KR20220018504A - 암 치료를 위한 변이체 nrf2의 유전자 녹아웃 - Google Patents

암 치료를 위한 변이체 nrf2의 유전자 녹아웃 Download PDF

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KR20220018504A
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Abstract

본 개시내용은 DNA-결합 도메인 및 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 단백질-결합 도메인을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 제공하며, 여기서 상기 DNA-결합 도메인은 암 세포에서는 발견되지만 비-암성 세포에서는 발견되지 않는 변이체 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적이다. 본 개시내용은 또한 상기 gRNA를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 및 대상체의 변이체 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적인 가이드 RNA를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 대상체의 변이체 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 서열; 및 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법이 또한 제공된다.

Description

암 치료를 위한 변이체 NRF2의 유전자 녹아웃
관련 출원
본 출원은 2019년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/852,123호의 우선권 혜택을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원과 관련된 서열 목록은 EFS-Web을 통해 전자 형식으로 제출되며 이로써 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 130949_00220_SEQUENCELISTING.TXT이다. 텍스트 파일의 크기는 21 KB이며, 텍스트 파일은 2020년 5월 22일에 작성되었다.
분야
본 개시내용은 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR)/엔도뉴클레아제 유전자 편집을 사용하여 소정 암을 치료하기 위해 이러한 암에서 발견된 변이체 NRF2를 녹아웃시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
암은 현재 선진국에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 암 진단은 전통적으로 심각한 건강 합병증을 수반한다. 암은 기형, 만성 또는 급성 통증, 병변, 장기 부전 또는 심지어 사망을 유발할 수 있다. 통상적으로 진단되는 암은 폐암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 림프종, 암종, 육종 백혈병, 자궁내막암, 결장 및 직장암, 전립선암 및 방광암을 포함한다. 전통적으로, 많은 암은 수술, 화학요법, 방사선 또는 이들의 조합으로 치료된다.
NFE2L2 또는 NRF2로도 공지된 핵 인자(적혈구 유래의 2)-유사 2는 인간에서 NFE2L2 유전자에 의해 암호화되는 전사 인자이다. NRF2는 상해 및 염증에 의해 촉발되는 산화 손상으로부터 보호하는 항산화 단백질의 발현을 조절하는 염기성 류신 지퍼(bZIP) 단백질이다.
최근 연구는 더 캔서 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas)에 보고된 다양한 암 사례에서 체세포 NRF2 돌연변이의 목록을 작성하였다. Kerins, M. J. & Ooi, A, Sci. Rep. 8, Article No. 12846 (2018). 상기 연구는 33가지 상이한 종양 유형에서 발견된 NRF2 및 KEAP1 돌연변이의 비율뿐만 아니라 항시적(constitutive) NRF2 활성화를 담당하는 흔한 돌연변이를 식별하였다. 상기 연구는 214건의 NRF2 돌연변이 사례를 보고하였으며, 대부분의 사례는 폐 편평세포 암종에서 나타났다. 종양 유형에서 흔히 보이는 NRF2 돌연변이는 KEAP1 결합 도메인으로서 공지된 단백질의 Neh2 도메인 내에서 발견된다. KEAP1은 NRF2의 음성 조절인자이며 기본 조건 하에 NRF2 분해를 매개한다. 연구에서 보고된 돌연변이는 KEAP1 결합의 손실을 유발하고 암성 세포에서 NRF2의 항시적 발현을 유도한다. LUSC에서 보고된 가장 흔한 돌연변이인 R34G는 이 돌연변이가 Cas9 인식을 위한 새로운 PAM 부위를 형성하기 때문에 특히 관심대상이다. NRF2에서 코돈 34의 제1 염기는 시토신에서 구아닌으로 돌연변이되어 있다. 이러한 새로운 PAM 부위는 암성 세포 및 비-암성 세포가 분화될 수 있게 한다. 마찬가지로 새로운 PAM 부위를 형성하는 NRF2의 Neh2 도메인 내에서 보고된 몇 가지 다른 돌연변이가 있다. Frank, R. et al., Clin. Cancer Res. 24:3087-96 (2018); Menegon, S., Columbano, A. & Giordano, S. The Dual Roles of NRF2 in Cancer. Trends in Molecular Medicine (2016); Shibata, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105:13568-73 (2008). CRISPR/Cas9에 대한 새로운 인식 부위로서 공지된 돌연변이를 사용하여 유사한 실험이 수행되었다. Cheung, A. H. K. et al., Lab. Investig. 98:968-76 (2018).
암 치료에 사용되는 화학치료제는 환자에서 몇가지 심각하고 불쾌한 부작용을 일으키는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 화학치료제는 신경병증, 신독성, 구내염, 탈모증, 면역 감소, 빈혈, 심장독성, 피로, 신경병증, 골수억제 또는 이들의 조합을 유발한다. 종종, 화학요법은 치료 동안 또는 치료 용법(treatment regimen)이 완결된 직후에, 효과가 없거나 일정 효능 기간 후에 효과를 상실한다.
따라서, 개선된 암 치료 방법에 대한 필요성이 존재한다.
개요
한 측면은 암 세포에서 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, (a) 변이체 NRF2 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열 및 (b) 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 암 세포 내로 도입하고, 이로 인해 하나 이상의 gRNA가 변이체 NRF2 유전자에 하이브리드화하고 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 변이체 NRF2 유전자를 절단하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 암 세포에서의 NRF2 발현 또는 활성은 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열이 도입되지 않은 암 세포에 비해 감소되는, 방법에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 서열에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 전사-활성화된 소형 RNA(tracrRNA) 및 CRISPR RNA(crRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 하나 이상의 단일 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제이고, 일부 실시형태에서, 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 Cas12a이다. 일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자의 하나 이상의 대립유전자(들)의 발현은 암 세포에서 감소된다. 일부 실시형태에서, NRF2 활성은 암 세포에서 감소된다. 일부 실시형태에서, NRF2 발현 또는 활성은 암 세포에서 완전히 제거되지 않는다. 일부 실시형태에서, NRF2 발현 또는 활성은 암 세포에서 완전히 제거된다. 일부 실시형태에서, 암 세포는 폐암 세포이고; 일부 실시형태에서, 폐암 세포는 비소세포 폐암 세포(NSCLC)이고; 일부 실시형태에서, NSCLC는 선암종, 편평세포 암종 또는 대세포 암종이다. 일부 실시형태에서, 암 세포를 함유하는 대상체의 비-암성 세포에서 야생형 NRF2의 발현 또는 활성은 (a)의 하나 이상의 DNA 서열 및 (b)의 핵산 서열의 도입에 의해 영향을 받지 않는다. 일부 실시형태에서, 암 세포에서 변이체 NRF2 유전자에 의해 암호화되는 변이체 NRF2 폴리펩타이드는 (a) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (b) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (c) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (d) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (e) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; (f) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; (g) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; 또는 (h) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자는 (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 측면은 전술한 방법에 의해 생산된 돌연변이된 NRF2 유전자 변이체를 포함하는 암 세포에 대한 것이다.
추가 측면은 암 세포에서 변이체 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, (a) 변이체 NRF2 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA) 및 (b) 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 암 세포 내로 도입하고, 이로 인해 하나 이상의 gRNA가 변이체 NRF2 유전자에 하이브리드화하고 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 변이체 NRF2 유전자를 절단하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 암 세포에서의 변이체 NRF2 발현 또는 활성은 하나 이상의 gRNA 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 도입되지 않은 암 세포에 비해 감소되는, 방법에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 서열에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 전사-활성화된 소형 RNA(tracrRNA) 및 CRISPR RNA(crRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA는 하나 이상의 단일 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제이고; 일부 실시형태에서, 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 Cas12a이다. 일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자의 하나 이상의 대립유전자(들)의 발현은 암 세포에서 감소된다. 일부 실시형태에서, NRF2 활성은 암 세포에서 감소된다. 일부 실시형태에서, NRF2 발현 또는 활성은 암 세포에서 완전히 제거되지 않는다. 일부 실시형태에서, NRF2 발현 또는 활성은 암 세포에서 완전히 제거된다. 일부 실시형태에서, 암 세포는 폐암 세포이고; 일부 실시형태에서, 폐암 세포는 비소세포 폐암 세포(NSCLC)이고; 일부 실시형태에서, NSCLC는 선암종, 편평세포 암종 또는 대세포 암종이다. 일부 실시형태에서, 암 세포를 함유하는 대상체의 비-암성 세포에서 야생형 NRF2의 발현 또는 활성은 (a)의 하나 이상의 DNA 서열 및 (b)의 핵산 서열의 도입에 의해 영향을 받지 않는다. 일부 실시형태에서, 암 세포에서 변이체 NRF2 유전자에 의해 암호화되는 변이체 NRF2 폴리펩타이드는 (a) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (b) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (c) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (d) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (e) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; (f) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; (g) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; 또는 (h) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자는 (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 또는 서열번호 7의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 또는 서열번호 7의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 또는 서열번호 7의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 또는 서열번호 7의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열(a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57; (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
추가의 측면은 전술한 방법에 의해 생성된 돌연변이된 변이체 NRF2 유전자를 포함하는 암 세포에 대한 것이다.
또 다른 측면은 DNA-결합 도메인 및 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 단백질-결합 도메인을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)에 대한 것이고, 여기서 상기 DNA-결합 도메인은 변이체 NRF2 유전자 내의 표적 서열에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자는 (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 유전자에 상보적이다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 도메인은 서열번호 18,서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 53, 서열번호 55 또는 이들의 생물학적 활성 단편의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 전사-활성화된 소형 RNA(tracrRNA) 및 CRISPR RNA(crRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 가이드 RNA이다.
추가 측면은 전술한 gRNA를 포함하는 약제학적 조성물에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하고; 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제이고; 일부 실시형태에서, 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 Cas12a이다.
추가 측면은 전술한 gRNA 및 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제이고; 일부 실시형태에서, 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 Cas12a이다.
또 다른 측면은 전술한 RNP 복합체를 포함하는 약학 조성물에 대한 것이다.
추가 측면은 전술한 gRNA 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 DNA 서열에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 활성 단편은 tracrRNA 또는 crRNA이다. 일부 실시형태에서, DNA 서열은 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 54 또는 서열번호 56의 핵산 서열을 포함하고; 일부 실시형태에서, 생물학적 활성 단편은 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 54 또는 서열번호 56의 핵산 서열을 포함하는 crRNA이다.
추가적인 측면은 전술한 DNA 서열을 포함하는 벡터에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고; 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제이고; 일부 실시형태에서, 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 Cas12a이다.
또 다른 측면은 전술한 DNA 서열 또는 전술한 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 전술한 DNA 서열을 포함하고 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고; 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제이고; 일부 실시형태에서, 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 Cas12a이다.
추가 측면은 치료학적 유효량의 전술한 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 대상체의 비-암성 세포에서의 야생형 NRF2의 발현 또는 활성은 약제학적 조성물의 투여에 의해 영향을 받지 않는다. 일부 실시형태에서, 암은 하나 이상의 화학치료제에 내성이다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암이고; 일부 실시형태에서, 폐암은 비소세포 폐암(NSCLC)이고; 일부 실시형태에서, NSCLC는 선암종, 편평세포 암종 또는 대세포 암종이다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 화학치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고; 일부 실시형태에서, 하나 이상의 화학치료제는 시스플라틴, 비노렐빈, 카보플라틴 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로 치료되지 않은 암 세포에 비해 암 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로 치료되지 않은 종양에 비해 종양 성장을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 화학치료제로 치료되지만 약제학적 조성물로 치료되지 않은 암 세포에 비해 암 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 화학치료제로 치료되지만 약제학적 조성물로 치료되지 않은 종양에 비해 종양 성장을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
다른 목적 및 이점은 이하의 상세한 설명을 참조하여 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 CRISPR 설계 및 NRF2 녹아웃 실험 작업 흐름을 도시한다. 6가지의 공지된 유전적 이소형을 포함하는 NRF2 암호화 영역은 CRISPR/Cas9에 의한 표적화를 위해 사용되었다. gRNA 서열은 염색체 좌위 및 클로닝 세부정보와 함께 표시된다(a). NRF2 단백질의 CRISPR-지시된 유전자 편집의 구조적 도메인 및 위치(b). 표적화된 집단과 단리 및 증식된 클론 세포주에서 NRF2의 CRISPR/Cas9 녹아웃 효율을 시험하기 위한 실험 작업 흐름(c).
도 2a 및 도 2b는 NRF2 녹아웃 클론의 게놈 분석을 도시한다. gRNA1 또는 gRNA2로 형질감염된 대규모 분류된 GFP+ A549 세포를 생거(Sanger) 시퀀싱하고 TIDE에 의해 인델(indel, 삽입과 결실) 활성에 대해 분석하였다(a). 클론으로 단리된 NRF2 표적화된 세포를 CRISPR/Cas9 유도된 NHEJ 활성에 대해 게놈 분석하였다. 게놈 DNA를 생거 시퀀싱하고, TIDE를 사용하여 클론 1-40 및 2-11에 대해 도시된 바와 같이 NRF2의 인델 스펙트럼, 서열 분해 및 대립유전자 패턴을 개발하였다(b).
도 3a 및 도 3b는 NRF2 녹아웃 A549 세포의 세포 증식 프로파일 및 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 세포를 72시간 동안 에탄올로 고정시키고 Alexa Fluor 647 항-Ki67로 염색하였다. 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 Ki67-염색된 세포의 강도를 캡처하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 히스토그램으로서 플로팅하였다(좌측 패널)(a). 세포 증식을 MTS의 포르마잔 생성물로의 생물 환원(bioreduction)을 통해 측정하고 평균 원시 흡광도 값으로 플롯팅하고(우측 패널) 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다(a). 인산화된 NRF2에 대한 항체를 사용한 야생형 A549 세포 및 NRF2 녹아웃 2-11 세포의 웨스턴 블롯 분석(b).
도 4a 및 도 4b는 화학치료 약물에 대한 반응으로서 야생형 및 NRF2 변형된 A549 세포(2-11)의 증식능을 도시한다. 증식은 MTS의 포르마잔 생성물로의 생물 환원을 통해 측정하였다. 세포를 72시간 동안 증가하는 용량의 시스플라틴(a) 및 5μM 비노렐빈과 함께 증가하는 용량의 시스플라틴(b)으로 처리한 다음, 세포 증식을 평가하였다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다.
도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d 및 도 5e는 종양에 NRF2 녹아웃을 갖는 마우스에서 복원된 화학민감성을 도시한다. 마우스 이종이식편의 실험적 작업 흐름. 무흉선 누드 마우스에 야생형 A549 세포 또는 NRF2 녹아웃 A549 세포를 피하 주사하고, 일단 확립된 종양이 100 mm3에 도달하면, 0일차에 화학요법의 제1 용량으로 처리하였다. 후속적으로 마우스를 3일, 6일, 9일차에 화학요법으로 처리하였다. 종양이 2000 mm3에 도달할 때까지 16일 동안 종양 용적을 매일 측정하였다(a). 야생형 A549 또는 NRF2 녹아웃 A549 종양을 2mg/kg의 시스플라틴(b), 5mg/kg의 시스플라틴과 5mg/kg의 비노렐빈(c), 25mg/kg의 카보플라틴(d) 또는 식염수로 처리하고, 종양 크기를 16일 동안 측정하였다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다. 종양(2mg/kg의 시스플라틴 또는 식염수로 처리됨)을 야생형 A549 이식된 마우스와 NRF2 녹아웃 A549(2-11) 이식된 마우스 둘 다로부터 추출하였다. 각 그룹의 대표적인 종양이 도시되어 있다(n=3)(e).
도 6은 이종이식 종양의 증식을 도시한다. 2mg/kg 시스플라틴 또는 식염수의 초기 처리 후 16일차에 야생형 A549 또는 NRF2 녹아웃 A549 세포(2-11)가 이식된 마우스로부터 추출된 이종이식 종양을 절단하고 Ki67(녹색) 및 DAPI(파란색)로 염색한 대표적인 이미지. DAPI 및 Ki67에 대한 형광 강도 평균 값을 Zeiss Zen 소프트웨어를 사용하여 이미지에 대해 수득하고, Ki67의 형광 강도에 대한 상대적 값을 수득하였다. 축척 막대는 100 ㎛를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 야생형 A549 세포 및 클론 2-11에서 NRF2의 시스플라틴-유도된 핵 및 세포질 국소화를 도시한다. 세포를 2μM 시스플라틴으로 처리하고 고정시키고 NRF2에 대해 염색하였다. 면역세포화학은 형광 현미경을 사용하여 수행하였다. 무작위 시야를 이미지화하고, 총 세포 수/시야를 계수하였다. 각 카테고리에서 분석된 총 세포에 대한 NRF2 양성 염색된 세포의 퍼센트를 상기 그래프에 플롯팅하였다. 오차 막대는 ± SEM을 나타내고 *는 <0.05인 유의한 p 값을 나타낸다(스튜던트 t-검정)(a). 야생형 A549 및 NRF2 녹아웃 A549(2-11)에서 NRF2의 핵 및 세포질 국소화의 대표적인 이미지(b). 축척 막대는 50 ㎛를 나타낸다.
도 8은 NRF2의 엑손 4에서 103개 염기를 절단하기 위해 2개의 CRISPR 플라스미드 작제물을 사용한 클론 분석을 도시한다. 상단 패널은 문헌[Bialk et al., Mol. Ther. - Oncolytics 11, 75-89 (2018)]에 의해 설계 및 사용된 gRNA1 및 gRNA2의 구조적 도메인 및 표적 영역을 나타낸다. 하단 패널은 형광 활성화된 단일 세포 분류(FACS)에 의해 회수된 다양한 클론의 유전자 분석을 나타낸다. 녹색의 서열은 야생형 서열을 나타내고 빨간색으로 강조 표시된 염기는 정지 코돈을 초래하는 프레임시프트를 나타낸다.
도 9는 CRISPR/Cas9-표적화 세포의 집단 서열 분석을 도시한다. A549 세포주를 gRNA 5' TGGATTTGATTGACATACTTTGG 3'(서열번호 13)을 사용하여 엑손 2 내의 Neh2 도메인을 표적화하는 RNP 복합체로 형질감염시켰다. 형질감염 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간차에 세포를 수집하였다. DNA를 단리하고 (NRF2의 엑손 2에 걸쳐) 시퀀싱하고 분해에 의한 인델 추적(Tracking of Indels by DEcomposition: TIDE)을 사용하여 분석하였다. 인델 효율(%)은 본 도면에 나열되어 있다.
도 10은 CRISPR/Cas12a-표적화된 세포의 집단 서열 분석을 도시한다. A549 세포주를 gRNA 5' TTTGATTGACATACTTTGGAGGCAA 3'을 사용하여 엑손 2 내의 Neh2 도메인을 표적화하는 RNP 복합체로 형질감염시켰다. 형질감염 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간차에 세포를 수집하였다. DNA를 단리하고 (NRF2의 엑손 2에 걸쳐) 시퀀싱하고 TIDE를 사용하여 분석하였다. 인델 효율(%)은 본 도면에 나열되어 있다.
도 11은 폐 종양 DNA 서열의 CRISPR 표적 인식을 도시한다. R34G 돌연변이를 표적화하는 gRNA를 사용하여 CRISPR/Cas9 RNP 복합체로 시험관내 절단 반응을 수행하였다. 반응은 R34G 돌연변이를 함유하는 NRF2 발현 플라스미드의 절단을 시험하는 것뿐만 아니라 발현 플라스미드로부터 901개 염기쌍 길이의 앰플리콘 사용하는 것을 포함하였다. 두 경우 모두, R34G RNP는 존재하는 돌연변이만을 인식하고 절단하여 새로운 PAM 부위를 생성한다.
도 12는 다양한 길이의 R34G sgRNA를 사용하여 표적이탈(off target)을 평가하기 위한 sSchematic 다이어그램 및 실험 설계를 도시한다. 표적적중(on target) 및 표적이탈 인델 효율을 평가하기 위해 PAM 부위로서 R34G 돌연변이를 사용하여 5가지 sgRNA를 설계하였다. 본 도면은 CRISPR/Cas9 복합체화, 폐암 세포주의 형질감염, 샘플 수집 및 분석을 포함하는 실험 설계의 개요를 제시한다.
도 13은 다양한 길이의 R34G sgRNA의 인델 효율에 대한 TIDE의 유전자 분석- 반복물 1- 을 도시한다. H1703 모 세포주는 복합체화된 CRISPR/Cas9 RNP(250 pmol sgRNA 대 50 pmol Cas9)로 형질감염시켰다. 72시간의 회수 기간 후, 게놈 DNA 단리, PCR 증폭, 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석을 위해 각 R34G sgRNA 길이에 대한 샘플을 수집하였다. 본 도면은 반복물 1의 TIDE에 의한 유전자 분석을 도시한다.
도 14는 다양한 길이의 R34G sgRNA의 인델 효율에 대한 TIDE에 의한 유전자 분석- 반복물 2 -을 도시한다. H1703 모 세포주는 복합체화된 CRISPR/Cas9 RNP(250 pmol sgRNA 대 50 pmol Cas9)로 형질감염시켰다. 72시간의 회수 기간 후, 게놈 DNA 단리, PCR 증폭, 생거 시퀀싱 및 TIDE 분석을 위해 각 R34G sgRNA 길이에 대한 샘플을 수집하였다. 본 도면은 반복물 2의 TIDE에 의한 유전자 분석을 도시한다.
도 15는 표적적중 분석의 요약을 도시한다. 본 도면에 제공된 표는 각 반복물에 대한 각 실험으로부터의 총 인델 효율(절단으로 나열됨)을 편집한 것이다. "절단 없음" 컬럼은 대조 샘플에 대해 정렬된 서열의 백분율을 의미한다.
도 16은 A549 엑손(Neh2) KO 클론의 DECODR에 의한 인델 디콘볼루션(deconvolution)을 도시한다. 엑손 2의 시작부터 78bps 하류의 Neh2 도메인을 암호화하는 단일 gRNA를 사용하여 엑손 2를 표적화하였다. 3가지 클론 1-17, 2-16, 2-23을 클론 증식시키고 DECODER 툴을 사용하여 인델 효율을 분석하였다. 클론 1-17은 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 절단 부위에 -2, -2, -13bp 결실을 함유한다. 클론 2-16은 절단 부위에서 모든 대립유전자에 걸쳐 -1bp 결실을 포함한다. 클론 2-23은 2개의 야생형 대립유전자와 절단 부위에 -2bp 결실을 함유하는 다른 대립유전자를 함유한다.
도 17은 시스플라틴으로 처리된 A549 Neh2 KO 클론을 사용하여 MTS에 의해 측정한 상대적 세포 증식의 산점도 그래프를 도시한다. 본 도면은 동일한 실험 절차를 사용하여 수행된 2가지 별개의 실험의 MTS 검정으로부터 컴파일된 데이터를 포함한다. 각 클론 유래의 세포주(클론 1-17, 2-16, 2-23)를 4반복으로 플레이팅하고 증가하는 농도의 시스플라틴(1, 2, 3, 5, 10 μM)으로 처리하였다. 모든 흡광도 값을 정규화하고 두 반복물 모두에 걸친 각 농도 값과 클론에 대해 평균화한 다음, 그래프로 작성하였다. 오차 막대는 그래프 아래의 표에 나열된 ± SEM을 나타낸다.
도 18은 시스플라틴으로 처리된 A549 Neh2 KO 클론을 사용하여 MTS에 의해 측정한 상대적 세포 증식의 막대 그래프를 도시한다. 본 도면은 동일한 실험 절차를 사용하여 수행된 2가지 별개의 실험의 MTS 검정으로부터 컴파일된 데이터를 포함한다. 각 클론 유래의 세포주(클론 1-17, 2-16, 2-23)를 4반복으로 플레이팅하고 증가하는 농도의 시스플라틴(1, 2, 3, 5, 10 uM)으로 처리하였다. 모든 흡광도 값을 정규화하고 두 반복물 모두에 걸친 각 농도 값과 클론에 대해 평균화한 다음, 그래프로 작성하였다. 오차 막대는 그래프 아래의 표에 나열된 ± SEM을 나타낸다.
도 19. 보고 및 특성규명된 NRF2 돌연변이의 카탈로그. NRF2 돌연변이는 유전자의 엑손 2에서 발견되는 단백질의 Neh2 도메인에서 주로 볼 수 있다. 각 돌연변이에 대한 염기 변화는 빨간색 텍스트로 표시되어 있다. Cas9 인식을 위한 새로운 PAM 부위를 생성하는 돌연변이는 자홍색으로 도시되어 있다. 보고된 다른 돌연변이들은 녹색으로 도시되어 있다.
도 20. NRF2의 구조적 도메인 및 선택적 표적화. 상단 패널에 도시된 R34G 돌연변이는 NRF2 단백질의 Neh2 도메인을 암호화하는 NRF2 유전자의 엑손 2에서 발생한다. 하단 패널은 R34G 돌연변이(TCG→TGG)를 통한 새로운 CRISPR/Cas9 PAM 부위 생성의 도식을 제시한다.
도 21. NRF2 발현 플라스미드에서 R34G 돌연변이의 재현. NRF2 발현 플라스미드(pcDNA3-EGFP-C4-NRF2, Addgene)는 2개의 CRISPR/Cas12a 절단 부위 및 이중체화(duplexed) 올리고뉴클레오타이드를 이용한 CRISPR-지시된 돌연변이유발법을 사용하여 R34G 돌연변이를 포함하도록 돌연변이되었다.
도 22. R34G 돌연변이를 CRISPR/Cas9 절단 부위로서 사용한 시험관내 절단 반응의 개념 증명. 야생형(WT NRF2) 및 돌연변이된(R34G NRF2) NRF2 발현 플라스미드의 앰플리콘을 절단 반응을 위해 사용하고 겔 전기영동에 의해 시각화하였다. 레인 1 및 레인 5는 완충액과만 항온배양된 앰플리콘이다(음성 대조군). 레인 2 및 레인 5는 비특이적 RNP(HBB RNP)와 항온배양된 앰플리콘이다. 레인 3 및 레인 6은 R34G RNP와 항온배양된 앰플리콘이다. 빨간색 막대는 비절단 앰플리콘(90 1bp) 및 절단 생성물(222bp)의 크기를 나타낸다.
도 23. A549 및 H1703 모 세포주 및 A549 R34G-돌연변이된 세포주의 NRF2 서열 분석. 각 세포주로부터의 게놈 DNA를 생거 시퀀싱하고 Neh2 도메인(엑손 2)의 돌연변이에 대해 분석하였다. A549 및 H1703 모 세포주는 야생형 서열을 함유하고; 반면에 A549 R34G-6 클론은 빨간색 화살표로 표시된 이형접합 R34G 돌연변이를 함유한다.
도 24. 다양한 농도의 R34G RNP를 사용한 야생형 및 R34G-돌연변이된 NRF2 앰플리콘의 시험관내 절단 반응. A549 모 세포 및 R34G-6 세포로부터의 NRF2 앰플리콘을 증가하는 농도의 R34G RNP와 함께 항온배양하고 겔 전기영동에 의해 시각화하였다. 레인 1 및 레인 6은 완충액과만 항온배양된 NRF2 앰플리콘이다. 레인 2 내지 5는 R34G RNP와 항온배양된 야생형 NRF2 앰플리콘이다. 레인 7 내지 10은 R34G RNP와 항온배양된 R34G-돌연변이된 NRF2 앰플리콘이다. 빨간색 막대는 비절단 앰플리콘(530bp) 및 절단 생성물(145 및 385bp)의 크기를 나타낸다.
도 25. 다양한 농도의 Neh2-표적화 RNP 및 R34G-표적화 RNP를 사용한 야생형 및 R34G-돌연변이된 NRF2 앰플리콘의 시험관내 절단 반응. A549 모 세포 및 R34G-6 세포로부터의 NRF2 앰플리콘은 유전자의 엑손 2(Neh2로 표시됨) 내의 천연 부위 또는 돌연변이된 세포에만 존재하는 R34G 돌연변이를 표적화하는 RNP와 함께 항온배양하였다. 각각의 RNP의 농도를 증가시키면 NRF2 앰플리콘과 항온배양하고 겔 전기영동에 의해 시각화하였다. 레인 1, 레인 5, 레인 9 및 레인 13은 완충액과만 항온배양된 NRF2 앰플리콘이다. 레인 2 내지 4 및 레인 10 내지 12는 Neh2-표적화 RNP와 항온배양된 NRF2 앰플리콘이다. 비절단 앰플리콘은 530bp에서 시각화될 것이고 절단 생성물은 116 및 414bp에서 시각화될 것이다. 레인 6 내지 8 및 레인 14 내지 16은 R34G-표적화 RNP와 항온배양된 NRF2 앰플리콘이다. 비절단 앰플리콘은 530bp에서 시각화되고 절단 산물은 145 및 385bp에서 시각화될 것이다.
도 26. 다양한 농도의 R34G RNP와 야생형 및 R34G-돌연변이된 NRF2 앰플리콘을 사용한 시험관내 절단 반응. A549 모 세포, H1703 모 세포 및 A549 R34G-6 세포로부터의 NRF2 앰플리콘을 1 및 5 pmol의 R34G RNP와 함께 항온배양하고 겔 전기영동에 의해 시각화하였다. 레인 1, 레인 4 및 레인 7은 완충액과만 항온배양된 NRF2 앰플리콘이다. 레인 2, 레인 3 및 레인 5, 레인 6은 R34G RNP와 항온배양된 야생형 NRF2 앰플리콘이다. 레인 8 및 레인 9는 R34G RNP와 항온배양된 R34G 돌연변이된 NRF2 앰플리콘이다. 빨간색 막대(사다리의 우측)는 비절단 앰플리콘(530bp) 및 절단 생성물(145 및 385bp)의 크기를 나타낸다.
도 27. A549 모세포에서 R34G-표적화 RNP 활성의 유전자 분석. 게놈 DNA를 유전자 편집 활성의 척도로서 TIDE 분석에 의해 분석하였다. 상단 패널은 미분류된 대규모 집단의 인델 효율 및 서열 정렬을 나타낸다. 총 인델 효율은 11.4%이고 분홍색 막대로 표시된 통계적으로 유의한 하나의 결실이 있는 반면, 나머지 삽입 및 결실은 통계적으로 유의하지 않은 것으로 간주된다(검정색 막대 - p 값 > 0.001). 중간 패널은 통계적으로 유의하지 않은 삽입 또는 결실만을 갖는 대규모 GFP-양성 분류된 집단으로부터의 3.0%의 총 인델 효율을 나타낸다. 하단 패널은 하나의 통계적으로 유의한 삽입을 갖는 대규모 GFP-양성 분류된 집단으로부터의 11.3%의 총 인델 효율을 나타낸다.
도 28. A549 R34G-돌연변이된 클론 세포주(A549 R34G-6)에서 R34G-표적화 RNP 활성의 유전자 분석. 게놈 DNA를 TIDE 분석에 의해 분석하였다. 상단 패널은 34.2%의 총 인델 효율 및 통계적으로 유의한 삽입(+1bp) 및 결실(-9bp)과 함께 몇가지 유의하지 않은 결실을 갖는 미분류된 대규모 집단의 인델 효율 및 서열 정렬을 도시한다. 중간 패널은 통계적으로 유의한 몇가지 삽입과 결실 및 유의하지 않은 결실을 갖는 대규모 GFP-양성 분류된 집단으로부터 55.7%의 총 인델 효율을 도시한다. 하단 패널은 대규모 GFP-양성 분류된 집단으로부터 32.7%의 총 인델 효율과 유의한 및 유의하지 않은 삽입과 결실을 모두 나타낸다.
도 29. H1703 모 세포주에서 R34G-표적화 RNP의 형질감염 후 유전자 분석. 게놈 DNA는 TIDE 분석에 의한 것이었다. 상단 패널은 대규모 미분류된 집단으로부터 0.0%의 총 인델 효율을 나타낸다. 하단 패널은 대규모 GFP-분류된 집단으로부터 4.6%의 총 인델 효율 및 유의하지 않은 인델만을 나타낸다.
도 30은 H1703 NRF2 KO 클론 유래의 세포주의 유전자 분석을 도시한다. H1703 세포주를 엑손 2 gRNA 3 및 R34G ssDNA 주형으로 형질감염시켰다. 세포를 증식시키고 분석하였다. 추가의 특성규명을 위해 몇가지 NRF2 KO 클론을 선택하였다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 화학내성 A549 폐암 세포에서 CRISPR/Cas9를 사용한 NRF2 유전자의 성공적인 녹아웃이 시험관내 배양 및 이종이식 마우스 모델 둘 다에서 암 세포의 증식을 감소시키고 항암 약물 시스플라틴, 카보플라틴 및 비노렐빈의 효과를 증가시켰다는 발견에 기초한다. 전반적인 전략은 CRISPR/Cas 유전자 편집 도구를 설계하고 이용하여 암 세포 내의 NRF2 유전자를 무능화시킴으로써 기능적 단백질을 생산할 수 없도록 하는 것이었다. CRISPR/Cas9 복합체는 표적 유전자와 함께 상동 레지스터에서 정렬되어 이중가닥 DNA 절단을 실행할 수 있다. 이러한 작업은 가장 빈번하게 비상동 말단 연결(NHEJ)로서 공지된 과정을 통해 세포가 절단을 재폐쇄하려는 시도가 뒤따른다. 재폐쇄는 종종 불완전하고 불충실한데, 그 과정 동안 다수의 뉴클레오타이드가 손실되어 유전자 프레임시프트 및 후속적으로 NRF2의 유전자 녹아웃인 비기능성 전사체의 생산이 초래되기 때문이다.
본원에 설명된 조성물은 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9), 및 NRF2 유전자(예를 들어, NRF2 유전자의 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5)에 상보적인 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함한다. 가이드 RNA 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물뿐만 아니라, 암 치료를 위해 대상체에게 상기 조성물을 투여하는 방법이 또한 설명된다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 정상(즉, 비-암성) 세포의 야생형 NRF2 유전자가 아닌 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자(예를 들어, 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5)에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2의 서열에 상보적이다.
정의
본 출원인은 본 개시내용에서 인용된 모든 참고문헌의 전체 내용을 구체적으로 포함시킨다. 또한, 양, 농도 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위 또는 상한값 및 하한값의 나열로 주어질 경우에, 범위가 별도로 개시되었는지의 여부에 상관없이, 임의의 상한 범위 한계값 또는 값과 임의의 하한 범위 한계값 또는 값의 임의의 쌍으로부터 형성되는 모든 범위는 구체적으로 개시된 것으로 이해되어야 한다. 수치 범위가 본원에서 언급될 경우에, 달리 명시하지 않는 한, 상기 범위에는 이의 종점, 및 그 범위 내의 모든 정수 및 분수를 포함시키고자 한다. 본 개시내용의 범주를 범위를 한정할 때 언급된 특정 값으로 제한하지 않고자 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 부정관사 "a" 및 "an"은 명백하게 반대로 나타내지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 명세서 및 청구범위에 사용된 문구 "및/또는"은 이렇게 연결된 요소들, 즉 일부 경우에는 공동으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소들 중 "하나 또는 양쪽 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소는, 반대로 명백하게 표시되지 않는 한 구체적으로 식별된 요소와 관련되든지 또는 관련되지 않든지, 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 표현과 함께 사용되었을 때, "A 및/또는 B"의 언급은 한 실시형태에서 B 없이 A(B 이외의 요소를 임의로 포함함)를 의미할 수 있고; 다른 실시형태에서 A 없이 B(A 이외의 요소를 임의로 포함함)를 의미할 수 있고; 또 다른 실시형태에서 A 및 B 양쪽 모두 (기타 요소를 임의로 포함함)를 지칭할 수 있다.
본원에서 명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같이, "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 의미가 동일한 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 다수의 요소 또는 열거된 요소 중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 1개 초과를 포함하고 추가적인 열거되지 않은 항목을 임의로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 오직 하나" 또는 "~ 중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용된 경우의 "~로 이루어지는"과 같은, 명백하게 이와 반대로 지시된 용어들만이 다수의 요소 또는 열거된 요소 중 정확하게 1개의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "어느 하나", "~ 중 하나", "~ 중 오직 하나" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배타적인 용어가 선행하는 경우에만 배타적인 대안(즉, "하나 또는 다른 하나이지만 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로 해석될 것이다. 청구범위에서 사용될 때, "~로 본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 통상의 의미를 지닐 것이다.
양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약"은 명시된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1% 또는 ±0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미하는데, 이러한 편차가 개시된 방법을 수행하는데 적절하기 때문이다.
"클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 단백질-단백질 도메인" 또는 "Cas 결합 도메인"은 하나 또는 복수의 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능적 단편)와 유효량에서 결합하거나 이에 대한 친화도를 가질 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 핵산 요소 또는 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 복수의 단백질(또는 이의 기능적 단편) 및 표적 서열의 존재 하에, 하나 또는 복수의 단백질 및 핵산 요소는 생물학적 활성 CRISPR 복합체를 형성하고/하거나 표적 서열 상에서 효소적으로 활성일 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 클래스 1 또는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제이고, 일부 실시형태에서 Cas9 또는 Cas12a 엔도뉴클레아제이다. Cas9 엔도뉴클레아제는 야생형 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 다른 종, 예를 들어 다른 스트렙토코커스 종, 예컨대 서모필루스(thermophilus); 슈도모나 아에루기노사(Pseudomona aeruginosa), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 또는 기타 시퀀싱된 세균 게놈 및 고세균, 또는 기타 원핵 미생물로부터의 서열일 수 있다. 이러한 종은 아시도보락스 아베네(Acidovorax avenae), 액티노바실러스 플뢰로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae), 액티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 액티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 액티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 사이클리필러스데니트리피칸스(Cycliphilusdenitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스미티(Bacillus smithii), 바실러스 트루린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피레룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실러스 라테로스포러스(Brevibacillus laterosporus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마프로테오박테리움(Gammaproteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp.), 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 종(Neisseria sp.), 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텔스(Phascolarctobacterium succinatutells), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스트렐라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 및 베르미네프로박터 에이세니애(Verminephrobacter eiseniae)(또는 전술한 Cas9 엔도뉴클레아제 중 임의의 것과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 전술한 서열 중 임의의 것의 기능적 단편 또는 변이체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas12a 뉴클레아제일 수 있다. Cas12a 뉴클레아제는 야생형 프레보텔라(Prevotella) 또는 프랜시셀라(Francisella) 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열(또는 전술한 Cas12 엔도뉴클레아제 중 임의의 것과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 전술한 서열 중 임의의 것의 기능적 단편 또는 변이체)을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 용어 "CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 단백질-단백질 도메인" 또는 "Cas 결합 도메인"은 하나 또는 복수의 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제(또는 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제와 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동인 이의 기능성 단편 또는 변이체)와 유효량에서 결합하거나 이에 대한 친화도를 가질 핵산 서열 내의 핵산 요소 또는 도메인(예를 들어, 및 RNA 요소 또는 도메인)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, Cas 결합 도메인은 적어도 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245 또는 250개 이하의 뉴클레오타이드로 이루어지고 CRISPR 시스템 형성에 적합한 농도에서 및 미세환경 내에서 생물학적 활성 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제와 부분적으로 회합하거나 결합하는 헤어핀 또는 이중체를 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
"클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-CRISPR 연관(Cas)(CRISPR-Cas) 시스템 가이드 RNA" 또는 "CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA"는 전사 종결자 도메인을 포함할 수 있다. 용어 "전사 종결자 도메인"은 CRISPR 복합체가 세균 종에 있을 때 유효량에서 세균 전사를 방지하고/하거나 하나 또는 복수의 Cas 단백질(또는 이의 기능적 단편)에 대한 핵산 서열의 회합을 안정화시키는 2차 구조를 형성하는 핵산 서열(또는 폴리뉴클레오타이드 서열) 내의 핵산 요소 또는 도메인을 지칭하는 것으로, 하나 또는 복수의 단백질(또는 이의 기능적 단편)의 존재 하에 하나 또는 복수의 Cas 단백질과 핵산 요소는 생물학적 활성 CRISPR 복합체를 형성하고/하거나 표적 서열 및 DNA-결합 도메인의 존재 하에 이러한 표적 서열 상에서 활성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 전사 종결자 도메인은 적어도 또는 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245 또는 250개 이하의 뉴클레오타이드로 이루어지고 CRISPR 시스템 형성에 적합한 농도 및 미세환경에서 생물학적 활성 CRISPR 복합체에 대한 핵산 서열(sgRNA, crRNA와 tracrRNA, 또는 기타 핵산 서열)의 회합을 부분적으로 유도하는 헤어핀 또는 이중체를 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
용어 "DNA-결합 도메인"은 표적 서열(예를 들어, NRF2 유전자)에 상보적인 핵산 서열(예를 들어, 가이드 RNA) 내의 핵산 요소 또는 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 도메인은 생물학적 활성 CRISPR 복합체의 존재 하에 하나 또는 복수의 Cas 단백질이 표적 서열 상에서 효소적으로 활성일 수 있도록 NRF2 유전자에 결합하거나 이에 대한 친화성을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, DNA 결합 도메인은 CRISPR 시스템 형성에 적합한 농도 및 미세환경에서 생물학적 활성 CRISPR 시스템의 일부분으로서 표적 서열과 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
"CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복체" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분적 직접 반복체를 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭) 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사체를 포함하여, CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현에 수반되거나 이의 활성을 지시하는 전사체 또는 합성적으로 생성된 전사체 및 다른 요소를 총칭한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 그에 대해 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재한다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 DNA 폴리뉴클레오타이드이고 DNA 표적 서열로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은, Cas 단백질과 적어도 하나의 sgRNA 또는 하나의 tracrRNA/crRNA 이중체를 포함하는 CRISPR 복합체 또는 시스템이 이러한 시스템의 회합에 적합한 농도에서 및 미세환경 내에서 회합될 때 Cas-단백질에 의해 인식되는 적어도 3개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 DNA는 적어도 하나 이상의 프로토-스페이서 인접 모티프를 포함하며, 그 서열은 당업계에 공지되어 있고 이러한 작업에 의해 사용되는 sgRNA 또는 crRNA/tracrRNA와 함께 사용될 Cas 단백질 시스템에 의존적이다. 일부 실시형태에서, 표적 DNA는 NNG를 포함하고, 여기서 G는 구아닌이고 N은 임의의 천연 발생 핵산이다. 일부 실시형태에서, 표적 DNA는 NNG, NNA, GAA, NNAGAAW 및 NGGNG 중 임의의 하나 또는 조합을 포함하며, 여기서 G는 구아닌이고, A는 아데닌이고, N은 임의의 천연 발생 핵산이다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 하이브리드화되어 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열 내 또는 그 근처(예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 내)에서 하나 또는 두 가닥 모두의 절단을 초래한다. 이론으로 구속되지 않으면서, 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부분(예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 tracr 서열도, 예컨대 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부분에 대한 tracr 서열의 적어도 일부분에 따른 하이브리드화에 의해 CRISPR 복합체의 일부분을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, tracr 서열은 tracr 메이트 서열에 대해 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 형성에 참여하기에 충분한 상보성을 갖는다. 표적 서열과 마찬가지로, 기능적(Cas 단백질 또는 이의 기능적 단편에 결합)이기에 충분하다면 완전한 상보성은 필요하지 않은 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, tracr 서열은 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터는 CRISPR 시스템의 요소의 존재 및/또는 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터 상에서 별개의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현되는 요소 중 둘 이상은 단일 벡터에서 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공한다. 본 개시내용에 의해 고려되는 변형의 적어도 일부와 함께, 일부 실시형태에서, CRISPR 복합체를 형성하는 가이드 서열 또는 RNA 또는 DNA 서열은 적어도 부분적으로 합성이다. 단일 벡터에서 조합되는 CRISPR 시스템 요소는 임의의 적합한 배향으로 배열될 수 있으며, 예컨대 하나의 요소는 제2 요소에 대하여 5'(이의 "상류")에 또는 제2 요소에 대하여 3'(이의 "하류")에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 화학적으로 합성된 가이드 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 화학적으로 합성된 가이드 서열은 클래스 2 Cas9 또는 Cas12a 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 벡터와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, 화학적으로 합성된 가이드 서열은 하나 이상의 벡터와 함께 사용되며, 여기서 각각의 벡터는 클래스 2 Cas9 또는 Cas12a 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 암호화 서열을 포함한다. 하나의 요소의 암호화 서열은 제2 요소의 암호화 서열의 동일한 또는 반대 가닥에 위치할 수 있고 동일한 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 프로모터는 CRISPR 효소 및 하나 이상의 추가(제2, 제3, 제4 등) 가이드 서열, tracr 메이트 서열(임의로 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된), 및 하나 이상의 인트론 서열 내에 포함된 tracr 서열(예를 들어, 각각이 상이한 인트론에, 둘 이상이 적어도 하나의 인트론에, 또는 모두가 단일 인트론에 있음)을 암호화하는 전사체의 발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소, 하나 이상의 추가 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열은 각각 상이한 핵산 서열의 성분이다. 예를 들어, tracr 및 tracr 메이트 서열의 경우 및 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 제1 및 제2 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 제1 핵산 서열은 tracr 서열을 포함하고 제2 핵산 서열은 tracr 메이트 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열에 상보적이어서 제1 핵산과 제2 핵산은 이중체를 형성하고 제1 핵산 및 제2 핵산은 개별적으로 또는 집합적으로 DNA-표적화 도메인, Cas 단백질 결합 도메인 및 전사 종결자 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 효소, 하나 이상의 추가 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이로부터 발현된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하나의 가이드 서열 상의 개시된 도메인들 중 임의의 하나 또는 조합 또는 임의의 개시된 변형을 갖거나 갖지 않는 2개의 별개의 tracrRNA/crRNA 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에 개시된 임의의 방법은 또한 조성물이 본원에 개시된 변형된 도메인들 중 임의의 하나 또는 조합을 갖는 단일 합성 가이드 서열 및/또는 합성 tracrRNA/crRNA를 포함할 수 있도록, 가이드 서열의 사용과 상호교환 가능한 tracrRNA/crRNA 서열의 사용에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 짧은 합성 키메라 tracrRNA/crRNA("단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA")일 수 있다. 가이드 RNA는 또한 2개의 짧은 합성 tracrRNA/crRNA("이중 가이드 RNA" 또는 'dgRNA")를 포함할 수 있다.
용어 "암" 또는 "종양"은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 대상체에서 제어되지 않는 증식, 불멸, 전이 잠재성, 급속 성장 및 증식 속도 및 소정의 특징적인 형태 특징과 같은 암-유발 세포를 대표하는 특징을 지니는 세포의 존재를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "암"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종을 포함하나 이에 제한되지 않는, 인간에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 또는 표현 "암", "신생물" 및 "종양"은 상호교환 가능하게 사용되며, 단수 형태이든 또는 복수 형태이든 숙주 유기체에 병적 상태를 발생시키는 악성 형질전환을 경험한 세포를 지칭한다. 원발성 암 세포(즉, 악성 형질전환 부위 근처에서 수득되는 세포)는 널리 확립된 기술, 특히 조직학적 검사에 의해 비-암성 세포로부터 용이하게 구별될 수 있다. 본원에서 사용되는 암 세포의 정의는 원발성 암 세포뿐만 아니라, 암 세포 선조로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이는 전이된 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주를 포함한다. 소정 실시형태에서, 암은 혈액 종양(즉, 비고형 종양)이다. 일부 실시형태에서, 암은 림프성 신생물 미만성 거대 B-세포 림프종, 담관암종, 자궁암 육종, 신장 혐색소성, 포도막 흑색종, 중피종, 부신피질 선암종, 흉선종, 급성 골수성 백혈병, 고환 생식 세포 종양, 직장 선암종, 췌장 선암종, 크롬친화세포종 및 부신경절종, 식도 암종, 육종, 신장 유두상 신세포 암종, 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경부 선암종, 신장 투명 신세포 암종, 간 간세포 암종, 다형성 교모세포종, 방광 요로상피 암종, 결장 선암종, 위 선암종, 난소 장액낭 선암종, 피부 흑색종, 전립선 선암종, 갑상선 암종, 폐 편평세포 암종, 두경부 편평세포 암종, 뇌 저등급 신경교종, 자궁 체부 내막 암종, 폐 선암종 또는 유방 침윤성 암종(예를 들어, 문헌[Kerins et al., Sci. Rep. 8:12846 (2018)] 참조).
소정 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. "고형 종양"은 종양 질량에 기초하여, 예를 들어 CAT 스캔, MR 영상화, X-선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 검출 가능한 및/또는 환자로부터 수득될 수 있는 샘플에서 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현으로 인해 검출 가능한 종양이다. 종양은 측정 가능한 치수를 가질 필요가 없다.
암의 병기결정을 위한 구체적 기준은 종양 크기, 조직학적 특징, 종양 마커, 및 당업자에게 공지된 기타 기준에 기반한 구체적 암 유형에 의존적이다. 일반적으로 암 병기는 다음과 같이 설명될 수 있다:
0기 - 제자리 암종
1기, 2기 및 3기 - 더 높은 숫자는 더욱 광범위한 질환: 더 큰 종양 크기 및/또는 최초 발병된 장기를 넘어서 주변 림프절 및/또는 원발성 종양의 위치에 인접하는 조직 또는 장기로의 확산을 나타낸다
4기 - 암은 먼 조직 또는 장기로 확산되었다
본원에 사용된 "변이체", "돌연변이체" 또는 "돌연변이된" 폴리뉴클레오타이드는 상응하는 야생형 또는 모 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열 변경을 함유한다. 돌연변이는 자연적이거나 의도적이거나 우발적일 수 있다. 돌연변이는 치환, 결실 및 삽입을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상의 경감 또는 호전(예를 들어, 퇴행, 부분적 또는 완전환), 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정성(즉, 악화되지 않음, 안정한 질환 달성), 질환 상태의 호전 또는 완화, 진행 속도 또는 진행까지의 시간의 감소 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함하나 이에 제한되지 않는 유익한 또는 바람직한 임상 결과를 달성하기 위한 조치를 지칭한다. 암의 "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 치료가 치유적일 필요는 없다. 소정 실시형태에서, 치료는, 예를 들어 통증 및 삶의 질(QOL)을 평가하는 허용된 도구를 사용하여, 자격을 갖춘 개인, 예를 들어 치료 의사가 판단하는 통증의 감소 또는 QOL의 증가 중 하나 이상을 포함한다. 소정 실시형태에서, 예를 들어 통증 및 QOL을 평가하는 허용된 도구를 사용하여, 자격을 갖춘 개인, 예를 들어 치료 의사가 판단하는 통증의 감소 또는 QOL의 증가는 암의 "치료"로 간주되지 않는다.
"화학치료제"는 암의 치료에 사용되는 약물을 지칭한다. 화학치료제는 소분자, 호르몬 및 호르몬 유사체, 생물 제제(예를 들어, 항체, 펩타이드 약물, 핵산 약물)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 소정 실시형태에서, 화학요법은 호르몬 및 호르몬 유사체를 포함하지 않는다.
"하나 이상의 화학치료제에 내성이 있는 암"은 화학치료 용법에 의한 치료에 반응하지 않거나 반응을 중단하는, 즉 화학치료 용법 동안 또는 완료 후에 표적 병변에서 적어도 안정한 질환(즉, 안정한 질환, 부분적 반응 또는 완전한 반응)을 달성하지 않는 암이다. 하나 이상의 화학치료제에 대한 내성은 예를 들어 종양 성장, 종양 부담 증가 및/또는 종양 전이를 초래한다.
"치료학적 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안, 목적하는 치료 결과, 예컨대 질환(예를 들어, 암), 병태 또는 장애의 치료 및/또는 대상체에서 치료의 약동학적 또는 약역학적 효과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 치료학적 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.
NRF2
핵 인자 적혈구 2-관련 인자(NRF2)는 산화/친전자성 스트레스에 대한 세포 반응에 관여하는 100 내지 200가지 표적 유전자의 마스터 조절자로 간주된다. 표적은 글루타티온(GSH) 매개체, 항산화제 및 유출 펌프를 제어하는 유전자를 포함한다. Hayden, et al., Urol. Oncol. Semin. Orig. Investig. 32, 806-814 (2014). NRF2는 또한 단백질 분해 및 해독에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지되어 있으며 Cul3-의존성 E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 기질 어댑터인 켈치-유사 ECH 관련 단백질 1(Kelch-like ECH associated protein 1: KEAP1)에 의해 음성적으로 조절된다. 정상적인 조건 하에, Keap1은 유비퀴틴-의존적 분해를 위해 NRF2를 지속적으로 표적화하여 하류 표적 유전자에서 NRF2의 낮은 발현을 유지한다. 그러나, 화학요법은 종종 세포보호 반응을 촉발하는 NRF2 표적 유전자의 전사 활성을 활성화시키는 것으로 나타났다; NRF2의 향상된 발현은 환경적 스트레스 또는 해로운 성장 조건에 반응하여 발생한다. NRF2 상향조절을 유도하는 다른 메커니즘은 KEAP1의 돌연변이 또는 프로모터 영역의 후성 유전적 변화를 포함한다. NRF2 발현의 상향조절은 화학치료 약물에 대한 암 세포의 내성을 향상시키며, 이는 바로 그 작용에 의해 세포 증식에 불리한 환경을 유도한다. 실제로, 헤이든(Hayden) 등(ibid)은 증가된 NRF2 발현이 시스플라틴을 포함하는 화학치료 약물에 대한 암 세포의 내성을 유도한다는 것을 명백히 입증하였다. 문헌[Singh et al. (2010, Antioxidants & Redox Signaling 13)]은 또한 NRF2의 항시적 발현이 방사선 내성성을 유발하고 NRF2의 억제가 내인성 반응성 산소종(ROS) 수준의 증가뿐만 아니라 생존 감소를 유발한다는 것을 보여주었다. 최근에, 문헌[Torrente et al. (Oncogene (2017). doi:10.1038/onc.2017.221)]은 NRF2와 호메오도메인 상호작용 단백질 키나제 2인 HIPK2 간의 혼선(crosstalk)을 식별하여 HIPK2가 NRF2를 통해 세포보호 효과를 나타냄을 입증하였다.
CRISPR/Cas9를 사용함으로써, 야생형 NRF2 단백질의 기능을 방해하지 않으면서 화학내성을 유발하는 돌연변이된 NRF2 단백질을 표적화하고 녹아웃시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태는 암 세포에서만 발견되고 비-암성 세포에서는 발견되지 않는 변이체 NRF2의 발현을 감소시키거나 일부 실시형태에서는 제거하는 것에 관한 것이다. 이들 변이체는 KEAP1 결합 도메인으로서 공지된 NRF2의 Neh2 도메인 내에서 흔하게 발견된다. 일부 실시형태에서, NRF2 돌연변이는 하기 표 1에서 발견되는 돌연변이일 수 있다.
Figure pct00001
일부 실시형태에서, 암 세포에서 변이체 NRF2 유전자에 의해 암호화되는 변이체 NRF2 폴리펩타이드는 (a) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (b) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (c) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (d) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D; (e) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; (f) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; (g) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; 또는 (h) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자는 (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는 (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
CRISPR/엔도뉴클레아제
CRISPR/엔도뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas9) 시스템은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 그 전체가 참고로 본원에 포함된 미국 특허 제9,925,248호에 설명되어 있다. CRISPR-지시된 유전자 편집은 놀랍도록 높은 효율성과 정밀도로 염색체 내의 특정 부위에서 DNA 절단을 식별하고 실행할 수 있다. CRISPR/Cas9의 천연 활성은 세균 세포를 감염시키는 바이러스 게놈을 무력화시키는 것이다. 인간 세포에서 CRISPR/Cas 기능의 후속적 유전자 재조작은 상당한 빈도로 인간 유전자를 무력화시킬 가능성을 제시한다.
세균에서, CRISPR/Cas 유전자좌는 이동성 유전 요소(바이러스, 전이성 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 RNA-가이드된 적응 면역계를 암호화한다. CRISPR 시스템의 3가지 유형(I 내지 III)이 식별되었다. CRISPR 클러스터는 선행 이동성 요소에 상보적인 서열인 스페이서를 함유한다. CRISPR 클러스터는 표적 유전자에 상보적인 DNA 결합 영역(스페이서)을 함유하는 성숙한 CRISPR(클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체) RNA(crRNA)로 전사되고 프로세싱된다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인 Cas9는 II형 CRISPR/Cas 시스템에 속하며 표적 DNA를 절단하는 강력한 엔도뉴클레아제 활성을 갖는다. Cas9는 고유한 표적 서열의 약 20개 염기쌍(bp)을 함유하는 성숙한 crRNA(스페이서라 불림) 및 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 III-보조된 프로세싱을 위한 가이드 역할을 하는 전사-활성화된 소형 RNA(tracrRNA)에 의해 안내된다. crRNA:tracrRNA 이중체는 crRNA 상의 스페이서와 표적 DNA 상의 상보적 서열(프로토스페이서라 불림) 간의 상보적 염기쌍 형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 지시한다. Cas9는 절단 부위(PAM으로부터 3번째 뉴클레오타이드)를 지정하는 트리뉴클레오타이드(NGG) 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 인식한다.
본원에 설명된 조성물은 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 예를 들어, 클래스 1 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 또는 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제일 수 있다. 클래스 1 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제에는 다수의 서브유닛을 포함하는 효과기 분자를 갖는 I형, III형 및 IV형 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 클래스 1 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제의 경우, 효과기 분자는 일부 실시형태에서 Cas7 및 Cas5와 함께, 일부 실시형태에서 SS(Cas11) 및 Cas8a1; Cas8b1; Cas8c; Cas8u2 및 Cas6; Cas3" 및 Cas10d, Cas SS(Cas11), Cas8e 및 Cas6, Cas8f 및 Cas6f, Cas6f, Cas8-유사(Csf1), SS(Cas11) 및 Cas8-유사(Csf1), 또는 SS(Cas11) 및 Cas10을 포함할 수 있다. 클래스 1 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 또한 일부 실시형태에서 Cas3(I형) 또는 Cas10(III형)일 수 있는 표적 절단 분자, 및 예를 들어 Cas1, Cas2 및/또는 Cas4와 같은 스페이서 획득 분자와 회합할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Koonin et al., Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78 (2017); Strich & Chertow, J. Clin. Microbiol. 57:1307-18 (2019)] 참조.
클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 단일 효과기 분자를 갖는 I형, V형 및 VI형 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제의 경우, 효과기 분자는 일부 실시형태에서, Cas9, Cas12a (cpf1), Cas12b1 (c2c1), Cas12b2, Cas12c (c2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12f1 (Cas14a), Cas12f2 (Cas14b), Cas12f3 (Cas14c), Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12k (c2c5), Cas13a (c2c2), Cas13b1 (c2c6), Cas13b2 (c2c6), Cas13c (c2c7), Cas13d, c2c4, c2c8, c2c9 및/또는 c2c10을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Koonin et al., Curr. Opin. Microbiol. 37:67-78 (2017); Strich & Chertow, J. Clin. Microbiol. 57:1307-18 (2019); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 18:67-83 (2020)] 참조.
일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. Cas9 뉴클레아제 야생형 스트렙토코커스 피오게네스 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 다른 종, 예를 들어 다른 스트렙토코커스 종, 예컨대 서모필루스; 슈도모나 아에루기노사, 에스케리키아 콜라이, 또는 기타 시퀀싱된 세균 게놈 및 고세균, 또는 기타 원핵 미생물로부터의 서열일 수 있다. 이러한 종은 아시도보락스 아베네, 액티노바실러스 플뢰로뉴모니아, 액티노바실러스 숙시노게네스, 액티노바실러스 수이스, 액티노마이세스 종, 사이클리필러스데니트리피칸스, 아미노모나스 파우시보란스, 바실러스 세레우스, 바실러스 스미티, 바실러스 트루린기엔시스, 박테로이데스 종, 블라스토피레룰라 마리나, 브라디리조븀 종, 브레비바실러스 라테로스포러스, 캄필로박터 콜라이, 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 라리, 칸디다투스 푸니세이스피릴룸, 클로스트리디움 셀룰로리티쿰, 클로스트리디움 페르프린겐스, 코리네박테리움 악콜렌스, 코리네박테리움 디프테리아, 코리네박테리움 마트루코티, 디노로세오박터 쉬배, 유박테리움 돌리춤, 감마프로테오박테리움, 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스, 헤모필루스 파라인플루엔자, 헤모필루스 스푸토룸, 헬리코박터 카나덴시스, 헬리코박터 시나에디, 헬리코박터 무스텔라, 일리오박터 폴리트로푸스, 킨겔라 킨가에, 락토바실러스 크리스파투스, 리스테리아 이바노비, 리스테리아 모노사이토게네스, 리스테리아세 박테리움, 메틸로시스티스 종, 메틸로시너스 트리코스포리움, 모빌룬커스 물리에리스, 네이세리아 바실리포르미스, 네이세리아 시네레아, 네이세리아 플라베센스, 네이세리아 락타미카, 네이세리아 메닝지티디스, 네이세리아 종, 네이세리아 와드워티, 니트로소모나스 종, 파르비바쿨룸 라바멘티보란스, 파스테우렐라 물토시다, 파스콜락토박테리움 숙시나투텔스, 랄스토니아 시지기, 로도슈모나스 팔루스트리스, 로도불룸 종, 시몬시엘라 무엘레리, 스핑고모나스 종, 스포로락토바실러스 비니애, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 루그두넨시스, 스트렙토코커스 종, 서브돌리그라눌룸 종, 티스트렐라 모빌리스, 트레포네마 종 또는 베르미네프로박터 에이세니애를 포함한다.
대안적으로, 야생형 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 서열이 변형될 수 있다. 핵산 서열은 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포에서 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 인간 세포 서열에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas9 뉴클레아제 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 KM099231.1 GI:669193757; KM099232.1 GI:669193761; 또는 KM099233.1 GI:669193765에 열거된 발현 벡터 중 임의의 것에 의해 암호화되는 Cas9 뉴클레아제 서열일 수 있다. 대안적으로, Cas9 뉴클레아제 서열은 예를 들어 Addgene(매사추세츠주 캠브리지)으로부터의 pX458, pX330 또는 pX260과 같은 상업적으로 입수 가능한 벡터 내에 함유된 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 Genbank 수탁 번호 KM099231.1 GI:669193757; KM099232.1 GI:669193761; 또는 KM099233.1 GI:669193765의 Cas9 아미노산 서열 또는 pX458, pX330 또는 pX260의 Cas9 아미노산 서열(Addgene, 매사추세츠주 캠브리지) 중 임의의 것의 변이체 또는 단편인 아미노산 서열을 가질 수 있다. Cas9 뉴클레오타이드 서열은 Cas9의 생물학적 활성 변이체를 암호화하도록 변형될 수 있으며, 이들 변이체는 예를 들어 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 첨가, 결실 또는 치환 돌연변이 또는 이러한 돌연변이들의 조합)를 함유함으로써 야생형 Cas9와 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 치환 돌연변이 중 하나 이상은 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)일 수 있다. 예를 들어, Cas9 폴리펩타이드의 생물학적 활성 변이체는 야생형 Cas9 폴리펩타이드에 대해 적어도 또는 약 50% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 또는 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72 %, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas12a 뉴클레아제일 수 있다. Cas12a 뉴클레아제는 Cas12a 뉴클레아제는 야생형 프레보텔라 또는 프랜시셀라 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 야생형 프레보텔라 또는 프랜시셀라 서열이 변형될 수 있다. 핵산 서열은 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포에서 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 인간 세포 서열에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas12a 뉴클레아제 서열은 예를 들어 Genbank 수탁 번호 MF193599.1 GI: 1214941796, KY985374.1 GI: 1242863785, KY985375.1 GI: 1242863787 또는 KY985376.1 GI: 1242863789에 나열된 발현 벡터 중 임의의 것에 의해 암호화된 Cas9 뉴클레아제 서열일 수 있다. 대안적으로, Cas12a 뉴클레아제 서열은 예를 들어 Addgene(매사추세츠주 캠브리지)의 pAs-Cpf1 또는 pLb-Cpf1과 같은 상업적으로 입수 가능한 벡터 내에 함유된 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas12a 엔도뉴클레아제는 Genbank 등록 번호 MF193599.1 GI: 1214941796, KY985374.1 GI: 1242863785, KY985375.1 GI: 1242863787 또는 KY985376.1 GI: 1242863789의 Cas12a 엔도뉴클레아제 서열 중 임의의 것의 변이체 또는 단편인 아미노산 서열 또는 pAs-Cpf1 또는 pLb-Cpf1의 Cas12a 아미노산 서열(Addgene, 매사추세츠주 캠브리지)을 가질 수 있다. Cas12a 뉴클레오타이드 서열은 Cas12a의 생물학적 활성 변이체를 암호화하도록 변형될 수 있으며, 이들 변이체는 예를 들어 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 첨가, 결실 또는 치환 돌연변이 또는 이러한 돌연변이들의 조합)를 함유함으로써 야생형 Cas12a와 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 치환 돌연변이 중 하나 이상은 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)일 수 있다. 예를 들어, Cas12a 폴리펩타이드의 생물학적 활성 변이체는 야생형 Cas12a 폴리펩타이드에 대해 적어도 또는 약 50% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 또는 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72 %, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에 설명된 조성물은 또한 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인(예를 들어, NRF2 유전자의 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5로부터의 표적 도메인)에 상보적인 DNA-결합 도메인 및 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 단백질 결합 도메인을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 정상(즉, 비-암성) 세포의 야생형 NRF2 유전자가 아닌 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자의 표적 도메인(예를 들어, 변이체 NRF2 유전자의 엑손 1, 2, 3, 4, 또는 5로부터의 표적 도메인)에 상보적인 DNA-결합 도메인을 포함한다. 가이드 RNA 서열은 센스 또는 안티센스 서열일 수 있다. 가이드 RNA 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함할 수 있다. PAM의 서열은 사용된 CRISPR 엔도뉴클레아제의 특이성 요건에 따라 달라질 수 있다. 에스. 피오게네스로부터 유래된 CRISPR-Cas 시스템에서, 표적 DNA는 전형적으로 5'-NGG 프로토-스페이서 인접 모티프(PAM) 바로 앞에 있다. 따라서, 에스. 피오게네스 Cas9의 경우, PAM 서열은 AGG, TGG, CGG 또는 GGG일 수 있다. 다른 Cas9 오르톨로그(ortholog)는 상이한 PAM 특이성을 가질 수 있다. 가이드 RNA의 구체적 서열은 다양할 수 있지만, 서열에 관계없이 유용한 가이드 RNA 서열은 고효율을 달성하면서 표적이탈 효과(off-target effect)를 최소화하는 서열일 것이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 서열은 NRF2 유전자의 완전한 절제를 달성한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA 서열은 야생형 NRF2 유전자의 발현 또는 활성에 영향을 미치지 않으면서 변이체 NRF2 유전자의 완전한 절제를 달성한다.
일부 실시형태에서, DNA-결합 도메인은 약 20 내지 약 55개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54 또는 약 55개 뉴클레오타이드로 길이가 다양하다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질-결합 도메인은 길이가 약 30 내지 약 55개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54 또는 약 55개 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 가이드 RNA 및 CRISPR 엔도뉴클레아제를 암호화하는 하나 이상의 핵산(즉, DNA) 서열을 포함한다. 조성물이 핵산으로서 투여되거나 발현 벡터 내에 함유되는 경우, CRISPR 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA 서열과 동일한 핵산 또는 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA 서열과 물리적으로 분리된 핵산 또는 별개의 벡터에서 암호화될 수 있다. 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열은 DNA 결합 도메인, Cas 단백질 결합 도메인 및 전사 종결자 도메인을 포함할 수 있다.
가이드 RNA 및/또는 CRISPR 엔도뉴클레아제를 암호화딩하는 핵산은 단리된 핵산일 수 있다. "단리된" 핵산은 예를 들어 천연 발생 게놈에서 DNA 분자의 바로 측면에서 정상적으로 발견되는 핵산 서열 중 적어도 하나가 제거되거나 존재하지 않는다면, 천연 발생 DNA 분자 또는 이의 단편일 수 있다. 단리된 핵산 분자는 표준 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여 본원에 설명된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본원에 설명된 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 단리된 핵산을 수득할 수 있다. PCR은 전체 게놈 DNA 또는 전체 세포 RNA의 서열을 포함하여 DNA뿐만 아니라 RNA로부터 특정 서열을 증폭하는 데 사용될 수 있다. 다양한 PCR 방법은 예를 들어 문헌[PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에 설명되어 있다. 일반적으로, 관심 영역의 말단 또는 그 이상으로부터의 서열 정보를 사용하여 증폭될 주형의 반대 가닥과 서열이 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계한다. 부위-특이적 뉴클레오타이드 서열 변형을 주형 핵산에 도입할 수 있는 다양한 PCR 전략도 이용 가능하다.
단리된 핵산은 또한 단일 핵산 분자로서(예를 들어, 포스포르아미디트 기술을 사용하여 3'에서 5' 방향으로 자동화 DNA 합성을 사용) 또는 일련의 올리고뉴클레오타이드로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 서열을 함유하는 한 쌍 이상의 긴 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, >50 내지 100개 뉴클레오타이드)를 합성할 수 있으며, 각 쌍은 올리고뉴클레오타이드 쌍이 어닐링될 때 이중체를 형성하도록 짧은 상보성 세그먼트(예를 들어, 약 15개 뉴클레오타이드)를 함유한다. DNA 폴리머라제를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 연장시키고, 결과적으로 올리고뉴클레오타이드 쌍당 단일 이중가닥 핵산 분자가 생성되며, 상기 핵산 분자는 이후에 벡터에 연결될 수 있다. 단리된 핵산은 또한 예를 들어, (예를 들어, 상기 식에 따른) Cas9-암호화 DNA의 천연 발생 부분의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
재조합 작제물이 또한 본원에 제공되며, CRISPR 엔도뉴클레아제 및/또는 NRF2 유전자(일부 실시형태에서, 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자)에 상보적인 가이드 RNA를 발현하기 위해 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 핵산 작제물은 세포에서 CRISPR 엔도뉴클레아제 및/또는 NRF2 유전자(일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자)에 상보적인 가이드 RNA를 발현하기에 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결된, CRISPR 엔도뉴클레아제 및/또는 NRF2 유전자에 상보적인 가이드 RNA를 암호화하는 핵산(일부 실시형태에서, 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산은 가이드 RNA를 암호화하는 핵산과 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 다른 실시형태에서, CRISPR 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및/또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 폐 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 적합한 폐 특이적 프로모터는 클라라 세포(Clara cell) 10-kDa 단백질(CC10)(Scgb1a1로도 공지됨) 프로모터(Stripp et al., J. Biol. Chem. 267:14703-12 (1992)), SFTPC 프로모터(Wert et al., Dev. Biol. 156:426-43 (1993)), FOXJ1 프로모터(Ostrowski et al., Mol. Ther. 8:637-45 (2003)), 애쿼린(aquaporin)(Aqp5) 프로모터(Funaki et al., Am. J. Physiol. 275:C1151-57 (1998)), 케라틴 5 (Krt5) 프로모터(Rock et al., Dis. Model Mech. 3:545-56 (2010)), 케라틴 14 (Krt14) 프로모터(Rock et al., Dis. Model Mech. 3:545-56 (2010)), 사이토케라틴 18(K18) 프로모터(Chow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14695-14700 (1997)), 표면활성 단백질 B(SP-B) 프로모터(Strayer et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 282:L394-404 (2002)), 인간 텔로머라제 역전사효소 프로모터 및 인간 표면활성 단백질 A1 프로모터 제어 하의 TTF1 유전자(Fukazawa et al., Cancer Res. 64:363-69 (2004)), 표면활성 단백질 C(SP-C) 프로모터(Zhuo et al., Transgenic Res. 15:543-55 (2006)), 인슐린종-연관 항원-1(INSM1) 프로모터(Li et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 236:776-81 (1997)) 및 표면활성 단백질 A (SP-A) 프로모터(Bruno et al., J. Biol. Chem. 270:6531-36 (1995))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 CRISPR 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA는 리보핵단백질 입자(RNP)의 형태로 조합되어 제공될 수 있다. RNP 복합체는 예를 들어 주사, 전기천공, 나노입자, 소포에 의해 및/또는 세포-투과 펩타이드의 도움으로 대상체에 도입될 수 있다.
본원에 설명된 것과 같은 핵산을 함유하는 DNA 벡터가 또한 제공된다. "DNA 벡터"는 삽입된 세그먼트의 복제를 발생시키기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 도입될 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드이다. 일반적으로, DNA 벡터는 적절한 제어 요소와 회합되어 있을 때 복제될 수 있다. 적합한 벡터 골격은 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, BAC, YAC 또는 PAC와 같은, 당업계에서 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 용어 "DNA 벡터"는 클로닝 및 발현 벡터뿐만 아니라, 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합이 본원에 설명된 핵산 서열을 발현하는 데 사용될 수 있다. 적합한 발현 벡터는, 비제한적으로, 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시스템이 노바젠(Novagen) (미국 위스콘신주 매디슨), 클론텍(Clontech)(미국 캘리포니아주 팔로 알토), 스트라테이진(Stratagene)(미국 캘리포니아주 라 졸라) 및 인비트로젠/라이프 테크놀로지(미국 캘리포니아주 칼스바드)와 같은 기업으로부터 상업적으로 입수가능하다.
본원에 제공된 DNA 벡터는 또한 예를 들어, 복제 기점, 스캐폴드 부착 영역 (SAR) 및/또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 숙주 세포에 선택 가능한 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들어, 마커는 항생제(예를 들어, 카나마이신, G418, 블레오마이신 또는 하이그로마이신)에 대한 내성과 같은 살생물제 내성을 부여할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 발현 벡터는 발현된 폴리펩타이드의 조작 또는 검출(예를 들어, 정제 또는 국소화)을 용이하게 하기 위해 설계된 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 폴리히스티딘, c-myc, 혈구응집소 또는 Flag™ 태그(Kodak, 미국 코네티컷주 뉴헤이븐) 서열은 전형적으로 암호화된 폴리펩타이드와의 융합체로서 발현된다. 이러한 태그는 카복실 또는 아미노 말단을 포함하는 폴리펩타이드 내의 임의의 곳에 삽입될 수 있다.
DNA 벡터는 또한 조절 영역을 포함할 수 있다. 용어 "조절 영역"은 전사 또는 번역 개시 및 속도, 및 전사 또는 번역 산물의 안정성 및/또는 이동성에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 비제한적으로 프로모터 서열, 인핸서 서열, 반응 요소, 단백질 인식 부위, 유도성 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역(UTR), 전하 출발 부위, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 핵 국소화 신호 및 인트론을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 내의 전사될 서열 및 조절 영역(예를 들어, 프로모터)을 이러한 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미치도록 배치하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 암호화 서열을 프로모터의 제어 하에 두기 위해, 폴리펩타이드의 번역 판독 프레임의 번역 개시 부위는 전형적으로 프로모터의 1 내지 약 50개 뉴클레오타이드 하류에 배치된다. 그러나, 프로모터는 번역 개시 부위의 약 5,000개 뉴클레오타이드 상류만큼 또는 전사 개시 부위의 약 2,000개 뉴클레오타이드 상류에 배치될 수 있다. 프로모터는 전형적으로 적어도 코어(기본) 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 적어도 하나의 제어 요소, 예컨대 인핸서 서열, 상류 요소 또는 상류 활성화 영역(UAR)을 포함할 수 있다. 포함될 프로모터의 선택은 효율, 선택 능력, 유도 가능성, 목적하는 발현 수준 및 세포- 또는 조직-선호 발현을 포함하나 이에 제한되지 않는 몇가지 인자에 의존한다. 당업자에게 있어 암호화 서열에 대한 프로모터 및 다른 조절 영역을 적절히 선택하고 배치함으로써 암호화 서열의 발현을 조정하는 것은 일상적인 것이다.
벡터는 예를 들어 바이러스 벡터(예컨데, 아데노바이러스("Ad"), 아데노-연관 바이러스(AAV), 수포성 구내염 바이러스(VSV) 및 레트로바이러스), 리포솜 및 기타 지질-함유 복합체, 숙주 세포로의 폴리뉴클레오타이드 전달을 매개할 수 있는 기타 거대분자 복합체를 포함한다. 아데노바이러스 벡터를 폐 종양에 직접 주사하는 것은 폐암의 유전자 요법을 평가하는 임상 시험에서 일상적인 절차였다. Dong et al., J. Int. Med. Res. 36, 1273-1287 (2008); Li et al., Cancer Gene Ther. 20, 251-259 (2013); Zhou, et al., Cancer Gene Ther. 23, 1-6 (2016). 벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 그 밖에 표적화된 세포에 유익한 특성을 제공하는 다른 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 하기에서 보다 상세히 설명되고 예시되는 바와 같이, 이러한 다른 성분은 예를 들어 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분(세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분을 포함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후 세포 내 폴리뉴클레오타이드의 국소화에 영향을 미치는 성분(예컨대, 핵 국소화를 매개하는 제제); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 이러한 성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출하거나 선택하는 데 사용될 수 있는 검출가능 및/또는 선택가능 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 천연 특징으로서 제공될 수 있거나(예컨대, 결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 기능을 갖는 소정 바이러스 벡터의 사용), 벡터는 이러한 기능을 제공하도록 변형될 수 있다. 다른 벡터는 문헌[Chen et al; Bio Techniques, 34: 167-171 (2003)]에 의해 설명된 것들을 포함한다. 이러한 매우 다양한 벡터가 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 이용 가능하다.
적합한 핵산 전달 시스템은 재조합 바이러스 벡터, 전형적으로 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스(AAV), 헬퍼-의존적 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 일본-리포솜(HVJ) 복합체의 혈구응집 바이러스 중 적어도 하나로부터의 서열을 포함한다. 이러한 경우에, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 강력한 진핵생물 프로모터, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함한다. 재조합 바이러스 벡터는 내부에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 일부 실시형태에서 약 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 비-바이러스 벡터와 함께 투여되는 실시형태에서, 약 0.1 나노그램 내지 약 4000 마이크로그램, 예를 들어 약 0.1 ng 내지 약 3900 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3800 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3700 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3600 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3500 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3400 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3300 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3200 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3100 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 3000 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2900 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2800 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2700 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2600 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2500 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2400 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2300 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2200 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2100 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 2000 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1900 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1800 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1700 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1600 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1500 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1400 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1300 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1200 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1100 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1000 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 900 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 800 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 700 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 600 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 500 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 400 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 300 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 200 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 100 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 90 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 80 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 70 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 60 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 50 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 40 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 30 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 20 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 10 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 1 ㎍, 약 0.1 ng 내지 약 900 ng, 약 0.1 ng 내지 약 800 ng, 약 0.1 ng 내지 약 700 ng, 약 0.1 ng 내지 약 600 ng, 약 0.1 ng 내지 약 500 ng, 약 0.1 ng 내지 약 400 ng, 약 0.1 ng 내지 약 300 ng, 약 0.1 ng 내지 약 200 ng, 약 0.1 ng 내지 약 100 ng, 약 0.1 ng 내지 약 90 ng, 약 0.1 ng 내지 약 80 ng, 약 0.1 ng 내지 약 70 ng, 약 0.1 ng 내지 약 60 ng, 약 0.1 ng 내지 약 50 ng, 약 0.1 ng 내지 약 40 ng, 약 0.1 ng 내지 약 30 ng, 약 0.1 ng 내지 약 20 ng, 약 0.1 ng 내지 약 10 ng, 약 0.1 ng 내지 약 1 ng, 약 1 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3900 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3800 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3700 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3600 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3500 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3400 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3300 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3200 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3100 ㎍, 약 1 ng 내지 약 3000 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2900 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2800 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2700 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2600 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2500 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2400 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2300 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2200 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2100 ㎍, 약 1 ng 내지 약 2000 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1900 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1800 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1700 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1600 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1500 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1400 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1300 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1200 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1100 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1000 ㎍, 약 1 ng 내지 약 900 ㎍, 약 1 ng 내지 약 800 ㎍, 약 1 ng 내지 약 700 ㎍, 약 1 ng 내지 약 600 ㎍, 약 1 ng 내지 약 500 ㎍, 약 1 ng 내지 약 400 ㎍, 약 1 ng 내지 약 300 ㎍, 약 1 ng 내지 약 200 ㎍, 약 1 ng 내지 약 100 ㎍, 약 1 ng 내지 약 90 ㎍, 약 1 ng 내지 약 80 ㎍, 약 1 ng 내지 약 70 ㎍, 약 1 ng 내지 약 60 ㎍, 약 1 ng 내지 약 50 ㎍, 약 1 ng 내지 약 40 ㎍, 약 1 ng 내지 약 30 ㎍, 약 1 ng 내지 약 20 ㎍, 약 1 ng 내지 약 10 ㎍, 약 1 ng 내지 약 1 ㎍, 약 1 ng 내지 약 900 ng, 약 1 ng 내지 약 800 ng, 약 1 ng 내지 약 700 ng, 약 1 ng 내지 약 600 ng, 약 1 ng 내지 약 500 ng, 약 1 ng 내지 약 400 ng, 약 1 ng 내지 약 300 ng, 약 1 ng 내지 약 200 ng, 약 1 ng 내지 약 100 ng, 약 1 ng 내지 약 90 ng, 약 1 ng 내지 약 80 ng, 약 1 ng 내지 약 70 ng, 약 1 ng 내지 약 60 ng, 약 1 ng 내지 약 50 ng, 약 1 ng 내지 약 40 ng, 약 1 ng 내지 약 30 ng, 약 1 ng 내지 약 20 ng, 약 1 ng 내지 약 10 ng, 약 10 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 20 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 30 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 40 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 50 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 60 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 70 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 80 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 90 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 100 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 200 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 300 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 400 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 500 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 600 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 700 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 800 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 900 ng 내지 약 4000 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 10 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 20 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 30 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 40 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 50 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 60 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 70 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 80 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 90 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 100 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 200 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 300 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 400 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 500 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 600 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 700 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 800 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 900 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1000 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1100 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1200 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1300 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1400 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1500 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1600 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1700 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1800 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 1900 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2000 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2100 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2200 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2300 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2400 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2500 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2600 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2700 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2800 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 2900 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3000 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3100 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3200 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3300 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3400 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3500 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3600 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3700 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 3800 ㎍ 내지 약 4000 ㎍, 또는 3900 ㎍ 내지 약 4000 ㎍의 사용이 종종 유용할 것이다.
추가 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스를 포함한다. 하나의 HIV-기반 바이러스 벡터는 gag 및 pol 유전자가 HIV 게놈으로부터 유래하고 env 유전자가 다른 바이러스로부터 유래하는 적어도 2개의 벡터를 포함한다. DNA 바이러스 벡터는 오르토폭스 또는 조류폭스 벡터와 같은 폭스 벡터, I형 단순 포진 바이러스(HSV) 벡터와 같은 헤르페스바이러스 벡터[Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)], 아데노바이러스 벡터[LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)] 및 아데노-연관 바이러스 벡터[Kaplitt, M. G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)]를 포함한다.
원하는 경우, 본원에 설명된 폴리뉴클레오타이드는 양이온성 리포솜, 아데노바이러스 벡터 및 엑소솜과 같은 미세전달 비히클과 함께 사용될 수도 있다. 리포솜 제조, 표적화 및 내용물의 전달 절차에 대한 검토는 문헌[Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682 (1988)]을 참조한다. 또한, 문헌[Feigner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989) 및 Maurer, R. A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 CRISPR 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 표적 세포, 예를 들어, 암 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 엑소좀은 다양한 세포에 의해 분비되는 나노 크기의 소포이며 세포막으로 구성된다. 엑소좀은 다양한 표면 접착 단백질 및 벡터 리간드(테트라스파닌, 인테그린, CD11b 및 CD18 수용체)에 의해 표적 세포에 부착될 수 있고 표적 세포로 이들의 페이로드(payload)를 전달할 수 있다. 몇가지 연구는 엑소좀이 이의 특징 및 기원에 따라 특이적 세포 친화성을 갖고, 이를 사용하여 엑소좀을 질환 조직 및/또는 기관으로 표적화할 수 있음을 나타낸다. 문헌[Batrakova et al., 2015, J Control Release 219: 396-405] 참조. 예를 들어, 암 유래의 엑소좀은 CRISPR/Cas9 플라스미드를 암 세포로 효율적으로 전달할 수 있는 천연 운반체로서 기능을 한다. 문헌[Kim et al., 2017, J Control Release 266: 8-16] 참조.
복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터는 공지된 기술에 따라 생산될 수 있다. 문헌[Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); 및 Rosenfeld, et al., Cell, 68:143-155 (1992)] 참조.
또 다른 전달 방법은 세포내에서 발현되는 산물을 생산할 수 있는 단일가닥 DNA 생산 벡터를 사용하는 것이다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Chen et al., Bio Techniques, 34: 167-171 (2003)] 참조.
약제학적 조성물
본원에 개시된 임의의 약제학적 조성물은 의약의 제조에 사용하기 위해 제형화될 수 있으며, 특정 용도는 치료, 예를 들어 암을 앓는 대상체의 치료의 맥락에서 하기에 나타낸다. 약제로서 사용되는 경우, 임의의 핵산 및 벡터는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 투여는 폐(예를 들어, 분무기에 의한 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기; 기관내, 비강내, 표피 및 경피), 국소(안과 및 비강내, 질 및 직장 전달을 포함하는 점막으로의 투여를 포함), 눈, 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다. 비경구 투여는 단일 볼루스 투여의 형태일 수 있거나, 예를 들어 연속 관류 펌프에 의한 것일 수 있다. 국소 투여를 위한 약제학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체, 분말 등을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 기재, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 활성 성분으로서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 본원에 기재된 핵산 및 벡터를 함유할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 적절한 경우 동물 또는 인간에게 투여될 때 유해한, 알레르기성 또는 기타 해로운 반응을 일으키지 않는 분자적 실체 및 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적으로 허용되는 물질의 매질로서 사용될 수 있는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항세균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 부형제, 결합제, 윤활제, 겔, 계면활성제 등을 포함한다. 본원에 개시된 약제학적 조성물을 제조함에 있어서, 활성 성분은 전형적으로 부형제와 혼합되거나, 부형제에 의해 희석되거나, 예를 들어 캡슐, 정제, 사셰(sachette), 종이 또는 기타 용기의 형태로 이러한 담체 내에 봉입된다. 부형제가 희석제로서 역할을 하는 경우, 이는 활성 성분에 대한 비히클, 담체 또는 매질로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질(예를 들어, 생리 식염수)일 수 있다. 따라서, 조성물은 정제, 환제, 분말, 로젠지제, 사셰, 카세(cachet), 엘릭시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸(고체로서 또는 액체 매질 중), 로션, 크림, 연고, 젤, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 멸균 주사액 및 멸균 포장된 분말의 형태일 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 희석제의 유형은 의도된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 생성된 조성물은 방부제와 같은 추가 제제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체는 지질-기반 또는 중합체-기반 콜로이드일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 물질은 리포솜, 하이드로겔, 미립자, 나노입자 또는 블록 공중합체 미셀로서 제형화된 콜로이드일 수 있다. 언급된 바와 같이, 담체 물질은 캡슐을 형성할 수 있으며, 그 물질은 중합체- 기반 콜로이드일 수 있다.
본원에 개시된 핵산 서열은 대상체의 적절한 세포, 예를 들어 암 세포로 전달될 수 있다. 이것은 예를 들어 대식세포와 같은 식세포에 의한 식균작용을 최적화하기 위해 크기가 조정된 중합체성 생분해성 미립자 또는 마이크로캡슐 전달 비히클의 사용에 의해 달성될 수 있다. 근육내, 피내 또는 피하 부위로 "나형(naked) DNA"(즉, 전달 비히클 없이)를 전달하는 것은 생체내 발현을 달성하기 위한 또 다른 수단이다. 관련 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 발현 벡터)에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열 및 가이드 RNA를 포함하는 단리된 핵산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터 또는 인핸서-프로모터 조합에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 및 인핸서는 상기 설명되어 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 나노입자, 예를 들어 DNA와 복합체화되었고 폴리에틸렌글리콜-변형된(페길화된(PEGylated)) 저분자량 LPEI의 쉘에 의해 둘러싸인 고분자량 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)의 코어로 구성된 나노입자로서 제형화될 수 있다. .
핵산 및 벡터는 장치(예를 들어, 카테터)의 표면에 적용되거나 펌프, 패치 또는 기타 약물 전달 장치 내에 함유될 수도 있다. 본원에 개시된 핵산 및 벡터는 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체(예를 들어, 생리 식염수)의 존재 하에 단독으로 또는 혼합물로 투여될 수 있다. 부형제 또는 담체는 투여 방식 및 투여 경로에 기반하여 선택된다. 적합한 약제학적 담체뿐만 아니라, 약제학적 제형에 사용하기 위한 약제학적 필수품은 본 분야에서 널리 공지된 참고 문헌인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(EW Martin)] 및 USP/NF(미국 약전 및 국민의약품집)에 설명되어 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 NRF2 유전자(또는 일부 실시형태에서 변이체 NRF2 유전자)에 상보적인 가이드 RNA 서열을 캡슐화하는 나노입자, 또는 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 NRF2 유전자(또는 일부 실시형태에서 변이체 NRF2 유전자)에 상보적인 가이드 RNA 서열을 포함하는 벡터로서 제형화될 수 있다.
세포에서 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법
소정 측면에서, 본 개시내용은 세포에서 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, (a) NRF2 유전자 내의 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열(들) 및 (b) 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하고, 이로 인해 gRNA가 NRF2 유전자에 하이브리드화하고 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 NRF2 유전자를 절단하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 세포에서의 NRF2 발현 또는 활성은 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열 및 CRISPR-연관 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열이 도입되지 않은 세포에 비해 감소되는, 방법에 관한 것이다.
세포에서 NRF2 발현을 감소시키는 것은 세포에서 NRF2 mRNA의 발현을 감소시키는 것, 세포에서 NRF2 단백질의 발현을 감소시키는 것, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, NRF2 유전자의 하나 이상의 대립유전자(들)의 발현이 감소된다. 일부 실시형태에서, gRNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열(들) 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 것은 세포에서 NRF2 발현 및/또는 활성을 감소시키지만, 완전히 제거하지는 않는다. 다른 실시형태에서, 세포에서 NRF2 발현 및/또는 활성은 완전히 제거된다.
gRNA는 NRF2 유전자의 엑손 내의 표적 서열에 상보적일 수 있다. 특정 실시형태에서, gRNA는 NRF2 유전자의 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5 내의 표적 서열에 상보적이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 DNA 서열에 의해 암호화된다. 다른 실시형태에서, gRNA는 둘 이상의 DNA 서열에 의해 암호화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, gRNA는 전사-활성화된 소형 RNA(tracrRNA)를 암호화하는 제1 DNA 서열 및 CRISPR RNA(crRNA)를 암호화하는 제2 DNA 서열에 의해 암호화된다. tracrRNA 및 crRNA는 세포 내에서 하이브리드화하여 가이드 RNA를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, gRNA는 전사-활성화된 소형 RNA(tracrRNA) 및 CRISPR RNA(crRNA)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 정상(즉, 비-암성) 세포의 야생형 NRF2 유전자가 아닌 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자(예를 들어, 엑손 1, 2, 3, 4, 또는 5)에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 서열에 상보적이다. 일부 실시형태에서, gRNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열(들) 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 것은 세포에서 변이체 NRF2 발현 및/또는 활성을 감소시키지만, 완전히 제거하지는 않는다. 다른 실시형태에서, 세포에서 변이체 NRF2 발현 및/또는 활성은 완전히 제거된다.
일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용하기에 적합한 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 예를 들어 Cas7 및 Cas5와 같은 클래스 1 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제와 함께, 일부 실시형태에서 SS(Cas11) 및 Cas8a1; Cas8b1; Cas8c; Cas8u2 및 Cas6; Cas3" 및 Cas10d, Cas SS(Cas11), Cas8e 및 Cas6, Cas8f 및 Cas6f, Cas6f, Cas8-유사(Csf1), SS(Cas11) 및 Cas8-유사(Csf1); 또는 SS(Cas11) 및 Cas10를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 단일 효과기 분자를 갖는 I형, V형 및 VI형 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용하기에 적합한 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 예를 들어 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas13a, Cas13b, Cas13c, c2c4, c2c5, c2c8, c2c9, 및/또는 c2c10과 같은 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 NRF2 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용하기에 적합한 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 CasX, CasY 및/또는 MAD6을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Liu et al., Nature 566:218-23 (2019)] 참조).
변이체 NRF2 유전자를 함유하는 임의의 세포는 본원에 기재된 변이체 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법에 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, NRF2 유전자는 인간 NRF2 유전자이다.
소정 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법에 의해 생산된 돌연변이된 NRF2 유전자를 포함하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 NRF2 유전자는 변이체 NRF2 유전자에 비해 삽입 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입 또는 결실은 NRF2 유전자에서 프로토스페이서 인접 모티프 서열(PAM)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오타이드(들) 내에서 발생한다.
암의 치료 방법
소정 측면에서, 본 개시내용은 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 및 대상체의 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적인 가이드 RNA를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 소정 측면에서, 본 개시내용은 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 및 대상체의 암 세포 내의 변이체 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적인 가이드 RNA를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
소정 측면에서, 본 개시내용은 (a) 대상체의 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 서열; 및 (b) 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 정상(즉, 비-암성) 세포의 야생형 NRF2 유전자가 아닌 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자(예를 들어, 엑손 1, 2, 3, 4, 또는 5)에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2의 서열에 상보적이다.
소정 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 소정 실시형태에서, 암은 비소세포 폐암이다. 소정 실시형태에서, 암은 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 및 대상체의 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적인 가이드 RNA를 포함하는 약제학적 조성물로만 또는 (a) 대상체의 NRF2 유전자로부터의 표적 도메인에 상보적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 서열; 및 (b) 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 약제학적 조성물로만 치료된다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 정상(즉, 비-암성) 세포의 야생형 NRF2 유전자가 아닌 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자(예를 들어, 엑손 1, 2, 3, 4, 또는 5)에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA는 암 세포에서만 발견되는 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2의 서열에 상보적이다. 소정 실시형태에서, 암은 본원에 설명된 바와 같은 약제학적 조성물 및 추가 제제, 예를 들어, 화학치료제를 사용하여 치료된다. 소정 실시형태에서, 화학치료제를 사용한 치료는 약제학적 조성물을 사용한 치료와 동시에 개시된다. 소정 실시형태에서, 화학치료제를 사용한 치료는 약제학적 조성물을 사용한 치료가 개시된 후에 개시된다. 소정 실시형태에서, 화학치료제를 사용한 치료는 약제학적 조성물을 사용한 치료 전에 개시된다.
소정 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 대상체가 적어도 하나의 이전 화학치료 용법에 실패한 암의 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암은 하나 이상의 화학치료제에 내성이다. 따라서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 상기 대상체는 암에 대한 적어도 하나의 이전 화학치료 용법에 실패하였고, 본원에 설명된 약제학적 조성물을 암을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본원에 설명된 약제학적 조성물은 또한 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 상기 대상체는 적어도 하나의 이전 화학치료 용법에 실패하였다. 따라서, 본 개시내용은 대상체에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법으로서, 예를 들어 여기서 상기 대상체는 적어도 하나의 이전 화학치료 용법에 실패하였고, 본원에 설명된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여 종양 세포 성장이 억제되도록 하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 소정 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
예를 들어, 본원에 설명된 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로 치료되지 않은 암 세포에 비해 암 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 암 세포 증식을 약제학적 조성물로 치료되지 않은 암 세포에 비해 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% , 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 종양 성장을 약제학적 조성물로 치료되지 않은 종양에 비해 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 약제학적 조성물은 종양 성장을 약제학적 조성물로 치료되지 않은 암 세포에 비해 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51% , 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68 %, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상체에 대한 약제학적 조성물의 투여는 종양 성장을 완전히 억제한다.
한 실시형태에서, 본원에 설명된 약제학적 조성물의 투여는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 안정한 질환을 달성하고/하거나, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양-보유 대상체의 생존 시간을 연장시킨다. 따라서, 본 개시내용은 또한 적어도 하나의 이전 화학치료 용법에 실패한 대상체를 포함하는 인간 또는 다른 동물에게 본원에 기재된 약제학적 조성물의 유효량을 투여함으로써 이러한 인간 또는 동물의 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 본원에 제공된 지침에 따른 일상적인 실험에 의해 적어도 하나의 이전 화학치료 용법에 실패한 대상체를 포함하여 악성 종양을 치료할 목적을 위한 약제학적 조성물의 유효량이 얼마인지를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 치료학적 활성 양은 질환 병기(예를 들어, 1기 대 4기), 연령, 성별, 의학적 합병증 및 대상체의 체중, 및 대상체에서 원하는 반응을 유발하는 약제학적 조성물의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여 용법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇가지 분할 용량을 매일 투여할 수 있고, 용량을 연속 주입에 의해 투여할 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 따라 용량을 비례적으로 감소시킬 수 있다.
소정 실시형태에서, 방법은 수술, 방사선, 화학요법, 예를 들어, 호르몬 요법, 항체 요법, 성장 인자를 사용한 요법, 사이토카인 및 항혈관신생 요법 중 임의의 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 치료 용법을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 방법을 사용하여 치료하기 위한 암은 예를 들어 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양을 포함한다. 일 실시형태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료하기 위한 암은 흑색종, 암종 및 육종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코엔자임 Q10 조성물은 다양한 유형의 고형 종양, 예를 들어 유방암, 방광암, 결장 및 직장암, 자궁내막암, 신장(신세포)암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 피부암, 골암, 뇌암, 자궁경부암, 간암, 위암, 구강(mouth 및 oral)암, 신경모세포종, 고환암, 자궁암, 갑상선암, 두경부, 신장, 폐, 비소세포 폐, 흑색종, 중피종, 난소, 육종, 위, 자궁 및 수모세포종 및 외음부암을 포함한다. 소정 실시형태에서, 고형 종양은 삼중 음성 유방암을 포함하는 유방암을 포함한다. 소정 실시형태에서, 피부암은 흑색종, 편평세포 암종, 피부 T 세포 림프종(CTCL)을 포함한다. 소정 실시형태에서, 암은 백혈병을 포함한다. 소정 실시형태에서, 암은 폐암, 흑색종, 식도 편평세포암(ESC), 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 및 유방암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 암은 폐암, 예를 들어 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 실시형태에서, NSCLC는 선암종, 편평세포 암종 또는 대세포 암종이다. NSCLC를 치료하는 데 사용되는 현재 잘 확립된 조합 약물 전략 이외에, 암 치료를 위해 몇가지 상이한 조합적 접근법이 또한 조사되고 있다. 예를 들어, 종양 세포를 감염시키는 종양용해 바이러스의 사용은 화학요법의 활성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 시스플라틴 또는 젬시타빈과 병용된 점액종 바이러스로의 감염은 바이러스를 첨가하지 않고도 필요한 것보다 훨씬 낮은 용량에서 난소암 세포를 효율적으로 파괴하였다. Nounamo et al., Mol. Ther. oncolytics 6, 90-99 (2017). 암 치료의 개선된 효과를 위한 종양용해성 바이러스 요법 및 세포독성 화학요법의 사용은 활발한 개발 분야이다. Wennier, et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 13, 1817-33 (2012); Pandha, et al., Oncolytic Virotherapy 5, 1 (2016). 시스플라틴으로 치료하기 전에 복제 적격(competent) 바이러스로 감염시키는 것은 화학요법의 치료 혜택을 현저하게 향상시킨다.
표적화 요법(EGFR 돌연변이, ALK 재배열 등을 표적화)과 면역요법(체크포인트(checkpoint) 억제제, 항-PD1, 항-CTLA4 등)을 사용함으로써 NSCLC의 임상적 관리가 크게 개선되었다. 환자는 더 길고 더 나은 삶의 질을 누릴 수 있다. 그러나, 이들 요법이 모든 문제를 해결할 수는 없다. 예를 들어, 특정 분자를 표적화하는 제제는 전형적으로 약 70%의 반응율을 갖는다. 그러나, 8 내지 16개월의 중앙값 기간 후에, 불가피한 내성으로 인해 거의 모든 환자에서 재발이 발생한다. Anichini, et al., Cancer Immunol. Immunother. 67, 1011-1022 (2018). 면역요법과 관련하여, 소정 폐암 환자에서 펨브롤리주맙(키트루다(Keytruda))을 1차 치료로서 사용할 수 있지만, 이들 중 일부만이 반응할 것이다. Bianco, et al., Curr. Opin. Pharmacol. 40, 46-50 (2018).
다른 한편으로, 화학요법은 폐암 치료 패러다임에서 여전히 필수불가결한 것이다. 국소 NSCLC 환자에서, 화학요법은 수술 또는 방사선과 병용될 때 치유 가능성을 향상시키는 것으로 입증된 유일한 전신 요법이다. Wang, et al., Investig. Opthalmology Vis. Sci. 58, 3896 (2017). 전이를 갖는 환자에서, 화학요법은 여전히 표적화 요법 제제에 대한 내성이 발달한 환자를 위한 관리의 핵심이다. 한편, 이는 또한 면역계를 자극하여 면역요법의 효과를 증진시킬 가능성을 갖고 있다.
병용 요법
소정 실시형태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가 항암제, 예를 들어 화학치료제와의 병용 요법에서 사용될 수 있다.
소분자 화학치료제는 일반적으로, 예를 들어: 1. 토포이소머라제 II 억제제(세포독성 항생제), 예컨대 안트라사이클린/안트라센디온, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 네모루비신, 안트라퀴논, 예를 들어, 미톡산트론 및 로소잔트론 및 포도필로톡신, 예를 들어 에토포시드 및 테니포시드; 2. 미세소관 형성에 영향을 미치는 제제(유사분열 억제제), 예컨대 식물 알칼로이드(예를 들어, 생물학적으로 활성이고 세포독성인 식물 유래의 알칼리성 질소-함유 분자의 계열에 속하는 화합물), 예를 들어 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀, 및 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈, 및 포도필로톡신의 유도체; 3. 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드, 에틸렌이민 화합물, 알킬 설포네이트 및 알킬화 작용을 갖는 기타 화합물, 예컨대 니트로소우레아, 다카르바진, 사이클로포스파미드, 이포스파미드 및 멜팔란; 4. 항대사물질(뉴클레오시드 억제제), 예를 들어 폴레이트, 예를 들어 엽산, 피우로피리미딘(fiuropyrimidine), 퓨린 또는 피리미딘 유사체, 예컨대 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트 및 에다트렉세이트; 5. 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 토포테칸, 이리노테칸, 및 9-니트로캄프토테신, 캄프토테신 유도체, 및 레티노산; 및 6. 백금 화합물/착체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴을 포함하는 다양한 부류에 속한다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 예시적인 화학치료제는 특정 종양 또는 암에 대한 적절한 관리 표준에 기반하여 당업자에게 용이하게 명백한, 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소 머스타드), 스트렙토조신, 사이클로포스파미드, 카르누스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 독소루비신 리포(독실), 젬시타빈(젬자르), 다우노루비신, 다우노루비신 리포(다우녹솜), 프로카바진, 미토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실(5-FU), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소테레), 알데스류킨, 아스파라기나제, 부술판, 카보플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT-I 1, 10-하이드록시-7-에틸-캄프토테신(SN38), 카페시타빈, 프토라푸르, 5'데옥시플루로우리딘, UFT, 에닐우라실, 데옥시사이티딘, 5-아자사이토신, 5-아자데옥시사이토신, 알로푸리놀, 2-클로로 아데노신, 트리메트렉세이트, 아미노프테린, 메틸렌-10-데아자아미노프테린(MDAM), 옥사플라틴, 피코플라틴, 테트라플라틴, 사트라플라틴, 백금-DACH, 오르마플라틴, CI-973(및 이의 유사체), JM-216(및 이의 유사체), 에피루비신, 9-아미노캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시캄프토테신, 카레니테신, 9-니트로캄프토테신, TAS 103, 빈데신, L-페닐알라닌 머스타드, 이포스파미드메포스파미드, 퍼포스파미드, 트로포스파미드 카르무스틴, 세무스틴, 에포틸론 A-E, 토뮤덱스, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 암사크린, 에토포시드 포스페이트, 아시클로비르, 발라사이클로비르, 간시클로비르, 아만타딘, 리만타딘, 라미부딘, 지도부딘, 베바시주맙, 트라스투주맙, 리툭시맙, 펜토스타틴, 플록스우리딘, 플루다라빈, 하이드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤라이드, 메게스트롤, 멜팔란, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 피포브로만, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실, mTor, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 화학치료제는 시스플라틴, 비노렐빈, 카보플라틴 및 이들의 조합(예를 들어, 시스플라틴과 비노렐빈; 시스플라틴과 카보플라틴; 비노렐빈과 카보플라틴; 시스플라틴, 비노렐빈과 카보플라틴)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 적어도 하나의 화학치료제로 치료되지만 약제학적 조성물로 치료되지 않는 종양에 비해 종양 성장을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 약제학적 조성물은 종양 성장을 적어도 하나의 화학치료제로 치료되지만 약제학적 조성물로 치료되지 않는 암 세포에 비해 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51% , 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소시킬 수 있다.
Figure pct00002
NM_006164.5 (서열번호 7)
Figure pct00003
Figure pct00004
NP_006155.2 (서열번호 8)
Figure pct00005
실시예
실시예 1. CRISPR-지시된 유전자 편집 접근법을 사용한 NRF2 녹아웃 클론 A549 세포주의 생성
방법
세포 배양 조건
인간 폐 암종 A549 세포는 ATCC(미국 버지니아주 마나사스)로부터 구입하였다. A549는 NRF2의 과발현을 유발하는 KEAP1의 켈치 도메인 내에 돌연변이를 보유하는 잘 확립된 비소세포 폐 선암종 세포주이다. 이것은 암에 대한 신규 치료제의 발견을 위한 표준으로서 종종 사용되었다. 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 해동하고 10% FBS(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(ATCC, 버지니아주 마나사스)이 보충된 F-12K 배지(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스)에서 성장시켰다. 세포를 배양하고 2x103 내지 1x104 생존 세포/cm2의 농도에서 유지시키고 37℃ 및 5% CO2에서 항온배양하였다. 세포 수를 혈구계를 사용하여 결정하였다.
가이드 RNA 설계 및 작제
NRF2 유전자 암호화 서열을 장 랩(Zhang lab)의 온라인 생성기(crispr.mit.edu/)에 입력하고, 최고 점수를 가진 gRNA를 gRNA1(5' - UCGAUGUGACCGGGAAUAUCAGG)(서열번호 2)용으로 선택하고, NRF2를 표적화하는 이전에 검증된 gRNA(Sanjana et al., 2014, Nature Methods 11(8); 783-784)를 또한 gRNA2(5' - UGAUUUAGACGGUAUGCAACAGG)(서열번호 4)용으로 선택하였다. CRISPR-지시된 유전자 편집 시스템은 NRF2의 NES 도메인을 무능화시키도록 설계하였으며, 이는 핵으로 재진입하고 전사 인자를 활성화하는 단백질의 능력을 감소시킨다. CRISPR 플라스미드를 단일-단계 분해-라이게이션과 함께 표준 클로닝 방법을 사용하여 클로닝하였다. 적절한 5' 돌출부를 갖는 CRISPR 가이드 서열을 Addgene(addgene.org)을 통해 구입한 BbsI로 분해된 pX458 백본 벡터(플라스미드 48138; Addgene), 인간 코돈 최적화된 pSpCas9 및 2AeGFP를 갖는 키메라 가이드 RNA 발현 플라스미드로 클로닝하였다. 가이드 RNA 서열은 항시적 U6 프로모터의 전사 제어 하에 있었다. 도 1a를 참조한다. 작제 후, 플라스미드를 생거 시퀀싱(Genewiz Inc., 미국 뉴저지주 사우스 플레인필드)에 의해 검증하였다.
형질전환 및 클론 단리
A549 세포를 4mm 갭 큐벳(BioExpress, 미국 유타주 케이스빌)에서 5×105 세포/100μl의 농도로 형질감염시켰다. NRF2 표적화 pX458 작제물을 Bio-Rad Gene Pulser XCell 전기천공 시스템(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘레스)을 사용하여 A549 세포 내로 별도로 전기천공시켰다(250 V, LV, 13 ms 펄스 길이, 2회 펄스, 1 s 간격). 그 다음, 분류 전에 72시간 동안 37℃에서 완전 성장 배지를 갖는 6웰 플레이트에서 세포를 회수하였다. A549를 FACS AriaII 유세포분석기(BD Biosciences, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 96웰 플레이트로 분류하고, 개별 eGFP+ 세포를 각 웰로 분류하였다. 클론을 증식시키고, 개별 클론이 컨플루언스(confluence)에 도달하였을 때 더 큰 플레이트로 옮겼으며, 세포가 6웰 플레이트에서 컨플루언스(1×106 세포/mL)에 도달하였을 때 DNA 단리가 발생하였다.
시퀀싱 및 서열 분석
CRISPR/Cas9 표적화된 A549 클론을 Amplitaq Gold Fast PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 간략하게 언급하면, 주형 DNA, 프라이머, 물 및 마스터 믹스를 조합하고 순환시켰다: 95℃에서 10분 동안, (96℃에서 3초 동안, 60℃에서 3초 동안, 68℃에서 5초 동안) x35 사이클 및 72℃ 10초 동안. 402bp 생성물을 정제하고(Qiagen, 독일 힐덴) 정방향 PCR 프라이머를 사용하여 생거 시퀀싱하였다. 개별 A549 세포 클론의 클론 대립유전자 분석은 소프트웨어 프로그램인 분해에 의한 인델 추적(TIDE)에 의해 분석하여 CRISPR/Cas9 활성 후 다중-피크 분해 산물 내의 개별 하위서열을 결정하였다. Brinkman, et al., Nucleic Acids Res. 42, e168-- (2014). TIDE 분석은 서열 분해, 클론의 인델 패턴뿐만 아니라 각 클론 인델 패턴의 상대적 비를 시각적으로 제공하여, 각 대립유전자 프로파일의 결정 시 중간 단계 역할을 한다. TIDE에 의해 제공된 인델 패턴 및 이의 상대적 비를 사용하여, 대조군 추적 서열 및 클론 추적 서열을 수동으로 정렬하여 클론의 각 대립유전자의 인델 패턴을 시각화할 수 있었다.
웨스턴 블롯 분석
총 세포 단백질은 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 표준 RIPA 용해 완충액을 사용하여 A549 세포주로부터 수집하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 미국 일리노이주 락포드)를 사용하여 결정하였다. 샘플을 95℃에서 10분 동안 가열한 다음, 100V에서 90분 동안 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE에 적용하였다. 겔을 100V에서 1시간 동안 니트로셀룰로오스 막으로 전이시켰다. 블롯을 3% BSA에 넣고 4℃에서 진탕기에서 밤새 차단하였다. 1차 항체 항온배양은 NRF2(포스포 S40)(1:10,000, Abcam ab76026)의 경우 4℃에서 진탕기에서 밤새 수행하고 베타 액틴(1:8,000, Abcam ab8226)의 경우 실온에서 1시간 동안 수행하고, 2차 항체(Jackson Immunoresearch, 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브) 항온배양은 모두 실온에서 1시간 동안 1:10,000 희석율에서 수행하였다. 단백질 밴드를 Super signal west dura extended duration ECL(Pierce)을 사용한 화학발광을 통해 시각화하고 LiCor Odyssey FC에서 검출하였다. 모든 밴드를 Image Studio 소프트웨어 시스템에서 농도 측정을 위해 정량화하였다.
FACS 분석에 의한 세포 증식
A549 세포주를 트립신 처리하고 50 내지 70% 컨플루언시에서 수거하였다. 세포를 볼텍싱하면서 빙냉 70% 에탄올을 적가하여 고정시키고 4℃에서 최소 72시간 동안 항온배양하였다. 고정된 세포를 펠렛화하고 PBS로 2회 세척한 후, 얼음 위에서 30분 항온배양하였다. 제조업체의 프로토콜(BD Biosciences)에 표시된 바와 같이, 106개 세포당 20μl의 Alexa Fluor 647 마우스 항-Ki67(561126, BD Biosciences)를 세포에 첨가하고 30분 동안 항온배양하였다. 대조군은 동일한 희석율에서 Alexa Fluor 647 마우스 IgG1 k 이소형 대조군(557714, BD Biosciences)을 포함하였다. 항온배양 후, 세포를 2회 세척하고 염색 완충액(1x PBS 중 5% BSA)에 재현탁시켰다. 세포를 FACS AriaII 유세포분석기로 분석하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
결과
전략은 CRISPR-지시된 유전자 편집을 사용하여 A549 폐암 세포 내의 NRF2 대립유전자를 기능적으로 무능화시키는 것이었다. 유전자 편집 기술이 표적 유전자를 녹아웃시킬 수 있다는 사실을 확립하는 것이 중요하다. A549 세포에서 NRF2를 무능화시키는 데 사용되는 유전적 도구를 생성하기 위해 사용된 전략의 세부정보는 하기에 제공되어 있다. 도 1a는 NRF2를 표적화하여 녹아웃시키도록 설계된 CRISPR/Cas9 기구를 예시한다. 패널의 상단을 따라 이어지는 회색 막대는 NRF2의 게놈 서열을 나타내며 빨간색 블록은 암호화 영역을 나타낸다. 파란색 괄호는 각 CRISPR/Cas9가 DNA를 절단하도록 설계된 상대적 영역을 나타낸다. 각 gRNA는 유전자의 완전한 제거를 보장하기 위해 공지된 모든 이소형(ncbi.nlm.nih.gov/gene/4780)을 함유하는 영역에서 NRF2의 제4 엑손을 표적화하도록 설계하였다. 브로드 인스티튜트(Broad Institute)의 CRISPR 디자인 소프트웨어(crispr.mit.edu/)에 따라 최고 점수를 갖는 gRNA를 gRNA1용으로 선택하고 이전에 검증된 gRNA(Sanjana et al., bioRxiv 006726 (2014). doi:10.1101/006726)를 gRNA2용으로 선택하였다. 각 패널에 도시된 바와 같이, crRNA 올리고를 어닐링하고 이들을 BbsI로 분해된 플라스미드 px458(Addgene #48138)의 상보적 제한 부위 돌출부에 라이게이션하여 gRNA를 조립하였다.
도 1b는 KEAP1 결합 도메인, 전사활성화 도메인, 억제자 결합 도메인, β-TrCP 결합 도메인, DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 포함하는 NRF2 단백질의 기능적 도메인을 예시한다. Pandey et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 116, 89-98 (2017); Jung et al., Molecular Mechanisms to Therapeutic Opportunities. 26, 57-68 (2018); Namani et al., Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1843, 1875-1885 (2014). Neh5 도메인은 엑손 4와 엑손 5에 걸쳐 있으며 NRF2의 세포내 국소화를 조절하는 산화환원-민감성 핵-수송 신호(NES)를 포함한다. Jung et al., Molecular Mechanisms to Therapeutic Opportunities. 26, 57-68 (2018). 이론상으로, Neh4 및 Neh5 도메인 내의 유전자/단백질을 파괴함으로써 NES가 이동하여 비기능성이 되었다. 도 1c는 gRNA1 또는 gRNA2를 함유하는 pX458을 A549 폐 선암종 세포로 형질감염시키는 것으로 시작하여 개별 클론 집단의 대립유전자 분석의 최종 단계로 진행되는 실험 작업 흐름을 나타낸다. 중요하게도, 플라스미드 pX458은 FACS에 의해 형질감염된 개별 세포를 단리할 수 있도록 하는 eGFP 리포터를 함유한다. 전체 표적화 집단에서 CRISPR-지시된 NRF2 녹아웃의 효율을 평가하기 위해, eGFP+ 세포를 집단으로서 단리하고, gRNA1 또는 gRNA2 pX458로 형질감염된 세포 내의 NRF2 유전자좌에서 유전적 파괴 정도를 결정하였다. 분류된 집단을 생거 시퀀싱하고 생성된 추적 파일을 유전자 파괴의 마커인 인델의 존재에 대해 분석하였다. 이들 데이터는 분해에 의한 인델 추적(TIDE)으로 알려진 프로그램을 사용하여 수득하였다. Brinkman, et al., Nucleic Acids Res. 42, e168-- (2014). 도 2a에 나타난 바와 같이, 두 CRISPR/Cas9 설계는 모두 TIDE 결과로 입증되는 상당한 양의 인델을 생성하였으며, 이는 높은 정도의 NRF2 파괴를 나타낸다. 이들 결과는 본 접근법을 검증하고 A549 세포에서 NRF2의 파괴가 CRISPR/Cas9를 통해 가능함을 나타낸다.
다음으로, 본 경우에는 FACS 분류에 의해 개별 세포를 단리하여 단일 세포 클론 증식을 수득한 것을 제외하고, 동일한 실험을 수행하였다. 단일 세포 단리체가 충분한 양으로 증식되었을 때, 각 클론 집단의 절반을 냉동보존하고 나머지 절반에 대해 전술한 동일한 전략 및 방법을 사용하여 대립유전자 서열 분석을 수행하였다. 도 2b는 후속 실험 및 분석을 위해 총 9개(도면 보충 1)로부터 선택된 gRNA1 및 gRNA2 형질감염된 세포로부터 각각 유래된 2가지 클론, 1-40 및 2-11의 대립유전자 분석을 나타낸다. ATCC로부터 입수한 상기 A549 세포의 모 롯트(parent lot)로부터 생성된 모든 단리된 클론이 NRF2 유전자좌에 3개의 대립유전자를 보유하였다는 것이 바로 곧 명백해졌다. 빨간색 컬럼은 해당 클론 내 존재하는 인델 크기 및 이들 각각의 대표적 비를 나타낸다. 클론 1-40은 NRF2의 이형접합 KO를 나타내는 0bp 인델에 대한 2:1 비에서 9bp 결실을 함유하며 이는 NRF2의 이형접합 KO를 나타낸다. 클론 2-11은 1:1:1 비에서 10bp 결실, 6bp 결실 및 1bp 결실을 함유하며 이는 NRF2의 동형접합 KO를 나타낸다. 두 클론 모두의 각 대립유전자에서 특이적 인델 패턴은 TIDE 인델 데이터를 가이드로서 사용하여 서열 추적 파일을 야생형 서열에 대해 수동으로 정렬함으로써 특성규명하였다. 편의상, 본 발명자들은 클론 1-40을 이형접합 녹아웃이라 지칭하고 클론 2-11을 동형접합 녹아웃이라 지칭한다.
NES의 결여에 의해 영향을 받을 수 있는 기본적인 세포 표현형은 세포가 배양물에서 증식하는 속도이다. Murakami et al., Free Radic. Biol. Med. 88, 168?178(2015); Mitsuishi et al., Cancer Cell 22, 66-79(2012). 야생형 A549 세포는 전형적으로 24시간의 배가 시간을 갖지만, 클론 1-40, 보다 명확하게는 2-11은 클론 증식 과정에서 더 느리게 성장하였다는 것이 주목되었다(데이터는 제시하지 않음). 이러한 관찰은 본 발명자들로 하여금 세포를 Ki67에 대한 항체로 염색한 후 FACS 분석에 의해 클론 1-40 및 2-11의 증식 프로파일을 추가로 조사하도록 하였다. Ki67은 활발하게 증식하는 세포에서 발현되는 핵 항원이다. 따라서, 세포 배양에서 보이는 성장 특성에 기반하여 Ki67 발현의 감소를 예측할 수 있다. 에탄올-고정된 세포를 Alexa Fluor 647 항-Ki67로 염색하고 FACS에 의해 분석하고 히스토그램으로서 플로팅하였다(좌측 패널, 도 3a). FlowJo 상에 제공되고 게이트된 마우스 IgG1 κ 이소형 대조군을 사용하여 비특이적 결합을 제어하였다. x-축은 알로피코시아닌(APC)-접합된 항-Ki67의 형광 강도를 나타내며, 이이의 좌측으로의 이동은 클론 2-11에서 볼 수 있으며, 이는 세포 증식의 감소와 상관관계가 있는 형광 강도의 감소를 나타낸다.
2-11 세포의 증식 감소는 현저한 반면, 1-40 세포의 증식 감소는 기껏해야 크지 않은 정도였다. 따라서, 본 발명자들은 2-11 세포만을 사용하여 NRF2 녹아웃의 효과에 대한 연구를 계속하기로 결정하였는데, CRISPR-지시된 유전자 편집이 상기 세포들에서 기능을 더욱 완전히 파괴하는 데 성공하였기 때문이다. 세포 배양에서의 성장 특성 및 FACS 분석에 기반하여, MTS 검정을 사용하여 2-11 세포의 증식을 야생형 세포와 비교하여 평가하였다(우측 패널, 도 3a). 클론 2-11의 대립유전자 분석은 NRF2가 유전적으로 무능화되었으며, 베타 액틴에 대해 정규화되고 야생형 A549 세포와 비교될 때 클론 2-11이 약 68%의 녹다운을 보여주었음을 나타냈다(도 3b). 클론 2-11의 세 대립유전자 중 하나가 기능적 판독 프레임을 유지하기 때문에, 이러한 결과는 예상치 못한 것은 아니다. 유전자 분석은 NES를 함유하는 Neh5 도메인이 파괴되었음을 나타냈다. 따라서, 본 발명자들은 상기 클론을 특성규명하여 이것이 기능적 녹아웃인지를 식별하기 위해 전진하였다.
실시예 2. 화학민감성은 NRF2 녹아웃 A549 세포주에서 증가된다
방법
MTS 세포 증식 검정
CellTiter 96 수성 비-방사성 세포 증식 검정(Promega, 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 세포 생존력을 평가하였다. A549 세포주를 웰당 2x103 세포로 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포 배지를 흡인하고, 세포를 PBS로 세척한 다음, MTS 시약에 3시간 동안 노출시켰다. 세포 증식에 의한 3시간 MTS 생물 환원 후, Infinite 2000 PRO 마이크로플레이트 리더(Tecan, 스위스 만도르프)에서 450nm 필터를 사용하여 포르마잔 생성물의 흡광도를 측정하였다. 약물 노출 후의 세포 생존력을 CellTiter 96 수성 비-방사성 세포 증식 검정을 사용하여 평가하였다. A549 세포주를 웰당 2x103 세포로 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 시스플라틴, 카보플라틴, 또는 시스플라틴과 비노렐빈의 조합으로 3일 동안 처리하였다. 그 다음, 세포 배지를 흡인하고, 세포를 PBS로 세척한 다음, MTS 시약에 3시간 동안 노출시켰다. 세포 증식에 의한 3시간 MTS 생물 환원 후, Infinite 2000 PRO 마이크로플레이트 리더에서 450nm 필터를 사용하여 포르마잔 생성물의 흡광도를 측정하였다.
결과
유전자 조작된 NRF2-결핍 A549 세포주의 화학민감성을 조사하기 위해, 도 4에 도시된 MTS 검정을 이용하였다. 4a에서, 야생형 및 2-11 A549 세포는 증가되는 용량의 시스플라틴에 노출시켰다. 72시간 후, 시스플라틴을 제거하고 MTS 시약을 3시간 동안 첨가한 후, 집단을 포르마잔의 흡광도에 대해 측정하였다. 데이터는 예측한 대로 야생형 A549 세포가 고 용량의 시스플라틴에 내성이 있음을 보여준다. 사실, 야생형 A549는 각각 5μM 및 10μM의 최종 농도에서 증식이 악영향을 받기 전에 최대 3μM의 시스플라틴에서 세포 증식의 약간의 증가를 나타낸다. 유전자 조작된 녹아웃 세포주에서, 본 발명자들은 용량 의존적 방식의 화학민감성의 증가를 명백히 관찰하였다. 2-11 동형접합 녹아웃 세포는 1μM 이상의 농도에서 증식의 손실과 함께 심지어 최저 용량에서도 명백한 증가된 민감성을 나타낸다. 따라서, 이형접합 세포주가 적어도 하나의 생존성 유전자 카피를 함유하기 때문에 동형접합 녹아웃 세포보다 시스플라틴에 대한 더 큰 내성을 나타낸다는 점에서 본 발명자들은 일종의 유전자 용량 효과(gene dosage effect)를 관찰할 수 있다. 도 4에서, 본 발명자들은 비노렐빈이 5μM의 최종 농도까지 첨가되었다는 점을 제외하고는 패널 A에 대해 설명한 바와 같이 동일한 증가하는 양의 시스플라틴에 세포를 노출시킨 결과를 나타내고 있다. 비노렐빈은 시스플라틴 및 조합적 화학치료 용법 NSCLC에 대한 확립된 동반자이다. Hellmann, et al., Ann. Oncol. Off. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 27, 1829-35 (2016). 야생형 A549 세포는 심지어 낮은 용량에서도 극적인 증식 증가를 다시 나타냈고 용량이 5μM을 초과할 때까지 상승된 민감성을 보여주지 않았지만, 녹아웃 세포주(2-11)는 조합적 약물 요법에 대해 증가된 민감성을 나타냈다. 관련 항암 약물이자 NSCLC용으로 통상적으로 사용되는 화학요법인 카보플라틴(Hellmann et al., ibid)도 이들 유전자 조작된 A549 세포에서 향상된 화학민감성에 대해 평가하였고, 세포 사멸 반응은 시스플라틴을 사용한 실험에서 관찰된 것을 반영하였다(데이터는 제시하지 않음).
실시예 3. 유전자 재조작된 A549 세포는 폐암의 이종이식 마우스 모델에서 더 느린 성장 속도 및 증가된 화학민감성을 나타냈다
방법
동물 실험 및 통계 분석
본원에 제시된 동물 실험은 워싱턴 바이오테크놀로지사(Washington Biotechnology Inc., 메릴랜드주 심슨빌)(AAALAC 공인 동물 복지 보증 번호 A4192-01)의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 동물 사용 및 관리 프로토콜(SOP 505, SOP 520, SOP 522, SOP 1610, SOP1650)에 따라 워싱턴 바이오테크놀로지사에서 수행되었다. 인간 이종이식 모델은 이전에 보고된 방법론을 사용하여 확립하였다. Kellar et al., Biomed Res. Int. 2015, 1-17(2015). 암컷 무흉선 누드 마우스(Envigo, 5 내지 6주령)가 본 연구에 사용되었다. 20% 마트리겔을 사용하여 PBS에 현탁시킨 대략 5 x 106 세포(야생형 A549 또는 동형접합 녹아웃(클론 증식 2-11))를 각 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 체적은 일단 촉진되면 디지털 캘리퍼스로 주 3회 측정하고, 종양 크기 = ab2/2의 식을 사용하여 계산하였고, 여기서 'a'는 두 치수 중 더 크고 'b'는 더 작다. 종양이 약 100mm3의 평균 체적까지 성장했을 때, A549 종양 보유 마우스 또는 A549-2-11 종양 보유 마우스를 각각 7개 그룹(각 그룹마다 N=5)으로 무작위로 나누고 용량/용법-발견 연구를 하였다. 상기 마우스들을 0, 3, 6 및 9일차에(0일은 투여 시작일로 지정한다) (1) 시스플라틴(2mg/kg), (2) 카보플라틴(25mg/kg), (3) 시스플라틴(5mg/kg) 및 비노렐빈(5mg/kg) 또는 (4) 식염수의 꼬리 정맥 주사로 처리하였다(Sanjana et al., 2014, Nature Methods 11(8); 783-784). 종양 체적 및 체중을 시간 경과에 따라 면밀히 모니터링하였다. 16일 후, 동물을 희생시키고 종양을 제거하고 칭량하고 분자 분석을 위해 가공처리하였다. 마우스를 안락사시켰다. 데이터는 평균 ± SD로 표현하였다. 차이의 유의성을 평가하기 위해 스튜던트 t-검정 및 일원 또는 이원 ANOVA를 사용하였다. P 값 < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
면역형광 염색
A549 이종이식편을 16일차에 절제하고 액체 질소에 급속 동결시키고 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 모든 면역형광 염색은 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다. Wang et al., Investig. Ophalmology Vis. Sci. 58, 3896(2017). 간략하게 언급하면, 종양을 Optimum Cutting Temperature(Tissue Tek, 미국 캘리포니아주 토런스)에 포매시키고 Leica CM3050 저온유지 장치(Leica Microsystems, 미국 일리노이주 버팔로 그로브)를 이용하여 16㎛ 두께의 절편을 수득하고 슬라이드에 마운트하였다. 슬라이드를 고정시키고 실온에서 1시간 동안 차단 완충액과 항온배양하였다. 그 다음, 절편을 1차 항체와 함께 항온배양한 다음(보다 상세한 내용에 대해서는 표 3을 참조), PBS로 세척하고 Alexa Fluor 488 표지된 2차 항체(1:200 희석; Invitrogen, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 절편을 PBS로 세척한 다음, DAPI를 갖는 SlowFade Gold 변색 방지 마운트제(antifade mountant)(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로 마운트하였다. Zeiss Observer.Z1 현미경(Carl Zeiss, Inc., 독일 괴팅겐)을 이용하여 이미지를 수득하였다. TUNEL 검정을 제조업체의 지침에 따라 원 위치 세포 사멸 검출 키트, 플루오레세인(In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)(Roche, 스위스 바젤)을 이용하여 수행하였다.
Figure pct00006
면역세포화학 및 이미지 정량화
A549 세포주를 8웰 챔버 슬라이드(LabTek II)에 접종하고 24시간 동안 성장시켰다. 2μM의 시스플라틴에 48시간 동안 노출시킨 후, 세포를 PBS로 세척하고, 고정시키고, 실온에서 진탕하면서 4% 파라포름알데히드 + 0.1% Triton X-100으로 45분간 투과화하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 차단 완충용액(1X PBS에서 제조된 5% 표준 염소 혈청 + 0.3% Triton X-100)으로 차단하였다. 차단 후, 세포를 항체 희석 완충액(1X PBS에서 제조된 1% BSA + 0.3% Triton X-100)에서 제조된 1차 항체(NRF2 1:500, Abcam ab62352)와 함께 4℃의 가습 챔버에서 밤새 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 항체 희석 완충액에서 1:200 농도로 제조된 접합된 2차 항체(염소 항-토끼 Alexafluor 594, Thermo Fisher A-11037)와 함께 항온배양하였다. 대조군은 동일한 희석율에서 2차 전용 항체 염색을 포함하였다. 세포를 암실에서 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 챔버를 유리 슬라이드로부터 분리하였다. 상기 단계 직후, DAPI를 갖는 Slow Fade Gold 변색방지 시약(S36938, Invitrogen) 5μl를 슬라이드의 각 절편에 첨가하고 커버슬립을 첨가하고 밀봉하였다. 슬라이드는 Zeiss Axio 형광 관찰기에서 이미지화하였다. Z1 현미경 및 이미지를 AxioVision 소프트웨어에서 처리하였다. 무작위 시야를 이미지화하고 총 세포 수/시야를 계수하였다. 각 시야를 염색 없음(없음), 핵 염색 또는 세포질 염색에 대해 정량화하였다. 2명의 개인이 독립적으로 이미지를 계수하고 정량화하고 값을 평균화하였다. 각 범주에서 분석된 총 세포에 대한 NRF2 양성 염색된 세포의 퍼센트를 그래프에 플롯팅하였다. 오차 막대는 ±SEM을 나타내고 *는 <0.05인 유의한 p 값을 나타낸다(스튜던트 T-검정).
결과
CRISPR/Cas9-매개 NRF2 녹다운이 시험관내 A549 세포에서 화학민감성을 증가시켰기 때문에, 본 발명자들은 이종이식 마우스 모델에서 유전자 편집에 의해 구동되는 향상된 화학민감성을 조사한다. 동형접합 녹아웃 A549 세포(클론 2-11) 및 야생형 A549 세포(대조군)를 누드 마우스의 등에 이식하고 세포(세포주당 5x106)를 직경이 약 10 mm3인 종양으로 증식시켰다. 작업 흐름은 도 5a에 도시되어 있다. 전략의 일부분으로서, 화학치료제를 도표에 표시된 바와 같이 각각 0일, 3일, 6일 및 9일차에 꼬리 정맥 주사를 통해 첨가하였다. 화학치료제를 처음 주사한 시점인 0일차부터 16일 동안 체적 및 증식을 통해 종양 성장을 측정하였고, 그 결과는 도 5b, 도 5c 및 도 5d에 제시한다.
도 5b는 16일 동안의 종양 성장의 결과를 도시한다. 예상대로, 식염수 또는 2 mg/kg의 시스플라틴으로 처리된 야생형 A549 세포의 증식은 약물에 의해 억제되지 않았고, 시스플라틴에 대한 A549 세포의 잘 확립된 내성을 확인시켜준다. NRF2 녹아웃 이종이식편은 마우스에서 증식하였지만, 시스플라틴을 첨가하지 않아도 감소된 비율로 증식하였다. 가장 극적인 효과는 NRF2 녹아웃 세포를 16일의 기간 동안 시스플라틴으로 처리하는 조합적 접근법을 취할 때 나타난다. 이러한 경우, 이식된 세포의 증식은 정지되고 종양 크기는 실험 과정 전반에 걸쳐 동일한 수준에서 유지되어, 세포 배양물에서 수행된 실험으로부터 생성된 본 발명자들의 이전 결과를 확인시켜 준다(도 4).
도 5c는 동일한 이종이식 마우스 실험 프로토콜에 따라 고정 농도의 5 mg/kg 시스플라틴과 5 mg/kg 비노렐빈을 조합하여 사용할 때 유사한 결과를 도시한다. 흥미롭게도, 야생형 A549 세포는 이러한 약물 조합에 더욱 민감한 것으로 보인다. 상기 관찰은 비노렐빈이 A549 세포의 시스플라틴 사멸에 미치는 시너지 효과를 반영할 수 있으며, 이는 본 발명자들의 실험 시스템이 이전에 알려진 결과를 재현한다는 중요한 내부 제어를 제공한다. 다시 한번 말하면, 동형접합 녹아웃 2-11 세포주는 약물 처리의 부재 하에 야생형 세포보다 느린 속도로 증식하지만 NRF2 녹아웃과 약물 처리의 병용은 종양 성장의 중단과 16일 동안의 종양 크기 유지로 이어진다. 25mg/kg 카보플라틴이 꼬리 정맥에 주사된 도 5d에 제시된 데이터에서 동일한 반응이 다시 한 번 보이고; 동일한 감소된 증식 및 전술한 성장 경향이 재현된다. 이들 결과는 화학요법에서 유전자 편집의 병용이 세포 배양물과 이종이식 마우스 모델 둘 다에서 A549 세포에서의 향상된 화학민감성을 생성한다는 것을 시사한다.
A549 종양 증식의 분석
대표적인 종양 샘플을 4개의 그룹(식염수를 이용한 야생형 A549, 시스플라틴 2mg/kg을 이용한 야생형 A549, 식염수를 이용한 녹아웃 2-11, 시스플라틴 2mg/kg을 이용한 녹아웃 2-11)로부터 수거하였다(각 그룹마다 N=3). 도 5e에 도시된 바와 같이, 4개의 추출된 종양 그룹 간에 뚜렷한 차이가 명백하다. 상기 설명한 바와 같이, 야생형 세포로부터 생성된 종양은 시스플라틴의 부재 또는 존재 하에 이종이식 마우스 모델 내에서 공격적으로 증식한다. NRF2 녹아웃 세포주는 약물의 부재하에서도 야생형보다 더 천천히 증식한다. 그러나, 시스플라틴으로 처리된 NRF2 녹아웃 세포를 보유한 마우스로부터의 모든 샘플에서 가장 작은 종양이 관찰된다.
A549 2-11 녹아웃 이종이식 종양은 이의 야생형 대응물에 비해 더 작은 종양 체적을 나타냈기 때문에, 본 발명자들은 세포 주기의 모든 활성기(G1, S, G2 및 유사분열) 동안 나타나는 널리 공지된 증식 마커인 Ki67을 사용하여 종양 내 증식 활성을 조사하고자 하였다. Scholzen et al., J. Cell. Physiol. 182, 311-322(2000). 도 6에 도시된 바와 같이, 식염수로만 처리된 A549 세포 내에서, 풍부한 Ki67-양성 세포가 관찰되었고; 시스플라틴으로 처리된 마우스로부터 추출된 종양은 유사한 수준의 Ki67 양성 세포를 생성하였다. 2-11 세포로부터 생성된 종양의 경우에, Ki67 염색은 두드러지게 감소하고 시스플라틴으로의 처리는 심지어 더 낮은 Ki67 수준을 초래하였으며, 이는 시스플라틴이 증식을 더욱 늦춤으로써 KO 2-11 세포의 반응을 향상시킨다는 것을 시사한다.
종합하면, 축적된 데이터는 기능적 녹아웃으로서 클론 2-11에 대한 강력한 사례를 구축하는데, 이들 세포가 야생형 대응물에 비해 화학요법에 대한 더 높은 민감성을 가능하게 하기 때문이다. 본 발명자들은 세포 배양물과 마우스 둘 다에서 관찰된 이러한 표현형에 대한 설명을 제공하고자 하였다. NRF2의 Neh5 도메인에 위치한 NES 영역의 파괴 효과는 면역세포화학을 사용하여 추가로 특성규명하였다. 야생형 A549 및 클론 2-11 세포를 NRF2 발현을 자극하기 위해 2μM 시스플라틴으로 전처리하였다. 각 세포 샘플의 무작위 시야를 식별하고 이미지화하고 총 세포 계수를 결정하였다. 세포를 다음의 관찰 결과에 기반하여 정량화하였다: NRF2의 염색 없음, 핵 염색만 또는 세포질 염색만. 도 7a는 데이터 세트에 통합된 시야가 적어도 10개인 몇가지 실험의 다중 반복물의 평균 정량화를 나타낸다. 본 발명자들은 각각 야생형 A549와 클론 2-11 세포 간에 NRF2의 핵 국소화 정도에서 통계학적 유의차를 관찰하였다. 도 7b에서 볼 수 있는 바와 같이, 야생형 세포에서 대다수의 NRF2는 핵에 위치하는 반면, 기능적 녹아웃 세포주(2-11)에서 NRF2는 세포질에서 주로 발견된다. 시스플라틴-유도된 야생형 및 녹아웃 세포의 이미지(도 7b)는 도 7a에 제시된 데이터를 반영한다.
세포주 2-11은 증가하는 용량의 시스플라틴에 대한 강화된 민감성을 나타내고 증가하는 농도의 카보플라틴에 대한 반응으로 보다 적게 민감성을 나타냈다. 시스플라틴과 비노렐빈이 병용될 때, 강화된 민감성이 또한 관찰된다. 세포 사멸은 표준 MTS 검정에 의해 결정하였다. 그 다음, 동형접합 녹아웃 세포주 2-11의 화학민감성을 이종이식 마우스 모델에서 평가하였으며, 여기서는 세포를 누드 마우스의 등에 이식하고 16일 동안 증식되도록 하였다. 종양이 약 100mm3로 성장한 후 다양한 날에 시스플라틴, 카보플라틴 또는 시스플라틴과 비노렐빈을 후속적으로 꼬리 정맥 주사하는 것은 다음 16일 동안 종양 증식의 감소를 유도하였다. 흥미롭게도, 세포주 2-11 단독은 화학치료 약물의 첨가 없이도 이종이식 마우스 모델에서 더 느린 성장 표현형을 나타냈다. 이러한 결과는 시스플라틴, 카보플라틴 또는 시스플라틴/비노렐빈의 첨가가 종양 세포 증식의 유의한 감소를 유도하지만 NRF2 유전자 자체의 파괴는 증식 활성을 약간만 감소시킨다는 것을 나타낸다.
야생형 A549 세포 또는 시스플라틴 또는 식염수로 처리된 클론 녹아웃 세포가 이식된 마우스로부터 단리된 종양을 절단하고 세포 증식에 통상적으로 사용되는 마커인 Ki67에 대해 염색하였다. Ki67은 세포 증식과 엄격하게 연관되며 세포 주기의 모든 활성기 동안 존재하지만, 휴지기 세포에는 존재하지 않는다. 본 발명자들의 결과는 이종이식 모델에서 성장한 처리된 또는 미처리된 야생형 A549 세포에서 Ki67 수준에 차이가 없음을 시사하며, 이는 다시 시스플라틴에 대한 A549 세포의 널리 공지된 내성을 반영한다. 대조적으로, 시스플라틴으로 처리된 NRF2 녹아웃 세포의 Ki67 수준은 야생형 대응물과 비교할 때 실질적으로 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 CRISPR-지시된 유전자 편집의 기능으로서 NRF2 녹아웃 세포가 이식된 마우스에서 발견되는 종양의 크기 감소, 종양 세포 증식의 감소에 대한 그럴듯한 설명을 제공한다. 이러한 결과는 시스플라틴-처리된 세포가 농도 증가의 함수로서 G0/G1 경계에서 정지된다고 보고한 벨마(Velma) 등(Biomark Insights 11, BMI.S39445, 2016)의 결과를 반영한다. 시스플라틴은 G0와 G1 간의 경계면에 영향을 주어 세포 주기 진행의 지연 또는 증식을 감소시킨다. 이들 데이터는 확실히 A549 세포에서 NRF2의 파괴가 감소된 증식성 표현형을 유도하여 16일차에 분석된 종양에서 세포자멸사의 출현을 배제할 수 있음을 나타낸다. 실험 초기에 시스플라틴의 4가지 처리 중 임의의 것이 도입된 직후 세포자멸사가 명백해질 수 있다.
스트레스 요인으로 자극될 때, 기능적 NRF2는 핵으로 전위하고 여기서 ARE(항산화 반응 요소) 서열에 결합하고 다양한 하류 세포보호 유전자의 전사를 활성화한다. NRF2의 핵으로의 전위(자주색으로 나타남)는 야생형 A549 세포의 이미지에서 볼 수 있다(도 7b). 그러나, 클론 2-11에서 NRF2의 유전적 녹아웃은 NRF2 기능의 손실을 유발하고, 도 7b에서도 볼 수 있는 바와 같이 단백질의 전위를 중단시키고 대신 세포질에 체류하는 것으로 보인다. 기능적 녹아웃은 CRISPR이 특히 암 요법을 위해 임상 적용으로 이동함에 따라 가치가 있을 수 있다.
본 발명자들의 결과는 유전자 편집 활성과 화학요법의 병용이 종양 세포 성장을 상승적으로 감소시키는 작용을 한다는 개념을 뒷받침한다. 본 발명자들의 경우에, 유전자 수준에서 NRF2를 무능화시키기 위해 A549 세포를 CRISPR/Cas9로 처리하는 것도 다수의 화학치료제의 더 낮은 용량에서 효과적인 사멸을 유도하였다.
실시예 4. 흑색종, ESC, HNSCC 및 유방암의 시험관내 및 이종이식 마우스 모델에서의 화학민감성(예측)
상기 실시예의 방법에 따라, CRISPR/Cas9-매개 NRF2 녹다운의 효과를 시험관 내 및 이종이식 마우스 모델 둘 다에서 추가 암에 대해 평가할 것이다. 예를 들어, 상기 실시예 1의 방법에 따라, gRNA1 서열(5' - UCGAUGUGACCGGGAAUAUCAGG)(서열번호 2) 또는 gRNA2 서열(5' -UGAUUUAGACGGUAUGCAACAGG)(서열번호 4)을 사용하여 인간 악성 흑색종 A375 세포주(Wang, et al., 2018, Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2018, Article ID 9742154), 식도 편평세포 암(ESC) 세포주 KYSE-30, -50, - 70, -110, -140, -150, -170, -180, -220 및 -270(Shibata et al., 2015, Neoplasia 13:864), 두경부 편평세포 암종(HNSCC) HSC-4 세포주(Kitamura & Motohashi, 2018, Cancer Science 109:900) 및 유방암(선암종) 세포주 MCF7(Kang et al., 2014, Scientific Reports 4:7201)의 NRF2 녹다운 세포주를 생성할 것이다. 유전자 조작된 NRF2-결핍 암 세포주의 화학민감성은 상기 실시예 2에 제공된 방법에 따라 시험관내에서 상응하는 야생형 암 세포주의 화학민감성과 비교할 것이다. 각 세포주마다, 다음의 화학치료제에 대한 화학민감성을 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 같이 평가할 것이다.
Figure pct00007
상기 표 4에 나타낸 바와 같은 야생형 및 NRF2-결핍 암 세포주를 누드 마우스에 이식하고 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이 화학민감성에 대해 평가할 것이다.
실시예 5
RF2 gRNA 설계
ppx458 플라스미드 벡터
엑손 4 gRNA1 - 5' TCGATGTGACCGGGAATATC AGG 3'(서열번호 9)
엑손 4 gRNA2 - 5' TGATTTAGACGGTATGCAAC AGG 3'(서열번호 10)
NRF2 유전자-암호화 서열을 장 랩의 온라인 생성기(crispr.mit.edu/)에 입력하고, 최고 점수를 가진 gRNA를 gRNA1(5' TCGATGTGACCGGGAATATCAGG 3'(서열번호 9))용으로 선택하고 NRF2를 표적화하는 이전에 검증된 gRNA를 또한 gRNA2(5' TGATTTAGACGGTATGCAACAGG 3'(서열번호 10))용으로 선택하였다(1). CRISPR 플라스미드를 단일-단계 분해-라이게이션과 함께 표준 클로닝 방법을 사용하여 클로닝하였다. 적절한 5' 돌출부를 갖는 CRISPR 가이드 서열을 BbsI로 분해된 pX458 백본 벡터(플라스미드 48138; Addgene)로 클로닝하였다. 이들 두 플라스미드를 개별적으로 형질감염시켜 A549 세포주의 NRF2를 녹아웃시켜, 절단 부위에 작은 인델을 갖는 세포주 1-40 및 2-11을 생성하였다(2).
103개의 염기쌍 단편을 절단하고 제거하기 위해, 두 플라스미드 작제물 gRNA1 및 gRNA2 모두를 A549 세포주에 형질감염(리포펙션)시켜 NRF2를 표적화하였다. 형질감염된 세포를 단일-세포 분류하고 증식시켰다. 클론 집단을 초기에 PCR 및 겔 전기영동을 사용하여 스크리닝하여 앰플리콘 크기의 변화를 시각적으로 분석하였다. 일단 스크리닝되면, DNA는 NRF2의 엑손 4에 걸쳐 시퀀싱을 위해 보내졌다. 도 8은 인델 형성에 대해 분석된 10개의 클론을 도시한다.
엑손 3 gRNA3 - 5' AAGTACAAAGCATCTGATTT GGG 3'(서열번호 11)
엑손 3 gRNA4 - 5' AGCATCTGATTTGGGAATGT GGG 3'(서열번호 12)
이전에 설명된 실험은 엑손 4 내에서 절단하도록 설계하였다. NRF2의 완전한 녹아웃을 보장하기 위해, gRNA3(5' AAGTACAAAGCATCTGATTTGGG 3'(서열번호 11)) 및 gRNA4(5' AGCATCTGATTTGGGAATGTGGG 3'(서열번호 12))(Benchling에 입력된 NRF2 서열 및 gRNA는 전략적으로 선택되었다)는 px458 백본 벡터에 클로닝되어 엑손 3 내에서 절단하도록 설계하였다. 새로 설계된 gRNA는 이전에 설계된 gRNA1 및 gRNA2와 함께 사용되어 엑손 3 내지 엑손 4를 절단할 수 있다. gRNA4는 gRNA1과 함께 사용되어 782개 염기를 제거할 수 있도록 설계하였다. gRNA3은 gRNA2와 함께 사용되어 877개 염기를 제거할 수 있도록 설계하였다. 이러한 두 조합은 모두 엑손 3 및 엑손 4의 대부분의 손실을 초래하여 엑손 3의 시작 부분과 엑손 4의 말단 부분만을 남겼다(Sanjana et al., Nat. Methods 11:783 (2014); Bialk et al., Mol. Ther. - Oncolytics 11:75-89 (2018))
Cas9 RNP
엑손 2 gRNA - 5' TGGATTTGATTGACATACTT TGG 3' (NRF2 KO를 위한 Neh2) (서열번호 13)
엑손 5 gRNA - 5' GCTTCTTACTTTTGGGAACA AGG 3' (NRF2 KO를 위한 Neh3) (서열번호 14)
다음의 gRNA들은 tracrRNA 및 Cas9 단백질과 복합체화되어 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하도록 설계하였다. gRNA는 Benchling 내의 NRF2 서열을 사용하여 설계하였다.
NRF2를 녹아웃시키기 위해 엑손 2 gRNA(5' TGGATTTGATTGACATACTTTGG 3'(서열번호 13))를 엑손 2 내의 Neh2 시작 부분에서 절단하도록 설계하였다. RNP를 A549 세포에서 형질감염시키고 다양한 시점에서 수집하여 도 9에 도시된 인델 형성을 평가하였다(TIDE 분석). 세포를 FACS에 의해 단일-세포 분류하여 클론 집단을 수득하여 NRF2 KO의 정도를 결정할 수 있었다.
엑손 5 gRNA(5' GCTTCTTACTTTTGGGAACAAGG 3'(서열번호 14))는 엑손 5 내의 Neh3 말단에서 절단하고 엑손 2 gRNA와 함께 사용되도록 설계하였다. 2가지 gRNA 모두를 사용함으로써 전체 NRF2 유전자가 제거되었다(3429bp). 세포를 두 RNP 복합체 모두로 형질감염시키고 FACS에 의해 단일-세포 분류하였다. 클론 집단을 NRF2 KO에 대해 분석하였다.
Cas12a RNP
엑손 2 gRNA - 5' TTTG ATTGACATACTTTGGAGGCAA 3' (NRF2 KO를 위한 Neh2) (서열번호 15)
엑손 5 gRNA - 5' TTTT CCTTGTTCCCAAAAGTAAGAA 3' (NRF2 KO를 위한 Neh3) (서열번호 16)
다음의 gRNA들은 tracrRNA 및 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하도록 설계하였다. gRNA는 Benchling에서 NRF2 서열을 사용하여 설계하였다.
NRF2를 녹아웃시키기 위해 엑손 2 gRNA(5' TTTGATTGACATACTTTGGAGGCAA 3'(서열번호 15))를 엑손 2 내의 Neh2 시작 부분에서 절단하도록 설계하였다. RNP를 A549 세포에 형질감염시키고 다양한 시점에서 수집하여 도 10에 도시된 인델 형성을 평가하였다. 세포를 FACS에 의해 단일-세포 분류하여 클론 집단을 수득하여 NRF2 KO의 정도를 결정할 수 있었다.
엑손 5 gRNA(5' TTTTCCTTGTTCCCAAAAGTAAGAA 3'(서열번호 16))는 엑손 5 내의 Neh3 말단에서 절단하고 엑손 2 gRNA와 함께 사용되도록 설계하였다. 2가지 gRNA 모두를 사용함으로써 전체 NRF2 유전자가 제거되었다(3429bp). 세포를 두 RNP 복합체 모두로 형질감염시키고 FACS에 의해 단일-세포 분류하였다. 클론 집단을 NRF2 KO에 대해 분석하였다.
실시예 6
CRISPR/Cas9를 사용하여 R34G 돌연변이를 표적화하는 데 사용될 수 있는 gRNA는 5' GATATAGATCTTGGAGTAAGT G G 3'(서열번호 25)(밑줄 표시 - PAM 부위, 볼드체 - R34G 돌연변이)이다. 개념 증명으로서, 리보핵단백질 복합체(RNP) 내의 R34G gRNA를 사용하여 구별 수준을 평가하기 위해 시험관내 절단 반응을 수행하였다. 야생형 및 돌연변이된(R34G) NRF2 서열을 R34G RNP 복합체와 함께 항온배양하고 절단 산물을 겔 전기영동에 의해 분석하였다(도 11).
돌연변이 세포와 대비하여 정상 세포에서 CRISPR/Cas9의 특이성 및 차등적 인식을 시험하기 위해, 본 발명자들은 정상 인간 기관지 상피로부터 유래하는 BEAS-2B 세포주를 사용하여 내인성 R34G 돌연변이를 생성할 것이다. 이것은 Neh2 도메인 내에서 절단하도록 설계된 2개의 CRISPR/Cas9 작제물(플라스미드 벡터 또는 RNP)을 형질감염시킴으로써 수행될 것이다. 절단되는 단편은 R34G 돌연변이를 생성하는 단일 염기 변경을 제외하고 동일한 서열을 갖는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 대체할 것이다. 형질감염된 세포는 클론 증식 및 클론 서열 분석을 위해 형광 활성화된 단일 세포 분류(FACS)에 의해 분류할 것이다. 돌연변이는 조작된 세포주에서 종양 발생을 유도해야 한다.
일단 확립되면, 본 발명자들은 새로운 돌연변이 세포주에서 R34G-표적화 CRISPR/Cas9의 특이성 및 효율을 시험할 것이다. 본 발명자들은 새로운 클론 세포주를 R34G-표적화 CRISPR로 형질감염시킨 후 인델 형성을 위한 절단 부위를 분석하여 유전자 편집 활성을 평가할 것이다. R34G 표적화 CRISPR의 차등적 인식을 보여주는 대조군으로서, 본 발명자들은 야생형 세포주를 R34G CRISPR로 형질감염시키고 인델 형성을 평가할 것이다. 이러한 실험 후, 본 발명자들은 다양한 기술을 사용하여 유전자 편집 후의 NRF2의 기능뿐만 아니라, 세포 경로에 대한 CRISPR 절단 효과를 분석할 것이다. 본 발명자들은 세포 생존력을 측정하기 위한 MTS 검정을 사용하여 유전자 편집 전에 돌연변이 세포주에서 화학내성의 기준선을 결정할 것이다. 본 발명자들은 R34G CRISPR의 형질감염 후 동일한 실험을 수행하여 화학치료 약물에 대한 반응을 평가할 것이다. 본 발명자들은 유전자 편집 후 NRF2 녹아웃 정도를 결정하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행할 것이다.
정상(즉, 비-암성) 세포와 대비하여 돌연변이 세포에서 R34G CRISPR의 차등적 인식을 보여주기 위해 이종이식 모델에서 유사한 접근법을 수행할 것이다. 본 발명자들은 확립된 돌연변이 세포주를 사용하여 마우스 이종이식편을 주사할 것이다. 일단 종양이 확립되면, R34G CRISPR을 전신 전달할 것이다. 종양을 절제하고 절단 부위에 걸친 NRF2 유전자의 철저한 유전적 분석을 위해 사용할 것이다. 정상(즉, 비-암성) 조직을 무작위로 샘플링하여 표적이탈 유전자 편집의 존재/부재를 평가할 것이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 7.
H1703(NCI-H1703)은 p53 유전자의 코돈 285에 미스센스 돌연변이(GAG→AAG)를 갖는 폐 편평세포 암종 세포주이다. You et al., Cancer Res. 60:1009-13(2000). NCI-H1703은 주로 FGFR1c를 발현하고 FGF2로 자극 시 Erk1/2 인산화를 유도하는 것으로 나타났다. Marek et al., Mol. Pharmacol. 75:196-207 (2009).
Cas9 RNP
엑손 2 gRNA 3 - 5' TGGAGGCAAGATATAGATCT TGG 3' (NRF2 KO를 위한 Neh2) (서열번호 64)
R34G ssDNA 주형 - 5' TTAAAAAACATGAGCTCTCTCCTTCCTTTTTTTGTCTTAAACATAGGACATGGATTTGATTGACATACTTTGGAGGCAAGATATAGATCTTGGAGTAAGT G GAGAAGTATTTGACTTCAGTCAGCGACGGAAAGAGTATGAGCTGGAAAAACAGAAAAAACTTGAAAAGGAAAGACAAGAACAACTCCAAAAGGAGCAAG 3' (밑줄 표시: 의도된 R34G 돌연변이) (서열번호 65)
엑손 2 gRNA 3은 R34G 돌연변이를 재생성하기 위해 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 D29 코돈을 절단하도록 설계하였다. gRNA는 Cas9 단백질과 복합체화되어 RNP를 형성하고 R34G 주형 DNA와 함께 사용되어 DNA 복구를 용이하게 하고 NRF2 유전자에 의도된 R34G 돌연변이를 도입하였다. 실험은 몇가지 클론 유래의 세포주를 산출하였으며, 이는 추가로 특성규명 중에 있다. 도 30은 인델 형성에 대해 DECODER에 의해 유전적으로 분석된 클론을 표시한다. 클론 26(G9_H1703-26)은 형질감염에 사용된 gRNA의 절단 부위에서 4bp 결실이 선행된 동형접합 R34G 돌연변이를 함유한다. 클론 53(G2_H1703_R34G_53)은 형질감염에 사용된 gRNA의 절단 부위에서의 2bp 결실이 선행된 동형접합 R34G 돌연변이를 함유한다. 클론 2-31(H1703_R34G_2-31)은 형질감염에 사용된 gRNA의 절단 부위에서 2가지 별개의 인델 패턴, 즉 하나의 대립유전자 상의 6bp 결실 및 다른 대립유전자 상의 4bp 결실을 갖는 2가지 야생형 대립유전자를 함유한다. 클론 2-91(H1703_R34G_2-91)은 형질전환에 사용된 gRNA의 절단 부위에서 20bp 결실을 함유하는 야생형 대립유전자와 함께 이형접합 R34G 돌연변이를 함유한다. 이들 클론은 H1703 세포주에서 엑손 2 내의 R34G 돌연변이 및 NRF2 KO의 효과를 추가로 특성규명하는 데 사용될 것이다.
다음의 gRNA들은 H1703 세포주에서 추가 실험을 위해 px458 플라스미드 벡터에서 사용될 뿐만 아니라 Cas9 RNP와 함께 사용되도록 설계하였다. 개별 RNP 복합체 및 두 RNP 복합체 모두는 H1703 세포주에서 NRF2 KO의 특성규명을 위한 NRF2 KO 클론 유래의 세포주를 생성하는 데 사용된다. 클론 유래의 세포주는 화학민감성을 결정하기 위한 MTS 증식 검정을 위해 사용된다.
Cas9 RNP
엑손 4 gRNA1 - 5' TCGATGTGACCGGGAATATC AGG 3' (NRF2 KO) (서열번호 66)
엑손 4 gRNA2 - 5' TGATTTAGACGGTATGCAAC AGG 3' (NRF2 KO) (서열번호 67)
실시예 8. (예측적) 화학민감성은 NRF2 녹아웃 H1703 세포주에서 증가된다.
방법
MTS 세포 증식 검정
CellTiter 96 수성 비-방사성 세포 증식 검정(Promega, 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 세포 생존력을 평가할 것이다. H1703 세포주를 웰당 2x103 세포로 플레이팅하고 24시간 동안 배양할 것이다. 그 다음, 세포 배지를 흡인하고, 세포를 PBS로 세척한 다음, MTS 시약에 3시간 동안 노출시킬 것이다. 세포 증식에 의한 3시간의 MTS 생물환원 후, Infinite 2000 PRO 마이크로플레이트 판독기(Tecan, 스위스 만도르프)에서 450nm 필터를 사용하여 포르마잔 생성물의 흡광도를 측정할 것이다. 약물 노출 후의 세포 생존력을 CellTiter 96 수성 비-방사성 세포 증식 검정을 사용하여 평가할 것이다. H1703 세포주는 웰당 2x103 세포로 플레이팅하고 24시간 동안 배양할 것이다. 그 다음, 세포를 시스플라틴, 카보플라틴 또는 시스플라틴과 비노렐빈의 조합으로 3일 동안 처리할 것이다. 그 다음, 세포 배지를 흡인하고 세포를 PBS로 세척한 다음, MTS 시약에 3시간 동안 노출시킬 것이다. 세포 증식에 의한 3시간의 MTS 생물환원 후, Infinite 2000 PRO 마이크로플레이트 판독기에서 450nm 필터를 사용하여 포르마잔 생성물의 흡광도를 측정할 것이다.
결과
유전자 조작된 NRF2-결핍 H1703 세포주의 화학민감성을 조사하기 위해, MTS 검정을 이용할 것이다. 야생형 및 NRF-2 결핍 H1703 세포를 증가하는 용량의 시스플라틴에 노출시킬 것이다. 72시간 후, 시스플라틴을 제거하고, MTS 시약을 3시간 동안 첨가하고, 이후 집단을 포르마잔의 흡광도에 대해 측정한다. 데이터는 야생형 H1703 세포가 고용량의 시스플라틴에 내성이 있음을 보여줄 것이다. 유전자 조작된 녹아웃 세포주에서, 본 발명자들은 용량 의존적 방식으로 화학민감성의 증가를 관찰할 것이다. NRF2 녹아웃 세포는 강화된 민감성을 나타낼 것이다. 따라서, 이형접합 세포주가 적어도 하나의 생존성 유전자 카피를 함유하기 때문에 동형접합 녹아웃 세포보다 시스플라틴에 대한 더 큰 내성을 나타낸다는 점에서 본 발명자들은 일종의 유전자 용량 효과를 관찰할 수 있을 것이다.
실시예 9.
단일 가이드 RNA는 Synthego(캘리포니아주 멘로 파크)에서 주문하였다. IDT로부터의 ALT-R SpCas9를 사용하였다.
Figure pct00010
H1703 모 세포는 형질감염 48시간 전에 배양하였고 형질감염 당일에 약 60 내지 80% 컨플루언시에 도달하였다. 100 ul당 106개의 세포를 형질감염당 사용하였고 각 조건은 2반복으로 실행하였다.
각 CRISPR/Cas9 RNP를 sgRNA 대 Cas9의 5:1 비로 복합체화하였다. 250 pmol의 sgRNA를 실온에서 50pmol의 Cas9와 2반복으로 복합체화하였다. 그 다음, RNP 복합체를 SF 뉴클레오펙션 키트를 이용한 뉴클레오펙션(Lonza)을 사용하여 H1703 모 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 플레이팅하고 72시간 동안 회수하였다. 72시간 후, 세포의 각 샘플을 트립신 처리에 의해 수집하고 추가 분석을 위해 펠렛화하였다. 세포 펠릿을 게놈 DNA 단리, PCR 및 생거 시퀀싱을 위해 사용하였다. 생거 서열은 TIDE에 의한 인델 분석을 위해 사용하였다(전체 계획은 도 12에 도시되어 있다).
gRNA 길이는 표적 특이성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되었다(Fu et al., Nat. Biotechnol. 32:279-84 (2014)). 야생형 "표적-적중(on-target)" 부위에 대한 다양한 길이의 R34G sgRNA의 인델 형성의 효율을 평가하였다. 각 길이마다 sgRNA를 합성하고 정제된 Cas9와 복합체화하였다. 각 RNP로 형질감염된 H1703 폐 편평세포로 반복 실험을 수행하고 72시간 동안 회수한 다음, 인델 형성에 대해 분석하였다. H1703 세포주의 야생형 NRF2 유전자에는 R34G 부위가 존재하지 않으므로, 최소의 또는 배경 유전자 편집 활성만이 예상된다.
반복 실험으로부터 다양한 길이의 sgRNA의 인델 효율은 도 13 및 도 14에 표시되어 있다. 각 gRNA 길이는 최소의 통계적으로 유의하지 않은 인델을 생성하였으며, 총 인델 효율은 TIDE에 의해 분석된 바에 따르면 전체 3.8%(p 값 <0.05)를 초과하지 않았다. 두 반복물 모두에서, 17개 뉴클레오타이드 길이의 sgRNA는 1.5% 및 1.6%의 총 인델 효율을 생성하였으며, 서열의 98.0% 및 97.7%는 야생형을 유지하였다. 18개 뉴클레오타이드 길이의 sgRNA는 1.9% 및 2.6%의 총 인델 효율을 생성하였으며, 서열의 97.4% 및 96.6%는 야생형을 유지하였다. 20개 뉴클레오타이드 길이의 sgRNA는 0.8% 및 2.9%의 총 인델 효율을 생성하였으며, 서열의 98.4% 및 96.2%는 야생형을 유지하였다. 22개 뉴클레오타이드 길이의 sgRNA는 1.2% 및 2.3%의 총 인델 효율을 생성하였으며, 서열의 98.2% 및 96.5%는 야생형을 유지하였다. 23개 뉴클레오타이드 길이의 sgRNA는 3.4% 및 3.8%의 총 인델 효율을 생성하였으며, 서열의 95.8% 및 95.2%는 야생형을 유지하였다. 각 그래프의 삽도에 도시된 바와 같이, 모든 시험 샘플(녹색 막대)은 대조 샘플(검은색 막대)과 정렬되었으며 비정상 서열 신호가 도시되어 있다. 각 삽도는 두 신호 모두의 거의 완전한 중첩을 도시하며, 이는 주요 그래프와 총 인델 효율에 의해 나타낸 바와 같이 시험 샘플 중에 인델 활성이 거의 없음을 나타낸다. 이로부터, 본 발명자들은 표적 서열에 대해 각 sgRNA의 높은 특이성이 있다는 결론을 내릴 수 있다. 인델 활성의 부족은 CRISPR 절단에 요구되는 야생형 서열 내의 누락된 PAM 부위에 기인할 수 있다. sgRNA 길이의 차이는 인델 효율에 최소의 영향을 미치는 것으로 보이며, 길이가 증가함에 따라 효율이 높아지는 약간의 경향이 있으며, 이는 더 긴 gRNA가 미스매치를 더 쉽게 허용하고 야생형 "표적-적중" 서열을 절단할 수 있음을 시사한다(요약은 도 15에 도시되어 있다).
실시예 10. A549 Neh2 녹아웃.
폐 선암종 유래의 세포주인 A549를 사용하여, NRF2의 엑손 2를 표적화하도록 설계된 CRISPR/Cas9로 형질감염시켜 무작위 인델 패턴을 갖는 개별 클론을 생성하였다. 총 3가지 클론, 1-17, 2-16 및 2-23을 단리하고 증식시켰다. 존재하는 인델을 확인하기 위한 게놈 DNA 단리 및 생거 시퀀싱을 위해 모든 3가지 클론을 수집하였다. DECODR 프로그램을 사용하여 각 클론의 생거 시퀀싱을 디컨볼루팅(deconvolute)하였다. A549 세포주는 배수체이므로 이들 클론은 NRF2 유전자의 3개의 대립유전자를 함유한다. 클론 1-17은 -2, -2, -13 염기쌍 결실을 함유한다. 클론 2-16은 모든 대립유전자에 걸쳐 -1 염기쌍 결실을 함유한다. 클론 2-23은 2개의 야생형 대립유전자 및 -2 염기쌍 결실을 함유한다. 도 16 참조. 세포 증식 검정을 사용하여 시스플라틴 처리와 병용된 CRISPR 표적화 후의 NRF2의 기능을 평가하였다. MTS 검정을 사용하여 A549 야생형, 클론 1-17, 2-16 및 2-23 세포의 세포 증식을 측정하였다. 세포를 각 웰에 동일한 농도로 플레이팅하고 24시간 동안 회수하였다. 세포는 시험된 시스플라틴의 각 농도(0, 1, 2, 3, 5 및 10 μM)마다 4반복으로 플레이팅하였다. 각 MTS 실험은 농도당 클론당 총 8개의 반복물에 대해 2반복으로 수행하였다. 각 클론 및 농도에 대한 흡광도 값은 흡광도를 각 대조군 웰의 흡광도로 나누어 정규화하였다(0 μM). 그 다음, 각 농도에서 각 클론에 대한 정규화된 값을 평균화하고 평균의 표준 오차를 계산하였다. 각 농도의 정규화된 평균 값을 산점도 그래프로 나타냈다.
몇가지 A549 NRF2 녹아웃 클론이 생성되었고 시스플라틴 및 카보플라틴(0 내지 10 uM 농도)과 용량 곡선에 사용하였다. 단일 가이드 RNA를 사용하여 NRF2 유전자의 엑손 2를 표적화하여 NRF2 녹아웃 클론을 생성하였다. 선택된 A549 클론은 클론 1-17, 2-16, 2-23이었다. 이들 3가지는 Neh2 도메인을 암호화하는 엑손 2 내의 단일 가이드 RNA로 NRF2를 표적화함으로써 생성하였다. 클론 1-17은 -2(62%), -2(318%) 및 -13(6%)bp 결실을 함유한다. 클론 2-16는 -1(100%)bp 결실을 함유한다. 클론 2-23은 2개의 야생형 대립유전자(79%) 및 -2(21%)bp 결실을 함유한다. 이들 게놈 프로파일을 TIDE 및 DECODR에 의해 분석하였다. MTS 검정을 사용하여 각 NRF2 KO 클론의 세포 증식 및 화학민감성 프로파일을 결정하였다. 세포를 다양한 농도의 시스플라틴(1, 2, 3, 5, 10 uM)으로 처리하여 상이한 정도의 NRF2 KO 후의 화학민감성을 평가하였다. 도 17 및 도 18는 둘다, 각각 산포도 및 막대 그래프로서 도시된 녹색으로 나타난 야생형 A549 세포와 비교하여 2회의 실험 반복으로부터의 정규화 및 평균 데이터를 포함한다. 클론 2-23은 야생형 세포보다 훨씬 더 높은 내성을 나타내도록 하는 우세한 야생형 대립유전자를 함유한다. 클론 1-17 및 2-16은 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 CRISPR 절단 부위에 있는 다양한 인델의 결과로서 비교적 동일한 민감성 경향을 나타낸다. NRF2 녹아웃 후 시스플라틴에 대한 세포의 민감성에 미치는 유전자 용량-의존적 효과가 있다. 이러한 데이터는 CRISPR 및 화학요법을 이용하여 암 세포를 표적화할 때 잠재적으로 나타날 수 있는 반응의 유형과 흡사하다.
실시예 11. DNA 수준에서 CRISPR-지시된 종양 세포 선택성
NRF2는 정상 세포에서 발현될 때 산화 스트레스에 대한 세포 생존을 촉진하는 종양 억제인자로서 작용한다. 그러나, 종양 세포에서 과발현될 때, NRF2는 종양 세포 생존에 유리하고 산화 스트레스 및 화학예방 화합물로부터 보호하는 종양유전자로서 작용함으로써 화학내성을 부여한다(Menegon et al., Trends Mol. Med. doi:10.1016/j.molmed.2016.05.002(2016)). NRF2의 과발현은 KEAP1 및/또는 NRF2의 돌연변이 결과로 발생할 수 있으며 폐암에서 가장 흔하게 발견된다. 단백질의 모든 도메인에서 발견되는 KEAP1의 기능-상실 돌연변이는 NRF2의 결합을 방해한다. NRF2의 기능-획득 돌연변이는 도 19(보고 및 특성규명된 NRF2 돌연변이의 개략도)에 도시된, KEAP1에 대한 결합을 담당하는 DLG 및 ETGE 모티프에서 주로 발견된다(Frank et al., Clin. Cancer Res. 24:doi:10.1158/1078-0432.CCR-17-3416 (2018); Kerins et al., Sci. Rep. 8:12846 (2018); Menegon et al., Trends Mol. Med. 22:578-93 (2016); Shibata et al., Source 105:13568-73 (2008); Fabrizio et al., Oxid. Med. Cell. Longev. 2018:1-21 (2018); Fabrizio et al., Oxid. Med. Cell. Longev. 2018:2492063 (2018); Fukutomi et al., Mol. Cell. Biol. 34:832-46 (2014)). 이들 돌연변이는 KEAP1과 NRF2 간의 단백질-단백질 상호작용을 독점적으로 방해하여 종양 세포에서 NRF2의 과발현을 유발한다. 이러한 NRF2의 과발현은 단백질의 축적 및 분해 부족을 통해 이의 기능을 종양 억제인자에서 종양유전자로 변경한다. KEAP1 결합의 상실로 인해, NRF2는 더 이상 분해를 위해 격리되지 않아 세포질 및 핵 내의 단백질 축적을 유발하고 결국 하류 경로의 활성화를 통해 세포보호 및 해독을 부여한다.
최근에 사이언티픽 리포트(Scientific Reports)에서 케린스(Kerins)와 우이(Ooi)에 의한 연구는 더 캔서 게놈 아틀라스에 보고된 다양한 암 사례에서 체세포 NRF2 돌연변이의 목록을 작성하였다(Kerins et al., Sci. Rep. 8:12846 (2018)). 상기 연구는 33가지의 상이한 종양 유형에서 발견된 NRF2 및 KEAP1 돌연변이의 비율뿐만 아니라 항시적 NRF2 활성화를 담당하는 흔한 돌연변이를 식별하였다. 그들은 주로 폐 편평세포 암종(LUSC)에서 볼 수 있는 214건의 NRF2 돌연변이 사례를 보고하였다. 이들 NRF2 돌연변이 중 몇 가지가 이전에 보고되고 특성규명되었으며 도 19에 도시되어 있다. 이러한 214건의 사례 중, LUSC에 보고된 가장 흔한 돌연변이는 R34G이다. R34G 돌연변이는 NRF2의 KEAP1-매개 분해를 억제하여 NRF2 안정성 및 핵 축적을 증가시키는 것으로 특성규명되었다(Kerins et al., Sci. Rep. 8:12846 (2018); Fabrizio et al., Oxid. Med. Cell. Longev 2018:2492063(2018)). R34G 돌연변이는 NRF2의 코돈 34의 제1 염기에서 시토신에서 구아닌으로 염기 변화(CGA → GGA)된 결과로서 발생하며, 이는 아미노산을 아르기닌에서 글리신으로 변화시킨다. 상기 돌연변이는 Cas9 인식, 결합 및 절단을 위한 새로운 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 부위를 생성하기 때문에 상기 돌연변이는 CRISPR-지시된 유전자 편집 접근법에서 특히 관심대상이다(도 20). PAM은 CRISPR 시드 서열에 인접한 2 내지 6개의 뉴클레오타이드로 구성되며 Cas 뉴클레아제 단백질이 표적 DNA를 인식, 결합 및 절단할 수 있도록 한다. Cas9 뉴클레아제는 5' NGG 3'을 인식하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 절단 후, Cas9는 평활 말단, 이중가닥 절단을 생성하고, 이어서 이는 2가지 메커니즘: 비상동 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성-지시된 복구(HDR) 중 하나에 의해 복구된다. NHEJ는 절단 부위에서 삽입 또는 결실(인델)을 담당하여 유전자의 유전적 녹아웃(KO)을 생성하고 잠재적으로 단백질 발현의 손실을 유발한다. 이와 같은 차등적 Cas9 인식 부위는 종양 세포 게놈의 선택적 절단의 기초가 될 수 있다. 이러한 접근법에 적용할 수 있는 몇 가지 다른 NRF2 돌연변이가 보고되고 특성규명되었다. 이러한 돌연변이들은 도 19에 자홍색으로 제시되어 있고, 여기서 빨간색 염기는 돌연변이되어 새로운 Cas9 PAM 부위를 생성하는 뉴클레오타이드를 나타낸다.
DLG 모티프의 돌연변이는 분자내 상호작용을 방해하여 KEAP1 결합을 억제하는 것으로 나타났다(Fukutomi et al., Mol. Cell. Biol. 34:832-46 (2014)). 보다 최근에, 케린스와 우이는 NRF2에서 R34G 돌연변이의 성질을 조사하고 돌연변이 자체가 단백질 안정성을 증가시켰다는 것을 발견하였다. 따라서, R34G 돌연변이의 성질로 인해, 암성 세포에만 존재함으로써 종양 게놈 DNA를 정상 게놈 DNA와 구별할 수 있게 한다. 이러한 접근법은 또한 전달 방법 및 전달의 특이성을 개선한다. CRISPR/Cas9를 이용하여 R34G 돌연변이를 표적화하는 데 사용될 수 있는 가이드 RNA(gRNA)는 5' GATATAGATCTTGGAGTAAGT G G 3'(볼드체 - PAM 부위, 밑줄 표시 - R34G 돌연변이(서열번호 25))이다. R34G 돌연변이-특이적 CRISPR/Cas9 복합체의 구별 수준과 특이성을 평가하기 위해 몇가지 실험을 수행하였다.
개념 증명으로서, 리보핵단백질 복합체(RNP)에서 R34G 가이드 RNA를 사용하여 구별 수준을 평가하기 위해 시험관내 절단 반응을 수행하였다. 시험관내 절단 반응은 표적 특이적-가이드 RNA를 Cas9 단백질과 복합체화하여 리보핵단백질(RNP)을 형성하는 것을 포함한다. RNP는 관심대상의 DNA(100 ng)와 함께 항온배양되고, 반응 및 절단 산물은 겔 전기영동에 의해 시각화된다. 이 실험을 위해, NRF2 발현 플라스미드(도 21)로부터의 야생형 및 R34G-돌연변이된 NRF2 PCR 산물(901bp)을 R34G-표적화 RNP 복합체(1 μM)와 함께 항온배양하고 절단 산물을 겔 전기영동에 의해 시각화하였다(도 22 참조). 비특이적 RNP(HBB RNP)를 또한 사용하여 새로운 부위 및 이의 표적화 RNP의 특이성을 입증하였다. 겔 이미지(R34G NRF2 - R34G RNP)의 레인 6에서, RNP 절단의 결과로서 2개의 새로운 밴드(222 & 679bp)가 보이며, 이는 R34G-표적화 RNP가 돌연변이된 DNA 서열만을 인식하고 절단함을 나타낸다.
초기 개념 증명 후, 특이성 및 효능을 추가로 평가하기 위해 생체내 실험을 수행하였다. 초기 생체내 연구는 인간 폐 선암종으로부터 유래된 A549 세포주에서 수행하였다. A549 세포주는 NRF2 유전자에 R34G 돌연변이를 함유하도록 유전자 조작하였다. A549 세포주에서 수행된 작업은 인간 폐 편평세포 암종으로부터 유래된 H1703 세포주에서도 수행되고 있다. 모 A549 세포주, R34G-돌연변이된 A549 세포주(A549 R34G-6) 및 H1703 모 세포주를 엑손 2에 걸쳐 시퀀싱하였다. A549와 H1703 모 세포주는 둘 다 NRF2 유전자의 엑손 2 내에 돌연변이를 함유하지 않는 반면, A549 R34G-6 세포주는 이형접합 R34G 돌연변이를 함유한다(도 23). A549 세포주는 이중 대립유전자(bi-allelic) 및 삼중 대립유전자(tri-allelic)인 것으로 공지되어 있으므로, 빨간색 화살표(도 23)로 표시된 A549 R34G-6 클론의 R34G 돌연변이는 'C' 뉴클레오타이드의 피크(파란색 피크)와 비교하여 'G' 뉴클레오타이드의 이중 피크(검정색 피크)로 나타난 바와 같이 3개의 대립 대립유전자 중 2개에 있는 것으로 여겨진다.
일단 서열이 확인되면, 각 세포주로부터의 게놈 DNA를 사용하여 NRF2의 엑손 2를 증폭시켰다. 그 다음, 각 세포주로부터의 PCR 산물(530bp)을 다양한 파라미터 하에 시험관내 절단 반응에서 사용하여 R34G-표적화 RNP의 특이성 및 충실도를 시험하였다. 이러한 절단 반응의 경우, 예상되는 절단 산물은 사다리를 따라 빨간색 선으로 표시된 바와 같이 385 및 145bp에 보이며, 절단되지 않은 산물은 530bp에서 보인다. 도 24는 모 A549 세포로부터의 야생형 NRF2 서열 및 A549 R34G-6 세포로부터의 R34G-돌연변이된 NRF2 서열을 사용한 시험관내 절단 반응으로부터의 겔 이미지를 도시한다. 증가하는 농도(0.5 내지 5 pmol)의 R34G-표적화 RNP를 사용하여 서열의 임계값 및 충실도를 결정하였다. 겔 이미지는 사용된 RNP의 표준 농도의 5배가 야생형 NRF2 서열의 절단을 초래하지 않는 반면(레인 2 내지 5), R34G-돌연변이된 NRF2 서열의 경우 R34G-표적화 RNP의 표준 농도의 절반에서도 절단 생성물을 볼 수 있음을 보여준다(레인 7). 절단되지 않은 생성물(상단 밴드, 530bp)은 A549 R34G-6 세포주에서 R34G 돌연변이의 이형접합성에 상응하는 레인 7 내지 10에서 여전히 볼 수 있다. 따라서, A549 R34G-6 세포주의 야생형 NRF2 대립유전자는 내부 음성 대조군으로 작용한다.
R34G-표적화 RNP가 R34G 돌연변이의 결여로 인해 실제로 야생형 NRF2 서열을 절단하지 않는다는 것을 보장하기 위해 야생형 NRF2 서열의 절단 효율을 평가하는 또 다른 시험관내 절단 반응을 수행하였다. R34G RNP 절단 부위로부터 29bp 상류에 절단 부위를 갖는 가이드 RNA(표지된 Neh2 RNP)를 선택하고 양성 절단 대조군으로서 사용하였다. 두 RNP 모두를 사용한 시험관내 절단 반응의 결과는 도 25의 겔 이미지에 표시된다. 레인 1 내지 8은 야생형 NRF2 서열을 사용한 반응인 반면, 레인 9 내지 16은 R34G-돌연변이된 NRF2 서열을 사용한 반응이었다. 레인 2 내지 4 및 레인 10 내지 12에서, PCR 산물을 엑손 2(Neh2 RNP)의 시작 부분을 표적화하는 증가하는 농도(1, 3 및 5 pmol)의 RNP와 함께 항온배양하였다. Neh2 가이드 RNA 서열은 5' TGGATTTGATTGACATACTTTGG 3'(서열번호 13)이며, 이는 천연 CRISPR 부위이며 이들 반응 동안 절단을 위한 양성 대조군으로서 사용된다. Neh2 RNP를 사용한 절단 산물은 116 및 414bp이고 야생형 및 R34G-돌연변이된 NRF2 서열 둘 다에서 볼 수 있으며, 이는 야생형 및 R34G 돌연변이 NRF2 서열 둘 다가 표적 영역 내에서 CRISPR/Cas9 절단에 적합함을 나타낸다. 레인 6 내지 8 및 레인 14 내지 16에서, PCR 산물을 증가하는 농도(1, 3 및 5 pmol)의 R34G-표적화 RNP와 함께 항온배양하였다. 절단 산물은 145 및 385bp이고 레인 14 내지 16에서 명확하게 볼 수 있으며, 최소 절단은 야생형 NRF2 서열의 레인 6 내지 레인 8에서 볼 수 있다. 이는 NRF2의 엑손 2 내의 R34G 돌연변이의 존재 하에 표적 DNA를 인식하는 R34G-표적화 RNP만의 특이성을 더욱 강화한다. 야생형 NRF2 서열의 잔류 절단은 절단 반응의 성질 및 표적 DNA에 대한 가이드 RNA의 서열 상동성에 의해 설명될 수 있다. 절단 반응의 파라미터는 최대 절단을 위해 표적 DNA와 RNP를 1시간 동안 항온배양하는 것을 포함한다. 따라서, 이러한 반응의 성질은 비특이적 절단을 유도할 수 있다.
생체내 연구로 넘어가기 전 마지막 시험관내 절단 반응을 야생형 NRF2를 함유하는 H1703 및 A549 모 세포주 및 돌연변이된 NRF2를 함유하는 A549 R34G-6 세포주로부터의 게놈 DNA 및 NRF2 엑손 2 PCR 산물을 사용하여 수행하였다(도 26). R34G-표적화 RNP는 각 PCR 생성물(레인 2, 레인 3, 레인 5, 레인 6, 레인 8, 레인 9)과 함께 농도(1 & 5 pmol)를 증가시키면서 사용되었다. H1703 및 A549 모 세포주(레인 3 및 레인 6) 둘 다에서 야생형 NRF2 서열에서 최소 절단이 보이는 반면, R34G-돌연변이된 NRF2 서열을 갖는 A549 R34G-6 세포주에서는 절단 산물(145 및 385bp)이 명백히 보인다(레인 8 및 레인 9). 다시 말하면, 상기 데이터는 이전 도면에 제시된 데이터에 도시된 바와 같은 R34G-표적화 RNP의 특이성 및 효능을 강화한다.
시험관내 절단 반응을 동일한 세포주: A549 및 H1703 모 세포주와 A549 R34G-6 세포주를 사용하여 세포 기반 실험을 통해 추가로 평가하였다. 세포주를 표준 조건 하에 배양하고 이전에 확립된 파라미터를 사용하여 전기천공(Lonza, Nucleofection)에 의해 형질감염시켰다. 도 27 내지 도 29는 R34G-표적화 RNP의 형질감염 후 3가지 세포주 모두를 사용한 8가지 별개의 실험의 유전자 분석을 도시한다. 이 실험은 3가지 상이한 조건 하에 수행하였다. 제1 조건은 Cas9와 등몰 농도의 이중체화 가이드 RNA를 사용하는 것이었다. 제2 조건은 Cas9의 5배 양의 이중체화 가이드 RNA를 사용하는 것과 함께 형질감염 효율을 측정하고 추가 분석을 위한 GFP-양성 집단을 분류하기 위해 GFP(녹색 형광 단백질) 발현 벡터를 사용하여 것이었다. 제3 조건은 Cas9에 5배 양의 단일 가이드 RNA와 함께, GFP 발현 벡터 및 추가 분석을 위한 GFP-양성 집단의 분류를 사용하는 것이었다.
도 27은 A549 모 세포에서 R34G-표적화 RNP의 형질감염 후 유전자 분석을 도시한다. A549 모 세포는 야생형 NRF2 유전자를 함유하므로 R34G-표적화 RNP에 대한 천연 CRISPR/Cas9 인식 부위가 없다. 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 TIDE 분석에 의해 분석하였다(도 27에 도시됨). 상단 패널은 미분류된 집단의 인델 효율 및 서열 정렬을 나타낸다. TIDE 분석에 따르면, 11.8%의 총 인델 효율 및 통계적으로 유의하지 않은 삽입 및 결실이 있다(검은색 막대 - p 값 > 0.001). 중간 패널은 통계적으로 유의하지 않은 삽입 또는 결실만을 갖는 GFP-양성 분류된 집단으로부터 4.3%의 총 인델 효율을 보여준다. 하단 패널은 하나의 통계적으로 유의미한 삽입(+1bp)을 갖는 GFP-양성 분류 집단으로부터 11.4%의 총 인델 효율을 보여준다.
도 28은 A549 R34G-돌연변이된 클론 세포주(A549 R34G-6)에서 R34G-표적화 RNP의 형질감염 후 유전자 분석을 도시한다. A549 R34G-6 세포는 NRF2 유전자의 엑손 2 내에 이형접합 R34G 돌연변이를 함유하여 R34G-표적화 RNP를 위한 새로운 CRISPR 인식 부위를 생성한다. 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 TIDE 분석에 의해 유전자 편집 활성에 대해 분석하였다(도 28에 도시됨). 상단 패널은 43.0%의 총 인델 효율 및 통계적으로 유의한 삽입(+1, 30bp) 및 결실(-9, 41bp)과 함께 몇가지 유의하지 않은 결실을 갖는 미분류된 집단의 인델 효율 및 서열 정렬을 보여준다. 중간 패널은 통계적으로 유의한 삽입(+1, 30bp)과 결실(-1, 9bp) 및 유의하지 않은 결실을 갖는 GFP-양성 분류된 집단으로부터 55.7%의 총 인델 효율을 보여준다. 유의한 총 인델 효율은 R34G-표적화 RNP가 매우 활성임을 나타낸다. 상기 클론 세포주는 R34G 돌연변이에 대해 이형접합성이고 하나의 야생형 NRF2 대립유전자를 함유하기 때문에, 본 발명자들은 서열의 1/3이 야생형(0 눈금 표시에 표시됨)을 유지할 것으로 예상할 수 있었으며, 이는 본 실험 데이터(분석된 서열의 32.0%는 야생형이다)에서 볼 수 있다. 하단 패널은 GFP-양성 분류된 집단으로부터 유의한 삽입(+1, 30bp)과 결실(-2bp) 및 유의하지 않은 인델과 함께 32.7%의 총 인델 효율을 보여준다. 더 낮은 R2 값은 서열 분석의 일부가 서열 품질 때문에 설명되지 않을 수 있음을 나타낸다. 본 데이터로부터 전반적으로, 본 발명자들은 R34G 돌연변이가 세포-기반 실험에서 시험될 때 활발히 절단되는 새로운 CRISPR 인식 부위를 실제로 생성한다고 추론할 수 있다. 비록 추측일 뿐이지만, R34G-표적화 RNP는 클론 세포주 내에서 야생형과 R34G-돌연변이된 대립유전자를 구별한다.
도 29는 야생형 NRF2 유전자를 함유하고 천연 CRISPR 인식 부위를 함유하지 않는 NCI-H1703 세포주에서 R34G-표적화 RNP의 형질감염 후 유전자 분석을 도시한다. 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 TIDE 분석에 의해 유전자 편집 활성에 대해 분석하였다(도 29에 도시됨). 상단 패널은 미분류된 집단으로부터 0.0%의 총 인델 효율을 보여준다. 하단 패널은 GFP-분류된 집단으로부터 4.6%의 총 인델 효율과 유의하지 않은 인델만을 보여준다.
추가 연구는 다운스트림 실험에서 폐 편평세포 암종의 모델 시스템으로서 사용될 R34G 돌연변이를 포함하도록 H1703 세포주를 조작하는 것을 포함한다. 이것은 Neh2 도메인을 함유하는 NRF2 유전자의 엑손 2 내에서 절단하도록 설계된 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP)을 형질감염시킴으로써 수행될 것이다. R34G 돌연변이를 함유하는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(ssODN)는 이중가닥 절단을 가교하는 주형 가닥 역할을 할 것이다. RNP 및 ssODN은 전기천공법(Nucleofection, Lonza)을 통해 형질감염시키고, 형질감염된 세포는 클론 증식 및 서열 분석을 위해 형광 활성화 단일 세포 분류(FACS)에 의해 분류할 것이다. R34G 돌연변이된-H1703 세포주가 확립되면, 본 발명자들은 몇가지 세포-기반 실험 및 이종이식 마우스 모델을 사용하여 새로운 돌연변이된 세포주에서의 R34G-표적화 CRISPR/Cas9(5' GATATAGATCTTGGAGTAAGTGG 3'(서열번호 25))의 특이성 및 효율을 시험할 것이다. 본 발명자들은 R34G 돌연변이된-H1703 세포주를 R34G-표적화 RNP로 형질감염시킨 후 절단 부위를 인델 형성(TIDE 분석, Desktop Genetics 웹사이트, https://tide.deskgen.com/)에 대해 분석하여 R34G-표적화 RNP의 유전자 편집 활성을 평가할 것이다. 세포는 형질감염 후 수거하고 시퀀싱하고 분석할 것이다. 본 발명자들은 또한 야생형 NRF2 서열의 인식 정도를 결정하기 위해 모 세포주에서 R34G-표적화 RNP의 특이성을 평가할 것이다. 재현성을 보장하기 위해 실험은 반복할 것이다. 이종이식 마우스 모델에서의 실험을 모방하기 위해, 세포 증식 및 세포 생존력 실험을 수행하여 CRISPR/Cas9를 사용한 R34G-표적화 후의 NRF2 녹아웃의 효과를 평가할 것이다. 이를 위해, 세포 증식 및 세포 생존력을 Ki67 염색 및 MTS 검정에 의해 측정할 것이다. R34G-표적화 후 이들 세포의 민감성을 추가로 평가하기 위한 조건으로서 시스플라틴 처리를 사용하여 실험을 반복할 것이다.
<110> Christiana Care Health Services, Inc. Kmiec, Eric Bialk, Pawel <120> Gene Knockout of Variant NRF2 for Treatment of Cancer <130> 130949-00201 <150> 62/852,123 <151> 2019-05-23 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 1 agctactctg gcccttatag tcc 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 2 ucgaugugac cgggaauauc agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 3 actaaatctg ccatacgttg tcc 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 4 ugauuuagac gguaugcaac agg 23 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gtagtggtgc cttagagctt actcatcc 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ctagcatggg cagtactcat gactaag 27 <210> 7 <211> 2446 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gattaccgag tgccggggag cccggaggag ccgccgacgc agccgccacc 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tcatttgaaa gatgaaaaag aaaaattgct caaagaaaaa ggagaaaatg acaaaagcct 1800 tcacctactg aaaaaacaac tcagcacctt atatctcgaa gttttcagca tgctacgtga 1860 tgaagatgga aaaccttatt ctcctagtga atactccctg cagcaaacaa gagatggcaa 1920 tgttttcctt gttcccaaaa gtaagaagcc agatgttaag aaaaactaga tttaggagga 1980 tttgaccttt tctgagctag tttttttgta ctattatact aaaagctcct actgtgatgt 2040 gaaatgctca tactttataa gtaattctat gcaaaatcat agccaaaact agtatagaaa 2100 ataatacgaa actttaaaaa gcattggagt gtcagtatgt tgaatcagta gtttcacttt 2160 aactgtaaac aatttcttag gacaccattt gggctagttt ctgtgtaagt gtaaatacta 2220 caaaaactta tttatactgt tcttatgtca tttgttatat tcatagattt atatgatgat 2280 atgacatctg gctaaaaaga aattattgca aaactaacca ctatgtactt ttttataaat 2340 actgtatgga caaaaaatgg cattttttat attaaattgt ttagctctgg caaaaaaaaa 2400 aaattttaag agctggtact aataaaggat tattatgact gttaaa 2446 <210> 8 <211> 605 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Met Asp Leu Glu Leu Pro Pro Pro Gly Leu Pro Ser Gln Gln Asp 1 5 10 15 Met Asp Leu Ile Asp Ile Leu Trp Arg Gln Asp Ile Asp Leu Gly Val 20 25 30 Ser Arg Glu Val Phe Asp Phe Ser Gln Arg Arg Lys Glu Tyr Glu Leu 35 40 45 Glu Lys Gln Lys Lys Leu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln Leu Gln Lys 50 55 60 Glu Gln Glu Lys Ala Phe Phe Ala Gln Leu Gln Leu Asp Glu Glu Thr 65 70 75 80 Gly Glu Phe Leu Pro Ile Gln Pro Ala Gln His Ile Gln Ser Glu Thr 85 90 95 Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Ser Gln Val Ala His Ile Pro Lys Ser Asp 100 105 110 Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Cys Met Gln Leu Leu Ala Gln Thr Phe Pro 115 120 125 Phe Val Asp Asp Asn Glu Val Ser Ser Ala Thr Phe Gln Ser Leu Val 130 135 140 Pro Asp Ile Pro Gly His Ile Glu Ser Pro Val Phe Ile Ala Thr Asn 145 150 155 160 Gln Ala Gln Ser Pro Glu Thr Ser Val Ala Gln Val Ala Pro Val Asp 165 170 175 Leu Asp Gly Met Gln Gln Asp Ile Glu Gln Val Trp Glu Glu Leu Leu 180 185 190 Ser Ile Pro Glu Leu Gln Cys Leu Asn Ile Glu Asn Asp Lys Leu Val 195 200 205 Glu Thr Thr Met Val Pro Ser Pro Glu Ala Lys Leu Thr Glu Val Asp 210 215 220 Asn Tyr His Phe Tyr Ser Ser Ile Pro Ser Met Glu Lys Glu Val Gly 225 230 235 240 Asn Cys Ser Pro His Phe Leu Asn Ala Phe Glu Asp Ser Phe Ser Ser 245 250 255 Ile Leu Ser Thr Glu Asp Pro Asn Gln Leu Thr Val Asn Ser Leu Asn 260 265 270 Ser Asp Ala Thr Val Asn Thr Asp Phe Gly Asp Glu Phe Tyr Ser Ala 275 280 285 Phe Ile Ala Glu Pro Ser Ile Ser Asn Ser Met Pro Ser Pro Ala Thr 290 295 300 Leu Ser His Ser Leu Ser Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ile Asp Val Ser 305 310 315 320 Asp Leu Ser Leu Cys Lys Ala Phe Asn Gln Asn His Pro Glu Ser Thr 325 330 335 Ala Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ser Gly Ile Ser Leu Asn Thr Ser Pro 340 345 350 Ser Val Ala Ser Pro Glu His Ser Val Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asp 355 360 365 Thr Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ser Glu Val Glu Glu Leu Asp Ser Ala 370 375 380 Pro Gly Ser Val Lys Gln Asn Gly Pro Lys Thr Pro Val His Ser Ser 385 390 395 400 Gly Asp Met Val Gln Pro Leu Ser Pro Ser Gln Gly Gln Ser Thr His 405 410 415 Val His Asp Ala Gln Cys Glu Asn Thr Pro Glu Lys Glu Leu Pro Val 420 425 430 Ser Pro Gly His Arg Lys Thr Pro Phe Thr Lys Asp Lys His Ser Ser 435 440 445 Arg Leu Glu Ala His Leu Thr Arg Asp Glu Leu Arg Ala Lys Ala Leu 450 455 460 His Ile Pro Phe Pro Val Glu Lys Ile Ile Asn Leu Pro Val Val Asp 465 470 475 480 Phe Asn Glu Met Met Ser Lys Glu Gln Phe Asn Glu Ala Gln Leu Ala 485 490 495 Leu Ile Arg Asp Ile Arg Arg Arg Gly Lys Asn Lys Val Ala Ala Gln 500 505 510 Asn Cys Arg Lys Arg Lys Leu Glu Asn Ile Val Glu Leu Glu Gln Asp 515 520 525 Leu Asp His Leu Lys Asp Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Glu Lys Gly 530 535 540 Glu Asn Asp Lys Ser Leu His Leu Leu Lys Lys Gln Leu Ser Thr Leu 545 550 555 560 Tyr Leu Glu Val Phe Ser Met Leu Arg Asp Glu Asp Gly Lys Pro Tyr 565 570 575 Ser Pro Ser Glu Tyr Ser Leu Gln Gln Thr Arg Asp Gly Asn Val Phe 580 585 590 Leu Val Pro Lys Ser Lys Lys Pro Asp Val Lys Lys Asn 595 600 605 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 9 tcgatgtgac cgggaatatc agg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 10 tgatttagac ggtatgcaac agg 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 11 aagtacaaag catctgattt ggg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 12 agcatctgat ttgggaatgt ggg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 13 tggatttgat tgacatactt tgg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 14 gcttcttact tttgggaaca agg 23 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 15 tttgattgac atactttgga ggcaa 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 16 ttttccttgt tcccaaaagt aagaa 25 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition sequence <400> 17 aaactaactg tatgaaacct ccc 23 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 18 uuugauugac auacuuugga ggg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 19 gaatgaggtt ctagatatag acc 23 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 20 cuuacuccaa gaucuauauc ugg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition sequence <400> 21 tatgaaacct ccgttctata tcc 23 <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 22 auacuuugga ggcaagauau agg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 23 tccgttctat atctagaacc tcc 23 <210> 24 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 24 aggcaagaua uagaucuugg agg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 25 ctatatctag aacctcattc acc 23 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 26 gauauagauc uuggaguaag ugg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 27 actgacttca gtttatgaag acc 23 <210> 28 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 28 ugacugaagu caaauacuuc ugg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 29 aagtagatca acattgactc gcc 23 <210> 30 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 30 uucaucuagu uguaacugag cgg 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 31 taagtggaca gagaagtaga tcc 23 <210> 32 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 32 auucaccugu cucuucaucu agg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 33 gagtcaatgt tgatctactt ccc 23 <210> 34 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 34 cucaguuaca acuagaugaa ggg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 35 acttaaccct ctttaagtgg acc 23 <210> 36 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 36 ugaauuggga gaaauucacc ugg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 37 gttgatctac ttctctgtcc acc 23 <210> 38 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 38 caacuagaug aagagacagg ugg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition element <400> 39 tattatcgag gagggtttga acc 23 <210> 40 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 40 auaauagcuc cucccaaacu ugg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 tttgattgac atactttgga ggg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 cttactccaa gatctatatc tgg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 atactttgga ggcaagatat agg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 aggcaagata tagatcttgg agg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gatatagatc ttggagtaag tgg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 tgactgaagt caaatacttc tgg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 ttcatctagt tgtaactgag cgg 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 attcacctgt ctcttcatct agg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ctcagttaca actagatgaa ggg 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 tgaattggga gaaattcacc tgg 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 caactagatg aagagacagg tgg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 ataatagctc ctcccaaact tgg 23 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition sequence <400> 53 aaaaagcgag taatgttgat cc 22 <210> 54 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 54 uuuuucgcuc aguuacaacu agg 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition sequence <400> 55 gttgatctac ttctctgtcc acc 23 <210> 56 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 56 caacuagaug aagagacagg ugg 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 tttttcgctc agttacaact agg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 caactagatg aagagacagg tgg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 59 caagatatag atcttggagt aag 23 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 60 aagatataga tcttggagta ag 22 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 61 gatatagatc ttggagtaag 20 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 62 tatagatctt ggagtaag 18 <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 63 atagatcttg gagtaag 17 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 64 tggaggcaag atatagatct tgg 23 <210> 65 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA template <400> 65 ttaaaaaaca tgagctctct ccttcctttt tttgtcttaa acataggaca tggatttgat 60 tgacatactt tggaggcaag atatagatct tggagtaagt ggagaagtat ttgacttcag 120 tcagcgacgg aaagagtatg agctggaaaa acagaaaaaa cttgaaaagg aaagacaaga 180 acaactccaa aaggagcaag 200 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 66 tcgatgtgac cgggaatatc agg 23 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA <400> 67 tgatttagac ggtatgcaac agg 23

Claims (100)

  1. 암 세포에서 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 암 세포 내에 (a) 변이체 NRF2 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열 및 (b) 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함함으로써, 상기 하나 이상의 gRNA가 상기 변이체 NRF2 유전자에 하이브리드화하고 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 변이체 NRF2 유전자를 절단하게 되어, 상기 암 세포에서의 NRF2 발현 또는 활성이, 상기 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열과 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열이 도입되지 않은 암 세포에 비해 감소되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA가 상기 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 서열에 상보적인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA가 전사-활성화된 (trans-activated) 소형 RNA(tracrRNA) 및 CRISPR RNA(crRNA)를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA가 하나 이상의 단일 가이드 RNA인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 NRF2 유전자의 하나 이상의 대립유전자(들)의 발현이 암 세포에서 감소되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRF2 활성이 암 세포에서 감소되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRF2 발현 또는 활성이 암 세포에서 완전히 제거되지 않는, 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRF2 발현 또는 활성이 암 세포에서 완전히 제거되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폐암 세포가 비소세포 폐암 세포(NSCLC)인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포를 함유하는 대상체의 비-암성 세포에서 야생형 NRF2의 발현 또는 활성이 (a)의 하나 이상의 DNA 서열 및 (b)의 핵산 서열의 도입에 의해 영향을 받지 않는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포에서 변이체 NRF2 유전자에 의해 암호화되는 변이체 NRF2 폴리펩타이드가
    (a) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (b) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (c) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (d) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (e) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D;
    (f) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D;
    (g) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; 또는
    (h) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D
    중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 NRF2 유전자가
    (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는
    (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 돌연변이된 변이체 NRF2 유전자를 포함하는 암 세포.
  17. 암 세포에서 변이체 NRF2 발현 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 암 세포 내에 (a) 변이체 NRF2 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열에 상보적인 하나 이상의 gRNA 및 (b) CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함함으로써, 상기 하나 이상의 gRNA가 변이체 NRF2 유전자에 하이브리드화하고 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 변이체 NRF2 유전자를 절단하게 되어, 상기 암 세포에서의 변이체 NRF2 발현 또는 활성이, 상기 하나 이상의 gRNA와 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 도입되지 않은 암 세포에 비해 감소되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA가 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 서열에 상보적인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA가 tracrRNA 및 crRNA를 포함하는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA가 하나 이상의 단일 가이드 RNA인, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 NRF2 유전자의 하나 이상의 대립유전자(들)의 발현이 암 세포에서 감소되는, 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRF2 활성이 암 세포에서 감소되는, 방법.
  25. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRF2 발현 또는 활성이 암 세포에서 완전히 제거되지 않는, 방법.
  26. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRF2 발현 또는 활성이 암 세포에서 완전히 제거되는, 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 폐암 세포인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 폐암 세포가 NSCLC인, 방법.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포를 함유하는 대상체의 비-암성 세포에서 야생형 NRF2의 발현 또는 활성이 (a)의 하나 이상의 DNA 서열 및 (b)의 핵산 서열의 도입에 의해 영향을 받지 않는, 방법.
  30. 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포에서 변이체 NRF2 유전자에 의해 암호화되는 변이체 NRF2 폴리펩타이드가
    (a) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (b) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (c) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (d) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (e) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D;
    (f) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D;
    (g) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; 또는
    (h) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D
    중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 방법.
  31. 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 NRF2 유전자가
    (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는
    (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, 방법.
  32. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 돌연변이된 변이체 NRF2 유전자를 포함하는 암 세포.
  33. DNA-결합 도메인 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 단백질-결합 도메인을 포함하는 gRNA로서, 상기 DNA-결합 도메인이 변이체 NRF2 유전자 내의 표적 서열에 상보적인, gRNA.
  34. 제33항에 있어서, 상기 변이체 NRF2 유전자가
    (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는
    (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, gRNA.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 gRNA가 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 서열에 상보적인, gRNA.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인이 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 53, 서열번호 55 또는 이들의 생물학적 활성 단편의 핵산 서열을 포함하는, gRNA.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA가 tracrRNA 및 crRNA를 포함하는, gRNA.
  38. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA가 단일 가이드 RNA인, gRNA.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항의 gRNA를 포함하는 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, 약제학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인, 약제학적 조성물.
  43. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항의 gRNA 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, RNP 복합체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인, RNP 복합체.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 RNP 복합체를 포함하는 약제학적 조성물.
  47. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항의 gRNA 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 DNA 서열.
  48. 제47항에 있어서, 상기 생물학적 활성 단편이 tracrRNA 또는 crRNA인, DNA 서열.
  49. 제47항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 54 또는 서열번호 56의 핵산 서열을 포함하는, DNA 서열.
  50. 제48항에 있어서, 상기 생물학적 활성 단편이 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 54 또는 서열번호 56의 핵산 서열을 포함하는 crRNA인, DNA 서열.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
  52. 제51항에 있어서, DNA 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 벡터.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  54. 제53항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, 벡터.
  55. 제54항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인 벡터.
  56. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항의 DNA 서열 또는 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  57. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항의 DNA 서열을 포함하고, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, 약제학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인, 약제학적 조성물.
  60. 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 제39항 내지 제42항, 제46항 및 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 대상체의 비-암성 세포에서 야생형 NRF2의 발현 또는 활성이 약제학적 조성물의 투여에 의해 영향을 받지 않는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 암이 하나 이상의 화학치료제에 내성이 있는, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 폐암, 흑색종, 식도 편평세포 암(ESC), 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 및 유방암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 폐암이 NSCLC인, 방법.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 화학치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 하나 이상의 화학치료제가 시스플라틴, 비노렐빈, 카보플라틴 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  67. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이, 해당 약제학적 조성물로 치료되지 않은 암 세포에 비해 해당 암 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는, 방법.
  68. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이, 해당 약제학적 조성물로 치료되지 않은 종양에 비해 해당 종양 성장을 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는, 방법.
  69. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이, 적어도 하나의 화학치료제로 치료되지만 해당 약제학적 조성물로 치료되지 않은 암 세포에 비해 해당 암 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는, 방법. .
  70. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 적어도 하나의 화학치료제로 치료되지만 해당 약제학적 조성물로 치료되지 않는 종양에 비해 해당 종양의 성장을 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는, 방법.
  71. 제60항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  72. 의약으로서 사용을 위한 CRISPR 시스템으로서, (a) 변이체 NRF2 유전자 내의 표적 서열에 상보적인 DNA-결합 도메인, 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 단백질-결합 도메인을 포함하는 gRNA, 및 (b) CRISPR 연관 엔도뉴클레아제를 포함하는, CRISPR 시스템.
  73. 제72항에 있어서, 상기 gRNA가 변이체 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 서열에 상보적인, CRISPR 시스템.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 gRNA가 tracrRNA 및 crRNA를 포함하는, CRISPR 시스템.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA가 단일 gRNA인, CRISPR 시스템.
  76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한, CRISPR 시스템.
  77. 제76항에 있어서, 상기 암이 하나 이상의 화학치료제에 내성이 있는, CRISPR 시스템.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 암이 폐암, 흑색종, ESC, HNSCC 및 유방암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, CRISPR 시스템.
  79. 제78항에 있어서, 상기 폐암이 NSCLC인, CRISPR 시스템.
  80. 제79항에 있어서, 상기 NSCLC가 선암종, 편평세포 암종 또는 대세포 암종인, CRISPR 시스템.
  81. 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 화학치료제를 추가로 포함하는, CRISPR 시스템.
  82. 제81항에 있어서, 상기 하나 이상의 화학치료제가 시스플라틴, 비노렐빈, 카보플라틴 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, CRISPR 시스템.
  83. 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, CRISPR 시스템.
  84. 제83항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인, CRISPR 시스템.
  85. 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포에서 변이체 NRF2 유전자에 의해 암호화되는 변이체 NRF2 폴리펩타이드가
    (a) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (b) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (c) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (d) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82W 또는 E185D;
    (e) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D;
    (f) 서열번호 8에 대하여 Q26E, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D;
    (g) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34G, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D; 또는
    (h) 서열번호 8에 대하여 Q26P, D29G, V32G, R34P, F71S, Q75H, D77G, E79G, T80P, E82G 또는 E185D
    중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, CRISPR 시스템.
  86. 제72항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 NRF2 유전자가
    (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57;
    (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는
    (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, CRISPR 시스템.
  87. 의약으로서 사용을 위한 RNP 복합체로서, (a) 변이체 NRF2 유전자 내의 표적 서열에 상보적인 DNA-결합 도메인, 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 단백질-결합 도메인을 포함하는 gRNA, 및 (b) CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 포함하는, RNP 복합체.
  88. 제87항에 있어서, 상기 gRNA가 NRF2 유전자의 엑손 2 내의 표적 서열에 상보적인, RNP 복합체.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 상기 gRNA가 tracrRNA 및 crRNA를 포함하는, RNP 복합체.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA가 단일 gRNA인, RNP 복합체.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 NRF2 유전자가
    (a) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (b) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (d) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 51, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (e) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (f) 서열번호 7의 위치 205 내지 227을 치환하는 서열번호 41, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (g) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 위치 230 내지 252를 치환하는 서열번호 45, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열; 또는
    (h) 서열번호 7의 역상보체의 위치 249 내지 227을 치환하는 서열번호 42, 서열번호 7의 위치 215 내지 237을 치환하는 서열번호 43, 서열번호 7의 위치 224 내지 246을 치환하는 서열번호 44, 서열번호 7의 역상보체의 위치 273 내지 251을 치환하는 서열번호 46, 서열번호 7의 역상보체의 위치 385 내지 363을 치환하는 서열번호 47, 서열번호 7의 역상보체의 위치 398 내지 376을 치환하는 서열번호 48, 서열번호 7의 위치 366 내지 388을 치환하는 서열번호 49, 서열번호 7의 역상보체의 위치 411 내지 389를 치환하는 서열번호 50, 서열번호 7의 위치 374 내지 396을 치환하는 서열번호 58, 서열번호 7의 역상보체의 위치 728 내지 706을 치환하는 서열번호 52, 또는 서열번호 7의 위치 360 내지 381을 치환하는 서열번호 57로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, RNP 복합체.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한, RNP 복합체.
  93. 제92항에 있어서, 상기 암이 하나 이상의 화학치료제에 내성이 있는, RNP 복합체.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 암이 폐암, 흑색종, ESC, HNSCC 및 유방암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, RNP 복합체.
  95. 제94항에 있어서, 상기 폐암이 NSCLC인, RNP 복합체.
  96. 제95항에 있어서, 상기 NSCLC가 선암종, 편평세포 암종 또는 대세포 암종인, RNP 복합체.
  97. 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 화학치료제를 추가로 포함하는, RNP 복합체.
  98. 제97항에 있어서, 상기 하나 이상의 화학치료제가 시스플라틴, 비노렐빈, 카보플라틴 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, RNP 복합체.
  99. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인, RNP 복합체.
  100. 제99항에 있어서, 상기 클래스 2 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제가 Cas9 또는 Cas12a인, RNP 복합체.
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