverfahren kann die Selektion über Wirkstoffe verwendet werden. Zum Beispiel können Basticidin, Puromycin, Hygromycin, Diphtherie-Toxin, Neomycin und ähnliche ohne Einschränkung als Wirkstoffe für die Wirkstoffselektion verwendet werden, sofern das Gen für die Wirkstofftoleranz bekannt ist.
Die retrovirale Vektor-DNA wird bevorzugt in jeden Clon der erhaltenen Verpackungszellen nach begrenzter Verdünnung der Zellen eingebracht. Anschließend werden durch die Messung des Titers der hergestellten Viren Zellen ausgewählt und cloniert, die Viren mit dem höchsten Titer herstellen.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die retrovirale Vektor-DNA, die in die Verpackungszellen eingebaut wird. Wenn die Verpackungszellen von Zellen abstammen, die das große T-Antigen von SV40 exprimieren, wie zum Beispiel 293T-Zellen, ermöglicht die Verwendung von Vektor-DNA, die an die Replikations-Initiations-Stelle von SV40 gebunden ist, eine Erhöhung der Zahl ihrer Kopien, die innerhalb der Verpackungszellen hergestellt werden, und daher kann man eine Steigerung des Titers erwarten.
Die Einbringung der retroviralen Vektor-DNA in die Zellen kann durch das gleiche Verfahren durchgeführt werden, wie dasjenige, das vorstehend für die Einbringung der Expressionskonstrukte für die viralen Strukturproteine in die Zellen beschrieben wurde. Der retrovirale Vektor von Interesse kann durch die Ernte der retroviralen Partikel, die in den Überstand der Verpackungszellkultur nach der Einbringung des retroviralen Vektors freigesetzt werden, hergestellt werden.
Die durch die Verpackungszellen dieser Erfindung produzierten retroviralen Vektoren können in den umfangreichen Gebieten der Forschung und der Medizin verwendet werden. Zum Beispiel können sie als Vektoren für die Expression eines Gens von Interesse ex vivo oder in vivo bei der Gentherapie sowie bei der Herstellung von Tiermodellen verwendet werden. Sie können auch als Impfstoffe nützlich sein, um antigene Proteine und Proteine, die die immunologischen Funktionen steigern, zu exprimieren. Weiterhin können sie auch als in vitro-Gentransfer-Vektoren für die Analyse von Genfunktionen nützlich sein. Des Weiteren können die Vektoren auch verwendet werden, um Proteine von Interesse herzustellen. Ebenso sind sie nützlich als Vektoren für die Herstellung einer Genbank, die unspezifische cDNA-Molekül-Spezies exprimiert, wie z. B. eine cDNA-Expressions-Genbank.
DAS BESTE VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele spezifisch beschrieben. Die Erfindung sollte jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt werden.
[Beispiel 1] FACS-GAL-Analyse
Die FACS-GAL-Analyse (Steven, N. F. et al., Cytometry 12: 291–301 (1991)) wurde durchgeführt, um den Promotor, der die höchste Aktivität aufweist, zu verwenden; dies erfolgte durch einen Vergleich der Promotoraktivitäten in 293-Zellen und in 293T-Zellen. Entsprechend dem Verfahren wurde jeder Promotor, mit dem das lacZ-Gen stromabwärts verknüpft war, in die Zellen transfiziert, und die Verteilung der Expression von lacZ innerhalb dieser Zellen wurde untersucht.
293-Zellen und 293T-Zellen wurden zu 2 × 10⁶ Zellen pro 6 cm-Gewebekultur-Schale 16 bis 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert. 3 μg Plasmid, in dem lacZ stromabwärts von jedem der Promotoren verknüpft war, und 9 μl Fugene (Boehringer Mannheim) wurden mit 200 μl DMEM-Medium ohne fötales Rinderserum vermischt und anschließend 5–10 Minuten stehen gelassen. Danach wurden die Plasmide zu den 6 cm-Kulturschalen, in denen entweder 293-Zellen oder 293T- Zellen ausplattiert worden waren, vorsichtig zugegeben. Die Zellen wurden nach 24 Stunden entfernt und wurden dann in 50 μl PBS suspendiert, danach erfolgte eine Inkubation bei 37°C über 5 Minuten. Dann wurden 50 μl FDG (Fluorescein-di-β-D-galactopyranosid, Molecular Probe, Eugene, OR, Katalog-Nr. F1179: 2 mM in 98% destilliertem Wasser), das auf 37°C vorgewärmt war, zugegeben. Nach 1 Minute Inkubation bei 37°C wurde 1 ml PBS zugegeben und die Zellen wurden 2 Stunden auf Eis gestellt. Nach 2 Stunden wurden 20 μl PETG (Phenylethyl-β-D-thiogalactosid, Sigma, Katalog-Nr. P4902) hinzu gegeben, um die Reaktion zu beenden, und die Expressionsverteilung von lacZ in den Zellen wurde durch FACS untersucht. Als Ergebnis wurde erhalten, dass die Promotoraktivität des EF1α-Promotors in 293T-Zellen am höchsten war. Im Vergleich zu dem retroviralen Promotor, d. h. der LTR („long terminal repeat” lange terminale Sequenzwiederholung), war die Promotoraktivität des EF1α-Promotors etwa 100-fach höher und verglichen mit den anderen Promotoren war die Aktivität um mehrere Zehnmale höher.
[Beispiel 2] Amplifikation des Selektionsmarker-Gens
Um Blasticidin und Puromycin als Selektionsmarker verwenden zu können, wurde unter Verwendung der Resistenzgene jedes Markers (bs^r: Kamakura, T. et al., Agric. Biol. Chem. 51: 3165–3168 (1987); puro^r: Buchholz, F. et al., Nucleic Acids Res. 24: 3118–3119 (1996)) als Matrizen eine PCR-Reaktion unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch enthielt 10 ng Matrizen-DNA, 5 μl 10 × KOD-Puffer, 5 μl 2 mM dNTP, 2,5 μl jedes Primers zu 10 μM (die Basensequenzen der Primer werden nachstehend gezeigt), 2 μl 25 mM MgCl₂ und 1 μl 2,5 E/ml KOD-DNA-Polymerase (TOYOBO).
Die für das Blasticidin-Resistenzgen (bs^r) verwendeten Primer waren:
5'-AAAACATTTAACATTTCTCAACAAG-3' (SEQ ID NO: 1)
und
5'-ACGCGTCGACTTAATTTCGGGTATATTTGAGTG-3' (SEQ ID NO: 2)
und diejenigen für das Puromycin-Resistenzgen (puro^r) waren:
5'-ACCGAGTACAAGCCCACG-3' (SEQ ID NO: 3)
und
5'-ACGCAGATCTTCAGGCACCGGGCTTG-3' (SEQ ID NO: 4).
Die Temperaturbedingungen waren: 30 Sekunden bei 94°C, 25 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C·30 Sekunden bei 54°C·2 Minuten bei 72°C und 10 Minuten bei 72°C. Nach einer Behandlung mit den Restriktionsenzymen Sall für das Blasticidin-Resistenzgen (bs^r) und Bglll für das Puromycin-Resistenzgen (puro^r) wurde eine Elektrophorese durchgeführt, danach erfolgte die Extraktion aus dem Gel. Für die Extraktion wurde Qiaexll (QIAGEN) verwendet.
[Beispiel 3] Herstellung von pMX-IRES-EGFP
Die IRES-Sequenz („internal ribosomal entry site", interne Ribosomen-Eintrittsstelle) ist eine Sequenz, die in der nicht-codierenden 5'-Region der viralen mRNA vorliegt, und man nimmt an, dass sie eine charakteristische Sekundärstruktur bildet. Aufgrund der Erkennung dieser Sequenz durch das Ribosom, das die Translation initiiert, wird die Translation der Proteine des Wirts gehemmt, wodurch die vorwiegende Translation des viralen Proteins ermöglicht wird. Um das Selektionsmarker-Resistenzgen stromabwärts der IRES einzubauen, wurde pMX-IRES-EGFP (Nosaka, T. et al., EMBO J. 18: 4754–4765 (1999)) mit Ncol verdaut. Nach einer Präzipitation mit Ethanol wurden mittels der Klenow-Reaktion glatte Enden hergestellt. Nach einer Behandlung mit Phenol/Chloroform und einer daran anschließenden Ethanol-Präzipitation wurde eine Behandlung mit dem Restriktionsenzym Sall, um bs^r zu inserieren, oder eine Behandlung mit Bglll, um puro^r zu inserieren, durchgeführt, danach erfolgte die Ligierung jedes Konstrukts. Auf diese Weise wurde das Selektionsmarker-Resistenzgen stromabwärts der IRES positioniert. Das IRES-bs^r-Fragment wurde aus pMX-IRES-bs^r durch Verdau mit NotI (TAKARA) und Sall herausgeschnitten, während das IRES-puro^r-Fragment aus pMX-IRES-puro^r mit NotI und BglII herausgeschnitten wurde.
[Beispiel 4] Amplifikation von gag-pol und des ekotropischen env-Gens
Die PCRs für gag-pol und das ekotropische env-Gen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch bestand aus 10 ng Matrizen-DNA (Shinnick et al., Nature 293: 543 (1981)), 5 μl 10 × LA-Taq-Puffer, 8 μl 2 mM dNTP, 1 μl jedes Primers zu 10 μM (die Nucleotidsequenzen werden nachstehend gezeigt) und 0,5 μl 5 E/ml LA-Taq (TAKARA).
Die Primer, die für die Amplifikation von gag-pol verwendet wurden, waren:
5'-CGAATTCGCCGCCACCATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAA-3 (SEQ ID NO: 5)
und
5'-TACGCCGGCGCTCTGAGCATCAGAAGAA-3' (SEQ ID NO: 6)
und diejenigen, die für die Amplifikation des ekotropischen env-Gens verwendet wurden, waren:
5'-CGAATTCGCCGCCACCATGGCGCGTTCAACGCTCTCAAAA-3' (SEQ ID NO: 7)
und
5'-TACGCCGGCGCTATGGCTCGTACTCTAT-3' (SEQ ID NO: 8).
Die Temperaturbedingungen für gag-pol waren 2 Minuten bei 98°C, 20 Zyklen mit 20 Sekunden bei 98°C·3 Minuten bei 68°C und 8 Minuten bei 68°C. Diejenigen für das ekotropische env-Gen waren: 2 Minuten bei 98°C, 30 Zyklen mit 20 Sekunden bei 98°C·2 Minuten bei 68°C und 7 Minuten bei 68°C.
Nach einer Elektrophorese der PCR-Produkte wurden die DNAs aus dem Gel mit Qiaexll (QIAGEN) extrahiert. Diese DNAs wurden in TA-Vektoren unter Verwendung des Original-TA-Clonierungskits (Invitrogen) subcloniert und wurden dann mit EcoRI und NotI (TAKARA) verdaut.
[Beispiel 5] Konstruktion des gag-pol-Expressionsvektors und des ekotropischen env-Expressionsvektors
Um entweder gag-pol-IRES-bs^r oder env-IRES-puro^r unter der Kontrolle des EF1α-Promotors zu exprimieren, wurden die entsprechenden Sequenzen in pCHO (Hirata, Y. et al., FEBS Letters 356: 244–248 (1994); Okayama, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 838–845 (1996); pCHO wurde von pEF-BOS abgeleitet (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res. 18: 5332 (1990)), wie nachstehend beschrieben, eingebaut.
[pCHO(gag-pol-IRES-bs^r)
Nach der Behandlung von pCHO mit dem Restriktionsenzym BamHI (TAKARA) wurden über eine Klenow-Reaktion glatte Enden hergestellt. Im Anschluss an eine Ligierung mit dem Sall-Linker d(CGGTCGACCG) (Stratagene) (SEQ ID NO: 9) wurde das Plasmid mit EcoRI und Sall (TAKARA) verdaut. Die in den Beispielen 2 und 3 hergestellten gag-pol- und IRES-bs^r-Fragmente wurden eingebaut, um pCHO(gag-pol-IRES-bs^r) herzustellen.
[pCHO(ecoenv-IRES-puro)
Nach der Behandlung von pCHO mit dem Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI (TAKARA) wurden das in den Beispielen 2 und 3 hergestellte ecotropische env und das IRES-puro^r-Fragment eingebaut, um pCHO(ecoenv-IRES-puro) herzustellen.
[Beispiel 6] Konstruktion eines amphotropischen env-Expressionsvektors
Während das ekotropische env-Gen nur diejenigen Zellen infizieren kann, die von der gleichen Art stammen, kann das amphotropische env-Gen eine Vielzahl von Zellen infizieren. Unter Verwendung dieses amphotropischen env-Gens wurde ein env-IRES-puro^r-Expressionsvektor wie in den Beispielen 4 und 5 hergestellt. Das Reaktionsgemisch enthielt 10 ng Plasmid, in das das amphotropische env-Gen (4070A) (Ott, D. et al., J. Virol. 64: 757–766 (1990)) eingebaut wurde, 5 μl 10 × KOD-Puffer, 5 μl 2 mM dNTP, 2,5 μl jedes Primers zu 10 μM (die Nucleotidsequenzen werden nachstehend gezeigt), 2 μl 25 mM MgCl₂ und 1 μl 2,5 E/ml KOD-DNA-Polymerase (TOYOBO). Als Primer wurden verwendet:
5'-CGAATTCGCCGCCACCATGGCGCGTTCAACGCTCTCAAAA-3' (SEQ ID NO: 10)
und
5'-ATGCGGCCGCTCATGGCTCGTACTCTAT-3' (SEQ ID NO: 11)
Die Temperaturbedingungen waren 3 Minuten bei 98°C, 25 Zyklen mit 15 Sekunden bei 98°C·2 Sekunden bei 65°C·30 Sekunden bei 72°C und 10 Minuten bei 72°C.
Das in Beispiel 5 hergestellte pCHO(ecoenv-IRES-puro) wurde mit EcoRI und NotI verdaut und durch eine Behandlung mit dem Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen. Dann wurde das vorstehende amphotropische env-Gen ligiert, um pCHO(amphoenv-IRES-puro) herzustellen.
[Beispiel 7] Erstellung der Verpackungszellen
Die aus menschlichen mesonephrogenen 293T-Zellen (DuBridge, R. B. et al., Mol. Cell. Biol. 7: 379–387 (1987)) wurden mit dem hergestellten Konstrukt transfiziert. Die 293T-Zellen wurden zu 2 × 10⁶ Zellen pro 6 cm-Gewebekulturschale 16 bis 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert. 3 μg pCHO(gag-pol-IRES-bs^r) und 9 μl Fugene (Boehringer Mannheim) wurden mit 200 μl DMEM-Medium ohne fötales Rinderserum vermischt, und anschließend wurde das Gemisch 5–10 Minuten stehen gelassen. Dann wurde das Gemisch zu den 6 cm-Kulturschalen mit den ausplattierten 293T-Zellen vorsichtig zugegeben. Die Zellen wurden 48 Stunden später entfernt und in einer 10 cm-Schale ausplattiert, und dann wurde ihnen DMEM-Medium, das 10% fötales Rinderserum (8 μg/ml Blasticidin) enthielt, zugegeben.
Etwa 10 Tage später wurden pCHO(ecoenv-IRES-puro) und pCHO(amphoenv-IRES-puro) auf ähnliche Weise transfiziert und dann in einem Medium angezogen, das sowohl Puromycin (0,8 μg/ml) als auch Blasticidin (8 μg/ml) enthielt. Die Verpackungszellen von Interesse wurden erstellt, indem einzelne Clone durch begrenzte Verdünnung zu dem Zeitpunkt, an dem eine Teilung der Zellen erfolgt war, erhalten wurden.
Die Verpackungszelle, in die der ecoenv-Expressionsvektor eingebracht worden war, wurde „Platinum-E-Zelle (PLAT-E-Zelle)" benannt. Die Zelle wurde als „Pt-E" bei einer Hinterlegungs-Institution hinterlegt, die nachstehend beschrieben wird.

(a) Name und Adresse der Hinterlegungs-Stelle Name: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology Adresse: 1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (Postleitzahl: 305–8566)
(b) Datum der Hinterlegung (Datum der Original-Hinterlegung): 31. Mai 1999
(c) Zugangs-Nummer: FERM BP-6737

Darüber hinaus wurde die Verpackungszelle, in die der amphoenv-Expressionsvektor eingebracht worden war, „Platinum-A-Zelle (PLAT-A-Zelle)" benannt. Die Zelle wurde als „Plat-A" bei einer Hinterlegungs-Institution hinterlegt, die nachstehend beschrieben wird.

(a) Name und Adresse der Hinterlegungs-Stelle Name: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology Adresse: 1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (Postleitzahl: 305–8566)
(b) Datum der Hinterlegung (Datum der Original-Hinterlegung): 22. Dezember 1999
(c) Zugangs-Nummer: FERM BP-6977

[Beispiel 8] Die Herstellung von Retroviren
Um die Infektionseffizienz der Viruslösung, die von den Verpackungszellen erhalten wird, zu untersuchen, wurde ein Infektionsexperiment nach dem folgenden Verfahren durchgeführt. Die Verpackungszellen (PLAT-E-Zellen, in die ecoenv eingebracht worden war) wurden zu 2 × 10⁶ Zellen pro 6 cm-Gewebekulturschale 16 bis 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert. 3 μg Vektor-DNA (pMX-GFP: Onishi, M. et al., Exp. Hematol. 24: 324–329 (1996)), bei der es sich um einen retroviralen Vektor handelt, der ein MOLuLV-Grundgerüst enthält und in den das GFP inseriert ist, und 9 μl Fugene wurden mit 200 μl serumfreien DMEM-Medium vermischt und 5 bis 10 Minuten stehen gelassen. Dieses Gemisch wurde dann der 6 cm-Schale, in die die Verpackungszellen auspLattiert worden waren, vorsichtig zugegeben.
Der Überstand (Virus-Lösung) wurde 48 Stunden später gesammelt und 5 Minuten bei 3.000 UpM zentrifugiert. Zu 500 μl dieser Lösung wurden 5 μl 1 mg/ml Polybren (Sigma) und 1 ml × 1000 IL3 (R und D) zugegeben, und mit dieser Lösung wurden dann 1 × 10⁵ BaF/3-Zellen 5 Stunden infiziert. Nach 5 Stunden wurden 500 μl RPMI1640-Medium (das IL3 enthielt) zugegeben. 24 Stunden später wurde unter Ausnutzung der Eigenschaft des GFP), das in den infizierten Zellen exprimiert wird, das heißt der Eigenschaft, dass es durch Licht einer Wellenlänge von 395 nm angeregt wird und Licht bei einer Wellenlänge von 509 nm emittiert, die Infektionseffizienz als Anteil derjenigen Zellen, die Licht emittierten (d. h. nach der Infektion exprimierten), unter Verwendung des FACS-Scan (Fluorescein-aktiviertes Zellsortiergerät von Becton Dickinson) gemessen. Die Infektionseffizienz gegenüber BaF/3-Zellen erreichte 95%, sogar ohne eine Aufkonzentrierung der Viruslösung.
Die Messung der Infektionseffizienzen der Viruslösungen, die von den PLAT-E-Zellen (PLAT-E-Zellen, in die ecoenv eingebracht worden war) und von BOSC23-Zellen, die gleichzeitig aus flüssigem Stickstoff aufgetaut worden waren, erhalten wurde, unter Verwendung von BaF/3-Zellen offenbarte, dass die Infektionseffizienzen 7 Tage nach dem Beginn der Passagen 90% oder mehr für beide Verpackungszellen betrugen. Andererseits nahm nach 2 Monaten Passage die Infektionseffizienz auf 23% ab, wenn BOSC23-Zellen (Pear, W. S. et al., Proc. Natl. Acad: Sci. USA 90: 8392–8396 (1993)) verwendet wurden, wohingegen die Beibehaltung einer Infektionseffizienz, die so hoch wie nach 7 Tagen war, sogar nach 2 Monaten Passage sowie nach 4 Monaten Passage bestätigt wurde (4 Monate nach Beginn der Passagierung wurde gegenüber den BaF/3-Zellen eine Infektionseffizienz von 70% oder mehr beibehalten), wenn PLAT-E-Zellen verwendet wurden. Das heißt, dass es für etwa 4 Monate möglich war, Retroviren in einem Titer von etwa 1 × 10⁷/ml zu produzieren.
Wenn die Infektionseffizienz einer Viruslösung, die aus PLAT-A-Zellen erhalten worden war, unter Verwendung von BaF/3-Zellen gemessen wurde, wurde ein Wert von 30% am 7. Tag nach Beginn der Passage bestätigt (Titer etwa 1 × 10⁶/ml).
[Beispiel 9] Untersuchung der Sicherheit der PLAT-E-Zellen
Es wurde untersucht, ob Retroviren, die die Fähigkeit erworben haben, sich aufgrund einer Rekombination zu replizieren (RCR; replikationskompetente Retroviren), nachdem die Retrovirus-Vektoren in die Zellen eingebracht worden waren, auftraten oder nicht auftraten.
16 Stunden nachdem 5 × 10⁴ NIH3T3-Zellen in 6 cm-Gewebekultur-Schalen ausplattiert worden waren, wurden die Zellen mit Viren unter Verwendung von 1 ml Viruslösung infiziert, zu der 10 μl 1 mg/ml Polybrene hinzugefügt worden war und die durch die Einbringung von pMX-neo in die Verpackungszellen hergestellt worden war. Nach 4 Stunden wurden 3 ml DMEM mit 10% FCS hinzugefügt und die Anzucht wurde weiter fortgesetzt, bis eine Konfluenz erreicht wurde. Nach einer Passage wurde das System in DMEM, das mit Polybrene in einer Endkonzentration von 2 μg/ml ergänzt worden war, kultiviert, bis eine Konfluenz von 50% erreicht war. Dann wurde das Medium ausgetauscht und die Anzucht wurde weitere 2 bis 3 Tage in 2 ml DMEM fortgesetzt. Der Überstand wurde durch einen 0,45 μm-Filter filtriert, erneut für die Infektion von NIH3T3-Zellen eingesetzt, die in DMEM, das G418 (neo) enthielt, unter Selektion kultiviert wurden. Wenn Retroviren, die die Fähigkeit zu Replikation aufwiesen, hergestellt worden wären, sollte eine gegenüber G418 resistente Kolonie erscheinen. Solche Kolonien wurden jedoch nicht nachgewiesen.
[Beispiel 10] Untersuchung der Stabilität von PLAT-E-Zellen im Vergleich zu der von BOSC23-Zellen und Phoenix-E-Zellen
Die genannten Erfinder verglichen bei ihren anfänglichen Untersuchungen PLAT-E-Zellen mit Bosc23-Zellen und Phoenix-E-Zellen im Hinblick auf ihre Fähigkeit oder ihr Unvermögen, Retroviren in hohem Titer mit Langzeit-Stabilität herzustellen, dies erfolgte mit Hilfe der transienten Transfektion. Vergleiche dazu mit http://www.stanford.edu/group/ndan/tutorials/retpkg_7_phx_sys.html (ein Kolloquium über ekotropische und amphotropische Phoenix-Verpackungszelllinien auf der Web-Seite des Nolan-Labors im Department of Molecular Pharmacology/The Department of Microbiology and Immunology in the School of Medicine at Stanford-University). Die Kulturbedingungen für die drei Verpackungs-Zelllinien waren wie folgt:
Gemäß den Vorschriften des Herstellers wurden die BOSC23-Zellen in DMEM, das GPT als Selektionsmittel enthielt (Speciality Media, Lavallette, NJ, USA) und mit 10% fötalem Rinderserumalbumin ergänzt worden war, vermehrt. Die Phoenix-E-Zellen wurden unter Verwendung der Expression von CD8 als Index mittels FACS klassifiziert, sie wurden eine Woche in DMEM, das Hygromycin (300 μg/ml) und Diphtherie-Toxin (1 μg/ml) enthielt und mit 10% fötalem Rinderserumalbumin ergänzt worden war, angezogen, und wurden dann auf DEME-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserumalbumin ergänzt worden war, aber kein Hygromycin und Diphtherie-Toxin enthielt, übertragen. Die PLAT-E-Zellen wurden die ganze Zeit über in DEME, das Blasticidin (10 μg/ml) und Puromycin (1 μg/ml) enthielt und mit 10% fötalem Rinderserumalbumin ergänzt worden war, gehalten. Die Infektionseffizienz der Retroviren, die durch BOSC23-Zellen produziert wurden, verminderte sich innerhalb von 3 Monaten und die der Retroviren, die von Phoenix-E-Zellen produziert wurden, verminderte sich in ähnlicher Weise. Andererseits behielten die Retroviren, die von PLAT-E-Zellen produziert wurden, einen durchschnittlichen Titer von etwa 1 × 10⁷/ml bei NIH3T3-Zellen über mindestens 4 Monate unter Bedingungen des Wirkstoff-Selektionsdrucks sowie eine Infektionseffizienz von 75% oder mehr (maximal 99%) bei BaF/3-Zellen bei, wenn sie transient transfiziert wurden.
Um die Expressionsspiegel von gag-pol- und env-mRNA in PLAT-E-, BOSC23- und Phoenix-E-Verpackungs-Zelllinien zu vergleichen, wurde eine Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von über 3 Wochen angezogenen Zellen durchgeführt. Die Expressionsspiegel der gag-pol und der env-mRNA in PLAT-E-Zellen waren vierfach beziehungsweise zehnfach höher im Vergleich zu den anderen Zelllinien.
Die RT-Aktivität in den Zelllysaten wurde ebenfalls analysiert. Es wurde nachgewiesen, dass die RT-Aktivität in PLAT-E-Zellen mindestens zweimal so hoch wie in BOSC23- und in Phoenix-E-Zellen war. Des Weiteren war der Expressionsspiegel des env-Proteins, der durch eine Antikörper-Färbung unter Verwendung von Antikörpern, die gegen das env-Genprodukt erzeugt worden waren, bewertet wurde, beträchtlich höher als der in BOSC23- und Phoenix-E-Zellen.
Somit wurde gezeigt, dass PLAT-E-Zellen Retroviren in hohem Titer mit einer Langzeit-Stabilität herstellen können.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Virus-produzierende Zelle bereitgestellt, die die Fähigkeit beibehält, infektiöse Viren in hohem Titer sogar nach Passagen über einen langen Zeitraum herzustellen. Darüber hinaus wird ein Verfahren für die Herstellung von infektiösen Viren in hohem Titer unter Verwendung der Virus-produzierenden Zellen ebenfalls bereitgestellt. Die Verwendung der retroviralen Verpackungszellen dieser Erfindung ermöglicht die stabile Bereitstellung von Retroviren in hohen Titern. Darüber hinaus verminderten die Erfinder durch die Minimierung des viralen Genoms, das in die Verpackungszelle eingebracht wird, erfolgreich die Möglichkeit des Auftretens von unerwünschten rekombinanten Viren wie z. B. von replikationskompetenten Retroviren (RCR). Daher dienen die retroviralen Verpackungszellen dieser Erfindung als leistungsstarke Werkzeuge für die Herstellung von retroviralen Vektoren in den Gebieten der Biologie und der medizinischen Forschung und sind ebenfalls nützlich für die Herstellung von Gentransfer-Vektoren, die bei der Gentherapie verwendet werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

293T-Zelle zur Herstellung von Retroviren, wobei die Zelle (i) ein erstes Expressionskonstrukt aufweist, das eine DNA umfasst, die stromabwärts von einem EF1α-Promotor funktionell verknüpft ist und die retroviralen Strukturproteine gag und pol codiert, und (ii) ein zweites Expressionskonstrukt aufweist, das eine DNA umfasst, die stromabwärts von einem EF1α-Promotor funktionell verknüpft ist und das retrovirale Strukturprotein env codiert.
293T-Zelle nach Anspruch 1, wobei das env entweder von einem ekotropischen Retrovirus oder einem amphotropischen Retrovirus stammt.
293T-Zelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Kozak-Konsensus-Sequenz stromaufwärts von einem Translationsinitiationscodon der DNA platziert ist, die gag, pol und env in dem Expressionskonstrukt codiert.
293T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die gag, pol und env codierende DNA über eine IRES-Sequenz an eine DNA gebunden ist, die einen selektiven Marker codiert.
293T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die gag, pol und env codierende DNA im Wesentlichen frei von Virusgenom-abgeleiteter DNA ist, mit der Ausnahme der Protein-codierenden Region.
293T-Zelle, die durch Zugangs-Nr. FERM BP-6737 und FERM BP-6977 spezifiziert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Retrovirus, das folgenden Schritt umfasst: Einführen einer retroviralen Vektor-DNA, der mindestens eines der gag, pol und env codierenden Gene fehlt, in eine Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der retroviralen Vektor-DNA alle gag, pol und env codierenden Gene fehlen.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei dem in die retrovirale Vektor-DNA ein fremdes Gen eingeschlossen ist.