JP2023526049A - Ｇｍ１ガングリオシド－シスおよび他の障害を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、遺伝子疾患、例えばリソソーム蓄積症を処置するための遺伝子治療ベクターおよびそれを使用する方法を提供する。例えば、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを処置するための遺伝子治療ベクターおよび方法を提供する。本開示はまた、提供される遺伝子治療ベクターを作製するための方法も提供する。実施形態では、本開示は、以下の５’から３’の順に：プロモーター配列；ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；およびポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む発現カセットを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）由来ベクターを提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その全内容がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年５月１３日に出願された米国特許仮出願第６３／０２４，２９８号の優先権の利益を主張する。

配列表
本出願に関連する配列表は、紙コピーではなくてテキストフォーマットで提供され、本明細書にこれにより参照により組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＬＹＳＯ－００４＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、１３ＫＢであり、２０２１年５月１３日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子提出されている。

背景
ＧＭ１ガングリオシドーシスは、小児に罹患する重度の衰弱性の生命を脅かすリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。ＧＭ１ガングリオシドーシスは、リソソーム酸性ベータガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）酵素をコードするＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされる。その結果としての酵素欠乏は、ニューロンにおけるＧＭ１ガングリオシドの蓄積および進行性の神経変性をもたらす。ＧＭ１ガングリオシドーシスに罹患した小児は、重度の最終的に致死性の運動および発達障害を有する。Ｉ型（乳児型）ＧＭ１ガングリオシドーシスは乳児に起こり、発症は生後６カ月より前で、余命は約３年である。ＩＩａ型（後期乳児型）ＧＭ１ガングリオシドーシスでは、発症は乳児期から２歳までの間に起こり、余命は１０年未満である。ＩＩｂ型（若年型）ＧＭ１ガングリオシドーシスでは、発症は小児期の間に起こり、余命は３０年未満である。ＩＩＩ型（成人型）ＧＭ１ガングリオシドーシスは、成人期初期に起こり、生存は多様である。

現在、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者が利用可能な処置はない。この致死性疾患に提供することができるのは単なる支持的処置に過ぎない。支持的処置は、成長を維持するための適切な栄養、言語療法、発作のコントロール、吸引のリスクの日常的管理、および在宅支援介護のホスピスサービスを含む。通常の免疫を介しての合併症の防止、および心臓弁に障害のある患者では細菌性心内膜炎の予防、ならびに骨格筋に障害がある場合および気道が不全である場合には麻酔の予防措置に対しても重要な注意を払わなければならない（Regier and Tifft 2013）。

このように、ＧＭ１ガングリオシドーシスなど、ＬＳＤの有効な治療が緊急に必要である。本開示は、この必要性および他の必要性に取り組む。

開示の簡単な概要
本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスなどのリソソーム蓄積障害を処置するための遺伝子治療ベクターおよびその使用方法を提供する。実施形態では、本開示は、ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードする遺伝子治療ベクターまたは遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することによって、ＧＭ１ガングリオシドーシスなどのリソソーム蓄積障害を処置する方法であって、ベクターまたは組成物が対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与される方法を提供する。実施形態では、本開示は、ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードする遺伝子治療ベクターまたは遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することによって、ＧＭ１ガングリオシドーシスなどのリソソーム蓄積障害を処置する方法であって、ベクターまたは組成物が大槽内（ＩＣＭ）注射を介して対象に投与される方法を提供する。

実施形態では、本開示は、以下の５’から３’の順に：プロモーター配列；ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；およびポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む発現カセットを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）由来ベクターを提供する。実施形態では、プロモーター配列は、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列に由来する。実施形態では、ポリＡ配列はヒト成長ホルモン１配列に由来する。

実施形態では、本開示は、発現カセットを含む複製欠損ＡＡＶｒｈ．１０由来ベクターであって、発現カセットが、以下の５’から３’の順に：ＣＡＧプロモーター配列に由来するプロモーター配列；ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；およびヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来するポリＡ配列からなる、ベクターを提供する。

実施形態では、本明細書に提供される発現カセットは、２つのＡＡＶ２末端逆位反復（internal terminal repeat）（ＩＴＲ）配列に挟まれており、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列のうちの１つは、発現カセットの５’に位置し、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列のうちの１つは発現カセットの３’に位置する。実施形態では、発現カセットの５’末端に位置するＩＴＲ配列は、配列番号４に従うヌクレオチド配列を含み、発現カセットの３’末端に位置するＩＴＲ配列は、配列番号５に従うヌクレオチド配列を含む。

実施形態では、本明細書に提供されるベクターは、ヒトβ－ｇａｌをコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１に従う配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＧプロモーター配列は、配列番号２に従う配列を含む。実施形態では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、配列番号３に従う配列を含む。

実施形態では、本開示は、発現カセットを含む複製欠損ＡＡＶｒｈ．１０由来ベクターであって、発現カセットが、以下の５’から３’の順に：ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；ＣＡＧプロモーター配列に由来するプロモーター配列；ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来するポリＡ配列；およびＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む、ベクターを提供する。実施形態では、ベクターは、配列番号６に従う配列を含む。

実施形態では、本開示は、本明細書に提供されるベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。実施形態では、本明細書に提供される組成物は、約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ～約５．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬの濃度のベクターを含む。実施形態では、組成物中のベクターの濃度は、約１．８Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬである。

実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスなどのリソソーム蓄積障害を処置する方法を提供する。実施形態では、方法は、本明細書に提供されるベクターまたは本明細書に提供される組成物を、それを投与することを必要とする対象に投与することを含む。実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを処置するための医薬として使用するための本明細書に提供されるベクターを提供する。実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを処置するための医薬として使用するための本明細書に提供される組成物を提供する。実施形態では、本明細書に提供される方法および使用は、本明細書に提供されるベクターまたは組成物を、それを投与することを必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することを含む。実施形態では、本明細書に提供される方法および使用は、本明細書に提供されるベクターまたは組成物を、それを投与することを必要とする対象に大槽内（ＩＣＭ）注射を介して投与することを含む。実施形態では、ベクターおよび組成物は、ＣＳＦへの投与のために製剤化される。実施形態では、ベクターおよび組成物は、ＩＣＭ注射を介しての投与のために製剤化される。実施形態では、本明細書に提供されるベクターおよび組成物は、対象のＣＳＦに投与するためのものである。実施形態では、本明細書に提供されるベクターおよび組成物は、ＩＣＭ注射を介して投与するためのものである。実施形態では、本明細書に提供されるベクターおよび組成物は、約０．１ｍＬ／ｋｇ体重～約１．０ｍＬ／ｋｇ体重の体積で対象に投与される。実施形態では、本明細書に提供されるベクターおよび組成物は、約０．８ｍＬ／ｋｇ体重の体積で対象に投与される。実施形態では、本明細書に提供されるベクターおよび組成物は、約０．４ｍＬ／ｋｇ体重の体積で対象に投与される。実施形態では、本明細書に提供されるベクターおよび組成物は、約１ｍＬ～約１５ｍＬの体積、例えば約２ｍＬ～約１２ｍＬの体積、例えば約２ｍＬ～６ｍＬの体積で対象に投与される。実施形態では、ベクターまたは組成物の投与前に、ある体積の脳脊髄液（ＣＳＦ）が除去される。例えば、実施形態では、ベクターまたは組成物の投与前に除去されるＣＳＦの体積は、投与されるベクターまたは組成物の体積の約半分に対応する。他の実施形態では、ベクターまたは組成物の投与前に除去されるＣＳＦの体積は、投与されるベクターまたは組成物の体積に対応する。

実施形態では、本明細書に提供される方法および使用は、約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重～約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ体重の間の用量のベクターを、それを投与することを必要とする対象に投与することを含む。実施形態では、ベクターの用量は、約７．２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重である。実施形態では、ベクターの用量は、対象におけるＣＳＦの予想されるまたはおおよその体積に基づいて計算される。例えば、実施形態では、投与されるベクターの用量は、約５．０Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦ～約５．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦである。実施形態では、約１．８Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦのベクターの用量。実施形態では、ベクターの全量は、約１．０Ｅ＋１３ｖｇ～約５．０Ｅ＋１４ｖｇ、または約４Ｅ＋１３ｖｇ～約１．２Ｅ＋１４ｖｇである。

実施形態では、本明細書に提供される方法および使用は、免疫抑制レジメンを対象に投与することをさらに含む。実施形態では、免疫抑制レジメンは、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、および／またはプレドニゾンを含む。

実施形態では、本開示は、本明細書に提供されるＬＹＳ－ＧＭ１０１ベクターおよびそれを使用するための指示を含むキットを提供する。

図１Ａは、アデノ随伴ウイルスベクター構築物であるＬＹＳ－ＧＭ１０１の概略図である。ＬＹＳ－ＧＭ１０１は、ヒトベータ－ガラクトシダーゼを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０－ＣＡＧ－βｇａｌ）である。図１Ｂおよび図１Ｃは、完全なベクター配列（配列番号６）を提供する。 同上。 同上。

図２Ａ～２Ｆは、ＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌの注射の１カ月後の脳、小脳、および脊髄におけるβ－ｇａｌ酵素活性およびＧＭ１ガングリオシドレベルを示す。ＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌを視床（２×２．２２μｌ）または大脳側脳室（１４．８μｌ）に両側に注射した。１群ごとのマウス（ｎ＝４～６）を注射の１カ月後に安楽死させ、脳（２Ａおよび２Ｄ）、小脳（２Ｂおよび２Ｅ）および脊髄（２Ｃおよび２Ｆ）におけるβ－ｇａｌ活性（２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）およびＧＭ１ガングリオシドの蓄積（２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ）を測定した。ＰＢＳと比較して^＊ｐ＜０．０５（ＴｈａｌとＩＣＶを組み合わせてＰＢＳを注射したＧＭ１ガングリオシドーシスの動物）。青色の線は注射されていないＷＴマウスから評価した正常レベルに対応する。

図３は、１カ月の時点でのβ－ｇａｌ酵素の空間分布を示す。酵素の分布は、脳の矢状切片における低ｐＨでのＸ－ｇａｌによる組織化学染色（青色染色）によって評価した。Ｔｈａｌ：視床注射；ＩＣＶ：脳室内注射。ＮＡ：該当なし。

図４は、ネコの研究においてＧＭ１ガングリオシドーシスを評価するための脳および脊髄の領域を示す。剖検において、脳を前頭極から尾部小脳まで６ｍｍのブロックに切断し、合計９ブロックとした（Ａ～Ｉ）。各ブロックから、右半球を酵素アッセイ用にＯＣＴ培地中で凍結させ、左半球を半分にさらに切断して１０％のホルマリン中で保存するか（吻側半分）または液体窒素中で凍結させて－８０℃で保存した（尾側半分）。脊髄を全摘出し、７つの領域をアッセイした（Ｊ～Ｐ）。脊髄をＯＣＴまたは１０％のホルマリン中で保存するか、または－８０℃で保存するために液体窒素中で凍結させた。

図５は、１カ月の時点でのＧＭ１ガングリオシドーシスのネコのＣＮＳにおけるβ－ｇａｌ酵素活性を示す。β－ｇａｌ活性を図８で説明したＣＮＳブロックにおいて分析し（脳Ａ～Ｉ；脊髄Ｊ～Ｐ）、処置動物からの各ＣＮＳブロックにおけるβ－ｇａｌ酵素活性を正常動物（ｎ＝３）からの対応するブロックのレベルに対して正規化したことを意味する、「正常活性の倍数」として表した。両側ｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。記号は以下の群と比較したｐ＜０．０５を示す：未処置ＧＭ１ガングリオシドーシスのネコ（＋）；腰椎槽（∧）。

図６は、１カ月の時点でのＧＭ１ガングリオシドーシスのネコのＣＮＳにおける蓄積物質のフィリピン染色を示す。フィリピン染色は、未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコの灰白質に点状の白色または灰色の点として現れ、ＷＴネコの灰白質ではほとんど染色されない。フィリピン染色は、すべてのＡＡＶ処置したネコの大脳（図８に位置するブロックＤ）において明らかであり、大槽内（ＩＣＭ）注射によって処置したネコでは染色は中程度に減少した。小脳の灰白質および脳幹（図８に位置するブロックＨ）は、ＣＭ注射後に蓄積物質の顕著なクリアランスを示したが、ＩＣＶまたはＩＴＬの両側注入後にはクリアランスはほとんどなかった。フィリピン染色は、すべての処置したネコの脊髄の腰椎膨大（図８に位置するブロックＰ）において低減した。

図７は、個々の未処置のおよび処置したＧＭ１ガングリオシドーシスのネコの疾患進行を示す。データ点は平均スコアに対する傾向線を伴っている。ＷＴネコの平均スコアも示されている。

図８は、ネコの研究における神経変性のバイオマーカーを示す。未処置のまたは処置したＧＭ１ガングリオシドーシスのネコの人道的エンドポイント（それぞれ、８カ月または１１カ月）において収集したＣＳＦ試料のＡＳＴレベルおよびＬＤＨレベル。^＊ｐ＜０．０５ ｖ．正常な、年齢を適合させたネコ（ｎ＝５）；＋ｐ＜０．０５ ｖ．未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコ（ｎ＝５）。

図９は、ネコの研究におけるＣＮＳにおけるβ－ｇａｌの生体分布を示す。図８で説明したように収集した脳および脊髄の試料（脳Ａ～Ｉ；脊髄Ｊ～Ｐ）を、β－ｇａｌによって切断した際に青色の沈殿を形成するＸｇａｌで染色した。比較のために左のパネルで示されているのは、未処置の正常対照およびＧＭ１対照である（脳切片Ｅおよび脊髄切片Ｌ）。未処置のＧＭ１ネコの白質は、一貫してバックグラウンド染色を示す。

図１０は、ネコの研究においてＣＮＳにおけるβ－ｇａｌ活性レベルを示す。β－ｇａｌ活性を図８で説明したＣＮＳブロックにおいて分析し（脳Ａ～Ｉ；脊髄Ｊ～Ｐ）、処置動物からの各ＣＮＳブロックにおけるβ－ｇａｌ酵素活性を正常動物（ｎ＝５）からの対応するブロックのレベルに対して正規化したことを意味する、「正常活性の倍数」として表した。破線の横線は正常活性を表す。両側ｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。^＊は、正常と比較したｐ＜０．０５を示す。

図１１は、１２週間の時点でのＮＨＰの脳におけるβ－ｇａｌ活性の分布の例である。群１のある動物（Ｍ１９１８８８ 左パネル）および群３のある動物（Ｆ１９１９０７ 右パネル）からの１０×１０ｍｍ切片に分割した均等な脳スラブの例。タンパク質１ｍｇ当たり４－ＭＵ／時間のｎｍｏｌで表した、各１０×１０ｍｍ切片のβ－ｇａｌ酵素活性値を、淡橙色（最も低いβ－ｇａｌ酵素活性）から濃橙色（最も高いβ－ｇａｌ酵素活性）までの範囲のカラーコードと組み合わせて提示する。

図１２は、１２週間の時点でのＮＨＰのＣＮＳにおけるβ－ｇａｌ活性の平均値を示す。タンパク質１ｍｇ当たり４－ＭＵ／時間のｎｍｏｌで表したＮＨＰの脳および脊髄におけるβ－ｇａｌ酵素活性の平均値。両側ｔ検定を使用して統計的有意性を決定した。^＊は、群１と比較したｐ＜０．００１を示す。

詳細な説明
実施形態では、本開示は、遺伝子疾患（コードされる遺伝子産物の低減された発現もしくは発現の欠如、遺伝子産物の変更された形態の発現、または遺伝子産物の発現を制御する調節エレメントの破壊をもたらす遺伝子の欠失または変異に起因する疾患を含む）、神経疾患および障害、ならびに脳の疾患および障害を含む多様な疾患および障害の処置に有用である新規組成物および方法を提供する。実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスなどのリソソーム蓄積障害に対する遺伝子治療に関する。実施形態では、ＧＭ１ガングリオシドーシスなどのリソソーム蓄積障害に対する遺伝子治療は、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与される。実施形態では、ＧＭ１ガングリオシドーシスなどのリソソーム蓄積障害に対する遺伝子治療は、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して対象に投与される。実施形態では、遺伝子治療は、ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードする遺伝子治療ベクターまたは遺伝子治療ベクターを含む組成物を含む。

ＧＭ１ガングリオシドーシスは、リソソーム酸性β－ガラクトシダーゼ酵素（β－ｇａｌ）をコードするＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患である。β－ｇａｌは、ガラクトース含有オリゴ糖、ケラタン硫酸、および他のβ－ガラクトース含有複合糖質の末端ガラクトース残基を加水分解する。ＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされた細胞におけるその低減されたまたは無効な活性は、多くの組織、特に脳における基質（ＧＭ１ガングリオシドおよびそのアシアロ誘導体ＧＡ１）の毒性レベルの蓄積をもたらし、進行性の神経変性、認知および運動障害、発作、および早期死亡をもたらす。現在、承認されたおよび／または有効な処置はない。疾患は、小児では常に致死的である。主な脳および脊髄病態に加えて、複数の他の臓器が影響を受ける。さらなる病態は、視覚障害、骨／骨格機能障害、および肝脾腫大を含む。

ＧＭ１ガングリオシドーシスの分類は以下の通りである。Ｉ型（乳児型）は、生後６カ月未満での発症および約３歳での死亡によって特徴付けられ；発生率は、約２５０，０００人に１人～３００，０００人に１人である。ＩＩａ型（後期乳児型）は、生後１２～２４カ月での発症および１０歳までの死亡によって特徴付けられ；発生率は約５００，０００人に１人である。ＩＩｂ型（若年型）は、４～６歳での発症、および３０年の生存期間によって特徴付けられ；発生率は約５００，０００人に１人である。ＩＩＩ型（成人型）は、成人期初期での発症、および多様な生存期間によって特徴付けられ；発生率は不明である。疾患の重症度は一般的に、発症年齢と共に減少する。

若年型ＧＭ１ガングリオシドーシスの症例報告において、神経合併症を処置するための骨髄移植は成功しなかった（Shield, Stone, and Steward 2005）。ケトン体ダイエットと組み合わせたミグルスタットが、現在臨床試験中である。初期乳児型ＧＭ１ガングリオシドーシスでの予備的な結果は、余命に対して正の影響を示唆するが、運動または認知機能に対して影響を及ぼさない（Jarnes Utz et al. 2017）。イミノ糖を使用する基質の低減は、ガングリオシド生合成の阻害に成功し、齧歯類ＣＮＳにおいて蓄積を低減させた（Kasperzyk et al. 2005）が、このアプローチが患者において治療利益を有するかどうかは不明である。酵素を安定化させる化学的シャペロン（Ｎ－オクチル－４－エピ－β－バリエナミン、ＮＯＥＶ）は、マウスにおいてβ－ｇａｌ活性の増加をもたらし、神経学的悪化を防止することが示された（Matsuda et al. 2003）。しかし、この治療は、β－ｇａｌ活性が残存している対象に依存する。成人発症型ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者における深部脳刺激は、ジストニアの機能的改善を示したが、疾患進行に変化を示さなかった。最後に、ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスまたはネコにおけるＧＬＢ１遺伝子のＡＡＶに基づく送達は、疾患表現型の持続的修正をもたらすことが示された（McCurdy et al. 2014）；（Weismann et al. 2015）；（Hayward et al. 2015）；（Regier et al. 2016）。しかし、ＡＡＶ遺伝子治療によってリソソーム蓄積症を処置する場合の主要な難題は、すべての罹患した組織、特に脳および脊髄全体を通して欠乏酵素の広範な治療レベルを達成することである。

ＧＭ１ガングリオシドーシスマウスにおける頭蓋内注射（視床および深部小脳核［ＤＣＮ］への、または脳室内［ＩＣＶ］注射）、およびＧＭ１ガングリオシドーシスネコモデルにおける槽内注入（ＩＣＶ、ＩＣＭ、または髄腔内腰部（intrathecal lumbar）［ＩＴＬ］）を含む異なるＣＮＳ送達経路を、本明細書に提供される研究において調べた。本明細書に提供される遺伝子治療ベクターを、意図されるヒト臨床用量と類似の用量で非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の大槽に注射すると、投与の１２週間後に、非注射対照と比較して脳および脊髄全体を通してβ－ｇａｌ活性の有意な上昇をもたらした。したがって、本開示は、例えば槽内注射（ＩＣＭ）を介した脳脊髄液内（ＣＳＦ）送達が、例えば本明細書に提供されるＧＭ１０１治療を介するＧＭ１ガングリオシドーシスの処置のための最適な投与経路であることを実証する。

例えば、実施形態では、本開示は、目的の治療遺伝子ＧＬＢ１を運ぶように操作された複製欠損組換えアデノ随伴ウイルスｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）ベクターであるＧＭ１０１（本明細書において「ＬＹＳ－ＧＭ１０１」とも呼ばれる）を提供する。ベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＧＬＢ１ ｃＤＮＡ、およびヒト成長ホルモンポリＡ配列を含み、ＡＡＶ２末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれており、ＡＡＶｒｈ．１０タンパク質シェル（カプシド）内にパッケージングされる発現カセットからなる。ＬＹＳ－ＧＭ１０１遺伝子治療の治療目標は、脳および脊髄を含む中枢神経系（ＣＮＳ）におけるβ－ｇａｌの長期発現を回復し、それによって蓄積されたＧＭ１ガングリオシドおよびアシアロＧＭ１（ＧＡ１）を除去し、ＧＭ１ガングリオシドのｄｅ ｎｏｖｏ蓄積を防止することである。

したがって、実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者におけるすべての罹患組織を通して欠乏酵素の広範な治療レベルを達成する方法を提供する。実施形態では、方法は、ＡＡＶベクターによるＧＬＢ１遺伝子治療の、それを必要とする対象へのＣＳＦ内送達を伴う。

理論に拘束されることを望まないが、大槽内に注射すると、ＡＡＶベクター粒子は局所で拡散し、細胞表面受容体に結合し、軸索または間質液に沿って離れた解剖学的ＣＮＳ構造に輸送もされ得る。ベクター粒子は、ニューロンまたはグリア細胞によって内部移行する。これらの細胞タイプの各々は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者ではβ－ｇａｌ酵素が欠乏しており、ガングリオシド基質の毒性の蓄積に苦しむ。細胞に入ると、β－ｇａｌタンパク質をコードする組換えゲノムは、核に輸送され、そこで一連の分子変換を受けて二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子として安定に確立される。このＤＮＡは、細胞機構によってメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写される。ｍＲＮＡは、タンパク質β－ｇａｌに翻訳され、これは細胞酵素欠乏を回復する。

酵素補充およびリソソーム蓄積の補正は、３つの異なる機構によって起こる。１）酵素は、ＡＡＶによって運ばれるトランスジーンを含有および発現する細胞のリソソームに到達し、蓄積された異化産物を分解し得る。２）遺伝子改変細胞内で作製された酵素は、これらの細胞から放出され、隣接する細胞に再度捕捉され、そのリソソームに再度向けられ得る。この現象は、「クロスコレクション」として公知である（Tomanin et al., 2012）。実施形態では、ＡＡＶによる細胞の形質導入および酵素発現後、リソソーム酵素は、分泌され、マンノース－６－リン酸受容体媒介取り込みを介して近傍の細胞をクロスコレクトすることができる。３）ＡＡＶベクターまたは分泌可能な酵素の順行性および逆行性輸送は、注射部位から離れた部位への治療酵素の輸送をもたらすことができる（Chen et al., 2006）。

当業者によって認識されるように、ある特定の組成物および方法が本明細書において具体的に例示されているが、本開示は、それらに限定されず、本明細書に具体的に記載されるものを含むがこれらに限定されない追加の実施形態および使用を含む。加えて、以下の説明では、ある特定の具体的な詳細が、本開示の様々な実施形態の十分な理解を提供するために記載されている。しかし、当業者は、これらの詳細がなくとも本開示が実践され得ることを理解する。

定義
それ以外であることを定義していない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本開示の目的に関して、以下の用語を以下に定義する。

「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、具体的に記載していない限り、１つまたは複数を示す。

「約」とは、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％ほど異なる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。「約」という用語に関連して使用される数値の文脈で考察される任意の実施形態において、「約」という用語を省略することができることが具体的に企図される。

「活性バリアント」という用語は、「生物活性断片」および「生物活性バリアント」の両方を示し、包含する。代表的な生物活性断片および生物活性バリアントは、一般的に相互作用、例えば分子内または分子間相互作用に関与している。分子間相互作用は、特異的結合相互作用または酵素的相互作用であり得る。酵素的相互作用または活性の例としては、脱ヒドロキシル化および本明細書に記載される他の酵素活性が挙げられるがこれらに限定されない。

「生物活性断片」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片に適用される場合、参照配列の少なくとも１つの活性（例えば、酵素活性）の少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％またはそれより高い活性を有する断片を指す。「参照配列」という用語は、一般的に、それに対して別の配列が比較される核酸コード配列またはアミノ酸配列を指す。配列表に提供されるすべての配列もまた、参照配列として含まれる。長さが、その間のすべての整数を含む少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、５００、６００、またはそれより多くの連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の生物活性断片もまた、本開示の範囲に含まれる。

「生物活性バリアント」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のバリアントに適用される場合、参照配列の活性（例えば、酵素活性）の少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％、またはそれより高い活性を有するバリアントを指す。参照配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性、その間のすべての整数を含む同一性を有する生物活性バリアントが本開示の範囲内に含まれる。

「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに関与する任意のポリヌクレオチド配列を意味する。これに対し、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに関与しない任意のポリヌクレオチド配列を指す。

文脈がそれ以外であることを必要としている場合を除き、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（comprise）」という用語、ならびにその変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むがこれらに限定されない」という制限のない包括的な意味で解釈されるべきである。

「からなる」とは、「からなる」という語句の後に続くいかなるものも含み、これらに限定されることを意味する。このため、「からなる」という語句は、記載されるエレメントが必要または必須であり、他のエレメントは存在しなくてもよいことを示す。

「から本質的になる」とは、語句の後に記載される任意のエレメントを含み、記載されるエレメントに関して本開示に指定されている活性または作用を妨害せず、関与もしない他のエレメントに限定されることを意味する。このように、「から本質的になる」という語句は、記載されるエレメントが必要または必須であるが、他のエレメントが必須ではなく、それらが記載されるエレメントの活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。

本明細書全体を通して「一（ｏｎｅ）実施形態」または「ある（ａｎ）実施形態」という言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特色、構造、または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書全体を通して様々な場所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すのではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴を、１つまたは複数の実施形態において任意の適した様式で組み合わせてもよい。

本明細書で使用される場合、「機能」および「機能的」等の用語は、生物機能、酵素機能、または治療機能を指す。

「遺伝子」とは、染色体上の特定の遺伝子座を占有し、転写および／もしくは翻訳調節配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる遺伝の単位を意味する。

遺伝子に関連する「変異」または「欠失」という記述は、一般的に、コードされる遺伝子産物の発現の減少もしくは発現なしをもたらす、または遺伝子産物を非機能的にするもしくは野生型遺伝子産物と比較して低減された機能を有するようにする、遺伝子の変化または変更を指す。そのような変化の例としては、転写もしくは翻訳レベルであるかによらず、その遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を破壊する、除去する、下方調節する、もしくは有意に低減する、および／または比較的不活性（例えば、変異したまたは切断された）もしくは不安定なポリペプチドを産生する、標的遺伝子全体または一部のコード配列または調節配列に対する、ヌクレオチド置換、欠失、または付加が挙げられる。ある特定の態様では、標的化遺伝子は、改変されたポリペプチドが発現されるが、１つまたは複数の酵素活性に関して低減された機能または活性を有するように、そのポリペプチドの活性部位、その細胞局在、その安定性、または当業者に明白である他の機能的特色を改変することによって、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更するヌクレオチドレベルでの変化または変異によって「非機能的」にされ得る。

「増加した」または「増強された」量は、典型的には「統計学的に有意な」量であり、本明細書に記載される量またはレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０倍、またはそれより多くの倍数（例えば、１００、５００、１０００倍）（その間のおよび１を超えるすべての整数および小数点、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４等を含む）である増加を含み得る。

「減少した」または「低減された」または「より少ない」量は、典型的には「統計学的に有意な」量であり、本明細書に記載される量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０倍、またはそれより多くの倍数（例えば、１００、５００、１０００倍）（その間のおよび１を超えるすべての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である減少を含み得る。

「から得られた」とは、試料、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、特定の起源、例えば所望の生物または所望の生物内の特定の組織から単離されたまたはそれに由来することを意味する。

「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子をプロモーターの調節的制御下に置き、それによって遺伝子の転写および必要に応じて翻訳を制御することを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子の組合せを構築する場合、一般的に遺伝子配列またはプロモーターを、その遺伝子配列またはプロモーターと、それが天然の状況で制御する遺伝子、すなわち遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子との間の距離とおおよそ同じである遺伝子転写開始部位からの距離で配置することが好ましい。当技術分野で公知であるように、機能を喪失することなく、この距離のいくらかの変動を適合させることができる。同様に、その制御下に置かれる異種遺伝子に関して調節配列エレメントの好ましい配置は、その天然の状況、すなわちそれが由来する遺伝子におけるエレメントの配置によって定義される。「構成的プロモーター」は、典型的に活性であり、すなわちほとんどの条件下で転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的にはある特定の条件、例えば所定の分子因子（例えば、ＩＰＴＧ）の存在下または所定の環境条件下に限って活性である。その条件が存在しない場合、誘導性プロモーターは、典型的に有意なまたは測定可能なレベルの転写活性を可能にしない。多数の標準的な誘導性プロモーターが当業者に公知である。

「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」は、米国食品医薬品局によってヒトまたは家畜動物での使用に関して許容可能であると承認されている任意の補助剤、担体、賦形剤、滑剤、甘味料、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、または乳化剤を含むがこれらに限定されない。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という記述は、本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡを示す。用語は典型的には、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド、またはそのいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型の、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を指す。用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖型の両方を含む。

「ポリヌクレオチドバリアント」という用語は、本明細書において以下に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、または置換によって参照ポリヌクレオチドとは区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」という用語は、１つまたは複数のヌクレオチドが付加、または欠失されている、または異なるヌクレオチドと交換されているポリヌクレオチドを含む。この点に関して、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更を、参照ポリヌクレオチドに行うことができ、それによって変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物機能または活性を保持する、または参照ポリヌクレオチドに関連して増加した活性を有する（すなわち、最適化される）ことは当技術分野において十分に理解される。ポリヌクレオチドバリアントは、例えば本明細書に記載される参照ポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％（および少なくとも５１％～少なくとも９９％、およびその間のすべての整数のパーセンテージ、例えば、９０％、９５％、または９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語はまた、これらの酵素をコードする天然に存在する対立遺伝子バリアントおよびオルトログも含む。

ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、「外因性」という用語は、野生型細胞または生物において天然に存在しないが、典型的に分子生物学技術によって細胞に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。外因性のポリヌクレオチドの例としては、所望のタンパク質をコードするベクター、プラスミド、および／または人工核酸構築物が挙げられる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、「内因性」または「天然の」という用語は、所定の野生型細胞または生物において見出され得る天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。

「導入された」ポリヌクレオチド配列は、細胞または生物に付加または導入されたポリヌクレオチド配列を指す。「導入された」ポリヌクレオチド配列は、細胞もしくは生物に対して外因性であるポリヌクレオチド配列であり得るか、または細胞もしくは生物に既に存在するポリヌクレオチド配列であり得る。例えばポリヌクレオチドを、例えばそれ以外は天然に存在するポリヌクレオチド配列の１つまたは複数の追加のコピーを作り出すため、およびそれによってコードされるポリペプチドの過剰発現を促進するために、そのようなポリヌクレオチド配列を既に含有する微生物に分子生物学技術によって「導入する」ことができる。

「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書においてアミノ酸残基のポリマー、ならびにそれらのバリアントおよび合成アナログを指すために互換的に使用される。このように、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば対応する天然に存在するアミノ酸の化学アナログであるアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに当てはまる。ある特定の態様では、ポリペプチドは、典型的に様々な化学反応を触媒する（すなわち、反応速度を増加させる）酵素ポリペプチドまたは「酵素」を含み得る。

「ポリペプチドバリアント」という記述は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって参照ポリペプチド配列とは区別されるポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、保存的または非保存的であり得る１つまたは複数の置換によって参照ポリペプチドとは区別される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、保存的置換を含み、この点において一部のアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、広く類似の特性を有する他のアミノ酸に変化させてもよいことは当技術分野で十分に理解されている。ポリペプチドバリアントはまた、１つまたは複数のアミノ酸が付加もしくは欠失されている、または異なるアミノ酸残基で置き換えられているポリペプチドも包含する。本明細書に記載される参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のいずれかと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する。

本明細書で使用される場合、「配列同一性」という記述、または例えば「５０％同一である配列」を含むことは、比較ウィンドウに対して配列が、ヌクレオチド毎またはアミノ酸毎に同一である程度を指す。このように、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに対して２つの最適に整列させた配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算すること、および結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。

２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係を説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含む、長さが少なくとも１２、しかししばしば１５～１８、多くの場合少なくとも２５単量体単位である。２つのポリヌクレオチドは各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似である配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含み得ることから、２つ（またはそれより多くの）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」に対して比較し、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列を同数の連続する位置の参照配列と比較する、少なくとも６つの連続する位置、通常約５０～約１００、より通常約１００～約１５０個の連続する位置の概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のコンピューターによる実行、または検査および選択した様々な方法のいずれかによって生成された最善のアライメント（すなわち、比較ウィンドウに対して最高のパーセンテージ相同性をもたらす）によって実行され得る。例えば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389に開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照してもよい。配列解析の詳細な考察は、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15のユニット１９．３に見出され得る。

「形質転換」は、宿主細胞ゲノムへの外来ＤＮＡの取り込みおよび組み込みに起因する、または宿主細胞内の染色体外で維持される永続的な細胞内の遺伝性の変更を指し；同様に、１つの生物から別の生物のゲノムへの外因性遺伝子の移入も指す。

本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」、「処置される」、または「処置すること」という用語は、特にその目的が、変異した遺伝子に起因する脳障害、例えばリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）などの発生および／または進行などの、望ましくない生理的変化または障害を防止するまたは遅らせる（弱める）ことである予防および／または治療を指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかによらず、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行を遅らせるまたは弱める、疾患の状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体）が挙げられるがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存および／またはクオリティオブライフと比較して、生存を延長させること、および／またはクオリティオブライフを増加させることも意味し得る。処置を必要とする対象は、状態もしくは障害（例えば、変異した遺伝子に起因する脳の障害、例えばＧＭ１ガングリオシドーシス）を既に有する対象、ならびに状態もしくは障害を有する傾向がある対象、または状態もしくは障害を防止すべき対象を含む。このように、「処置」はまた、家族の既往、遺伝的もしくは染色体異常により、および／または疾患の１つもしくは複数の生物学的マーカーの存在により、疾患に対して素因を有すると考えられる個体に、例えば疾患を阻害、防止、もしくはその発症を遅らせるために、または疾患の発生の可能性を低減するために、本開示の化合物を投与することも含む。特定の実施形態では、処置は以下のいずれかを含み得る：発育後退の減少、言語障害の減少、または言語発達の改善、運動スキル障害の減少、知的発達障害の減少、活動亢進（過剰な運動活動）の減少、睡眠の改善、注意、身体的および精神的能力障害（患者は完全な運動能力（歩行、言語、食事等）を失う）の減少、認知能力、重度の発作、障害、例えば気道閉鎖および心不全の減少。実施形態では、「処置」は、失われた酵素を細胞が産生できるようにすること、疾患を処置および／もしくは疾患の結末を逆転させること、例えばＧＬＢ１遺伝子の機能を対象に回復もしくは提供すること、または蓄積したＧＭ１ガングリオシドおよびアシアロＧＭ１（ＧＡ１）を切断することを含む。

「対象」は、哺乳動物、例えば疾患もしくは障害の処置を必要とする哺乳動物、例えば、疾患もしくは障害を有すると診断されている、または疾患もしくは障害を発症するリスクがあると決定されている哺乳動物を含むヒトを含む。特定の例では、対象は、遺伝疾患、脳障害、または神経疾患もしくは障害、例えばＧＭ１ガングリオシドーシスを含むリソソーム蓄積障害を有すると診断されている哺乳動物である。実施形態では、対象はヒトであり、成人であっても非成人であってもよい。実施形態では、対象は小児または乳児である。

「ベクター」とは、ポリヌクレオチド分子、例えばその中にポリヌクレオチドを挿入またはクローニングすることができる、例えばプラスミド、バクテリオファージ、酵母、またはウイルスに由来するＤＮＡ分子を意味する。ベクターは典型的には、１つまたは複数の独自の制限部位を含有し、定義された宿主細胞において自律複製を可能にすることができ、またはクローニングされた配列が再生可能であるように、定義された宿主のゲノムに統合されることが可能であり得る。したがって、ベクターは、自律複製するベクター、すなわちその複製が染色体の複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば線形または閉鎖環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有することができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。そのようなベクターは、宿主染色体の特定の所望の部位への組換えを可能にする特定の配列を含み得る。ベクター系は、宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡまたはトランスポゾンを共に含有する単一のベクターまたはプラスミド、２つまたはそれより多くのベクターまたはプラスミドを含み得る。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。「ベクター」はまた、その中にポリヌクレオチドを挿入またはクローニングすることができるウイルスおよびウイルス粒子も含む。それらは、「ウイルスベクター」と呼ばれ得る。「遺伝子治療ベクター」は、例えば、典型的に対象における遺伝的変異により、対象において発現が失われている、変異している、または脱調節されているポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列である治療的ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を、それを必要とする対象に送達するために使用されるウイルスベクターを含むベクターである。

目的のＤＮＡ配列をＤＮＡベクターに挿入するための一般的な手段は、制限部位と呼ばれる特定の部位でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を伴う。「カセット」、「遺伝子カセット」、または「発現カセット」は、１つまたは複数の発現産物をコードし、定義された制限部位でベクターに挿入することができる、これらの産物の発現のために必要なシス作用エレメントを含有するポリヌクレオチド配列を指す。

「野生型」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する起源から単離された場合にその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団において最も頻繁に観察されるものであり、このようにその遺伝子の任意にデザインされた「正常」または「野生型」形態である。

遺伝子治療ベクター
ある特定の実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの処置のための遺伝子治療ベクターを含む。そのような遺伝子治療ベクターを使用して、ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントの送達を必要とする対象内の細胞にヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントを送達してもよい。添付の実施例に記載されるように、本開示の遺伝子治療ベクターは、ＧＭ１ガングリオシドーシスの処置にとって有効かつ安全であることが研究により確立されている。実施形態では、添付の実施例に提供される研究は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者の処置において優れた効果を提供する投与経路、および／または用量および／または投与レジメンを確立する。

理論に拘束されることを望まないが、投与されると、本明細書に提供される遺伝子治療ベクター粒子、および産生される酵素は、局所で拡散し、ならびに軸索に沿って離れた解剖学的ＣＮＳ構造に輸送され、広範囲のＣＮＳ領域の修正を可能にすると理解される。細胞に流入すると、ＧＬＢ１（β－ｇａｌをコードする遺伝子）を含む遺伝子治療ベクターは、核へと輸送され、そこで一連の分子形質転換を受けて、二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子として安定に確立する。このＤＮＡは、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）へと転写され、次にＧＭ１ガングリオシドーシス患者において失われた酵素であるβ－ｇａｌへと翻訳される。形質導入された細胞は、酵素を連続的に発現および送達し、このように、欠如している内因性酵素を補完するために酵素産生の永続的なＣＮＳ起源を構成する。本明細書に記載される遺伝子治療ベクターは、ＬＹＳ－ＧＭ１０１であり、本明細書では、ＧＭ１０１またはＡＡＶｒｈ１０－ＧＭ１０１とも呼ばれる。ＬＹＳ－ＧＭ１０１は、ＧＬＢ１遺伝子を含有する欠陥ＡＡＶ２ゲノムからなる複製欠損アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）を含む。加えて、本開示は、脳および脊髄全体を通して優れた遺伝子発現を提供するＬＹＳ－ＧＭ１０１の改善された送達系を提供する。実施形態では、ＬＹＳ－ＧＭ１０１は、ＩＣＭ注射経路を介して投与される。本明細書に提供される組成物および方法と組み合わせたそのような注射経路は、酵素の広い脳分布およびＧＭ１ガングリオシドーシスの処置において増強された有効性をもたらす。

本開示の遺伝子治療ベクターは、以前に記載された利点と比較して、ＩＣＭ注射後のＣＮＳにおける高レベルのβ－ｇａｌ発現を含む予想外の利点を提供することが、本明細書に提供された研究を介して発見された。加えて、本開示の組成物および方法は、治療産物の改善された発現を介した増強された有効性、より広い発現分布、および最適な投与を介したより効率的な送達を提供する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科のメンバーであり、４．７キロベース（ｋｂ）～６ｋｂの一本鎖線形ＤＮＡゲノムを有する小さい非病原性の非エンベロープ正二十面体ウイルスである。ＡＡＶのライフサイクルは、感染後にＡＡＶゲノムが宿主染色体に部位特異的に組み込まれる潜伏相、およびアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのいずれかの感染後に、組み込まれたゲノムがその後レスキューされ、複製され、感染ウイルスにパッケージングされる感染相を含む。非病原性、非分裂細胞を含む広い宿主範囲の感染性、および潜在的な部位特異的染色体組み込みの特性により、ＡＡＶは、遺伝子移入のための魅力的なツールとなっている。この属のメンバーは、増殖性感染および複製を促進するために、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスを必要とする。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、宿主ゲノムへの部位特異的組み込み（まれ）によって、またはエピソーム形態で持続することによるかの何れかで細胞内で潜伏感染を確立する。

今日まで、その表面特性が多様である少なくとも１２個の異なるＡＡＶの血清型がヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離されており、特徴付けられている。「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶに対する識別である。血清学的識別は、他のＡＡＶ血清型と比較して、１つのＡＡＶ血清型に対する抗体間での相互反応性がないことに基づいて決定される。本開示の遺伝子治療ベクター、同様に名称をつけられたベクターは、ＡＡＶの公知の血清型（ｒｈ）のいずれか１つ、例えばｒｈ１、ｒｈ２、ｒｈ３、ｒｈ４、ｒｈ５、ｒｈ６、ｒｈ７、ｒｈ８、ｒｈ９、またはｒｈ１０のいずれか１つ、好ましくはｒｈ１０を有し得る。これらの様々なＡＡＶ血清型はまた、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ．１０）とも呼ばれ得る。

実施形態では、本開示のベクターは、人工ＡＡＶ血清型を有し得る。人工ＡＡＶ血清型としては、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない。そのような人工カプシドは、本開示の新規ＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、別のＡＡＶ血清型（既知または新規）、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス起源、または非ウイルス起源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して、任意の適した技術によって生成され得る。人工ＡＡＶ血清型は、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得るがこれらに限定されない。

ＡＡＶカプシドは、６０個のウイルスタンパク質（ＶＰ）サブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）から組み立てられる。コアＶＰモノマー（ＶＰ３）は、互いに組み合わせたループ領域によって接続される７個の逆平行β鎖からなるゼリーロール、ベータバレル構造を有する。これらの非常に可変のループの一部は、表面に露出し、ＡＡＶカプシドのトポロジーを定義し、次に、様々なＡＡＶ血清型に渡る組織指向性、抗原性、および受容体使用を決定する。

ＡＡＶ血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）は、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００３／０４２３９７号に記載されている。ＡＡＶｒｈ．１０ベクターは、新生児マウス中枢神経系においてニューロンおよびアストロサイトを形質導入することが示されている（Zhang, H., et al., Molecular Therapy 19, 1440-1448 (August 2011)）。加えて、ＡＡＶｒｈ．１０ベクターは、齧歯類の脳に注射すると優れた活性を有するが、ヒト集団ではＡＡＶ血清型ｒｈ．１０による自然の疾患はない。

ＡＡＶゲノムは、比較的単純であり、短い末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ＩＴＲは、中でもウイルス複製、レスキュー、パッケージング、および組み込みにとって必要なシス作用配列を含有する。ＩＴＲの組み込み機能により、ＡＡＶゲノムは感染後細胞の染色体に組み込むことが可能となる。

非構造タンパク質または複製（Ｒｅｐ）タンパク質およびカプシド（Ｃａｐ）タンパク質はそれぞれ、５’および３’オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。４つの関連するタンパク質がｒｅｐ遺伝子から発現される：Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写されるが、下流のプロモーターｐ１９は、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０の発現を方向付ける。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ＡＡＶ複製ならびにウイルス遺伝子発現の調節に直接関係している。ｃａｐ遺伝子は、第３のウイルスプロモーターｐ４０から転写される。カプシドは重複する配列の３つのタンパク質で構成され、最も小さいタンパク質（ＶＰ－３）が最も豊富である。末端逆位反復配列は、複製、パッケージング、および組み込みのために同側で必要な唯一のＡＡＶ配列であるため、ほとんどのＡＡＶベクターは、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするウイルス遺伝子がなく、外来遺伝子（複数可）、例えば末端反復配列の間に挿入された治療遺伝子（複数可）のみを含有する。

ＧＬＢ１遺伝子は、リソソーム酸性β－ｇａｌ酵素をコードする。β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）は、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関係する欠乏酵素である。β－ｇａｌは、ガラクトース含有オリゴ糖、ケラタン硫酸、および他のβ－ガラクトース含有複合糖質の末端ガラクトース残基を加水分解する酵素である。ＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされた細胞における活性が低減されているまたは活性がないことは、多くの組織、特に脳において基質（ＧＭ１ガングリオシドおよびそのアシアロ誘導体（ＧＡ１））の毒性レベルの蓄積をもたらし、進行性の神経変性および早期死亡をもたらす。

実施形態では、本開示の遺伝子治療ベクターは、ＧＬＢ１をコードするポリヌクレオチド配列を含む。実施形態では、本開示の遺伝子治療ベクターは、ヒトＧＬＢ１ポリペプチドまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ血清型ｒｈ１０ベクターである。実施形態では、これらの遺伝子治療ベクターは、プロモーターによって駆動されるβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む欠陥ＡＡＶ２ゲノムを含み、ＡＡＶｒｈ１０のカプシドにパッケージングされる複製欠損ＡＡＶｒｈ．１０ベクター中で、それを必要とする対象に投与され得る。

実施形態では、遺伝子治療ベクターは、追加の調節配列、例えばプロモーター配列、エンハンサー配列、および正確または効率的な転写または翻訳に関与する他の配列、例えば配列内リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）またはポリアデニル化（ポリＡ）配列、ならびに追加のトランスジーンをさらに含む。実施形態では、β－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ポリＡ配列を含むが、ＩＲＥＳ配列も追加のトランスジーン配列も含まない。

実施形態では、本開示は、以下の５’から３’の順に：プロモーター配列；ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；およびポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むポリヌクレオチド配列、例えば発現カセットを含む複製欠損ＡＡＶ由来ベクターを提供する。

実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、脳特異的または神経組織または神経細胞特異的プロモーター）、または対象に対して内因性のプロモーターである。構成的プロモーターの例としては、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じてＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じてＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌαプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられるがこれらに限定されない。実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターであり、ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー、ＣＢプロモーター、ＣＢＡエクソン１、ＣＢＡイントロン、ウサギベータイントロン、およびウサギベータ－グロビンエクソン２を有する。

内因性に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、およびテトラサイクリン誘導系が挙げられる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを含むがこれらに限定されない多様な販売元から入手可能である。他の多くの系が記載されており、当業者は容易に選択することができる。

ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）は、追加のトランスジーンを含有するベクターにおいて使用される。ＩＲＥＳは、翻訳機構がｍＲＮＡ内に動員されることを可能にする構造ＲＮＡエレメントであるが、翻訳開始の主な経路はリボソームを、５’末端がキャッピングされたｍＲＮＡに動員する。実施形態では、本明細書に提供されるベクターは、追加のトランスジーンもＲＩＥＳも含まない。

ポリ（Ａ）シグナルは、ポリＡテールをｍＲＮＡに３’付加するために細胞によって使用される。このテールは、ｍＲＮＡの核輸送、翻訳、および安定性にとって重要である。一部の実施形態では、ポリＡ単位は、ヒト成長ホルモン１ポリＡ単位である。

本開示のベクターの実施形態では、プロモーター配列は、ＣＡＧプロモーター配列に由来する；および／またはポリＡ配列はヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来する。

実施形態では、本開示は、以下の５’から３’の順に：ＣＡＧプロモーター配列；ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；およびヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来するポリアデニル化（ポリＡ）配列を含むポリヌクレオチド配列、例えば発現カセットを含む複製欠損ＡＡＶ由来ベクターを提供する。

実施形態では、本開示は、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターおよび薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物を含む。そのような組成物は、医薬組成物と呼ばれ得る。１つの特定の実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤は、無菌的でおよび／または適正製造規範（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ＧＭＰ）の臨床等級であり得るリン酸緩衝食塩水溶液である。

実施形態では、本開示の組成物に存在するベクターの濃度は、約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ～約５．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬである。例えば、実施形態では、組成物に存在するベクターの濃度は、約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約２．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約３．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約４．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約５．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約６．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約７．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約８．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約９．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ、約２．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ、約３．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ、約４．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ、または約５．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬである。

実施形態では、投与される用量は、約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重～約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ体重である。例えば、実施形態では、投与される用量は、約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約２．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約３．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約４．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約５．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約６．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約７．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約８．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約９．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、または約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇである。実施形態では、投与される用量は、約３．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約９．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇの間である。実施形態では、ＣＳＦの対応する体積は、投与前に推定または計算される。例えば、実施形態では、投与される用量は、約３．２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重であり、約７．３Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦに対応する。他の実施形態では、投与される用量は、約７．２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重であり、約１．８Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦに対応する。

実施形態では、本開示の単位剤形は、約５００μｌ～２０ｍＬの本開示の組成物を含有するバイアルを含む。実施形態では、本開示の単位剤形は、約２ｍＬ～約１２ｍＬを含む。実施形態では、単位剤形は、約５００μｌ、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約３ｍＬ、約４ｍＬ、約５ｍＬ、約６ｍＬ、約７ｍＬ、約８ｍＬ、約９ｍＬ、約１０ｍＬ、約１１ｍＬ、約１２ｍＬ、約１３ｍＬ、約１４ｍＬ、約１５ｍＬ、約１６ｍＬ、約１７ｍＬ、約１８ｍＬ、約１９ｍＬ、または約２０ｍＬの組成物を含有するバイアルを含む。実施形態では、組成物は、約０．０１ｍＬ／分～約５ｍＬ／分の流速で投与される。例えば、実施形態では、組成物は、約０．０１ｍＬ／分、約０．０５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分、約０．４ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分、約０．６ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分、約０．８ｍＬ／分、約０．９ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分、約２．０ｍＬ／分、約３．０ｍＬ／分、約４．０ｍＬ／分、または約５．０ｍＬ／分の流速で投与される。

実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療は、槽内注射を介して投与され、これはまた、本明細書において大槽内への注射またはＩＣＭ注射とも呼ばれる。ＩＣＭ注射は、脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接投与を含む。これは、直接注射またはカテーテルを介して実施することができる。実施形態では、ＩＣＭ注射は、注入速度を制御するために注入ポンプによって実施される。

実施形態では、遺伝子治療は、約０．１ｍＬ／ｋｇ～約２ｍＬ／ｋｇ体重の体積で投与される。例えば、遺伝子治療は、約０．１ｍＬ／ｋｇ、約０．２ｍＬ／ｋｇ、約０．３ｍＬ／ｋｇ、約０．４ｍＬ／ｋｇ、約０．５ｍＬ／ｋｇ、約０．６ｍＬ／ｋｇ、約０．７ｍＬ／ｋｇ、約０．８ｍＬ／ｋｇ、約０．９ｍＬ／ｋｇ、約１ｍＬ／ｋｇ、または約２ｍＬ／ｋｇの体積で投与される。このように、実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを処置するための方法であって、本明細書に提供されるＬＹＳ－ＧＭ１０１ベクターを、ＩＣＭ注射を介して約０．５ｍＬ／ｋｇ～約１．０ｍｌ／ｋｇ体重、例えば、約０．８ｍＬ／ｋｇ体重、例えば、約１ｍＬ～約２０ｍＬの間、例えば約２ｍＬ～約１２ｍＬの間の体積で投与することを含む方法を提供する。実施形態では、ＩＣＭ注射の体積の約半分に対応するＣＳＦの体積がＩＣＭ注射の前に除去される。

ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列
実施形態では、本開示は、本明細書に記載される発現カセットを含むまたはそれからなるポリヌクレオチド配列、ならびに本明細書に記載される発現カセットを含むプラスミドおよびベクターを含む。加えて、本開示は、本開示のポリヌクレオチド配列、ベクターまたはプラスミドのいずれかを含む細胞を含む。当業者は、当技術分野における標準的な分子および細胞生物学技術および知識を使用して、本開示のポリヌクレオチド配列、ベクター、および宿主細胞を容易に産生することができる。

ＡＡＶ ｃａｐ配列は当技術分野で公知である。例示的なＡＡＶｒｈ．１０ｃａｐポリヌクレオチド配列は、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００３／０４２３９７号の配列番号５９に提供され、ＶＰ１をコードする配列はヌクレオチド８４５～３０６１であり、ＶＰ２をコードする配列はヌクレオチド１２５６～３０６１であり、およびＶＰ３をコードする配列は１４５４～３０６１である。例示的なＡＡＶｒｈ．１０ｃａｐポリペプチド配列は、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００３／０４２３９７号の配列番号８１のアミノ酸１～７３８として提供され、ＶＰ１配列はアミノ酸１～７３８であり、ＶＰ２配列はアミノ酸１３８～７３８であり、およびＶＰ３配列はアミノ酸２０３～７３８である。

ある特定の実施形態では、発現カセットを含むポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列の複製または産生を容易にするために、ベクターまたはプラスミド、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターに存在する。本開示のポリヌクレオチド配列を、ＩＴＲ配列の境界部位で適合性の制限部位、または制限部位を含有するＤＮＡリンカー配列を利用することを通して、ならびに当業者に公知の他の方法を通してベクターに挿入してもよい。例えば、ｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、ｐＲｅｐ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）などの分子生物学において日常的に使用されるプラスミドを、発現カセットの挿入のための骨格として使用してもよい。

本開示のベクターまたはプラスミドは、例えば臨床で使用するための遺伝子治療ベクターまたはウイルス粒子を産生するために宿主細胞に存在し得る。特定の実施形態では、本開示は、本開示の発現カセットを含むベクターまたはプラスミドを含む細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、２９３ヒト胎児腎細胞、例えばＳＶ４０ Ｔ抗原を含有する２９３細胞の高度にトランスフェクト可能な誘導体である２９３Ｔ細胞である。他のベクター、宿主細胞、およびウイルスベクターを産生する方法の例は、Kotin RM, Hum Mol Genet, 2011 Apr 15;20(R1):R2-6. Epub 2011 Apr 29)に記載されている。

実施形態では、本開示は、本開示の発現カセットのいずれかを含む遺伝子治療ベクターまたはウイルス粒子を含み、前記遺伝子治療ベクターまたはウイルス粒子は、カプシド、例えばＡＡＶｒｈ．１０カプシドを含む。実施形態では、カプシドは、１つまたは複数のＡＡＶｒｈ．１０カプシドポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、発現カセット、およびベクターは、１つまたは複数の活性なポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の活性バリアント、例えばプロモーター配列の活性バリアント、ポリＡ配列の活性バリアント、またはβ－ｇａｌの活性バリアントを含み得る。活性バリアントは、参照配列と呼ばれ得る、本明細書に提供される配列のいずれかの生物活性バリアントおよび生物活性断片の両方を含む。特定の実施形態では、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の活性バリアントは、デフォルトパラメーターを使用して本明細書の他所で記載される配列アライメントプログラムによって決定した場合に、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、通常約９０％～９５％、またはそれより高い、および典型的に約９７％または９８％または９９％またはそれより高い配列類似性または同一性を有する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される任意の配列、例えば配列番号１～６に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。

実施形態では、β－ｇａｌをコードするポリヌクレオチド配列の活性バリアントは、遺伝子コードの縮重により、野生型または天然に存在する遺伝子またはｃＤＮＡ配列が多様である。したがって、ポリヌクレオチド配列は野生型とは異なるが、コードされるβ－ｇａｌは野生型配列を保持している。このように、本開示は、β－ｇａｌ酵素またはその活性バリアントをコードする任意のポリヌクレオチド配列の使用を企図する。

実施形態では、それ自身活性であるポリヌクレオチド配列の活性バリアント、例えばポリＡ配列はその配列がその対応する野生型参照配列とは異なり得るが、その天然の活性を保持している。参照ポリヌクレオチド配列の活性バリアントは、その配列から一般に２００、１００、５０、または２０ヌクレオチド残基だけ、またはふさわしくはわずか１～１５ヌクレオチド残基、わずか１～１０残基、例えば６～１０、わずか５、わずか４、３、２、またはさらに１ヌクレオチド残基が異なり得る。

実施形態では、ポリペプチドの活性バリアントは、生物学的に活性であり、すなわちそれらは、参照ポリペプチドの酵素活性を保持し続ける。そのようなバリアントは、例えば遺伝子多型および／またはヒトの操作に起因し得る。参照ポリペプチドの活性バリアントは、そのポリペプチドから一般的に２００、１００、５０、または２０アミノ酸残基だけ、またはふさわしくはわずか１～１５アミノ酸残基、わずか１～１０残基、例えば６～１０、わずか５、わずか４、３、２、またはさらに１アミノ酸残基が異なり得る。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、本明細書で言及する参照配列と少なくとも１つ、しかし１５未満、１０未満、または５未満のアミノ酸残基が異なる。他の実施形態では、これは、参照配列とは、少なくとも１つの残基、しかし２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の残基が異なる。

参照ポリペプチドは、活性バリアントを産生するために、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含む様々な様式で変更され得る。そのような操作の方法は、当技術分野で一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変更についての方法は、当技術分野で周知である。例えば、Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)、米国特許第４，８７３，１９２号、Watson, J. D. et al., (“Molecular Biology of the Gene”, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)およびその中で引用されている参照を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)のモデルにおいて見出され得る。

実施形態では、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチド配列と比較してその配列に沿って様々な位置で保存的アミノ酸置換を含有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されており、一般的に以下のように下位分類され得る：酸性：残基は生理的ｐＨでＨイオンの喪失により負電荷を有し、残基は、ペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中にある場合、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおいて表面位置を求めるように水溶液によって引き寄せられる。酸性側鎖を有するアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸を含む；塩基性：残基は、生理的ｐＨでまたはその１つもしくは２つのｐＨ単位内で（例えば、ヒスチジン）Ｈイオンとの会合により正電荷を有し、残基は、ペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中にある場合、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおいて表面位置を求めるように水溶液によって引き寄せられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む；荷電：残基は生理的ｐＨで帯電しており、したがって酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジン）を含む；疎水性：残基は生理的ｐＨで帯電せず、残基は、ペプチドが水性媒体中にある場合、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおいて内部位置を求めるように水溶液によって反発される。疎水性側鎖を有するアミノ酸は、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンを含む；ならびに中性／極性：残基は、生理的ｐＨで帯電していないが、残基は、ペプチドが水性媒体中にある場合にそれが含有されるペプチドの立体配置における内部位置を求めるように水溶液によって十分に反発されない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン、およびスレオニンを含む。

アミノ酸残基は、環状または非環状、および芳香族または非芳香族、残基の側鎖置換基に関する自明の分類、および小さいまたは大きいとしてさらに下位分類することができる。残基は、追加の極性置換基が存在する場合、カルボキシル炭素を含む全体で４個またはそれ未満の炭素原子、存在しない場合は３個またはそれ未満の炭素原子を含有する場合、小さいと考えられる。小さい残基は、もちろん常に非芳香族である。その構造特性に応じて、アミノ酸残基は２つまたはそれより多くのクラスに分けられ得る。天然に存在するタンパク質アミノ酸に関して、このスキームに従う下位分類を、表１に提示する。
表1. アミノ酸の下位分類

保存的アミノ酸置換もまた、側鎖に基づく分類を含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり：塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの置き換え、アスパルテートのグルタメートでの置き換え、スレオニンのセリンでの置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での類似の置き換えは、得られるバリアントポリペプチドの特性に対して主要な影響を及ぼさないと予想することは妥当である。アミノ酸の変化が、機能的な切断および／またはバリアントポリペプチドをもたらすかどうかは、本明細書に記載されるようにその酵素活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。保存的置換を例示的な置換の見出しの下に表２に示す。本開示の範囲内に入るアミノ酸置換は、一般的に（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のかさを維持することに関してその効果に有意差がない置換を選択することによって達成される。置換を導入した後、バリアントを生物活性に関してスクリーニングする。
表2. 例示的なアミノ酸置換

このように、参照ポリペプチドにおける予想される非必須アミノ酸残基は、典型的に同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基により置き換えられる。「非必須」アミノ酸残基は、その活性の１つまたは複数を消失させるまたは実質的に変更することなく、ある実施形態のポリペプチドの野生型配列から変更することができる残基である。ふさわしくは、変更は、これらの活性の１つを実質的に消失させず、例えば活性は、野生型の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％、または８０％、１００％、５００％、１０００％であるか、またはそれより高い。「必須」アミノ酸残基は、参照ポリペプチドの野生型配列から変更された場合に、野生型活性の２０％未満が存在するように親分子の活性の消失をもたらす残基である。例えば、そのような必須アミノ酸残基は、様々な起源からの参照ポリペプチドの酵素部位で保存されている残基を含み得る。

実施形態では、本開示はまた、天然に存在する参照ポリペプチド配列の活性バリアントであって、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって天然に存在する配列とは区別される活性バリアントも企図する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドの活性バリアントは、本明細書に記載される参照ポリペプチドの対応する配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれより高い配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含み、その参照ポリペプチドの酵素活性を保持する。

配列間の配列類似性または配列同一性（用語は、本明細書において互換的に使用される）の計算は、以下のように実施される。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入することができ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のために整列させる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。

２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。一実施形態では、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453）のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用して決定される。なお別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、およびギャップ重み４０、５０、６０、７０、または８０、ならびに長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用して決定される。特に好ましいパラメーターセット（およびそれ以外であると指定されている場合を除き使用すべきセット）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコア行列であり、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５である。

遺伝子治療ベクターを産生するための方法
本開示の遺伝子治療ベクターは、当技術分野で公知の方法および例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ０３０４２３９７号および米国特許第６，６３２，６７０号において以前に記載された方法によって産生することができる。

ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース長である、ポジティブセンスまたはネガティブセンスのいずれかである一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両末端のＩＴＲならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐは、ＡＡＶの生活環に必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子を含み、ｃａｐはキャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする重複ヌクレオチド配列を含み、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、相互作用して正二十面体対称のキャプシドを形成する。

ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組み込みとそれからのレスキューの両方に、ならびにＡＡＶ ＤＮＡの効率的なキャプシド形成および完全にアセンブルされたＡＡＶ粒子の生成に必要とされると考えられている。遺伝子治療に関して、ＩＴＲは、治療用遺伝子の次にシスで必要とされる唯一の配列であると考えられ、構造（ｃａｐ）遺伝子およびパッケージング（ｒｅｐ）遺伝子はトランスで送達され得る。したがって、治療用遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの産生のために確立されたある特定の方法は、２つまたは３つのプラスミドの使用に関与する。特定の実施形態では、第１のプラスミドは、隣接するＩＴＲを含有する、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。一部の実施形態では、第２のプラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに隣接するＩＴＲを含む。一部の実施形態では、第３のプラスミドは、ヘルパー機能を提供する（例えば、アデノウイルス血清型５に由来する）。組換えＡＡＶベクターストックを生成するために、標準的アプローチは、治療用ポリペプチドをコードするＡＡＶベクタープラスミドと一緒に好適な細胞に共トランスフェクトするために使用されるプラスミド上にＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子産物を提供する。一部の実施形態では、標準的アプローチは、治療用ポリペプチドをコードするＡＡＶベクタープラスミドと一緒に、およびヘルパー機能を提供するプラスミドと一緒に、好適な細胞に共トランスフェクトするために使用されるプラスミド上にＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子産物を提供する。

実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含有する複製プラスミド上に提供される。実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、複製起点としてＩＴＲを活性化させ、プラスミドの複製をもたらす。複製起点としては、以下に限定されないが、ＳＶ４０複製起点、エプスタイン－バー（ＥＢＶ）複製起点、ＣｏｌＥ１複製起点、および当業者にとって公知の他のものを挙げることができる。例えば、複製起点が活性化タンパク質を必要とする場合（例えば、ＳＶ４０起点はＴ抗原を必要とし、ＥＢＶ起点はＥＢＮＡタンパク質を必要とする）、活性化タンパク質は細胞系供給源（例えば２９３Ｔ細胞）を作り出すために安定したトランスフェクションによって、または適切な遺伝子を含有するプラスミドによる一過性トランスフェクションによって提供することができる。

他の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子は、複製起点を含有しない非複製プラスミド上に提供されてもよい。このような非複製プラスミドは、細胞の複製装置が、ウイルスの産生を最適化するために、組換えＡＡＶゲノムを複製することに向けられていることをさらに保証する。このような非複製プラスミドによってコードするＡＡＶタンパク質のレベルは、これらの遺伝子の発現を駆動する特定のプロモーターの使用によってモジュレートすることができる。このようなプロモーターとしては、とりわけ、ＡＡＶプロモーター、および外因性供給源に由来するプロモーター、例えばＣＭＶ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、Ｅ１Ａ、ＥＦ１ａ、アクチン、サイトケラチン１４、サイトケラチン１８、ＰＧＫ、および当業者に公知の他のものが挙げられる。これらのヘルパープラスミドによって産生されるｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質のレベルは、所望のタンパク質のレベルに最適に適した各遺伝子に対するプロモーターの選択によって個々に調節され得る。

本開示のウイルスベクターを産生するために使用されるヘルパープラスミドを構築するために、遺伝子とＡＡＶ ＩＴＲ配列（使用される場合）または制限部位を含有するＤＮＡリンカー配列の境界における適合性制限部位の利用、および当業者に公知の他の方法を含む標準的な組換えＤＮＡ技法を用いることができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel., F. et al., eds, Wiley and Sons, New York 1995を参照されたい）。

実施形態では、本開示の遺伝子治療ベクターは、２つまたは３つのプラスミドの２９３または２９３Ｔヒト胚性腎臓細胞系へのトランスフェクションによって産生される。実施形態では、治療用遺伝子をコードするＤＮＡは１つのプラスミドによって提供され、キャプシドタンパク質（ＡＡＶｒｈ．１０に由来する）、複製遺伝子（ＡＡＶ２に由来する）およびヘルパー機能（アデノウイルス血清型５に由来する）はすべて、第２のプラスミドによってトランスで提供される。実施形態では、治療用遺伝子をコードするＤＮＡは１つのプラスミドによって提供され、キャプシドタンパク質（ＡＡＶｒｈ．１０に由来する）および複製遺伝子（ＡＡＶ２に由来する）は第２のプラスミドによってトランスで提供され、ヘルパー機能（アデノウイルス血清型５に由来する）は第３のプラスミドによって提供される。特定の実施形態では、第１のプラスミドは、隣接するＩＴＲを含む、本開示の発現カセットを含む。

細胞培養後に、遺伝子治療ベクターは、凍結融解サイクルによって細胞から放出され、イオジキサノールステップ勾配と、その後のＨｉ－Ｔｒａｐ ＱＨＰカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。得られる遺伝子治療ベクターは、スピンカラムによって濃縮されてもよい。精製されたベクターは、例えば、リン酸緩衝食塩水中で凍結保存されてもよい（－６０℃または－６０℃未満で）。

最終的に製剤化されたベクターの特徴付けは、キャプシドタンパク質に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット、導入遺伝子のＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ、機能的遺伝子の移入に対するウエスタン分析、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの一般的および特定の外来ウイルス、ならびに酵素アッセイによって達成することができる。

処置方法
本開示は、脳疾患および障害、神経疾患および障害、ならびにリソソーム蓄積症を含むがこれらに限定されない遺伝性疾患および障害を処置する方法を提供する。例えば、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを処置する方法であって、それを必要とする対象に、対象の細胞によって取り込まれた場合にβ－ｇａｌを発現するようにデザインされた遺伝子治療ベクターを含む組成物を提供することを含む、方法を提供する。実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤、例えば、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。実施形態では、対象は、哺乳動物、例えばヒトである。実施形態では、ヒトは成人であるか、またはヒトは成人ではない。実施形態では、ヒトは、０日から１８歳の間である。実施形態では、ヒトは、０日から６カ月の間であるか、または６カ月から３歳の間であるか、または３歳から６歳の間であるか、または６歳から１２歳の間であるか、または１２歳から１８歳の間である。実施形態では、対象は、例えば、対象のＧＬＢ１遺伝子における変異を同定するための遺伝子検査によって、または対象から得られた生体試料からβ－ｇａｌ活性を測定することによって、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有すると診断されている。実施形態では、本明細書において提供される方法は、対象の脳全体にわたり、正常なβ－ｇａｌ活性の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、またはそれより高い割合を回復させる。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、対象の脳における正常なβ－ｇａｌ活性の少なくとも約２０％を回復させる。

ある特定の実施形態では、本明細書において提供される遺伝子治療ベクターを含む組成物は、対象の脳および／または脊髄に投与される。実施形態では、本明細書において提供される遺伝子治療ベクターは、対象のＣＳＦに投与される。例えば、一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターを含む組成物は、脳室内または槽内（ＩＣＭ）注射を介して投与される。注射は、単回の神経外科セッションで達成されてもよい。注射は、直接注射、または注入ポンプに接続された埋込みカテーテルを介して実施されてもよい。注入ポンプは、送達速度を制御する。

本開示の様々な実施形態では、ゲノムコピー（ｇｃ）という用語または単位は、ウイルスゲノム（ｖｇ）という用語または単位と交換可能に使用される。

ある特定の実施形態では、合計約１．０×１０^１１ｖｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ、約５．０×１０^１１ｖｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ、約５．０×１０^１２ｖｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ、約１．０×１０^１２ｖｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ～約５．０×１０^１４ｖｇのウイルスベクターが対象に投与される。

実施形態では、遺伝子治療ベクターＬＹＳ－ＧＭ１０１は、注射用溶液である。実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＰＢＳバッファーを含む製剤で投与される。実施形態では、ＰＢＳバッファーは、０．００１％のポロクサマー（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標） Ｐ１８８）を補充されている。一部の実施形態では、ＰＢＳバッファーは、いずれの賦形剤または防腐剤も含まない。一部の実施形態では、ＰＢＳバッファーの組成は、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＣｌ、および／またはＮａ_２ＨＰＯ_４を含む。一部の実施形態では、ＰＢＳバッファーの組成は、約２．６７ｍＭのＫＣｌ、約１．４７ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、約１３７．９ｍＭのＮａＣｌ、および約８．０６ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４を含む。一部の実施形態では、製剤のｐＨは、約６．８～約７．８、または約７．２～７．４である。

実施形態では、本開示は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを処置する方法であって、それを必要とする対象（例えば、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有すると診断されたヒト）に、ＩＣＭ注射を介して、５’から３’の順に以下の配列：ＣＡＧプロモーター配列に由来するプロモーター配列、ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列、およびヒト成長ホルモン１ポリＡ配列を含む発現カセットを含むウイルスベクターを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。

したがって、実施形態では、本開示は、変異したＧＬＢ１遺伝子から生じる脳または神経の疾患または障害を処置することを必要とする対象における変異したＧＬＢ１遺伝子から生じる脳または神経の疾患または障害を処置する方法であって、対象への、その野生型もしくは非変異形態の遺伝子、またはその活性バリアントによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む遺伝子治療ベクターのＩＣＭ投与を含み、前記ポリヌクレオチド配列がプロモーター配列に作動可能に連結しており、前記ＩＣＭ投与が、約１×１０^１３ｖｇ～約５×１０^１４ｖｇ、または約５．０×１０^１３ｖｇ～約１．２×１０^１４ｖｇを、約０．５ｍＬ／ｋｇ～約１．５ｍＬ／ｋｇの体積で投与することを含む、方法を含む。例えば、約５ｋｇの体重を有する患者（例えば、乳児）では、遺伝子治療ベクターは、約２ｍＬの体積で投与されてもよく；約１５ｋｇの体重を有する患者では、遺伝子治療ベクターは、約６ｍＬの体積で投与されてもよい。実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＣＡＧプロモーターに作動可能に連結している。実施形態では、ＩＣＭ投与は、必要に応じてカテーテルを含む送達デバイスを使用して実施される。実施形態では、投与はカテーテルを介するものである。実施形態では、ＩＣＭ投与は、注入ポンプを使用して実施される。

実施形態では、本明細書において提供される方法は、１つまたは複数の免疫抑制剤と組み合わせた本明細書において提供される遺伝子治療の投与を含む。実施形態では、免疫抑制剤は、遺伝子治療ベクターの投与前および／またはそれと併せておよび／またはその後に、本明細書において提供される遺伝子治療を必要とする対象に投与される。実施形態では、免疫抑制剤の１つまたは複数は、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムス）、マクロライド（例えば、シロリムスまたはラパマイシン）、および／またはミコフェノール酸モフェチルを含む。実施形態では、免疫抑制剤の１つまたは複数は、ステロイド（例えば、プレドニゾロン）を含む。実施形態では、免疫抑制剤の１つまたは複数は、遺伝子治療ベクターの投与直後に、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、または少なくとも１２カ月間投与される。実施形態では、免疫抑制剤の１つまたは複数は、対象の人生の残りの期間、または対象が発現カセットから検出可能なレベルのβ－ｇａｌを産生している限り、投与される。

本出願において引用されるすべての文書は参照によりすべての目的でその全体として本明細書に組み込まれる。

本開示は、以下の実施例を参照してさらに例証される。これらの実施例は、上記実施形態と同様に、例示であり、いかなるようにも本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。

（実施例１）
ＬＹＳ－ＧＭ１０１遺伝子治療ベクター
ＬＹＳ－ＧＭ１０１は、ニワトリβ－アクチンプロモーター／ウサギβグロビンイントロン（ＣＡＧプロモーター）、およびヒト成長ホルモンポリＡ配列に融合したサイトメガロウイルスエンハンサーによって駆動されるヒトＧＬＢ１遺伝子を有する複製欠損組換えＡＡＶｒｈ．１０ベクターである。プロモーター、ＧＬＢ１ ｃＤＮＡ、およびポリＡ配列を含む発現カセットは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列に挟まれている。ＬＹＳ－ＧＭ１０１プラスミド上のプロモーター、ｈＧＬＢ１導入遺伝子、ポリＡ配列、および隣接配列の概略図を図１Ａとして提供する。プラスミドの特徴および各特徴に対する配列番号の表を以下の表３に提供する。プラスミドの配列は配列番号６として本明細書において提供される（図１Ｂおよび図１Ｃ）。
表3. GM-101構成成分の表

発現カセットは、順番に、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、リソソーム酸ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）酵素をコードするヒトＧＬＢ１遺伝子（ｈＧＬＢ１）に対するｃＤＮＡ、およびヒト成長ホルモン１ポリＡユニット（ｈＧＨ１ ポリＡ）を含む。発現カセットは、１４５ヌクレオチドを含有する第１のＡＡＶ２逆位反復配列（ＩＴＲ）および１４５ヌクレオチドを含有する第２のＡＡＶ２ ＩＴＲに挟まれている。２つのＩＴＲ末端は、ゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる唯一のシス作用型エレメントである。ｈＧＨ１ポリＡユニットは、ｍＲＮＡ安定性およびｍＲＮＡ翻訳に向けた核外輸送に関与する。

ＬＹＳ－ＧＭ１０１ ＤＮＡは４．６０ｋｂからなり、分子量は１４２２．５ｋＤａである。β－ｇａｌ配列は２．０３ｋｂからなり、ＧＬＢ１ ＤＮＡ配列の分子量は６２７．５ｋＤａである。

（実施例２）
ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスにおけるマウスのＬＹＳ－ＧＭ１０１の視床内または脳室内注射の用量応答研究
視床内経路およびＩＣＶ経路に関する用量応答を個々に確立するために研究を行った。この研究は、ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスにおいて行われたＬＹＳ－ＧＭ１０１のマウスバージョン（ＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌ）の視床内（Ｔｈａｌ）注射または脳室内（ＩＣＶ）注射に対する用量応答研究であった。

ＧＭ１ガングリオシドーシスノックアウトマウス（Hahn et al. 1997）は、ＧＭ１ガングリオシドーシス疾患の十分に確立されたモデルである。ＧＬＢ１遺伝子のエクソン６における大きな挿入によって、切断されたβ－ガラクトシダーゼタンパク質およびβ－ｇａｌ活性の欠如がもたらされる。５週齢までに、脳および脊髄において広範なリソソーム蓄積欠陥が見られ、その後数カ月にわたり病態が進行する。リソソーム機能不全にもかかわらす、ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスは、運動失調、振戦および異常歩行が明らかになる約５カ月齢まで臨床表現型を示さない。ノックアウトマウスモデルは、低レベルのβ－ｇａｌ活性およびＣＮＳ全体にわたるＧＭ１ガングリオシドの大量の蓄積を有する乳児型ＧＭ１ガングリオシドーシスのいくつかの臨床的および生化学的特徴を再現する（Baek et al. 2010）。よって、リソソーム病態は、このモデルがヒトの早期乳児型疾患と同等であることを示すが、マウスにおける神経疾患の進行はヒトにおけるよりも遅い。

ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスの視床に両側から（２×２．２μＬ）または側脳室に片側から（１４．８μＬ）、漸増用量のＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌ（Ｔｈａｌ：３．５Ｅ＋０９、１．０Ｅ＋１０、３．５Ｅ＋１０、１．０Ｅ＋１１ｖｇ；ＩＣＶ：３．５Ｅ＋１０、１．０Ｅ＋１１、３．５Ｅ＋１１ｖｇ）を注射した（表４）。これらの注射部位および用量の選択は、ｍβ－ｇａｌをコードするＡＡＶ１を使用するＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスにおける以前の研究に基づいており、これは、処置した動物のＣＮＳにおいて酵素的および神経化学的な補正を示した（Baek et al. 2010; Broekman et al. 2007）。ＰＢＳを注射したＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスを陰性対照とした（ベクター注射群と同じ部位および体積を注射した）。１群当たり４～６匹のマウス（両方の性別）に注射した。６～８週齢のマウスに注射し、注射の１カ月後に安楽死させ、生化学的および組織学的な分析のために組織を収集した。脳切片の組織病理学的分析によって潜在的毒性も評価した。
表4: GM1ガングリオシドーシスのマウスにおける用量応答研究:研究用量

定量アッセイを実施し、脳、小脳および脊髄におけるβ－ｇａｌ酵素活性およびＧＭ１ガングリオシド含量を測定した。図２Ａ～２Ｆに提示した結果は、ＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌによって、視床への注射後に脳の全領域にわたって、有意かつ用量依存的なβ－ｇａｌ酵素活性の増加およびＧＭ１ガングリオシド含量の減少が生じ、ＩＣＶ注射では用量応答があまり明確ではなかったことを示す。視床内送達において使用した最低用量の３．５Ｅ＋０９ｖｇは、β－ｇａｌ活性の有意な増加をもたらし、最小有効用量（ＭＥＤ）に達しなかったことを示した。ＩＣＶ送達（中および高用量）により、小脳において同等のβ－ｇａｌ酵素活性およびＧＭ１ガングリオシドのレベルがもたらされ、視床内注射と比較して脊髄ではより効果が高かった。最低用量の視床内注射によって達成された低減と同様の大脳のＧＭ１ガングリオシド含量の低減を達成するために、３．５Ｅ＋１１ｖｇのＩＣＶ用量が必要とされた。

Ｘ－ｇａｌによる組織化学染色（図３）は、ＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌを注射した動物の脳におけるβ－ｇａｌ酵素活性の用量依存的増加を示した。視床の注射部位から放射状に強力な染色および分布が観察された。ＩＣＶ注射後に、最高用量でさえ、染色強度ははるかに低かったが、より広範囲に分布し、小脳などの視床注射後に染色されなかった領域に到達したようであった。ＩＣＶ注射ではなく視床内への直接注射によって、注射部位付近では、２つの最高用量（３．５Ｅ＋１０ｖｇおよび１．０Ｅ＋１１ｖｇ）で用量依存的毒性がもたらされた。より深刻な組織病理学的変化は、脊髄の貯蔵不足を緩和するのに必要とされる１．０Ｅ＋１１ｖｇの視床内用量で観察された。ＡＡＶベクターの視床内注射が、神経損傷を引き起こすことが以前から記載されていることに留意されたい。一方、最高用量（３．５Ｅ＋１１ｖｇ）でさえも、ＩＣＶ注射後に毒性は観察されず、これは、すべてのＣＮＳ区画での正の薬理学的効果に関連した。

まとめると、本研究は、ＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌのＩＣＶ注射が、視床内注射と異なり、観察可能な有害作用のない用量で、広範囲にわたる（大脳、小脳および脊髄）貯蔵不足の補正をもたらしたことを示した。

（実施例３）
ＧＭ１ガングリオシドーシスのネコの経路比較研究におけるネコ科のＬＹＳ－ＧＭ１０１
ＣＮＳにおけるβ－ｇａｌレベルを回復させ、ＧＭ１ガングリオシドを低減するＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌ（ＬＹＳ－ＧＭ１０１のネコ科アナログ）の効果は、十分に特徴付けられたＧＭ１ガングリオシドーシスのネコ科モデルを使用する以下の２つの研究で本明細書において提供される（Martin et al. 2008））。このモデルは、ヒト疾患の若年形態に類似する。罹患したネコの臨床神経疾患の発症は、およそ３．５カ月齢で生じ、頭や四肢の微細な振戦を伴う。ＧＭ１ガングリオシドーシス変異のネコは、進行性の運動困難および歩行困難を有し、９～１０カ月齢の末期の疾患段階では失明および発作を伴う。

ネコ科モデルの初期の研究は、３つの投与経路：ＩＣＭ、ＩＣＶおよびＩＴＬを探るために行った。この第１の研究の結果に基づいて、ＧＭ１ガングリオシドーシスのネコにおいて最も有望なＣＳＦ経路、すなわちＩＣＭにより高用量で送達されたＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌの長期有効性を評価するために、第２の研究（実施例４において提供される）を行った。

第１に、ＬＹＳ－ＧＭ１０１のネコ科バージョンの有効性および投与経路の比較研究をＧＭ１ガングリオシドーシスのネコにおいて行った。この研究では、ＣＳＦ送達の様々な経路をＣＮＳ分布およびβ－ｇａｌ酵素レベルに影響を与えるそれらの可能性について評価した。ＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌを３つの経路：ＩＣＭ（ｎ＝４ 両方の性別）、ＩＣＶ（ｎ＝４ 両方の性別）またはＩＴＬ（ｎ＝４ 両方の性別）のうちの１つによって、１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重の総用量でＧＭ１ガングリオシドーシスのネコに送達した。２～５カ月齢のネコを処置し、注射の１カ月後に安楽死させた。未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコ（ｎ＝４ 両方の性別）およびＷＴネコ（ｎ＝４ 両方の性別）を対照として使用した。生化学分析では、脳および脊髄を収集し、図４に示されているように分割した。

定量アッセイを実施し、大脳、小脳および脊髄におけるβ－ｇａｌ酵素活性を測定した。β－ｇａｌ酵素活性を、処置動物からの各ＣＮＳブロックにおけるβ－ｇａｌ酵素活性を正常な（ＷＴ）動物（ｎ＝３）からの対応するブロックにおけるレベルに対して表わすことを意味する、「正常レベルの倍数」として表わす。結果を図５に提示し、ＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌの両側ＩＣＶおよびＩＣＭ注入により、未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコ組織と比較して、大脳、小脳および脊髄のβ－ｇａｌ酵素活性が上昇したことを示す。ＩＴＬ送達により脊髄のβ－ｇａｌ酵素活性の上昇が生じたが、この経路はβ－ｇａｌを脳および小脳に送達する際には効果的ではなかった。一般に、脳と脊髄の両方で最も高いβ－ｇａｌ酵素活性は、ＩＣＭ注入から生じ、脳においては正常なＷＴレベルの０．０８～０．６２倍および脊髄においては正常なＷＴレベルの０．４７～２．０倍の範囲であった。

β－ｇａｌ活性はＣＳＦにおいても測定し、ここでは、活性の平均値はＣＭまたはＩＣＶ注射後に増加した（正常値の０．５～２．７倍の範囲）。末梢臓器のβ－ｇａｌ活性の最高レベルは肝臓において測定され、ここでは、平均値は、注射経路にわたり同様であり、正常値の０．７２～１．１倍の範囲であった。さらに、心臓のβ－ｇａｌ活性は、ＣＭ（正常値の０．４５倍）またはＩＣＶ（正常値の０．３２倍）経路による処置後に有意な上昇を示し、ＩＴＬ注射後には上昇しなかった。末梢臓器におけるβ－ｇａｌ活性の増加は、ベクターがＣＳＦから血中に漏出し、次いで、末梢臓器に伝わることを示す。特に肝臓および心臓におけるこの末梢のβ－ｇａｌ活性の増加は、心筋症および肝脾腫大などのＧＭ１ガングリオシドーシスに関連し得る身体症状に有益な影響を有し得る（Regier et al. 2016）。

リソソーム蓄積を評価するために、処置したＧＭ１ガングリオシドーシスのネコのサブセットにおいて、ＣＮＳのフィリピン染色を実施した（図６）。点状の白色または淡灰色の点として可視化されるように、フィリピン染色は、正常なネコのＣＮＳの灰白質には存在しないが、未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコの大脳、小脳、脳幹および脊髄の灰白質では、顕著なフィリピン染色が観察される。ＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌで処置したＧＭ１ガングリオシドーシスのネコの腰髄ではフィリピン染色が減少し、注射経路にかかわらず、処置したネコのすべてにおいて貯蔵物質の部分的クリアランスが実証された。しかし、ＩＣＭ注射によって処置したネコだけは、小脳と脳幹において有効なクリアランスを有し、大脳では部分的なクリアランスを有した。対照的に、本研究において、ＩＣＶまたは腰椎経路によって処置したネコでは、大脳、小脳および脳幹からは、貯蔵物質が効果的に取り除かれなかった。

まとめると、本研究は、大動物モデルにおけるＡＡＶｒｈ．１０ベクターのＣＳＦ投与により、β－ｇａｌの広範なＣＮＳ送達がもたらされ得ることを示した。１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇでは、特に脳においては、酵素活性の増加が限定的であったにもかかわらず、本研究は、脳におけるβ－ｇａｌ活性の上昇には、ＩＣＶおよびＩＣＭ投与が腰椎送達よりも好ましいことを示した。脳と脊髄の両方において、最も高いβ－ｇａｌ酵素活性と関連する貯蔵物のクリアランスは、ＩＣＭ注入によりもたらされた。

（実施例４）
ＧＭ１ガングリオシドーシスのネコにおけるネコ科のＬＹＳ－ＧＭ１０１のＩＣＭ注入の長期有効性
実施例３において上記で考察した研究によって与えられたデータに基づき、ＩＣＭ注入によって高用量で送達されたＬＹＳ－ＧＭ１０１のネコ科バージョンの長期有効性研究を２匹の若年型雄性ＧＭ１ガングリオシドーシスのネコにおいて行った。

ＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌを２～３カ月齢のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコ（ｎ＝２）に、１．５Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ体重の用量で、超音波ガイド下の定位ＩＣＭ注入によって送達した。処置したＧＭ１ガングリオシドーシスのネコのＣＮＳにおけるβ－ｇａｌ活性のレベルを増加させるために、初期研究と比較して１５倍高い用量を選択した。若年型動物を使用して、最初の臨床徴候前の処置を可能にした。未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコ（ｎ＝５）およびＷＴネコ（ｎ＝５）を対照として使用した。臨床評価尺度（表５）を使用して、未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコが８．０（±０．６）カ月で到達する２日連続で立つことができないことによって定義される人道的エンドポイントまで（Gray-Edwards, Regier, et al. 2017；McCurdy et al. 2014）、疾患進行について２週間ごとにネコを評価した。
表5: 未処置のGM1ガングリオシドーシスのネコにおける症状の発症

(Gray-Edwards, Regier, et al. 2017; McCurdy et al. 2014)

ＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌをＩＣＭ注射したネコは、未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコよりも有意に長く生存し、未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコに対する８．０±０．６カ月と比較して、１１．３±０．７カ月の平均寿命を有した（ｐ＝０．０４０５、ログランクマンテル－コックス検定）。臨床評価スコアは図７に提示され、臨床的疾患進行はＡＡＶｒｈ．１０－ｆβｇａｌのＩＣＭ注射によって遅延されたが停止はされなかったことを示す。失明は評価尺度に組み込まれていないが、すべての動物は、疾患が進行すると失明した。

８．８カ月および人道的エンドポイントにおいて処置したネコにおいて、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）測定を実施した。ＧＭ１ガングリオシドーシスのネコにおける以前の研究では、ＣＮＳの疾患進行の最も有益で一貫した予測因子は、グリセロホスホコリン＋ホスホコリン（ＧＰＣ＋ＰＣ）を組み合わせたレベルであり、これは、ミエリンの完全性が損なわれると増加する（Gray-Edwards, Regier, et al. 2017）。処置したネコにおけるＧＰＣ＋ＰＣは、小脳を除くすべてのボクセルにおいて、人道的エンドポイントにおける未処置のＧＭ１ガングリオシドーシスのネコのレベルと同等であるか、またはそれより高かった。小脳では、ＧＰＣ＋ＰＣレベルの平均値は、８．８カ月と人道的エンドポイントの両方で、処置後に中程度に低下した。

遺伝子治療の効果を追跡するために脳のＭＲＳに加えて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）などの疾患進行のマーカーをＣＳＦにおいて測定した。典型的には、末梢血中のそれらのレベルを測定することによって肝臓または筋肉の疾患を評価するために使用されるが、ＡＳＴおよびＬＤＨはまた、ＧＭ１ガングリオシドーシスのネコのＣＳＦにおいて測定した場合に、神経変性と相関することが以前の研究において示されている（Gray-Edwards, Jiang, et al. 2017）。図８において示されているように、ＣＳＦにおけるＡＳＴおよびＬＤＨは、処置したネコに対して未処置レベルの約５０％まで減少したが、レベルは依然として正常値より高いままであった。

β－ｇａｌ活性および生体分布を脳および脊髄からの１６切片のＸｇａｌ染色によって評価した（図９）。β－ｇａｌ活性は、処置したＧＭ１ガングリオシドーシスのネコの小脳および脊髄において広範囲で明らかであった。しかし、大脳では活性はほとんど検出されなかった。大脳における少量のβ－ｇａｌ活性は、脳深部構造では検出されなかったが、脳溝および脳室周囲領域などのＣＳＦに直接曝露される領域に限られていた。

定量アッセイにより、Ｘｇａｌ染色からの所見が確認され、大脳では低レベルのβ－ｇａｌ活性ならびに小脳および脊髄では高レベルのβ－ｇａｌ活性を有した（図１０）。大脳では正常値の０．２～０．６倍、小脳では正常値の０．４～０．７倍および脊髄では正常値の０．３～１．０倍の範囲のレベルであった。

初期の研究と比較して本研究で試験した１５倍多い用量にもかかわらず、同様のレベルのβ－ｇａｌ活性が脳内に見られ（図５を参照されたい）、酵素は脳深部構造からは実質的に認められなかった。この予想外の結果の原因は決定されていないが、これがウイルス滴定の誤差および／または注射の失敗に起因することを除外することはできない。特に脳深部構造における、本研究で観察されたβ－ｇａｌ活性の限定された増加は、処置したネコの臨床表現型の不完全な補正を説明し得る。

まとめると、本研究は、脳におけるβ－ｇａｌ増加のレベルが低いにもかかわらず、ＬＹＳ－ＧＭ１０１のネコ科バージョンのＩＣＭ注射によって、ＣＳＦにおける神経変性バイオマーカーおよび小脳における神経変性のＭＲＳマーカーの減少に関連したＧＭ１ガングリオシドーシスのネコにおける臨床的改善がもたらされることを示した。

（実施例５）
ＬＹＳ－ＧＭ１０１の単回ＩＣＭ投与後の若年型非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳにおけるβ－ｇａｌ活性
ＣＮＳにおけるβ－ｇａｌ酵素活性を若年型ＮＨＰにおいて行われたＧＬＰ毒性学および生体分布の研究において評価した。本研究の目的は、カニクイザルの大槽に１回投与したＬＹＳ－ＧＭ１０１の毒性および生体分布を決定することであった。表６に記載したデザインに従って本研究を行った。
表6: NHP研究デザイン

M:雄性、F:雌性(25～33カ月齢)。

ＬＹＳ－ＧＭ１０１またはそのビヒクルを、以下の濃度で０．５ｍＬ／分の流速にて４．５ｍＬを注入することによって、大槽空間でＤ１に一回の単一セッションで投与した：低用量－３．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ、すなわち１．４Ｅ＋１３ｖｇ／動物；高用量－１．２Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ、すなわち５．４Ｅ＋１３ｖｇ／動物

本明細書に記載のＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスおよびネコのモデルにおける研究に基づいて、処置有効性には比較的高用量のＬＹＳ－ＧＭ１０１が必要とされるようである。したがって、ＬＹＳ－ＧＭ１０１の実行可能な最大用量を、薬物製品バッチの実行可能な最大ベクター濃度およびＮＨＰの大槽に安全に注射することができる最大体積である、それぞれ１．２Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬおよび４．５ｍＬに基づいて、ＮＨＰにおいて試験した。したがって、用量応答の観察を可能にするために、実行可能な最大用量（すなわち、５．４Ｅ＋１３ｖｇ）および４分の１の用量（すなわち、１．４Ｅ＋１３ｖｇ）を試験した。

ＬＹＳ－ＧＭ１０１またはそのビヒクルを、麻酔した動物の大槽空間に触診により手動で挿入した２０ゲージの脊髄針を使用して、Ｄ１に一回の単一セッションで投与した。針からのＣＳＦの流れによって、正しい位置を確認した。針の場所は脳定位固定装置（stereotaxic frame）を使用して確保した。針を１ｍの延長セットを介して注入ポンプに接続し、０．５ｍＬ／分の流速で４．５ｍＬの試験品またはビヒクルの注入を可能にした。注射の終わりに、逆流を防ぐために針を５分間留置した。次いで、針を取り外し、注射部位に約３０秒間圧力をかけた。

剖検の日（１２週目（Ｄ７８／Ｄ７９））および６カ月目（Ｄ１８１／Ｄ１８２）に、屠殺前に一晩絶食した後、動物にケタミンＨＣｌを前投薬し、静脈内経路によってペントバルビタールナトリウム麻酔後にほぼ完全な失血によって安楽死させた。

脳（冷たい滅菌生理食塩水で灌流した）を脳スライサーを使用して４ｍｍ厚のスライスに切断した。組織病理学検査のために奇数のスラブを緩衝ホルマリンで固定した。偶数のスラブを１０×１０ｍｍの切片に分割し、各切片の位置を記録するために写真撮影（スケール付き）した（図１１）。各切片を半分に分割し、一方の半分をＤＮＡ定量用（１２週目のコホートのみ）、他方の半分をβ－ｇａｌ酵素活性用（１２週目と６カ月目の両コホート）に提出した。１２週目のコホートからのβ－ｇａｌ酵素活性の結果を本明細書に提示する。

ＣＮＳ試料（動物当たり９９～１２３個の脳試料および３個の脊髄試料）のβ－ｇａｌ酵素活性を、蛍光酵素アッセイを使用して定量し、結果を１時間当たりおよびタンパク質１ｍｇ当たりの生成物（４－ＭＵ）のｎｍｏｌとして表した。ビヒクル処置した動物（群１）で観察されたβ－ｇａｌ酵素活性のレベルは、ＮＨＰにおける酵素の内因性活性に対応し、群２および３ではバックグラウンドレベルと考えられた。群１では、酵素活性の平均値はタンパク質１ｍｇ当たり５２ｎｍｏｌ／時間であり、性別間に有意差はなかった（雄性では平均値は５３ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、雌性では平均値は５１ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ）。

脳試料において測定したβ－ｇａｌの活性は、図１０に例示されているように、脳切片間、さらには類似する脳切片からの試料間で不均一な値を示した。しかしながら、両方のＬＹＳ－ＧＭ１０１処理群の脳では、対照群と比較して、酵素活性の全体的な増加が観察された（群２および群３についてそれぞれ２０％および６０％の増加）。この差は、群１と群３の間で統計的に有意であり、平均値はそれぞれ５２．１および８３．４ｎｍｏｌ／時間／ｍｇであった（ｐ＝０．００２）（図１２）。脳で観察された全体的なβ－ｇａｌ活性の増加は、β－ｇａｌ活性がバックグラウンドレベルに対して２０％以上の増加を示した分析試料の割合の増加と関連しており、β－ｇａｌ活性が一部のわずかな脳領域のみに限定されるのではなく、脳全体で増加したことを反映していた。脊髄切片では、群３の動物において、群１の平均値と比較して、β－ｇａｌ活性の４２％の増加が観察されたが、しかしながら、これは統計的有意性には達しなかった（図１２）。

群３から分析した脳試料の平均値６８％（＋／－１６％）は、バックグラウンドレベルに対して２０％以上のβ－ｇａｌ活性の増加を示した。このレベルのβ－ｇａｌ活性の増加は、乳児型の、または若年型のＧＭ１ガングリオシドーシス患者に置き換えると、治療効果につながることが期待されることに留意されたい。実際に、ＧＭ１ガングリオシドーシスの疾患重症度は、残存酵素活性と相関しており、乳児型および若年型の患者はそれぞれ正常レベルの１％未満および１０％未満しか発現しておらず（Regier and Tifft 2013）、無症状のヘテロ接合性の対象は、線維芽細胞／白血球において正常なβ－ｇａｌ活性の３６～３８％の平均値を有し、下限は１６～１９％に見出された（Sopelsa et al. 2000）。

（実施例６）
非臨床研究の概要
まとめると、非臨床研究の結果によって、ＬＹＳ－ＧＭ１０１０のＩＣＭ投与によるＣＮＳにおけるβ－ｇａｌ活性の上昇によって、ＧＭ１ガングリオシドーシスにおいて有益な治療効果がもたらされるという定性的原理が確立された。

前臨床ベクター用量をヒトベクター用量に外挿するのではなく、実施例７で以下に提供する臨床研究のための用量選択は、ターゲットエンゲージメント分析に基づくものであった。臨床的利益が期待されるＬＹＳ－ＧＭ１０１の用量を選択するために、本明細書において提供される前臨床研究で得られた情報に基づいて、本発明者らは、この用量が、ＧＭ１ガングリオシドーシスの患者の中枢神経系における正常β－ｇａｌ活性の約２０％の回復につながるはずであると推論した。これは、以下の根拠に基づいている。第１に、ＧＭ１ガングリオシドーシスでは、残存酵素活性と疾患の発症年齢および重症度との間に良好な相関が存在する（（Regier and Tifft 2013）および表７）。
表7: 残存酵素活性と疾患の発症年齢および重症度の間の相関(Regier and Tifft 2013)

残存酵素活性が１０％を超える保因者では疾患は観察されていない。一貫して、無症状のヘテロ接合性対象は、正常なβ－ｇａｌ活性の３６～３８％の平均値を有し、下限は１６～１９％である（Sopelsa et al. 2000）。第２に、Ｓａｎｄｈｏｆｆと同僚（Conzelmann and Sandhoff 1983）；（Leinekugel et al. 1992）；（Sandhoff and Harzer 2013）は、リソソーム基質ターンオーバーの酵素反応速度モデルを使用して、ほとんどのリソソーム酵素について、酵素活性の有意な低下は基質ターンオーバーに有意な影響を与えることなく許容され得ることを実証した。酵素活性が臨界閾値未満に低下した場合にのみ、基質が蓄積し、リソソーム蓄積の病態をもたらす。多くのリソソーム酵素では、この臨界閾値は正常な平均の５～１０％で起こる。ＧＭ２ガングリオシドーシスの場合には、様々な程度の残存酵素活性を有する細胞の基質分解速度は、残存活性と共に急峻に増加し、残存活性が正常値の１０～１５％で正常レベルに達することが示された。この臨界閾値を超える活性を有するすべての細胞は、正常なターンオーバーを有していた（Leinekugel et al. 1992）。同様の観察は、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ、サンドホフ、およびＡＳＭ欠損ニーマン－ピック病についても報告された（Sandhoff and Harzer 2013）。重要なことに、ＧＭ１ガングリオシドーシスにおける残存酵素活性と疾患重症度の間の相関は、ＧＭ２ガングリオシドーシスで見られるものと非常に類似しており、ＧＬＢ－１変異の健常な保因者が１６％という低い残存活性を有し得るという事実は、Ｓａｎｄｈｏｆｆと同僚によって説明された酵素反応速度モデルと適合しているということである。

さらに、ＧＭ１ガングリオシドーシスの動物モデルにおけるいくつかの前臨床研究によって、β－ｇａｌ発現ベクターの送達後の酵素活性（これはターゲットエンゲージメントを反映する）と疾患表現型の間の関係が実証されており、これは約２０％の閾値という概念を確認するものである。よって、ＡＡＶ９－ｍβｇａｌのＩＶ注射で処置したＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスの大脳における正常なβ－ｇａｌ活性の１０％～２０％は、表現型の改善および寿命の延長を伴う有意な生化学的影響を達成するのに十分である（Weismann et al. 2015）。さらに、ヒトβ－ｇａｌをコードするＩＣＶ投与ＡＡＶベクターを使用して、ヘテロ接合体のレベル（正常酵素活性の約５０％を有する）の２分の１～３分の１の、ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスの脳におけるβ－ｇａｌ活性レベルの回復は、神経スコア、リソソーム病理および生存時間への有意に有益な効果を有した。上記ネコの研究では、脳のβ－ｇａｌ活性レベルが平均して５０％より低い場合に、有意な臨床的改善が観察された。使用したＡＡＶｒｈ．１０－ｍβｇａｌの最低用量は野生型動物よりも高い脳β－ｇａｌ活性を生じたため、ターゲットエンゲージメントの最小有効レベルに関する結論は、マウスの研究からは導き出すことができなかった。

まとめると、これらの結果は、ＧＬＢ－１変異のヘテロ接合性ヒト保因者における疾患の発症を防ぐだけではなく（上記で考察したように）、ホモ接合性疾患動物、およびおそらくヒト患者のＣＮＳにおける疾患の顕在化を補正または復帰させるのに、正常な酵素活性の約２０％で十分であることを示す。Ｉ型ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者に対して、わずか数％の正常な活性を付与するだけでも有益であり得、なぜなら、この疾患の最も重症の形態では、余命２～３年であり、１％未満の残存活性を伴うが、比較的軽度の若年型および成人型形態の疾患では、３～１０％の残存活性を伴うためである（Regier and Tifft 2013）。

全体として、前臨床研究によって、ＬＹＳ－ＧＭ１０１が臨床利益をもたらすことを実証した。意図した臨床用量に相当するＬＹＳ－ＧＭ１０１の用量は、ＣＮＳ解剖学的構造が小児のものと類似しているカニクイザルの脳および脊髄において、正常なβ－ｇａｌ活性の２０％より多くを回復させることができる。ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者の細胞において、β－ｇａｌ活性を正常値の１５～２０％のレベルにまで回復させることにより、基質の蓄積を止めることが期待されるため、ＬＹＳ－ＧＭ１０１の意図した臨床用量は、疾患進行を遅らせ、場合によっては生存期間を延長することを含む有意な臨床利益をもたらすことが期待される。重要なことに、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者の細胞においてβ－ｇａｌ活性が数％回復するだけでも、Ｉ型ＧＭ１ガングリオシドーシスの経過を疾患のより軽度な若年型または成人型形態の経過に転換する潜在性を有する。

（実施例７）
ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者におけるＬＹＳ－ＧＭ１０１遺伝子治療のヒト臨床研究
ＧＭ１ガングリオシドーシスの処置のための、ヒトβ－ガラクトシダーゼｃＤＮＡを有するアデノ随伴ウイルスベクター血清型ｒｈ．１０の槽内（ＩＣＭ）投与の例示的な非盲検の、アダプティブデザイン研究が本明細書において提供される。本研究は、安全性および予備的有効性の段階と確認段階の２段階で行われる。第１の段階の主要目的は、早期乳児型および後期乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシスの患者におけるＬＹＳ－ＧＭ１０１の槽内投与の安全性および忍容性を評価することである。第１の段階の二次的な目的は、予備的有効性データを収集すること、ならびに第２の段階での主要な有効性評価項目および主要目的の時点を選択することである。主要評価項目の選択は、第１の段階の間に乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシスの患者において収集した自然経過データおよび予備的有効性データに基づく。確認段階の主要な目的は、乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシス患者におけるＬＹＳ－ＧＭ１０１の槽内投与の有効性を実証することである。確認段階の二次的な目的は、乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシス患者におけるＬＹＳ－ＧＭ１０１の安全性および忍容性を評価することである。

第１の段階は、初期および後期の乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者を登録する。患者の初期コホート（早期および後期の乳児型を含む）は、ＧＬＰ毒性学研究で試験した最高用量（ＣＳＦのｖｇ／ｍＬで）に対して２～５倍の安全マージンを有する前臨床データに基づき、潜在的有効用量を受ける。第２のコホートにおける患者（早期および後期の乳児型を含む）の登録は、独立したデータ安全性モニタリング委員会（Ｄａｔａ Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｏａｒｄ）（ＤＳＭＢ）によるコホート１内のサブタイプごとの投与後１カ月の安全性データの精査後に開始される。ＧＭ１ガングリオシドーシスのサブタイプごとに、１名の患者が毒性を示す事象では追加の患者が登録される。

コホート２に登録した最初の患者に関する１カ月の安全性およびバイオマーカーのデータのＤＳＭＢによる精査後に、コホート２の登録が再開され、第２段階（研究の確認期）が開始される。

処置に対する応答について評価するために、６カ月の時点で複数の安全性および有効性の変数が測定される。本研究の確認期における各ＧＭ１ガングリオシドーシスサブタイプに関する評価項目、アウトカム尺度、フォローアップ期間、および主要目的の時点は、本研究に最初に登録した８名の患者の６カ月間のデータの中間的分析後に選択される。第１段階に登録したすべての患者は、少なくとも２年間のフォローアップの間、研究に参加したままであり、最終的な分析に含まれる。

早期乳児型と後期乳児型の形態間の様々な進行パターンを考慮して、各群の患者に関する様々な主要評価項目および時点を第２段階のために選択することができる。自然経過データに記載した低下速度に基づき、主要目的の時点は、それぞれ、早期乳児型では１年および後期乳児型では２年になることが予想される。すべての患者は、ＬＹＳ－ＧＭ１０１投与後、少なくとも２年間は追跡される。

様々なＧＭ１ガングリオシドーシスのタイプが別々に分析される。投与の１年後に中間的分析を計画する。データは、早期乳児型（Utz et al. 2017）および後期乳児型（Regier et al. 2015）のＧＭ１ガングリオシドーシス患者の公開された病歴の自然経過データ、ならびに継続中の自然経過研究（ＮＣＴ ００６６８１８７、ＮＣＴ０３３３３２００、ＮＣＴ０００２９９６５）および登録からのデータと比較する。

本研究が完了した後に、すべての患者は、少なくとも３年間の長期フォローアップ研究へと移行するよう依頼される。

選択基準は以下を含む：
１．β－ｇａｌ遺伝子の変異および／または検査室検査によって文書化されたβ－ｇａｌ酵素の欠損
２．治験対象母集団
－ 嚥下能力を有する１２カ月齢未満の早期乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシスを有する小児（栄養管の存在は許容される）
－ 腕だけで支えるか、または支えを用いて座ることができる３歳未満の後期乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシスを有する小児
３．すべての研究関連の手順が実施される前に書面のインフォームドコンセントに署名していること
４．患者の医学的状態が十分に安定しており、治験責任医師の意見により、患者／法定代理人が治験の通院スケジュールおよび他のプロトコールの要件を遵守することができること。

除外基準は以下を含む：
１．発作障害が未制御であること。抗痙攣薬で安定している患者は含めることができる
２．スクリーニング時に総脳体積をＭＲＩで測定した場合に脳の萎縮が４０％を超えること
３．別の治験薬の臨床試験に現在参加中であること
４．過去に遺伝子治療の治験に参加したことがあること
５．造血幹細胞移植の既往歴
６．免疫抑制剤治療による処置が禁忌となる任意の状態
７．腰椎穿刺または槽内注射を不可能にする併発する医学的状態または解剖学的異常の存在
８．ＭＲＩを受けることを不可能にするいずれかの永久的な物品（例えば、金属製装具）の存在
９．科学的厳密性または結果の解釈を混乱させるＧＭ１ガングリオシドーシス以外の医学的状態の既往歴
１０．稀で無関係な重篤な併存疾患、例えば、ダウン症、新生児期の脳室内出血、または極端な低出生時体重（１５００グラム未満）
１１．計画した免疫抑制処置の１カ月前に何らかのワクチン接種を受けたこと
１２．ＨＩＶへの曝露と一致するか、または活動性Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎への感染と一致する血清学
１３．ＣＴＣＡＥ ｖ５．０によるＬＦＴ、ビリルビン、クレアチニン、ヘモグロビン、ＷＢＣ数、血小板数、ＰＴ、およびＰＴＴのグレード２またはそれを超える検査値異常。

治験薬物はＬＹＳ－ＧＭ１０１である。ＬＹＳ－ＧＭ１０１は、注射用液剤として製剤化された、ヒトＧＬＢ１遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスベクターの血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）である。大槽内注射の体積は、４～１２ｍＬの範囲（体重１Ｋｇ当たり０．８ｍＬ）であることが想定される。

各患者は、イメージングガイダンスの下、大槽内への注射を介して単回用量のＬＹＳ－ＧＭ１０１を受ける。注射される薬物体積の半分に対応するＣＳＦの体積は注入前に除去される。コホート１では、患者の用量は３．２Ｅ＋１２ｖｇ／Ｋｇであり、７．３Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬのＣＳＦに対応し、コホート１に対する薬物物質は４．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬの濃度である。注射体積は０．８ｍＬ／ｋｇとなり、４ｍＬ（５ｋｇの３カ月齢の小児に対して）～１２ｍＬ（１５Ｋｇの３６カ月齢の小児に対して）の範囲となる。コホート２では、患者の用量は８．０Ｅ＋１２ｖｇ／Ｋｇであり、１．８Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬのＣＳＦに対応し、コホート２に対する薬物物質は１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬの濃度である。注射体積は０．８ｍＬ／ｋｇとなり、４ｍＬ（５ｋｇの３カ月齢の小児に対して）～１２ｍＬ（１５Ｋｇの３６カ月齢の小児に対して）の範囲となる。

コホート１の４名の最初の患者の投与の１カ月後に、ＤＳＭＢによってデータを精査する。予期せぬ安全性シグナルの非存在下、かつ陽性バイオマーカーの読取り情報の存在下で、研究に追加登録されたすべての患者が処置される。患者の用量は、３６カ月齢（１５Ｋｇ）までの体重に基づいて算出される。

すべての患者は、ベクターＤＮＡに対する一次免疫反応を防止するために、ＬＹＳ－ＧＭ１０１投与の１日前に開始して１０日間、短期間コルチコステロイド（プレドニゾロン１ｍｇ／Ｋｇ／日）を受ける。さらに、β－ｇａｌ導入遺伝子に対する長期免疫反応を防止するために、すべての患者は、手術の７日前に開始され、投与後２カ月間（８週間）のミコフェノール酸モフェチル（経口液剤）；および手術の７日前に開始され、投与後少なくとも６カ月間のタクロリムス（経口懸濁剤用顆粒剤またはカプセル剤）を受ける。６カ月を超える長期免疫抑制の維持は、ベースラインの患者のβ－ｇａｌ酵素レベルに依存する。酵素レベルがヌルの患者は潜在的にタンパク質を作製しないため、免疫抑制剤（タクロリムス）は、導入遺伝子に対する免疫反応を防止するために非常に低用量で継続されるが、一方、残存酵素レベルがヌルではない患者は、投与のおよそ６カ月後に徐々に中断する。漸減期は、体液性および細胞性の免疫応答を定期的に測定し、タクロリムスの安全な中断を保証するためにモニターされる。

第１段階の主要な目的は、２用量のＬＹＳ－ＧＭ１０１薬物製品の安全性／忍容性を評価することである。安全性および忍容性は、予定された全身理学的検査（身長および体重を含む）、神経学的検査、バイタルサイン（体温、脈拍および血圧（ＢＰ）測定を含む）、イメージング（ＭＲＩ、Ｘ線、心臓および腹部超音波検査）、機能評価（ＥＣＧ、ＥＲＰによるＥＥＧ、視覚および聴覚評価）、検査室測定（血液学、血液化学および凝固）、および研究中の有害事象の収集によってモニターされる。安全性評価には、免疫原性の評価：抗ＡＡＶｒｈ．１０抗体、抗β－ｇａｌ抗体、および細胞性免疫の評価（特に免疫抑制が中断された場合）も含まれる。

第１段階の二次的な目的は、本研究の確認期に関する適切な有効性評価項目の決定のための標準化された評価ツールを使用して一連の有効性変数を収集および分析することである。早期乳児型および後期乳児型のＧＭ１ガングリオシドーシス患者に対する主要なおよび二次的な有効性評価項目は、８名の最初の患者が６カ月間のフォローアップに到達した場合に確認される（中間的分析）。これらは、６カ月の時点での中間的分析に基づき、かつ自然経過研究および登録データによって支持される、第１段階の間に収集された有効性変数の中から選択される。確認期に関して選択された評価項目は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの臨床型に基づいて異なることが予想される。
参照文献
Baek, R. C., M. L. Broekman, S. G. Leroy, L. A. Tierney, M. A. Sandberg, A. d'Azzo, T. N. Seyfried, and M. Sena-Esteves. 2010. 'AAV-mediated gene delivery in adult GM1-gangliosidosis mice corrects lysosomal storage in CNS and improves survival', PLoS One, 5: e13468.
Bartus, R. T. 2015. 'Gene therapy for Parkinson's disease: a decade of progress supported by posthumous contributions from volunteer subjects', Neural Regen Res, 10: 1586-8.
Broekman, M. L., R. C. Baek, L. A. Comer, J. L. Fernandez, T. N. Seyfried, and M. Sena-Esteves. 2007. 'Complete correction of enzymatic deficiency and neurochemistry in the GM1-gangliosidosis mouse brain by neonatal adeno-associated virus-mediated gene delivery', Mol Ther, 15: 30-7.
Broekman, M. L., L. A. Tierney, C. Benn, P. Chawla, J. H. Cha, and M. Sena-Esteves. 2009. 'Mechanisms of distribution of mouse beta-galactosidase in the adult GM1-gangliosidosis brain', Gene Ther, 16: 303-8.
Brunetti-Pierri, N., and F. Scaglia. 2008. 'GM1 gangliosidosis: review of clinical, molecular, and therapeutic aspects', Mol Genet Metab, 94: 391-6.
Chen, F., S. Vitry, M. Hocquemiller, N. Desmaris, J. Ausseil, and J. M. Heard. 2006. 'alpha-L-Iduronidase transport in neurites', Mol Genet Metab, 87: 349-58.
Chen, J. C., A. R. Luu, N. Wise, R. Angelis, V. Agrawal, L. Mangini, J. Vincelette, B. Handyside, H. J. Sterling, M. J. Lo, H. Wong, N. Galicia, G. Pacheco, J. Van Vleet, A. Giaramita, S. Fong, S. M. Roy, C. Hague, R. Lawrence, S. Bullens, T. M. Christianson, A. d'Azzo, B. E. Crawford, S. Bunting, J. H. Lebowitz, and G. Yogalingam. 2019. 'Intracerebroventricular enzyme replacement therapy with Beta-Galactosidase reverses brain pathologies due to GM1 gangliosidosis in mice', J Biol Chem.
Conzelmann, E., and K. Sandhoff. 1983. 'Partial enzyme deficiencies: residual activities and the development of neurological disorders', Dev Neurosci, 6: 58-71.
Golebiowski, D., I. M. J. van der Bom, C. S. Kwon, A. D. Miller, K. Petrosky, A. M. Bradbury, S. Maitland, A. L. Kuhn, N. Bishop, E. Curran, N. Silva, D. GuhaSarkar, S. V. Westmoreland, D. R. Martin, M. J. Gounis, W. F. Asaad, and M. Sena-Esteves. 2017. 'Direct Intracranial Injection of AAVrh8 Encoding Monkey beta-N-Acetylhexosaminidase Causes Neurotoxicity in the Primate Brain', Hum Gene Ther, 28: 510-22.
Gray-Edwards, H. L., X. Jiang, A. N. Randle, A. R. Taylor, T. L. Voss, A. K. Johnson, V. J. McCurdy, M. Sena-Esteves, D. S. Ory, and D. R. Martin. 2017. 'Lipidomic Evaluation of Feline Neurologic Disease after AAV Gene Therapy', Mol Ther Methods Clin Dev, 6: 135-42.
Gray-Edwards, H. L., A. S. Maguire, N. Salibi, L. E. Ellis, T. L. Voss, E. B. Diffie, J. Koehler, A. N. Randle, A. R. Taylor, B. L. Brunson, T. S. Denney, R. J. Beyers, A. S. Gentry, A. L. Gross, A. R. Batista, M. Sena-Esteves, and D. R. Martin. 2020. '7T MRI Predicts Amelioration of Neurodegeneration in the Brain after AAV Gene Therapy', Mol Ther Methods Clin Dev, 17: 258-70.
Gray-Edwards, H. L., D. S. Regier, J. L. Shirley, A. N. Randle, N. Salibi, S. E. Thomas, Y. L. Latour, J. Johnston, G. Golas, A. S. Maguire, A. R. Taylor, D. C. Sorjonen, V. J. McCurdy, P. W. Christopherson, A. M. Bradbury, R. J. Beyers, A. K. Johnson, B. L. Brunson, N. R. Cox, H. J. Baker, T. S. Denney, M. Sena-Esteves, C. J. Tifft, and D. R. Martin. 2017. 'Novel Biomarkers of Human GM1 Gangliosidosis Reflect the Clinical Efficacy of Gene Therapy in a Feline Model', Mol Ther, 25: 892-903.
Hadaczek, P., J. L. Eberling, P. Pivirotto, J. Bringas, J. Forsayeth, and K. S. Bankiewicz. 2010. 'Eight years of clinical improvement in MPTP-lesioned primates after gene therapy with AAV2-hAADC', Mol Ther, 18: 1458-61.
Hahn, C. N., M. del Pilar Martin, M. Schroder, M. T. Vanier, Y. Hara, K. Suzuki, and A. d'Azzo. 1997. 'Generalized CNS disease and massive GM1-ganglioside accumulation in mice defective in lysosomal acid beta-galactosidase', Hum Mol Genet, 6: 205-11.
Hayward, C., H. C. Patel, S. G. Manohar, and A. R. Lyon. 2015. 'Gene therapy for GM1 gangliosidosis: challenges of translational medicine', Ann Transl Med, 3: S28.
Hinderer, C., P. Bell, N. Katz, C. H. Vite, J. P. Louboutin, E. Bote, H. Yu, Y. Zhu, M. L. Casal, J. Bagel, P. O'Donnell, P. Wang, M. E. Haskins, T. Goode, and J. M. Wilson. 2018. 'Evaluation of Intrathecal Routes of Administration for Adeno-Associated Viral Vectors in Large Animals', Hum Gene Ther, 29: 15-24.
Hinderer, C., P. Bell, C. H. Vite, J. P. Louboutin, R. Grant, E. Bote, H. Yu, B. Pukenas, R. Hurst, and J. M. Wilson. 2014. 'Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna', Mol Ther Methods Clin Dev, 1: 14051.
Hordeaux, J., C. Hinderer, E. L. Buza, J. P. Louboutin, T. Jahan, P. Bell, J. A. Chichester, A. F. Tarantal, and J. M. Wilson. 2019. 'Safe and Sustained Expression of Human Iduronidase After Intrathecal Administration of Adeno-Associated Virus Serotype 9 in Infant Rhesus Monkeys', Hum Gene Ther, 30: 957-66.
Hordeaux, J., C. Hinderer, T. Goode, E. L. Buza, P. Bell, R. Calcedo, L. K. Richman, and J. M. Wilson. 2018. 'Toxicology Study of Intra-Cisterna Magna Adeno-Associated Virus 9 Expressing Iduronate-2-Sulfatase in Rhesus Macaques', Mol Ther Methods Clin Dev, 10: 68-78.
Hordeaux, J., C. Hinderer, T. Goode, N. Katz, E. L. Buza, P. Bell, R. Calcedo, L. K. Richman, and J. M. Wilson. 2018. 'Toxicology Study of Intra-Cisterna Magna Adeno-Associated Virus 9 Expressing Human Alpha-L-Iduronidase in Rhesus Macaques', Mol Ther Methods Clin Dev, 10: 79-88.
Jarnes Utz, J. R., S. Kim, K. King, R. Ziegler, L. Schema, E. S. Redtree, and C. B. Whitley. 2017. 'Infantile gangliosidoses: Mapping a timeline of clinical changes', Mol Genet Metab, 121: 170-79.
Kasperzyk, J. L., A. d'Azzo, F. M. Platt, J. Alroy, and T. N. Seyfried. 2005. 'Substrate reduction reduces gangliosides in postnatal cerebrum-brainstem and cerebellum in GM1 gangliosidosis mice', J Lipid Res, 46: 744-51.
Leinekugel, P., S. Michel, E. Conzelmann, and K. Sandhoff. 1992. 'Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease', Hum Genet, 88: 513-23.
Martin, D. R., B. A. Rigat, P. Foureman, G. S. Varadarajan, M. Hwang, B. K. Krum, B. F. Smith, J. W. Callahan, D. J. Mahuran, and H. J. Baker. 2008. 'Molecular consequences of the pathogenic mutation in feline GM1 gangliosidosis', Mol Genet Metab, 94: 212-21.
Matsuda, J., O. Suzuki, A. Oshima, Y. Yamamoto, A. Noguchi, K. Takimoto, M. Itoh, Y. Matsuzaki, Y. Yasuda, S. Ogawa, Y. Sakata, E. Nanba, K. Higaki, Y. Ogawa, L. Tominaga, K. Ohno, H. Iwasaki, H. Watanabe, R. O. Brady, and Y. Suzuki. 2003. 'Chemical chaperone therapy for brain pathology in G(M1)-gangliosidosis', Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 15912-7.
McCurdy, V. J., A. K. Johnson, H. L. Gray-Edwards, A. N. Randle, B. L. Brunson, N. E. Morrison, N. Salibi, J. A. Johnson, M. Hwang, R. J. Beyers, S. G. Leroy, S. Maitland, T. S. Denney, N. R. Cox, H. J. Baker, M. Sena-Esteves, and D. R. Martin. 2014. 'Sustained normalization of neurological disease after intracranial gene therapy in a feline model', Sci Transl Med, 6: 231ra48.
Mittermeyer, G., C. W. Christine, K. H. Rosenbluth, S. L. Baker, P. Starr, P. Larson, P. L. Kaplan, J. Forsayeth, M. J. Aminoff, and K. S. Bankiewicz. 2012. 'Long-term evaluation of a phase 1 study of AADC gene therapy for Parkinson's disease', Hum Gene Ther, 23: 377-81.
Regier, D. S., R. L. Proia, A. D'Azzo, and C. J. Tifft. 2016. 'The GM1 and GM2 Gangliosidoses: Natural History and Progress toward Therapy', Pediatr Endocrinol Rev, 13 Suppl 1: 663-73.
Regier, D. S., and C. J. Tifft. 2013. 'GLB1-Related Disorders.' in M. P. Adam, H. H. Ardinger, R. A. Pagon, S. E. Wallace, L. J. H. Bean, K. Stephens and A. Amemiya (eds.), GeneReviews((R)) (Seattle (WA)).
Rochette, A., M. P. Malenfant Rancourt, C. Sola, O. Prodhomme, M. Saguintaah, R. Schaub, N. Molinari, X. Capdevila, and C. Dadure. 2016. 'Cerebrospinal fluid volume in neonates undergoing spinal anaesthesia: a descriptive magnetic resonance imaging study', Br J Anaesth, 117: 214-9.
Sandhoff, K., and K. Harzer. 2013. 'Gangliosides and gangliosidoses: principles of molecular and metabolic pathogenesis', J Neurosci, 33: 10195-208.
Shield, J. P., J. Stone, and C. G. Steward. 2005. 'Bone marrow transplantation correcting beta-galactosidase activity does not influence neurological outcome in juvenile GM1-gangliosidosis', J Inherit Metab Dis, 28: 797-8.
Sopelsa, A. M., M. H. Severini, C. M. Da Silva, P. R. Tobo, R. Giugliani, and J. C. Coelho. 2000. 'Characterization of beta-galactosidase in leukocytes and fibroblasts of GM1 gangliosidosis heterozygotes compared to normal subjects', Clin Biochem, 33: 125-9.
Takaura, N., T. Yagi, M. Maeda, E. Nanba, A. Oshima, Y. Suzuki, T. Yamano, and A. Tanaka. 2003. 'Attenuation of ganglioside GM1 accumulation in the brain of GM1 gangliosidosis mice by neonatal intravenous gene transfer', Gene Ther, 10: 1487-93.
Tomanin, R., A. Zanetti, E. Zaccariotto, F. D'Avanzo, C. M. Bellettato, and M. Scarpa. 2012. 'Gene therapy approaches for lysosomal storage disorders, a good model for the treatment of mendelian diseases', Acta Paediatr.
Weismann, C. M., J. Ferreira, A. M. Keeler, Q. Su, L. Qui, S. A. Shaffer, Z. Xu, G. Gao, and M. Sena-Esteves. 2015. 'Systemic AAV9 gene transfer in adult GM1 gangliosidosis mice reduces lysosomal storage in CNS and extends lifespan', Hum Mol Genet, 24: 4353-64.

Claims (36)

1. 複製欠損アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）由来ベクターであって、以下の５’から３’の順に：
   ａ．プロモーター配列；
   ｂ．ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；
   および
   ｃ．ポリアデニル化（ポリＡ）配列
   を含む発現カセットを含む、ベクター。
2. 前記プロモーター配列が、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列に由来する、請求項１に記載のベクター。
3. 前記ポリＡ配列がヒト成長ホルモン１配列に由来する、請求項１に記載のベクター。
4. 前記発現カセットが、以下の５’から３’の順に：
   ｄ．ＣＡＧプロモーター配列に由来するプロモーター配列；
   ｅ．ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；および
   ｆ．ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来するポリＡ配列
   からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のベクター。
5. 前記発現カセットが、２つのＡＡＶ２末端逆位反復（ＩＴＲ）配列に挟まれており、前記２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列のうちの１つが前記発現カセットの５’に位置し、前記２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列のうちの１つが前記発現カセットの３’に位置する、請求項１～４のいずれか一項に記載のベクター。
6. 前記発現カセットの５’末端に位置する前記ＩＴＲ配列が、配列番号４に従うヌクレオチド配列を含み、前記発現カセットの３’末端に位置する前記ＩＴＲ配列が配列番号５に従うヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のベクター。
7. 前記ＣＡＧプロモーター配列が、配列番号２に従う配列を含む、請求項２に記載のベクター。
8. ヒトβ－ｇａｌをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１に従う配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のベクター。
9. 前記ポリアデニル化（ポリＡ）配列が、配列番号３に従う配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のベクター。
10. 以下を５’から３’の順に以下：
    ｇ．ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；
    ｈ．ＣＡＧプロモーター配列に由来するプロモーター配列；
    ｉ．ヒトβ－ｇａｌまたはその活性バリアントをコードするポリヌクレオチド配列；
    ｊ．ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来するポリＡ配列；ならびに
    ｋ．ＡＡＶ ＩＴＲ配列
    を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のベクター。
11. 配列番号６に従う配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のベクター。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
13. 前記ベクターが、前記組成物中に約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ～約５．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１２に記載の組成物。
14. ＧＭ１ガングリオシドーシスを処置する方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１２～１３のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
15. 前記ベクターまたは組成物が、前記対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ベクターまたは組成物が、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して前記対象に投与される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ベクターまたは組成物が、約０．１ｍＬ／ｋｇ体重～約１．０ｍＬ／ｋｇ体重の体積で前記対象に投与される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ベクターまたは組成物が、約０．４ｍＬ／ｋｇ体重～約０．８ｍＬ／ｋｇ体重の体積で前記対象に投与される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ベクターまたは組成物が、約０．４ｍＬ／ｋｇ体重の体積で前記対象に投与される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ベクターまたは組成物が、約１ｍＬ～約１５ｍＬの体積で前記対象に投与される、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記ベクターまたは組成物が、約２ｍＬ～約１２ｍＬの体積で前記対象に投与される、請求項２０に記載の方法。
22. 脳脊髄液（ＣＳＦ）のある体積が、前記ベクターまたは組成物の投与前に除去される、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記ベクターまたは組成物の投与前に除去される脳脊髄液（ＣＳＦ）の前記体積が、投与される前記ベクターまたは組成物の体積の約半分に対応する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記対象が、約１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重～約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ体重の間の前記ベクターの用量を投与される、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記対象が、約８．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ体重の前記ベクターの用量を投与される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記対象が、約５．０Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦ～約５．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦの前記ベクターの用量を投与される、請求項２４に記載の方法。
27. 前記対象が、約１．８Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ ＣＳＦの前記ベクターの用量を投与される、請求項２４に記載の方法。
28. 免疫抑制レジメンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１４～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記免疫抑制レジメンが、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、およびプレドニゾンを含む、請求項２８に記載の方法。
30. ＧＭ１ガングリオシドーシスの処置を必要とする対象におけるＧＭ１ガングリオシドーシスの処置における医薬として使用するための請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクター。
31. 前記対象の前記脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与するための請求項３０に記載のベクター。
32. 大槽内（ＩＣＭ）注射を介して投与するためのものである、請求項３１に記載のベクター。
33. ＧＭ１ガングリオシドーシスの前記処置における医薬として使用するための、請求項１２または１３に記載の組成物。
34. 前記対象の前記脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与するための、請求項３３に記載の組成物。
35. 前記ベクターが大槽内（ＩＣＭ）注射を介して投与するためのものである、請求項３４に記載の組成物。
36. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクターおよびそれを使用するための指示を含むキット。

Images