CN109844124B - 年龄相关疾病和病症的基因治疗方法 - Google Patents

Abstract

提供基因治疗方法，用于通过调控与年龄相关疾病或病症关联的一种或多种功能性蛋白来治疗或预防年龄相关疾病或病症。

Description

年龄相关疾病和病症的基因治疗方法

相关申请数据

本申请要求2016年5月20日提交的美国临时申请号62/339,182和2016年11月14日提交的美国临时申请号62/421,665的优先权，其全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

政府利益声明

本发明是在国立卫生研究院授予的HG005550的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。该ASCII拷贝创建于2017年6月21日，名为010498_00961-WO_SL.txt，大小为221,563字节。

背景

衰老是细胞，组织和器官水平的功能逐渐丧失和恶化，导致对疾病和外部应激源的易感性增加，并最终导致死亡。所有生物都会衰老，但衰老的影响可以被减缓或减小或操纵。许多实验已经显示出增加最大寿命以及健康寿命的能力，同时对年龄相关病症的易感性降低。迄今为止测试的衰老干预措施包括环境操纵，如热量限制(CR)，小分子药物如雷帕霉素，以及通过创造转基因动物如Ames和Snell矮小鼠实现的遗传操纵。虽然这些实验已经使人们更加了解衰老所涉及的机制，但它们并不适合转化至衰老的人类和宠物群体。热量限制要求严格遵守饮食限制，迄今为止的证据表明这不是治疗的可能途径。雷帕霉素具有免疫调节作用，可增加对某些病原体的易感性。而且创造转基因动物并不适用于所有现存的生物。在Bernardes de Jesus B.等人，(2012)EMBO Mol Med.4(8):691-704中描述了将hTERT经AAV递送到抗癌遗传背景小鼠中。

基因治疗方法是已知的。例如，GLYBERA是来自uniQure的人类基因疗法，其通过肌内注射AAV(腺相关病毒)来添加所涉及基因的工作拷贝来治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)。SPK-RPE65来自Spark治疗公司，是一种人类基因疗法，可治疗由无功能的RPE65基因引起的罕见致盲症。

发明内容

本公开内容提供基因治疗方法，例如组合基因治疗方法，以提供或调控一种或多种内源蛋白质。本公开内容提供了使用基因疗法治疗或预防年龄相关疾病和病症或衰老表型的方法。本公开内容提供了对基因的鉴定，所述基因与可能与衰老关联的某些疾病和病症相关。本公开内容提供对这些基因的调控，通过增加与基因相关的蛋白质或减少与基因相关的蛋白质来实现。本公开内容提供了通过引入在细胞内表达的功能性蛋白质的编码核酸来增加与基因相关的功能性蛋白质。所述表达导致功能性蛋白质的量增加，所述功能性蛋白质可以是细胞内的或分泌的，从而提供治疗效果或预防效果。本发明提供了基因的抑制，从而通过引入编码抑制性RNA的核酸来减少与基因相关的功能性蛋白，所述抑制性RNA在表达时与基因或信使RNA结合以抑制功能性蛋白质的表达。本公开提供了功能性蛋白质的抑制，从而通过引入编码蛋白质抑制剂(例如可溶性受体蛋白质)的核酸来降低功能性蛋白质的活性，所述蛋白质抑制剂在表达时与功能性蛋白质结合。本公开内容提供了使用靶向动物细胞的遗传构建体的基因治疗方法，以及使用载体(例如病毒载体)对此类遗传构建体的递送。本公开内容提供了使用靶向动物细胞的遗传构建体的基因治疗方法，以及使用诸如脂质体、合成或天然存在的聚合物、电穿孔、涂覆或未涂覆的纳米颗粒递送、扩散粒子递送、激光介导转染(光穿孔或光转染)等方法对此类遗传构建体的递送。参见例如Kim,T.K.等,(2010)Analytical and Bioanalytical Chemistry.397(8):3173-3178。本公开内容提供了使用靶向动物细胞的遗传构建体的基因治疗方法以及对这种遗传构建体的递送，其中所述遗传构建体已经从原始DNA加工成miRNA，shRNA，RNAi，或mRNA(其中mRNA由5'帽和3'聚A或等同物组成)。根据另外的方面，使用本领域技术人员已知的5'帽类似物或本领域技术人员已知的3'聚A类似物将RNA靶向核糖体用于翻译。对于本文所述的基因治疗方法，本公开内容提供了基因或基因产物或编码该基因的DNA或对应于该基因的mRNA或对应于该基因的经加工的初-mRNA或miRNA在本文所述的基因治疗方法中的用途，只要基因或基因产物或编码该基因的DNA或对应于该基因的mRNA或对应于该基因的经加工的初-mRNA或miRNA被改变或调控以在本文所述的治疗或预防方法中提供细胞效应。

调控或提供与年龄相关疾病和病症关联的某些蛋白质提供了预防方法或治疗方法以解决年龄相关疾病和病症。调控或提供与年龄相关疾病和病症关联的某些蛋白质或基因或基因产物或编码该基因的DNA或对应于该基因的mRNA或对应于该基因的经加工的初-mRNA或miRNA提供了使包括人和其他哺乳动物在内的生物体恢复活力的方法。本公开提供了基因治疗方法，其中将一个或多个或多种核酸(例如基因)递送至动物中的一种或多种靶细胞。本公开内容使用单一载体向细胞递送多种核酸，所述核酸包括驱动其表达的单一启动子。表达一个或多个或多种核酸以产生一种或多种相应的蛋白质，并且一种或多种蛋白质改变生物体的病症。本公开提供了组合疗法，其中不同细胞类型被动物中的一个或多个或多种核酸靶向。

本公开提供了组合疗法，其中细胞内的一种或多种细胞过程被一个或多个或多种核酸靶向。本公开内容提供了使用病毒载体(例如细小病毒的病毒粒子)的基因治疗。本公开内容提供了使用病毒载体(例如腺相关病毒(“AAV”))的基因治疗。腺相关病毒将外源基因插入细胞中，并且由外源基因编码的蛋白质将会表达。以这种方式，蛋白质，无论是功能性蛋白质、抑制性RNA还是抑制性蛋白质，都会改变细胞和/或携带细胞的生物体。

本公开内容提供了与年龄相关疾病或病症的减缓，抑制，预防或逆转。示例性的年龄相关或其他疾病或病症包括心血管疾病，糖尿病，动脉粥样硬化，肥胖症，癌症，感染和神经障碍中的一种或多种。本公开提供了长期基因疗法以治疗和/或预防年龄相关疾病或病症或其他疾病或病症。这些方法包括逆转年龄相关疾病和病症，并纠正这些病理状态，从而提高健康寿命(良好生活质量的年数)和寿命。

本公开内容提供了用于鉴定待调控的基因或基因的集的方法，所述基因或基因的集预防或治疗一种或多种疾病或病症，例如与衰老相关的疾病或病症。基因或基因的集被鉴定为与年龄相关疾病或病症有关。确定基因与特定组织类型相关或不相关，从而可以确定使用所需方法对基因的适当调控。另外，与特定组织类型相关的基因可受益于使用特定载体的调控，所述特定载体向特定组织类型细胞递送核酸，抑制性RNA或抑制性蛋白质以调控特定组织类型细胞内蛋白质的量或活性。组织特异性启动子可用于表达核酸。

编码特定功能蛋白，抑制性RNA或抑制性蛋白的示例性核酸在附录A中提供，其序列在附录A中提供或者是文献中容易知道或可获得的。同样，功能性蛋白质，抑制性RNA或抑制性蛋白质的序列是本领域技术人员已知的，或者可以源自核酸序列。附录B包括基因的小鼠版本的DNA和氨基酸序列以及靶向多种RNA种类的初-miRNA(pri-miRNA)DNA构建体。

如本文所述的功能性蛋白质可以是全长蛋白质或是与全长蛋白质不同但保留全长蛋白质的全部或部分活性的蛋白质。

本发明的某些实施方式的其他特征和优势将在权利要求中以及以下附图和实施方式的说明下更为显而易见。

附图说明

图1是AAC手术后7周后的代表性超声心动图。

图2是显示TGFb1敲减对比剂量的数据图。

图3是显示纤维化百分比和相关图像的数据图。

图4是显示对照心脏和经处理的心脏切片的WGA染色的图像。

图5是显示对照中心脏参数变化对比sTGFbR2-FC给予中心脏参数变化的数据图。

图6是代表性的三色染色图像。

图7是存活百分比对比时间天数的图。

图8A是FGF21的体重减轻对比时间天数的图。图8B是各种FGF21基因治疗的体重减轻对比时间天数的图。

图9是GDF15，脂连蛋白，ZAG和Nrf2的体重减轻对比时间天数的图。

图10是包含ITR启动子sTGFbR2-Fc和3'UTR的病毒构建体的载体图。

图11是包含ITR启动子Nrf2和3'UTR的病毒构建体的载体图。

图12是7种初-miRNA的可能构建及其连接顺序的载体图。对于miRNA的正确加工，在“shRNA”部分中计划的错配位置还用红色标记。图中按顺序分别公开了SEQ ID NO：137的核苷酸序列和SEQ ID NO：138-145的氨基酸序列。

图13是6种初-miRNA的可能构建及其连接顺序的载体图。对于miRNA的正确加工，在“shRNA”部分中计划的错配位置还用红色标记。图中按顺序分别公开了SEQ ID NO：146的核苷酸序列和SEQ ID NO：147-151的氨基酸序列。

图14描绘了ELISA测定设计。

图15描绘了狗血清中可溶性TGFb受体2与TGFb1结合的数据。

图16是对照小鼠对比用FGF21处理的小鼠的食物摄入的图。

图17描绘了对照小鼠对比用FGF21处理的小鼠的数据。

图18描绘了葡萄糖水平数据。

图19描绘了分数缩短数据。

图20描绘了基因治疗后存活百分比的数据。

图21描绘了针对增加的健康寿命的数据。

图22描绘了对照小鼠的肾脏对比用本文所述的基因疗法治疗的小鼠的肾脏。

具体实施方式

本公开内容提供了基因治疗方法，其中向对象内的细胞提供编码功能性蛋白质，抑制性RNA或抑制性蛋白质的一个或多个或多种核酸。一个或多个核酸通过一种或多种载体给予或组合入单一病毒载体，例如AAV，以治疗或预防与衰老相关的疾病或病症和年龄相关生理衰退。

在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”、“所述”包含复数指示物，除非上下文中有明确的另外说明。因此，例如，提及“蛋白质”包括一种以上的蛋白质，并且提及“赋形剂”包括一种以上的赋形剂。

还应理解，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。类似地，“包括”，“包含”，“含有”，“涵盖”，“具有”和“含”是可互换的而不是限制性的。此外，在各种实施方式的描述使用术语“包括”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况中，可以使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言来替代地描述实施方式。

前面的一般描述(包括附图)和以下的详细描述仅是示例性和说明性的，并不是对本公开的限制。

本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制主题。

定义

参考本公开，除非另外特别定义，否则本文描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。因此，以下术语旨在具有以下含义：

如本文所用的“基因”是指核酸区域，也称为转录区域，其表达多核苷酸，例如RNA。转录的多核苷酸可以具有编码多肽例如功能性蛋白质的序列，当置于合适的调控区域的控制下时，该序列可以翻译成编码的多肽。基因可包含数个操作性连接的片段，例如启动子，5'前导序列，编码序列和3'非翻译序列，例如聚腺苷酸化位点。嵌合或重组基因是通常在自然界中不存在的基因，例如这样的基因，该基因中(例如)启动子与部分或全部的转录DNA区域天然无关联。“基因的表达”是指其中基因转录成RNA和/或翻译为功能性蛋白质的过程。

“基因递送”或“基因转移”是指将重组或外源DNA导入宿主细胞的方法。转移的DNA可以保持未整合或优选整合到宿主细胞的基因组中。基因递送可以例如使用病毒载体通过转导，或使用已知方法(例如电穿孔，细胞轰击)通过细胞转化来进行。

“转基因”是指已被导入宿主细胞的基因。转基因可包含细胞天然的序列，细胞中不天然存在的序列，或其组合。转基因可含有编码一种或多种蛋白质的序列，所述蛋白质可与适当的调控序列可操作地连接以在细胞中表达编码序列。

“转导”是指将核酸分子递送到受体宿主细胞中，例如通过基因递送载体，例如rAAV。例如，通过rAAV病毒颗粒转导靶细胞导致包含在该病毒颗粒中的rAAV载体被转移到转导的细胞中。“宿主细胞”或“靶细胞”是指发生核酸递送的细胞。

“功能性蛋白质”包括全长蛋白质的变体，突变体，同源物和功能片段。本领域技术人员将能够容易地构建与全长蛋白质同源的蛋白质，其全部或部分保留全长蛋白质的活性。

“载体”通常是指适于克隆和表达核苷酸序列的核酸构建体。载体的一个例子是病毒载体。术语载体有时也可以指包含载体，例如病毒或病毒颗粒的运输载剂，其能够将载体转移到宿主细胞中和在宿主细胞之间转移载体。

“AAV载体”或“rAAV载体”是指衍生自腺相关病毒血清型的重组载体，例如AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV12，AAV2.5，AAvDJ，AAVrh10.XX等。rAAV载体可以缺失一种或优选所有野生型AAV基因，但仍包含功能性ITR核酸序列。功能性ITR序列是AAV病毒颗粒的复制、拯救和包装所必需的。ITR序列可以是野生型序列或基本上相同的序列(如下定义)，或者可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或取代来改变，只要这些序列保持功能。

“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量，所述结果例如针对年龄相关疾病或病症的结果。细小病毒的病毒颗粒或药物组合物的治疗有效量会根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及细小病毒的病毒颗粒或药物组合物在个体中引起所需响应的能力而不同。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。治疗有效量也是细小病毒的病毒颗粒或药物组合物的治疗有益效果胜过毒性或有害效果的量。

“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量，所述结果例如防止或抑制各种年龄相关疾病或病症的结果。预防剂量可在疾病之前或者在疾病的早期阶段用于对象，并且在某些情况下预防有效量可以多于或少于治疗有效量。

“核酸”包括由单体核苷酸组成或包含单体核苷酸的任何分子。术语“核苷酸序列”可与本文的“核酸”互换使用。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核酸可以是DNA或RNA。核酸可以是基因。核酸可以是经化学修饰的或人工的。人工核酸包括肽核酸(PNA)，吗啉代和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。通过改变分子主链，这些中的每一个都与天然存在的DNA或RNA不同。而且，可以使用硫代磷酸酯核苷酸。

“核酸构建体”在本文中应理解为意指由使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。核酸构建体是单链或双链的核酸分子，其已被修饰为含有核酸区段，所述核酸区段以一种在自然界中不存在的方式组合和并置。核酸构建体通常是“载体”，即用于将外源产生的DNA递送到宿主细胞中的核酸分子。一种类型的核酸构建体是“表达盒”或“表达载体”。这些术语是指能够在宿主细胞或与这些序列相容的宿主生物中实现基因表达的核苷酸序列。表达盒或表达载体通常至少包括合适的转录调控序列和任选的3'转录终止信号。还可以存在实现表达所必需或有帮助的其他因子，例如表达增强子元件。核酸构建体也可以是载体，其通过作为RNA而不是DNA操作来指导蛋白质的表达或抑制。在增加靶蛋白表达的情况下，该核酸构建体可以是mRNA或类似物，其中细胞或更具体地核糖体将识别并产生许多拷贝的蛋白质。在抑制靶序列表达的情况下，RNA可以是通过阻止核糖体产生蛋白质而起作用的形式，这可以通过RNAi或shRNA或miRNA或初-miRNA的机制来完成。人们还可以通过布尔逻辑来想象，如果抑制靶序列的已知阻遏物，则反过来实际上通过抑制实现靶序列的增加，并且本领域技术人员可以对靶蛋白进行抽象，从而通过递送mRNA(或类似物)或shRNA(或类似物)实现的“倒位”或“暗示”的组合可以产生靶序列的调控。这也可以通过载体来完成，所述载体提供必须在AAV中表达的DNA。

“操作性连接”是指多核苷酸(或多肽)元件以功能关系的连接。当将核酸置于与另一核酸序列的功能性关系中时，其是“操作性连接”。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则它与编码序列操作性连接。操作性连接意指连接的DNA序列通常是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区域连续连接并且在阅读框架中连接。

“表达控制序列”是指调控与其操作性连接的核苷酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调控核苷酸序列的转录和/或翻译时，表达控制序列与核苷酸序列“操作性连接”。因此，表达控制序列可包括启动子，增强子，内部核糖体进入位点(IRES)，转录终止子，蛋白质编码基因前的起始密码子，内含子的剪接信号，2A肽序列(允许多顺反子表达)和终止密码子。术语“表达控制序列”旨在至少包括其存在被设计为影响表达的序列，并且还可以包括其他有利组分。例如，前导序列和融合伴侣序列是表达控制序列。该术语还可以包括核酸序列的设计，使得从序列中除去框内和框外的不期望的潜在起始密码子。它还可以包括核酸序列的设计，从而去除不期望的潜在剪接位点。它包括序列或聚腺苷酸化序列(pA)，其指导聚A尾的添加，即mRNA的3'末端的腺嘌呤残基串，其可称为聚A序列。它还可以设计用于增强mRNA稳定性。影响转录和翻译稳定性的表达控制序列，例如启动子，以及影响翻译的序列，例如适用于昆虫细胞的Kozak序列，是本领域技术人员熟知的。表达控制序列可具有调控与其操作性连接的核苷酸序列的性质，从而实现较低的表达水平或较高的表达水平。

还可以将功能域融合到已知的蛋白质上。这是线粒体信号与CAT(过氧化氢酶)融合的情况，使得过氧化氢酶被靶向以穿梭至线粒体并在线粒体内部或附近而不是过氧化氢酶的天然位置发挥其功能。还可以向其他蛋白质添加靶向信号，使其靶向细胞的其他部分或甚至从细胞分泌。在一些蛋白质的情况下，更好的已知形式可以取代天然序列以增强效果，例如将TGFbR2的人或小鼠分泌信号与狗形式的蛋白质融合。

“启动子”或“转录调控序列”是指用于控制一个或多个编码序列的转录的核酸片段，并且位于编码序列的转录起始位点的转录方向的上游，并且结构上通过DNA依赖性RNA聚合酶、转录起始位点和任何其他DNA序列的结合位点的存在来鉴定，包括但不限于转录因子结合位点，阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知直接或间接地起作用以调控来自启动子的转录量的任何其他核苷酸序列，包括例如衰减子或增强子，以及沉默子。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是，例如，由应用化学诱导剂在生理上或发育上调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。本公开内容提供了核酸构建体与哺乳动物细胞相容的表达控制序列(例如启动子)的操作性连接。许多这样的启动子是本领域已知的(参见Sambrook和Russell，2001，同上)。公开了在许多细胞类型中广泛表达的组成型启动子，例如CMV和hEf1α启动子。还公开了全长hEf1α的变体，其较短但仍提供有效的组成型表达。公开了可诱导的，组织特异性的，细胞类型特异性的或细胞周期特异性的启动子。在公开的实施方式中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列与肝特异性启动子操作性连接。肝特异性启动子特别优选与非红细胞脱氨酶结合使用。优选地，在本公开的构建体中，用于肝特异性表达的表达控制序列(例如)选自α-抗胰蛋白酶(AAT)启动子，甲状腺激素结合球蛋白启动子，白蛋白启动子，甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子，肝脏控制区(HCR)-ApoCII混合启动子，HCR-hAAT混合启动子，与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。其他示例包括用于肿瘤选择性的E2F启动子，特别是神经细胞肿瘤选择性表达(Parr等，(1997)Nat.Med.3:1145-9)或用于单核血细胞的IL-2启动子(Hagenbaugh等，(1997)J Exp Med；185:2101-10)。

“3'UTR”或“3'非翻译序列”(通常也称为3'非翻译区，或3'末端)是指在基因编码序列下游发现的核酸序列，其包含，例如，转录终止位点和(在大多数但不是所有真核mRNA中)聚腺苷酸化信号(例如，AAUAAA或其变体)。在转录终止后，mRNA转录物可以在聚腺苷酸化信号的下游被切割，并且可以添加聚(A)尾，其涉及mRNA向细胞质(其中发生翻译)的转运。

如本文所用的“天然存在的序列”或“天然序列”是指从天然存在的来源分离的多核苷酸或氨基酸。“天然序列”包括天然多肽或多核苷酸的重组形式，其具有与天然形式相同的序列。

如本文所用的“突变体”或“变体”是指通过取代，插入和/或缺失而被改变的氨基酸或多核苷酸序列。在一些实施方式中，与亲本序列相比，突变体或变体序列可具有增加的，减少的或基本相似的活性或性质。

“序列同一性百分比”和“百分比同源性”在本文中可互换使用，指多核苷酸和多肽之间的比较，并通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定，其中，与用于两个序列的最佳比对的参考序列相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括添加或缺失(即，缺口)。该百分比可如下计算：通过测定两种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数产生匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列相同性百分比。或者，该百分比可如下计算：测定两种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，或者测定核酸碱基或氨基酸残基与间隙对齐的位置数，产生匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列相同性百分比。本领域技术人员理解，有许多已建立的算法可用于比对两个序列。可通过Smith和Waterman,(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索法、通过计算机执行这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目测(参见例如，《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，《新编实验指南》(CurrentProtocols)，Greene出版公司和约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)(1995增刊))进行最优序列比对以便比较。

适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的算法示例是BLAST和BLAST2.0算法，分别描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然后，沿各个序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，和比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。

氨基酸序列同一性百分比的程度也可以通过ClustalW分析(版本W 1.8)来获得，这通过计算比对中相同匹配的数量并将这些相同匹配数除以参考序列的长度来实现，并使用以下默认ClustalW参数实现缓慢/准确的成对最佳比对–缺口罚分：10；缺口延伸罚分：0.10；蛋白质重量矩阵：Gonnet系列；DNA重量矩阵：IUB；切换慢速/快速成对比对＝慢速或完全对齐。

“对象”或“患者”是指哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛，猪，马，猫，狗，大鼠等)或灵长类动物(例如猴子或人)。优选地，哺乳动物是家养动物，例如狗，猫，小鼠，牛，绵羊，山羊，马，猪或人类对象。在一些实施方式中，人是成年患者。在一些实施方式中，人是儿科患者。

通过表达功能蛋白和调控功能蛋白表达的基因治疗

如上所概述，本公开内容提供了在治疗或预防与靶向的基因相关的疾病或病症的方法中调控一个或多个或多种基因或其相关的功能蛋白。特别地，个体靶向的基因或靶向的基因的一种或多种组合与年龄相关疾病或病症和/或影响生物寿命相关。所述基因疗法靶向的基因或基因产物涉及多种细胞作用，例如代谢活性，胰岛素样生长因子活性途径(即IGF1/GH/mTOR轴)，线粒体功能，炎症/纤维化，自噬，神经功能，基因组稳定性等。作为示例而非限制，基因治疗可以基于过表达功能性蛋白质或其突变体形式的核酸或基因中的一种或多种；调控另一种靶基因/蛋白质的功能性蛋白质的表达；表达多核苷酸，如抑制性RNA，以调控靶基因的表达；和原位修饰靶基因的基因编辑系统的表达。此类核酸可以是“合成核苷酸序列”，其在本文中理解为意指核苷酸序列并非天然如此，而是通过人为干预设计、工程化和/或构建。因此，术语“合成”不一定意味着专门和/或完全通过化学合成获得序列。相反，尽管合成序列的一部分可以在一个阶段通过化学合成获得，但是包含本发明的合成序列的分子通常将从生物来源获得，例如(培养的，例如重组的)细胞。

在一些实施方式中，表1中提供了用于治疗应用的基因和相应表达的基因产物，其可以例如通过病毒载体系统或Cas9引导RNA系统给予。

表1

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表1中的描述鉴定了示例性基因以及该基因是否在该方法中过表达(“过表达”)或受抑制(“初-miRNA/shRNA”)。因此，当描述提及“过表达”基因时，基因疗法是指使用编码所示蛋白质产物的核酸并且蛋白质产物过表达。因此，在这样的描述中，对鉴定的基因的提及也指由该基因编码的蛋白质。例如，“klotho”可以指基因和由该基因编码的蛋白质。在一些实施方式中，核酸可以编码蛋白质产物，其是天然存在的表达蛋白质的突变形式。作为示例而非限制，Adra1a(mut)是指编码天然存在的Adra1a蛋白产物的突变形式的核酸序列，其中表达的受体蛋白的突变形式是组成型活性的。当表1中的描述提及“初-miRNA/shRNA”时，基因疗法是指使用具有表达的初-miRINA/shRNA序列的核酸，其中表达的pri-miRINA/shRNA抑制或最终减弱靶基因的基因产物的表达。

在一些实施方式中，用于基因治疗的核酸可以使用与本文提供的或本领域已知的基因序列同源的序列，并且其功能为参考蛋白，抑制性RNA或抑制性蛋白。因此，本公开涵盖本文所述的核酸序列和与其至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源的核酸序列。同样地，本公开考虑了本文所述的氨基酸序列和与其至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源的氨基酸序列，使得蛋白质至少全部或部分保留功能或活性。应理解，技术人员可以容易地设计与本文鉴定的或本领域已知的核酸序列不同的核酸序列，以基于遗传密码的简并性编码已知蛋白质。因此，应理解，本文中特定核酸序列的鉴定不是限制性的。

应理解，表1中的每个基因和因此相应的核酸可以分别用于基因治疗方法中，以产生所需的生理(例如治疗)效果。在一些实施方式中，表1中核酸的组合可用于基因治疗方法中以产生所需的治疗效果。因此，如本文所述，本公开涵盖表1中基因和相应核酸的每种可能组合，用于基因治疗。在一些实施方式中，基因疗法包括表1的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53个或所有核酸的组合，其中所述组合具有预期的治疗效果，特别是关于治疗或预防与年龄相关疾病或病症。应理解，本领域技术人员可容易地设想核酸的组合和亚组合用于治疗方法。

根据一个方面，表1中的一种或多种基因，例如FGF21或Klotho，可以与稳定肽(例如sTGFbR2-FC)操作性连接，以增加其半衰期。技术人员可以容易地鉴定合适的融合肽，例如FC。此外，本公开考虑了表1中列出的一种或多种基因的修饰，例如FGF21和Klotho，以增加由该基因编码的蛋白质的稳定性或半衰期。

根据一个方面，表1中的一个或多个基因，例如FGF21或Klotho，可以与分泌信号操作性连接，使得分泌信号以增强表达的方式附着于分泌的蛋白质。技术人员可以容易地鉴定合适的分泌信号和向分泌蛋白添加分泌信号以增强表达的方法。

在表2中鉴定的一些实施方式中，用于治疗或预防与年龄相关疾病或病症的基因疗法的方法包括向有此需要的对象给予有效量的一种载体或多种表达以下基因的载体，其表达如上表1所述的基因产物。

表2：

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在前述示例性实施方式中，当存在两种或更多种用于基因治疗的基因时，基因可以单独地或在允许的情况下(例如，基于病毒基因治疗载体的容量)以某些组合形式包含在单独的基因递送载体中，例如基于预期的靶组织，如下面进一步所述。

如本文进一步详细描述的，表1中的核酸和相应的核酸构建体，表达盒，表达载体，表达控制序列，启动子和与核酸序列递送相关的其他元件可以构建为基因递送载体，例如病毒载体。在导致核酸表达的条件下将载体给予哺乳动物，所述核酸以提供预防或治疗效果的方式改变功能性蛋白质的水平。因此，本公开内容还考虑了载体，特别是病毒载体，更特别是用于表1中列出的每个基因和相应核酸的AAV载体。这些病毒载体的细节描述如下。

在一些实施方式中，可以共同调控表1的核酸以产生期望的治疗效果。所使用的基因治疗和相应的核酸可以基于期望的影响进行分组，所述期望的影响包括对下述的影响：代谢、IGF1或GH信号传导、蛋白质合成或自噬、炎症、纤维化或免疫应答、基因组稳定性、癌症、线粒体适宜数或功能、氧化或神经功能等。

表3基于对指示的生物功能的影响鉴定示例性基因及其分组，所述生物功能可以被共同调控以实现期望的影响。

表3

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10*表示假设的影响。

0*表示对寿命的积极影响。

在一些实施方式中，基因治疗方法涉及表2或3中每组中提供的核酸(即基因)的示例性组合。在一些实施方式中，基因疗法包括就FGF21、GDF15(hNAG)、Slc13a1、mTOR、Cebpa/Cebpb、Dgat1、Insr、Ubd、Prkar2b、UCP1、Pck1、Sirt1、脂连蛋白、AMPK、PCSK9和Slc13a5(INDY)(如表1中所提供)而言的核酸组合或亚组合用于例如治疗或预防与衰老相关的代谢病症或疾病的用途。

在一些实施方式中，基因疗法包括就FGF21、GDF15(hNAG)、Pappa、Klotho、mTOR、Sirt6、sIFG1r-Fc、Akt1、和Rps6kb1(S6K1)(如表1中所提供)而言的核酸组合或亚组合用于例如治疗或预防与IGF1/GH活性(特别是涉及与年龄相关疾病或病症的此类活性)相关的病症或疾病的用途。

在一些实施方式中，基因疗法包括就mTOR、Cisd2、Atg5、Akt1、TFEB(如表1中所提供)而言的核酸组合或亚组合用于例如治疗或预防与蛋白质合成和自噬(特别是涉及与年龄相关疾病或病症的此类活性)相关的病症或疾病。

在一些实施方式中，基因疗法包括就Klotho，FGF21，Ctf1，Txn1，Nrf2，Sirt1和sTGFbR2-FC(如表1中所提供)而言的核酸组合或亚组合用于例如治疗或预防炎症、纤维化、免疫病症或疾病(特别是与年龄相关疾病或病症有关的此类活性)的用途。示例性的基因组合包括FGF21和Klotho；FGF21和sTGFbR2-FC；Klotho和sTGFbR2-FC或FGF21，Klotho和sTGFbR2-FC。

在一些实施方式中，基因疗法包括就Coq7，Ctf1，NUDT1，BubR1，TERT，Par4SAC结构域和HAS2(如表1中所提供)而言的核酸组合或亚组合在用于例如治疗或预防DNA损伤，基因组不稳定性或癌症(特别是涉及与年龄相关疾病或病症的此类活性，例如DNA损伤或基因组不稳定性)的用途。

在一些实施方式中，基因疗法包括就Adcy5，Agtrla，Cisd2，Coq7，mCAT，Mt1，Pck1，Sirt6，Slcl3al，Nrf2和TFAM(如表1中所提供)而言的核酸组合或亚组合在用于例如治疗或预防与线粒体功能或氧化损伤有关的病症或疾病(特别是涉及与年龄有关的疾病或病症的此类活性)中的用途。

在一些实施方式中，基因疗法包括就Ikbkb，NUDT1，Adra1a(mut)，NGF，NEU1，人源化FoxP2和PDE4b(如表1中所提供)而言的核酸组合或亚组合用于例如治疗或预防神经病症或疾病，如认知障碍或认知能力下降，特别是与衰老相关的神经系统病症或疾病中的用途。

还应理解，用于治疗或预防相应类别的生物过程中的病症或疾病的基因和相应核酸的组可与一个或多个基因和相应核酸的其他组组合使用，以治疗多种类别的生物过程，特别是那些与衰老有关的生物过程。因此，本公开内容包括使用表1中列出的或在上表2或表3中的不同组中鉴定的基因和相应核酸的每种可能组合的基因治疗方法。用于(i)治疗或预防代谢病症或疾病，(ii)IGF1/GH活性相关病症或疾病，(iii)与蛋白质合成和自噬相关的病症或疾病，(iv)炎症，纤维化，免疫状况或疾病，(v)DNA损伤，基因组不稳定或癌症，(vi)与线粒体功能或氧化损伤相关的病症或疾病；和(vii)神经病症或疾病的基因疗法的基因和相应核酸的组可以组合或亚组合使用以治疗多种疾病或病症，特别是与衰老有关的多种疾病或病症。举例来说，用于治疗或预防神经疾病或病症(vii)的基因和相应核酸的组的组合或亚组合可与用于治疗或预防与线粒体功能相关的疾病或病症(即氧化损伤组，即组(iv))的基因和相应核酸的组的组合或亚组合一起使用。其他此类示例性组合包括，作为示例而非限制，前述组(i)至(vii)的2、3、4、5、6或全部7个的组合。

在一些实施方式中，还可以基于为基因治疗而靶向的组织类型来选择用于本文的基因治疗方法的基因和相应核酸的组。用于在特定组织中表达的合适的基因递送构建体可以掺入相关核酸用于基因治疗。在一些实施方式中，组织特异性递送基于合适的病毒载体和病毒包装系统的选择。病毒载体可以掺入合适的启动子和其他转录调控因子，其允许基因产物在靶向的组织中表达。病毒包装系统可以使用用于包装病毒载体的病毒组分的宿主细胞范围特异性，以便将基因治疗载体递送至靶向的组织。在AAV载体和衣壳设计的背景下，AAV血清型(天然存在的或合成的衍生物)可用于操纵基因治疗应用的趋向性范围，如下文进一步详细描述的。例如，神经元靶向的基因可以使用设计用于穿过血脑屏障的病毒衣壳，例如AAV9，而肝靶向的基因可以使用AAV8，其不会以相同的程度穿过血脑屏障但是在肝脏和肌肉中积累。

其他组织特异性方法可用于限制感兴趣组织中的表达，其中包括使用组织特异性启动子和靶向靶组织中表达的那些序列的miRNA结合位点。表4提供了如本文所定义的示例性基因治疗核酸，被靶向的细胞或组织，AAV血清型或对靶组织具有适当趋向性的血清型组合，在特定细胞或靶组织中起作用以调控表达的示例性启动子，给药途径和基因大小：A＝脂肪组织，M＝肌肉组织，B＝脑组织，L＝肝组织，E＝整个生物体的全身递送，N＝非脑组织，H＝心脏组织。表4还表明基因产物是表达蛋白还是抑制剂RNA。在一些实施方式中，用于基因治疗的核酸包括表达抑制剂元件，其在表达时抑制或减弱基因产物在一个或多个非靶组织中的表达，也称为脱靶向(参见，例如，Broderick等，(2011)Gene Ther.18(2):1104-1110，通过引用并入本文)。在表4中，示例性抑制剂元件是在表达的mRNA的3'UTR处的miRNA的序列，使得mRNA(或其他转录的RNA，例如初-miRNA/shRNA)在指定的非靶组织(例如肝脏)中沉默。用于在非靶组织中脱靶向表达的各种miRNA包括用于在肝细胞中沉默表达的miRNA-122，用于在神经元细胞中沉默表达的miRNA-124，以及用于在造血细胞中沉默表达的miRNA-142。本领域已知的用于抑制特定细胞和组织中的表达的其他miRNA可以由本领域技术人员用于本发明的基因治疗应用中。这种沉默性miRNA靶向序列中的一种或组合可用于抑制或减弱基因治疗构建体在一种或多种非靶细胞和组织中的不希望的表达，其中非靶组织可彼此不同。

表4

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根据表4中的描述，本公开内容涉及示例性基因治疗载体，其含有为表4中针对实施方式1-53中每一个特定的元件(即，基因，启动子，miRNA沉默子)。在一些实施方式中，基因治疗载体可以基于载体构建体hEf1a-WPRE3-SV40，其中Hef1a是指人延伸因子1a启动子；WPRE3是土拨鼠肝炎转录后调控元件的截短形式；并且SV40是SV40聚腺苷酸化位点的截短形式(PMCID:PMC3975461)。本公开内容涉及具有特定AAV血清型的重组AAV病毒颗粒和针对表4中实施方式1-53中每一个的特定载体元件。可以使用适当的AAV辅助病毒提供特异于重组病毒颗粒血清型的AAV衣壳蛋白。参见，例如，Yuan等，2011,Hum Gene Ther.22(5):613-24，通过引用并入本文。hEf1a还可以指hEf1a启动子的截短形式，其长231bp并且以SEQ IDNO：18引用。

在一些实施方式中，根据用于将核酸递送到靶细胞中的基因治疗载体的容量，病毒载体可具有两种或更多种核酸，用于表达两种或更多种相应的功能蛋白、抑制性RNA或抑制性蛋白。用于表达不同基因表达产物的每种核酸可以具有其自身的转录调控元件，并且如果表达蛋白质，可以具有单独的翻译调控元件，从而表达分开的RNA。在一些实施方式中，单一RNA可以以顺反子形式表达，其中基因产物由单一RNA表达。因此，在一些实施方式中，基因治疗载体可具有多顺反子元件，例如内部核糖体进入位点(IRES)或2A序列(PMCID:PMC3084703)，用于诱导核糖体跳跃，因为它们可能需要表达来自单一RNA的不同基因治疗产物。

在一些实施方式中，在用表达多种不同基因产物的多种核酸进行基因治疗时，将两种或更多种基因递送载体，特别是病毒载体给予哺乳动物。因此，在一些实施方式中，本公开内容提供同时或分开给予2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个单独的载体，用于在基因治疗方法中递送相关基因。单独给予或作为载体组合给予的每种单独载体的量可以基于载体设计、待递送的核酸序列、递送至靶组织的效率、给药方式和预期治疗效果等来确定。在各种实施方式中，可以从每个对象的最大病毒剂量通过每个单独载体的有效性来评估同时给予的每种病毒载体的最佳比例。本领域技术人员可基于本公开确定合适的比例和剂量。

表2中给出了具有用于基因治疗的一种或多种基因的病毒载体的示例性集合。对于用表达参考蛋白质和/或抑制性RNA的基因的组合进行基因治疗，在基因治疗方法中将如上所述的多种病毒给予哺乳动物。因此，本公开内容提供了给予多种病毒的方法，所述病毒包括一个或多个或多种基因、抑制性RNA或抑制性蛋白质，其示例和组合在下文提供，特别是用于治疗或预防与衰老相关的疾病或病症。

在组1中，病毒1包括AAV8-GFP作为对照，病毒2包括AAV9:GFP作为对照。

在组2中，在基因治疗方法中将包括单一基因GDF15的单一病毒给予哺乳动物。

在组3中，病毒1包括TERT，病毒2包括BubR1。

在组4中，病毒1包括GDF15，病毒2包括TERT，病毒3包括BubR1。

在组5中，病毒1包括GDF15，病毒2包括TERT，病毒3包括FGF21，病毒4包括BubR1。

在组6中，病毒1包括GDF15，病毒2包括TERT，病毒3包括FGF21，病毒4包括Klotho，病毒5包括BubR1。

在组7中，病毒1包括BubR1，p2A和Par4，病毒2包括Cis2d，病毒3包括Txn1，病毒4包括FGF21，病毒5包括BubR1，病毒6包括Agtr1a，ikbkb和mTOR，病毒7包括Nudtl，病毒8包括Slc13a5和pappa，病毒9包括Coq7，ASdcy5和Agtr1a，病毒10包括Ctf1/akt1。

在组8中，病毒1包括FGF21，病毒2包括Nrf2，病毒3包括sTGFbR2-Fc，病毒4包括HAS2，病毒5包括Nudt1，病毒6包括TERT，病毒7包括BubR1，p2A和Par4，病毒8包括Ubd和Dgat1，病毒9包括Ctf1和Coq7，病毒10包括Adcy5，Agtr1a和mTOR。

在组9中，病毒1包括Atg5，病毒2包括Nudt1，病毒3包括Adra1a(mut)，病毒4包括NGF，病毒5包括NEU1，病毒6包括人源化foxP2，病毒7包括TFEB，病毒8包括PDE4b，mTOR，和Slc13a5，病毒9包括Slc13a5，Coq7和Akt1，病毒10包括ikbkb和Slc13a1。

在组10中，病毒1包括klotho，病毒2包括GDF15(hNAG)，病毒3包括sIGF1r-Fc，病毒4包括Mtl，病毒5包括Adra1a(mut)，病毒6包括Nrf2，病毒7包括Rps6kb1和PCsk9，病毒8包括Prkar2b和Dgat，病毒9包括Ctf1和Coq7，病毒10包括pappa和ikbkb。

在组11中，病毒1包括Atg5，病毒2包括Cebpa和Cebpb，病毒3包括Ctf1和aktl，病毒4包括Pck1，病毒5包括脂连蛋白，病毒6包括PcsK9，病毒7包括Nrf2，病毒8包括Cisd2，病毒9包括pappa和Dgat，病毒10包括Ctf1，Coq7和mTOR。

在组12中，病毒1包括FGF21，病毒2包括GDF15，病毒3包括klotho，病毒4包括Adra1a(mut)，病毒5包括Sirt6，病毒6包括Bubr1，p2A和Par4，病毒7包括Coq7，Adcy5和Agtr1a，病毒8包括Agtr1a，ikbkb和mTOR，病毒9包括Slc13a1，pappa和Ctf1，病毒10包括Ctf1，Slc13a5(AAV9)。

在组13中，病毒1包括FGF21，病毒2包括GDF15，病毒3包括klotho，病毒4包括TERT，病毒5包括sIGF1r-Fc，病毒6包括Bubr1，p2A和Par4，病毒7包括Rps6kb1和PCSk9，病毒8包括Adcy5和Coq7，病毒9包括Agtr1a和ikbkb，病毒10包括mTOR和Slc13a1。

在组14中，病毒1包括klotho，病毒2包括Txn1，病毒3包括Nrf2，病毒4包括TFEB，病毒5包括sTGFbr2-Fc，病毒6包括Nudt1，病毒7包括mt1，病毒8包括Atg5，病毒9包括Bubr1，p2A和Par4，病毒10包括Ctf1，Coq7和ikbkb。

在组15中，病毒1包括FGF21，IRES和sIGF1r-Fc，病毒2包括klotho，病毒3包括sTGFbr2-Fc，IRES和GDF15，病毒4包括HAS2，p2A，Mt1和Txn1，病毒5包括Nrf2，p2A和mCAT，病毒6包括Adra1a(mut)，p2A和TFEB，病毒7包括Bubr1，p2A和Par4，病毒8包括Atg5，p2A，Cisd2和Nudt1，病毒9包括Sirt1，p2A和Sirt6，病毒10包括mTOR，slc13a5，pappa，ikbkb，adcy5，agtr1a和akt1。

在组16中，病毒1包括TFEB，p2A和Atg5，病毒2包括klotho，病毒3包括UCP1，p2A，Cebpβ和miCebpa，病毒4包括脂连蛋白，IRES，Mt1，p2A和Txn1，病毒5包括Nrf2，p2A和mCAT，病毒6包括TERT，病毒7包括Bubr1，p2A和Par4，病毒8包括TFAM，p2A，Cisd2和Nudt1，病毒9包括Neu1，p2A，NGF和Sirt6，病毒10包括Dgat，prkar2b，insr，ubd，Coq7，Ctfl，mTOR和Slc13a5。

在组17中，病毒包括sTGFbR2-FC和/或Nrf2。

在组18中，病毒包括FGF21，TERT，BubR1，Agtra1a，Adcy5，Coq7，Slc13a1，Ikbkb，Klotho，GDF15，CTF1，mTOR，Slc13a5，Pappa，Pcsk9和/或Rps6kb1。

在组19中，病毒包括FGF21，GDF15，Klotho，Adra1a(mut)，Sirt6，BubR1，Agtra1a，Adcy5，Akt1，MCAT，Slc13a1，Ikbkb，Ctf1，mTOR，Coq7和/或Slc13a5。

在组20中，病毒包括Txn1，Sirt6，Mt1，TFEB，Pck1，脂连蛋白，Cisd2，Nudt1，Atg5，Ctf1，Ikbkb和/或Coq7。

在组21中，病毒包括Fgf21，Nrf2，sTGFbR2-FC，Has2，NudT1，TERT，BubR1，Dgat1，Pappa，Ctf1，mTOR，Coq7，Slc13a5，Agtra1a，Adcy5和/或Akt1。

在组22中，病毒包括Ctf1，Coq7，Agtra1a，Adcy5，mTOR，Cisd2，MCAT，FGF21，GDF15，Klotho，Slc13a1，Ikbkb，Txn1和/或Sirt6。

在组23中，病毒包括Klotho，GDF15，Neu1，Mt1，Adra1a，hFoxP2，PCSK9，Rps6kb1，Ctf1，Ikbkb，Coq7，Slc13a1，mTOR和/或NudT1。

在组24中，病毒包括Atg5，Ctf1，Akt1，BubR1，Pck1，脂连蛋白，TERT，Nrf2，Cisd2，Dgat1，Pappa，Ctf1，mTOR，Coq7和/或Slc13a5。

在组25中，病毒包括FGF21和/或BMP2。

在组26中，病毒包括FGF21和/或BMP4。

在组27中，病毒包括FGF21和/或Sema3a。

在组28中，病毒包括FGF21、BMP2和/或BMP4。

在组29中，病毒包括FGF21、BMP2和/或Sema3a。

在组30中，病毒包括FGF21、BMP4和/或Sema3a。

在组31中，病毒包括FGF21、BMP2、BMP4和/或Sema3a。

在组32中，病毒包括FGF21和Klotho。

在组33中，病毒包括FGF21，sTGFbR2-FC。

在组34中，病毒包括Klotho和sTGFbR2-FC。

在组35中，病毒包括FGF21、Klotho和sTGFbR2-FC。

用针对靶基因的初-miRNA/shRNA进行基因治疗

在本公开中，表达初级miRNA分子(初-miRNA)和/或短发夹(shRNA)的基因构建体用于抑制或减弱靶基因的表达。单个初-miRNA可以含有1-6个miRNA前体，并且被加工以产生miRNA，其从细胞核输出到细胞质，在那里它沉默靶RNA的表达。示例性发夹环结构各自包括约70个核苷酸。每个发夹的两侧都是有效加工所必需的序列。

初-miRNA中发夹的双链RNA(dsRNA)结构由称为DiGeorge综合征关键区8(DGCR8或无脊椎动物中的“Pasha”)的核蛋白所识别，该核蛋白的名称与DiGeorge综合征有关。DGCR8与酶Drosha结合以形成微处理器复合物，Drosha是一种切割RNA的蛋白质。参见Lee,Y.等,Nature 425(6956):415–9(2003)；Gregory RI.等,(2006)Methods Mol.Biol.342:33–47。在该复合物中，DGCR8通过从由距离发夹碱基约11个核苷酸处切割RNA(一个螺旋dsRNA转变为茎)来定向Drosha的催化性RNA酶III结构域以从初-miRNA释放发夹。参见Han,J等,(2004)Genes&Development 18(24):3016–27；Han,J.等(2006)Cell 125(5):887–901。得到的产物在其3'末端具有两个核苷酸的突出端；它具有3'羟基和5'磷酸基团。它通常被称为前-miRNA(前体-miRNA)。已经鉴定了对于有效加工重要的前-miRNA下游的序列基序。Conrad,T.等,Cell Reports 9(2):542–554；Auyeung,V.等,(2013)Cell 152(4):844–858；Ali,P.S.等,(2012)FEBS Letters586(22):3986–90。

直接从内含子剪接的前-miRNA被称为“Mirtrons”，其绕过微处理器复合体。最初认为只存在于果蝇和秀丽隐杆线虫中，现在已经在哺乳动物中发现了mirtrons。参见Berezikov E.等,(2007)"哺乳动物mirtron基因(Mammalian mirtron genes)"Mol.Cell28(2):328–36。

通过核RNA编辑可以改变多达16％的前-miRNA。参见Kawahara Y.等,(2008)Nucleic Acids Res.36(16):5270–80；Winter J.等,(2009)Nat.Cell Biol.11(3):228–34；Ohman M.(2007)Biochimie 89(10):1171–6。最常见的是，作为作用于RNA(ADAR)的称为腺苷脱氨酶的酶催化腺苷肌苷(A至I)转换。RNA编辑可以阻止核加工(例如，初-miR-142，导致核糖核酸酶Tudor-SN降解)并改变下游过程，包括细胞质miRNA加工和靶特异性(例如，通过改变中枢神经系统中miR-376的种子区域)。参见Kawahara Y,等,(2008)Nucleic AcidsRes.36(16):5270–80.

前-miRNA发夹在涉及核质穿梭物输出蛋白-5的过程中从细胞核输出。该蛋白质是核转运蛋白家族的成员，识别由RNA酶III酶Drosha在前-miRNA发夹的3'末端处留下的双核苷酸突出端。输出蛋白-5介导的向细胞质的转运是能量依赖性的，使用与Ran蛋白结合的GTP。参见Murchison E.P.等,(2004)Curr.Opin.Cell Biol.16(3):223–9。

在细胞质中，前-miRNA发夹被RNA酶III酶切酶(Dicer)切割。参见Lund E.等,(2006)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.71:59–66。该内切核糖核酸酶与发夹的5'和3'末端相互作用。参见Park,J.E.等,(2011)Nature 475(7355):201–5，并切除连接3'和5'臂的环，产生长度约22个核苷酸的不完全miRNA：miRNA*双链体。参见Lund E.等,(2006)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.71:59–66。总发夹长度和环尺寸影响切酶加工的效率。miRNA:miRNA*配对的不完美性质也影响切割。参见Lund E.等,(2006)Cold SpringHarb.Symp.Quant.Biol.71:59–66；Ji X(2008)Current Topics in Microbiology andImmunology 320:99–116。一些富含G的前-miRNA可能会采用G-四联体结构作为规范茎环结构的替代品。例如，人前-miRNA 92b采用G-四链体结构，其对细胞质中切酶介导的切割具有抗性。参见Mirihana A.等,(2015)Chem.Biol.22:262–272。尽管双链体的任一链可能潜在地充当功能性miRNA，但通常仅将一条链并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中miRNA及其mRNA靶标相互作用。

用Cas9介导的功能蛋白调控进行基因治疗

本公开还提供了使用具有转录调控子的Cas9/引导RNA系统调控本文所述的靶基因及其相应的功能蛋白的方法。应理解，技术人员将能够设计合适的引导RNA以与靶核酸形成共定位复合物，所述靶核酸包括如本文所述的靶基因。

Cas9 DNA结合蛋白

本领域技术人员容易知晓RNA引导的DNA结合蛋白与DNA结合用于各种目的。这种DNA结合蛋白可以是天然产生的。具有核酸酶活性的DNA结合蛋白为本领域技术人员所知，并且包括具有核酸酶活性的天然产生的DNA结合蛋白，例如在II型CRISPR系统中存在的Cas9蛋白。这种Cas9蛋白和II型CRISPR系统在本领域中充分记载。参见Makarova等，NatureReviews,Microbiology，第9卷，2011年6月，第467-477页，包括所有补充信息，通过引用全文纳入本文。这种RNA引导的DNA结合蛋白可包括附着于其上的一个或多个核定位信号，以促进RNA引导的DNA结合蛋白转移到核酸酶中。

通常，细菌和古细菌CRISPR-Cas系统依赖于与Cas蛋白复合的短引导RNA以引导入侵外来核酸内存在的互补序列的直接降解。参见Deltcheva,E.等,(2011)Nature 471,602-607；Gasiunas,G.等,(2012)Proc Natl Acad Sci USA 109,E2579-2586；Jinek,M.等(2012)Science 337,816-821；Sapranauskas,R.等,(2011)Nucleic Acids Res 39:9275-9282；和Bhaya,D.等,(2011)Ann Rev Gen 45:273-297。最近的酿脓链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系统的体外重建证明与正常反式编码tracrRNA融合的crRNA(“CRISPR RNA”)(“反式-作用CRISPR RNA”)足够引导Cas9蛋白序列特异性切割匹配crRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9招募以及靶DNA降解。参见H.Deveau等,(2008)J Bact 190,1390。其他有用的Cas蛋白来自嗜热链球菌(S.thermophilis)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)。

三类CRISPR系统一般已知并且称为I类、II类或III类。根据一个方面，根据本发明的用于切割dsDNA的特定有用酶是II型常见的单效应酶Cas9。参见K.S.Makarova等,(2011)Nature Rev Microbiol.9:467；所有出版物的全部内容均以引用的方式并入本文。

在酿脓链球菌(S.pyogenes)中，Cas9通过由蛋白质中的以下2个催化结构域介导的过程在原型间隔子-相邻基序(PAM)上游3bp处生成钝末端双链断裂：切割DNA的互补链的HNH结构域和切割非互补链的RuvC-样结构域。参见Jinek等,(2012)Science 337,816-821,其全部内容通过引用并入本文。已知Cas9蛋白存在于许多II型CRISPR系统中，包括如Makarova等，Nature Reviews,Microbiology,卷9,2011年6月,第467-477页所述的下述内容：海沼甲烷球菌C7；白喉棒状杆菌；棒状杆菌效率蛋白(efficien)YS-314；谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032Kitasato；谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032Bielefeld；谷氨酸棒状杆菌R；克氏棒杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)DSM 44385；脓肿分枝杆菌ATCC 19977；皮诺卡菌IFM10152；平红球菌PR4；约氏红球菌(Rhodococcus jostii)RHA1；混浊红球菌B4uid36573；嗜酸纤维素分解菌11B；氯酚节杆菌A6；黄色生工菌(Kribbella flavida)DSM17836uid43465；弯曲高温单孢菌DSM 43183；齿双歧杆菌Bdl；长双歧杆菌DJO10A；贺氏史雷克氏菌(Slackia heliofrinireducens)DSM 20476；海洋普西芬尼菌(Persephonellamarina)EX HI；脆弱拟杆菌NCTC9434；黄褐二氧化碳嗜纤维菌DSM 7271；黄杆菌ΠP0286；粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)ATCC BAA 835；卡氏花弯菌(Roseiflexuscastenholzii)DSM 13941；花弯菌RSI；集胞藻PCC6803；细小迷踪菌(Elusimicrobiumminutum)Pei191；未培养的白蚁组1细菌系统型Rs D17；产琥珀酸丝状杆菌S85；蜡状芽孢杆菌ATCC 10987；英诺克李斯特菌(Listeria innocua)；干酪乳杆菌；鼠李糖乳杆菌GG；唾液乳杆菌UCC118；无乳链球菌A909；无乳链球菌NEM316；无乳链球菌2603；似马停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae equisimilis)GGS 124；兽瘟马链球菌(Streptococcusequi zooepidemicus)MGCS10565；解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)UCN34uid46061；格氏链球菌查利斯变种(Streptococcus gordonii Challis subst)CHI；变形链球菌NN2025uid46353；变形链球菌；化脓性链球菌M1GAS；化脓性链球菌MGAS5005；化脓性链球菌MGAS2096；化脓性链球菌MGAS9429；化脓性链球菌MGAS10270；化脓性链球菌MGAS6180；化脓性链球菌MGAS315；化脓性链球菌SSI-1；化脓性链球菌MGAS 10750；化脓性链球菌NZ131；嗜热链球菌CNRZ1066；嗜热链球菌LMD-9；嗜热链球菌LMG 18311；肉毒杆菌A3Loch Maree；肉毒杆菌B Eklund 17B；肉毒杆菌Ba4 657；肉毒杆菌F朗格兰岛；解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10；大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)ATCC 29328；直肠短杆菌ATCC 33656；鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)；运动支原体(Mycoplasmamobile)163K；穿透支原体(Mycoplasma penetrans)；滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae)53；念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)DSM 12112；慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)BTAi1；汉堡包硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14；沼泽红假单孢菌(Rhodopseudomonas palustris)BisB18；沼泽红假单孢菌(Rhodopseudomonaspalustris)BisB5；食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)DS-1；海洋玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)DFL 12；固氮葡萄糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)Pal 5FAPERJ；固氮葡萄糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)Pal 5JGI；固氮螺菌(Azospirillum)B510uid46085；深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC11170；迪氏菌(Diaphorobacter)TPSY uid29975；赤子爱胜蚓生菌(Verminephrobacter eiseniae)EF01-2；脑膜炎奈瑟氏球菌053442；脑膜炎奈瑟氏球菌α14；脑膜炎奈瑟氏球菌Z2491；需盐脱硫弧菌(Desulfovibrio salexigens)DSM 2638；空肠弯曲杆菌德莱亚种(Campylobacter jejuni doylei)269 97；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)81116；空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)；海鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)RM2100；肝螺杆菌；产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)；奥湖甲苯单胞菌(Tolumonas auensis)DSM 9187；大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c；皮氏希瓦氏菌(Shewanella pealeana)ATCC700345；巴黎嗜肺军团菌(Legionella pneumophila Paris)；琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)130Z；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)；土拉弗朗西斯菌新变种(Francisella tularensis novicida)U112；土拉弗朗西斯菌全北区亚种(Francisella tularensis holarctica)；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)FSC 198；土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)；土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)WY96-3418；和牙密螺旋体(Treponema denticola)ATCC 35405。在文献中，本领域技术人员可将Cas9蛋白称为Csn1。Deltcheva等,(2011)Nature 471,602-607中提供了示例性化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白质序列，其全文通过引用并入本文。

对Cas9蛋白的修饰是本公开的代表性实施方式。本公开中有用的CRISPR系统如Barrangou,R.等,(2012)Ann Rev Food Sci Technol.3:143和Wiedenheft,B.等,(2012)Nature 482,331所述，其各自通过引用整体并入本文。

根据某些方面，DNA结合蛋白经改变或修饰以使得核酸酶活性灭活。这类改变或修饰包括改变一个或多个氨基酸以使核酸酶活性或核酸酶结构域灭活。这类修饰包括去除显示出核酸酶活性的一个或多个多肽序列，即核酸酶结构域，使得DNA结合蛋白上没有显示出核酸酶活性的一个或多个多肽序列，即核酸酶结构域。基于本发明，灭活核酸酶活性的其他修饰将对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，无核酸酶活性的DNA结合蛋白包括经修饰以灭活核酸酶活性或去除一个或多个多肽序列以灭活核酸酶活性的多肽序列。无核酸酶活性的DNA结合蛋白保留了结合至DNA的能力，即使核酸酶活性已经被灭活。因此，DNA结合蛋白包括DNA结合所需的一个或多个多肽序列，但是可缺少显示核酸酶活性的一个或多个或全部核酸酶序列。因此，DNA结合蛋白包括DNA结合所需的一个或多个多肽序列，但是可具有显示灭活的核酸酶活性的一个或多个或全部核酸酶序列。参见Jinek等,(2012)Science 337,816-821。缺乏核酸酶活性的Cas9蛋白被称为无核酸酶活性(nuclease-null)的Cas9(“Cas9Nuc”)并且表现出降低或消除的核酸酶活性，或在检测水平内不存在或基本上不存在核酸酶活性。根据该方面，使用已知测定法检测Cas9Nuc的核酸酶活性可能是不可检测的，即低于已知测定的检测水平。

根据一个方面，Cas9蛋白包括来自嗜热链球菌(S.thermophiles)或化脓性链球菌(S.pyogenes)的天然存在的Cas9所示的序列和与其具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％或99％同源性并且是DNA结合蛋白(例如RNA引导的DNA结合蛋白)的蛋白质序列。

示例性CRISPR系统包括嗜热链球菌(S.thermophiles)Cas9核酸酶(ST1Cas9)(参见Esvelt,K.M.等,(2013)Nature Methods.10(11):1116-21，其通过引用整体并入本文)。示例性CRISPR系统包括化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶(Sp.Cas9)，其，从II型CRISPR相关系统分离的具有极高的亲和力(参见Sternberg,S.H.,等,(2014)Nature 507,62-67，其通过引用整体并入本文)的可编程DNA结合蛋白(参见Garneau,J.E.等,(2010)Nature 468,67-71和Jinek,M.等,(2012)Science 337,816-821，其各自通过引用整体并入本文)。各种Cas蛋白是本领域技术人员已知的，包括CasI(Cas3)、Cas IA(Cas8a)、CasIB(Cas8b)、CasIC(Cas8c)、CasID(Cas10d)、CasIE(Cse1)、CasIF(Csy1)、CasIU、CasII(Cas9)、CasIIA(Csn2)、CasIIB(Cas4)、CasIIC、CasIII(Cas10)、CasIIIA(Csm2)、CasIIIB(Cmr5)、CasIIIC、CasIIID、CasIV(Csf1)、CasIVA、CasIVB、CasV(Cpf1)、C2c2和C2c1等。

在多种基于CRISPR的生物技术应用中(参见Mali,P.等,(2013)Nature Methods10:957-963；Hsu,P.D.等,(2014)Cell 157,1262-1278；Chen,B.等,(2013)Cell 155:1479-1491；Shalem,O.等,(2014)Science 343,84-87；Wang,T.等,(2014)Science 343:80-84；Nissim,L.等,(2014)Molecular Cell 54:698-710；Ryan,O.W.等,(2014)eLife 3；Gilbert,L.A.等,(2014)Cell 159(3):647-61；and Citorik,R.J.等,(2014)NatureBiotechnol.32:1141–1145，其各自都通过引用整体并入本文)，引导通常以所谓sgRNA(单引导RNA)呈递，其中两个天然Cas9RNA辅因子(gRNA和tracrRNA)通过工程化的环或接头而融合。

根据一个方面，Cas9蛋白是酶活性Cas9蛋白，Cas9蛋白野生型蛋白，Cas9蛋白切口酶或无核酸酶活性的Cas9蛋白或核酸酶缺陷的Cas9蛋白。其他示例性Cas9蛋白包括附着、结合功能蛋白(例如转录调控子，例如转录激活子或抑制子)或与该功能蛋白融合的Cas9蛋白。

根据某些方面，Cas9蛋白可以通过本领域技术人员已知的方法(包括注射或脂质转染)直接递送至细胞，或从其同源mRNA翻译，或从其同源DNA转录成mRNA(其后翻译成蛋白质)。Cas9 DNA和mRNA本身可以通过电穿孔、瞬时和稳定转染(包括脂质转染)和病毒转导或本领域技术人员已知的其他方法引入细胞。

引导RNA

本公开内容提供了使用引导RNA将Cas蛋白靶向如本文所述的靶基因。当知道特定的靶核酸时，本领域技术人员可以容易地设计这种引导RNA。引导RNA可包括间隔序列，tracr配对序列和tracr序列中的一种或多种。术语间隔序列是本领域技术人员所理解的，可包括与靶核酸序列具有足够互补性的任何多核苷酸以与靶核酸序列杂交并且将CRISPR复合物与靶序列直接序列特异性结合。引导RNA可以由与tracr配对序列(可以称为crRNA)共价连接的间隔序列和单独的tracr序列形成，其中tracr配对序列与tracr序列的一部分杂交。根据某些方面，tracr配对序列和tracr序列通过例如接头序列通过共价键连接或联接，该构建体可以称为tracr配对序列和tracr序列的融合体。本文提及的接头序列是核苷酸序列，在本文中称为核酸序列，其连接tracr配对序列和tracr序列。因此，引导RNA可以是双组分物质(即，一起杂交的分开的crRNA和tracr RNA)或单分子物质(即crRNA-tracr RNA融合体，通常称为sgRNA)。

根据某些方面，引导RNA在约10至约500个核苷酸之间。根据一个方面，引导RNA在约20至约100个核苷酸之间。根据某些方面，间隔序列的长度为约10至约500个核苷酸。根据某些方面，tracr配对序列的长度为约10至约500个核苷酸。在一些实施方式中，tracr序列的长度为约10至约100个核苷酸。在一些实施方式中，接头核酸序列的长度为约10至约100个核苷酸。

在一些实施方式中，可通过本领域技术人员已知的方法(包括注射或脂质转染)将引导RNA作为天然物质直接递送至细胞，或从其同源DNA转录，其中同源DNA通过电穿孔、瞬时和稳定转染(包括脂质转染)和病毒转导而引入细胞中。

用Cas9修饰靶基因的转录

根据一个方面，提供了经工程改造的Cas9-gRNA系统，其使得能够通过将转录调控结构域系连或连接至无核酸酶活性的Cas9或至引导RNA而在细胞(例如人细胞)中进行RNA-引导的DNA调控。根据本发明的一个方面，一个或多个转录调控蛋白或结构域(这类术语互换使用)接合或连接至核酸酶缺陷型Cas9或者一种或多种引导RNA(gRNA)。转录调控结构域对应于被靶向的基因座。因此，本公开内容的多方面包括通过将转录调控结构域融合、连接或接合至Cas9N或至gRNA而将这些结构域定位于靶向的基因座的方法和材料。

根据一个方面，提供了能够进行转录活化的突变体Cas9N-融合蛋白。根据一个方面，VP64活化结构域(Zhang等，Nature Biotechnology 29,149-153(2011)，通过引用全文纳入本文)接合、融合、连接或系连至突变体Cas9N的C末端。根据一种方法，通过突变体Cas9N蛋白将转录调控结构域提供至靶线粒体DNA的位点。根据一个方法，提供了在细胞内与转录调控结构域融合的突变体Cas9N，其伴随一种或多种引导RNA。具有与其融合的转录调控结构域的突变体Cas9N在靶线粒体DNA处或附近结合。一种或多种引导RNA在靶线粒体DNA处或附近结合。转录调控结构域调控靶线粒体核酸序列的表达。根据一个具体方面，突变体Cas9N-VP64融合体与靶向启动子附近的gRNA靶向序列组合时激活报告构建体的转录，从而显示RNA引导的转录激活。

根据一个方面，提供了能够进行转录活化的gRNA-融合蛋白。根据一个方面，VP64激活结构域与gRNA接合、融合、连接或以其他方式系连。根据一种方法，通过gRNA将转录调控结构域提供至靶线粒体DNA的位点。根据一种方法，与转录调控结构域融合的gRNA与突变体Cas9N蛋白一起在细胞内提供。突变体Cas9N在靶DNA处或附近结合。具有与之融合的转录调控结构域的一种或多种引导RNA在靶DNA处或附近结合。转录调控结构域调控靶基因的表达。根据一个具体方面，突变体Cas9N蛋白和与转录调控结构域融合的gRNA激活报道构建体的转录，从而显示RNA引导的转录激活。

作为转录激活子的转录调控蛋白或结构域包括VP16和VP64以及基于本公开内容本领域技术人员容易鉴定的其他蛋白或结构域。例如，本领域技术人员将能够使用Cas9-gRNA系统(具有完整切割或dCas9，与VP16、RAB、HDAC、甲基转移酶等融合或不融合，或者能够募集具有“间谍捕获器”或MS2募集结构域或类似物的类似的激活子或抑制子)可用于增加或减少本文提供的靶基因的表达，以组合用于治疗或预防效果。

靶核酸

靶核酸包括本文所述的共定位复合物可用于调控的任何核酸序列，例如本文鉴定的基因。靶核酸包括能够表达成蛋白质的核酸序列。出于本公开的目的，共定位复合物可以在靶核酸处或邻近或附近并且以共定位复合物可对靶核酸产生期望效果的方式与靶核酸结合或以其他方式共定位。基于本发明，本领域技术人员将能易于鉴定或设计引导RNA和Cas9蛋白，其共定位至包括靶核酸。本领域技术人员将能够进一步鉴定转录调控蛋白或结构域，其同样与靶核酸共定位。

细胞

本发明的细胞包括其中可如本文所述导入并表达外来核酸的任何细胞。应理解，本文所述的本发明的基本概念并不受到细胞类型的限制。根据本公开的细胞包括真核细胞，哺乳动物细胞，动物细胞，人细胞等。此外，细胞包括其中调控功能性蛋白质的生产将是有益的或期望的任何细胞。此类细胞可包括缺乏特定蛋白质表达并导致疾病或有害病症的细胞。这些疾病或有害病症是本领域技术人员容易知道的。根据本公开，负责表达特定蛋白质的核酸可以通过本文描述的方法而被转录激活子靶向，导致靶核酸的上调和特定蛋白质的相应表达。以这种方式，本文描述的方法提供治疗性治疗。此类细胞可包括过表达特定蛋白质的细胞，或者其中期望特定蛋白质的产生减少的细胞，导致疾病或有害病症。这些疾病或有害病症是本领域技术人员容易知道的。根据本公开，负责表达特定蛋白质的核酸可以通过本文描述的方法而被转录抑制子或阻遏物靶向，导致靶核酸的下调和特定蛋白质的相应表达。以这种方式，本文描述的方法提供治疗性治疗。

调控功能性蛋白质的核酸的递送

外来核酸或称为外源核酸(即，不是细胞的天然核酸组成的那些)可使用本领域技术人员已知的用于这种导入的任何方法导入细胞。这类方法包括转染、转导、病毒转导、微注射、脂质转染、核转染、纳米颗粒轰击、转化、偶联等。使用易于鉴定的文献来源，本领域技术人员将易于理解和接受这类方法。外来核酸可以通过将包含如本文所述的核酸的载体或核酸给予对象而递送至对象，例如全身给予对象，例如通过静脉内给予或注射，腹膜内给予或注射，肌内给予或注射，颅内给予或注射，眼内给予或注射，皮下给予或注射。

US 6,967,018、WO2014/093622、US2008/0175845、US 2014/0100265、EP2432490、EP2352823、EP2384200、WO2014/127198、WO2005/122723、WO2008/137490、WO2013/142114、WO2006/128190、WO2009/134681、EP2341068、WO2008/027084、WO2009/054994、WO2014059031、US 7,977,049和WO 2014/059029中描述了基因治疗方法和将基因递送至对象的方法(例如使用腺相关病毒)，其各自通过引用整体并入本文。

载体

预期载体与本文描述的方法和构建体一起使用。术语“载体”包括能够转运与其连接的其他核酸的核酸分子。用于将核酸递送至如本文所述的细胞的载体包括本领域技术人员已知的用于此目的的载体。某些示例性载体包括质粒、慢病毒和腺相关病毒等，如本领域技术人员已知。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；其包含一个或多个游离末端、没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；和本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以插入额外的DNA区段，例如通过标准分子克隆技术。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于载体中以包装成病毒(例如逆转录病毒，慢病毒，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒，复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)。病毒载体还包括由病毒携带的多核苷酸，用于转染到宿主细胞中。某些载体能够在其转导的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后将其他载体(例如，非附加体哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能够引导与其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。用于重组DNA技术中的常见表达载体通常是质粒形式。重组表达载体可包含本发明的核酸序列，该核酸序列具有适于所述核酸在宿主细胞中表达的形式，这意味着该重组表达载体包括一种或多种调控元件，基于待用于表达的宿主细胞对其进行选择，其被操作性连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“操作性连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中，或者，当载体被导入宿主细胞时在宿主细胞中)的方式与调控元件连接。

非病毒递送核酸或天然DNA结合蛋白质、天然引导RNA或其他天然物质的方法包括脂质转染、微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸DNA、人工病毒粒，和试剂增强型DNA摄取。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355，其通过引用并入本文。脂质转染试剂市售可得(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适于多核苷酸的高效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些。可以递送至细胞(例如，体外或离体给予)或靶组织(例如，体内给予)。术语天然包括蛋白质、酶或引导RNA物质本身，而不包括编码该物质的核酸。

在一些实施方式中，用于本文方法的基因治疗载体是细小病毒载体，例如动物细小病毒，特别是依赖病毒，例如感染性人或猿腺相关病毒(AAV)及其组分(例如动物细小病毒基因组)用作在哺乳动物细胞中引入和/或表达编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的载体。细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科的成员在本文中称为细小病毒并且包括腺伴随病毒(Dependovirus)属。从其属的名称可以推断，腺伴随病毒属的成员是独特的，因为它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染以在细胞培养物中产生感染。腺伴随病毒属包括通常感染人类(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)的AAV，以及感染其他温血动物(例如，牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)的相关病毒。关于细小病毒和细小病毒科的其他成员的进一步信息在Kenneth 1.Berns,"细小病毒科：《病毒及其复制》(Parvoviridae:The Viruses and Their Replication)"病毒学领域第69章(1996年第三版)中有描述。为方便起见，本文通过参考AAV进一步例示和描述了本发明。然而，应理解，本发明不限于AAV，而是同样可以应用于其他细小病毒。

所有已知AAV血清型的基因组组织非常相似。AAV的基因组是线性单链DNA分子，其长度小于约5,000个核苷酸(nt)。反向末端重复序列(ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1，-2和-3)形成衣壳。末端145nt是自身互补的并且被组织成可以形成能量稳定的分子内双链体，该双链体形成T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)AAV感染后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别由P5启动子和P19启动子表达，并且两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中具有功能。Rep ORF中的剪接事件导致实际上表达四种Rep蛋白(即Rep78，Rep68，Rep52和Rep40)。然而，已经显示哺乳动物细胞中编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以产生AAV载体。同样在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白质足以产生AAV载体。

“重组细小病毒”或“AAV载体”或“rAAV载体”在本文中是指包含一个或多个感兴趣多核苷酸序列、感兴趣基因或“转基因”的载体，其侧翼为至少一个细小病毒或AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时，这种rAAV载体可以复制并包装成感染性病毒颗粒。当将rAAV载体整合到更大的核酸构建体中时(例如在染色体中或在另一种载体中，例如用于克隆或转染的质粒或杆状病毒)，则rAAV载体通常被称为“前载体”，其在存在AAV包装功能和必要的辅助功能的情况下，可以通过复制和封装而被“拯救”。因此，在另一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含编码如上文所定义的胆色素原脱氨酶的核苷酸序列，其中所述核酸构建体是重组细小病毒或AAV载体，因此包含至少一种细小病毒或AAV ITR。优选地，在核酸构建体中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的两侧是细小病毒或AAV ITR。

AAV能够感染许多哺乳动物细胞。参见例如Tratschin等,(1985)Mol.CellBiol.5:3251-3260)和Grimm等,(1999)Hum.Gene Ther.10:2445-2450)。然而，人类滑膜成纤维细胞的AAV转导显著地比类似的鼠细胞更有效(Jennings等,(2001)Arthritis Res，3:1)，并且AAV的细胞的嗜性(tropicity)在血清型之间不同。参见例如Davidson等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:3428-3432),讨论了AAV2，AAV4和AAV5在哺乳动物CNS细胞趋向性和转导效率方面的差异；Goncalves，(2005)Virol J.2(1)：43，其讨论了修饰AAV趋向性的方法。在一些实施方式中，对于肝细胞的转导，优选具有AAV1、AAV8和AAV5衣壳蛋白的rAAV病毒颗粒(Nathwani等,(2007)Blood 109(4):1414-1421；Kitajima等,(2006)Atherosclerosis 186(1):65-73)，其中最优选具有AAV5衣壳蛋白的rAAV病毒颗粒。

AAV在人群中非常普遍。参见Gao,G.,等,(2004)J Virol.78(12):6381-8；和Boutin,S.,等,(2010)Hum Gene Ther.21(6):704-12)并且可用作病毒载体。存在许多血清型，每种血清型具有不同的组织类型的趋向性，参见Zincarelli,C.,等,(2008)MolTher.16(6):1073-80)，其允许通过适当的假型化优先靶向特定组织。一些血清型，例如血清型8、9和rh10，转导哺乳动物体。参见Zincarelli,C.,等,(2008)Mol Ther.16(6):1073-80,Inagaki,K.,等,(2006)Mol Ther.14(1):45-53；Keeler,A.M.,等,(2012)Mol Ther.20(6):1131-8；Gray,S.J.等,(2011)Mol Ther.19(6):1058-69；Okada,H.,等,(2013)MolTher Nucleic Acids.2:e95；和Foust,K.D.,等,(2009)Nat Biotechnol.27(1):59-65。已经证明AAV9穿过许多病毒载体和生物物质都无法通过的血脑屏障(参见Foust,K.D.,等,(2009)Nat Biotechnol.27(1):59-65；和Rahim,A.A.等,(2011)FASEB J.25(10):3505-18)。某些AAV的有效载荷为4.7-5.0kb，包括病毒反向末端重复序列(ITR)，这是顺式病毒包装所必需。参见Wu,Z.等,(2010)Mol Ther.18(1):80-6；和Dong,J.Y.等,(1996)Hum GeneTher.7(17):2101-12；所有出版物通过引用并入本文。

已知AAV VP蛋白质决定AAV病毒颗粒的细胞嗜性。VP蛋白编码序列比不同AAV血清型中的Rep蛋白和基因显著更不保守。Rep和ITR序列交叉互补其他血清型的相应序列的能力允许产生包含一种血清型(例如，AAV5)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型的Rep和/或ITR序列的假型rAAV颗粒(例如，AAV2)。这种假型rAAV颗粒是本发明的一部分。在本文中，假型rAAV颗粒可以被称为“x/y”型，其中“x”表示ITR的来源，“y”表示衣壳的血清型，例如2/5rAAV粒子具有来自AAV2的ITR和来自AAV5的衣壳。修饰的“AAV”序列也可以用于本公开的上下文中，例如，用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。这种修饰序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、AAvDJ、AAVrh10.XXITR、Rep或VP具有至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或更多核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(例如，具有约75％至约99％核苷酸序列相同性的序列)，可代替野生型AAV ITR，Rep或VP序列。优选的腺病毒载体被修饰以降低宿主响应。参见例如Russell(2000)J.Gen.Virol.81:2573-2604；美国专利公开号20080008690；和Zaldumbide等(2008)Gene Therapy 15(4):239-46；所有公开通过引用并入本文。

调控元件和终止子

预期调控元件与本文描述的基因疗法载体构建体一起使用。术语“调控元件”旨在包括启动子，增强子，内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，例如聚腺苷酸化信号和聚-U序列)。所述调控元件描述于，例如，Goeddel；《基因表达技术：酶学方法》(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185，学术出版社(Academic Press)，加利福尼亚州圣迭戈(1990)。调控元件包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的那些(例如，组织特异性调控序列)。组织特异性启动子可以主要在期望的目标组织中引导表达，目标组织例如肌肉，神经元，骨，皮肤，血液，特定器官(例如肝脏，胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)。调控元件还可以以时间依赖性方式引导表达，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式，其可以或可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施方式中，载体可包含一种或多种pol III启动子(例如1、2、3、4、5或更多种pol III启动子)、一种或多种polII启动子(例如1、2、3、4、5或更多的pol II启动子)，一种或多种pol I启动子(例如1、2、3、4、5或更多个pol I启动子)，或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的例子包括但不限于：逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选连有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选连有CMV增强子)[参见，例如：Boshart等，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EFlα启动子和本文所述的Pol II。术语“调控元件”还包括增强子元件，例如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5'区段(Takebe,Y.(1988)Mol.Cell.Biol.8(1):466-472)；SV40增强子；和兔β-球蛋白的外显子2和3之间的内含子序列(O'Hare K.等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78(3):1527-31)。本领域技术人员应理解，表达载体的设计可取决于如下因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需的表达水平等。可以将载体引入宿主细胞中，从而产生转录物，蛋白质或肽，包括由本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)转录物，蛋白质，酶，其突变体形式，其融合蛋白等)。

本文描述的方法的方面可以使用终止子序列。终止子序列包括一段核酸序列，其在转录过程中标记基因组DNA中操纵子或基因的末端。该序列通过在新合成的mRNA中提供信号来介导转录终止，所述信号触发从转录复合物释放mRNA的过程。这些过程包括mRNA二级结构与募集的终止因子的复合物和/或间接活性的直接相互作用。转录复合物的释放释放RNA聚合酶和相关的转录机制以开始新mRNA的转录。终止子序列包括本领域已知的并在本文中鉴定和描述的序列。

给药，剂量和治疗

在各种实施方式中，一种或多种基因递送载体(包括病毒载体，和包含病毒载体的包装病毒颗粒)可以是药物或药物组合物的形式，并且可以用于制备药物或药物组合物。药物组合物可包括药学上可接受的运载体。优选地，运载体适用于肠胃外给药。在特定的实施方式中，运载体适用于静脉内，腹膜内或肌肉内给药。药学上可接受的运载体或赋形剂描述于例如《雷明顿：药物科学与实践》(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编辑)出版公司(1997)。示例性药物形式可以与无菌盐水，右旋糖溶液或缓冲溶液或其他药学上可接受的无菌流体组合。或者，可以使用固体运载体，例如微载体珠。

在制备和储存条件下，药物组合物通常是无菌和稳定的。药物组合物可以配制成溶液，微乳液，脂质体或适于递送基因治疗载体的其他有序结构。运载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，组合物中可优选地包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。本公开的载体可以以时间释放制剂或控释制剂给予，例如在包含缓释聚合物或其他运载体的组合物(包括植入物和微囊化递送系统)中，将保护化合物免于快速释放。例如，可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯，聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。

在一些实施方式中，用任何可接受的运载体配制的基因治疗载体可以胃肠外给药，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，肌肉内给药，肢体灌注或其组合。给药可以是全身性的，使得基因递送载体通过对象的身体递送。在一些实施方式中，基因递送载体可以直接给予至靶向的组织，例如心脏，肝脏，滑膜或鞘内给予至神经组织。在一些实施方式中，基因递送载体可经局部给予，例如通过导管给予。给药途径可以由本领域技术人员确定，考虑例如靶组织的性质、基因递送载体、预期的治疗效果和可以给予并由靶组织吸收的最大负荷。

通常，将有效量、特别是治疗有效量的基因递送载体给予有需要的对象。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量，所述结果例如针对年龄相关病症的治疗或缓解。载体的有效量或治疗有效量会根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及病毒载体在个体中引起所需响应的能力而不同。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。

在具体的实施方式中，治疗或预防有效量的核酸、核酸构建体、细小病毒的病毒颗粒或药物组合物的范围可以是1x10¹¹至1x10¹⁴基因组拷贝(gc)/kg或1x10¹²至1x10¹³基因组拷贝(gc)/kg。需要注意的是，剂量值可能会根据待缓解病症的严重程度而不同。剂量也可以根据所用病毒颗粒的功效而变化。例如，与AAV2相比，AAV8在感染肝脏方面更好，并且AAV9在感染脑部方面比AAV8更好，在这两种情况下，对于肝脏或大脑的情况，分别需要更少的AAV8或AAV9。对于任何特定对象，可以根据个体需要和给予或监督组合物给予的人的专业判断而随时间调整特定剂量方案。本文所述的剂量范围仅是示例性的，并不限制医师可以选择的剂量范围。

组织靶标可以是特异性的，例如肝脏组织，或者它可以是几种组织的组合，例如肌肉和肝脏组织。示例性组织靶标可包括肝脏、骨骼肌、心肌、脂肪沉积物、肾、肺、血管内皮、上皮和/或造血细胞。在一些实施方式中，肌内注射后小动物(小鼠)的有效剂量范围可以是1x10¹²至1x10¹³基因组拷贝(gc)/kg，对于较大的动物(猫或狗)和人对象则可以是1x10¹¹至1x10¹²gc/kg，或1x10¹¹至1x10¹⁴基因组拷贝(gc)/kg。

在各种实施方式中，基因递送载体可以推注或通过连续输注随时间给予。在一些实施方式中，可以随时间给予几个分开的剂，或者可以按照治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。在一些实施方式中，基因递送载体可以每天，每周，每两周或每月给予。治疗持续时间可以是至少一周，1个月，2个月，3个月，6个月或8个月或更长时间。在一些实施方式中，治疗持续时间可长达1年或更长，2年或更长，3年或更长或无限期。

在一些实施方式中，向对象给予治疗有效量以治疗与衰老相关的病症或疾病，例如与年龄相关疾病或紊乱。本发明的应用延长了个体通常健康且无慢性疾病的时间段和/或本发明改善了老年人和年长的人中常见的疾病，包括心血管疾病，糖尿病，动脉粥样硬化，肥胖，癌症，感染和神经系统疾病中的一种或多种。可以使用任何完善的衰老进展指标。

在一些实施方式中，本文所述的基因疗法用于以下至少一种衰老指标：降低癌症的发病率，延迟或改善心血管疾病，例如动脉粥样硬化；延迟和/或改善骨质疏松症；改善葡萄糖耐量或降低相关疾病的发病率，如糖尿病和肥胖症；改善或减少记忆功能和其他认知功能的下降；改善或减少神经肌肉协调的下降；和改善或减少免疫功能的下降。本文的基因治疗方法提供的年龄相关疾病的改善可以是与未治疗的群体相比，受影响的对象的症状减轻或者群体中疾病或病症的发生率降低的结果。基因治疗具有治疗和/或预防各种年龄相关病症和疾病的作用，如通过衰老的特定标志物和紊乱所评估的。因此，在另一方面，本发明涉及如上所述的基因治疗方法或核酸载体的用途，用于治疗或预防对象的至少一种选自以下的病症或衰老标志物：心血管功能降低，骨质疏松症，关节病，葡萄糖耐受不良，胰岛素抵抗，记忆丧失，神经肌肉协调丧失，心血管疾病增加，心脏、循环或肺功能降低和寿命减少或其组合。

在一些实施方式中，本文所述的基因疗法用于延长任何特定物种对象的寿命。延长的寿命可以是到达成年期的该物种个体的平均寿命的增加，和/或该物种的最大寿命的延长。在一些实施方式中，延长的寿命可以是最大寿命增加5％，10％，15％，20％或更多和/或平均寿命增加5％，10％，15％，20％或更多。

实施例

实施例1：调控TGFβ1的方法

本公开内容提供了用于在动物例如人或其他哺乳动物(例如家养动物例如狗或猫)中长期调控TGFβ1的基因治疗方法。本公开提供了用于在动物例如人或其他哺乳动物(例如家养动物，例如狗或猫)中长期调控TGFβ1的基因治疗方法，作为治疗或预防炎症、重塑或纤维化的方法。本公开内容提供了用于调控动物例如人或其他哺乳动物(例如家养动物，例如狗或猫)中的TGFβ1的基因治疗方法，用于治疗心脏病变，例如增加的纤维化。本公开提供了通过基因治疗方法调控TGFβ1，包括通过例如腺相关载体将核酸递送至细胞。本公开提供了通过递送核酸来调控TGFβ1，所述核酸产生结合TGFβ1的可溶性循环蛋白，从而抑制其激活其内源途径的能力。可溶性循环蛋白可以是TGFβ受体2的细胞外结构域。本领域技术人员也可以从TGFβ受体1或3产生形式。如由注释软件和氨基酸的疏水性所预测的，可溶性TGFβ受体2蛋白在蛋白质的跨膜结构域被截短。

质粒

通过扩增细胞外结构域来产生载体AAV载体，使用正向引物和反向引物/>正向引物的粗体和斜体部分是Kozak序列。反向引物的粗体和斜体部分匹配通过重叠PCR在C末端融合的小鼠igg结构域。

正向引物 和反向引物5’-TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTC(SEQ ID NO:2)用于扩增igg结构域。粗体和斜体部分匹配TGFbR2的细胞外结构域用于重叠PCR。在第二轮PCR中，使用相等摩尔比的扩增段来合并两部分，使用来自TGFbR2扩增的正向引物和来自igg扩增的反向引物。这产生了融合蛋白sTGFbR2-Fc(igg2Ae)，总长度为1251个碱基对。其由独特的限制酶位点突出NotI和NheI连接到AAV骨架中。

生成AAV

根据Lock,M.2010《人类基因治疗》(Human gene therapy)；Kwon,O.等,(2010)JHistochem Cytochem.58(8):687-694进行AAV产生和滴度定量的方法。简而言之，Hek 293细胞在来自Thermo科学公司(伊利诺伊州罗克福德)的10层Nunc^TMCell Factory^TM系统中使用PEI转染试剂按照制造商的说明以75％汇合共转染三份。转染后72小时分别收获细胞和上清液。将细胞离心并用3次冷冻-解冻循环裂解，并用Benzonase(E1015-25KU，Sigma公司)孵育。然后通过在10,500xG下旋转20分钟澄清，并将上清液加入剩余的培养基上清液中。将所有物质通过0.2uM滤器过滤，然后使用实验室规模的TFF系统(EMD化学公司，新泽西州吉布斯镇)浓缩至15ml。使用Pellicon XL 100kDa滤器并遵循制造商说明(EMD化学公司，新泽西州吉布斯镇)。通过在10,500×g和15℃下离心20分钟重新澄清浓缩的制剂，并将上清液小心地移至新管中。根据Zolotukhin及其同事的方法形成六个碘克沙醇步进梯度。参见Zolotukhin S.,(1999)Gene Ther.6:973-85，进行了如下修改：在含有10mM氯化镁和25mM钾的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中密度越来越高的碘克沙醇(OptiPrep；Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯)溶液在39ml Quick-Seal离心管(Beckman Instruments，Palo Alto，CA)依次铺垫。梯度的步进是4ml的15％，9ml的25％，9ml的40％和5ml的54％碘克沙醇。然后将14毫升澄清的原料覆盖在梯度上并密封管。将管在242,000×g下在VTi 50转子(Beckman仪器公司)中于18℃离心70分钟，并通过在54％/40％界面水平插入的18号针收集40％梯度。含有碘克沙醇的病毒使用Amicon15-Ultra进行渗滤，用最终制剂缓冲液(PBS-35mM NaCl)洗涤5次，并浓缩至约1ml。

载体表征

使用针对转基因盒中编码的WPRE3聚腺苷酸化信号的引物和探针，通过TaqManPCR扩增(应用生物系统(Applied Biosystems)公司，加利福尼亚福斯特城)滴定DNase I抗性载体基因组。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估梯度级分和最终载体批次的纯度，并通过SYPRO红宝石染色(Invitrogen公司)和UV激发使蛋白质可视化。

感染

通过腹膜内(IP)，尾静脉(TV)或眼眶后(RO)注射感染小鼠。简而言之，IP注射位置通过在膝盖正上方划出跨腹部的假想线来定位。将针沿着该线插入动物的右侧并靠近中线。为了执行IP注射，必须很好地限制小鼠，以便在操作过程中其不能移动。倾斜整个小鼠，使头顶朝向地面，后腿向上，使腹部朝向你。将针以大约30度的角度插入腹部，针的轴应进入约半厘米的深度。吸气以确保针头没有穿透血管、肠道或膀胱。注射注射器的内容物并取出针并将小鼠放回笼子中。小鼠IP注射的推荐针尺寸为25-27号。对于IV注射到尾静脉中，限制小鼠并通过将尾巴保持在明亮的光线上来找到尾静脉。通过将小鼠简单地放在加热灯下以使血管扩张，使静脉变大。然后使用25号针向小鼠注射多至200ul。RO注射在麻醉下进行。麻醉的小鼠通过施加轻微压力使眼睛膨胀并将针头滑到眼睛后面而准备，成年小鼠只需150ul。

手术

通过升主动脉缩窄术在成年动物中诱导主动脉缩窄(ACC)。在胸壁中大约在第三肋间隙处切口。插入啮齿动物肋骨扩张器并且肋骨轻轻地扩展以允许进入胸腔。然后将升主动脉从肺动脉中分离出来，并将无菌的8.0聚丙烯结扎线从心脏基部约3mm处绕过它。将钝化的27号针置于主动脉顶部，并将结扎线系在针周围。然后小心地从系连下面取出针。肋骨扩张器关闭，肺部再次充气。使用无菌缝合线(5-0Dexons和6-0Prolene缝合线分别关闭肌肉和皮下层和皮肤)闭合肋骨，胸部肌肉组织和皮肤。外科医生将通过扩张肺部来最小化气胸，同时放置最后缝合线结束开胸术。假手术动物经历类似的过程而没有主动脉缩窄。密切监测动物直至从麻醉中完全恢复。一旦动物恢复知觉(并且能够保护其气道)，动物将被拔管。持续密切监测动物，直至达到完全的神经意识。缝合线将在手术后10-14天移除。根据需要，在临床术后记录中记录外科手术的日期，时间和类型。ACC手术死亡率可能为30％。

非侵入性超声心动图

为了连续非侵入性地评估心脏结构和功能，动物在指定时间点(每周不超过一次)进行非侵入性经胸超声心动图检查。为此，将动物带到指定的手术室。用1.5-5％(小鼠和大鼠)异氟烷轻度麻醉动物。通过对温和的皮肤挤压的反应不足来确认镇静效果。将眼膏涂在麻醉的动物身上，以防止眼睛干燥并引起刺激或溃疡。使用#40刀片和医用级脱毛膏移除动物胸部毛发，以获得清晰的回声图像。将动物轻轻放在平台上，将超声心动图探针置于左胸壁上。使用连接到回声机器的生理监测器和在超声成像进行时放置动物的平台监测动物的心率和呼吸速率。超声图像通常在15分钟内获得并且不会导致动物疼痛。在手术过程中，密切监测动物的任何窘迫迹象，如果有任何迹象，立即终止手术并将动物放回笼中。

安乐死

根据设施中可用的设备，通过缓慢填充方法给予CO2使动物安乐死。通常，动物在其他动物的视野外在家笼中安乐死。调节器用于确保适当的流速。动物应在约30秒迅速失去知觉。在呼吸停止(几分钟)时，动物将接受第二次安乐死物理方法。

组织收获

安乐死后立即收获组织。将每个器官的一部分在干冰中快速冷冻用于qPCR分析和测序，然后将每个器官的另一部分在24-48小时内根据大小经福尔马林固定过夜并在OCT缓冲液中冷冻用于切片和分析。

血液收集

握住小鼠颈背并用针刺穿下颌静脉/动脉，并将血液收集在涂有肝素的管中。

染色和切片

使用切片机切片小鼠，然后石蜡包埋。通过将载玻片加热至50℃，然后连续加入二甲苯和乙醇，最后加入DI H₂O，进行脱蜡和再水合。然后将载玻片在沸腾的柠檬酸盐缓冲液中孵育10分钟，并在室温下在工作台上冷却。然后将它们在PBS中洗涤5次，每次2分钟。将载玻片在室温下在PBS中的3％BSA中封闭1小时。将一抗在3％BSA/PBS中以1:300稀释度在4℃下应用过夜。然后将载玻片在PBS中洗涤5次，每次2分钟。将3％BSA/PBS中的二抗在37℃下施用1小时，稀释度为1/100。然后将载玻片在PBS中洗涤5次，每次2分钟。在室温下(在潮湿室中)每载玻片施加50μl PBS中的DAPI(或赫斯特(Hoechst)最终5μ/ml)，持续30分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤5次，每次2分钟。使用不带DAPI和盖子的安装介质进行安装。

转化生长因子β1(TGF61)的抑制

编码用于转化生长因子受体II(TGFbRII)的可溶性受体蛋白的核酸使用AAV递送至HCM/DCM小鼠模型中的细胞，其使用主动脉条带以实现最终引起所需表型的压力超负荷。AAV用于TGFβ1的长期永久性减少，这有利于减少心力衰竭并改善寿命，如图7中所示的存活曲线所示。可溶性受体蛋白结合TGFβ1以减少该途径的信号传导并减轻纤维化组织诱导和炎症反应。如图2所示，给予带有编码转化生长因子受体II(TGFbRII)的可溶性受体蛋白的核酸的AAV使血清TGFβ1降低多达95％，导致TGFβ1信号传导减少。

基因治疗影响纤维化病灶的发展。如图3所示，与具有约8％的AAV处理的小鼠心脏相比，对照样品在切片心脏的总面积上具有约30％的纤维化。AAC手术后7周，基因治疗也影响了心脏的功能。如图1所示，在超声心动图中可见心脏收缩力的强度和左心室容积差异很大。图5表明对照动物在几个参数中具有负变化，例如心脏壁厚度，射血分数，缩短分数和左心室体积。基因治疗动物在这些参数中没有变化或有积极的变化。

图4描绘了对照心脏的WGA和DAPI染色。图6描绘了代表性的三色染色图像。

实施例2：组合基因治疗

本公开内容提供了用于递送编码用于转化生长因子受体II(TGFbRII)的可溶性受体蛋白的核酸和编码Nrf2的核酸(或核因子(红系细胞衍生的2)样2Nfe212)的基因治疗方法。Nrf2是一种抗氧化蛋白，可以防止因受伤和炎症引起的氧化损伤。本公开内容提供了通过直接注射两种病毒而组合使用它们的方法，每种病毒含有一个转基因盒(即ITR-hEf1α-sTGFbR2-Fc-WPRE3-SV40pA-ITR和ITR-hEf1α-Nrf2-WPRE3-SV40pA-ITR)。本公开提供了通过使用病毒2A序列或IRES将两种转基因合并成一种载体，其中两种基因由一个启动子表达(即ITR-hEf1α-sTGFbR2-Fc-P2A-Nrf2-WPRE3-SV40pA-ITR或ITR-hEf1α-sTGFbR2-Fc-IRES-Nrf2-WPRE3-SV40pA-ITR)。

实施例3：调控脂连蛋白的方法

本公开内容提供了用于调控动物(例如人或其他哺乳动物，例如家养动物，例如狗或猫)中的脂连蛋白的基因治疗方法。提供腺相关病毒，其包括驱动编码脂连蛋白和DsbA-L(GSTK1)的核酸表达的组成型启动子。核酸构建体可包括3'UTR，其包括WPRE3和后SV40pA。编码脂连蛋白的核酸在第一载体中提供，编码DsbA-L的核酸在第二载体中提供。第一载体和第二载体是自身互补AAV载体。自身互补的腺相关病毒(scAAV)是由天然存在的腺相关病毒(AAV)工程化的病毒载体。rAAV被称为“自身互补”，因为编码区被设计为形成分子内双链DNA模板。标准AAV基因组的限速步骤涉及第二链合成，因为典型的AAV基因组是单链DNA模板。然而，scAAV基因组不是这种情况。在感染时，scAAV的两个互补半部分将关联而不是等待第二链的细胞介导的合成，以形成一个准备立即复制和转录的双链DNA(dsDNA)单元。在利用rAAV的基因治疗应用中，病毒用单链DNA(ssDNA)转导细胞，侧翼为两个反向末端重复序列(ITR)。这些ITR在序列末端形成发夹，用作在随后的感染步骤开始之前引发第二链合成的引物。第二链合成被认为是用以有效感染的几个区块之一。scAAV的其他优点包括体外和体内增加和延长的转基因表达，以及更高的体内DNA稳定性和更有效的环化。

实施例4：治疗肥胖症的方法

本公开内容提供了用于递送编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的核酸和编码BMP2，BMP4或Sema3a或它们全部的核酸的基因治疗方法。已知FGF21通过抑制细胞向成骨细胞的分化和促进细胞分化为破骨细胞来将成骨细胞和破骨细胞的平衡转向破骨细胞形成。为了平衡由于增加的FGF21表达而引起的骨损失的负面影响，递送了多个基因。FGF21会导致体重减轻，如图8A和8B所示，而没有任何明显的毒性(通过身体状况评分和活性监测所示)。保持高脂肪饮食的小鼠能够减掉高达40％的体重(恢复到他们年龄的小鼠的正常体重)并且似乎已经达到正常范围。为了对抗骨损失，BMP2、BMP4或Sema3a中的一种或两种或全部与FGF21同时或串联递送，作为组合疗法的一部分，以将平衡转变回成骨细胞和破骨细胞的体内平衡。

根据某些方面，提供了用于减轻个体体重或增加个体代谢率的方法，包括在基因治疗方法中向个体递送编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的核酸，例如使用AAV或调控(上调或下调)FGF21。

在进行的实验中，测量小鼠的食物摄入量，其中小鼠提供有FGF21作为基因疗法，并且接受该疗法的小鼠消耗更多高脂肪食物但仍然能够维持正常的瘦小鼠体重，表明代谢状态改变。参见图16。确定了基因治疗对呼吸率和活动的影响。将用FGF21处理的小鼠置于Columbus Instruments CLAMS系统中以测量它们的O₂消耗，CO₂产生及其在X、Y、Z平面中的移动，结果显示在图17中。一旦小鼠进入系统，数据就会自动生成。与对照相比，维持瘦体重同时消耗更多食物的FGF21小鼠具有更高的代谢活性，如通过增加的O₂消耗和CO₂产生所示。然而，正如运动传感器所示，FGF21小鼠表现出较少的运动，这另外表明，它们改变的线粒体活性和代谢状态而不是它们的行为是导致它们在高脂肪饮食时维持瘦体重的能力的原因。

通过葡萄糖耐量试验测试FGF21对葡萄糖和胰岛素敏感性的影响，并确定具有如图18中所示的较大效果。简言之，将小鼠禁食过夜6-10小时。收集血液以分析基线血糖水平。然后通过口服管饲法对小鼠给予一定剂量的葡萄糖溶液，使用多至500ul的ddH₂O中的250mg/ml葡萄糖。然后采集血液并以下列增量测量血糖：15分钟，30分钟，60分钟和120分钟。数据显示在图18中，左手图是几种不同剂量的FGF21，然后是其他蛋白质恒定1E10剂量的FGF21的不同组合。测试了FGF21+sTGFbR2-FC和FGF21+sTGFbR2-FC+Klotho，结果显示在右手图中，标明了葡萄糖的差异。

本公开内容提供了用于递送编码生长分化因子15(GDF15)的核酸和编码脂连蛋白的核酸，和编码ZAG的核酸和编码Nrf2的核酸的基因治疗方法。有效量的所有这4种核酸的组合递送已经显示体重减轻而没有毒性的证据(通过身体状况评分和活动监测所示)。如图9所示，这些小鼠体重减轻了多达15％并继续呈下降趋势。

实施例5：表达盒

本公开提供了包含在AAV内的表达盒，包含14个初-miRNA-shRNA序列。载体具有面向上游的第一盒和面向下游的第二盒。第一盒包含7个miRNA-shRNA序列。第二盒包括miRNA-shRNA序列。面向上游的盒和面向下游的盒防止两个盒之间的通读。两个盒的示意图如下：ITR_3'UTR-1_7miRNA_启动子-1__启动子-2_7miRNA_3'UTR-2_ITR。第一盒面向上游3’←5’.<-------第二盒面向下游5’→3’("正常")------>，如示意图所示：ITR___<---------------____--------------->___ITR.

ITR-bGHpA-7miRNA-CMV-hEf1α-7miRNA-WPRE3-SV40pA-ITR。

实施例6：狗蛋白狗-stgfbr2-fc的修饰

狗蛋白狗-stgfbr2-fc被修饰为包括小鼠/人分泌信号。编码狗-stgfbr2-fc的核酸经修饰以用以下小鼠/人分泌信号：

ATGGGTCGGGGGCTGCTCCGGGGCCTGTGGCCGCTGCATATCGTCCTGTGGACGCGCATCGCCAGCACG(SEQ ID NO:121)

代替以下先天分泌信号

ATGCACAGTCAAGGGCGGGGTTGCAACAACACAAAACAAAACAAAACTTCCGGACTTCGACCTGCAGCTGAGAAGAACATCTCGCAAAGCGGCGTT(SEQ ID NO:120)。

编码最终蛋白的核酸序列如下。

粗体表示分泌信号。粗体和斜体表示犬IGb重链。非粗体表示犬TGFb受体2细胞外结构域。

图14显示体外ELISA测定，其中证明杂合蛋白比原始犬蛋白表现更好。ELISA检测TGFb1，除非当TGFb1与可溶性TGFβ受体2结合并因此在ELISA测定中阻止其结合时。简言之，将来自用每种构建体转染的293-Hek细胞或作为对照的sHef1a-EGFP转染的293-Hek细胞的上清液与含有天然狗TGFb1的狗血清混合，并测定细胞分泌可溶性TGFβ受体2的能力。如图15所示，天然狗蛋白不会产生或分泌，包括小鼠/人分泌信号的杂合狗蛋白质也不会产生或分泌。293-Hek细胞能够更好地分泌包括小鼠/人分泌信号的杂合狗蛋白。

实验包括以下分泌因子代替天然TGFbR2分泌信号。本领域技术人员将能够在公开可用的信息中识别额外的有用分泌信号，其基于本公开将表达调节至期望水平。此外，可以进行筛选诱变以找到待分泌的特定肽序列的最佳分泌信号。根据该方面，分泌的序列可以调节分泌信号的功效，并且可以针对特定的目的基因优化分泌信号。

根据一个方面，载体可以包括合成内含子，以通过增强RNA向细胞核外的转运来增加表达。本领域技术人员已知的合成或天然内含子可用于此目的。

胰凝乳蛋白酶原(网址unitargeting.com/Resources/Trends07.pdf)

ATGGCTTTTCTTTGGTTGCTGAGCTGCTGGGCACTGCTGGGTACTACTTTTGGA(SEQ ID NO:123)

MAFLWLLSCWALLGTTFG(SEQ ID NO:124)

胰蛋白酶原

ATGAACTTGCTTCTCATCCTGACTTTTGTTGCAGCCGCCGTGGCT(SEQID NO:125)

重链

ATGGAGTTCGGGCTTTCTTGGGTGTTCTTGGTCGCTTTGTTTCGGGGGGTCCAGTGT(SEQ ID NO:126)

MEFGLSWVFLVALFRGVQC(SEQ ID NO:127)

IL2-ILco1(PMID:15619290)

ATGAGGATGCAACTTCTCCTCTTGATAGCCCTTTCCTTGGCTCTGGTCACCAACAGC(SEQ ID NO:128)

MRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:129)

IL2-ILco2(PMID:15619290)

MRRMQLLLLIALSLALVTNS(SEQ ID NO:130)

IL2(PMID:15619290)

MQLLSCIALILALV(SEQ ID NO:131)

人血清白蛋白

MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:132)

人蓝啶前体蛋白质

MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:133)

挠足虫荧光素酶

MGVKVLFALICIAVAEA(SEQ ID NO:134)

实施例7：预防心力衰竭的方法

根据某些方面，提供了用于治疗或预防心力衰竭的基因治疗方法。第一组小鼠用如下处理：1E11vg/小鼠的AAV8:sHef1a-sTGFbR2-FC-WPRE3-SV40pA和1E11vg/小鼠的AAV9:sHef1a-Nrf2-WPRE3-SV40pA(双重疗法)。第二组小鼠用1E11vg/小鼠的AAV8:sHef1a-sTGFbR2-FC-WPRE3-SV40pA(单一疗法)处理。对照AAC小鼠接受手术但未接受治疗。与对照相比，接受双重治疗或单一治疗的小鼠具有更高的缩短分数，更高的射血分数和更低的心脏质量。根据某些方面，在治疗或预防心力衰竭或肾衰竭的方法中，用sTGFbR2-FC,sTGFbR2-FC+FGF21,sTGFbR2-FC+Klotho,或sTGFbR2-FC+FGF21+Klotho处理小鼠。

以下基因的组合作为基因治疗方法进行评估，例如通过使用一种或多种AAV治疗或预防心力衰竭：FGF21，Klotho和sTGFbR2-FC。如图19所示，缩短分数测量值(在手术后3个月，先前描述的对AAC的手术)表明基因的组合治疗或预防心力衰竭。组合组中的更多小鼠分叉为补偿方案，从而克服3个月前放置的手术带。所有对照小鼠都会失去功能，很可能在未来几周内死亡。而最终补偿的其他组中的老鼠没有表现出他们将会死亡的迹象。超声心动图全部在有意识的小鼠上进行，并用天然回声软件进行分析。

实施例8：促进体重减轻的方法

根据某些方面，提供了用于促进体重减轻的基因治疗方法，例如用于促进肥胖个体的体重减轻。从杰克逊实验室获得脂肪小鼠，其在高脂肪饮食中持续3个月。从杰克逊实验室到达后，将小鼠从研究饮食形式维持在45％高脂肪饮食D12451约1周。然后给小鼠注射不同剂量的AAV8:sHef1a-FGF21-WPRE3-SV40pA,以及下述的一种组合：1E9vg/小鼠的AAV8:sHef1a-FGF21-WPRE3-SV40pA,1E11vg/小鼠的AAV8:sHef1a-Klotho-WPRE3-SV40pA,1E11vg/小鼠的AAV8:sHef1a-sTGFbR2-Fc-WPRE3-SV40pA。所有剂量均促进体重减轻，而1E11和1E10促进体重持续减轻。

实施例9：延长寿命的方法

根据某些方面，提供了如本文所述的基因治疗方法，用于增加个体的寿命，健康寿命或存活。使用本文所述的基因治疗方法中的sTGFbR2-FC处理的小鼠进行实验。给予sTGFbR2-FC基因的小鼠的寿命增加，如图20所示，平均寿命和最大寿命增加约10％。

进行另外的实验以确定健康寿命的增加，如通过使用照相机和传感器每周7天每天24小时测量进入晚年的增加的活动和呼吸，提供图像分析以提供这些指标。随时间测量小鼠的体重。结果如图21所示。该实验在各种治疗组之间在昼夜节律，呼吸速率，寿命，每日运动和夜间运动方面产生了许多差异。治疗组和基因治疗的组合如下表5所示。

实施例10：治疗或预防肾衰竭的方法

根据某些方面，提供了用于治疗或预防肾衰竭的基因治疗方法。以下基因的组合作为基因治疗方法进行评估，例如通过使用一种或多种AAV治疗或预防心力衰竭：FGF21，Klotho和sTGFbR2-FC。图22显示了对照小鼠和用sTGFbR2-Fc基因疗法治疗的小鼠的肾脏之间的显著差异。A和C描绘了非手术对侧对照肾脏。B和D描绘UUO肾脏，B描绘了与D相比改善的结果。

本申请中提到的所有公开出版物、专利、专利申请和其他文献都通过引用全文纳入本文中，相当于所述各单独的公开出版物、专利、专利申请或其他文献都独立地通过引用纳入本文用于所有目的。

虽然已经说明和描述了各种具体实施方式，但是应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。附录A:

序列:黑体＝指示时表示分泌信号

1.(SEQ ID NO:3)sTGFBr2人DNA

2.(SEQ ID NO:4)sTGFBr2狗DNA

3.(SEQ ID NO:5)具有小鼠/人分泌信号的sTGFBr2的另一形式

4.sTGFBr2猫DNA

5.04sTGFBr2牛DNA

6.sTGFBr2绵羊DNA

7.sTGFBr2马DNA

8.sTGFBr2猪DNA

9.(SEQ ID NO:6)sTGFBr2小鼠DNA

10.(SEQ ID NO:7)sTGFBr2人AA

11.(SEQ ID NO:8)sTGFBr2狗AA

12.sTGFBr2猫AA

13.sTGFBr2牛AA

14.sTGFBr2绵羊AA

15.sTGFBr2马AA

16.sTGFBr2猪AA

17.(SEQ ID NO:9)sTGFBr2小鼠AA

18.Fc人

19.(SEQ ID NO:10)Fc狗

CCCAAAAGAGAAAATGGAAGAGTTCCTCGCCCACCTGATTGTCCCAAATGCCCAGCCCCTGAAATGCTGGGAGGGCCTTCGGTCTTCATCTTTCCCCCGAAACCCAAGGACACCCTCTTGATTGCCCGAACACCTGAGGTCACATGTGTGGTGGTGGATCTGGACCCAGAAGACCCTGAGGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGGACGGTAAGCAGATGCAAACAGCCAAGACTCAGCCTCGTGAGGAGCAGTTCAATGGCACCTACCGTGTGGTCAGTGTCCTCCCCATTGGGCACCAGGACTGGCTCAAGGGGAAGCAGTTCACGTGCAAAGTCAACAACAAAGCCCTCCCATCCCCGATCGAGAGGACCATCTCCAAGGCCAGAGGGCAAGCCCATCAGCCCAGTGTGTATGTCCTGCCGCCATCCCGGGAGGAGTTGAGCAAGAACACAGTCAGCTTGACATGCCTGATCAAAGACTTCTTCCCACCTGACATTGATGTGGAGTGGCAGAGCAATGGACAGCAGGAGCCTGAGAGCAAGTACCGCACGACCCCGCCCCAGCTGGACGAGGACGGGTCCTACTTCCTGTACAGCAAGCTCTCTGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCGGGGAGACACCTTCATATGTGCGGTGATGCATGAAGCTCTACACAACCACTACACACAGGAATCCCTCTCCCATTCTCCGGGTAAATGA

20.(SEQ ID NO:11)Fc狗AA形式:PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK

21.Fc猫

22.Fc牛

23.Fc绵羊

24.Fc马

25.Fc猪

26.(SEQ ID NO:12)Fc小鼠

CCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCGAGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGCGTTCGCATGCGCGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA

27.(SEQ ID NO:13)Fc小鼠AA形式:PRGPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKAFACAVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

28.UCP1

29.AMPK

30.人源化FoxP2

31.NEU1

32.NGF

33.BubR1

34.NAMPT

35.Nmnat1

36.(SEQ ID NO:14)mNrf2(mXXX表示小鼠的鼠)

ATGATGGACTTGGAGTTGCCACCGCCAGGACTACAGTCCCAGCAGGACATGGATTTGATTGACATCCTTTGGAGGCAAGACATAGATCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGTTTGACTTTAGTCAGCGACAGAAGGACTATGAGTTGGAAAAACAGAAAAAACTCGAAAAGGAAAGACAAGAGCAACTCCAGAAGGAACAGGAGAAGGCCTTTTTCGCTCAGTTTCAACTGGATGAAGAAACAGGAGAATTCCTCCCAATTCAGCCGGCCCAGCACATCCAGACAGACACTAGTGGATCCGCCAGCTACTCCCAGGTTGCCCACATTCCCAAACAAGATGCCTTGTACTTTGAAGACTGTATGCAGCTTTTGGCAGAGACATTCCCATTTGTTGATGACCATGAGTCGCTTGCCCTGGATATCCCCAGCCACGCTGAAAGTTCAGTCTTCACTGCCCCTCATCAGGCCCAGTCCCTCAATAGCTCTCTGGAGGCAGCCATGACTGATTTAAGCAGCATAGAGCAGGACATGGAGCAAGTTTGGCAGGAGCTATTTTCCATTCCCGAATTACAGTGTCTTAATACCGAAAACAAGCAGCTGGCTGATACTACCGCTGTTCCCAGCCCAGAAGCCACACTGACAGAAATGGACAGCAATTACCATTTTTACTCATCGATCTCCTCGCTGGAAAAAGAAGTGGGCAACTGTGGTCCACATTTCCTTCATGGTTTTGAGGATTCTTTCAGCAGCATCCTCTCCACTGATGATGCCAGCCAGCTGACCTCCTTAGACTCAAATCCCACCTTAAACACAGATTTTGGCGATGAATTTTATTCTGCTTTCATAGCAGAGCCCAGTGACGGTGGCAGCATGCCTTCCTCCGCTGCCATCAGTCAGTCACTCTCTGAACTCCTGGACGGGACTATTGAAGGCTGTGACCTGTCACTGTGTAAAGCTTTCAACCCGAAGCACGCTGAAGGCACAATGGAATTCAATGACTCTGACTCTGGCATTTCACTGAACACAAGTCCCAGCCGAGCGTCCCCAGAGCACTCCGTGGAGTCTTCCATTTACGGAGACCCACCGCCTGGGTTCAGTGACTCGGAAATGGAGGAGCTAGATAGTGCCCCTGGAAGTGTCAAACAGAACGGCCCTAAAGCACAGCCAGCACATTCTCCTGGAGACACAGTACAGCCTCTGTCACCAGCTCAAGGGCACAGTGCTCCTATGCGTGAATCCCAATGTGAAAATACAACAAAAAAAGAAGTTCCCGTGAGTCCTGGTCATCAAAAAGCCCCATTCACAAAAGACAAACATTCAAGCCGCTTAGAGGCTCATCTCACACGAGATGAGCTTAGGGCAAAAGCTCTCCATATTCCATTCCCTGTCGAAAAAATCATTAACCTCCCTGTTGATGACTTCAATGAAATGATGTCCAAGGAGCAATTCAATGAAGCTCAGCTCGCATTGATCCGAGATATACGCAGGAGAGGTAAGAATAAAGTCGCCGCCCAGAACTGTAGGAAAAGGAAGCTGGAGAACATTGTCGAGCTGGAGCAAGACTTGGGCCACTTAAAAGACGAGAGAGAAAAACTACTCAGAGAAAAGGGAGAAAACGACAGAAACCTCCATCTACTGAAAAGGCGGCTCAGCACCTTGTATCTTGAAGTCTTCAGCATGTTACGTGATGAGGATGGAAAGCCTTACTCTCCCAGTGAATACTCTCTGCAGCAAACCAGAGATGGCAATGTGTTCCTTGTTCCCAAAAGCAAGAAGCCAGATACAAAGAAAAACTAG

37.Sirt6

38.TERT

39.(SEQ ID NO:15)mTFAM

ATGGCGCTGTTCCGGGGAATGTGGAGCGTGCTAAAAGCACTGGGGCGCACGGGGGTCGAGATGTGCGCGGGCTGCGGGGGTCGCATCCCCTCGTCTATCAGTCTTGTCTGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCATGGGTAGCTATCCAAAGAAACCTATGAGTTCATACCTTCGATTTTCCACAGAACAGCTACCCAAATTTAAAGCTAAACACCCAGATGCAAAACTTTCAGAATTGGTTAGGAAAATTGCAGCCCTGTGGAGGGAGCTACCAGAAGCAGAAAAAAAGGTTTATGAAGCTGATTTTAAAGCTGAGTGGAAAGCATACAAAGAAGCTGTGAGCAAGTATAAAGAGCAGCTAACTCCAAGTCAGCTGATGGGTATGGAGAAGGAGGCCCGGCAGAGACGGTTAAAAAAGAAAGCACTGGTAAAGAGAAGAGAATTAATTTTGCTTGGAAAACCAAAAAGACCTCGTTCAGCATATAACATTTATGTATCTGAAAGCTTCCAGGAGGCAAAGGATGATTCGGCTCAGGGAAAATTGAAGCTTGTAAATGAGGCTTGGAAAAATCTGTCTCCTGAGGAAAAGCAGGCATATATTCAGCTTGCTAAAGATGATAGGATTCGTTACGACAATGAAATGAAGTCTTGGGAAGAGCAGATGGCTGAAGTTGGACGAAGTGATCTCATCCGTCGAAGTGTGAAACGATCCGGAGACATCTCTGAGCATTAA

40.TFEB

41.Fat1

42.(SEQ ID NO:16)脂连蛋白

ATGCTACTGTTGCAAGCTCTCCTGTTCCTCTTAATCCTGCCCAGTCATGCCGAAGATGACGTTACTACAACTGAAGAGCTAGCTCCTGCTTTGGTCCCTCCACCCAAGGGAACTTGTGCAGGTTGGATGGCAGGCATCCCAGGACATCCTGGCCACAATGGCACACCAGGCCGTGATGGCAGAGATGGCACTCCTGGAGAGAAGGGAGAGAAAGGAGATGCAGGTCTTCTTGGTCCTAAGGGTGAGACAGGAGATGTTGGAATGACAGGAGCTGAAGGGCCACGGGGCTTCCCCGGAACCCCTGGCAGGAAAGGAGAGCCTGGAGAAGCCGCTTATGTGTATCGCTCAGCGTTCAGTGTGGGGCTGGAGACCCGCGTCACTGTTCCCAATGTACCCATTCGCTTTACTAAGATCTTCTACAACCAACAGAATCATTATGACGGCAGCACTGGCAAGTTCTACTGCAACATTCCGGGACTCTACTACTTCTCTTACCACATCACGGTGTACATGAAAGATGTGAAGGTGAGCCTCTTCAAGAAGGACAAGGCCGTTCTCTTCACCTACGACCAGTATCAGGAAAAGAATGTGGACCAGGCCTCTGGCTCTGTGCTCCTCCATCTGGAGGTGGGAGACCAAGTCTGGCTCCAGGTGTATGGGGATGGGGACCACAATGGACTCTATGCAGATAACGTCAACGACTCTACATTTACTGGCTTTCTTCTCTACCATGATACCAACTGATAA

42.Klotho(犬)(SEQ ID NO:135)

ATGGCCACCTGCATTTTACAGATGAGATTCCTAAGGCTGGGGAAGATACTGTTCCACTCCAGCCCACAAAGCACAGGTGGCAGTGGTGGGACCCGGGGACCTCGAGCTCCGGCACAGCTGCGAACGCAGCGTGGCACAGATAAGTTAGTTGCTAAGTCAGAGCTCAAGGCTAAAACGGCCCACCGCGCGCTGGCCGACCACTTCAGGGACTACGCCGAGCTCTGCTTCCGCCACTTCTGCGGCCAGGTCAAGTACTGGATCACCATCGACAACCCCTACGTGGTGGCCTGGCACGGCTACGCCACCGGTCGCCTGGCACCCGGAGTCAGAGGCAGCCCGCGGCTCGGGTACCTGGTGGCGCACAACCTCCTCCTGGCTCACGCCAAAATCTGGCATCTCTACAATACTTCTTTCCGCCCAACTCAGGGAGGCCAGGTATCCATTGCCCTAAGCTCCCACTGGATCAATCCTCGAAGAATGACCGACCATAGCATCAAAGAATGTCAAAAATCTCTTGACTTTGTACTAGGCTGGTTTGCCAAGCCCATATTTATTGATGGTGACTATCCTGAGAGCATGAAGAATAACCTGTCATCTCTTCTGCCTGTTTTTACTGAATCTGAGAAAAAGTTCATCAAGGGAACAGCTGACTTTTTTGCTCTTTCTTTTGGACCAACTTTGAGTTTTCAACTCTTGGACCCTCATATGAAGTTCCACCAATTAGAATCTCCCAGCCTGAGGCAACTCCTTTCTTGGATTGACCTTGAATATAACCACCCTCAAATATTTATTGTGGAAAATGGCTGGTTTGTCTCAGGGACCACCAAGAGAGATGATGCCAAATATATGTATTACCTCAAAAAATTCATAATGGAAACCTTAAAAGCCATCAGGCTGGATGGGGTGGATGTCATAGGATACACAGCGTGGTCCCTTATGGATGGCTTCGAGTGGCACAGAGGCTACAGCATCAGACGTGGACTCTTCTACGTGGACTTTCTAAGCCAGGATAAGAAACTGTTGCCAAAGTCTTCAGCCTTGTTCTACCAAAAGCTGATAGAGAAAAATGGCTTCCCTCCTTTACCTGAAAATCAGCCCCTAGAAGGGACATTTCCCTGTGACTTTGCTTGGGGAATTGTTGACAACTACATTCAAGTGGACACCACTCTGTCTCAGTTTACCGACCCGAACGTTTACCTGTGGGACGTCCATCACAGCAAGAGGCTGATTAAGGTGGACGGGCTGCGGGCCAAGAAGAGGAAGCCCTACTGCGTGGACTTTGCCGCCATCGGGCCCCAGGTGGCCCTGCTGCAGGAGATGCACGTCTCGCATTTTCACTTCTCGCTGGACTGGGCCCTGCTCCTGCCGCTGGGCAACCAGTCCCGGGTGAACCACGCGGCCCTGCACTACTACGGCTGCGTGGCCAGCGAGCTCCTGCGCGCCAACATCACCCCGGTGGTGGCGCTCTGGAGACCAGCCGCTGCGCACCAGGGTCTGCCTGGACCGCTGGCACAGCGCGGTGCCTGGGAGAACCCACGCACCGCCCTGGCGTTCGCCGAGTACGCGCGCCTGTGCTTCCGCGCCCTGGGCCGCCACGTCAAGGTGTGGATCACGCTGCGCGAGCCGCCCACGCGGAACCTGACGCTCCGCGCCGGGCACAACCTGCTGCGGGCGCACGCGCTGGCCTGGCGCGTGTACGACGAGCAGTTCCGGGGCTCGCAGCAGGGGAAGGTGTCCATCGCCCTGCAGGCCGACTGGGTGGAGCCCGCCTGCCCCTCCTCCCAGAAGGACCGCGAAGTGGCCGAGAGGGTTCTGGAGTTCGACGTCGGCTGGCTGGCCGAGCCCATCTTCGGCTCCGGGGACTACCCGCGGCTGATGCGCGACTGGCTCACCCGGAGAGACCATTCCCTCCTGCCCTATTTCACTGACGAAGAGAAGAGGCTAATCCGGGGTTCCTTTGACTTCCTGGCCTTGAGCCATTACACCACCATCCTCGTGGACTGGGAAAAGGAAGACCCAGTCAAATACAATGATTACCTGGAAGTGCAGGAGATGACCGACATCACCTGGCTCAACTCCCCCAGTCAGGTGGCCGTAGTGCCCTGGGGCCTGCGCAAAGTGCTCAACTGGCTCAAGTTCAAGTACGGAGACCTCCCCATGTATATCGTATCCAACGGCATAGATGACGATCCGCGGGCAGCCCAGGACTCGTTGAGGGTGTATTACATGCAGAACTATGTAAATGAAGCTCTGAAAGCCTACGTATTGGATGGTATCAATCTTTGTGGATACTTTGCCTACTCATTTAATGATCGCACAGCTCCGAAGTTTGGCCTCTATCATTATGCTGCAAACCAGTTTGAGCCCAAACCGTCGGTGAAGCATTACAGGAAAATTATTGACAACAATGGCTTCCCAGGCCCTGAAACTTTGGGGCGGTTTTGTCCAGAGGAATTCACCCTGTGCACCGAATGCAGCTTTTTTCACACCCGAAAGTCTTTACTGGCTTTCATAGCTTTCCTACTTTTTGCTTTTATTATTTCTCTTTCTCTGATTTTCTACTACTCTAGGAAAGGCAGAAGAAGTTATAAAGGAGGGAGTGGTGGGTCCGATTACAAAGATCACGATGGGGACTATAAAGATCACGACATCGACTATAAGGATGACGATGATAAATGA

43.FGF21(犬)(SEQ ID NO:136)

ATGGGCTGGGCCGAGGCCGGGTTCGAGCACCTGGGACTGTGGGTCCCTGTGCTGGCTGTGCTTTTGCTGGAAGCCTGCCGGGCACATCCGATCCCTGACTCCAGCCCCCTCCTACAATTTGGAGGTCAAGTTCGACAGCGGTACCTCTACACCGACGATGCCCAGGAGACAGAGGCCCACCTAGAGATCAGGGCCGATGGCACAGTGGTGGGGGCTGCCCGCCAGAGCCCTGAAAGTCTCCTGGAGCTGAAAGCCCTAAAGCCAGGGGTCATTCAAATCTTGGGAGTCAAAACATCCAGGTTCCTGTGCCAGGGCCCAGATGGGACACTATATGGCTCGCTCCATTTCGACCCTGTGGCCTGCAGTTTCCGAGAACTGCTTCTTGAGGATGGGTACAACATCTACCACTCCGAGACCCTTGGTCTCCCGCTTCGCCTGCGCCCCCACAACTCCGCATACCGGGACTTGGCACCCCGCGGGCCTGCCCGCTTCCTGCCACTGCCAGGCCTGCTTCCAGCACCCCCAGAGCCTCCAGGGATCCTGGCCCCGGAGCCTCCTGACGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGGCCTTCACAGGGCCGGAGTCCCAGCTATGCTTCCTGATAG

44.GDF15(hNAG)

45.IL4

46.ZAG

47.HAS2

48.Txn1

49.Cat

50.Plau

51.Ucp2

52.Atg5

53.NUDT1

54.Mt1

55.Adra1a(mut)

56.Pck1

57.Serpine1

58.GH

59.IFG1

60.TGFb1

61.PDE4b

62.mTOR

63.nf-kb

64.PCSK9

65.bCATm

66.ADcy5

67.Coq7

68.Eps8

69.Insr

70.Pappa

71.Shc1

72.Agtr1a

73.Slc13a1

74.Dgat1

75.Ikbkb

76.Kcna3

77.Myc

78.Surf1

79.Ubd

80.Rps6kb1

81.Ctf1

82.Htt

83.Irs1

84.Irs2

85.Mif

86.Trpv1

87.Prkar2b

88.Gsta4

89.Akt1

90.Gpx4

91.Bax

92.Cebpα

93.Cebpβ

94.(SEQ ID NO:17)heF1a启动子

TTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGTGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGT

95.(SEQ ID NO:18)sheF1a启动子

AGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACA

96.(SEQ ID NO:19)rheF1a启动子

GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC

97.AAT启动子

98.甲状腺激素结合球蛋白启动子

99.白蛋白启动子

100.甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子

101.肝脏控制区(HCR)-ApoCII混合启动子

102.HCR-hAAT混合启动子

103.与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子

104.(SEQ ID NO:20)P2A

GGATCTGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGCCCA

105.(SEQ ID NO:21)T2A

GAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCC

106.E2A

107.(SEQ ID NO:22)105IRES

GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCCACC

108.AAV1 ITR

109.(SEQ ID NO:23)AAV2 ITR 5’ITR

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

110.(SEQ ID NO:24)AAV2 ITR 3’ITR

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

111.AAV5 ITR

112.AAV6 ITR

113.AAV7 ITR

114.AAV8 ITR

115.AAV9 ITR

116.(SEQ ID NO:25)AAV-8衣壳

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTGCAGGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGTTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAACAGCCCGCCAGAAAAAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGACCTAATACAATGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACATCGGGAGGAGCCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAGCTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTCACCAGCACCATCCAGGTGTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTGCCGTACGTTCTCGGCTCTGCCCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCCCAGTACGGCTACCTAACACTCAACAACGGTAGTCAGGCCGTGGGACGCTCCTCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACCATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCAACACACAAAGACGACGAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTG

117.AAV-9衣壳

118.(SEQ ID NO:26)AAV-PHP.b衣壳

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGTACCGGCAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAACTTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAGGCGCAGACCGGTTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTG

119.(SEQ ID NO:27)WPRE

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG

120.(SEQ ID NO:28)WPRE3

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTT

121.(SEQ ID NO:29)SV40pA

GCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGC

122.(SEQ ID NO:30)bGHpA

ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGA

123.(SEQ ID NO:31)rBGpA

TGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATC

124.(SEQ ID NO:32)hGHpA

ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTT

附录B

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Claims (13)

1. 一种组合物在制备用于治疗对象的心力衰竭的药物中的用途，其中所述组合物包含：

包含第一核酸序列和第二核酸序列的第一病毒载体，所述第一核酸序列编码sTGFβR2蛋白，所述第二核酸序列编码FGF21蛋白，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过多顺反子元件操作性连接；或

包含第一核酸序列和第二核酸序列的第一病毒载体，所述第一核酸序列编码sTGFβR2蛋白，所述第二核酸序列编码FGF21蛋白，

其中所述第一和/或第二核酸与调控序列操作性连接，用于表达sTGFβR2和FGF21蛋白。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述调控序列包括启动子，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述调控序列包括选自以下的启动子：heFla启动子、CMV、shEf1a、AAT启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白（TBG）启动子、肝控制区（HCR）-ApoCII混合启动子、CASI、HCR-hAAT混合启动子和与小鼠白蛋白基因增强子（Ealb）元件和载脂蛋白E启动子组合的AAT启动子。

4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述第一核酸序列与3'非翻译区操作性连接，用于RNA在哺乳动物细胞中的表达和稳定性。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述3'非翻译区包含选自以下的聚腺苷酸化信号：WPRE，WPRE3，SV40后聚腺苷酸化信号，HBG聚腺苷酸化信号，兔β珠蛋白聚A，牛bgpA、ETC聚腺苷酸化信号和它们的混合体。

6.如权利要求1或2所述的用途，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述AAV载体衍生自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2.5、和AAVrh10.32病毒载体的AAV血清型。

8.如权利要求1或2所述的用途，其中所述第一核酸序列编码选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪sTGFβR2蛋白的sTGFβR2蛋白。

9.如权利要求1或2所述的用途，其中所述sTGFβR2蛋白与SEQ ID NO：7、8或9所示的氨基酸序列中的任一个具有至少90％的序列相同性。

10.如权利要求1或2所述的用途，其中所述sTGFβR2蛋白或所述FGF21蛋白是包含Ig Fc结构域的融合蛋白，其中所述Ig Fc结构域选自人、犬、猫、牛、绵羊、山羊、马、鼠和猪Ig Fc或其亚型，包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述Ig Fc结构域与SEQ ID NO：11或13所示的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性。

12.如权利要求1或2所述的用途，其中所述调控序列包含肝组织特异性启动子，用于在肝细胞中表达sTGFβR2或FGF21。

13.如权利要求1所述的用途，其中所述多顺反子元件是IRES或2A序列，用于由多顺反子转录物表达sTGFβR2和FGF21。