JP2024517737A - Ｎｇｙｌ１欠損症を治療する組成物及び方法 - Google Patents

Ｎｇｙｌ１欠損症を治療する組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、ＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含有するｒＡＡＶを投与することにより、対象において機能的ＮＧＬＹ１タンパク質を発現するのに有用な組成物及び方法が開示される。また、本明細書では、それを必要とする対象におけるＮＧＬＹ１遺伝子欠損症を治療する方法が開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１８０，０６５号明細書の利益を主張する。この先に出願された出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の記載
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本願の出願と同時に提出される配列表を含み、「３８１３２＿０００１Ｐ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」というファイル名を含み、２０２２年４月１１日に作製された２８，６７２バイトのサイズであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＮＧＬＹ１欠損症は、ＮＧＬＹ１機能の喪失によって引き起こされる極めて稀な常染色体劣性遺伝疾患である。現在公知である有病率は、米国在住で約３億３，１００万人のうち２７人である。出生時及び早期発達時に発現し、日常の機能に重大な影響を及ぼす極めて重度の小児疾患である。ＮＧＬＹ１タンパク質は分泌タンパク質ではないため、そのアッセイには組織生検が必要であり、その活性についての診断アッセイは存在しない。現在、全エキソーム又は全ゲノム塩基配列決定法が診断を確定する唯一の方法である。
ＮＧＬＹ１欠損症の個人は、症状が極めて重度である。患者の生存には、介護者による日常管理が必要である。表現型では、疾患の提示には、（１）全般的な発達遅延及び／又は知的障害、（２）（低）無涙症、（３）肝トランスアミナーゼの上昇、及び（４）運動亢進性運動障害が含まれる。患者の９０％は決して歩くことができず、早い年齢から歩行器又は車椅子を使用しなければならない。ＮＧＬＹ１登録の一環として調査された患者のほとんど（９４．６％；３５／３７）は言葉を発さず、言葉による表現が可能な患者は、コミュニケーション及び治療のために増大的及び代替的コミュニケーション（ＡＡＣ，augmentative and alternative communication）デバイスに依拠している。適切な栄養を得るためには、介護者によって投与されるマニュアル摂取又は胃瘻チューブ（Ｇチューブ）の使用が必要である。介護者は、毎日の入浴及びトイレのレジメンのあらゆる側面を管理しなければならない。肺炎及び尿路感染症には頻回の入院が必要である。患者の約半数（５１．４％；１８／３７）が入院を要し得る痙攣を経験する。手術は、脊椎癒合、鼠径ヘルニア、気管切開、腎臓の問題を含む複数の問題に対して一般的である。
追加の多系統の臨床所見には、明らかに進行性の脳萎縮及び後天性小頭症；眼球突出、視神経萎縮及び網膜変化を含む眼科症状；便秘；肝腫大及び他の肝臓異常；低コレステロール血症；長さ依存性感覚運動性軸索喪失；筋萎縮；並びに可動性を制限する関節拘縮が含まれる。
Ｇｒａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって同定された６５人の患者には５１のバリアントがある。これらには、ＮＧＬＹ１遺伝子全体に散在するナンセンス、ミスセンス、フレームシフト、及びスプライシング変異、並びに３つの部分的又は完全な遺伝子欠失が含まれる。バリアントは、触媒ドメイン、ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ結合ＰＵＢドメイン（ＩＰＲ０１８９９７）、及びＮ－結合型オリゴ糖鎖のマンノース部分に結合するＰＡＷドメイン（ＩＰＲ００６５８８）（図３）（Zhou X, Zhao G, Truglio JJ, Wang L, Li G, Lennarz WJ, et al. Structural and biochemical studies of the C-terminal domain of mouse peptide-N-glycanase identify it as a mannose-binding module. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(46):17214-17219）に見出される。最もよく報告されているナンセンスバリアントであるｃ．１２０１Ａ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０１Ｔｅｒ）は、ほぼ存在しない転写物に対応する、より重度の病状の前兆となり得る（Lam C, Wolfe L, Need A, Shashi V, Enns G. NGLY1 -related congenital disorder of deglycosylation. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, Stephens K, Amemiya A, editors. GeneReviews(R) [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. 2018 Feb 8）。
Zhou X, Zhao G, Truglio JJ, Wang L, Li G, Lennarz WJ, et al. Structural and biochemical studies of the C-terminal domain of mouse peptide-N-glycanase identify it as a mannose-binding module. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(46):17214-17219 Lam C, Wolfe L, Need A, Shashi V, Enns G. NGLY1 -related congenital disorder of deglycosylation. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, Stephens K, Amemiya A, editors. GeneReviews(R) [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. 2018 Feb 8
ＮＧＬＹ１欠損症に対する公知の治療は現在のところ存在せず、このような治療に当該技術分野において非常に大きな必要性がある。
本明細書に開示される発明は、対象における機能的ＮＧＬＹ１タンパク質の発現を促進する方法であって、該方法は、治療を必要とする対象に、対象の少なくとも中枢神経系（「ＣＮＳ」，central nervous system）（ＣＮＳの外側の組織に発現することがある）においてヒトＮＧＬＹ１を発現するように操作された核酸を含むカプシドを含む有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ，recombinant adeno- associated virus）を投与することを含み、ここで、対象はＮＧＬＹ１欠損症を有する。実施形態では、対象は、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する機能喪失変異を有する２つの内因性ＮＧＬＹ１対立遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、対象は、ＮＧＬＹ１欠損症キャリアであり、１つの機能喪失対立遺伝子を有する。実施形態では、ＮＧＬＹ１を発現するように操作された導入遺伝子を含むｒＡＡＶは、脳室内（ＩＣＶ，intracerebroventricular）投与によって、又は代替的に大槽（cisterna magna）への投与によって投与される。実施形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶ９血清型を有する。ＮＧＬＹ１タンパク質のコード配列は、実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドの存在下で還元を含めてコドン最適化され、配列番号１のヌクレオチド配列を有し得る。本明細書に記載される投与方法は、投与後の適切な期間内にＮＧＬＹ１欠損症の症状及び／又はバイオマーカーの改善、例えば、対象のＣＮＳ又は他の生物学的試料におけるＧｌｃＮＡｃ－アスパラギン（ＧＮＡ，GlcNAc-Asparagine）の蓄積の減少、１若しくは２以上のＮＧＬＹ１欠損症の徴候又は症状を定量することができるか又はそれを示す行動指標、痙攣の頻度、発達遅延、神経認知機能、ジストニア、多発神経障害、異常発汗応答、歩行異常、及び運動機能をもたらす。
また、本明細書では、ＮＧＬＹ１欠損症を有する対象を治療する方法が開示され、方法は、投与がＩＣＶ投与である実施形態では、対象のＣＮＳにおいて少なくともＮＧＬＹ１を発現するように操作された核酸を含有するカプシドを含む有効量のｒＡＡＶを対象に投与することを含む（代替的に、ｒＡＡＶは大槽を介して投与され得る）。
本発明の一実施形態によれば、対象の少なくともＣＮＳにおけるＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ（ＧＮＡ）の蓄積を減少させる方法が本明細書に開示され、方法は、対象のＣＮＳにおける発現のための調節エレメントに作動可能に連結されたＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含む、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含み、対象はＮＧＬＹ１欠損症を有し、特定の実施形態では、対象は、２つの機能喪失ＮＧＬＹ１対立遺伝子を有し（又はホモ接合であり）、又は代替的に、対象は、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する機能喪失変異を有する少なくとも１つの内在性ＮＧＬＹ１対立遺伝子を含み、例えば、ＮＧＬＹ１欠損症のキャリアであり、実施形態では、ｒＡＡＶはＩＣＶ投与によって、あるいは代替的に大槽を介して投与される。実施形態では、対象は、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する機能喪失変異を有する２つの内因性ＮＧＬＹ１対立遺伝子を含む。
本発明の一実施形態によれば、本明細書では、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ，cerebrospinal fluid）及び／又は血漿中のＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ（ＧＮＡ）レベルをモニタリングする方法が開示され、方法は、対象のＣＮＳにおける発現のための調節エレメントに作動可能に連結されたＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含む治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与する前に、ＣＳＦ及び／又は血漿を含む第１の試料中のＧＮＡレベルを測定し、ｒＡＡＶ投与後の対象からのその後の試料中のＧＮＡレベルを比較し、ｒＡＡＶの有効性を決定することを含み、ここで、対象は、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する機能喪失変異を有する少なくとも１つの内在性ＮＧＬＹ１対立遺伝子を含み、実施形態では、ｒＡＡＶは、ＩＣＶ投与によって、又は代替的に大槽を介して投与される。実施形態では、対象は、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する機能喪失変異を有する２つの内因性ＮＧＬＹ１対立遺伝子を含む。
本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、少なくとも中枢神経系（「ＣＮＳ」）においてＮＧＬＹ１を発現するように操作された核酸を含むｒＡＡＶである。別の実施形態では、ＮＧＬＹ１をコードする核酸は、配列番号４のプロモーター及び配列番号５を有するイントロンをさらに含む。配列番号８のヌクレオチド配列（ＣＡＧプロモーター及びポリＡシグナル配列に作動可能に連結される、配列番号１のヌクレオチド配列を含む）又は配列番号９（隣接するＩＴＲ配列を有する構築物全体）を有する遺伝子発現カセット構築物が提供される。
本明細書に開示される本発明のさらに別の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに組み込まれるＮＧＬＹ１を発現する核酸分子がある。
本発明の別の実施形態では、本発明のｒＡＡＶを含む宿主細胞がある。
ＧＳ－１００（例えば、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるｈＮＧＬＹ１（配列番号１）のコドン最適化された全長バージョン、及び隣接するＩＴＲ配列を有するポリＡシグナル（図８参照）を含むｒＡＡＶ９ベクター）ベクターＤＮＡの生体内分布を示す図である。 ＩＣＶ ＧＳ－１００投与が、ＮＧＬＹ１欠損症の動物モデルにおいてＣＮＳ ｈＮＧＬＹ１（ヒトＮＧＬＹ１）タンパク質発現をもたらすことを示す図である。 ＧＮＡがＮＧＬＹ１欠損生物において検出され得ることを示す図である。 ＧＳ－１００投与がＧＮＡバイオマーカーレベルを減少させたことを示す図である。 ＧＮＡバイオマーカー減少が組織及び体液中で相関することを示す図である。 ～ ＧＳ－１００がＮｇｌｙ１欠損ラット行動欠陥を改善することを示す図である。図６Ａは、ＧＳ－１００処置が、ラットがロータロッド上に落下するまでの時間を改善することを示す。図６Ｂは、ＧＳ－１００処置のＩＣＶ投与が後ろ足立ちを増加させることを示す。 ＧＳ－１００ベクターゲノム及びｈＮＧＬＹ１ ｍＲＮＡ発現が海馬におけるＧＮＡ組織濃度と相関することを示す図である。図７はまた、後ろ足立ち行動の改善がＧＳ－１００処置後のＣＳＦ及び組織ＧＮＡレベルの減少と関連することを示す。 ＡＡＶ９ＮＧＬＹ１発現ベクターＧＳ－１００の略図である。逆方向末端反復（ＩＴＲ，inverted terminal repeat）、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリＢ－アクチンプロモーター組み合わせ（ＣＡＧ，CMV enhancer/Chicken B-actin promoter）、コドン最適化ヒトＮＧＬＹ１ ｃＤＮＡ（ｈＮＧＬＹ１ ｃＤＮＡ）、変異したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ－ｍｕｔ６）；及びウサギベータ－グロビンポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）。 ＧＳＬ－１４（例えば、ＡＡＶ－ＮＧＬＹ１；減少したＣｐＧ含有量のために最適化されたｈＮＧＬＹ１ ｃＤＮＡコドン、及びＣＡＧプロモーターを用いて含まれるＶ５タグ）の静脈内投与後のＧＮＡ蓄積の減少傾向を示す図である。
本発明は、本発明の以下の詳細な説明、図面及び本明細書に含まれる実施例を参照することによって、より容易に理解することができる。
本明細書で使用される用語は、本発明の特定の態様を説明する目的であり、限定することを意図しない。
本明細書に記載されるすべての刊行物は、引用される刊行物に関連する方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において検討される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなる記述も、本発明が先行発明によりこのような公開に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書で提供される公開日は、実際の公表日とは異なる場合があり、これは、独立した確認を必要とする場合がある。
定義
明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈が明白に他のことを指示しない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される単語「又は」とは、特定のリストのいずれか１つのメンバーを意味し、また、そのリストのメンバーのいずれかの組み合わせを含む。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される語句「及び／又は」は、そのように結合されたエレメントの「いずれか又は両方」、すなわち、場合によっては接続的に存在し、他の場合には選言的に存在するエレメントを意味すると理解されるべきである。他のエレメントは、明確に別段の指示がない限り、具体的に特定されたそれらのエレメントと関連するか否かを問わず、「及び／又は」の箇条によって具体的に特定されたエレメント以外に、存在していてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、一実施形態では、「含んでいる」などのオープンエンド言語とともに使用される場合、ＢなしのＡ（Ｂ以外のエレメントを含んでいてもよい）；別の実施形態では、ＡなしのＢ（Ａ以外のエレメントを含んでいてもよい）；さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（他のエレメントを含んでいてもよい）などを指すことができる。
本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」とは、ある生物から別の生物、すなわち宿主生物への遺伝子操作技術によってゲノムに移入されたか若しくは人為的に導入された遺伝子又は遺伝物質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子発現」は、宿主生物における導入遺伝子の機能的産物の出現の量及び時期の制御に関する。
本明細書で使用される「内因性」という用語は、生物体、組織又は細胞内に由来する物質及びプロセスを指す。
「阻害する」、「阻害すること」及び「阻害」とは、遺伝子発現、活性、応答、状態、疾患、又は他の生物学的パラメーター（例えば、ＧＮＡ）を軽減又は低下させることを意味する。これには、限定されないが、活性、応答、状態、又は疾患の完全なアブレーションが含まれ得る。これはまた、例えば、野生型レベル又は対照レベルと比較して、遺伝子発現、活性、応答、状態、又は疾患における１０％の阻害又は減少を含み得る。したがって、一部の態様では、阻害又は減少は、天然レベル又は対照レベルと比較した場合、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又はその間の任意の減少量であり得る。一部の態様では、阻害又は減少は、野生型又は対照レベルと比較した場合、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、又は９０～１００％である。一部の態様では、阻害又は減少は、野生型又は対照レベルと比較した場合、０～２５、２５～５０、５０～７５、又は７５～１００％である。
「促進する」、「促進」、及び「促進すること」とは、活性、応答、状態、疾患、又は他の生物学的パラメーターの増加を指す。これには、限定されないが、活性、応答、状態、又は疾患の開始が含まれ得る。これにはまた、例えば、野生型レベル又は対照レベルと比較した場合、活性、応答、状態、又は疾患の１０％の増加が含まれ得る。したがって、一部の態様では、増加又は促進は、天然レベル又は対照レベルと比較した場合、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％若しくはそれ以上、又はその間の任意の促進量であり得る。一部の態様では、増加又は促進は、野生型又は対照レベルと比較した場合、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、又は９０～１００％である。一部の態様では、増加又は促進は、野生型又は対照レベルと比較した場合、０～２５、２５～５０、５０～７５、若しくは７５～１００％又はそれ以上、例えば、２００、３００、５００、又は１０００％以上である。一部の態様では、増加又は促進は、野生型又は対照レベルと比較した場合、１００％を超えることができ、例えば、野生型又は対照レベルと比較した場合、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００％又はそれ以上である。
用語「作動可能に連結された」とは、核酸と別の核酸配列の機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳停止部位、並びに他のシグナル配列は、全体として構築物の機能的活性を付与するために他の配列に連結される核酸配列の例である。例えば、ＤＮＡの転写制御エレメントへの作動可能な連結は、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的及び機能的関係を指し、そのため、このようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、及び転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始される。
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、又は「プロモーター配列」は同等物であり、本明細書で使用される場合、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された場合に、所望のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、所望のヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）（例えば、構造遺伝子の転写開始部位の近位）に位置するが、プロモーターと転写される配列の間に介在配列が任意に含まれ、ｍＲＮＡへの転写がそれを制御し、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写開始のための他の転写因子による特異的結合部位を提供するため、必ずしもすぐ上流である必要はない。
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、投与の標的、例えばヒトを指す。したがって、開示される方法の主題は、例えば、哺乳動物、魚、鳥、爬虫類、又は両生類などの脊椎動物であり得る。用語「対象」はまた、飼育動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）を含む。一部の態様では、対象は哺乳動物であり得る。一部の態様では、対象はヒトであり得る。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。したがって、成人、小児、青年及び新生児の対象、並びに胎児は、男性であるか女性であるかを問わず、本発明の範囲内である。
本明細書で使用される場合、用語「患者」とは、疾患又は障害を患っている対象を指す。用語「患者」には、ヒト及び獣医学的対象が含まれる。本発明の方法の一部の態様では、「患者」は、例えば、本発明の遺伝子治療ＮＧＬＹ１組成物を次に投与する前に、ＮＧＬＹ１欠損症の治療が必要であると診断されている。本発明の方法の一部の態様では、ＮＧＬＹ１欠損症の治療を必要とする患者は、ＮＧＬＹ１遺伝子における機能変異の喪失についてヘテロ接合体であり得るか、又はＮＧＬＹ１遺伝子における機能変異の喪失についてホモ接合体であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「正常」とは、ＮＧＬＹ１欠損症を有さないか、若しくはＮＧＬＹ１欠損症を発症する感受性が増加しない個体、試料又は対象を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」又は「治療」とは、（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症を）治癒させ、軽快させ、安定化することを目的とする患者の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療、すなわち、疾患、病理学的状態、又は障害の改善に特に向けた治療を含み、また、因果的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、又は障害の原因の除去に向けた治療を含む。さらに、この用語には、緩和治療、すなわち、疾患、病理学的状態、又は障害の治癒以外の症状の軽減のために設定された治療；予防的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、又は障害の発症を最小限にするか、部分的若しくは完全に阻害することに向けた治療；並びに、サポート治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、又は障害の改善に向けた別の特定の療法を補足するために採用される治療；並びに、サポート治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、又は障害の改善に向けた別の特定の療法を補足するために採用される治療が含まれる。様々な態様では、この用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含む対象の任意の治療を包含し、（ｉ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止すること；又は（ｉｉ）疾患（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。
本明細書で使用される場合、用語「予防する」又は「予防すること」とは、特に事前措置により、何かが起こることを排除し、回避し、取り除き、食い止め、停止させ、又は妨げることを意味する。特に別段の指示がない限り、減少、阻害又は予防が本明細書で使用される場合、他の２つの用語の使用もまた明示的に開示されることが理解される。例えば、「予防する」とは、ＮＧＬＹ１欠損症を発症する感受性が増加した対象がＮＧＬＹ１欠損症を発症する機会を最小限にすることを意味する。本明細書で使用される文脈において、予防は、ＮＧＬＹ１欠損症に関連するすべての後遺症を完全に排除する必要はなく、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する１又は２以上の症状の発現のいずれかの減少を包含する。
本明細書では、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する１若しくは２以上の症状を減少させるか、又はＮＧＬＹ１欠損症に関連する１若しくは２以上の症状の発生を予防するために、ＮＧＬＹ１欠損症の対象を治療するための治療様式、好ましくはＡＡＶ９を媒介したＮＧＬＹ１遺伝子治療（例えば、ＧＳ－１００）が開示される。ＧＳ－１００の開発には、１）ＮＧＬＹ１酵素活性の欠損と一致するＮＧＬＹ１欠損症に対する信頼できるバイオマーカーの同定、及び２）全身とＣＮＳ／ＰＮＳ疾患の特徴の両方を示す動物疾患モデルの使用が含まれた。
ＮＧＬＹ１遺伝子は、小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）経路に関与する保存された細胞質デグリコシラーゼであるＮ－グリカナーゼをコードする。ＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ結合で、ミスフォールドのタンパク質のアスパラギン残基からＮ－グリカンを切断する。ＮＧＬＹ１が存在しない場合、このＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ結合は無傷のままであり、ＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ（アスパルチルグルコサミン又はＧＮＡ）のようなＡｓｎ－グリカン代謝産物の細胞質蓄積をもたらすことがある。細胞におけるＮＧＬＹ１活性の喪失は、タンパク毒性ストレス応答の障害及びエネルギー代謝の欠損をもたらす。ラットにおけるＮＧＬＹ１の操作された喪失は、患者において観察されるものと同様に、早期生存率の低下、重度の神経変性表現型、末梢神経系及び中枢神経系の病理学的異常をもたらす。ＧＮＡは、ＮＧＬＹ１の活性に直接関連する疾患のバイオマーカーとしても使用することができ、本明細書に開示されるように、患者とＮｇｌｙ１欠損ラット試料の両方において上昇することが見出された。
組成物
核酸。本明細書では、プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの導入遺伝子を含む核酸が開示され、ここで、導入遺伝子は、ＮＧＬＹ１（Ｎ－グリカナーゼ１；ＧＥＮＥ ＩＤ：５５７６８）をコードする。ＮＧＬＹ１遺伝子は、Ｎ－グリカナーゼ（ＥＣ ３．５．１．５２）をコードし、プロテアソームによってタンパク質が分解される前に、グリカン鎖を切断することによって、ミスフォールドしたＮ結合型糖タンパク質の脱グリコシル化を触媒する高度に保存された酵素である。ＮＧＬＹ１は、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ，endoplasmic reticulum-associated degradation）経路の細胞質成分であり、ミスフォールドした糖タンパク質を同定し、分解する。
ＮＧＬＹ１遺伝子は、ＮＭ００１１４５２９３．１、ＮＭ００１１４５２９４．１、ＮＭ００１１４５２９５．１、又はＮＭ０１８２９７．４のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡをコードすることができる。ＮＧＬＹ１遺伝子は、アミノ酸配列ＮＰ００１１３８７６５．１、ＮＰ００１１３８７６６．１、ＮＰ００１１３８７６７．１又はＮＰ０６０７６７．２を有するタンパク質をコードすることができる。本発明の一部の実施形態では、ＮＧＬＹ１遺伝子は、例えば、ヒトなどの哺乳動物における発現用にコドンを最適化される。本開示に記載されるすべてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に対応する配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、本明細書に提供されるＤＮＡ配列は、二本鎖ＤＮＡ配列を形成するための逆相補物を含むことができ、又は本明細書に開示される配列の逆相補物であり得る。
一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードする単離された核酸は、以下の配列を含む：
ＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣａＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＡＴＣＣＡＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＴＡＣＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＡＴＡＣＣＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＴＡＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧａＧＧＴＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＴＧＴＧＡ（配列番号１）
一部の実施形態では、ＮＧＬＹ１をコードする核酸配列は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号１に示されるＮＧＬＹ１遺伝子とは異なる最大２０ヌクレオチドを含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１遺伝子は、配列番号１に示されるＮＧＬＹ１遺伝子とは異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号１に示されるＮＧＬＹ１遺伝子とは異なる２０を超えるヌクレオチドを含む。
一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードする核酸配列は、配列番号１と比べて挿入を含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードする核酸配列は、フレームシフト変異を導入しない配列番号１と比べて挿入を含む。一部の態様では、配列番号１に対する核酸配列への挿入は、３ヌクレオチドの倍数（例えば、３、６、９、１２、１５、１８など）の挿入を含む。一部の態様では、配列番号１に対する核酸配列の挿入は、結果として生じるＮＧＬＹ１タンパク質のアミノ酸残基の総数の増加（例えば、１～３、１５、３～１０、５～１０、５～１５、又は１０～２０アミノ酸残基の増加）をもたらす。
一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードする核酸配列は、配列番号１と比べて欠失を含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードする核酸配列は、フレームシフト変異を導入しない配列番号１と比べて欠失を含む。一部の態様では、配列番号１に対する核酸配列の欠失は、３ヌクレオチドの倍数（例えば、３、６、９、１２、１５、１８など）の欠失を含む。一部の態様では、配列番号１に対する核酸配列の欠失は、結果として生じるＮＧＬＹ１タンパク質のアミノ酸残基の総数の減少（例えば、１～３、１～５、３～１０、５～１０、５～１５、又は１０～２０アミノ酸残基の減少）をもたらす。
一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードする核酸配列は、コドン最適化された配列（例えば、哺乳動物細胞における発現のために最適化されたコドン）である。一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードするコドン最適化された配列は、コドン最適化されていない野生型配列と比べて減少したＧＣ含量を含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードするコドン最適化された配列は、コドン最適化されていない野生型配列と比べた、ＧＣ含量の１～５％、３～５％、３～１０％、５～１０％、５～１５％、１０～２０％、１５～３０％、２０～４０％、２５～５０％、又は３０～６０％減少を含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードするコドンを最適化された配列は、コドン最適化されていない野生型配列と比べて、より少ないグアニン及び／又はシトシン核酸塩基を含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードするコドンを最適化された配列は、コドン最適化されていない野生型配列と比べて、１～５、３～５、３～１０、５～１０、５～１５、１０～２０、１５～３０、２０～４０、２５～５０、又は３０～６０少ないグアニン及び／又はシトシン核酸塩基を含む。一部の態様では、ＮＧＬＹ１をコードするコドン最適化された配列は、コドン最適化されていない野生型配列と比べて、より少ないＣｐＧジヌクレオチドアイランドを含む。一部の実施形態では、ＮＧＬＹ１をコードするコドン最適化された配列は、コドン最適化されていない野生型配列と比べて１～３、３～５、３～１０、５～１０、５～１５、１０～２０、１５～３０、２０～４０、２５～５０、又は３０～６０少ないＣｐＧジヌクレオチドアイランドを含む。具体的な実施形態では、ＮＧＬＹ１をコードするヌクレオチド配列は配列番号１である。
プロモーター。本明細書において開示される構築物において、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、ＮＧＬＹ１タンパク質をコードする核酸は、特にＣＮＳ細胞において、ＮＧＬＹ１をコードする配列の直接発現のためにプロモーターに作動可能に連結される。一部の態様では、プロモーターは、構成性プロモーター、例えば、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ，chicken beta-actin）プロモーター、レトロウイルスロース肉腫ウイルス（ＲＳＶ，Rous sarcoma virus）ＬＴＲプロモーター（ＲＳＶエンハンサーを伴ってもよい）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ，cytomegalovirus）プロモーター（ＣＭＶエンハンサーを伴ってもよい）［例えば、Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)を参照されたい］、ＣＭＶ増強ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ，chicken β-actin）、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、（３アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ，phosphoglycerol kinase）プロモーター、又はＥＦ１ａプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］であり得る。一部の態様では、プロモーターは、増強ニワトリβ－アクチンプロモーターであり得る。一部の態様では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターであり得る。一部の態様では、プロモーターは、ＣＢ６プロモーターであり得る。一部の態様では、プロモーターは、ＪｅＴプロモーターであり得る。一部の態様では、プロモーターは、ＣＢプロモーターであり得る。
一部の態様では、ＣＢプロモーターは、以下の配列を含む：
ＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧ（配列番号２）
一部の態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因性に供給される化合物、温度などの環境因子、又は特定の生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在、又は複製細胞のみによって調節することができる。誘導性プロモーター及び誘導性システムは、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄを含む、種々の商業的供給源から入手可能である。多くの他のシステムが記載されており、当業者に容易に選択可能である。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ，metallothionine）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ，dexamethasone）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ，mouse mammary tumor virus）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）；テトラサイクリン抑制性システム（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）；テトラサイクリン誘導性システム（Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)、さらにはHarvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)を参照されたい）；ＲＵ４８６誘導性システム（Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及びWang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)）；及びラパマイシン誘導性システム（Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）が挙げられる。有用であり得るさらに他のタイプの誘導性プロモーターには、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、又は複製細胞のみによって調節されるものが含まれる。
一部の態様では、導入遺伝子（例えば、ＮＧＬＹ１）用の天然プロモーターを使用することができる。一部の態様では、導入遺伝子の発現が天然の野生型ＮＧＬＹ１遺伝子（例えば、変異していないＮＧＬＹ１遺伝子）の発現を模倣すべきであることが望ましい場合には、天然プロモーターを使用することができる。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的若しくは発生的に、又は組織特異的な様式で、又は特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない場合に使用することができる。一部の態様では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントはまた、天然発現を模倣するために使用することができる。
一部の態様では、プロモーターは、神経組織における導入遺伝子発現を駆動する。一部の態様では、本開示は、導入遺伝子に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを作動可能に含む核酸を提供する。本明細書で使用される場合、「組織特異的プロモーター」とは、他の細胞型と比べて特定の細胞型における遺伝子発現を優先的に調節する（例えば、駆動又は上方制御する）プロモーターを指す。細胞型特異的プロモーターは、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、肝臓細胞（例えば、肝細胞）、心臓細胞、筋肉細胞などの任意の細胞型に特異的であり得る。組織特異的プロモーターの例としては、限定されないが、肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ，thyroxin binding globulin）プロモーター、インスリンプロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ，creatine kinase）プロモーター、ａ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ，a-myosin heavy chain）プロモーター、又は心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ，cardiac Troponin T）プロモーターが挙げられる。他の例示的プロモーターには、ベータアクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ，alpha-fetoprotein）プロモーター（Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)）、骨オステオカルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、ＣＤ２プロモーター（Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）、及び免疫グロブリン重鎖プロモーターが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリッドプロモーター」とは、構築物が人為的に配置された２又は３以上の調節エレメントを含むＲＮＡ転写物（例えば、導入遺伝子によりコードされるものを含む転写物）の転写を駆動することができる調節構築物を指す。典型的には、ハイブリッドプロモーターは、最小プロモーターである少なくとも１つのエレメント、及び１若しくは２以上の転写調節エレメントを含むエンハンサー配列又はイントロン性、エクソン性、又はＵＴＲ配列を有する少なくとも１つのエレメントを含む。ハイブリッドプロモーターがエクソン性、イントロン性、又はＵＴＲ配列を含む一部の態様では、このような配列（複数可）は、転写物の転写を調節する（例えば、増強する）調節エレメントも含有しながら、ＲＮＡ転写物の上流部分をコードすることができる。一部の態様では、ハイブリッドプロモーターの２又は３以上のエレメントは、互いに対して異種源由来であり得る。一部の態様では、ハイブリッドプロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター由来の第１の配列及びＣＭＶエンハンサーの第２の配列を含む。一部の態様では、ハイブリッドプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー由来の第１の配列、及びニワトリベータ－アクチンプロモーターからの第２の配列を含む。一部の態様では、ハイブリッドプロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター由来の第１の配列、及びニワトリベータ－アクチン遺伝子のイントロンからの第２の配列を含む。一部の態様では、ハイブリッドプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー配列に融合されたニワトリベータ－アクチンプロモーターからの第１の配列、及びニワトリベータ－アクチン遺伝子のイントロンからの配列を含む。一部の態様では、ハイブリッドプロモーターは、ＣＢ６プロモーターを含む。一部の態様では、ハイブリッドプロモーターは、ＪｅＴプロモーターを含む。一部の態様では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターであり得る。一部の態様では、ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー配列及びＣＢプロモーター配列を含む。一部の態様では、ＣＭＶエンハンサー配列は、以下の配列を含む：
ＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣ（配列番号３）
一部の態様では、ＣＡＧプロモーターは、以下の配列（逆相補物を有する二本鎖ＤＮＡ配列を含む）を含む。
ＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧ（配列番号４）
本明細書に開示されるＮＧＬＹ１発現構築物において、ＮＧＬＹ１をコードする配列、例えば配列番号１は、配列番号４であるＣＡＧ「プロモーター」又は調節配列に作動可能に連結される。
一部の態様では、ベクターは、ベクターをトランスフェクトされるか、又は本開示により産生されるウイルスに感染された細胞内でのその転写、翻訳及び／又は発現を可能にする様式で、導入遺伝子のエレメントと作動可能に連結される従来の制御エレメントをさらに含むことができる。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ，polyadenylation）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；及び所望により、コードされた生成物の分泌を増強する配列が含まれる。天然、構成的、誘導性及び／又は組織特異的であるプロモーターを含む多数の発現制御配列が当該技術分野において公知であり、利用することができる。
ある特定の実施形態では、ＮＧＬＹ１をコードするヌクレオチド配列を含む構築物は、作動可能に連結され、コード配列に対して５’であるイントロン配列を含む。特に、イントロン配列はキメライントロンであり得る。一部の態様では、キメライントロンは、ニワトリベータ－アクチン遺伝子由来の核酸配列、例えば、ニワトリベータ－アクチン遺伝子のイントロン１由来の非コードイントロン配列を含む。一部の態様では、ニワトリベータ－アクチン遺伝子のイントロン配列は、約５０～約１５０ヌクレオチド長（例えば、５０～１５０ヌクレオチドの間の任意の長さ、その両端を含む）の範囲である。一部の態様では、ニワトリベータ－アクチン遺伝子のイントロン配列は、約１００～１２０（例えば、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、又は１２０）ヌクレオチド長の範囲である。一部の態様では、キメライントロンは、１又は２以上の非翻訳配列（例えば、プロモーター配列とキメライントロン配列の間に位置する非翻訳配列、及び／又はキメライントロンと導入遺伝子配列の最初のコドンの間に位置する非翻訳配列）に隣接することができる。一部の態様では、１又は２以上の非翻訳配列の各々は、ウサギベータ－グロブリン遺伝子由来の非コード配列（例えば、ウサギベータ－グロブリンエクソン１、エクソン２などからの非翻訳配列）であり得る。ある特定の実施形態では、イントロン配列は、以下の通りである（これは、ＤＮＡ配列の一方の鎖であり、二本鎖配列を形成するのと同様に、逆相補体を含み得る）：
ＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号５）
一部の態様では、ｒＡＡＶは、転写後応答エレメントを含む。本明細書で使用される場合、用語「転写後応答エレメント」とは、転写された場合、遺伝子の発現を増強する三次構造をとる核酸配列を指す。転写後調節エレメントの例には、限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ，woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）、マウスＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ，RNA transport element）、シミアンレトロウイルス１型（ＳＲＶ－１，simian retrovirus type 1）の構成的輸送エレメント（ＣＴＥ，constitutive transport element）、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス（ＭＰＭＶ，Mason-Pfizer monkey virus）由来のＣＴＥ、及びヒト熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０ ５’ＵＴＲ）の５’非翻訳領域が含まれる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。一部の態様では、ＷＰＲＥは、ミュータントＷＲＰＥであり得る。一部の態様では、ＷＰＲＥは、以下の配列を含む：
ＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号６）
一部の態様では、ポリアデニル化配列は、導入遺伝子配列の後、及び場合により３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に、挿入することができる。本開示において有用なｒＡＡＶ構築物はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子の間に位置するイントロンを含むことができる。ある特定の実施形態では、ポリＡシグナル配列は、以下のヌクレオチド配列を有するウサギベータグロビンポリＡ配列である：
ＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧ（配列番号７）
本明細書に提供されるある特定の実施形態では、遺伝子発現カセット構築物は、以下のように配列されたエレメントを含むか又はそれらからなる：
ＣＡＧプロモーター－キメライントロン配列－コドン最適化されたＮＧＬＹ１コード配列（配列番号１）－ＷＰＲＥ－Ｍｕｔ６配列－ウサギベータグロビンポリＡシグナル配列。この構築物は、図８に示される。ＣＡＧプロモーターからポリＡシグナル配列への遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列は、以下の通りである。
ＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＡＴＣＣＡＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＴＡＣＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＡＴＡＣＣＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＴＡＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧ（配列番号８）
組換え型ＡＡＶ。一部の態様では、本明細書に開示される単離された核酸は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。一部の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、最小限、導入遺伝子及びその調節配列、並びに５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）で構成され得る。カプシドタンパク質にパッケージングされ、選択された標的細胞に送達され得るのは、この組換えＡＡＶベクターである。一部の態様では、導入遺伝子は、所望のポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列と異種の核酸配列であり得る。一部の態様では、核酸コード配列は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で、調節成分に作動可能に連結され得る。
一部の態様では、本明細書に記載される単離された核酸は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む領域（例えば、第１の領域）、又はそのバリアント、及びＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含む第２の領域を含む。単離された核酸（例えば、組換えＡＡＶベクター）は、カプシドタンパク質にパッケージングされ、対象に投与され、及び／又は選択された標的細胞に送達され得る。導入遺伝子はまた、例えば、タンパク質及び／又は発現制御配列（例えば、ポリＡテール）をコードする領域を含み得る。
また、本明細書では、単一のシス作用性野生型ＩＴＲを含むベクターが開示される。一部の態様では、ＩＴＲは５’ＩＴＲであり得る。一部の態様では、ＩＴＲは３’ＩＴＲであり得る。ＩＴＲ配列は約１４５ｂｐ長である。一部の態様では、ＩＴＲ（複数可）をコードする全配列を分子中で用いることができるが、これらの配列のある程度の軽微な改変は許容される。一部の態様では、ＩＴＲは、その末端分解部位（ＴＲ，terminal resolution site）で変異され得、ＴＲが変異されたベクター末端での複製を阻害し、自己相補的ＡＡＶの形成をもたらす。一部の態様では、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントを５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列及び３’ヘアピン形成ＲＮＡ配列に隣接させることができる、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドを使用することができる。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶタイプを含む任意の公知のＡＡＶから得ることができる。一部の態様では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及び／又はＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ配列であり得る。一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列はＡＡＶ２である。
ある特定の態様では、導入遺伝子を含有する組換えＡＡＶゲノムは、以下のエレメント：ＡＡＶ２ＩＴＲ－ＣＡＧプロモーター－ＮＧＬＹ１コード配列－ポリＡシグナル配列－ＡＡＶ２ＩＴＲ配列を含有する。特定の態様では、構築物は、イントロン及び／又はＷＰＲＥ配列をさらに含む。さらなる具体的な実施形態では、構築物は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列－ＣＡＧプロモーター－イントロン配列－ＮＧＬＹ１コドンを最適化されたコード配列－ＷＰＲＥ Ｍｕｔ６配列－ウサギベータグロビンポリＡシグナル配列－ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含有する。特定の実施形態では、構築物のヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＴＴＣＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＡＴＣＣＡＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＴＡＣＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＡＴＡＣＣＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＴＡＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号９）
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、ＮＧＬＹ１タンパク質又はその一部をコードする核酸配列を含む自己相補的ベクターであり得る。
特定の態様では、ｒＡＡＶはＡＡＶ９血清型である。ＣＮＳ細胞に対する指向性を有する他の血清型もまた使用され得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドのアミノ酸配列を有するか、又はＡＡＶ９カプシドと９９％、９８％、９５％、９０％若しくは８５％同一であるカプシドを有する。ＡＡＶ９カプシドは、以下のようなアミノ酸配列を有する：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷ ＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲ ＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰ
ＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤ ＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹ ＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤ
ＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡ ＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤ ＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹ
ＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦ ＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦ ＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱ
ＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧ ＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰ ＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰ
ＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧ ＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲ ＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥ
ＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥ ＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳ ＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰ
ＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧ ＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣ ＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩ
ＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰ ＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩ ＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮ
ＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰ ＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨ ＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲ
ＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰ ＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩ ＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧ
ＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳ ＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹ ＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨ
ＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤ ＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬ ＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧ
ＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦ ＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮ ＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶ
ＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱ ＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩ ＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴ
ＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴ ＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮ ＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰ
ＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳ ＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥ ＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡ
ＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰ ＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧ ＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳ
ＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲ ＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩ ＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮ
ＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶ ＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱ ＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧ
ＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲ ＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡ ＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨ
ＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭ ＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫ ＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴ
ＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦ ＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳ ＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥ
ＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱ ＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮ ＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶ
ＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲ ＹＬＴＲＮＬ（配列番号１０）
一部の態様では、本明細書に記載される単離された核酸及び／又はｒＡＡＶは、標的組織（例えば、ＣＮＳ）への単離された核酸及び／又はｒＡＡＶの標的化を増強するために改変及び／又は選択され得る。改変及び／又は選択の非限定的な方法としては、ＡＡＶカプシド血清型（例えば、ＡＡＶ９）、組織特異的プロモーター、及び／又は標的ペプチドが挙げられる。一部の態様では、本明細書に開示される単離された核酸及びｒＡＡＶは、ＣＮＳ組織への標的化が増強されたＡＡＶカプシド血清型（例えば、ＡＡＶ９）を含むことができる。一部の態様では、本明細書に記載される単離された核酸及びｒＡＡＶは、組織特異的プロモーターを含むことができる。一部の態様では、本明細書に記載される単離された核酸及びｒＡＡＶは、ＣＮＳ組織及び組織特異的プロモーターへの標的化が増強されたＡＡＶカプシド血清型を含むことができる。ＡＡＶ９はＣＮＳ組織を標的化するが、ｒＡＡＶ９ベクターはまた、他の非ＣＮＳ組織に形質導入することができ、したがって、ＣＡＧプロモーターなどのプロモーターの制御下にある導入遺伝子は、ＣＮＳとＣＮＳ外の他の組織の両方で発現され得る。一部の態様では、本明細書に開示される構築物のＣＮＳ送達は、ＮＧＬＹ１のＣＮＳ発現をもたらすＣＮＳ組織を標的化することができるが、さらに、限定されないが、肝臓及び心臓を含む末梢組織におけるＮＧＬＹ１発現をもたらすことができる。
一部の態様では、本開示は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、人為的に得られたか又は産生されたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え法を用いて産生することができる。このようなＡＡＶは、本明細書において「組換えＡＡＶ」と称される。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、好ましくは、ｒＡＡＶの導入遺伝子が１又は２以上の所定の組織（複数可）に特異的に送達され得るように、組織特異的な標的化能力を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的な標的化能力の決定において重要なエレメントとなり得る。したがって、標的化される組織に適したカプシドを有するｒＡＡＶを選択することができる。一部の態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、若しくはＡＡＶ．ＰＨＰＢカプシドタンパク質、又はそれらと実質的に相同性を有するタンパク質を含む。一部の態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。一部の態様では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質を含む。
一部の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、シュードタイプ化されたｒＡＡＶであり得る。シュードタイピングは、外来ウイルスエンベロープタンパク質と組み合わせてウイルス又はウイルスベクターを産生するプロセスである。結果は、シュードタイプ化されたウイルス粒子である。この方法により、外来ウイルスエンベロープタンパク質を用いて、宿主指向性又はウイルス粒子の増加／減少した安定性を変化させることができる。一部の態様では、シュードタイプ化されたｒＡＡＶは、２又は３以上の異なるＡＡＶ由来の核酸を含み、ここで、１つのＡＡＶ由来の核酸は、カプシドタンパク質をコードし、少なくとも１つの他のＡＡＶの核酸は、他のウイルスタンパク質及び／又はウイルスゲノムをコードする。一部の態様では、シュードタイプ化されたｒＡＡＶとは、１つのＡＡＶ血清型の逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び異なるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含むＡＡＶを指す。例えば、Ｙのタンパク質でカプシド化された血清型ＸのＩＴＲを含有するシュードタイプ化されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶＸ／Ｙと称することができる（例えば、ＡＡＶ２／１はＡＡＶ２のＩＴＲ及びＡＡＶ１のカプシドを有する）。一部の態様では、シュードタイプ化されたｒＡＡＶは、あるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質の組織特異的標的化能力と、別のＡＡＶ血清型由来のウイルスＤＮＡとを組み合わせるのに有用であり得、それによって、標的組織への導入遺伝子の標的送達を可能にする。
所望のカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２号明細書を参照されたい）。典型的には、本方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質又はその断片をコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子で構成される組換えＡＡＶベクター；並びに組換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを伴う。典型的には、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。一部の態様では、ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質、ビリオンタンパク質１～３（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３と称する）を含み、選択的スプライシングを介して単一ｃａｐ遺伝子から転写される。一部の態様では、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の分子量は、それぞれ約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａ及び約６２ｋＤａである。一部の態様では、翻訳時に、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周囲に球形の６０－ｍｅｒタンパク質シェルを形成する。一部の態様では、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達し、及び／又は宿主細胞と相互作用する。一部の態様では、カプシドタンパク質は、組織特異的な様式でウイルスゲノムを宿主に送達する。
一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型であり得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、又はＡＡＶ．ＰＨＰＢ血清型であり得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶｒｈ８血清型であり得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型であり得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ．ＰＨＰＢ血清型であり得る。
一部の態様では、ＡＡＶカプシド中のｒＡＡＶベクターをパッケージングするために宿主細胞中で培養される成分は、トランスで宿主細胞に提供することができる。代替的に、必要とされる成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／又はヘルパー機能）のいずれか１又は２以上は、当業者に公知である方法を使用して必要とされる成分の１又は２以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供することができる。
一部の態様では、このような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要とされる成分（複数可）を含有することができる。しかしながら、必要な成分（複数可）は、構成プロモーターの制御下にあり得る。本明細書では、導入遺伝子との使用に適した調節エレメントの検討において、適切な誘導性及び構成性プロモーターの例を提供する。一部の態様では、選択された安定な宿主細胞は、構成性プロモーターの制御下での選択される成分（複数可）と１又は２以上の誘導性プロモーターの制御下での他の選択される成分（複数可）を含有することができる。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐ及び／又はｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞が生成され得る。さらに他の安定な宿主細胞を当業者によって生成することができる。
本明細書に記載されるｒＡＡＶを産生するのに有用な組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝的エレメント（ベクター）を用いてパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択される遺伝的エレメントは、本明細書に記載されるものを含め、任意の適切な方法によって送達することができる。本明細書に開示される組成物のいずれかを構築するために使用される方法は、核酸操作の当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、適切な方法の選択は、本開示上の制限ではない。例えば、K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)及び米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。
一部の態様では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号明細書に詳細に記載される）を用いて産生することができる。典型的には、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及びアクセサリー機能ベクターにパッケージングされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）を宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生することができる。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードし、産生性ＡＡＶ複製及びエンカプシド化のためにトランスに機能する。一部の態様では、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いずれの検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成することなく、効率的なＡＡＶベクター産生を支持することができる。本開示での使用に適したベクターの非限定的な例としては、両方の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，００１，６５０号明細書に記載されるｐＨＬＰ１９、及び米国特許第６，１５６，３０３号明細書に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる。アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／又は細胞機能（すなわち、「アクセサリー機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能には、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要な機能が含まれる。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、及びワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれからも誘導することができる。
細胞。本明細書では、トランスフェクションされた宿主細胞が開示される。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜を介して導入された場合に「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が当該技術分野で一般に公知である。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197を参照されたい。このような技術を使用して、ヌクレオチド組込みベクター及び他の核酸分子などの１又は２以上の外因性核酸を適切な宿主細胞に導入することができる。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、所望の物質を保持するか、又は保持することができる任意の細胞を指す。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、非ヒト霊長類、げっ歯類、又はヒトの細胞）であり得る。一部の態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は真菌細胞であり得る。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、又は組換えＡＡＶの産生に関連する他の伝達ＤＮＡのレシピエントとして使用することができる。この用語は、トランスフェクトされている元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされている細胞を指すことができる。単一の親細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異、又は意図的変異に起因して、必ずしも、形態において、又はゲノム若しくは全ＤＮＡ補体において、元の親と完全に同一であるとは限らないことが理解される。
本明細書では、インビボでＮＧＬＹ１導入遺伝子の発現を促進する調節エレメントに作動可能に連結されたＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子（配列番号１のヌクレオチド配列を含む）を含むゲノムを含有する、ｒＡＡＶ、特にｒＡＡＶ９粒子の産生のための宿主細胞が提供される。例えば、ＣＡＧプロモーター及びポリＡシグナル配列に作動可能に連結される。遺伝子発現カセットは、配列番号８のヌクレオチド配列を有し得、隣接するＩＴＲ配列を含み得、例えば、隣接するＩＴＲ配列を有する構築物全体は、配列番号９のヌクレオチド配列を有し得る。
本明細書で使用される場合、用語「細胞株」とは、インビトロで連続的又は持続的な増殖及び分裂が可能な細胞集団を指す。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。自然発生した又は誘導された変化が、このようなクローン集団の貯蔵又は移送中に核型において起こり得ることは、当該技術分野においてさらに公知である。したがって、言及された細胞株から誘導された細胞は、祖先細胞又は培養物と正確に同一でない場合があり、言及された細胞株はこのようなバリアントを含む。
本明細書で使用される場合、用語「組換え細胞」とは、生物学的に活性なポリペプチドの転写又はＲＮＡなどの生物学的に活性な核酸の産生を導くＤＮＡセグメントなどの外因性ＤＮＡセグメントが導入されている細胞を指す。
治療方法
ＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含み、ＣＮＳ及び他の組織（複数可）中でＮＧＬＹ１タンパク質を発現するように操作されたｒＡＡＶ、特に配列番号１のヌクレオチド配列を含むなどの、本明細書に開示される構築物を含むｒＡＡＶ９ベクターを投与することによって、ＮＧＬＹ１欠損症を患っている対象を治療する方法が提供される。ＮＧＬＹ１タンパク質をコードするｒＡＡＶは、当該技術分野において公知である任意の方法で投与することができる。一部の態様では、ｒＡＡＶは、脳室内投与又は大槽内（ＩＣＭ，intra cisterna magna）投与によって送達される。一部の態様では、対象のＣＮＳ組織に導入遺伝子を送達する方法は、２つの異なる投与経路、例えば、脳室内投与及び静脈内投与による有効量のｒＡＡＶの同時投与を含むことができる。ｒＡＡＶの同時投与は、ほぼ同時に、又は異なる時間に行うことができる。一部の態様では、ｒＡＡＶは、適切な投薬量、例えば、６×１０６～６×１０１６ゲノムコピー数／ｋｇ（又は代替的に、脳投与のための脳体積又はＣＳＦ体積に従って評価される投薬量）で送達される。ＡＡＶ９、調節エレメント、及び投与様式を含むｒＡＡＶ血清型の組み合わせは、投与の治療的利益を促進する他の末梢組織と同様に、ＣＮＳ組織へのＮＧＬＹ１タンパク質の治療的に有効な送達をもたらす。
一部の態様では、標的とされるＣＮＳ組織は、皮質、海馬、視床、視床下部、小脳、脳幹、頸髄、胸髄、腰髄、又はそれらの組み合わせであり得る。一部の態様では、標的とされる組織はＰＮＳである。ＣＮＳ組織を標的とする投与経路は、ＡＡＶ血清型に依存し得る。一部の態様では、ＡＡＶ血清型がＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３及びＣＳｐ３である場合、投与経路は血管内注射であり得る。一部の態様では、ＡＡＶ血清型がＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３及びＣＳｐ３である場合、投与経路は、髄腔内及び／又は脳内注射であり得る。一部の態様では、ＡＡＶ血清型がＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３及びＣＳｐ３である場合、投与経路は脳室内又はＩＣＭ投与であり得る。一部の態様では、ＡＡＶ血清型がＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３及びＣＳｐ３である場合、投与経路は脳室内又はＩＣＭ投与であり得る。
一部の態様では、組成物（例えば、医薬組成物）は、ＮＧＬＹ１をコードする核酸を含むｒＡＡＶを含み得る。一部の態様では、少なくとも１つの改変された遺伝子調節配列又はエレメントを含む組換えＡＡＶを含む組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。適切な担体は、ｒＡＡＶが対象とする適応症に対して選択することができる。例えば、１つの適切な担体は、種々の緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化され得る生理食塩水を含む。他の適切な担体の例としては、限定されないが、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。場合により、本明細書に開示される組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）に加えて、保存剤などの他の医薬成分、又は化学的安定剤も含むことができる。適切な保存剤の例としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学的安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。
一部の態様では、ｒＡＡＶは、ｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）、及び０．００１％の薬学的に許容される非イオン性界面活性剤、例えば、プルロニックＦ－６８（ＰＦ６８，pluronic F-68）、又は他の適切な薬学的に許容される緩衝液若しくは賦形剤を含む医薬組成物中で投与される。製剤は、使用の準備が整うまで凍結され、次に解凍し、投与することができる。
一部の態様では、本明細書に開示される組成物は、ｒＡＡＶを単独で、又は１又は２以上の他のウイルス（例えば、１又は２以上の異なる導入遺伝子を有する第２のｒＡＡＶコーディング）と組み合わせて含むことができる。一部の態様では、組成物は、各々１若しくは２以上の異なる導入遺伝子を有する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の異なるｒＡＡＶを含み得る。
ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞にトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供するのに十分な量で投与することができる。一部の態様では、許容される投与経路は、限定されないが、選択された臓器への直接送達（例えば、肝臓、骨格筋への注射）、経口、吸入（鼻腔内及び気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、及び他の非経口の投与経路を含む。一部の態様では、投与経路は、脳室内注射によるものであり得る。必要に応じて、投与経路を組み合わせることができる。
特定の「治療効果」を達成するために必要とされるｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、体重１キログラムあたりのゲノムコピー数における用量の単位（ＧＣ／ｋｇ）、脳体積あたりのゲノムコピー数における用量の単位、及びＣＳＦ体積あたりのゲノムコピー数における用量の単位は、限定されないが、ｒＡＡＶビリオン投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子又はＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患又は障害、並びに遺伝子又はＲＮＡ産物の安定性を含むいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、上述の因子、並びに当該技術分野において周知である他の因子に基づいて、特定の疾患又は障害を有する患者を治療するために、ｒＡＡＶビリオン用量範囲を容易に決定することができる。
ｒＡＡＶの有効量は、動物に標的感染し、所望の組織を標的とするのに十分な量である。有効量は、主に、対象の種、年齢、体重、健康、及び標的とする組織などの因子に依存し、したがって、動物及び組織の間で変化し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、約１０６～１０１６のゲノムコピー数（例えば、１×１０６～１×１０１６、その両端を含む）を含む約１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液の範囲であり得る。本明細書に開示される方法において、治療有効用量は、６×１０１３ｇｃ／ｋｇ～６×１０１４ｇｃ／ｋｇであり、７×１０１３ｇｃ／ｋｇ、８×１０１３ｇｃ／ｋｇ、９×１０１３ｇｃ／ｋｇ、１×１０１４ｇｃ／ｋｇ、２×１０１４ｇｃ／ｋｇ、３×１０１４ｇｃ／ｋｇ、４×１０１４ｇｃ／ｋｇ、又は５×１０１４ｇｃ／ｋｇ（又は代替的に、ＩＣＶ若しくはＩＣＭ送達に適した脳体積あたりのゲノムコピー数、ＣＳＦ体積若しくは他の測定）を含む。一部の態様では、約１０１１～１０１２／ｋｇの投薬量、又は適切な測定ｒＡＡＶゲノムコピー数が適切であり得る。一部の態様では、約１０１１～１０１３／ｋｇの投薬量、又は適切な測定ｒＡＡＶゲノムコピー数が適切であり得る。一部の態様では、約１０１１～１０１４／ｋｇの投薬量、又は適切な測定ｒＡＡＶゲノムコピー数が適切であり得る。一部の態様では、約１０１１～１０１５／ｋｇの投薬量、又は適切な測定ｒＡＡＶゲノムコピー数が適切であり得る。一部の態様では、約１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ，vector genome）コピー数／ｋｇの投薬量、又は適切な測定が適切であり得る。一部の態様では、１若しくは２以上の脳領域（複数可）を特異的に標的化する場合、投薬量を変化させることができるか又は減少させることができる。一部の態様では、約１０７～１０８ｒＡＡＶゲノムコピー数／ｋｇの投薬量、又は適切な測定が適切であり得る。一部の態様では、約１０８～１０９ｒＡＡＶゲノムコピー数／ｋｇの投薬量、又は適切な測定が適切であり得る。一部の態様では、約１０９～１０１０ｒＡＡＶゲノムコピー数／ｋｇの投薬量、又は適切な測定が適切であり得る。一部の態様では、約１０１０～１０１１ｒＡＡＶゲノムコピー数／ｋｇの投薬量、又は他の適切な測定が適切であり得る。
一部の態様では、対象にＡＡＶを投与するための潜在的な副作用は、炎症を含むＡＡＶに対する対象における免疫応答であり得、特にＡＡＶの投与が全身性である場合、投与経路に依存し得る。一部の態様では、本明細書に記載されるように、１又は２以上のｒＡＡＶの投与前に、対象を免疫抑制することができる。
本明細書で使用される場合、「免疫抑制される」又は「免疫抑制」とは、対象における免疫応答の活性化又は効力の低下を指す。免疫抑制は、限定されないが、リツキシマブ、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、シロリムス、免疫グロブリン注射、プレドニゾン、メトトレキサート、及びそれらの任意の組み合わせを含む、１又は２以上の（例えば、複数、例えば２、３、４、５又はそれ以上の）剤を使用して、対象において誘導され得る。
一部の態様では、本明細書に開示される方法は、対象にｒＡＡＶ（例えば、本明細書に開示されるｒＡＡＶ又は医薬組成物）を投与される前に、対象において免疫抑制を誘導する（例えば、１又は２以上の免疫抑制剤を投与する）ステップをさらに含むことができる。一部の態様では、対象は、対象へのｒＡＡＶの投与前に、約３０日間～約０日間（例えば、ｒＡＡＶの投与までの３０日間の任意の時間、両端を含む）で免疫抑制され得る（例えば、免疫抑制が対象において誘導される）。一部の態様では、対象は、少なくとも７日間、免疫抑制剤（例えば、リツキシマブ、シロリムス、及び／又はプレドニゾン）で前処置され得る。
一部の態様では、対象の免疫抑制は、ｒＡＡＶ若しくは医薬組成物の投与中及び／又は投与後に維持された。一部の態様では、ｒＡＡＶ又は医薬組成物の投与後の１日から１年の間、対象を免疫抑制（例えば、１又は２以上の免疫抑制剤を投与）することができる。
一部の態様では、ｒＡＡＶ組成物は、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を減少させるように、特に、高ｒＡＡＶ濃度が存在する場合（例えば、－１０１３ＧＣ／ｍｌ又はそれ以上）に製剤化することができる。ｒＡＡＶの凝集を減少させる方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などが含まれる。（例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられるWright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照されたい。）
薬学的に許容される賦形剤及び担体溶液の製剤は、種々の治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬及び治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
一部の態様では、活性成分（複数可）のパーセンテージは、もちろん、変化させることができ、便宜的には、全製剤の重量又は体積の約１若しくは２％～約７０％若しくは８０％又はそれ以上であり得るが、これらの製剤は、活性化合物の少なくとも約０．１％又はそれ以上を含有することができる。当然のことながら、各治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物の任意の与えられた単位用量において適切な投薬量を得ることができるように調製することができる。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期限、並びに他の薬理学的考察などの因子は、このような医薬製剤を調製する当業者によって企図され得、それ自体、種々の投薬量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
一部の態様では、皮下、膵内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、又は経口、腹腔内、脳室内、又は吸入のいずれかで、本明細書に開示されるような適切に製剤化された医薬組成物中にｒＡＡＶベースの治療構築物を送達することが望ましい。一部の態様では、米国特許第５，５４３，１５８号明細書；同第５，６４１，５１５号明細書；及び同第５，３９９，３６３号明細書（各々、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）に記載される投与モダリティは、ｒＡＡＶを送達するために使用することができる。一部の実施形態では、好ましい投与モードは、脳室内注射によるものであり得る。
注射可能な使用に適した医薬形態には、滅菌の水溶液又は分散液、及び滅菌の注射可能な溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。多くの場合、この形態は、容易な注射可能性が存在する程度まで、滅菌及び流体であり得る。それは製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用を受けないように保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び／又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用、分散剤の場合に必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることができる。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン、の組成物における使用によってもたらすことができる。
注射可能な水溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要であれば、適切に緩衝化され得、液体希釈剤は、まず、十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、脳室内、及び腹腔内投与に適している場合がある。これに関連して、採用することができる無菌水性媒体は当業者に公知である。例えば、１投薬量を１ｍｌの等張ＮａＣ１溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注射用液体に添加するか、又は提案された注入部位に注入することができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、０．００１％の薬学的に許容される非イオン性界面活性剤、例えばＰＦ６８を含む、ｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に製剤化される。投薬量には、宿主の状態に応じて、ある程度の変動が必然的に生じる。投与責任者は、いかなる場合にも、個々の宿主に適した用量を決定する。
滅菌の注射可能な溶液は、必要な量の活性ｒＡＡＶを、必要に応じて、本明細書に列挙される種々の他の成分とともに適切な溶媒中に取り込み、続いて、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本分散媒及び上記に列挙したものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製することができる。滅菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末と、以前に無菌濾過されたその溶液から任意の追加の所望の成分とを生じる真空乾燥及び凍結乾燥技術であり得る。
本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物はまた、中性又は塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、無機酸、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成させることができる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄、並びに有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導することができる。製剤化に際して、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、及び治療有効量で投与される。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの種々の投薬形態で容易に投与することができる。
本明細書で使用される場合、「担体」には、あらゆるすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、被覆剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助活性成分を組成物に組み込むこともできる。語句「薬学的に許容される」とは、宿主に投与された場合、アレルギー性又は類似の好ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルは、本開示の組成物を適切な宿主細胞に導入するために使用することができる。特に、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子などに封入された送達のために製剤化することができる。
このような製剤は、本明細書に開示される核酸又はｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤の導入に使用することができる。リポソームの形成及び使用は、一般に、当業者に公知である。最近、血清安定性及び循環半減期を改善したリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号明細書）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の種々の方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号明細書；同第５，５５２，１５７号明細書；同第５，５６５，２１３号明細書；同第５，７３８，８６８号明細書及び同第５，７９５，５８７号明細書）。
リポソームは、通常、他の手法によるトランスフェクションに対して抵抗性を示す多数の細胞型とともに使用され、成功している。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達システムに典型的なＤＮＡの長さによる制約を受けない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写因子及びアロステリックエフェクターを種々の培養細胞株及び動物に導入するために効果的に使用されている。加えて、リポソームを媒介したドラッグデリバリーの有効性を調べるいくつかの成功した臨床試験が完了している。
リポソームは、水性媒体中に分散可能なリン脂質から形成することができ、自発的に多層同心二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ，multilamellar vesicles）とも呼ばれる）を形成することができる。ＭＬＶは、一般に２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水溶液を含有する、２００～５００オングストロームの範囲の直径を有する小さな単層小胞（ＳＵＶ，small unilamellar vesicles）の形成をもたらす。
代替的に、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは、一般に、安定であり、再現性のある方法で物質を取り込むことができる。細胞内ポリマーの過負荷による副作用を避けるために、このような超微細粒子（約０．１ｐｍの大きさ）は、インビボで分解することができるポリマーを用いて設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子の使用が考えられる。
上記の送達方法に加えて、以下の技術を、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替方法として使用することもできる。ソノフォレシス（例えば、超音波）が使用されており、循環系への、及びそれを介して薬物の透過速度及び有効性を高めるためのデバイスとして、米国特許第５，６５６，０１６号明細書に記載されている。考えられる他の薬物送達代替物は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号明細書）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号明細書）、眼科用製剤（Bourlais et al., 1998）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号明細書及び同第５，７８３，２０８号明細書）、及びフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号明細書）である。
一部の態様では、本方法は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ又は医薬組成物を投与された対象に、１又は２以上のさらなる治療剤を投与することを含むことができる。
本明細書では、ＣＮＳにおいて発現されるように操作されたＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含有し、ＡＡＶ９血清型であり得る、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターの投与によってＮＧＬＹＩ欠損症を治療する方法が開示される。ＮＧＬＹ１遺伝子の機能喪失変異に起因するＮＧＬＹ１欠損症は極めて稀な遺伝性障害であり、患者は発達遅延、痙攣、涙液の不足、小児期の肝トランスアミナーゼ上昇、及び運動障害に苦しむ。一部の態様では、主に中枢神経系（ＣＮＳ）においてあるが、肝臓及び心臓を含む他の組織においても、ＮＧＬＹ１機能を回復するのに有用であり得る本明細書に記載される遺伝子置換療法は、疾患症状を緩和することができる。
本明細書では、ＮＧＬＹ１欠損症の治療に有用な単離された核酸、ｒＡＡＶ、組成物、及び方法が開示される。一部の態様では、対象におけるＮＧＬＹ１欠損症を治療する方法は、例えば、ＣＮＳにおいてＮＧＬＹ１を発現するように操作された遺伝子発現カセット（例えば、ＣＡＧプロモーターの制御下で、例えば、配列番号８のヌクレオチド配列（ＣＡＧプロモーター及びポリＡシグナル配列に作動可能に連結された配列番号１のヌクレオチド配列を含む）又は配列番号９（隣接するＩＴＲ配列を有する構築物全体）を有する構築物）において、配列番号１のコード配列を有するＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶを投与することを含むことができ、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＩＣＶ、又は代替的に、大槽に投与される。一部の態様では、大槽への送達は、直接注射（例えば、大槽内（ＩＣＭ））又は腰椎穿刺によって可能である。ＮＧＬＹ１欠損症の患者の中には、脊柱側弯症に悩まされ、腰椎穿刺による治療薬を投与することが困難な患者もいる。したがって、脊柱側弯症の患者では、ｒＡＡＶはＩＣＶによって投与されるか、又はＩＣＭによって大槽に直接投与される。一部の態様では、ｒＡＡＶは脊柱側弯症の対象にＩＣＭ投与される。一部の態様では、ｒＡＡＶは、ＩＣＶ及びＩＶ、又はＩＣＭ及びＩＶによって投与される。
また、本明細書では、対象（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）及び対象の他の組織）における機能的ＮＧＬＹ１タンパク質の発現を促進する方法であって、低レベルのＮＧＬＹ１発現と関連する障害の疾患（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）を有するか又は有することが疑われる対象に、本明細書に記載されるｒＡＡＶを、ＩＣＶ投与（又は代替的に、大槽への投与）を含め、投与することを含む方法が開示される。本明細書中で使用される場合、低レベルのＮＧＬＹ１発現と関連する疾患又は障害は、対照である対象（例えば、健康な対象又は治療されていない対象）と比べて、対象が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％低いレベルのＮＧＬＹ１発現を有する疾患又は障害である。
一部の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを対象に投与することにより、対照である対象と比較して、ＮＧＬＹ１の発現を２倍～１００倍（例えば、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍など）促進する。一部の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを対象に投与することにより、対照である対象と比較して、対象のＣＮＳにおけるＮＧＬＹ１の発現を２倍～１００倍（例えば、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍など）促進する。本明細書で使用される場合、「対照である」対象は、本明細書中に記載される単離された核酸、ｒＡＡＶ、若しくは組成物を投与されていない対象、又は健康な対象を指すことができる。一部の態様では、対照である対象は、本明細書に記載される単離された核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与される（例えば、投与前の）同一対象であり得る。一部の態様では、記載される単離された核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を対象に投与することにより、対照と比較してＮＧＬＹ１の発現を２倍促進する。一部の態様では、記載されるｒＡＡＶを対象に投与することにより、対照と比較してＮＧＬＹ１の発現を１００倍促進する。一部の態様では、記載されるｒＡＡＶを対象に投与することにより、対照と比較してＮＧＬＹ１の発現を５倍促進する。一部の態様では、記載されるｒＡＡＶを対象に投与することにより、対照と比較してＮＧＬＹ１の発現を１０倍促進する。一部の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを対象に投与することにより、対照と比較してＮＧＬＹ１の発現を５倍～１００倍（例えば、対照と比較して５倍～１０倍、１０倍～１５倍、１０倍～２０倍、１５倍～２５倍、２０倍～３０倍、２５倍～３５倍、３０倍～４０倍、３５倍～４５倍、４０倍～６０倍、５０倍～７５倍、６０倍～８０倍、７５倍～１００倍）促進する。
一部の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを対象に投与することにより、対照である対象と比較して５％～２００％の増加（例えば、５％～５０％、２５％～７５％、５０％～１００％、７５％～１２５％、１００％～２００％、又は１００％～１５０％など）で、対象におけるＮＧＬＹ１の発現を促進する（例えば、対象のＣＮＳにおけるＮＧＬＹ１の発現を促進する）。
さらに本明細書では、低レベルのＮＧＬＹ１発現と関連する疾患又は障害（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）を有する対象を治療する方法が開示される。一部の態様では、本方法は、特にＩＣＶ投与（又は代替的に大槽へ）によって対象のＣＮＳにおいてＮＧＬＹ１を発現するように操作された核酸を含有するカプシドを含む有効量のｒＡＡＶを対象に投与することを含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、障害、疾患の症状、若しくは疾患の素因を治癒する、癒す、緩和する、軽減する、変更する、治す、軽快させる、改善する、又は影響を与えることを目的として、低レベルのＮＧＬＹ１発現と関連する疾患又は障害（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）を有する対象への、組成物（例えば、本明細書に記載される単離された核酸又はｒＡＡＶ）の適用又は投与を指す。
低レベルのＮＧＬＹ１発現と関連する疾患（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）の緩和には、疾患の発症若しくは進行を遅延させること、又は疾患の重症度を減少させることが含まれる。疾患を緩和することは、必ずしも治療的な結果は必要ではない。本明細書で使用される場合、疾患の発症を「遅延させる」とは、疾患の進行を遅らせ、妨げ、減速させ、妨害させ、安定化させ、及び／又は延期することを意味する。この遅延は、疾患の病歴及び／又は治療される個人に応じて、様々な長さの時間であり得る。疾患の発症を「遅延させる」若しくは緩和するか、又は疾患の発病を遅延させる方法は、その方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠内で疾患の１又は２以上の症状を発症する確率を減少させ、及び／又は所定の時間枠内で症状の範囲を減少させる方法である。このような比較は、典型的には、臨床研究に基づいており、統計学的に有意な結果を得るのに十分な対象数を用いている。
特に、本明細書に記載されるｒＡＡＶをＮＧＬＹ１欠損症に苦しむヒト対象に投与することは、投与後の１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、４０週間、５０週間又は１年以内に、疾患の１若しくは２以上のバイオマーカー又は特徴の減少をもたらす。特に、低／無涙症の減少、痙攣の発生、発達遅延、末梢神経障害の減少又は進行の減速、又は肝トランスアミナーゼレベルの減少をもたらす。本発明者らは、ＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ（ＧＮＡ）の体液中のレベル及び蓄積を、ＮＧＬＹ１欠損症のマーカーとして同定し、したがって、ｒＡＡＶ治療薬の投与後、例えば、体液試料中で、及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより測定した場合、ＧＮＡレベルの減少は、治療効果を示す（下記を参照されたい）。
疾患の「発症」又は「進行」とは、疾患の初期所見及び／又はその後の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知である標準的な臨床技術を用いて検出可能及び評価可能であり得る。しかしながら、発症はまた、検出不能であり得る進行を指す。本明細書で使用される場合、発症又は進行という用語は、症状の生物学的経過を指す。「発症」には、出現、再発、及び発病が含まれる。本明細書で使用される場合、疾患の「発病」又は「出現」は、低レベルのＮＧＬＹ１発現（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）と関連し得る。
一部の態様では、対象は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ネコ、又は非ヒト霊長類であり得る。一部の態様では、対象は、低レベルのＮＧＬＹ１発現と関連する疾患又は障害（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）を有するか又は有することが疑われる。一部の態様では、低レベルのＮＧＬＹ１発現と関連する疾患又は障害（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症）を有する対象は、機能喪失変異（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する）を有する少なくとも１つのＮＧＬＹ１対立遺伝子を含む。一部の態様では、機能喪失変異（例えば、ＮＧＬＹ１欠損症に関連する）を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、フレームシフト変異、スプライス部位変異、ミスセンス変異、切断変異又はナンセンス変異を含む。対象は、同じ機能喪失変異（ホモ接合型）を有する２つのＮＧＬＹ１対立遺伝子、又は異なる機能喪失変異（複合ヘテロ接合型）を有する２つのＮＧＬＹ１対立遺伝子を有することができる。ある特定の態様では、対象はＮＧＬＹ１欠損症のキャリアであり、ある特定の態様では、本明細書に記載される機能喪失対立遺伝子についてヘテロ接合である。
一部の態様では、機能喪失変異を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、エクソン１２におけるフレームシフト変異を含み得る。一部の態様では、機能喪失変異を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、Ａｒｇ４０１からＴｅｒ（例えば、終止コドン）（Ｒ４０１Ｘ）の置換をもたらすエクソン８におけるナンセンス変異を含み得る。一部の態様では、機能喪失変異を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、１－ｂｐ欠失（ｃ．１８９１ｄｅｌＣ）から生じるフレームシフト変異を含む。一部の態様では、機能喪失変異を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、Ａｒｇ４０１からＴｅｒ（例えば、終止コドン）（Ｒ４０１Ｘ）の置換をもたらすエクソン８におけるｃ．１２０１Ａ－Ｔトランスバージョンを含む。一部の態様では、機能喪失変異を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、フレームシフト及び早期終結（Ａｒｇ４５８からＴｅｒ）をもたらすエクソン９における１－ｂｐ重複（ｃ．１３７０ｄｕｐＧ）を含み得る。一部の態様では、機能喪失変異を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、１残基の欠失（４０２ｄｅｌ）をもたらす３－ｂｐ欠失（ｃ．１２０５ １２０７ｄｅｌＴＴＣ）を含む。一部の態様では、機能喪失変異を有するＮＧＬＹ１対立遺伝子は、Ａｒｇ５４２からＴｅｒ（Ｒ５４２Ｘ）の置換をもたらすｃ．１５７０Ｃ－Ｔ移行を含み得る。
一部の態様では、本明細書に開示されるｒＡＡＶは、所望の組織の細胞にトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供するのに十分な量で投与することができる。薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、選択された臓器（例えば、中枢神経系）への直接送達、ＩＣＶ又は大槽への投与、経口、吸入（鼻腔内及び気管内送達を含む）、眼内、脳室内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路を含む。必要に応じて、投与経路を組み合わせることができる。
一部の態様では、特定の「治療効果」を達成するのに必要なｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、ゲノムコピー／体重ｋｇ（ＧＣ／ｋｇ）あたりの用量単位（又は代替的に、脳サイズ又はＣＳＦ体積に基づく）は、限定されないが、ｒＡＡＶビリオン投与の経路、治療効果を達成するのに必要な遺伝子又はＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患又は障害、及び遺伝子又はＲＮＡ産物の安定性を含むいくつかの因子に基づいて変化し得る。当業者は、ｒＡＡＶビリオン用量範囲を容易に決定し、上述の因子、並びに当該技術分野において周知である他の因子に基づいて、特定の疾患又は障害を有する患者を治療することができる。有効量のｒＡＡＶは、対象又は所望の組織に標的感染するのに十分な量である。一部の態様では、ｒＡＡＶの有効量は、安定な体細胞トランスジェニック動物モデルを生成するのに十分な量である。有効量は、主に、対象の種、年齢、体重、健康、及び標的とする組織などの因子に依存し、したがって、動物及び組織の間で変化し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、約１０９～１０１６のゲノムコピーを含有する約１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液の範囲であり得る。一部の態様では、ｒＡＡＶは肝細胞を形質導入する。一部の態様では、ｒＡＡＶの有効量は、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４ゲノムコピー／ｋｇであり得る。一部の態様では、ｒＡＡＶの有効量は、対象あたり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５ゲノムコピーであり得る。場合によっては、約６×１００９～６×１０１４のｒＡＡＶゲノムコピーの投与量が適切であり得る。
一部の態様では、ｒＡＡＶ組成物は、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を減少させるように、特に、高ｒＡＡＶ濃度が存在する場合（例えば、－１０１３ＧＣ／ｍｌ以上）に製剤化することができる。ｒＡＡＶの凝集を減少させる方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などが含まれる。（例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられるWright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照されたい。）
治療有効性の評価。本明細書に記載されるｒＡＡＶ組成物の有効性は、インビトロアッセイ及びインビボアッセイ、例えば、ＮＧＬＹ１欠損動物モデルによって評価することができる。投与の有効性の評価は、本明細書の実施例１及び２に記載される。
バイオマーカーとしてのＧＮＡ。ＮＧＬＹ１欠損症は、ＮＧＬＹ１の単一酵素欠損に起因するゆっくりと進行する超低有病率の稀な疾患である。ＮＧＬＹ１は、ミスフォールドされたタンパク質において、還元末端ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ結合型グリカン由来）をアスパラギンに連結する結合を切断するのに必要である。この疾患は、血漿、ＣＳＦ、及び組織におけるＮＧＬＹ１基質であるＧｌｃＮＡｃ－アスパラギン（ＧＮＡ）の有意な蓄積と関連する。ＧＮＡの蓄積は、これまでに調べられたすべての前臨床モデル及び患者試料において観察されている。ＧＮＡにおけるＧｌｃＮＡｃとアスパラギン（ＡＳＮ）を連結する結合が、通常ＮＧＬＹ１によって切断される結合と同じであるという生化学的理解と組み合わせたこれらの観察は、ＧＮＡ蓄積がこの疾患における主要な生化学的事象であることを示す。ＮＧＬＹ１機能の回復は、ＧＮＡの蓄積が妨げられる。
重要なＣＮＳ領域におけるＧＮＡの蓄積は、ＮＧＬＹ酵素活性の非存在の直接的な結果であり、ＮＧＬＹ１欠損ラットにおける疾患重症度と相関することが示されている。これらの動物の組織への野生型ＮＧＬＹ１遺伝子の導入は、病理学及び動物行動の改善と相関するＧＮＡレベルの有意な減少をもたらす。ＮＧＬＹ１自然史研究からのデータは、ＮＧＬＹ１欠損症は、疾患の大部分の態様において高い表現型の変動性と進行が遅いことを示すため、進行を測定するには長期にわたる臨床観察が必要になる場合があることを示唆している。ＮＧＬＹ１機能の生化学的理解、野生型ＮＧＬＹ１の置換を目的とした治療プローチ、及び非臨床データに基づき、ＧＮＡレベルは、ＮＧＬＹ１補正を反映し、臨床的利益を予測する可能性が適度に高い。
ＮＧＬＹ１欠損細胞では、Ｎ結合型糖タンパク質の分解が破壊され、ＧＮＡの生成をもたらす。ＮＧＬＹ１は通常、細胞質のマンノシダーゼ（Ｍａｎ２ｃ１）、ＥＮＧａｓｅ、プロテオソーム、リソソーム系とともに働き、Ｎ結合型糖タンパク質を単糖とアミノ酸に分解する。ＮＧＬＹ１欠損細胞では、細胞質のマンノシダーゼ（Ｍａｎ２ｃ１）、ＥＮＧａｓｅ、プロテアーゼ、リソソーム系はなおも正常に機能するが、ＮＧＬＹ１細胞の非存在下では、末端のＧｌｃＮＡｃとアスパラギンを連結する結合を代謝することができない。この代謝ブロックは、全身の組織及び体液中にＧＮＡの蓄積をもたらす。
ＮＧＬＹ１の非存在下では、ＧＮＡは細胞質では異化され得ないため、細胞質に蓄積しているすべてのＮ結合型糖タンパク質の「限界消化産物」となる。ＧＮＡはすべてのＮＧＬＹ１標的糖タンパク質の基質「総和」であるため、ＮＧＬＹ１酵素活性の最適な基質尺度と考えられる。
ＮＧＬＹ１欠損症のマウスモデル。Ｎｇｌｙ１欠損マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（Fujihira H, Masahara-Negishi Y, Tamura M, Huang C, Harada Y, Wakana S, et al. Lethality of mice bearing a knockout of the Ngly1-gene is partially rescued by the additional deletion of the Engase gene. PLoS Genet. 2017;13(4):e1006696）における胚致死である。マウスではＮｇｌｙ１の非存在は致死的であるが、マウスの他の研究では、ｈＮＧＬＹ１の４～５倍の過剰発現は毒性を示さず、マウスの胚致死性を回復させるためには比較的少量の活性ＮＧＬＹ１タンパク質が必要であることが示唆されている。
ＮＧＬＹ１欠損症のラットモデル。ＮＧＬＹ１欠損症のラットモデルは、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Asahina M, Fujinawa R, Nakamura S, Yokoyama K, Tozawa R, Suzuki T. Ngly1-/- rats develop neurodegenerative phenotypes and pathological abnormalities in their peripheral and central nervous systems. Hum Mol Genet. 2020;29(10):1635-1647）にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いて作成されている。このモデルは、Ｎｇｌｙ１遺伝子の３’ポリＡ領域だけでなく、エクソン１１と１２の欠失についてもホモ接合である。エクソン１１及び１２はＮＧＬＹ１のＰＡＷ（マンノース結合）ドメインをコードする。Ｎｇｌｙ１－／－ラットは、ロータロッド、運動／後ろ足立ち、及び受動的回避行動の評価を用いて測定した場合、潜在的な疾患関連表現型を示す。ＮＧＬＹ１治療薬の治療効果は、このモデルで評価することができる。ＮＧＬＹ１欠損症の全身（腎細胞、肝細胞）とＣＮＳ／ＰＮＳ（神経前駆細胞）成分の両方を表す、ＮＧＬＹ１欠損症のヒトＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、及びＲｅＮｃｅｌｌ ＶＭ細胞株はまた、治療効果の評価に有用である。
ラットモデルにおける行動表現型の特徴付けに加えて、基質バイオマーカーＧＮＡはまた、Ｎｇｌｙ１欠損ラット及びＮＧＬＹ１欠損ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、及びＲｅＮｃｅｌｌ ＶＭ細胞株において評価された。３つのＮＧＬＹ１欠損細胞株はいずれも、それらの野生型対照と比較してＧＮＡレベルの増加を示した。特に、Ｎｇｌｙ１－／－動物は、野生型動物と比較して、調べた尿、血中、ＣＳＦ及びすべての組織中の基質バイオマーカーの有意な上昇を示した。ＧＮＡ基質バイオマーカーの蓄積は、ＰＮＳ及び全身組織と比較して脳において最も高く、ＣＮＳ組織への効率的な送達の必要性を強調した。Ｎｇｌｙ１－／－動物におけるＧＮＡ基質レベルの減少は、例えば、投与から数日又は数週間以内の治療効果の指標となる。
病理学的には、Ｎｇｌｙ１－／－ラットは進行性のＣＮＳ及びＰＮＳ病理学を示した。ＤＲＧと脊髄の両方の早期発病軸索／ミエリン変性は重症度が増加させたが、浸潤性免疫細胞は後年出現した。同様のことは、出生後３３日では検出されなかった視床のニューロン喪失、石灰化及びグリオーシスに関してあてはまった。
キット
本明細書では、本明細書に記載される薬剤のいずれかを含むキットが開示される。一部の態様では、本明細書に開示される薬剤のいずれかは、薬学的又は診断的又は研究的キットに組み立てられ得、治療的、診断的又は研究的応用におけるそれらの使用を容易にすることができる。キットは、本開示及び使用説明書の構成要素を収容する１若しくは２以上の容器を含むことができる。具体的には、このようなキットは、意図された用途及びこれらの薬剤の適切な使用を記載する使用説明書とともに、本明細書に記載される１若しくは２以上の薬剤を含み得る。一部の態様では、キット中の薬剤は、特定の用途に、及び薬剤の投与方法に適した医薬製剤及び投薬量であり得る。研究目的のためのキットは、種々の実験を行うために、適切な濃度又は量の成分を含有することができる。
本明細書では、ｒＡＡＶを産生するためのキットもまた開示される。一部の態様では、キットは、ＮＧＬＹ１タンパク質又はその一部をコードする単離された核酸を収容する容器を含むことができる。一部の態様では、キットは、ｒＡＡＶを産生するための使用説明書をさらに含むことができる。一部の態様では、キットは、さらに、組換えＡＡＶベクターを収容する少なくとも１つの容器を含み、ここで、組換えＡＡＶベクターは導入遺伝子を含む。
一部の態様では、キットは、上述した組換えＡＡＶを収容する容器を含むことができる。一部の態様では、キットは、薬学的に許容される担体を収容する容器をさらに含むことができる。例えば、キットは、ｒＡＡＶを収容する１つの容器と、ｒＡＡＶを対象に注入するのに適した緩衝液を収容する第２の容器とを含むことができる。一部の態様では、容器は注射器であり得る。
一部の態様では、キットは、研究者によって本明細書に記載される方法の使用を容易にするように設計され得、多くの形態をとることができる。キットの組成物の各々は、該当する場合、液体形態（例えば、溶液）、又は固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供することができる。一部の態様では、組成物の一部は、例えば、キットとともに提供され得るか又は提供され得ないで、適切な溶媒又は他の種（例えば、水又は細胞培養培地）の添加によって、構成可能であるか、又は他には（例えば、活性形態へ）加工可能であり得る。本明細書で使用される場合、「指示書」は、指示及び／又は促進の構成要素を定義することができ、典型的には、開示のパッケージ上又はそれと関連する書面による指示書を伴う。指示書はまた、ユーザが、指示書がキットと関連付けられ得ることを明確に認識するように、任意の方法で提供される任意の口頭又は電子的指示、例えば、オーディオビジュアル（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、及び／又はウェブベースの通信などを含むことができる。書面による指示書は、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定される様式であり得、その指示書は、動物投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映することもできる。
本明細書に開示されるキットはまた、本明細書に記載される成分のいずれか１又は２以上を、１又は２以上の容器に含有させることができる。一部の態様では、キットは、キットの１若しくは２以上の成分を混合するため、並びに／又は試料を単離及び混合し、対象に適用するための指示書を含むことができる。キットは、本明細書に記載される容器収容剤を含むことができる。薬剤は、液体、ゲル又は固体（粉末）の形態であり得る。薬剤は、無菌的に調製され、注射器にパッケージングされ、冷蔵して出荷することができる。代替的に、保存のためにバイアル又は他の容器に収容することもできる。第２の容器は、無菌的に調製された他の薬剤を有することができる。代替的に、キットは、注射器、バイアル、チューブ、又は他の容器に予め混合され、出荷される活性剤を含むことができる。キットは、特に特定の体細胞動物モデルを作製するためのキットの場合には、注射器、局所適用デバイス、又はｉｖ針チューブ及びバッグなどの、動物に薬剤を投与するために必要な成分の１若しくは２以上又は全部を有することができる。
一部の態様では、本明細書に開示される方法は、プロウイルスＡＡＶゲノムを非常に低量で保持する可能性がある組織から単離された全細胞ＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞におけるＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子転写を誘発及び／又はブーストするためにヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルス）を補足することを伴うことができる。一部の態様では、トランスフェクトされた細胞由来のＲＮＡは、ｃＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲ増幅及び新規ＡＡＶの検出のための鋳型を提供することができる。プロウイルスＡＡＶゲノムを保持する可能性のある組織から単離された全細胞ＤＮＡを細胞にトランスフェクトする場合、ＡＡＶ遺伝子転写を促進する因子を細胞に補足することがしばしば望ましい。例えば、細胞はまた、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させることができる。一部の態様では、ヘルパー機能は、アデノウイルスによって提供され得る。アデノウイルスは、野生型アデノウイルスであり得、ヒト又は非ヒト起源、例えば、非ヒト霊長類（ＮＨＰ，non-human primate）起源であり得る。同様に、非ヒト動物（例えば、チンパンジー、マウス）に感染することが公知であるアデノウイルスはまた、本開示の方法において採用することができる（例えば、米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照されたい）。野生型アデノウイルスに加えて、必要なヘルパー機能を有する組換えウイルス又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド、エピソームなど）を利用することができる。このような組換えウイルスは当該技術分野において公知であり、公開された技術に従って調製することができる。例えば、ハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウイルスを記載する米国特許第５，８７１，９８２号明細書及び米国特許第６，２５１，６７７号明細書を参照されたい。種々のアデノウイルス株は、American Type Culture Collection, Manassas, Va.から入手可能であるか、又は請求によって種々の商業的及び施設的供給源から利用可能である。さらに、このような菌株の多くの配列は、例えば、ＰｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋを含む種々のデータベースから利用可能である。
細胞はまた、ＡＡＶにヘルパー機能を提供するベクター（例えば、ヘルパーベクター）をトランスフェクトされ得る。ヘルパー機能を提供するベクターは、例えば、Ｅｌａ、Ｅｌｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ＯＲＦ６を含むアデノウイルス機能を提供することができる。これらの機能を提供するアデノウイルス遺伝子の配列は、血清型２、３、４、７、１２及び４０などの任意の公知のアデノウイルス血清型から得ることができ、さらに、当該技術分野において公知である現在同定されているヒト型のいずれかを含むことができる。したがって、一部の態様では、本方法は、ＡＡＶ複製、ＡＡＶ遺伝子転写、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な１又は２以上の遺伝子を発現するベクターを細胞にトランスフェクトすることを伴う。
一部の態様では、単離されたカプシド遺伝子を用いて、組換えＡＡＶベクターを構築及びパッケージングし、当該技術分野において周知である方法を用いて、該遺伝子によりコードされる新規なカプシドタンパク質と関連する機能的特徴を決定することができる。例えば、単離されたカプシド遺伝子を用いて、レポーター遺伝子（例えば、Ｂ－ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼなど）を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを構築し、パッケージングすることができる。次に、ｒＡＡＶベクターを動物（例えば、マウス）に送達することができ、単離されたカプシド遺伝子の組織標的化特性は、動物の種々の組織（例えば、心臓、肝臓、腎臓）におけるレポーター遺伝子の発現を調べることによって決定することができる。単離されたカプシド遺伝子を特徴付けるための他の方法が本明細書に開示され、さらに他の方法は当該技術分野において周知である。
開示されるキットは、種々の形態、例えば、ブリスターポーチ、収縮包装されたポーチ、真空密封可能なポーチ、密封可能な熱成形トレイ、又は同様のポーチ若しくはトレイ形態を有することができ、付属品は、ポーチ内にゆるくパッキングされ、１若しくは２以上のチューブ、容器、ボックス又はバッグが含まれる。キットは、付属品が追加された後に滅菌することができ、それによって、容器内の個々の付属品を、そうでなければ、開封させることができる。キットは、任意の適切な滅菌技術、例えば、放射線滅菌、加熱滅菌、又は当該技術分野において公知である他の滅菌方法を用いて滅菌することができる。キットは、特定の用途に応じて、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝液、試薬、注射器、針、消毒剤を塗布又は除去するための布、例えばガーゼ、使い捨て手袋、投与前の薬剤のための支持体などの他の構成要素を含むこともできる。
キット内に含まれる指示書は、細胞における潜伏性ＡＡＶを検出するための方法を伴うことができる。さらに、本開示のキットには、指示書、陰性及び／又は陽性対照、容器、試料用の希釈剤及び緩衝液、試料調製チューブ、並びに配列比較のための参照ＡＡＶ配列の印刷された表又は電子表が含まれ得る。
［実施例］
ＡＡＶ９－ＮＧＬＹ１遺伝子補充療法のＩＣＶ送達は、Ｎｇｌｙ１欠損ラットにおける表現型及びバイオマーカーエンドポイントを改善する
ＮＧＬＹ１欠損症は、ＮＧＬＹ１の機能変異の喪失によって引き起こされる壊滅的であり、極めて稀な常染色体劣性疾患である。Ｇｒａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって世界中で約９０例の患者が確認され、公表されている。ＮＧＬＹ１遺伝子は、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路の一部としてプロテアソーム分解に向かうミスフォールドした糖タンパク質からＮ－グリカンを切断する保存酵素であるＮ－グリカナーゼ１をコードする。ＮＧＬＹ１欠損症の症状には、運動亢進、神経障害、筋緊張低下、側弯症、便秘、歩行異常、小さな手及び／又は足、肝機能異常、発達遅延、低／無涙症、痙攣、言語発達の欠如、並びに嚥下困難が含まれる。
本明細書では、ＮＧＬＹ１欠損症の治療のために全長ヒトＮＧＬＹ１遺伝子（ｈＮＧＬＹ１）の機能的コピーを送達するＡＡＶ９遺伝子治療（例えば、ＧＳ－１００）が開示される。
ベクター設計。本明細書では、ＣＡＧプロモーター（図８を参照されたい；さらに、配列番号８（ＣＡＧプロモーター及びポリＡシグナル配列に作動可能に連結された配列番号１のヌクレオチド配列を含む）又は配列番号９（隣接するＩＴＲ配列を有する構築物全体））の制御下、コドン最適化された全長バージョンのｈＮＧＬＹ１（配列番号１）を含有するｒＡＡＶ９ベクターが記載されている。
ベクターエレメントは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、キメラＣＢ－ＢＧイントロン、コドン最適化されたヒトＮＧＬＹ１ ｃＤＮＡ、ＷＰＲＥ－ｍｕｔ６エンハンサーエレメント、及びＲｂ－ＢＧポリＡシグナルである。ベクターは、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ，human embryonic kidney）２９３細胞培養産生系におけるＡＡＶ９カプシド中にパッケージングすることができる。ＧＳ－１００ベクターゲノム内のエレメントは、組織にわたって持続的な広範な発現を提供するように選択された。
プロモーター。ＣＡＧプロモーター（０．９７ｋｂ）は、ＣＭＶ初期エンハンサーとニワトリＢ－アクチンプロモーターを組み合わせて、組織にわたって広く発現させる。
エンハンサー。ＷＰＲＥ－ｍｕｔ６配列は、タンパク質発現を増加させるためにベクターに含まれた。
イントロン。ニワトリベータ－アクチンプロモーター（最初のエクソン及びイントロンを含む）とウサギベータ－グロビンイントロンの両方からの配列が、核外輸送及び翻訳を増加させるために含まれた。
導入遺伝子。導入遺伝子自体は、クローニング及び最適なタンパク質翻訳を可能にするために、その公知のコード配列（ＮＭ＿０１８２９７．４）から改変された。ウサギＢ－グロビンポリアデニル化部位は強力なポリアデニル化シグナルであり、ｍＲＮＡの安定性を促進し、発現レベルを維持するために含まれた。
方法。ＮＧＬＹ１欠損症のラットモデルを用いた。ラットは、ＧＳ－１００を生後３９日目から４５日目までに注射され、９週目に屠殺された。ＧＳ－１００は静脈内（ＩＶ，intravenous）、脳室内（ＩＣＶ）、又はその両方（二重ＩＶ＋ＩＣＶ）を順に投与された。ラットは、ロータロッド、位置（後ろ足立ちを伴うオープンフィールド）、及びバイオマーカー決定を用いて評価された。
結果。図１は、ＩＣＶ ＧＳ－１００投与が広範なベクターゲノム生体内分布をもたらすことを示す。ＧＳ－１００ベクターゲノム（ＶＧ）ＤＮＡをｑＰＣＲにより定量し、二倍体ゲノムあたりのＶＧコピーを計算した。結果は、ＩＣＶ及びＩＣＶ＋ＩＶ投与が、ＩＶ単独よりもＣＮＳ組織においてより高い生体内分布をもたらし、末梢組織（心臓及び肝臓）において広範な分布をもたらすことを示す。二重投与（ＩＣＶ＋ＩＶ）は、ＩＣＶ単独と比べて、生体内分布の一貫した有意な増加をもたらさなかった。ＩＶ投与は、ＩＣＶ又はＩＣＶ＋ＩＶ投与よりもＣＮＳにおける分布がかなり低かった。
ＧＳ－１００投与後の心臓、後根神経節、脊髄及び脳組織について免疫組織化学（ＩＨＣ，immunohistochemistry）分析を行い、対照と比較した。ラット組織のＩＨＣ分析は、ＧＳ－１００処置されたラットにおいてｈＮＧＬＹ１タンパク質発現を検出した。図２は、ＩＣＶ ＧＳ－１００投与がＣＮＳ ｈＮＧＬＹ１タンパク質発現をもたらすことを示す。ＩＣＶ及びＩＣＶ＋ＩＶ投与は、ＣＮＳにおいて実質的なｈＮＧＬＹ１タンパク質発現をもたらす。ＧＳ－１００のＩＶ投与のＩＣＨ分析は、ｈＮＧＬＹ１タンパク質の実質的なＣＮＳ発現を検出しなかった。
次に、ＮＧＬＹ１の非存在下では、糖タンパク質からＮ－グリカンを完全に切断できないことが、ＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ（ＧＮＡ）の蓄積をもたらす。例えば、ＧＮＡは、ＮＧＬＹ１欠損生物（ヒト細胞株及びラットデータを示す、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｐ＜０．０１；図３）において検出され得る。ＧＮＡバイオマーカーレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いてＧＳ－１００投与後に定量的に測定された。図４は、ＧＳ－１００投与がＧＮＡバイオマーカーレベルを減少させたことを示す。ＩＣＶ又はＩＣＶ＋ＩＶ投与は、ほとんどの組織におけるＧＮＡ蓄積を有意に減少させ（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐ＜０．０１）、二重投与によって追加の有意な利益は提供されない。ＧＳ－１００のＩＶ投与は、２つの脳領域及び一部の末梢組織におけるＧＮＡ蓄積を減少させる。
ＧＮＡバイオマーカーレベルの減少は、組織及び体液において相関する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定されたＧＮＡ濃度は、ＧＳ－１００投与後の組織マトリックスと液体マトリックスの間で比較された。図５は、脳組織中のＧＮＡ濃度がＣＳＦ中のＧＮＡ濃度と相関し（線形モデル、ｐ＜０．００１）、ＧＮＡ濃度が血漿中のＧＮＡ濃度と相関することを示す（線形モデル、ｐ＜０．０５）。これらのデータは、液体マトリックス中のＧＮＡ蓄積が、組織中の機能的ＮＧＬＹ１の存在のマーカーとして使用できることを示す証拠を提供する。
ＧＳ－１００はＮｇｌｙ１欠損ラットの行動障害を改善する。Ｎｇｌｙ１欠損ラットの行動分析は、野生型同腹仔と比較して、ロータロッドから落下するまでの時間の低下と、オープンフィールド運動試験における後ろ足立ちするそれらの能力によって評価した欠損を示す。ＧＳ－１００のＩＣＶ投与後、これらの行動の欠損は、治療されていない対照と比較して有意に改善した（ｐ＜０．０１）（図６を参照されたい）。ＩＣＶ＋ＩＶ投与では、ＩＣＶ投与と比較して行動改善に有意差はなかった。
ＧＮＡバイオマーカーの減少はまたＧＳ－１００と相関する。ＧＳ－１００ベクターゲノム（ＶＧ）ＤＮＡ及びｍＲＮＡ発現は、ｑＰＣＲ（Ｈｐｒｔ ｍＲＮＡ発現と比較したｈＮＧＬＹ１ ｍＲＮＡ）により決定した。図７は、ＧＮＡ蓄積レベルがＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて定量されたことを示す。ＧＳ－１００送達（ＶＧ ＤＮＡ）又は発現（ｍＲＮＡ）は、ＧＮＡ濃度と逆相関した（線形モデル、ｐ＜０．００１）。ＧＳ－１００投与後の改善された行動転帰は、ＧＮＡ濃度の減少と相関する。これらのデータは、ＧＮＡバイオマーカーが機能的ｈＮＧＬＹ１のＧＳ－１００媒介送達の薬力学的マーカーとして作用することを示す。
考察。ＧＳ－１００は、ＮＧＬＹ１欠損症の治療のための全長ヒトＮＧＬＹ１遺伝子の機能的コピーを送達するＡＡＶ９遺伝子治療である。Ｎｇｌｙ１欠損ラットへのＩＣＶ及びＩＣＶ＋ＩＶを介するＧＳ－１００投与は、ヒトＮＧＬＹ１ ＤＮＡをコードするＡＡＶ９の広範な生体内分布及び対応するヒトＮＧＬＹ１タンパク質発現をもたらす。ＩＶ投与はＣＮＳ組織への実質的な送達を提供しなかったが、ＩＣＶ又は二重経路ＩＣＶ＋ＩＶにより送達されたＧＳ－１００投与は、ＣＮＳにおけるバイオマーカーＧＮＡのレベルを有意に減少させた。ＩＣＶ及びＩＣＶ＋ＩＶ ＧＳ－１００で処置されたＮｇｌｙ１欠損ラットは、機能的行動試験における改善を示す。ＩＣＶ単独と比較したＩＣＶ＋ＩＶ投与は、ＣＮＳにおけるさらなるＧＳ－１００の形質導入若しくは発現レベル、又は行動表現型のさらなる改善を提供しなかった。ＧＳ－１００のＩＣＶ投与後のバイオマーカー減少は、ベクターＤＮＡの生体内分布、ｈＮＧＬＹ１ ｍＲＮＡ発現及び行動改善と相関した。組織ＧＮＡと体液ＧＮＡの相関は、ＧＮＡレベルとＧＳ－１００の相関と組み合わせて、ＧＮＡが機能的ヒトＮＧＬＹ１の送達のための薬力学的マーカーとして役立ち得ることを示す。
要約すると、これらのデータは、ＧＳ－１００のＩＣＶ送達がＮＧＬＹ１欠損症のための治療として有用であり得ることを示す証拠を提供する。
ＮＧＬＹ１欠損症に対するＡＡＶ９を媒介した遺伝子治療及びラット疾患モデルにおけるＧＮＡバイオマーカー変化の評価
最近、ＮＧＬＹ１患者由来の乾血スポット及び尿試料において、それぞれＧＮＡ及びＮＨＧＮＡの上昇が報告された。このデータに基づいて、細胞質ＧＮＡ（及びＮＨＧＮＡ）蓄積がＮＧＬＹ１欠損症の特徴であり、ＮＧＬＹ１活性の欠損と直接相関するかどうかを試験した。Ｎｇｌｙ１ノックアウトマウスは周産期致死であるが、Ｎｇｌｙ１ノックアウト（Ｎｇｌｙ１－／－）ラットモデルを用いた。これらのホモ接合体動物の約２５％は、離乳後も生存する。これらの生き残ったノックアウトの特徴付けは、初期体重の低下とロータロッド及び握力試験の異常を明らかにする。ＡＡＶ－ＮＧＬＹ１（ＧＳＬ－１４；ｈＮＧＬＹ１ ｃＤＮＡは、減少したＣｐＧ含有量について最適化されたコドンであり、ＣＡＧプロモーターを用いてＶ５タグを含めた；配列番号１１）で処置した後、これらの表現型、並びに血液、尿及びＣＳＦにおけるＧＮＡバイオマーカー変化の縦断的評価を行った。研究動物（野生型及びＮｇｌｙ１－／－ラット）のコホートは、５～７週齢で単回静脈内用量（３×１０１３のヒトＮＧＬＹ１を発現するＡＡＶ９ベクター）で処置された。血清／尿中のＧＮＡレベルは週１回モニタリングし、ＣＳＦは、未処置の野生型及びＮｇｌｙ１－／－対照と比較するために、研究終了の投与５週後に採取された。結果は、心臓におけるバイオマーカーの低下を示したが、脳及びＣＳＦでは示さなかった（図９を参照されたい）。ＧＮＡバイオマーカーは、ＮＧＬＹ１の酵素活性と密接に連結しており、患者の表現型と一致する運動ニューロン欠損の早期発病を示すＮＧＬＹ１疾患ラットモデルと組み合わせて、両者は、ＧＳ－１００遺伝子治療のインビボでの有効性を決定するために重要である。
配列番号１１（ＣＭＶエンハンサー－ＣＢプロモーター－キメライントロン－ｍｉｄＧＣ導入遺伝子コドン最適化－ＷＰＲＥｍｕｔ６－ｒＧＢポリＡ）：
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前述の発明は、理解を明確にする目的で、例証及び例として、ある程度詳細に記載されてきたが、ある特定の変更及び改変は、添付の特許請求の範囲内で行うことができる。
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Claims (39)

  1. それを必要とする対象におけるＮＧＬＹ１欠損症を治療する方法であって、前記対象のＣＮＳにおける発現のための調節エレメントに作動可能に連結された、ＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含む、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、ＩＣＶ投与によって又は大槽を介して前記対象に投与することを含む、前記方法。
  2. ＮＧＬＹ１をコードする配列が、コドン最適化されている、請求項１に記載の方法。
  3. ＮＧＬＹ１をコードする配列が、配列番号１である、請求項２に記載の方法。
  4. 調節エレメントがＣＡＧプロモーターを含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. キメライントロン配列が作動可能に連結され、ＮＧＬＹ１をコードするヌクレオチド配列に対して５’である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 核酸構築物が、ＷＰＲＥ－Ｍｕｔ６配列及びウサギベータグロビンポリＡシグナル配列をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 核酸構築物が配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 核酸構築物がＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 核酸構築物が配列番号９のヌクレオチド配列を有する、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. ｒＡＡＶがＡＡＶ９血清型であるか、又は配列番号１０（ＡＡＶ９配列）と少なくとも９５％同一であるカプシドを有する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 投与後、少なくとも５週間、１０週間、２０週間又は３０週間で、血漿、尿又は他の組織試料中のＧＮＡレベルが、前記投与前の患者の血漿、尿、ＣＳＦ又は他の組織試料中のＧＮＡレベルと比較して、１０％、２０％、５０％、７５％又は９０％減少する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 投与後、少なくとも５週間、１０週間、２０週間又は３０週間で、前記投与前の患者における症状と比べて、前記患者におけるＮＧＬＹ１欠損症の１若しくは２以上の症状の減少又は軽快が見られる、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 核酸が自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. ＮＧＬＹ１が対象のＣＮＳにおいて発現されるように調節エレメントに作動可能に連結された、配列番号１のヒトＮＧＬＹ１をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含有するＡＡＶ９カプシドを含む、ｒＡＡＶ。
  15. 調節エレメントが、ＣＡＧプロモーター、キメライントロン、ＷＰＲＥ－ＭＵＴ６配列及びＡＡＶ２－ＩＴＲ配列間のウサギベータグロビンポリＡシグナルを含む、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。
  16. 核酸構築物が配列番号８のヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。
  17. 請求項１２～１６のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。
  18. ｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水及び０．００１％ＰＦ６８を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. ＣＮＳにおけるヌクレオチド配列をコードするＮＧＬＹ１の発現のための調節エレメントに作動可能に連結された、配列番号１により規定されるコドン最適化されたＮＧＬＹ１をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  20. 配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列（ＩＴＲ配列を有する及び有さない構築物配列）を有する、請求項１９に記載の単離された核酸。
  21. 請求項１９又は２０に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
  22. ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする単離された核酸をさらに含む、請求項２１に記載の宿主細胞。
  23. カプシドタンパク質がＡＡＶ９である、請求項２２に記載の宿主細胞。
  24. 請求項２１又は２２に記載の宿主細胞を培養することによって、請求項１４又は１５に記載のｒＡＡＶを産生する方法。
  25. 対象のＣＮＳにおけるＧｌｃＮＡｃ－Ａｓｎ（ＧＮＡ）の蓄積を減少させる方法であって、前記対象のＣＮＳにおける発現のための調節エレメントに作動可能に連結されたヒトＮＧＬＹ１をコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含む、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、ＩＣＶ投与によって又は大槽を介して前記対象に投与することを含む、前記方法。
  26. ＮＧＬＹ１をコードする配列が、コドン最適化されている、請求項２５に記載の方法。
  27. ＮＧＬＹ１をコードする配列が、配列番号１である、請求項２６に記載の方法。
  28. 調節エレメントがＣＡＧプロモーターを含む、請求項２５～２７のいずれかに記載の方法。
  29. キメライントロン配列が作動可能に連結され、ＮＧＬＹ１をコードするヌクレオチド配列に対して５’である、請求項２５～２８のいずれかに記載の方法。
  30. 核酸構築物が、ＷＰＲＥ－Ｍｕｔ６配列及びウサギベータグロビンポリＡシグナル配列をさらに含む、請求項２５～２９のいずれかに記載の方法。
  31. 核酸構築物が配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項２５～３０のいずれかに記載の方法。
  32. 核酸構築物がＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する、請求項２５～３１のいずれかに記載の方法。
  33. 核酸構築物が配列番号９のヌクレオチド配列を有する、請求項２５～３２のいずれかに記載の方法。
  34. ｒＡＡＶがＡＡＶ９血清型であるか、又は配列番号１０（ＡＡＶ９配列）と少なくとも９５％同一であるカプシドを有する、請求項２５～３３のいずれかに記載の方法。
  35. 投与後、少なくとも５週間、１０週間、２０週間又は３０週間で、血漿、尿又は他の組織試料中のＧＮＡレベルが、前記投与前の患者の血漿、尿又は他の組織試料中のＧＮＡレベルと比較して、１０％、２０％、５０％、７５％又は９０％減少する、請求項２５～３４のいずれかに記載の方法。
  36. 投与後、少なくとも５週間、１０週間、２０週間又は３０週間で、前記投与前の患者における症状と比べて、前記患者におけるＮＧＬＹ１欠損症の１若しくは２以上の症状の減少又は軽快が見られる、請求項２５～３５のいずれかに記載の方法。
  37. 核酸が自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項２５～３６のいずれかに記載の方法。
  38. 請求項１４～１６のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む、それを必要とする対象におけるＮＧＬＹ１欠損症を治療する医薬組成物。
  39. 静脈内投与、ＩＣＶ投与、大槽投与又はそれらの組み合わせの群から選択される治療有効量で対象に投与される、請求項３８に記載の医薬組成物。
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