CN113227126A

CN113227126A - 成纤维细胞生长因子21(fgf21)基因治疗

Info

Publication number: CN113227126A
Application number: CN201980077622.5A
Authority: CN
Inventors: 玛丽亚·法蒂玛·博世图伯特; 伊维特·埃里亚斯普伊格多梅内克; 维罗妮卡·希门尼斯坎扎诺; 阿尔伯特·里贝拉桑切斯; 伊格纳西·格拉斯科斯塔
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2021-08-06
Also published as: MX2021005824A; IL283452A; US20210386870A1; WO2020109314A1; CA3120923A1; AU2019389253A1; EP3887392A1; BR112021010038A2; KR20210096128A; JP2022513127A

Abstract

本文描述了一种基因构建体，其包含编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的核苷酸序列，用于治疗和/或预防代谢紊乱，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统(CNS)中的表达。

Description

成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因治疗

背景技术

糖尿病的患病率正以惊人的速度增长，并且是世界范围内的主要健康问题。肥胖与胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2D)密切相关(Moller,D.E.,和Flier,J.S.,1991.N.Engl.J.Med.325:938-948)。T2D和肥胖都增加了死亡风险(Peeters,A.et al.,2003.Ann.Intern.Med.138:24-32)，也增加了高发病率的慢性疾病的风险，包括心血管疾病、高血压和某些类型的癌症(Haslam,D.W.et al.,2005,Lancet.366,1197–1209；Roberts,D.L.et al.,2010,Annu.Rev.Med.61,301–316)。胰岛素抵抗和肥胖相关疾病随后与预期寿命缩短和生活质量下降有关。

现在已公认，肥胖期间，在外周组织(例如脂肪组织、肝脏或骨骼肌)中存在慢性轻度炎症，可能引起代谢功能障碍，包括胰岛素抵抗的发展(Valdearcos,M.et al.,2015,Annu.Rev.Physiol.77,131-160；Hotamisligil,G.S.et al.,2017,Nature.542,177-185)。最近，越来越多的文献表明，肥胖和胰岛素抵抗也与脑部炎症有关(Guillemot-Legris,O.et al.,2017,Trends Neurosci.40,237-253；Beilharz,J.E.et al.,2016,Behav.BrainRes.306,1-7)。此外，肥胖和胰岛素抵抗不仅与神经炎症有关，而且还与动物模型和人类的认知功能缺陷有关(Guillemot-Legris,O.et al.,2017,Trends Neurosci.40,237-253)。

成纤维细胞生长因子21(FGF21)是一种主要由肝脏分泌的生长因子，也是脂肪组织和胰腺分泌的一种生长因子(Muise,E.S.et al.,2008.Mol.Pharmacol.74:403-412)，已显示增加棕色脂肪组织(BAT)的生长以及BAT和白色脂肪组织(WAT)中产热基因的表达，刺激能量消耗(Coskun,T.et al.,2008.Endocrinology 149:6018-6027；Fisher,F.M.etal.,2012.Genes Dev.26:271-281；Kharitonenkov,A.et al.,2005.J.Clin.Invest 115:1627-1635；Konishi,M.et al.,2000.J.Biol.Chem.275:12119-12122；Tomlinson,E.etal.,2002.Endocrinology 143:1741-1747；Xu,J.et al.,2009.Diabetes 58:250-259)。

天然FGF21蛋白表现出较差的药代动力学特征。它的半衰期短，并且易于体内蛋白水解降解和体外聚集(Huang,J.et al.,2013.J Pharmacol Exp Ther.346(2):270-80；So,W.Y.and Leung,P.S.2016.Med Res Rev.36(4):672-704；Zhang,J.and Li,Y.2015..FrontEndocrinol(Lausanne)6:168)。已经开发出各种改造方法来延长FGF21的半衰期并改善FGF21的稳定性和溶解性。目前，正在人类中测试两种工程化的FGF21模拟物(LY2405319和PF-05231023)。然而，那些FGF21模拟物需要多次施用，这给患者带来了很大的负担。此外，工程化FGF21模拟物/类似物可能比天然FGF21具有更高的免疫原性风险，例如用LY2405319治疗的患者出现注射部位反应、抗药物抗体和严重的超敏反应(Gaich,G.et al.,2013.Cell Metab.18(3):333-40)。因此，通过单次施用本发明的载体提供的长期有效表达代表了相对于其他疗法的显著优势。

鉴于神经炎症似乎在糖尿病和肥胖症中观察到的认知功能下降以及全身能量和葡萄糖代谢中发挥着重要作用，解决中枢神经系统(CNS)炎症的新治疗方法可能具有引人注目的重要性。最近的研究表明，FGF21周围代谢作用的确可能由中枢神经系统，尤其是下丘脑的FGF21信号传导介导，下丘脑的调控全身能量代谢的主要部位(D.A.Sarruf et al.,Diabetes.59,1817-1824(2010)；A.L.Bookout et al.,Nat.Med.19,1147–1152(2013)；B.M.Owen et al.,Cell Metab.20,670–677(2014)；N.Douris et al.,Endocrinology.156,2470–2481(2015)。

技术领域

本文的方面涉及医学领域，其包含用于治疗哺乳动物，尤其是人类中的代谢紊乱的基因治疗组合物。

发明简述

在第一方面，提供了一种用于治疗的基因构建体，其包含编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的核苷酸序列，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统(CNS)中，优选在脑中，更优选在下丘脑中表达。在一些实施方案中，提供了一种基因构建体，其包含编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的核苷酸序列，用于治疗代谢紊乱，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统(CNS)，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

优选地，编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子。在优选的实施方案中，遍在启动子选自CAG启动子和CMV启动子组成的组，优选地，其中所述遍在启动子是CAG启动子。优选地，编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子和在组织中表达的microRNA的至少一个靶序列，在所述组织中，希望防止FGF21的表达。

优选地，microRNA的至少一个靶序列选自与在哺乳动物的心脏和/或肝脏中表达的microRNA结合的那些靶序列。

更优选地，编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子和在肝脏中表达的microRNA的至少一个靶序列和在心脏中表达的microRNA的至少一个靶序列。

优选地，在心脏中表达的microRNA的靶序列选自SEQ ID NO：13和21-25，在肝脏中表达的microRNA的靶序列选自SEQ ID NO：12和14-20。

更优选地，基因构建体包含microRNA-122a的靶序列和microRNA-1的靶序列。

优选地，遍在启动子选自由CAG启动子和CMV启动子组成的组，优选地，其中所述遍在启动子是CAG启动子。

优选地，编码FGF21的核苷酸序列选自由以下组成的组：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列；

(b)核苷酸序列，其与SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10或11的核苷酸序列具有至少60％的序列同一性；和

(c)核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而与(b)的核苷酸序列的序列不同。

在第二方面，提供了一种表达载体，其包含如第一方面所述的基因构建体，用于治疗，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统中，优选在脑中，更优选在下丘脑中表达。在一些实施方案中，提供了一种表达载体，其包含如第一方面所述的基因构建体，用于治疗代谢紊乱，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统中，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。优选地，表达载体是病毒载体。

优选地，表达载体选自由腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体组成的组，优选地，其中所述表达载体是腺伴随病毒载体。

优选地，表达载体是血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh10、rh8、Cb4、rh74、DJ、2/5、2/1、1/2或Anc80的腺伴随病毒载体，更优选地，其中表达载体是血清型1、2或9的腺伴随病毒载体。

在第三方面，提供了一种药物组合物，其包含如第一方面所述的基因构建体和/或如第二方面所述的表达载体，以及一种或多种药学上可接受的成分，用于治疗，其中所述治疗涉及基因构建体在CNS和/或脑中的表达。在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含如第一方面所述的基因构建体和/或如第二方面所述的表达载体，以及一种或多种药学上可接受的成分，用于治疗代谢紊乱，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统中，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中的表达。

在第四方面，提供了如第一方面所述使用的基因构建体和/或如第二方面所述使用的表达载体和/或如第三方面所述使用的药物组合物，其中所述基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物通过CSF内施用来施用。

在第五方面，提供了如第一方面所述使用的基因构建体和/或如第二方面所述使用的表达载体和/或如第三方面所述使用的药物组合物，用于治疗和/或预防代谢紊乱，优选地，其中所述代谢紊乱是糖尿病和/或肥胖症。

说明

本发明人已经开发出基于针对中枢神经系统(CNS)的FGF21基因治疗来抵抗肥胖症和/或糖尿病的改进的基因治疗策略。特别地，如实验部分所述，本发明人发现了脑定向FGF21基因治疗的以下意想不到的优势：

·本文所述的基因构建体和载体可获得在脑中稳健且广泛的过表达(实施例1、2、3和4)。

·本文所述的基因构建体和载体引起脂肪细胞大小减小，棕色脂肪细胞中脂肪积累减少，产热增加，循环甘油三酸酯和游离脂肪酸减少，胰腺更健康(胰岛数目增加，β细胞质量改善)和全身性炎症减少(减少促炎性细胞因子，例如F4/80，IL-6，TNFα)(实施例1.1)。

·在肥胖症和糖尿病的广泛使用的小鼠模型中，脑中FGF21的表达导致体重增加、体脂肪率(adiposity)和肝脏重量的明显降低以及进食糖血的完全正常化(实施例1)，改善的胰岛素抵抗，改善的糖耐量和糖异生减少(实施例4)。

·在具有年龄相关性脑病的广泛使用的衰老小鼠模型中，脑中FGF21的表达导致体重增加和肝脏重量明显减少(实施例2)。

·在两种小鼠模型中，下丘脑的炎症都减少了(实施例1、2)。

因此，本文所述的本发明的方面和实施方案解决了本文所讨论的至少一些问题和需求。

基因构建体

在第一方面，提供了一种基因构建体，其包含编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的核苷酸序列。

如本文所述的“基因构建体”具有其通常的和普通的含义，如本领域技术人员鉴于本公开内容的所理解的。“基因构建体”也可以称为“表达盒”或“表达构建体”，是指基因或一组基因，包括编码目的蛋白质的基因，该基因与控制其表达的启动子可操作地连接。本申请的标题为“基本信息”的部分包括关于“基因构建体”的更多详情。如本文所使用的“可操作地连接”在本申请的标题为“基本信息”的部分中进一步描述。

在一些实施方案中，本文所述的基因构建体适合在哺乳动物中表达。如本文所使用的，“适合在哺乳动物中表达”可以意指基因构建体包括一个或多个调控序列，其基于用于表达的哺乳动物宿主细胞而选择，其可操作地连接至待表达的核苷酸序列。优选地，所述用于表达的哺乳动物宿主细胞是人、鼠或犬细胞。

在一些实施方案中，本文所述的基因构建体用于治疗。在优选的实施方案中，本文所述的基因构建体用于治疗和/或预防代谢紊乱。在优选的实施方案中，治疗涉及基因构建体在CNS中，优选在脑中，更优选在下丘脑中表达。在一些实施方案中，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，优选在下丘脑中的表达。因此，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在选自由下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球组成的组的至少一个或至少两个或至少三个或所有脑区域中的表达。在优选的实施方案中，治疗涉及基因构建体在下丘脑中的表达。在一些实施方案中，在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的表达可以意指在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的特异性表达。在实施方案中，表达不涉及在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和/或心脏中的表达。在一些实施方案中，表达不涉及在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和心脏组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中的表达。在标题为“基本信息”的章节提供了CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性表达的描述。

可以按照标题为“基本信息”章节所述评估表达。在标题为“基本信息”章节提供了“CNS”、“脑”和“下丘脑”的描述。

在一些实施方案中，本文所述的基因构建体用于治疗，其中所述基因构建体通过CSF内(脑脊液)施用(通过小脑延髓池，鞘内或脑室内递送)，实质内施用或鼻内施用来施用。优选的施用是CSF内施用。

如本文所使用的，在本申请的标题“基本信息”部分描述了“CSF内施用”、“鼻内施用”、“实质内施用”、“小脑延髓池内施用”、“鞘内施用”和“脑室内施用”。

在一些实施方案中，本文所述的基因构建体包含编码待在CNS中，优选在脑中，更优选在下丘脑中表达的FGF21的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的基因构建体适合在CNS中，优选在脑中，更优选在下丘脑中表达。在一些实施方案中，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的表达。因此，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在选自由下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球组成的组的至少一个或至少两个或至少三个或所有脑区域中的表达。最优选在下丘脑中表达。可以按照标题为“基本信息”章节所述评估表达。

在本发明的实施方案的上下文中，待在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中表达的FGF21；以及适于在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中表达的基因构建体，指与其他器官或组织相比，FGF21在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中优先或优势表达(高出至少10％，高出至少20％，高出至少30％，高出至少40％，高出至少50％，高出至少60％，高出至少70％，高出至少80％，至少90％，高出至少100％，高出至少150％，高出至少200％或更高)。其他器官或组织可以是肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸等。优选地，其他器官是肝脏和/或心脏。在实施方案中，在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和/或心脏中的表达检测不到。在一些实施方案中，在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中的表达检测不到。可以按照标题为“基本信息”章节所述评估表达。

存在于根据本发明的基因构建体中的编码FGF21的核苷酸序列可以衍生自任何FGF21基因或FGF21编码序列，优选来自人、小鼠或狗的FGF21基因或FGF21编码序列；或突变的FGF21基因或FGF21编码序列，优选来自人、小鼠或狗；或密码子优化的FGF21基因或FGF21编码序列，优选来自人、小鼠或狗。

因此，在一些实施方案中，编码FGF21的优选核苷酸序列编码包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、2或3具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性或相似性。SEQ ID NO：1代表人FGF21的氨基酸序列。SEQ ID NO：2代表鼠FGF21的氨基酸序列。SEQ ID NO：3代表犬FGF21的氨基酸序列。在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码FGF21的核苷酸序列与选自由SEQID NO：4、5、6、7、8、9、10或11组成的组的任何序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。

在标题为“基本信息”的章节提供了“同一性”或“序列同一性”和“相似性”或“序列相似性”的描述。

在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码人FGF21的核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、6或7具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。SEQ ID NO：4是编码人FGF21的核苷酸序列。SEQ ID NO：5是密码子优化的编码人FGF21变体1的核苷酸序列。SEQ ID NO：6是密码子优化的编码人FGF21变体2的核苷酸序列。SEQ ID NO：7是密码子优化的编码人FGF21变体3的核苷酸序列。变体1、变体2和变体3编码相同的人FGF21蛋白，并通过不同的密码子优化算法获得。在标题为“基本信息”章节提供了“密码子优化”的描述。

在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码小鼠FGF21的核苷酸序列与SEQ ID NO：8或9具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。SEQ ID NO：8是编码小鼠FGF21的核苷酸序列。SEQ ID NO：9是密码子优化的编码小鼠FGF21的核苷酸序列。

在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码犬FGF21的核苷酸序列与SEQ ID NO：10或11具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。SEQ ID NO：10是编码犬FGF21的核苷酸序列。SEQ ID NO：11是密码子优化的编码犬FGF21的核苷酸序列。

在一些实施方案中，提供了如本文所述的基因构建体，其中编码FGF21的核苷酸序列选自由以下组成的组：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸的序列与SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性或相似性。

(b)核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10或11的核苷酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。

在优选的实施方案中，编码FGF21的核苷酸序列是密码子优化的核苷酸序列，优选密码子优化的人序列，优选选自SEQ ID NO：5、6和7的序列。

如本领域技术人员已知的，由本文描述的核苷酸序列编码的FGF21发挥至少可检测水平的FGF21的活性。FGF21的活性可以表现出抗肥胖和/或抗糖尿病作用，如本文稍后更详细描述的。FGF21的活性也可以是增加胰岛素敏感性。该活性可以通过本领域技术人员已知的方法来评估，例如通过使用胰岛素耐量测试或葡萄糖耐量测试。

在一些实施方案中，编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子。优选的遍在启动子选自CMV启动子和CAG启动子，优选CAG启动子。在一些实施方案中，编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子和在组织中表达的microRNA的至少一个靶序列，在所述组织中，希望防止FGF21的表达。

在标题为“基本信息”章节提供了“遍在启动子”、“可操作地连接”和“microRNA”的描述。如本文所使用的，“在组织中表达的microRNA的靶序列”或“与在组织中表达的microRNA结合的靶序列”或“在组织中表达的microRNA的结合位点”是指与在所述组织中表达的microRNA的至少一部分互补或部分互补的核苷酸序列，如本文其他地方所述。

在一些实施方案中，microRNA的至少一个靶序列选自与在哺乳动物的心脏和/或肝脏中表达的microRNA结合的那些靶序列。

在一些实施方案中，编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子和在肝脏中表达的microRNA的至少一个靶序列和在心脏中表达的microRNA的至少一个靶序列。

如本文所使用的，“在肝脏中表达的microRNA的靶序列”或“与在肝脏中表达的microRNA结合的靶序列”或“在肝脏中表达的microRNA的结合位点”是指与在肝脏中表达的microRNA的至少一部分互补或部分互补的核苷酸序列。类似地，如本文所使用的“在心脏中表达的microRNA的靶序列”或“与在心脏中表达的microRNA结合的靶序列”或“在心脏中表达的microRNA的结合位点”是指与在心脏中表达的microRNA的至少一部分互补或部分互补的核苷酸序列。

如本文所述，在肝脏中表达的microRNA的一部分或在心脏中表达的microRNA的一部分是指所述microRNA的至少四个，至少五个，至少六个或至少七个连续核苷酸的核苷酸序列。结合位点序列可以与表达的microRNA的至少一部分具有完美的互补性，这意味着该序列是完美的匹配而没有发生任何错配。或者，结合位点序列可以与表达的microRNA的至少一部分部分互补，这意味着可能发生四个、五个、六个或七个连续核苷酸中的一个错配。部分互补的结合位点优选包含与microRNA种子区域的完美或接近完美的互补性，这意味着在microRNA的种子区域及其结合位点之间不会发生错配(完美的互补性)或每四个、五个、六个或七个连续核苷酸一个错配(接近完美的互补性)。microRNA的种子区域由microRNA的5'区域的大约第二核苷酸到microRNA的大约第八核苷酸组成。本文所述的部分优选是所述microRNA的种子区域。包含在肝脏中表达的microRNA或在心脏中表达的microRNA的靶序列的信使RNA(mRNA)的降解可能是通过RNA干扰途径或通过mRNA的直接翻译控制(抑制)来实现的。本发明决不受限于miRNA在抑制转基因或编码蛋白表达中最终使用的途径。

在本发明的上下文中，与肝脏中表达的microRNA结合的靶序列可以被核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO：12或14-20具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，在肝脏中表达的microRNA的靶序列可以被核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO：12具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，如SEQID NO：12或14-20中所述，在肝脏中表达的microRNA的靶序列的至少一个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，如在SEQ ID NO：12或14-20中所述，在肝脏中表达的microRNA的靶序列的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在优选的实施方案中，序列miRT-122a(SEQ ID NO：12)的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在肝脏中表达的microRNA的靶序列的优选拷贝数为四个。

如本文所使用的，在肝脏中表达的microRNA的靶序列发挥在肝脏中表达的microRNA的靶序列的至少可检测水平的活性，如本领域技术人员已知的。在肝脏中表达的microRNA的靶序列的活性是与其在肝脏中表达的同源microRNA结合，并且当与转基因可操作地连接时，介导肝脏中转基因表达的脱靶。可以通过本领域技术人员已知的标准测定法，例如qPCR，蛋白质印迹分析或ELISA，通过测量mRNA或蛋白质水平上肝脏中转基因表达的水平来评估该活性。

在本发明的上下文中，在心脏中表达的microRNA的靶序列可以被核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO：13或21-25具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，在心脏中表达的microRNA的靶序列可以被核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO：13具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，如SEQID NO：13或21-25中所述，在心脏中表达的microRNA的靶序列的至少一个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，如SEQ ID NO：13或21-25中所述，在心脏中表达的microRNA的靶序列的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在优选的实施方案中，编码miRT-1(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在心脏中表达的microRNA的靶序列的优选拷贝数为四个。

如本文所使用的，在心脏中表达的microRNA的靶序列发挥在心脏中表达的microRNA的靶序列的至少可检测水平的活性，如本领域技术人员已知的。在心脏中表达的microRNA的靶序列的活性是与其在心脏中表达的同源microRNA结合，并且当与转基因可操作地连接时，介导心脏中转基因表达的脱靶。可以通过本领域技术人员已知的标准测定法，例如qPCR，蛋白质印迹分析或ELISA，通过测量mRNA或蛋白质水平上心脏中转基因表达的水平来评估该活性。

在一些实施方案中，如在SEQ ID NO：12或14-20中所述，在肝脏中表达的microRNA的靶序列的至少一个拷贝，以及如SEQ ID NO：13或21-25中所述在心脏中表达的microRNA的靶序列的至少一个拷贝，存在于本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，如在SEQ ID NO：12或14-20中所述，在肝中表达的microRNA的靶序列的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝，以及如在SEQ ID NO：13或21-25中所述在心脏中表达的microRNA的靶序列的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，编码miRT-122a(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝和编码miRT-1(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝组合在本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，编码miRT-122a(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列的四个拷贝和编码miRT-1(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列的四个拷贝组合在本发明的基因构建体中。

在一些实施方案中，提供了如上所述的基因构建体，其中在肝脏中表达的microRNA的靶序列和在心脏中表达的microRNA的靶序列选自由序列SEQ ID NO：12至25和/或其组合组成的组。在一些实施方案中，提供了如上所述的基因构建体，其中在心脏中表达的microRNA的靶序列选自SEQ ID NO：13和21-25，并且在肝脏中表达的microRNA的靶序列选自SEQ ID NO：12和14-20。在一些实施方案中，提供了如上所述的基因构建体，其中所述基因构建体包含microRNA-122a的靶序列和microRNA-1的靶序列。

在一些实施方案中，本文所述的遍在启动子选自由CAG启动子，CMV启动子，微型CMV启动子，β-肌动蛋白启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，延伸因子1α(EF1α)启动子，早期生长应答因子1(Egr-1)启动子，真核起始因子4A(elF4A)启动子，铁蛋白重链编码基因(FerH)启动子，铁蛋白重光编码基因(FerL)启动子，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)启动子，GRP78启动子，GRP94启动子，热休克蛋白70(hsp70)启动子，遍在蛋白B启动子，SV40启动子，β-驱动蛋白启动子，ROSA26启动子和PGK-1启动子组成的组。

在优选的实施方案中，遍在启动子是CAG启动子。在实施例中证明CAG启动子适合用于根据本发明的基因构建体。在一些实施方案中，CAG启动子包含，基本上由或由与SEQID NO：27具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的遍在启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，CMV启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：28具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。优选地，所述CMV启动子与内含子序列一起使用。在一些实施方案中，内含子序列包含，基本上由或由与SEQ ID NO：26具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的遍在启动子是微型CMV启动子。在一些实施方案中，微型CMV启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：36具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的遍在启动子是EF1α启动子。在一些实施方案中，EF1α启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：37具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的遍在启动子是RSV启动子。在一些实施方案中，RSV启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：38具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至组织特异性启动子。在优选的实施方案中，组织特异性启动子是CNS特异性启动子，更优选脑特异性启动子，最优选下丘脑特异性启动子。

在标题为“基本信息”章节提供了“组织特异性启动子”的描述。

在一些实施方案中，本文所述的CNS特异性启动子选自由突触蛋白1启动子，神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子，酪氨酸羟化酶(TH)启动子，叉头盒A2(FOXA2)启动子，α-互联蛋白(α-internexin)(INA)启动子，巢蛋白(NES)启动子，胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子，乙醛脱氢酶1家族成员L1(ALDH1L1)启动子，髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)启动子，同源盒蛋白9(HB9)启动子和髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子组成的组。

在一些实施方案中，本文所述的脑特异性启动子选自由突触蛋白1启动子，神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子，酪氨酸羟化酶(TH)启动子，叉头盒A2(FOXA2)启动子，α-互联蛋白(INA)启动子，巢蛋白(NES)启动子，胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子，乙醛脱氢酶1家族成员L1(ALDH1L1)启动子，髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)启动子，和髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子组成的组。

在一些实施方案中，下丘脑特异性启动子可以是促性腺激素释放激素(GnRH)启动子。

在优选的实施方案中，CNS和/或脑特异性启动子是突触蛋白1启动子。在一些实施方案中，突触蛋白1启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：39具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的CNS和/或脑特异性启动子是钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子。在一些实施方案中，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：40具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的CNS和/或脑特异性启动子是胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子。在一些实施方案中，胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子包含，基本上由或由与SEQID NO：41具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的CNS和/或脑特异性启动子是巢蛋白启动子。在一些实施方案中，巢蛋白启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：42具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的CNS特异性启动子是同源盒蛋白9(HB9)启动子。在一些实施方案中，同源盒蛋白9(HB9)启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：43具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的CNS和/或脑特异性启动子是酪氨酸羟化酶(TH)启动子。在一些实施方案中，酪氨酸羟化酶(TH)启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：44具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

另一个优选的CNS和/或脑特异性启动子是髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子。在一些实施方案中，髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：45具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，本文所述的CNS、脑和/或下丘脑特异性启动子引导所述核苷酸序列在CNS和/或脑和/或下丘脑的至少一个细胞中表达。优选地，所述启动子引导在CNS和/或脑/或下丘脑的至少10％，20％，30％，40％，40％，60％，70％，80％，90％或100％的细胞中表达。如本文所使用的，CNS和/或脑特异性启动子还涵盖引导在CNS和/或脑的特定区域或细胞亚群中表达的启动子。因此，本文所述的CNS和/或脑特异性启动子也可以引导在海马、小脑、皮质、下丘脑和/或嗅球的至少10％，20％，30％，40％，40％，60％，70％，80％，90％或100％的细胞中表达。可以按照标题为“基本信息”章节所述评估表达。

本文所使用的启动子(特别是当启动子序列被描述为与给定SEQ ID NO具有最小同一性百分比时)应发挥至少本领域技术人员已知的启动子活性。优选地，被描述为与给定SEQ ID NO具有最小同一性百分比的启动子应控制与其可操作地连接的核苷酸序列(即，至少编码FGF21的核苷酸序列)的转录，如在本领域技术人员已知的测定中所评估的那样。例如，这种测定可以涉及测量转基因的表达。可以按照标题为“基本信息”章节所述评估表达。

其他序列可以存在于本发明的基因构建体中。适用于本文的示例性额外的序列包括反向末端重复(ITR)，SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：32)，兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：33)，CMV增强子序列(SEQ ID NO：29)。在本发明的上下文中，“ITR”旨在涵盖一个5′ITR和一个3′ITR，每个都衍生自AAV的基因组。优选的ITR来自AAV2，并由SEQ ID NO：30(5′ITR)和SEQ ID NO：31(3′ITR)表示。在本发明的上下文中，包括使用CMV增强子序列(SEQID NO：29)和CMV启动子序列(SEQ ID NO：28)作为两个单独的序列或作为单个序列(SEQ IDNO：34)。这些另外的序列中的每一个都可以存在于根据本发明的基因构建体中。

任选地，其他核苷酸序列可以可操作地连接至编码FGF21的核苷酸序列，例如编码信号序列、核定位信号、表达增强子等的核苷酸序列。

在一些实施方案中，提供了一种基因构建体，其包含编码FGF21的核苷酸序列，任选地，其中所述基因构建体不包含在希望防止FGF21表达的组织中表达的microRNA的靶序列。

表达载体

可以将本文所述的基因构建体置于表达载体中。因此，在另一方面，提供了一种表达载体，其包含如前述实施方案中任一项所述的基因构建体。在标题为“基本信息”章节提供了“表达载体”的描述。

在一些实施方案中，本文所述的表达载体用于治疗。在优选的实施方案中，本文所述的表达载体用于治疗和/或预防代谢紊乱。在优选的实施方案中，治疗涉及表达载体中包含的基因构建体在CNS中，优选在脑中，更优选在下丘脑中表达。在一些实施方案中，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球，优选下丘脑中的表达。因此，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在选自由下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球组成的组的至少一个或至少两个或至少三个或所有脑区域中的表达。在优选的实施方案中，治疗涉及基因构建体在下丘脑中的表达。在一些实施方案中，在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的表达可以意指在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的特异性表达。在实施方案中，表达不涉及在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和/或心脏中的表达。在一些实施方案中，表达不涉及在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和心脏组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中表达。在标题为“基本信息”的章节提供了CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性表达的描述。

在一些实施方案中，本文所述的表达载体用于治疗，其中所述表达载体通过CSF内(脑脊液)施用(通过小脑延髓池，鞘内或脑室内递送)，实质内施用或鼻内施用来施用。优选的施用是CSF内施用。

在一些实施方案中，表达载体是病毒表达载体。在标题为“基本信息”章节提供了“病毒表达载体”的描述。

病毒载体可以是选自由腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体组成的组的病毒载体。腺病毒载体也称为腺病毒衍生的载体，腺伴随病毒载体也称为腺伴随病毒衍生的载体，逆转录病毒载体也称为逆转录病毒衍生的载体，慢病毒载体也称为慢病毒衍生的载体。优选的病毒载体是腺伴随病毒载体。在标题为“基本信息”章节提供了“腺伴随病毒载体”的描述。

在一些实施方案中，载体是腺伴随载体或腺相关的病毒载体或腺伴随病毒衍生的载体(AAV)，其选自由血清型1的AAV(AAV1)，血清型2的AAV(AAV2)，血清型3的AAV(AAV3)，血清型4的AAV(AAV4)，血清型5的AAV(AAV5)，血清型6的AAV(AAV6)，血清型7的AAV(AAV7)，血清型8的AAV(AAV8)，血清型9的AAV(AAV9)，血清型rh10的AAV(AAVrh10)，血清型rh8的AAV(AAVrh8)，血清型Cb4的AAV(AAVCb4)，血清型rh74的AAV(AAVrh74)，血清型DJ的AAV(AAVDJ)，血清型2/5的AAV(AAV2/5)，血清型2/1的AAV(AAV2/1)，血清型1/2的AAV(AAV1/2)，血清型Anc80的AAV(AAVAnc80)组成的组。

在优选的实施方案中，载体是血清型1、2或9的AAV(AAV1、AAV2或AAV9)。在实施例中证明这些AAV血清型适合用作根据本发明的表达载体。

在优选的实施方案中，表达载体是AAV1或AAV2或AAV9，优选AAV9，并包含基因构建体，所述基因构建体包含编码FGF21的核苷酸序列。更优选地，这种基因构建体包含CAG启动子，所述CAG启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：27具有至少60％的核苷酸序列组成。更优选地，这样的基因构建体包含在组织中表达的microRNA的至少一个靶序列，在该组织中希望阻止FGF21的表达，如本文所述。

在另一个优选的实施方案中，表达载体是AAV1并且包含基因构建体，所述基因构建体包含编码FGF21的核苷酸序列，任选地，其中所述基因构建体不包含microRNA的靶序列。在实施方案中，基因构建体不包含miRNA的靶序列，所述miRNA的靶序列在希望防止FGF21表达的组织中表达。更优选地，这种基因构建体包含CAG启动子，所述CAG启动子包含，基本上由或由与SEQ ID NO：27具有至少60％的核苷酸序列组成。

组合物

在进一步的方面，提供了一种组合物，其包含如上所述的基因构建体和/或如上所述的病毒载体，以及一种或多种药学上可接受的成分。

这样的组合物可以被称为基因治疗组合物。优选地，该组合物是药物组合物。

如本文所使用的，“药学上可接受的成分”包括药学上可接受的载体，填充剂，防腐剂，增溶剂，运载体，稀释剂和/或赋形剂。因此，一种或多种药学上可接受的成分可以选自由药学上可接受的载体，填充剂，防腐剂，增溶剂，运载体，稀释剂和/或赋形剂组成的组。这样的药学上可接受的载体，填充剂，防腐剂，增溶剂，运载体，稀释剂和/或赋形剂可以例如在《雷明顿：药学科学与实践》第22版，药学出版社(2013)中找到。

在一些实施方案中，本文所述的组合物用于治疗。在优选的实施方案中，本文所述的组合物用于治疗和/或预防代谢紊乱。在优选的实施方案中，治疗涉及组合物中包含的基因构建体在CNS中，优选在脑中，更优选在下丘脑中表达。在一些实施方案中，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球，优选下丘脑中的表达。因此，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在选自由下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球组成的组的至少一个或至少两个或至少三个或所有脑区域中的表达。在优选的实施方案中，治疗涉及基因构建体在下丘脑中的表达。在一些实施方案中，在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的表达可以意指在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的特异性表达。在实施方案中，表达不涉及在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和/或心脏中的表达。在一些实施方案中，表达不涉及在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和心脏组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中表达。在标题为“基本信息”的章节提供了CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性表达的描述。

在一些实施方案中，本文所述的组合物用于治疗，其中所述组合物通过CSF内(脑脊液)施用(通过小脑延髓池，鞘内或脑室内递送)，实质内施用或鼻内施用来施用。优选的施用是CSF内施用。

其他化合物可以存在于本发明的组合物中。所述化合物可以帮助递送组合物。在本发明的上下文中，合适的化合物是：能够形成复合物、纳米颗粒、胶束和/或脂质体的化合物，所述复合物、纳米颗粒、胶束和/或脂质体递送如本文所述的每种成分，通过细胞膜复合或捕获在囊泡或脂质体中。这些化合物中的许多是本领域已知的。合适的化合物包括聚乙烯亚胺(PEI)，或类似的阳离子聚合物，包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PEC)和衍生物；合成的两亲化合物(SAINT-18)；脂质体^TM，DOTAP。本领域技术人员将知道哪种制剂类型最适合本文所述的组合物。

方法与用途

在进一步的方面，提供了一种基因构建体，用于治疗，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

进一步提供了的如本文所述的表达载体，用于治疗，其中所述治疗涉及包含在表达载体中的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

进一步提供了如本文所述的药物组合物，用于治疗，其中所述治疗涉及包含在药物组合物中的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在一些实施方案中，如本文所述的基因构建体和/或如本文所述的表达载体和/或如本文所述的药物组合物用于治疗和/或预防代谢紊乱，优选肥胖症和/或糖尿病，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在另一方面，提供了一种治疗方法，其包括施用本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物，其中所述方法涉及如本文所述的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在一些实施方案中，施用基因构建体、表达载体或药物组合物是指向有需要的受试者施用治疗有效量的基因构建体、表达载体或药物组合物。

在一些实施方案中，提供了一种治疗方法，其包括施用本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物，其中所述方法用于治疗和/或预防代谢紊乱，并且涉及本文所述的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在另一方面，提供了本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物涉及如本文所述的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在一些实施方案中，提供了本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防代谢紊乱，并且涉及如本文所述的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在另一方面，提供了本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物在药物治疗中的用途，其中所述药物治疗涉及如本文所述的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在一些实施方案中，提供了本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物在药物治疗中的用途，其中所述药物治疗用于治疗和/或预防代谢紊乱，并且涉及如本文所述的基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中表达。

在使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，“涉及基因构建体的表达”可以被“引起基因构建体的表达”或“诱导基因构建体的表达”代替。

在使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，疗法和/或治疗和/或药物可能涉及基因构建体在CNS中，优选在脑中，更优选下丘脑中表达。在一些实施方案中，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球，优选在下丘脑中的表达。因此，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在选自由下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球组成的组的至少一个或至少两个或至少三个或所有脑区域中的表达。在优选的实施方案中，治疗涉及基因构建体在下丘脑中的表达。在一些实施方案中，在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的表达可以意指在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的特异性表达。在实施方案中，表达不涉及在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和/或心脏中的表达。在一些实施方案中，表达不涉及在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和心脏组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中表达。在标题为“基本信息”的章节提供了CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性表达的描述。

在使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，可以通过CSF内(脑脊液)施用(通过小脑延髓池，鞘内或脑室内给药)施用基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物。

在使用基因构建体、使用表达载体、使用药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，可以通过实质内施用施用基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物。

在使用基因构建体、使用表达载体、使用药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，可以通过鼻内施用施用基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物。

在使用基因构建体、使用表达载体、使用药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，疗法和/或治疗和/或药物可用于治疗和/或预防代谢紊乱，优选肥胖症和/或糖尿病。也可以包括代谢紊乱的并发症。

代谢紊乱可能包括代谢综合征，糖尿病，肥胖症，肥胖相关合并症，糖尿病相关合并症，高血糖症，胰岛素抵抗，葡萄糖耐受不良，脂肪肝，酒精性肝病(ALD)，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非-酒精性脂肪性肝炎(NASH)，冠心病(CHD)，高脂血症，动脉粥样硬化，内分泌病变，骨少肌性肥胖综合征(OSO)，糖尿病肾病，慢性肾病(CKD)，心脏肥大，糖尿病性视网膜病变，糖尿病性肾病，糖尿病性神经病变，关节炎，败血症，眼部新血管形成，神经变性，痴呆，也可能包括抑郁症，腺瘤，癌。

糖尿病可包括前驱糖尿病，高血糖症，1型糖尿病，2型糖尿病，年轻人的成年发病型糖尿病(MODY)，单基因糖尿病，新生儿糖尿病，妊娠糖尿病，脆性糖尿病，特发性糖尿病，药物或化学诱导的糖尿病，僵人综合征，脂肪萎缩性糖尿病，成人潜伏性自身免疫性糖尿病(LADA)。

肥胖症可能包括超重，中/上身肥胖，外周/下身肥胖，病态肥胖，骨少肌性肥胖综合症(OSO)，小儿肥胖，孟德尔(单基因)综合征性肥胖，孟德尔非综合征性肥胖，多基因肥胖。

优选的代谢紊乱是肥胖症和/或糖尿病。

在优选的实施方案中，不必重复本文所述药物的治疗或疗法或使用或施用。在一些实施方案中，本文所述的药物的治疗或疗法或用途或施用可以每年或每2、3、4、5、6、7、8、9或10年重复，包括任意两个列出的值、年份之间的间隔。

被治疗的受试者可以是高等哺乳动物，例如猫，啮齿动物(优选小鼠，大鼠，沙鼠和豚鼠，更优选小鼠和大鼠)，狗或人。

在使用基因构建体、使用表达载体、使用药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物优选显示出抗糖尿病作用和/或抗肥胖症作用。

当增加血液中葡萄糖的处理量和/或改善葡萄糖耐量和/或增加胰岛素敏感性时，可以实现抗糖尿病作用。这可以使用本领域技术人员已知的技术来评估，例如测量糖血，胰岛素血症和/或进行胰岛素耐量测试和/或葡萄糖耐量测试，例如在实验部分中进行的测量。在本文中，“增加”(分别为“改善”)是指使用本领域技术人员已知的测定法至少可检测到的增加(分别为可检测的改善)。所述增加可以是至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％的增加，使用诸如测量糖血，胰岛素血症和/或进行胰岛素耐量测试和/或葡萄糖耐量测试的测定。

当体重、体重增加和/或体脂肪百分比降低时，可以实现抗肥胖症作用。当体重指数(BMI)，腰围，腰臀比(WHR)和/或腰高比(WHtR)降低时，也可以实现抗肥胖症作用。当诸如肝脏的组织的重量减少时，也可以实现抗肥胖症作用。这可以使用本领域技术人员已知的技术来评估，例如如在实验部分中进行。在该上下文中，“减少”(分别是“改善”)是指使用本领域技术人员已知的测定法，例如在实验部分中进行的测定，至少可检测到的减少(分别是可检测的改善)。抗肥胖症作用包括预防肥胖症和逆转肥胖症。

当典型症状(例如，胰岛炎，β细胞损失，β细胞群减少，体重增加)的进展减慢时，如医师所评估的，也可能观察到抗糖尿病作用和/或抗肥胖症作用。典型症状的减轻可能意味着症状发展进展减慢或症状完全消失。可以使用多种方法来评估症状，以及症状的减轻，这些方法在很大程度上与诊断糖尿病和/或肥胖症所使用的方法相同，包括临床检查和常规实验室检查。这些方法包括宏观和微观方法，以及分子方法，射线照相方法如X射线，生化方法，免疫组织化学方法和其他方法。β细胞损失和/或β细胞群的减少可以使用免疫组织化学方法来评估，优选地在实验部分中进行。

当评估减轻的全身性炎症(减少促炎性细胞因子如F4/80，IL-6，TNFα)时，还可观察到抗糖尿病作用和/或抗肥胖症作用。在本文中，“减少”是指使用本领域技术人员已知的测定法至少可检测到的减少。减少可以是减少至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％，使用诸如本领域技术人员已知的技术，优选实验部分中使用的技术(即RTPCR)，使用例如测量促炎性细胞因子例如F4/80，IL-6和/或TNFα的测定。

在使用基因构建体、使用表达载体、使用药物组合物，根据本发明的方法和用途的上下文中，本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物优选减轻个体、所述个体的细胞、组织或器官中代谢紊乱例如糖尿病和/或肥胖症的一种或多种症状，或缓解所述个体的细胞、组织或器官的一种或多种特征或症状。

如本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物优选地能够减轻患者或所述患者的细胞、组织或器官的症状或特征，如果使用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物治疗在至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间后，所述症状或特征已减少(例如不再可检测或减慢)，如本文所述。

如本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物可以适合于施用至受代谢紊乱影响或具有患代谢紊乱的风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，所述代谢紊乱例如糖尿病和/或肥胖症，并且可以体内、离体或体外施用。可以将所述基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物直接或间接地施用于受代谢紊乱影响或具有患代谢紊乱的风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，所述代谢紊乱例如糖尿病和/或肥胖症，可以在体内、离体或体外直接或间接施用。

施用方式可以是静脉内，肌内，鞘内，脑室内，腹膜内，通过吸入，鼻内，眼内和/或实质内施用。优选的施用方式是鼻内，实质内和CSF内(通过小脑延髓池，鞘内或脑室内递送)施用。最优选CSF内施用。

本发明的病毒表达构建体和/或病毒载体和/或核酸分子和/或组合物可以使用本领域已知的合适方法直接或间接施用。考虑到迄今为止已经实现的进展，可以预期向个体或所述个体的细胞、组织、器官提供本发明的病毒表达构建体和/或病毒载体和/或核酸分子和/或组合物的手段的改进。当然，可以结合这种未来的改进以实现本发明的上述效果。病毒表达构建体和/或病毒载体和/或核酸分子和/或组合物可以递送至个体，所述个体的细胞、组织或器官。取决于疾病或病况，所述个体的细胞、组织或器官可以如本文先前所述。当施用本发明的病毒表达构建体和/或病毒载体和/或核酸分子和/或组合物时，优选这样的病毒表达构建体和/或载体和/或核酸和/或组合物是溶解在与递送方法兼容的溶液中。

如本文所涵盖的，治疗有效剂量的如上所述的病毒表达构建体、载体、核酸分子和/或组合物优选以单一且独特的剂量施用，从而避免了重复的定期施用。

基本信息

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员惯常和通常理解的含义相同的含义，并且鉴于本公开而阅读。

序列同一性/相似性

在本发明的上下文中，核酸分子例如编码FGF21的核酸分子由编码蛋白质片段或多肽或肽或衍生肽的核酸或核苷酸序列表示。在本发明的上下文中，FGF21蛋白片段或作为成纤维细胞生长因子21(FGF21)的多肽或肽或衍生肽由氨基酸序列表示。

应该理解的是，本文中通过给定的序列身份编号(SEQ ID NO)鉴定的每个核酸分子或蛋白质片段或多肽或肽或衍生的肽或构建体不限于所公开的该特定序列。本文所鉴定的每个编码序列编码给定的蛋白质片段或多肽或肽或衍生的肽或构建体，或者其本身是蛋白质片段或多肽或构建体或肽或衍生的肽。在本申请全文中，每次提及编码给定蛋白质片段或多肽或肽或衍生肽的特定核苷酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO：X为例)，都可以用以下取代：

i.核苷酸序列，其包含与SEQ ID NO：X具有至少60％序列同一性的核苷酸序列；

ii.核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而与(i)的核酸分子的序列不同；或

iii.核苷酸序列，其编码与由核苷酸序列SEQ ID NO：X编码的氨基酸序列具有至少60％的氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。

在本申请全文中，每次提及特定的氨基酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO：Y为例)，都可以用以下代替：多肽，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO：Y具有至少60％序列同一性或相似性的氨基酸序列。

在进一步优选的实施方式中，借助于其与给定核苷酸序列或氨基酸序列的同一性或相似性百分比(至少60％)的本文描述的每个核苷酸序列或氨基酸序列分别与给定核苷酸或氨基酸序列具有至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性或相似性。

每个非编码核苷酸序列(即启动子或另一个调控区的)可以被核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与特定核苷酸序列SEQ ID NO(取SEQ ID NO:A为例)具有至少60％的序列同一性或相似性的核苷酸序列。优选的核苷酸序列与SEQ ID NO：A具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在优选的实施方案中，如本领域技术人员已知的，此类非编码核苷酸序列例如启动子表现出或发挥至少这种非编码核苷酸序列的活性例如启动子的活性。

术语“同源性”，“序列同一性”，“同一性”等在本文可互换使用。序列同一性在本文中描述为通过比较序列确定的两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。两个氨基酸序列之间的“相似性”或“序列相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较来确定的。可以通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，包括但不限于Bioinformatics andthe Cell:Modern Computational Approaches in Genomics,Proteomics andtranscriptomics,Xia X.,Springer International Publishing,New York,2018；和Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis,Mount D.,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,2004中描述的那些。

可以根据两个给定SEQ ID NO的全长或其部分来计算序列同一性或相似性。在一些实施方案中，其部分是指两个SEQ ID NO.的至少50％，60％，70％，80％，90％或100％。在优选的实施方案中，通过比较本文鉴定的序列的全长来确定序列同一性或相似性。除非本文另外指出，与给定SEQ ID NO的同一性或相似性是指基于所述序列的全长(即，在其整个长度或整体上)的同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，如通过这种序列链的之间的匹配确定的。

取决于两个序列的长度，可以使用全局或局部比对算法通过两个肽或两个核苷酸序列的比对来确定序列同一性或相似性。优选使用全局比对算法(例如，Needleman-Wunsch)对相似长度的序列进行比对，所述全局比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而优选地，使用局部比对算法(例如，Smith-Waterman)对基本上不同长度的序列进行比对。当序列(例如，使用默认参数通过程序EMBOSS Needle或EMBOSS water进行最佳比对)共享至少某最小百分比的序列同一性或相似性(如下面所描述的)时，序列被称为“大体上相同”或“实质上相似”。

当两个序列具有相似的长度时，全局比对适合用于确定序列同一性或相似性。当序列的总体长度大体不同时，优选局部比对(例如使用Smith-Waterman算法的比对)。EMBOSS Needle使用Needleman-Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度(全长)上进行比对，使得匹配数最大且空位数最小。EMBOSS water使用Smith-Waterman局部比对算法。通常，使用EMBOSS needle和EMBOSS water默认参数，空位开放罚分＝10(核苷酸序列)/10(蛋白质)，空位延伸罚分＝0.5(核苷酸序列)/0.5(蛋白质)。对于核苷酸序列，使用的默认评分矩阵是DNAfull，而对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。

备选地，可以通过使用诸如FASTA，BLAST等的算法通过对公共数据库进行搜索来确定相似性或同一性百分比。因此，本发明的一些实施方案的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以对公共数据库执行搜索，以例如识别其他家庭成员或相关序列。可以使用Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTn和BLASTx程序(版本2.0)执行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数。请访问国家生物技术信息中心的主页，该中心可从以下网站访问：www.ncbi.nlm.nih.gov/。

任选地，在确定氨基酸相似性时，本领域技术人员还可以考虑所谓的保守氨基酸取代。

如本文所使用的，“保守”氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。下表列出了用于保守取代的氨基酸残基类别的实例。

酸性残基	Asp(D)和Glu(E)
		碱性残基	Lys(K)、Arg(R)和His(H)
亲水性不带电残基	Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)
		脂肪族不带电残基	Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)
非极性不带电残基	Cys(C)、Met(M)和Pro(P)
		芳香族残基	Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)

替代的保守氨基酸残基取代类别：

氨基酸残基的其他物理和功能分类：

例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有酰胺基侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中公开的序列中的至少一个残基已被去除并且在其位置插入了不同残基的那些。优选地，氨基酸变化是保守的。每个天然存在氨基酸的优选保守取代如下：Ala取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser或Ala；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Pro；His取代为Asn或Gln；Ile取代为Leu或Val；Leu取代为Ile或Val；Lys取代为Arg；Gln或Glu；Met取代为Leu或Ile；Phe取代为Met、Leu或Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp或Phe；和Val取代为Ile或Leu。

基因或编码序列

术语“基因”是指包含区域(转录区域)的DNA片段，该区域被转录成细胞中的RNA分子(例如mRNA)，并与合适的调控区域(例如启动子)可操作地连接。基因通常将包含几个可操作地连接的片段，例如启动子，5′前导序列，编码区和3′非翻译序列(3′末端)，例如包含聚腺苷酸化和/或转录终止位点。嵌合或重组基因(例如FGF21基因)是通常在自然界中不存在的基因，例如其中启动子本质上不与部分或全部转录的DNA区域缔合。“基因的表达”是指这样的过程，其中将与适当的调控区域特别是启动子可操作地连接的DNA区域转录成具有生物学活性的RNA，即能够被翻译成生物学活性蛋白或肽的RNA。

“转基因”在本文中被描述为新引入细胞中的基因或编码序列或核酸分子(即编码FGF21的分子)，即可能存在但通常不表达或在细胞中表达不足的基因。在本上下文中，“不足”是指尽管所述FGF21在细胞中表达，但仍可发展如本文所述的病症和/或疾病。在这种情况下，本发明允许FGF21的过表达。转基因可包括对细胞天然的序列，天然不会发生在细胞中的序列，并且它可以包括两者的组合。转基因可以含有编码用于FGF21和/或额外的蛋白质的序列，如本文所鉴定的，其可以与适当的调控序列可操作地连接，用于编码FGF21的序列在细胞中的表达。优选地，转基因未整合到宿主细胞的基因组中。

启动子

如本文所使用的，术语“启动子”或“转录调控序列”是指用于控制一个或多个编码序列的转录的核酸片段，并且位于编码序列的转录起始位点的转录方向上游，通过存在用于DNA依赖性RNA聚合酶，转录起始位点和任何其他DNA序列的结合位点在结构上鉴定，包括但不限于转录因子结合位点，阻遏物和活化蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的任何其他核苷酸序列，用于直接或间接地调控从启动子转录的量。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是一种在生理学或发育学上受调控的启动子，例如，通过应用化学诱导剂进行调控。

“遍在启动子”在基本上生物体的所有组织、器官和细胞中有活性。

“器官特异性”或“组织特异性”启动子是分别在特定类型的器官或组织中有活性的启动子。器官特异性和组织特异性启动子主要在一个器官或组织中调节一种或多种基因(或编码序列)的表达，但也可以在其他器官或组织中允许可检测的水平(“泄漏”)表达。如通过本领域技术人员已知的标准测定(例如qPCR，Western印迹分析，ELISA)对mRNA或蛋白质的水平所评估的，与器官特异性或组织特异性表达相比，其他器官或组织中的泄漏表达意味着低至少一倍，至少两倍，至少三倍，至少四倍或至少五倍，但仍然是可检测到的表达。可以检测到泄漏表达的器官或组织的最大数量是五个，六个，七或八个。

“CNS或脑或下丘脑特异性启动子”是能够在CNS和/或脑和/或下丘脑中启动转录的启动子，同时仍然允许在身体的其它器官和部位中任何泄漏的表达(最多五，六，七或八个)。CNS和/或脑和/或下丘脑中的转录可以在相关区域中检测到，例如下丘脑，皮质，海马，小脑和嗅球，以及细胞，例如神经元和/或胶质细胞。

在本发明的上下文中，CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性启动子可以是与其他器官或组织相比，能够驱动FGF21优先或主要(高至少10％，高至少20％，高至少30％，高至少40％，高至少50％，高至少60％，高至少70％，高至少80％，高至少90％，高至少100％，高至少150％，高至少200％或更多)在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中表达的启动子。其他器官或组织可以是肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸等。优选地，其他器官是肝脏和心脏。可以按照标题为“基本信息”章节在其它地方所述评估表达。

在整个申请中，在表达的上下文中，在提到CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性时，还分别设想组成CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球的细胞类型的细胞型特异性表达。

可操作地连接

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件在功能关系中的连接。当核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，该核酸是“可操作地连接”。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则该转录调控序列可操作地连接到编码序列。可操作地连接意味着所连接的DNA序列通常是连续的，在必要时连接阅读框中连续的两个蛋白质编码区域。连接可以通过在方便的限制性位点连接或代替插入的衔接子或接头或通过基因合成来实现。

microRNA

如本文所使用的，鉴于本公开的内容，“microRNA”或“miRNA”或“miR”具有本领域技术人员所理解的惯常和普通含义。microRNA是在植物、动物和一些病毒中发现的小型非编码RNA分子，其可在RNA沉默和基因表达后的转录后调控中起作用。microRNA的目标序列可以表示为“miRT”。例如，microRNA-1或miRNA-1或miR-1的靶序列可以表示为miRT-1。

蛋白质和氨基酸

术语“蛋白质”或“多肽”或“氨基酸序列”可互换使用，并指的是由氨基酸链组成的分子，不参考特定的作用方式、尺寸、三维结构或起源。在如本文所述的氨基酸序列中，氨基酸或“残基”由三个字母的符号表示。这些三字母的符号以及相应的单字母符号是本领域技术人员所熟知的，并且具有以下含义：A(Ala)是丙氨酸，C(Cys)是半胱氨酸，D(Asp)是天冬氨酸，E(Glu)是谷氨酸，F(Phe)是苯丙氨酸，G(Gly)是甘氨酸，H(His)是组氨酸，I(Ile)是异亮氨酸，K(Lys)是赖氨酸，L(Leu)是亮氨酸，M(Met)是甲硫氨酸，N(Asn)是天冬酰胺，P(Pro)是脯氨酸，Q(Gln)是谷氨酸，R(Arg)是精氨酸，S(Ser)是丝氨酸，T(Thr)是苏氨酸，V(Val)是缬氨酸，W(Trp)是色氨酸，Y(Tyr)是酪氨酸。残基可以是任何蛋白氨基酸，也可以是任何非蛋白氨基酸例如D-氨基酸和通过翻译后修饰形成的修饰的氨基酸，以及任何非天然氨基酸。

CNS和脑

如本文所使用的，“中枢神经系统”或“CNS”是指包括脑和脊髓的神经系统的一部分，向其传播感觉脉冲和运动脉冲从其通过，并且协调整个神经系统的活动。

如本文所使用的，“脑”是指神经系统的中枢器官，由大脑、脑干和小脑组成。它控制了大多数身体的活动，处理，集成以及协调它从感知器官接收的信息，并为发送到身体其余部分的指示做出决定。

特别地，如本文所使用的，“下丘脑”是指丘脑下方的前脑区域，其协调自主神经系统和垂体的活动，控制体温、口渴、饥饿和其他稳态系统的活动，以及参与睡眠和情绪活动。

基因构建体

如本文所述的基因构建体可以使用本领域技术人员已知的任何克隆和/或重组DNA技术制备，其中编码所述FGF21的核苷酸序列在合适的细胞中表达，例如，培养的细胞或多细胞生物体的细胞，如在Ausubel等，"Current Protocols in Molecular Biology",Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)和Sambrook和Russell(2001，上述)中所描述的；两者都通过引用整体并入本文。还参见Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82:488(描述定点诱变)和Roberts等(1987)Nature 328:731-734或Wells,J.A.,et al.(1985)Gene 34:315(描述盒式诱变)。

表达载体

短语“表达载体”或“载体”通常是指能够在与这些序列相容的宿主中实现基因或编码序列的表达的核苷酸序列。表达载体携带能够在细胞中稳定并保持游离的基因组。在本发明的上下文中，细胞可能意味着包括用于制备构建体的细胞或其中将施用构建体的细胞。或者，载体能够整合到细胞的基因组中，例如通过同源重组或其他方式。

这些表达载体通常包括至少合适的启动子序列和任选的转录终止信号。如本文所述，也可以使用必要或有助于实现表达的额外因素。编码FGF21的核酸或DNA或核苷酸序列掺入能够导入并在体外细胞培养中表达的DNA构建体中。具体地，DNA构建体适用于原核宿主中的复制，例如细菌，例如大肠杆菌，或者可以被引入培养的哺乳动物、植物、昆虫(例如，Sf9)、酵母、真菌或其他真核细胞系中。

制备用于引入特定宿主的DNA构建体可包括由宿主识别的复制系统，编码所需多肽的预期DNA段，以及与多肽编码区段可操作地连接的转录和翻译起始和终止调控序列。本文已经描述了术语“可操作连接”。例如，如果启动子或增强子刺激序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接。如果信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则信号序列的DNA与编码多肽的DNA可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在信号序列的情况下，连续且在阅读框中。然而，增强子不需要与它们控制转录的编码序列连续。连接是通过在方便的限制性位点连接或代替插入衔接子或接头或通过基因合成来实现的。

合适的启动子序列的选择通常取决于选择用于表达DNA区段的宿主细胞。合适的启动子序列的实例包括本领域熟知的原核以及真核启动子(参见，例如，Sambrook和Russell，2001，同上)。转录调控序列通常包括由宿主识别的异源增强子或启动子。适当的启动子的选择取决于宿主，但是，诸如trp、lac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子的启动子是已知的和可用的(参见，例如，Sambrook和Russell，2001年，同上)。表达载体包括复制系统和转录和翻译调控序列以及用于多肽编码区段的插入部位。在大多数情况下，复制系统仅在用于制备载体(细菌细胞如大肠杆菌)的细胞中起作用。大多数质粒和载体不会在感染载体的细胞中复制。细胞系和表达载体的可行性组合的实例描述于Sambrook和Russell(2001，同上)和Metzger等，(1988)Nature 334:31-36。例如，合适的表达载体可以在酵母例如酿酒酵母(S.Cerevisiae)，例如昆虫细胞，例如Sf9细胞，哺乳动物细胞，例如CHO细胞和细菌细胞，例如大肠杆菌中表达。因此，细胞可以是原核或真核宿主细胞。细胞可以是适于在液体或固体培养基上培养的细胞。

或者，宿主细胞是一种细胞，其是多细胞生物例如转基因植物或动物的一部分。

病毒载体

病毒载体或病毒表达载体、病毒基因治疗载体是包含如本文所述的基因构建体的载体。

病毒载体或病毒基因治疗载体是适用于基因治疗的载体。适用于基因治疗的载体描述于Anderson 1998,Nature 392:25-30；Walther and Stein,2000,Drugs 60:249-71；Kay et al.,2001,Nat.Med.7:33-40；Russell,2000,J.Gen.Virol.81:2573-604；Amadoand Chen,1999,Science 285:674-6；Federico,1999,Curr.Opin.Biotechnol.10:448-53；Vigna and Naldini,2000,J.Gene Med.2:308-16；Marin et al.,1997,Mol.Med.Today 3:396-403；Peng and Russell,1999,Curr.Opin.Biotechnol.10:454-7；Sommerfelt,1999,J.Gen.Virol.80:3049-64；Reiser,2000,Gene Ther.7:910-3和其中引用的文献。

特别合适的基因治疗载体包括腺病毒和腺伴随病毒(AAV)载体。这些载体感染了大量分裂和非分裂细胞类型，包括滑膜细胞和肝脏细胞。进入细胞后腺病毒和AAV载体的游离性质使得这些载体适用于治疗应用(Russell,2000,J.Gen.Virol.81:2573-2604；Goncalves,2005,Virol J.2(1):43)，如上所述。AAV载体是甚至更优选的，因为已知它们导致转基因表达的非常稳定的长期表达(狗中最多9年(Niemeyer et al,Blood.2009Jan 22；113(4):797-806)和人中约10年(Buchlis,G.et al.,Blood.2012Mar29；119(13):3038-41)。优选的腺病毒载体被修饰为降低宿主响应，如Russell(2000，同上)所综述的。使用AAV载体的基因治疗方法描述于Wang et al.,2005,J Gene Med.March 9(印刷前电子出版),Mandel et al.,2004,Curr Opin Mol Ther.6(5):482-90和Martin et al.,2004,Eye 18(11):1049-55,Nathwani et al,N Engl J Med.2011Dec 22；365(25):2357-65，Apparailly et al,Hum Gene Ther.2005Apr；16(4):426-34。

另一个合适的基因治疗载体包括逆转录病毒载体。用于本发明的优选的逆转录病毒载体是基于慢病毒的表达构建体。慢病毒载体有能力感染并稳定地整合到分裂和非分裂细胞的基因组(Amado and Chen,1999Science285:674-6)。基于慢病毒的表达构建体的构建和使用方法描述于美国专利号6,165,782，6,207,455，6,218,181，6,277,633和6,323,031和Federico中(1999,Curr Opin Biotechnol 10:448-53)，以及Vigna et al.(2000,JGene Med2000；2:308-16)。

其他合适的基因治疗载体包括腺病毒载体、疱疹病毒载体、多瘤病毒载体或痘苗病毒载体。

腺伴随病毒载体(AAV载体)

术语“腺伴随病毒”、“AAV病毒”、“AAV病毒粒子”，“AAV病毒颗粒”和“AAV颗粒”，用作本文的同义词，指由AAV的至少一个衣壳蛋白(优选地由特定AAV血清型的所有衣壳蛋白组成)和AAV基因组的包封多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含侧翼为AAV反向末端重复序列的异源多核苷酸(即与野生型AAV基因组不同的多核苷酸，例如待递送到哺乳动物细胞的转基因)，则它们通常称为“AAV载体颗粒”或“AAV病毒载体”或“AAV载体”。AAV是指属于细小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependovirus)的病毒。AAV基因组的长度约为4.7kb，它由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)组成，所述单链脱氧核糖核酸可以是阳性或阴性可检测的。本发明还包括使用双链AAV，也称为dsAAV或scAAV。基因组包括在DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)，以及两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。该框rep由四个重叠基因组成，其编码AAV生命周期所需的蛋白质Rep。框cap含有与衣壳蛋白重叠的核苷酸序列：VP1、VP2和VP3，其相互作用以形成二十面体对称的衣壳(参见Carter and Samulski.,2000和Gaoet al,2004)。

优选的病毒载体或优选的基因治疗载体是AAV载体。本文所使用的AAV载体优选包含重组AAV载体(rAAV载体)。如本文所使用的“rAAV载体”是指包含源自如本文所述的AAV血清型的衣壳蛋白的蛋白质壳中包裹的AAV基因组部分的重组载体。AAV基因组的一部分可含有衍生自腺伴随病毒血清型的反向末端重复序列(ITR)，例如AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5等。优选的ITR是AAV2的ITR，其代表序列包含，基本上由，或由SEQ ID NO：30(5'ITR)和SEQID NO：31(3'ITR)组成。本发明还优选地涵盖了使用与作为5'ITR的SEQ ID NO：30具有至少80％(或至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％)的同一性的序列和与作为3'ITR的SEQ ID NO：31具有至少80％(或至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％)的同一性的序列。

由衣壳蛋白组成的蛋白质壳可以衍生自任意AAV血清型。蛋白质壳也可以命名为衣壳蛋白壳。rAAV载体可以具有一种或优选所有野生型AAV基因缺失，但仍包含功能性ITR核酸序列。功能性ITR序列是AAV病毒体的复制、拯救和包装所必需的。ITR序列可以是野生型序列，或者可以与野生型序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性或可以通过例如插入、突变、缺失或替代核苷酸来改变，只要它们仍然具有功能。在该上下文中，功能性是指能够引导基因组包装到衣壳壳中，然后允许在待感染宿主细胞或靶细胞中表达。在本发明的上下文中，衣壳蛋白壳可以具有与rAAV载体基因组ITR不同的血清型。

由所选择的核酸序列表示的核酸分子优选插入rAAV基因组或如上面鉴定的ITR序列之间，例如表达构建体，其包含与编码序列和3'终止序列可操作地连接的表达调控元件。所述核酸分子也可以称为转基因。

“AAV辅助功能”通常是指提供给反式rAAV载体的rAAV复制和包装所需的相应AAV功能。AAV辅助功能补充了rAAV载体缺少的AAV功能，但它们缺少AAV ITR(由rAAV载体基因组提供)。AAV辅助功能包括AAV的两个主要ORF，即rep编码区域和cap编码区域或其功能基本相同的序列。Rep和Cap区域在本领域中是众所周知的，参见例如Chiorini等(1999,J.ofVirology,Vol 73(2):1309-1319)或US 5,139,941，通过引用并入本文。AAV辅助功能可以在AAV辅助构建体上提供。在宿主细胞中引入辅助构建体可以例如通过在引入本文所鉴定的rAAV载体中存在的rAAV基因组之前或同时转化、转染或转导发生。因此，可以选择本发明的AAV辅助构建体，使得它们在一方面产生rAAV载体衣壳蛋白壳所需的血清型组合，另一方面产生在所述rAAV载体复制和包装中存在的rAAv基因组所需的的血清型组合。

“AAV辅助病毒”提供AAV复制和包装所需的额外功能。合适的AAV辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(如HSV类型1和2)和痘苗病毒。辅助病毒提供的额外功能也可以通过质粒引入宿主细胞中，如US6,531,456中所述，通过引用纳入本文。

“转导”是指通过病毒载体将FGF21递送到受体宿主细胞中。例如，通过本发明的rAAV载体转导靶细胞导致将载体中含有的rAAV基因组转移到转导的细胞中。“宿主细胞”或“靶细胞”是指DNA递送发生的细胞，例如受试者的肌肉细胞。AAV载体能够转导分裂和非分裂细胞两者。

产生AAV载体

先前已经描述了用于载体化转基因的重组AAV(rAAV)的产生。参见Ayuso E,etal.,Curr.Gene Ther.2010；10:423-436,Okada T,et al.,Hum.Gene Ther.2009；20:1013-1021,Zhang H,et al.,Hum.Gene Ther.2009；20:922-929和Virag T,et al.,Hum.GeneTher.2009；20:807-817。可以使用或修改这些方案以产生本发明的AAV。在一个实施方案中，生产细胞系用本发明的多核苷酸(包含侧翼为ITR的表达盒)，和编码rep和cap蛋白并提供辅助功能的构建体瞬时转染。在另一个实施方案中，细胞系稳定地供应辅助功能，并且用本发明的多核苷酸(包含侧翼为ITR的表达盒)和编码rep和cap蛋白的构建体瞬时转染。在另一个实施方案中，细胞系稳定地供应rep和cap蛋白和辅助功能，并且用本发明的多核苷酸瞬时转染。在另一个实施方案中，细胞系稳定地供应rep和cap蛋白，并且用本发明的多核苷酸和编码辅助功能的多核苷酸瞬时转染。在又一个实施方案中，细胞系稳定地供应本发明的多核苷酸，rep和cap蛋白和辅助功能。本领域已经描述了制造和使用这些和其他AAV生产系统的方法。参见Muzyczka N,et al.,US 5,139,941,Zhou X,et al.,US 5,741,683,Samulski R,et al.,US 6,057,152,Samulski R,et al.,US 6,204,059,Samulski R,etal.,US6,268,213,Rabinowitz J,et al.,US 6,491,907,Zolotukhin S,et al.,US6,660,514,Shenk T,et al.,US 6,951,753,Snyder R,et al.,US 7,094,604,Rabinowitz J,etal.,US 7,172,893,Monahan P,et al.,US 7,201,898,Samulski R,et al.,US 7,229,823和Ferrari F,et al.,US 7,439,065。

存在于rAAV载体中的rAAV基因组包括至少AAV血清型中的一个的反向末端重复区域(ITR)的核苷酸序列(优选在本文前面公开的血清型AAV2之一)，或基本上相同的核苷酸序列或与其具有至少60％同一性的核苷酸序列，以及编码FGF21的核苷酸序列(在适当的调控元件的控制下)插入两个ITR之间。载体基因组需要使用侧翼5'和3'ITR序列，以允许载体基因组有效包装到rAAV衣壳中。

已经测序了几个AAV血清型的完整基因组和相应的ITR(Chiorini et al.1999,J.of Virology Vol.73,No.2,p1309-1319)。它们可以通过本领域已知的克隆或化学合成制成，使用例如Applied Biosystems Inc.(Fosters,CA,USA)提供的寡核苷酸合成仪或标准分子生物学技术。ITR可以从AAV病毒基因组中克隆或从包含AAV ITR的载体中切除。ITR核苷酸序列可以使用标准分子生物学技术连接在编码一种或多种治疗蛋白的核苷酸序列的任一个末端，或者ITR之间的AAV序列可以用所需的核苷酸序列代替。

优选地，rAAV载体中存在的rAAV基因组不包含编码病毒蛋白的任何核苷酸序列，例如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。该rAAV基因组可以进一步包含标志物或报告基因，例如本领域已知的编码抗生素抗性基因，荧光蛋白(例如gfp)或编码化学、酶或其他可检测的和/或可选择的产品的基因(例如lacZ，aph等)。

存在于所述rAAV载体中的rAAV基因组还包含与编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。

合适的3'未翻译的序列也可以与编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接。合适的3'未翻译的区域可以是与核苷酸序列天然相关的那些，或者可以衍生自不同的基因，例如SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：32)和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：33)。

表达

可以通过本领域技术人员已知的任何方法评估表达。例如可以通过本领域技术人员已知的标准测定法，例如qPCR，蛋白质印迹分析或ELISA，通过测量mRNA或蛋白质水平上肝脏中转基因表达的水平来评估该表达。

如本文所述，可以在施用基因构建体、表达载体或组合物后的任意时间评估表达。在本文的一些实施方案中，表达可以在1周，2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，14周，16周，18周，20周，22周，24周，28周，32周，36周，40周或更长时间后评估。

在本发明的上下文中，CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性表达指与其他器官或组织相比，FGF21优先或主要(高至少10％，高至少20％，高至少30％，高至少40％，高至少50％，高至少60％，高至少70％，高至少80％，高至少90％，高至少100％，高至少150％，高至少200％或更多)在CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中表达。其他器官或组织可以是肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸等。优选地，其他器官是肝脏和/或心脏。在实施方案中，在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和/或心脏中的表达无法检测到。在一些实施方案中，在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中的表达无法检测到。可以如上所述评估表达。

在整个申请中，在表达的上下文中，在提到了CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性时，还分别设想组成CNS和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球的细胞类型的细胞型特异性表达。

施用

如本文所使用的，“CSF内施用”是指直接施用至位于围绕脑的脑膜的蛛网膜骨和软脑膜层之间的蛛网膜下腔空间中的CSF。CSF内施用可以通过小脑延髓池内、脑室内或鞘内施用进行。如本文所使用的，“小脑延髓池内施用”是指施用至小脑延髓池内，位于小脑和延髓背面之间的蛛网膜下腔的开口。如本文所使用的，“脑室内施用”意指施用至脑的两侧室中的任意一个中。如本文所使用的，“鞘内施用”涉及将直接施用至脊柱的鞘内空间中的CSF中。如本文所使用的，“实质内施用”意指直接局部施用至脑实质的任何区域中。如本文所使用的，“鼻内施用”意指通过鼻腔结构的施用。

密码子优化

如本文所使用的，“密码子优化”是指用于修饰现有的编码序列或设计编码序列的过程，例如，以改善表达宿主细胞或生物体中从编码序列转录的转录本RNA分子的翻译，或改善编码序列的转录。密码子优化包括但不限于包括针对编码序列选择密码子序列以适合表达宿主生物的密码子偏好的过程。例如，为了适合哺乳动物，优选鼠、犬或人表达宿主的密码子偏好。密码子优化还消除了可能负面影响RNA稳定性和/或翻译的元件(例如终止序列，TATA盒，剪接位点，核糖体进入位点，重复和/或富含GC的序列以及RNA二级结构或不稳定性基序)。在一些实施方案中，密码子优化的序列显示出转录、RNA稳定性和/或翻译增加至少3％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％或更多。

在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，意指包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，动词“由……组成”可以由“基本上由……组成”代替，意指本文所述的肽或模拟肽、培养基或组合物可包含除具体鉴定的组分以外的其它组分，所述其它组分不会改变本发明的独特特征。另外，动词“由……组成”可以由“基本上由……组成”代替，意指本文所述的方法可包含除具体鉴定的步骤以外的其它步骤，所述其它步骤不会改变本发明的独特特征。

不定冠词“一”或“一个”所指的元件不排除存在一个以上元件的可能性，除非上下文明确要求有一个元件且仅存在一个元件。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。

如本文所使用的，“至少”特定值意指该特定值或更多。例如，“至少2”应理解为与“2或更多”相同，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15...，等等。

各个数值表示为近似值，就好像这些值之前带有单词“大约”或“近似”。类似地，除非另外明确指出，否则在本申请中指定的各个范围内的数值被表示为近似值，好像在所述范围内的最小值和最大值前面均有单词“大约”或“近似”。如本文所使用的，术语“大约”和“近似”在指数值时应具有与所公开的主题最密切相关或与有争议的范围或元件相关的技术领域的普通技术人员的普通含义。从严格的数值边界扩展的数量取决于许多因素。例如，可以考虑的一些因素包括元件的临界性和/或给定量的变化将对所要求保护的主题的性能产生的影响，以及本领域技术人员已知的其他考虑因素。在没有任何相反的考虑的情况下，单词“大约”或“近似”当与数值(例如约10)结合使用时，优选地是指该值可以是给定值(10)的1％内外的值。

如本文所使用的，术语“和/或”表示一种或多种所述情况可单独发生或与至少一种所述情况组合发生，直至与所有所述情况一起发生。

除非另外指出，否则本文所鉴定的每个实施方案可以组合在一起。

本文引用的所有专利申请、专利和印刷出版物均通过引用整体纳入本文，除任何定义，主题放弃或否认外，和所纳入的材料与本文的明确公开内容不符的情况除外，其中以本公开中的语言为准。

本领域技术人员将认识到可以在本发明的实践中使用的许多与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。

通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1.moFGF21在db/db小鼠的脑中的表达。通过RTqPCR测量在db/db小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中鼠密码子优化的FGF21(moFgf21)编码序列的表达水平，并用Rplp0值归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后12周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。ND，未检测的。

图2.用AAV9-FGF21载体处理后db/db小鼠的体重和组织重量减少。(A)体重演变。AAV施用后每周测量体重。(B)体重增加。体重增加计算为增加的体重除以AAV施用时的体重的百分比。(C)未经处理和经AAV9-FGF21处理的db/db的iWAT，eWAT，mWAT，BAT和肝脏的重量。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后12周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。与未经处理的小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。iWAT，腹股沟白色脂肪组织；eWAT，附睾白色脂肪组织；mWAT，肠系膜白色脂肪组织；BAT，肩胛间棕色脂肪组织；L，肝脏。

图3.通过AAV9-FGF21载体的CSF内施用逆转db/db小鼠中的糖尿病。在CSF内载体施用后，未经处理和经AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT处理的db/db小鼠进食血糖水平的演变。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。***p<0.001vs未经处理的小鼠。

图4.用AAV9-FGF21载体处理的db/db小鼠的脑部炎症减少。通过RTqPCR测量在db/db小鼠下丘脑中星形胶质细胞标志物(Gfap和S100b)，小胶质细胞标志物(Aif1)和炎性分子(Nfkb，Il1b和Il6)的表达水平，并用Rplp0值进行归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后12周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。*p<0.05vs未经处理的小鼠。Gfap，胶质细胞原纤维酸性蛋白；S100b，钙结合蛋白B；Aif1，同种异体炎症因子1；Nfkb，核因子κB；Il1b，白介素1β；Il6，白介素6。

图5.moFGF21在SAMP8小鼠脑中的表达。通过RTqPCR测量在SAMP8小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中鼠密码子优化的FGF21(moFGF21)编码序列的表达水平，并用Rplp0值归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后14周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。ND，未检测的。

图6.用AAV9-FGF21载体处理后SAMP8小鼠的体重和组织重量减少。(A)体重演变。AAV施用后每周测量体重。(B)体重增加。体重增加计算为增加的体重除以AAV施用时的体重的百分比。(C)未经处理和经AAV9-FGF21处理的SAMP8的iWAT、eWAT、mWAT、BAT和肝脏的重量。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后14周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。与未经处理的小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。iWAT，腹股沟白色脂肪组织；eWAT，附睾白色脂肪组织；mWAT，肠系膜白色脂肪组织；BAT，肩胛间棕色脂肪组织；L，肝脏。

图7.用AAV9-FGF21处理的SAMP8小鼠的脑部炎症减少。通过RTqPCR测量在SAMP8小鼠下丘脑中星形胶质细胞标志物(Gfap和S100b)，小胶质细胞标志物(Aif1)和炎性分子(Nfkb，Il1b和Il6)的表达水平，并用Rplp0值进行归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后14周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。**p<0.01vs未经处理的小鼠。Gfap，胶质细胞原纤维酸性蛋白；S100b，钙结合蛋白B；Aif1，同种异体炎症因子1；Nfkb，核因子κB；Il1b，白介素1β；Il6，白介素6。

图8.在CSF内施用AAV1-FGF21、AAV2-FGF21和AAV9-FGF21载体后，moFGF21在脑中的表达。CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV1-CAG-moFGF21-dmiRT，AAV2-CAG-moFGF21-dmiRT或AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后3周，通过RTqPCR测定鼠密码子优化的FGF21(moFGF21)编码序列在野生型小鼠下丘脑、皮质、海马和小脑中的表达水平。结果用Rplp0值归一化，并表示为平均值±SEM，n＝5只动物/组。ND，未检测的。

图9.脑中的FGF21蛋白水平。在施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV1-CAG-moFGF21-dmiRT、AAV2-CAG-moFGF21-dmiRT或AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体3周后，通过ELISA测定在野生型小鼠脑匀浆中FGF21蛋白含量。结果用总蛋白水平归一化，并表示为平均值±SEM，n＝5只动物/组。ND，未检测的。

图10.用AAV9-FGF21载体处理后，体脂肪减少，产热增加。AAV9-FGF21处理和未经处理的db/db小鼠的(A)eWAT和(B)BAT用苏木精和曙红染色的切片的代表性图像。原始放大倍数x 200(C)通过RTqPCR测量在db/db小鼠的BAT中产热标志物(Ucp1和Cidea)的表达水平，并用Rplp0值进行归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后12周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。***p<0.001vs未经处理的小鼠。Ucp1，解偶联蛋白1；Cidea，诱导细胞死亡的DNA片段化因子，α亚基样效应子A；eWAT，附睾白色脂肪组织；BAT，棕色脂肪组织。

图11.AAV9-FGF21处理的小鼠中肝甘油三酯含量降低。(A)肝甘油三酯含量。(B)血清甘油三酯和(C)血清FFA水平。CSF内施用载体后12周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。*p<0.05vs未经处理的小鼠。FFA，游离脂肪酸。

图12.FGF21处理的db/db小鼠中β细胞质量的改善。在用抗胰岛素抗体染色的胰腺切片的免疫组织化学分析之后，在未经处理的和AAV9-FGF21处理的db/db小鼠中计算(A)胰岛的数目和(B)β细胞质量。结果表示为平均值±SEM，n＝3只动物/组。*p<0.05vs未经处理的小鼠。

图13.用AAV9-FGF21载体处理后，db/db小鼠脂肪组织和肝脏的炎症减少。(A)来自未经处理和经AAV9-FGF21处理的db/db小鼠(n＝6只动物/组)的eWAT的MAC-2免疫组织化学的代表性图像(B)通过RTqPCR测量在db/db小鼠的eWAT中炎症标志物F4/80的表达水平，并用Rplp0值归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后12周进行分析。(C-D)通过RTqPCR测量在db/db小鼠的BAT(C)和肝脏(D)中炎症标志物F4/80、Il6和Tnfa的表达水平，并用Rplp0值归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后12周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝9只动物/组。*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001***p<0.001vs未经处理的小鼠。F4/80，粘附G蛋白偶联受体E1；Il6，白介素6；Tnfa，肿瘤坏死因子α；eWAT，附睾白色脂肪组织；BAT，棕色脂肪组织。MAC-2，凝集素，半乳糖结合，可溶3；箭头指示MAC-2信号转导。

图14.moFGF21在AAV1-FGF21处理的db/db小鼠脑中的表达。通过RTqPCR测量在db/db小鼠的下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球中鼠密码子优化的FGF21(moFgf21)编码序列的表达水平，并用Rplp0值归一化。在CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体后16周进行分析。结果表示为平均值±SEM，n＝7只动物/组。ND，未检测的。

图15.用AAV1-CAG-FGF21载体处理后db/db小鼠的体重减少。在未经处理的db/+(瘦)，未经处理的db/db和AAV1-CAG-FGF21处理的db/db小鼠中，AAV施用后每周测量体重。结果表示为平均值±SEM，n＝7只动物/组。*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001vs db/+小鼠。^$$$p<0.001vs db/db未经处理的小鼠。

图16.AAV1-FGF21处理的db/db中糖尿病的逆转。(A)在CSF内载体施用后，瘦(db/+)，未经处理的和AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT处理的db/db小鼠的进食血糖水平的演变。(B)在施用AAV1-CAG-FGF21载体11周后测量空腹血糖水平。结果表示为平均值±SEM，n＝7只动物/组。**p<0.01和***p<0.001vs db/+小鼠。^$$$p<0.001vs db/db未经处理的小鼠。

图17.在AAV1-FGF21处理的db/db小鼠中胰岛素敏感性增加。腹膜内胰岛素耐量测试。给予瘦(db/+)，未经处理的和AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT处理的db/db小鼠腹腔内注射0.75U胰岛素/kg体重，并在指定的时间点测量血糖水平。在AAV施用后14周进行测试。结果表示为平均值±SEM，n＝7只动物/组。*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001vs db/+小鼠。^$p<0.05和^$$p<0.01vs db/db未经处理的小鼠。

图18.用AAV1-CAG-FGF21处理改善葡萄糖耐量。研究了腹膜内注射葡萄糖(1g/kg体重)后，在未经处理的db/+(瘦)，未经处理的db/db和AAV1-CAG-FGF21处理的db/db小鼠中AAV施用11周后的葡萄糖耐量。结果表示为平均值±SEM，n＝7只动物/组。*p<0.05和***p<0.001vs db/+小鼠。^$$$p<0.001vs db/db未经处理的小鼠。

图19.AAV1-FGF21施用后db/db小鼠糖异生减少。丙酮酸耐量测试是在瘦(db/+)，未经处理的和AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT处理的db/db小鼠中进行的。所有组均给予丙酮酸腹腔内注射(1g/kg体重)，并在指定的时间点测量血糖水平。在AAV施用后12周进行测试。结果表示为平均值±SEM，n＝7只动物/组。***p<0.001vs未经处理的小鼠。^$$$p<0.001vs db/db未经处理的小鼠。

实施例

通过使用AAV载体研究FGF21在脑中过表达时在脑中的作用。已经执行了三个不同的实验：

·用AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT处理db/db小鼠。所用剂量：5x10¹⁰vg/小鼠(实施例1)。

·用AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT处理SAMP8小鼠。所用剂量：5x10¹⁰ vg/小鼠(实施例2)。

·用AAV1-CAG-moFGF21处理db/db小鼠。所用剂量：5x10¹⁰ vg/小鼠(实施例4)。

此外，在野生型小鼠的CSF内施用后，我们还检查了通过AAV1-FGF21、AAV2-FGF21和AAV9-FGF21载体的脑转导效率(实施例3)。

dmiRT是指miRT-122a的4个拷贝和miRT-1序列的4个拷贝。

CAG-moFGF21-dmiRT基因构建体序列包含在SEQ ID NO：35的序列中。CAG-moFGF21基因构建体序列包含在SEQ ID NO：46的序列中。

实施例的基本程序

受试者特征

使用雄性BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db OlaHsd(db/db),BKS.Cg-m+/+Lepr^db/OlaHsd(db/+，瘦)SAMP8/TaHsd(SAMP8)和C57Bl/6J(野生型)小鼠。随意给小鼠喂食标准饮食(2018S Teklad Global

Harlan Labs.,Inc.,Madison,WI,US，保持在12小时的明暗循环中(上午8:00点光照)，并稳定温度(22℃±2)。为了进行组织采样，通过吸入麻醉异氟烷(

Abbott Laboratories,Abbott Park,IL,US)麻醉小鼠并断头。切下目标组织并保持在-80℃直到分析。所有实验程序均已获得巴塞罗那自治大学动物与人类实验伦理委员会的批准。

重组AAV载体

根据标准方法(Ayuso,E.et al.,2010.Curr Gene Ther.10(6):423-36)通过对HEK293细胞的三重转染产生血清型1、2和9的单链AAV载体。将细胞于10个滚瓶(850cm²,平的；Corning^TM,Sigma-Aldrich Co.,Saint Louis,MO,US)中在DMEM 10％FBS中培养至80％汇合度，并通过磷酸钙方法用带有侧翼为AAV2 ITR(SEQ ID NO：35)的表达盒的质粒,分别带有AAV2rep基因和AAV的血清型1、2或9cap基因的辅助质粒，以及带有腺病毒辅助功能的质粒一起共转染。使用的转基因是由早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子(SEQ ID NO：27)驱动的鼠密码子优化的FGF21编码序列(SEQ ID NO：9)。在实施例1、2和3中，转基因还包含miRT-122a序列(5'CAAACACCATTGTCACACTCCA3'，SEQ ID NO：12)的四个串联重复序列和miRT-1序列(5'TTACATACTTCTTTATACATTCCA3'，SEQ ID NO：13)的四个串联重复序列克隆到表达盒的3'非翻译区中。在实施例4中，盒未携带miRT-122a和miRT-1；通过基于聚乙二醇沉淀步骤和两个连续的氯化铯(CsCl)梯度的优化方法纯化AAV。该第二代基于CsCl的方案显著减少了空AAV衣壳以及DNA和蛋白质杂质(Ayuso,E.et al.,2010.Curr Gene Ther.10 (6):423-36)。纯化的AAV载体对PBS透析，过滤并保存在-80℃。根据AAV2参考标准物质描述的方案，使用线性化质粒DNA作为标准曲线，通过定量PCR确定病毒基因组的效价(Lock M,et al.,Hum.Gene Ther.2010；21:1273-1285)。根据本领域众所周知的分子生物学技术构建载体。

AAV载体的体内CSF内施用

用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)腹腔内注射麻醉小鼠，从耳朵后面到大约肩胛骨之间从头后部的皮肤刮毛并用乙醇漂洗。将小鼠俯卧，头部稍微向下倾斜。在枕骨和C1椎骨之间切成2毫米的头尾切口，以45-55°的角度将汉密尔顿注射器引入小脑延髓池，并施用5μl载体稀释液。鉴于CNS是载体递送的主要靶标区室，因此不考虑体重，给小鼠服用相同数量的载体基因组/小鼠(5x10¹⁰ vg/小鼠)。

免疫组织化学和形态计量学分析

将组织在福尔马林(Panreac Química)中固定24小时，包埋在石蜡中，然后切片。用苏木精-曙红对组织样品进行染色，并用连接有摄像机具有监视器的尼康Eclipse E800显微镜(尼康，日本东京)拍摄图像，所述监视器带有图像分析软件(analySIS 3.0；SoftImaging System，Center Valley，PA，EEUU)。

免疫组织化学

将组织在10％福尔马林中固定12-24小时，包埋在石蜡中，切片。为了进行免疫组织化学检测，将切片脱蜡并在4℃下与大鼠抗MAC2(1:50；CL8942AP；Cedarlane)和豚鼠抗胰岛素(1：100；I-8510；Sigma-Aldrich)一起孵育过夜。生物素化的兔抗大鼠(1：300；E0467；Dako)和与过氧化物酶偶联的兔抗豚鼠(1：300；P0141；Dako)被用作二抗。ABC过氧化物酶试剂盒(Pierce)用于免疫检测，切片在Mayer的苏木精中复染。通过将一个切片中所有胰岛素阳性细胞的面积除以该切片的总胰腺面积，在两个相距200μm的胰岛素染色切片中分析胰腺中β细胞面积的百分比。如前所述(Casellas等，2006)，将胰腺重量乘以β细胞面积的百分比来计算β细胞的质量。

RNA分析

使用Tripure分离试剂(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN，US)从下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球中，并使用Qiazol裂解试剂(Qiagen NV，Venlo，NL)从白色脂肪组织、棕色脂肪组织和肝脏中，以及使用RNeasy Mini Kit或RNeasy Micro Kit(QiagenNV，Venlo，NL)从海马样品获得总RNA。为了消除残留的病毒基因组，用DNAsel(Qiagen NV，Venlo，NL)处理总RNA。为了进行RT-PCR分析，使用Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit(04379012001，Roche，California，USA)对1μg RNA样品进行反转录。使用TBGreen Premix Ex TaqII(Takara Bio Europe，France)在

(Cepheid，Sunnyvale，美国)中进行实时定量PCR。用Rplp0值对数据进行归一化，并如先前所述进行分析(Pfaffl，M.，Nucleic Acids Res.2001；29(9)：e45)。

所用引物的概述如下所示：

moFgf21-Fw:5’-CCTAACCAGGACGCCACAAG-3’(SEQ ID NO:47)

moFgf21-Rv:5’-GTTCCACCATGCTCAGAGGG-3’(SEQ ID NO:48)

Gfap-Fw:5’-ACAGACTTTCTCCAACCTCCAG-3’(SEQ ID NO:49)

Gfap-Rv:5’-CCTTCTGACACGGATTTGGT-3’(SEQ ID NO:50)

S100b-Fw:5’-AACAACGAGCTCTCTCACTTCC-3’(SEQ ID NO:51)

S100b-Rv:5’-CGTCTCCATCACTTTGTCCA-3’(SEQ ID NO:52)

Aif1-Fw:5’-TGAGCCAAAGCAGGGATTTG-3’(SEQ ID NO:53)

Aif1-Rv:5’-TCAAGTTTGGACGGCAGATC-3’(SEQ ID NO:54)

Nfkb-Fw:5’-GACCACTGCTCAGGTCCACT-3’(SEQ ID NO:55)

Nfkb-Rv:5’-TGTCACTATCCCGGAGTTCA-3’(SEQ ID NO:56)

Il1b-Fw:5’-ATGAAGGGCTGCTTCCAAAC-3’(SEQ ID NO:57)

Il1b-Rv:5’-ATGTGCTGCTGCGAGATTTG-3’(SEQ ID NO:58)

Il6-Fw:5’-TCGCTCAGGGTCACAAGAAA-3’(SEQ ID NO:59)

Il6-Rv:5’-CATCAGAGGCAAGGAGGAAAAC-3’(SEQ ID NO:60)

Ucp1-Fw:5’-GGCCTCTACGACTCAGTCCA-3’(SEQ ID NO:61)

Ucp1-Rv:5’-TAAGCCGGCTGAGATCTTGT-3’(SEQ ID NO:62)

Cidea-Fw:5’-AAACCATGACCGAAGTAGCC-3’(SEQ ID NO:63)

Cidea-Rv:5’-AGGCCAGTTGTGATGACTAAGAC-3’(SEQ ID NO:64)

Tnfa-Fw:5’-CGGCATGGATCTCAAAGACAAC-3’(SEQ ID NO:65)

Tnfa-Rv:5’-AGATAGCAAATCGGCTGACG-3’(SEQ ID NO:66)

F4/80-Fw:5’-CTTTGGCTATGGGCTTCCAGTC-3’(SEQ ID NO:67)

F4/80-Rv:5’-GCAAGGAGGACAGAGTTTATC-3’(SEQ ID NO:68)

Rplp0-Fw:5’-ACTGGTCTAGGACCCGAGAA-3’(SEQ ID NO:69)

Rplp0-Fw:5’-TCCCACCTTGTCTCCAGTCT-3’(SEQ ID NO:70)

激素和代谢物测定

用Glucometer Elite^TM分析仪(Bayer，Leverkusen，Germany)测量血糖水平。通过定量夹心酶免疫法小鼠/大鼠FGF-21ELISA试剂盒(MF2100，R&Dsystems，Abingdon，UK)测定FGF21蛋白的脑水平，并通过Bradford试剂测得的全脑匀浆中总蛋白含量进行归一化(Bio-Rad蛋白质测定，Bio-Rad，德国)。为了从肝脏中提取脂质，按Carr等的描述，将大约100mg的冷冻样品称重并在氯仿：甲醇(2：1)中匀浆。使用酶分析试剂盒(Horiba-ABX,Montpellier,France)以分光光度法对肝甘油三酸酯和血清甘油三酸酯进行定量。通过酰基辅酶A合酶和酰基辅酶A氧化酶法(Wako Chemicals GmbH，Neuss，Germany)测量血清游离脂肪酸。使用Pentra 400分析仪(Horiba-ABX)确定所有生化参数。

胰岛素耐量测试

为了进行胰岛素耐量测试，将胰岛素(0.75IU/kg体重；Humulin Regular；EliLilly，Indianapolis，IN)腹腔内注射到清醒喂养的小鼠中。在注射胰岛素后的指定时间点，从尾静脉获得的血液样品中测定葡萄糖浓度。

葡萄糖耐量测试

将清醒的小鼠禁食过夜(16小时)，并腹腔内注射葡萄糖(1g/kg体重)进行施用。在指定的时间点在尾静脉血液样品中测量糖血。

丙酮酸耐量测试

将清醒的小鼠禁食过夜(16小时)，并用腹腔内注射丙酮酸(1g/kg体重)进行施用。在指定的时间点在尾静脉血液样品中测量糖血。

实施例1.在db/db小鼠中通过CSF内施用AAV9-CAG-moFGF21-dmirT载体逆转肥胖症和糖尿病

我们在7周龄的db/db雄性小鼠中评估了AAV介导的FGF21脑基因工程的抗糖尿病和抗肥胖症的治疗潜力，这些小鼠具有瘦素信号传导缺陷，是肥胖症和糖尿病广泛使用的遗传模型。为此，通过小脑延髓池对db/db小鼠进行局部脑脊液(CSF)内施用5x10¹⁰ vg/小鼠的AAV9载体，其编码鼠密码子优化的FGF21编码序列，所述编码序列在CAG遍在启动子的控制下，并包括肝脏特异性miR-122a和心脏特异性miR-1(AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT)的靶标位点。作为对照，使用未经处理的db/db动物。

AAV施用后12周，CSF内施用AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体介导脑中FGF21的广泛过表达，如由该因子在脑的不同区域(如下丘脑、皮质、海马和小脑)的表达水平升高证明的(图1)。

尽管未经处理的db/db小鼠在12周的随访期内持续增重(体重增加约50％)，但使用FGF21编码载体处理的群体中体重增加明显减少(体重增加约20％)(图2A和2B)。一致地，用AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体处理的动物显示出体脂肪减少和肝脏重量减少60％(图2C)。值得注意的是，其中FGF21基因转移靶向脑的db/db小鼠也表现出了进食血糖的完全正常化，证明了这些动物中糖尿病的抵抗作用(图3)。

肥胖与脑部炎症相关(O.Guillemot-Legris，G.G.Muccioli，TrendsNeurosci.40，237-253(2017)。通过星形细胞标志物Gfap和S100b，小胶质细胞标志物Aif1和促炎分子(例如Nfkb，Il1b和Il6)的表达来分析该器官的炎症。用AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体CSF内处理的Db/db小鼠在下丘脑中显示Gfap、S100b、Aif1、Nfkb、Il1b和Il6的表达降低(图4)。

实施例1.1

通过苏木精-曙红染色对白色脂肪组织进行的组织学分析显示，eWAT中白色脂肪细胞的大小减少了(图10A)。在BAT中，组织学分析显示较低的脂质积累和更多的多腔棕色脂肪细胞(图10B)。根据这些结果，在用FGF21处理的小鼠BAT中Ucp1和Cidea的表达水平高度增加(图10C)，表明在AAV-FGF21 CNS施用后产热增加。在AAV9-FGF21处理的db/db小鼠中，肝甘油三酯含量降低(图11A)。在这些小鼠中，甘油三酯和血清游离脂肪酸的平行循环水平也降低了(图11B和11C)。胰腺的免疫组织化学分析显示，在用AAV9-FGF21载体处理后，db/db小鼠的胰岛数目增加(图12A)，β细胞质量得到改善(图12B)。

肥胖症和糖尿病与全身性炎症有关。在白色脂肪组织中，针对MAC-2促炎标志物的免疫组织化学分析表明，在AAV9-FGF21处理的小鼠中巨噬细胞浸润减少(图13A)，这与F4/80mRNA表达水平降低有关(图13B)。在棕色脂肪组织和肝脏中，在用FGF21处理的动物中促炎细胞因子F4/80、Il6和Tnfα的表达水平也降低了(分别为图13C和13D)，表明在FGF21基因处理后全身性炎症减轻了。

实施例2.在SAMP8小鼠中通过CSF内施用AAV9-CAG-moFGF21-dmirT载体降低了体重的增加

七周龄的衰老加速小鼠易生8(SAMP8)雄性小鼠是广泛使用的衰老小鼠模型，具有与年龄相关的脑部疾病，通过小脑延髓池通过局部CSF内施用5x10¹⁰ vg/小鼠AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体。作为对照，使用未经处理的SAMP8动物。

类似于在db/db小鼠中所做的观察，AAV施用后14周，AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT载体的CSF内施用介导在SAMP8小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中FGF21的强烈过表达(图5)。FGF21处理的小鼠的体重增加比未经处理的群体低(图6A和6B)，这与肝脏重量的减少平行(图6C)。另外，在脑中过表达FGF21的SAMP8小鼠的下丘脑中，促炎性细胞因子Illb和Il6的表达降低(图7)。

实施例3.在CSF内施用AAV1-CAG-moFGF21-dmirT、AAV2-CAG-moFGF21-dmirT和 AAV9-CAG-moFGF21-dmirT载体后进行脑转导

为了检查通过小脑延髓池直接CSF施用后几种AAV血清型是否能够有效地转导脑，用5x10¹⁰vg/小鼠的编码在CAG遍在启动子的控制下的鼠密码子优化的FGF21编码序列的AAV1、AAV2和AAV9载体对野生型小鼠进行了处理，该载体包括肝脏特异性miR-122a和心脏特异性miR-1的靶位点(分别为AAV1-CAG-moFGF21-dmiRT、AAV2-CAG-moFGF21-dmiRT和AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT)。作为对照，使用未经处理的野生型小鼠。

在CSF内施用AAV载体三周后，获得了脑样本，RT-PCR分析显示在不同的脑区域(例如下丘脑、皮质、海马和小脑)中moFGF21表达增加(图8)。此外，moFGF21的过表达导致整个脑中FGF21蛋白含量的增加(图9)。

实施例4. 在db/db小鼠中通过CSF内施用AAV1-CAG-moFGF21载体逆转肥胖症和糖尿病

在7周龄的db/db雄性小鼠中，通过小脑延髓池局部脑脊髓液(CSF)内施用5x10¹⁰vg/小鼠的编码在CAG遍在启动子的控制下的小鼠密码子优化的FGF21编码序列的AAV1载体(AAV1-CAG-moFGF21)，评估了FGF21基因治疗对脑的AAV介导的基因工程化的抗糖尿病和抗肥胖症的治疗潜力。作为对照，使用未经处理的db/db和未经处理的db/+(瘦)小鼠。

CSF内施用AAV1-CAG-moFGF21载体介导脑中FGF21的广泛过表达，如AAV施用后16周，由该因子在脑的不同区域(如下丘脑、皮质、海马和小脑)的表达水平升高证明的(图14)。

尽管未经处理的db/db小鼠在14周的随访期内持续增重，但用AAV1-FGF21编码载体处理的群体的体重并未增加(图15)。值得注意的是，其中FGF21基因转移靶向脑的db/db小鼠也表现出了进食糖血和空腹糖血的完全正常化(图16A和16B)，证明了这些动物中糖尿病的抵抗作用。

胰岛素耐量测试表明，在用AAV1-FGF21病毒载体处理后，db/db中的胰岛素抵抗有所改善(图17)，对过夜饥饿的小鼠进行的腹膜内葡萄糖耐量测试表明，与db/db未经处理的小鼠相比，用AAV1-CAG-moFGF21处理的db/db小鼠对葡萄糖的耐量更高(图18)。作为肝糖异生的指标，进行了腹膜内丙酮酸耐量试验。丙酮酸激发后，未经处理的db/db小鼠的血糖水平上升至600mg/dl，在测试过程中仍保持较高水平，而经FGF21处理的db/db小鼠和瘦小鼠的葡萄糖水平最高上升至150mg/dl，因此表明在AAV1-CAG-FGF21处理后糖异生减少(图19)。

序列

智人(homo sapiens)FGF21的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)

MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS

智人(homosapiens)FGF21的核苷酸序列(SEQ ID NO: 4)

ATGGACTCGGACGAGACCGGGTTCGAGCACTCAGGACTGTGGGTTTCTGTGCTGGCTGGTCTTCTGCTGGGAGCCTGCCAGGCACACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCCTGA

智人(homo sapiens)FGF21变体1的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)

ATGGATTCTGATGAGACAGGCTTCGAGCACAGCGGCCTGTGGGTTTCAGTTCTGGCTGGACTGCTGCTGGGAGCCTGTCAGGCACACCCTATTCCAGATAGCAGCCCTCTGCTGCAGTTCGGCGGACAAGTGCGGCAGAGATACCTGTACACCGACGACGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAAATCAGAGAGGATGGCACAGTTGGCGGAGCCGCCGATCAGTCTCCTGAATCTCTGCTCCAGCTGAAGGCCCTGAAGCCTGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAAACCAGCCGGTTCCTGTGCCAAAGACCTGACGGCGCCCTGTATGGCAGCCTGCACTTTGATCCTGAGGCCTGCAGCTTCAGAGAGCTGCTGCTTGAGGACGGCTACAACGTGTACCAGTCTGAGGCCCATGGCCTGCCTCTGCATCTGCCTGGAAACAAGAGCCCTCACAGAGATCCCGCTCCTAGAGGCCCTGCCAGATTTCTGCCTCTTCCTGGATTGCCTCCTGCTCTGCCAGAGCCTCCTGGAATTCTGGCTCCTCAGCCTCCTGATGTGGGCAGCTCTGATCCTCTGAGCATGGTCGGACCTAGCCAGGGCAGATCTCCTAGCTACGCCTCTTGA

智人(homosapiens)FGF21变体2的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)

ATGGACAGCGATGAAACCGGGTTCGAGCACAGCGGTCTGTGGGTGTCCGTGCTGGCCGGACTGCTCCTGGGAGCCTGTCAGGCGCACCCCATCCCTGACTCCTCGCCGCTGCTGCAATTCGGCGGACAAGTCCGCCAGAGATACCTGTACACCGACGACGCCCAGCAGACCGAAGCCCACCTGGAAATTCGGGAGGACGGGACTGTGGGAGGCGCTGCAGATCAGTCACCCGAGTCCCTCCTCCAACTGAAGGCCTTGAAGCCCGGCGTGATTCAGATCCTGGGCGTGAAAACTTCCCGCTTCCTTTGCCAACGGCCGGATGGAGCTCTGTACGGATCCCTGCACTTCGACCCCGAAGCCTGCTCATTCCGCGAGCTGCTCCTTGAGGACGGCTATAACGTGTACCAGTCTGAGGCCCATGGACTCCCCCTGCATCTGCCCGGCAACAAGTCCCCTCACCGGGATCCTGCCCCAAGAGGCCCAGCTCGGTTTCTGCCTCTGCCGGGACTGCCTCCAGCGTTGCCCGAACCCCCTGGTATCCTGGCCCCGCAACCACCTGACGTCGGTTCGTCGGACCCGCTGAGCATGGTCGGTCCGAGCCAGGGAAGGTCCCCGTCCTACGCATCCTGA

智人(homo sapiens)FGF21变体3的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)

ATGGATTCCGACGAAACTGGATTTGAACATTCAGGGCTGTGGGTCTCTGTGCTGGCTGGACTGCTGCTGGGGGCTTGTCAGGCTCACCCCATCCCTGACAGCTCCCCTCTGCTGCAGTTCGGAGGACAGGTGCGGCAGAGATACCTGTATACCGACGATGCCCAGCAGACAGAGGCACACCTGGAGATCAGGGAGGACGGAACCGTGGGAGGAGCAGCCGATCAGTCTCCCGAGAGCCTGCTGCAGCTGAAGGCCCTGAAGCCTGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAGACATCTCGGTTTCTGTGCCAGCGGCCCGACGGCGCCCTGTACGGCTCCCTGCACTTCGATCCCGAGGCCTGTTCTTTTAGGGAGCTGCTGCTGGAGGACGGCTACAACGTGTATCAGAGCGAGGCACACGGCCTGCCACTGCACCTGCCTGGCAATAAGTCCCCTCACCGCGATCCAGCACCCAGGGGCCCAGCACGCTTCCTGCCTCTGCCAGGCCTGCCCCCTGCCCTGCCAGAGCCACCCGGCATCCTGGCCCCCCAGCCTCCAGATGTGGGCTCCAGCGATCCTCTGTCAATGGTGGGGCCAAGTCAGGGGCGGAGTCCTTCATACGCATCATAA

鼠密码子优化的FGF21的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)

ATGGAATGGATGAGAAGCAGAGTGGGCACCCTGGGCCTGTGGGTGCGACTGCTGCTGGCTGTGTTTCTGCTGGGCGTGTACCAGGCCTACCCCATCCCTGACTCTAGCCCCCTGCTGCAGTTTGGCGGACAAGTGCGGCAGAGATACCTGTACACCGACGACGACCAGGACACCGAGGCCCACCTGGAAATCCGCGAGGATGGCACAGTCGTGGGCGCTGCTCACAGAAGCCCTGAGAGCCTGCTGGAACTGAAGGCCCTGAAGCCCGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAGGCCAGCAGATTCCTGTGCCAGCAGCCTGACGGCGCCCTGTACGGCTCTCCTCACTTCGATCCTGAGGCCTGCAGCTTCAGAGAGCTGCTGCTGGAGGACGGCTACAACGTGTACCAGTCTGAGGCCCACGGCCTGCCCCTGAGACTGCCTCAGAAGGACAGCCCTAACCAGGACGCCACAAGCTGGGGACCTGTGCGGTTCCTGCCTATGCCTGGACTGCTGCACGAGCCCCAGGATCAGGCTGGCTTTCTGCCTCCTGAGCCTCCAGACGTGGGCAGCAGCGACCCTCTGAGCATGGTGGAACCTCTGCAGGGCAGAAGCCCCAGCTACGCCTCTTGA

CAG启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO: 27)

GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG

CMV启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO:28)

GTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT

CMV增强子的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)

GGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG

CMV启动子和CMV增强子序列(SEQ ID NO: 34)

GGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT

AAV2 5’ ITR(SEQ ID NO: 30)

GCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGCCCGGGCGTCG GGCGACCTTTGGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCGCGCAGAGAGG GAGTGGCCAA CTCCATCACT AGGGGTTCCT

AAV2 3’ ITR (SEQ ID NO:31)

AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCGCGCTCGCTCG CTCACTGAGGCCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCGGGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGC

兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(3'UTR和兔β-珠蛋白的侧翼区域，包括polyA信号) (SEQ ID NO：33)

GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATC

miRT序列

miRT-122a(SEQ ID NO:12):5’CAAACACCATTGTCACACTCCA 3’,靶向microRNA-122a(miRBase数据库登陆号MI0000442),其在肝脏中表达。

miRT-152(SEQ ID NO:14):5’CCAAGTTCTGTCATGCACTGA 3’，靶向microRNA-152(MI0000462)，其在肝脏中表达。

miRT-199a-5p(SEQ ID NO:15):5’GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG 3’，靶向microRNA199a(MI0000242)，其在肝脏中表达。

miRT-199a-3p(SEQ ID NO:16):5’TAACCAATGTGCAGACTACTGT 3’，靶向microRNA-199a(MI0000242)，其在肝脏中表达。

miRT-215(SEQ ID NO:17):5’GTCTGTCAATTCATAGGTCAT 3’，靶向microRNA-215(MI0000291)，其在肝脏中表达。

miRT-192(SEQ ID NO:18):5’GGCTGTCAATTCATAGGTCAG 3’，靶向microRNA-192(MI0000234)，其在肝脏中表达。

miRT-148a(SEQ ID NO:19):5’ACAAAGTTCTGTAGTGCACTGA 3’，靶向microRNA-148a(MI0000253)，其在肝脏中表达。

miRT-194(SEQ ID NO:20):5’TCCACATGGAGTTGCTGTTACA 3’，靶向microRNA-194(MI0000488)，其在肝脏中表达。

miRT-133a(SEQ ID NO:21):5’CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA 3’，靶向microRNA-133a(MI0000450)，其在心脏中表达。

miRT-206(SEQ ID NO:22):5’CCACACACTTCCTTACATTCCA 3’，靶向microRNA-206(MI0000490)，其在心脏中表达。

miRT-1(SEQ ID NO:13):5’TTACATACTTCTTTACATTCCA3’，靶向microRNA-1(MI0000651)，其在心脏中表达。

miRT-208a-5p(SEQ ID NO:23):5’GTATAACCCGGGCCAAAAGCTC 3’，靶向microRNA-208a(MI0000251)，其在心脏中表达。

miRT-208a-3p(SEQ ID NO:24):5’ACAAGCTTTTTGCTCGTCTTAT 3’，靶向microRNA-208a(MI0000251)，其在心脏中表达。

miRT-499-5p(SEQ ID NO:25):5’AAACATCACTGCAAGTCTTAA 3’，靶向microRNA-499(MI0003183)，其在心脏中表达。

pAAV-CAG-moFGF21-dmiRT(SEQ ID NO: 35)

AAV2 5’ITR:3615-3742 bp

CAG启动子：3782-5452 bp

小家鼠(Mus musculus)密码子优化的FGF21(moFGF21):5589-6221 bp

dmiRT(4个拷贝的miRT-122a和4个拷贝的miRT-1):6254-6514 bp

兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(兔β-珠蛋白的3'UTR和3’侧翼区域，包括polyA信号)：6674-6764bp

AAV2 3’ITR:7181-7308 bp

pAAV-CAG-moFGF21(SEQ ID NO:46)

AAV2 5’ITR:3601-3742 bp

CAG启动子：3779-5423 bp

小家鼠(Mus musculus)密码子优化的FGF21(moFGF21):5588-6221 bp

兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(兔β-珠蛋白的3’UTR和3'侧翼区域，包括polyA信号)：6315-6833bp

AAV2 3’ITR:6892-7024 bp

微型CMV：cmv中间早期启动子(SEQ ID NO:36)

TATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTT

EF1α启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO:37)

GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA

RSV启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO: 38)

CATGTTTGACAGCTTATCATCGCAGATCCGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATTCGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTAAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTGGGTACCAGCT

突触蛋白1启动子(SEQ ID NO: 39)

ctgcgctctcaggcacgacacgactcctccgctgcccaccgcagactgaggcagcgctgagtcgccggcgccgcagcgcagatggtcgcgcccgtgcccccctatctcgcgcctcgcgtggtgcggtccggctgggccggcggcggcgcggacgcgaccaaggtggccgggaaggggagtttgcgggggaccggcgagtgacgtcagcgcgccttcagtgctgaggcggcggtggcgcgcgccgccaggcgggggcgaaggcactgtccgcggtgctgaagctggcagtgcgcacgcgcctcgccgcatcctgtttcccctccccctctctgataggggatgcgcaatttggggaatgggggttgggtgcttgtccagtgggtcggggtcggtcgtcaggtaggcacccccaccccgcctcatcctggtcctaaaacccacttgcact

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子(SEQ ID NO:40)

taacattatggccttaggtcacttcatctccatggggttcttcttctgattttctagaaaatgagatgggggtgcagagagcttcctcagtgacctgcccagggtcacatcagaaatgtcagagctagaacttgaactcagattactaatcttaaattccatgccttgggggcatgcaagtacgatatacagaaggagtgaactcattagggcagatgaccaatgagtttaggaaagaagagtccagggcagggtacatctacaccacccgcccagccctgggtgagtccagccacgttcacctcattatagttgcctctctccagtcctaccttgacgggaagcacaagcagaaactgggacaggagccccaggagaccaaatcttcatggtccctctgggaggatgggtggggagagctgtggcagaggcctcaggaggggccctgctgctcagtggtgacagataggggtgagaaagcagacagagtcattccgtcagcattctgggtctgtttggtacttcttctcacgctaaggtggcggtgtgatatgcacaatggctaaaaagcagggagagctggaaagaaacaaggacagagacagaggccaagtcaaccagaccaattcccagaggaagcaaagaaaccattacagagactacaagggggaagggaaggagagatgaattagcttcccctgtaaaccttagaacccagctgttgccagggcaacggggcaatacctgtctcttcagaggagatgaagttgccagggtaactacatcctgtctttctcaaggaccatcccagaatgtggcacccactagccgttaccatagcaactgcctctttgccccacttaatcccatcccgtctgttaaaagggccctatagttggaggtgggggaggtaggaagagcgatgatcacttgtggactaagtttgttcgcatccccttctccaaccccctcagtacatcaccctgggggaacagggtccacttgctcctgggcccacacagtcctgcagtattgtgtatataaggccagggcaaagaggagcaggttttaaagtgaaaggcaggcaggtgttggggaggcagttaccggggcaacgggaacagggcgtttcggaggtggttgccatggggacctggatgctgacgaaggctcgcgaggctgtgagcagccacagtgccctgctcagaagccccaagctcgtcagtcaagccggttctccgtttgcactcaggagcacgggcaggcgagtggcccctagttctgggggcagcgggg

胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(SEQ ID NO: 41)

cgcgtgatctaacatatcctggtgtggagtaggggacgctgctctgacagaggctcgggggcctgagctggctctgtgagctggggaggaggcagacagccaggccttgtctgcaagcagacctggcagcattgggctggccgccccccagggcctcctcttcatgcccagtgaatgactcaccttggcacagacacaatgttcggggtgggcacagtgcctgcttcccgccgcaccccagcccccctcaaatgccttccgagaagcccattgagcagggggcttgcattgcaccccagcctgacagcctggcatcttgggataaaagcagcacagccccctaggggctgcccttgctgtgtggcgccaccggcggtggagaacaaggctctattcagcctgtgcccaggaaaggggatcaggggatgcccaggcatggacagtgggtggcagggggggagaggagggctgtctgcttcccagaagtccaaggacacaaatgggtgaggggagagctctccccatagctgggctgcggcccaaccccaccccctcaggctatgccagggggtgttgccaggggcacccgggcatcgccagtctagcccactccttcataaagccctcgcatcccaggagcgagcagagccagagcaggttggagaggagacgcatcacctccgctgctcgcggggtctagagtcga

巢蛋白启动子(SEQ ID NO: 42)

gaaggcagcccccggaggtcaaaggctgggcacgcgggaggagaggccagagtcagaggctgcgggtatctcagatatgaaggaaagatgagagaggctcaggaagaggtaagaaaagacacaagagaccagagaagggagaagaattagagagggaggcagaggaccgctgtctctacagacatagctggtagagactgggaggaagggatgaaccctgagcgcatgaagggaaggaggtggctggtggtatatggaggatgtagctgggccagggaaaagatcctgcactaaaaatctgaagctaaaaataacaggacacggggtggagaggcgaaaggagggcagattgaggcagagagactgagaggcctggggatgtgggcattccggtagggcacacagttcacttgtcttctctttttccaggaggccaaagatgctgacctcaagaactcataataccccagtggggaccaccgcattcatagccctgttacaagaagtgggagatgttcctttttgtcccagactggaaatccattacatcccgaggctcaggttctgtggtggtcatctctgtgtggcttgttctgtgggcctacctaaagtcctaagcacagctctcaagcagatccgaggcgactaagatgctagtaggggttgtctggagagaagagccgaggaggtgggctgtgatggatcagttcagctttcaaataaaaaggcgtttttatattctgtgtcgagttcgtgaacccctgtggtgggcttctccatctgtctgggttagtacctgccactatactggaataaggagacgcctgcttccctcgagttggctggacaaggttatgagcatccgtgtacttatggggttgccagcttggtcctggatcgcccgggcccttcccccacccgttcggttccccaccaccacccgcgctcgtacgtgcgtctccgcctgcagctcttgactcatcggggcccccgggtcacatgcgctcgctcggctctataggcgccgccccctgcccaccccccgcccgcgctgggagccgcagccgccgccactcctgctctctctgcgccgccgccgtcaccaccgccaccgccaccggctgagtctgcagtcctccgaaacgggccctct

同源盒蛋白9(HB9)启动子(SEQ ID NO:43)

tgaataaatttaagcaggctaattaatatataaactagctcaatttgtcaagttgatttgtattttagttaattgtgaaagtaattaccacatggtcaaattaacagctttctggaaatgaccaagcctgaggttttatttccttcctgggtgaagaaaattcatttttccaagctcttgatgtgatgaataaaagtcataaatctgggtgattggtgcaggcagagtctaaatggcttcatatttcattttaggtttaatagaaatattcatgctctgttttaatgaaattaaattgaagggggatggggctagagtggttagctgatgaattgacaaaaactaatcagctttattgggaaacaggtttaagggcacggacgtgtcaataacgctcagcctgaccccctcttccattagctaggcaggctgattaga

酪氨酸羟化酶(TH)启动子(SEQ ID NO: 44)

CTGCTAGGGGCTGCTTCCCAGCTACTCCTCTTGGCTCCGTGGCTTGCCTTCCAGCCTGTGTGCTGTCTGGAGAGCCTTTAAAGCCTCACTTCCACCAACTAGAAGTCTCTCCCCAACCCTGCCCTGACCTCAAGTGCACCTCTTCAAAGTCAGGTTTAGCAGCTGCAGCTGGGGGCCCTGAATCCCACCCCTGCTGTCTTCCTTGAAGACAGAAGTGTTGGGAGCTGAGGATCTGGGCTAGAGACTGGCTGTATGATCCAGAGAAGTAGTGTGCTTCTGGGCCTCAGATTTCCCTTCTGTAGAACAGGTTTGTCTGAAATGGAGAGGTTGGTGCTCCTCTGCAGGGCCTAGTGGGAGTCACCATGAGTGGTTAAAAGATCCAGCTTGTCTTTTGGTGAGCTTTGAGAGGAGGTAACAGGGCTGAGTTCTGGAAGCCTGACCAAGGGCAGACTTAAGGGGCCTCTTGGAGTTGTTCTCATCAAATGGGGATGGGACACAGCTAAAGTGCCCAGGGCTTCTCTGTGCCCACAGATGCTTTAGATCTTGGCACAGTGTGGTCTACCAGCTGTCTCTCTCTGTGTATATATATGTATTTCATAGACAGTGTACAGTGGCCTGGTTTGTGCTATCAGGCTGGATATGGACAGAGGCAAGAGTTTGTGGCAGCAGTTATCTCCCAAGAGAGTCCAAAGACATCATGTTTTCAAGTTTAGGCCAGGTGCTACTTGAGAGAGCTCAGACACAGACAAAGGTCTGGAGAGCACATGTCCTCCACCCCCACCTAGCTTCTGTTGCAAGCACCTCCAGCCGAGACAAGAGAACGAATTAAAAAGCAATATTTGTGTCAGTGTAAGACATTTGCCGAAAGGTTAAATCCACATTCGTGTTGCTGCAGAGCAGCCCCCTATGCAGGATTTGTTAGATACAGCTCCGTCCTACCCTGTGCCAGCTGAGCAAACGCCAGGCTGGGTGGGGTGGAACCCAGCCTGGGTTTGCCTCACCCTGCAATCCCCCCAGCACCCTCTAAAGGAGGACCCTGTGGTGGGCATGCAGACCTAGGGACTGGGCATAGATAACCTTTGGGTTTGGGCAACAGCCCCCACTCCTCAGGATTGAAGGCTAAGGTGCAGCCAGCTCTGCCTTCATGGTGGGAATGTCTCCACGTGACCCCTTTCTGGGCTGTGGAGAACACTCAGAGAAGAGTCCTGGGATGCCAGGCAGGCCAGGGATGTGCTGGGCATGTTGAGACAGGAGTGGGCTAAGCCAGCAGAGTTGCTGACCCAGGAAGAGTTCAGAAAGGGGCATGGAACATGGGGAGGGGTCCATAGTGAGAGAGAGCAGGCAGTGCAGAGTAAATAGTCCCTGAGCTGGGGGTTATGGGATTTGCAGGAGCTTGCTCAGAGAAGGCAGAGGAGAGATGCTGCGCCAAGCTGGGTATCACAGAGCCTCAGACTCCTGGAACAGGAACTGTGGGGGTCAGGTCAGCAGGGGAGGTTAGGGAGTGTTCCCTTTGTACTGACTTAGCATTTATCCTGCTTCTAGGGGGGAAGGGGGGCCAGTGGGGGATGCACAGCAAGGCAGTGATGTGGCAGGCAGCCTGCGGGAGCTCCTGGTTCCTGGTGTGAAAAAGCTGGGAAGGAAGAGGGCTGGGTCTGGTAAGTACAGCAGGCAGTTGGCTCCTGAGAGTCCAAGCCCTGTCTAGAGGGTGGAGTGAGATTTCAGAGGGAGAGCTAAACGGGGTGGGGGCTGGGGAGTCCAGGCTTCTGGCTCCTGCTAATACTCAGTGTGCTGGGTCCTCAGAACCTCAGGGTGGCCATTTTCAGGGTGAGAGCTCTGTCCTTTGGCACTTCTGCAGACTCCAGTATCCAGAGGAATAAAGATGGTACTCTTCCTCAGTTCCCTTAGTGAGAGGACACCTTTCTCTGAAGGGCTTGGGCAGTTGTCCTGAACCATTGCCTGAAGGAAGGACTTGACTCCAGGGACATAGAATGGGCTCAGCATAAGTCCCCTGTAGTAGAGAAAGGTCCCCTCTCTGGTCTCCTTAGAGATCCTGTTTCCTTGGCTGAGGAAGCTAGGGTGGATCTTTGTGTAAGTGGGTGTGGATGCTCACTGGAAATCAAAAGGCCCCTTGGTGTTAGACCTTGGGGTGCCATGGGAGAGTTGATCACTGAGTGCGCCCTTACATGGGGGCCAGCTGAGAATGGGGCTGCCTCTAGCTCGAGACCATGATGCAGGGAGTGAGTGGGGGAGTTCAGGATACTCTTAACTAAAGCAGAGGTCTGTCCCCCCAGGGAGGGGAGGTCAGAAGACCCTAGGGAGATGCCAAAGGCTAGGGTTGGCACCATGTTGCAGGCTGTGTCTTCAAGGAGATGATAATCAGAGGAATCGAACCTGCAAAAGTGGGCCAGTCTTAGATACACTATAGAGGAATAATCTTCTGAAACATTCTGTGTCTCATAGGACCTGCCTGAGGACCCAGCCCCAGTGCCAGCACATACACTGGGGCAGTGAGTAGATAGTATACTTTGTTACATGGGCTGGGGGGACATGGCCTGTGCCCTGGAGGGGACTTGAAGACATCCAAAAAGCTAGTGAGAGGGCTCCTAGATTTATTTGTCTCCAAGGGCTATATATAGCCTTCCTAACATGAACCCTTGGGTAATCCAGCATGGGCGCTCCCATATGCCCTGGTTTGATTAGAGAGCTCTAGATGTCTCCTGTCCCAGAACACCAGCCAGCCCCTGTCTTCATGTCGTGTCTAGGGCGGAGGGTGATTCAGAGGCAGGTGCCTGCGACAGTGGATGCAATTAGATCTAATGGGACGGAGGCCTCTCTCGTCCGTCGCCCTCGCTCTGTGCCCACCCCCGCCTCCCTCAGGCACAGCAGGCGTGGAGAGGATGCGCAGGAGGTAGGAGGTGGGGGACCCAGAGGGGCTTTGACGTCAGCCTGGCCTTTAAGAGGCCGCCTGCCTGGCAAGGGCCGTGGAGACAGAACTCGGGACCACCAGCTTGCACT

髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子(SEQ ID NO: 45)

caccgtggctttaacacttagagaaaatgcatcccctctaatcaataagtcatcgacagtgggtagatggaggaacggcagtgcgtagtaggatgcgtgcaagcatagtctcgtgcatgggtgcatagatcgctgggcaggtggacaaggtgggggtggataaagaagtgggtagatgattgatgttaggtaaatatcactgggtggacagatgggtggtaggtggatggatggttagaatagtcagaagagggatggattgataaggtgaacagatgataaatgggtgatagactggaagggttgtcaaaagaggataagggaagtgtgagctagccgtatttctaaggtcagtaatagagttgggagaagaggttaagttacatccatttaaacctcacacgaagctgagagggaatggacttgctgccgttggtgaggaaagcgttgcatttcccgtgtgcttggttgtgaagtgctcaggtcccacatgaagcagtcaggttactgcggcttacagaggagccagatccaaatgccccgagtaagcacgtccccgagccagaggcctccagcggaatccgggagagggattgctcagtgccctgcttccctggactgtaagctgcagaaagatgtgggaagtcctgttctccactgagaacactaaaagcaccttttgtcaaacgaccgcttcacatctggggcttgtgcactggtggccttttaaaccagagacaacccacaagatacctaacctgcggggctctctggtacagtgagcaactcaggaaatgctttggcttgattgctgtgggctctcaggccatcgccctctggagtggttcttttaatgagaacctgaagattggcccctgagccatgtataccaagcaagctcaatccaggttagctccctctggttggggcaagctaacgtgctccttgggccccgcgcgtaactgtgcgttttataggagacagctagttcaagaccccaggaagaaagcggctttgtccccctctaggcctcgtacaggcccacattcatatctcattgttgttgcaggggaggcagatgcgatccagaacaatgggacctcggctgaggacacggcggtgacagactccaagcacacagcagacccaaagaataactggcaaggcgcccacccagctgacccagggaaccgcccccacttgatccgcctcttttcccgagatgccccgggaagggaggacaacaccttcaaagacaggccctcagagtccgacgagcttcagaccatccaagaagatcccacagcagcttccgaagaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatc

Claims

1.基因构建体，其包含编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的核苷酸序列，用于治疗和/或预防代谢紊乱，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统(CNS)，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中的表达。

2.根据权利要求1使用的基因构建体，其中，编码FGF21的核苷酸序列与遍在启动子可操作地连接。

3.根据权利要求1或权利要求2使用的基因构建体，其中，遍在启动子选自由CAG启动子和CMV启动子组成的组，优选地，其中所述遍在启动子是CAG启动子。

4.根据权利要求1-3中任一项使用的基因构建体，其中所述基因构建体包含在希望防止FGF21表达的组织中表达的microRNA的至少一个靶序列。

5.根据权利要求1-4中任一项使用的基因构建体，其中所述microRNA的至少一个靶序列选自与在哺乳动物的心脏和/或肝脏中表达的microRNA结合的那些靶序列。

6.根据权利要求1-5中任一项使用的基因构建体，其中编码FGF21的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子和在肝脏中表达的microRNA的至少一个靶序列和在心脏中表达的microRNA的至少一个靶序列。

7.根据权利要求5或6使用的基因构建体，其中在心脏中表达的microRNA的靶序列选自SEQ ID NO：13和21-25，在肝脏中表达的microRNA的靶序列选自SEQ ID NO：12和14-20。

8.根据权利要求5-7中任一项使用的基因构建体，其中所述基因构建体包含microRNA-122a的靶序列和microRNA-1的靶序列。

9.根据权利要求1-8中任一项使用的基因构建体，其中，编码FGF21的核苷酸序列选自由以下组成的组：

10.表达载体，其包含权利要求1-9中任一项所述的基因构建体，用于治疗和/或预防代谢紊乱，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中的表达。

11.根据权利要求10使用的表达载体，其中，所述表达载体是病毒载体。

12.根据权利要求10或11使用的表达载体，其中，所述表达载体选自由腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体组成的组，优选地，其中所述表达载体是腺伴随病毒载体。

13.根据权利要求10至12中任一项使用的表达载体，其中，所述表达载体是血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh10、rh8、Cb4、rh74、DJ、2/5、2/1、1/2或Anc80的腺伴随病毒载体，优选地，其中所述表达载体是血清型1、2或9的腺伴随病毒载体。

14.药物组合物，其包含根据权利要求1-9中任一项的基因构建体和/或根据权利要求10-13中任一项的表达载体，以及一种或多种药学上可接受的成分，用于治疗和/或预防代谢紊乱，其中所述治疗涉及基因构建体在中枢神经系统中，优选在脑中，更优选在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中，最优选在下丘脑中的表达。

15.根据权利要求1-9中任一项使用的基因构建体和/或根据权利要求10-13中任一项使用的表达载体和/或根据权利要求14使用的药物组合物，其中所述基因构建体和/表达载体和/或药物组合物通过CSF内施用来施用。

16.根据权利要求1-9中任一项使用的基因构建体和/或根据权利要求10-13中任一项使用的表达载体和/或根据权利要求14使用的药物组合物，其中所述代谢紊乱是糖尿病和/或肥胖症。