JP2023516225A - Ｋｒａｓ突然変異を有するがんを処置するための組成物およびその使用 - Google Patents

Ｋｒａｓ突然変異を有するがんを処置するための組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本出願は、突然変異したＫＲＡＳを特異的に標的とするために有用なガイドＲＮＡおよびゲノム編集複合体またはナノ粒子を提供する。例示的なゲノム編集複合体またはナノ粒子は、細胞透過性ペプチド、および必要に応じてＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列は、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、その内容全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれる、２０２０年４月２４日出願の仏国特許出願番号ＦＲ２００４１２６号の優先権を主張するものである。
出願の技術分野
本出願は、突然変異したＫＲＡＳを特異的に標的とするために有用なガイドＲＮＡおよびゲノム編集複合体またはナノ粒子に関する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７３７３７２０００１２４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年４月２３日、サイズ：８７ＫＢ）。
出願の背景
ＲＡＳサブファミリーのメンバーであるＫＲＡＳは、非常に致死性の高い肺がん、結腸がん、および膵臓がんを含むがんにおいて最も突然変異頻度の高い発癌遺伝子である（Cox et al. 2014 Nat Rev Drug Discov 13, 828）。ＫＲＡＳにおける活性化突然変異は、がんの開始、伝播、および維持において重大な役割を果たし、重要な治療標的となる（Cox et al. 2014）。通常のがんに関連する突然変異は、ＫＲＡＳのグリシンをコードするコドン－１２において生じる。具体的には、単一ヌクレオチドミスセンス置換ｃ．３５ Ｇ＞Ｔおよびｃ．３５ Ｇ＞Ａによって、１２位のグリシンが、それぞれ、バリン（Ｇ１２Ｖ）およびアスパラギン酸（Ｇ１２Ｄ）と置き換えられる。Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ｄの置換は、膵臓腺癌（それぞれ、３０％および５１％）および結腸直腸腺癌（それぞれ、２７％および４５％）において最も一般的に観察される突然変異の１つであり、予後不良に関連している（Jones, S. et al. 2008, Science 321, 1801；Wood, L. D. et al. 2007, Science 318, 1108）。
今日、ＫＲＡＳ突然変異を標的とする強力な戦略に対して差し迫った必要性がある。ＲＡＳ依存性がんを標的とするために、いくつかの試みがなされてきたが、ＲＡＳタンパク質の直接的阻害は成功したことがなく、アプローチのほとんどは、突然変異したＲＡＳの下流のエフェクターに影響を及ぼすものであった。ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）特異的阻害剤（Patricelli et al. 2016 Cancer Discov 6: 316）および非突然変異選択的ＲＡＳ結合ドメイン阻害剤（Athuluri-Divakar et al.2016. Cell 165: 643）の近年の開発により、突然変異したＲＡＳ発癌遺伝子を直接的に標的とする可能性が示された。突然変異したＲＡＳ発癌遺伝子を直接的に標的とすることは、異常なＲＡＳタンパク質とそれらの下流のエフェクター経路の両方の機能を崩壊させる可能性を有する。しかし、この化学物質を生成することはその複雑な構造によって困難であり、突然変異特異的阻害は、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）よりも高い頻度で生じるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）またはＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）に対して小分子を使用して達成されなかった。突然変異体ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを選択的に阻害する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用するＫＲＡＳサイレンシングも報告されているが、ＫＲＡＳ突然変異体の継続的発現を考慮すると、完全なノックダウンを維持するために（Brummelkamp et al. 2002 Cancer Cell 2: 243）、標的ＲＮＡ抑制には永続的送達が必要とされる（Zorde Khvalevsky et al. 2013 Proc Natl Acad Sci 110: 20723）。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Cox et al. 2014 Nat Rev Drug Discov 13, 828 Jones, S. et al. 2008, Science 321, 1801 Wood, L. D. et al. 2007, Science 318, 1108 Patricelli et al. 2016 Cancer Discov 6: 316 Athuluri-Divakar et al.2016. Cell 165: 643 Brummelkamp et al. 2002 Cancer Cell 2: 243 Zorde Khvalevsky et al. 2013 Proc Natl Acad Sci 110: 20723
出願の簡単な概要
本出願は、一態様において、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含む、天然に存在しないポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列は、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的である。
上記の天然に存在しないポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、化学的に改変されている。
上記の天然に存在しないポリヌクレオチドのうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２００ヌクレオチド以下の長さを有する。
本出願は、別の態様では、ａ）第１の細胞透過性ペプチド、およびｂ）突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体であって、ガイドＲＮＡが、上記のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む、ゲノム編集複合体を提供する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、そのバリアント、その断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａである。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖、リンカー部分、および標的化部分からなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、２～７個のエチレングリコール単位からなる。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、Ｎ末端から、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した、アセチル基、標的化部分およびリンカー部分を含む。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＣ末端に共有結合により連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝（ｒａｍｉｆｉｅｄ）Ｃ１～Ｃ６アルキル、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖、リンカー部分および標的化部分からなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、そのＣ末端に共有結合により連結したシステアミド基を含む。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、炭水化物部分をさらに含む。一部の実施形態では、炭水化物部分は、ＧａｌＮＡｃである。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、レトロインベルソペプチドである。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５、２５９～２６０、および２６７～２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約２：１から約５０：１の間である。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約２：１から約５０：１の間である。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、異なるガイド配列を含む１つまたは複数の追加的なガイドＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つは、ある単一のＫＲＡＳ突然変異を標的とする。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つは、２つまたはそれよりも多くの異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つは、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、および／またはＧ１２Ｃを標的とする。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ゲノム編集複合体の平均直径は、約１０ｎｍから約３００ｎｍの間である。
本出願は、別の態様では、上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つを含むコアを含むナノ粒子を提供する。一部の実施形態では、コアは、上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つなどの１つまたは複数の追加的なゲノム編集複合体をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的なゲノム編集複合体は、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする少なくとも１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、コアは、第２の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
上記のナノ粒子のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ナノ粒子内の第２の細胞透過性ペプチドは、連結部分によって標的化部分に共有結合により連結している。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、コアは、末梢細胞透過性ペプチドを含む殻でコーティングされている。一部の実施形態では、末梢細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、末梢細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、殻内の末梢細胞透過性ペプチドは、連結部分によって標的化部分に共有結合により連結されている。
上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つによる一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径は、約１０ｎｍから約４００ｎｍの間である。
本出願は、別の態様では、上記のガイドＲＮＡのうちのいずれか１つ、ゲノム編集複合体のうちのいずれか１つ、またはナノ粒子のうちのいずれか１つ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、２つまたはそれよりも多くのナノ粒子を含み、２つまたはそれよりも多くのナノ粒子は、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする異なるガイドＲＮＡを含む。
本出願は、別の態様では、上記のゲノム編集複合体のうちのいずれか１つを調製する方法であって、第１の細胞透過性ペプチドをガイドＲＮＡと組み合わせ、それにより、ゲノム編集複合体を形成するステップを含む方法を提供する。
本出願は、別の態様では、細胞における突然変異したＫＲＡＳを改変する方法であって、細胞に上記のガイドＲＮＡのうちのいずれか１つ、ゲノム編集複合体のうちのいずれか１つ、またはナノ粒子のうちのいずれか１つを接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、別の態様では、個体におけるがんを処置する方法であって、個体に上記の医薬組成物のうちのいずれか１つを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、第２の薬剤を投与するステップをさらに含む。
図１Ａ～１Ｂは、ＳＷ４０３、ＳＷ４８０、およびＨＴ－２９細胞に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ突然変異体Ｇ１２Ｖ ＫＲＡＳを標的とするｇＲＮＡの評価を示す。がん細胞を、異なるＡＤＧＮ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（０．１５μｇ／０．２μｇ）複合体で処置した。図１Ａは、Ｔ７Ｅ１法によってトランスフェクションの７２時間後に評価した、異なる細胞株中の内因性標的配列におけるインデル頻度を示す。図１Ｂは、ＧｌｏｗＭａｘ上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した細胞増殖を示す。
図２Ａ～２Ｂは、Ｐａｎｃ１、ＬＳ５１３、ＰＫ－４５Ｈ、ＰＫ－１、ＨＳ－６８およびＨＴ－２９細胞に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ａ突然変異体Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを標的とするｇＲＮＡの評価を示す。がん細胞を、異なるＡＤＧＮ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（０．１５μｇ／０．２μｇ）複合体で処置した。図２Ａは、Ｔ７Ｅ１法によってトランスフェクションの７２時間後に評価した、異なる細胞株中の内因性標的配列におけるインデル頻度を示す。図２Ｂは、ＧｌｏｗＭａｘ上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した細胞増殖を示す。
図３Ａ～３Ｂは、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ－２３、Ｈ－３５８、ＰＡＮＣ１およびＨＴ－２９細胞に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ａ突然変異体Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを標的とするｇＲＮＡの評価を示す。がん細胞を、異なるＡＤＧＮ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（０．１５μｇ／０．２μｇ）複合体で処置した。図３Ａは、Ｔ７Ｅ１法によってトランスフェクションの７２時間後に評価した、異なる細胞株中の内因性標的配列におけるインデル頻度を示す。図３Ｂは、ＧｌｏｗＭａｘ上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した細胞増殖を示す。
図４Ａ～４Ｂは、異なる細胞株に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ａ、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ、ＫＲＡＳ ３４Ｇ＞Ｔ突然変異体を標的とするｇＲＮＡの評価を示す。ＳＷ４０３、ＳＷ４８０、ＰＡＮＣ１、ＰＫ－４５Ｈ、ＰＫ－１、ＭＩＡ－ＰＡＣＡ、ＮＩＨ－Ｈ２３、Ｈ３５８、ＨＴ－２９、ＰＣ－９、ＨＳ－６８およびＬＳ５１３細胞を、ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（０．４μｇ）で処置した。図４Ａは、Ｔ７Ｅ１法によってトランスフェクションの７２時間後に評価した、異なる細胞株中の内因性標的配列におけるインデル頻度を示す。図４Ｂは、ＧｌｏｗＭａｘ上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した細胞増殖を示す。
図５Ａ～５Ｂは、ＫＲＡＳシグナル伝達経路に対する、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖ突然変異体を標的とするリードｇＲＮＡの影響を示す。図５Ａは、ＰＡＮＣ－１細胞に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ａ突然変異体Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを標的とするｇＲＮＡの評価を示す。図５Ｂは、ＳＷ４０３細胞に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ突然変異体Ｇ１２Ｖ ＫＲＡＳを標的とするｇＲＮＡの評価を示す。ウエスタンブロット分析（上）および定量化（下）。
図６は、異なるＡＤＧＮ－ペプチドと会合させたＣＡＳｍＲＮＡ／ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ静脈内投与後の、異なる組織および腫瘍におけるＥＬＩＳＡによるＣａｓ９タンパク質発現の定量化を示す。
図７Ａ～７Ｂは、ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙ３（図７Ａ）およびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７（図７Ｂ）ペプチドと会合させたＣＡＳ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ ＩＶ投与後の、異なる組織および腫瘍におけるＥＬＩＳＡによるＣａｓ９タンパク質発現の定量化を示す。
図８Ａ～８Ｂは、ＡＤＧＮ－Ｈｙ－３／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡおよびＡＤＧＮ－Ｈｙ７／ｍＲＮＡＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体で静脈内処置したマウスにおけるＣａｓ９－ｍＲＮＡの血漿濃度を示す。Ｐａｎｃ１腫瘍を有するマウスを、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇのＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡナノ粒子の単回注射で処置した。血漿中のＣａｓ９ ｍＲＮＡレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎ ｂＤＮＡ法によって分析した。グラフは平均値を示す（ｎ＝４）。ピコグラムでの計算された量を、溶解物中の血漿の量およびプレートに適用された溶解物の量に対して正規化した。
図９Ａ～９Ｂは、膵臓腫瘍モデルにおけるＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ａ５のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す。３週間の期間を処置の開始前に経過させて、ＰＡＮＣ１腫瘍を発生させた。４つの群のマウスを同定した：未処置対照マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ６ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ５）。動物（群当たり動物６匹）に、０日目および７日目に静脈内（尾部静脈）注射した。腫瘍サイズを、生物発光イメージングによって１週間に１回評価した。図９Ａおよび９Ｂは、０日目、１５日目および３０日目の異なる群についての生物発光イメージング（図９Ｂ）および総発光の定量化（図９Ａ）を示す。
図１０は、結腸直腸腫瘍モデルにおけるＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ｔ３のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す。１０日間の期間を処置の開始前に経過させて、ＳＷ４０３腫瘍を発生させた。４つの群のマウスを同定した：未処置対照マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ５）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ７）およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ６ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ６）。動物（群当たり動物６匹）に、０日目および７日目に静脈内（尾部静脈）注射した。腫瘍サイズを、キャリパーを使用して、１週間に１回評価した。
図１１Ａ～１１Ｂは、膵臓腫瘍マウスモデルにおけるＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ａ５およびアブラキサンの共処置のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す。３週間の期間を処置の開始前に経過させて、ＰＡＮＣ１腫瘍を発生させた。７つの群のマウスを同定した：未処置対照マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／対照ｇＲＮＡ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）、アブラキサン（５０μｇ）およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ５）、アブラキサン（５０μｇ）およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ６）、ならびにアブラキサン（５０μｇ）のみ（Ｇ７）。Ｇ２～Ｇ６について、動物（群当たり動物６匹）に、ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを、０日目および７日目に静脈内（尾部静脈）注射した。Ｇ５～Ｇ７について、動物に、アブラキサン（５０μｇ）を１週間に１回静脈内（尾部静脈）注射した。腫瘍サイズを、生物発光イメージングによって１週間に１回評価した。図１１Ａおよび１１Ｂは、０日目、１５日目および３０日目の異なる群についての生物発光イメージングおよび総発光の定量化を示す。
図１２は、結腸直腸腫瘍マウスモデルにおけるＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ｔ３およびカペシタビンの共処置のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す。７つの群のマウスを同定した：未処置対照マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／対照ｇＲＮＡ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）、カペシタビン（２００μｇ）（Ｇ５）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ３ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ６）、ならびにカペシタビン（２００μｇ）およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ３ ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ７）。動物（群当たり動物６匹）に、ＳＷ４０３腫瘍を前もって接種し、０日目および７日目のＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体（Ｇ２～Ｇ４、Ｇ６、およびＧ７）ならびに１週間に１回のカペシタビン（２００μｇ）（Ｇ５およびＧ７）のＩＶ尾部静脈注射によって処置した。腫瘍サイズを、キャリパーを使用して、１週間に１回評価した。
図１３Ａ～１３Ｂは、処置後の異なる組織および腫瘍における候補ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを示す。動物（群当たり動物６匹）に、ＰＡＮＣ１腫瘍細胞（図１３Ａ）またはＳＷ４０３腫瘍細胞（図１３Ｂ）を接種し、次いで、ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、０日目および７日目に静脈内（尾部静脈）注射した。
図１４Ａ～１４Ｂは、ＰＡＮＣ１およびＳＷ４０３腫瘍に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞ＡおよびＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ突然変異体を標的とするｇＲＮＡに関連する遺伝子編集のレベルを示す。処置の５０日後に、ＰＡＮＣ１およびＳＷ４０３腫瘍中の内因性標的配列におけるインデル頻度を、ディープシーケンシングによって決定し、未処置のマウスと比較した。
図１５Ａ～１５Ｂは、ＰＡＮＣ１（図１５Ａ）およびＳＷ４０３腫瘍（図１５Ｂ）中のＫＲＡＳシグナル伝達経路に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞ＡおよびＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ突然変異体を標的とするＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ処置の影響を示す。
図１６Ａ～１６Ｂは、ＰＡＮＣ１腫瘍細胞（図１６Ａ）またはＳＷ４０３腫瘍細胞（図１６Ｂ）を接種した動物における動物体重に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞ＡおよびＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ突然変異体を標的とするＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ処置の影響を示す。
図１７Ａ～１７Ｄは、ＰＡＮＣ１腫瘍細胞を接種した動物における肝臓および腎マーカーに対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ａ突然変異体を標的とするＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ処置の影響を示す。４つの群のマウスを同定した：未処置対照マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ６ １．０ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）。動物（群当たり動物６匹）に、ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を、０日目および７日目に静脈内（尾部静脈）注射した。血液試料を、Ｄ７、Ｄ１５およびＤ３０に、ヘパリン処置した管中に収集し、血中尿素窒素（ＢＵＮ）（図１７Ｄ）、クレアチニン（図１７Ｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（図１７Ａ）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（図１７Ｂ）の血漿濃度について分析した。
図１８は、ＫＲＡＳ野生型またはＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、もしくはＧ１２Ｃ突然変異を有するＫＲＡＳを標的とするｓｇＲＮＡの設計のための種々の標的配列を示す。
図１９Ａ～１９Ｂは、ＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定したＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ複合体の粒子サイズと凝集のレベルとを示す。ＡＤＧＮ－Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ粒子を、５％グルコースまたはＤＭＥＭのいずれか中に、モル比２０／１／１で調製した。データを、強度によるサイズ分布（図１９Ａ）および体積によるサイズ分布（図１９Ｂ）で報告する。
図２０は、異なる細胞株に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ突然変異体を標的とするＡＤＧＮ－１２１ ｇＲＮＡの評価を示す。ＳＷ４０３、ＳＷ４８０、ＰＡＮＣ１、ＬＳ－５１３、ＨＴ－２９、Ｈ－４４１、およびＨ－２４４４細胞を、１日目に、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ－１２１（ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ）複合体（０．１ｎＭ～１０μＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図２１は、異なる細胞株に対する、ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ａ突然変異体を標的とするＡＤＧＮ－１２３ ｇＲＮＡの評価を示す。ＰＡＮＣ１、ＰＫ－４５Ｈ、ＰＫ－１、ＡＳＰＣ－１、ＭＩＡ－ＰＡＣＡ、ＬＳ－５１３、Ｈ３５８、ＨＴ－２９、およびＨ－４４１細胞を、１日目に、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ－１２３（ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ）複合体（０．１ｎＭ～１０μＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図２２は、異なる細胞株に対する、ＫＲＡＳ ３４Ａ＞Ｔ突然変異体を標的とするＡＤＧＮ－１２２ ｇＲＮＡの評価を示す。ＳＷ４０３、ＰＡＮＣ１、Ｈ３５８、ＣＡＬＵ－１、Ｈ－２１２２、Ｈ－４４１、ＭＩＡ－ＰＡＣＡ、およびＨ－１２９９細胞を、１日目に、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ－１２２（ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ）複合体（０．１ｎＭ～１０μＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図２３は、異なる細胞株に対する、ＫＲＡＳ ３４Ａ＞Ｔ突然変異体を標的とするＡＭＧ－５１０およびＡＤＧＮ－１２２の評価を示す。Ｈ３５８、ＣＡＬＵ－１、ＭＩＡ－ＰＡＣＡおよびＨ－２１２２細胞を、１日目に、ＡＤＧＮ－１２２（ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ）複合体およびＡＭＧ－５１０（０．１ｎＭ～１０００ｎＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図２４は、突然変異体ＫＲＡＳ遺伝子およびまたは突然変異体ｐ５３遺伝子を有するがん細胞株を列挙する表を示す。
図２５は、がん細胞株におけるＡＤＧＮ－１２１のＩＣ５０およびＣＣ５０パラメータを示す。
図２６は、がん細胞株におけるＡＤＧＮ－１２３のＩＣ５０およびＣＣ５０パラメータを示す。
図２７は、がん細胞株におけるＡＤＧＮ－１２２のＩＣ５０およびＣＣ５０パラメータを示す。
図２８は、がん細胞株におけるＡＤＧＮ－１２２およびＡＭＧ－５１０のＩＣ５０パラメータを示す。
出願の詳細な説明
本出願は、一態様では、特定のＫＲＡＳ突然変異配列（Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、またはＧ１２Ｃ突然変異を有するＫＲＡＳなど）を標的とする新規ガイドＲＮＡを提供する。実施例において実証されるように、例示的なガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ野生型配列に影響を及ぼさずに、特定の突然変異（例えば、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、またはＧ１２Ｃ）を有するＫＲＡＳ遺伝子を特異的に標的とすることができた。
本出願は、別の態様では、本明細書に記載のａ）第１の細胞透過性ペプチド、およびｂ）ガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体を提供する。実施例において実証されるように、本明細書に記載されている細胞透過性ペプチドおよびガイドＲＮＡを含む例示的なゲノム編集複合体の投与によって、いずれの重大な毒性、オフターゲット効果または他のＫＲＡＳ突然変異の出現も誘導することなく、ＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を有する個体を処置するのに成功した。一部の場合には、例示的なゲノム編集複合体の１回または２回の投与によって完全な腫瘍退縮がもたらされた。
ゲノム編集複合体を含むナノ粒子、ガイドＲＮＡ、ゲノム編集複合体またはナノ粒子を調製および使用する方法、ならびに本方法のための有用なキットおよび製造品も本発明で提供される。
Ｉ．定義
「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ編集によって細胞において標的ＤＮＡを切断するか、挿入するか、または連結させるポリヌクレオチドを指す。ガイドＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。ガイドＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列に対して特異的なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であってもよい。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと相互作用するトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含んでもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ループ構造を形成するポリヌクレオチドを含んでもよい。ガイドＲＮＡは、１０ヌクレオチド～３０ヌクレオチドの長さを有してもよい。ガイドＲＮＡは、例えば、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、または３０ヌクレオチドの長さを有してもよい。
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの組合せを含んでもよい。ガイドＲＮＡは、化学的に改変されていてもよい。
ガイドＲＮＡは、分子はさみ（プログラム可能なヌクレアーゼ）の構成成分であってもよい。分子はさみは、ゲノム上の特異的部位を認識および切断することが可能な全ての種類のヌクレアーゼを指す。分子はさみは、例えば、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型の工学的に作製されたヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＲＧＥＮ）、Ｃｐｆ１、およびＡｇｏホモログ（ＤＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ）であってもよい。ＲＧＥＮは、標的ＤＮＡおよび構成成分としてのＧａｓタンパク質に対して特異的なガイドＲＮＡを含むヌクレアーゼを指す。ポリヌクレオチドは、例えば、ＲＧＥＮの構成成分であってもよい。
本出願の態様では、「単一のガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という用語は、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」という用語は、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指す。「ｔｒａｃｒメイト配列」という用語は、「ダイレクトリピート」という用語と互換的に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当技術分野で当業者によって理解される用語であり、生物体、株、遺伝子または特徴の、突然変異体またはバリアント形態とは区別される、天然に存在する典型的な形態を意味する。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、天然に存在するものから逸脱するパターンを有する質を示すものと解釈されるべきである。
「天然に存在しない」、「合成の」、または「工学的に作製された」という用語は、互換的に使用され、人間の手の関与を示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、その核酸分子またはポリペプチドが、自然界で天然に付随し、自然界で見いだされる少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み入れることができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有する、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予め凝縮させたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、または誘導体およびこれらの群の組合せの形態であり得る。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびこれらの組合せの形態であり得る。核酸は、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、およびジップ核酸（ＺＮＡ）を含めた、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または連結を含有する核酸を含み、これらは、合成核酸、天然に存在する核酸、および天然に存在しない核酸であり得、また、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。特に限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列ならびに明確に示されている配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮退コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., j . Biol. Chern., 260:2605-2608 (1985)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を通じて連結している。「塩基」は、プリンおよびピリミジンを含み、これらは、天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体をさらに含み、これらとしては、これだけに限定されないが、例えば、これだけに限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラーゼ、およびハロゲン化アルキルなどの新しい反応性基が置かれる改変が挙げられる。「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、一般に、必ずではないが一般に約２００ヌクレオチド未満の長さの、短い、一般に合成されたものであるポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドに同等かつ完全に適用可能である。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または「ＲＧＥＮ」）の活性に関与するタンパク質、転写物および他の分子を集合的に指し、Ｃａｓ遺伝子産物、Ｃａｓ遺伝子配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡプロセシングによる部分的ダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する他の配列、転写物、および産物を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の分子は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の分子は、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物体、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する分子（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも称される）によって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションをもたらし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在するのであれば、完全な相補性は必ずしも必要とされるわけではない。標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどのいずれかのポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質内に存在する。一部の実施形態では、標的配列は、真核細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたはクロロプラスト内に存在し得る。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」、「編集ポリヌクレオチド」、「編集配列」、「ドナー配列」、または「ドナー核酸」と称される。本出願の態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型と称されてもよい。本出願の態様では、組換えは、相同組換えである。
一般には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成は、標的配列内またはその付近（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多くの塩基対内）に一方または両方の鎖の切断をもたらす。野生型ｔｒａｃｒ配列の全てまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列のうちの約２０個または約２０個よりも多く、約２６個または約２６個よりも多く、約３２個または約３２個よりも多く、約４５個または約４５個よりも多く、約４８個または約４８個よりも多く、約５４個または約５４個よりも多く、約６３個または約６３個よりも多く、約６７個または約６７個よりも多く、約８５個または約８５個よりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）を含み得る、またはそれからなり得るｔｒａｃｒ配列はまた、ガイド配列に作動可能に連結したｔｒａｃｒメイト配列の全てまたは一部への、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部分に沿ってのハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列に対して、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するのに十分な相補性を有する。標的配列と同様に、十分機能するのであれば、完全相補性は必要ないと考えられる。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の分子は、１つまたは複数の標的部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が起こり得るように、宿主細胞に導入される。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、ｔｒａｃｒメイト配列に連結したガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列をそれぞれ宿主細胞へと導入して、ガイド配列と相補的な宿主細胞内の標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を可能にすることができるであろう。
「相補性」は、核酸の、別の核酸配列と従来のワトソン・クリック塩基対合または他の従来のものではない型のいずれかで水素結合（複数可）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子内の、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することができる残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％／、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続した残基の全てが第２の核酸配列内の同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指す、または２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを指す。
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、標的配列との相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存性であり、いくつかの因子に応じて変わる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen (1993). Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay". Elsevier, N.Y.に詳細に記載されている。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化されている複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはそれよりも多くの鎖、自己ハイブリダイズする単一の鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセスの１ステップ、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断を構成し得る。所与の配列とハイブリダイズすることが可能な配列は、その所与の配列の「相補物」と称される。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から転写されるプロセス（例えば、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物に）および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に、「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡから引き出す場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では、互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏで得られたまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの後代も包含される。
「治療剤」、「治療能のある薬剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｐａｂｌｅ ａｇｅｎｔ）」または「処置剤」という用語は、互換的に使用され、対象に投与されるといくらかの有益な効果を付与する分子または化合物を指す。有益な効果としては、診断決定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の好転；疾患、症状、障害または状態発症の低減または防止；および一般に、疾患、症状、障害または病的状態を打ち消すことが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、これだけに限定されないが、治療的利益を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法を指す。治療的利益は、処置下にある１つまたは複数の疾患、状態、または症状に対するあらゆる治療に関連性のある改善または効果を意味する。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分である薬剤の量を指す。治療有効量は、処置を受けている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうちの１つまたは複数に応じて変動し得、当業者が容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載のイメージング方法のいずれか１つによって検出するための画像がもたらされる用量にも当て
はまる。特定の用量は、選択される特定の薬剤、従う投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、イメージングが行われる組織、および運ばれる物理的送達系のうちの１つまたは複数に応じて変動し得る。
本明細書で使用される場合、単数形「１個の（ａ）」、「１個の（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の指定のない限り、複数の参照対象を含む。
「約」値またはパラメータへの言及は、本明細書では、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本願の組成物および方法は、本明細書に記載の本願の必須の要素および限定、ならびに、本明細書に記載のまたは他の点で有用な任意の追加的なまたは必要に応じた成分、構成成分、または限定を含み得る、それからなり得る、またはそれから本質的になり得る。
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。ガイドＲＮＡ
一部の実施形態では、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列は、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
一部の実施形態では、配列番号１に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号６に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号８に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１５に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１６に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１９に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２０に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２１に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２３に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２９に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３１に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３３に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３４に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。
一部の実施形態では、配列番号２に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号４に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号５に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号７に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号９に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１０に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１１に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１２に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１３に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１４に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１７に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１８に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２２に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２４に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２５に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２６に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２７に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号２８に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３０に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３２に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３５に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３６に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。一部の実施形態では、配列番号３７に記載されている標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド（例えば、天然に存在しないポリヌクレオチド）が提供される。
Ｇ１２Ｖを標的とするガイドＲＮＡ
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｖ突然変異を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、配列番号１～１４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む、ガイドＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、および６～８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、６、および８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、および８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３に記載されている。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、３、６、および８からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３の標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｖを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、４２～４４位のＡＧＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｖを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、４１～４３位のＴＡＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｖを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、３６～３８位のＴＧＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異は、種々の疾患（例えば、固形がんまたは骨髄異形成症候群などの液性がん）に存在した。例示的ながんとしては、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ、小細胞肺がん、扁平細胞肺がん）、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、膵臓がん、直腸がん、多発性骨髄腫、および神経膠腫が挙げられる。一部の実施形態では、がんは、悪性がんまたは進行がんである。本明細書に記載のガイドＲＮＡは、上記疾患のいずれかを処置するために使用することができる（例えば、本明細書に記載の方法によって）。
Ｇ１２Ｄを標的とするガイドＲＮＡ
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｄ突然変異を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、ガイド配列が、配列番号１５～２８からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む、ガイドＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１９からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１９の標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｄを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、４２～４４位のＡＧＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｄを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、４１～４３位のＴＡＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異は、様々な疾患（例えば、固形がんまたは骨髄異形成症候群などの液性がん）に存在した。例示的ながんとしては、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ、小細胞肺がん、扁平細胞肺がん）、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、膵臓がん、直腸がん、多発性骨髄腫、および神経膠腫が挙げられる。一部の実施形態では、がんは、悪性がんまたは進行がんである。本明細書に記載のガイドＲＮＡは、上記疾患のいずれかを処置するために使用することができる（例えば、本明細書に記載の方法によって）。
Ｇ１２Ｃを標的とするガイドＲＮＡ
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｃ突然変異を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、ガイド配列が、配列番号２９～３７からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む、ガイドＲＮＡが提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３４に記載されている。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４の標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｃを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、４２～４４位のＡＧＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｃを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、４１～４３位のＴＡＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
一部の実施形態では、Ｇ１２Ｃを含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）であって、３６～３８位のＴＧＧのＰＡＭ配列に隣接した標的配列と相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイド配列は、約２０～２４塩基対、２０～２２塩基対、または２０～２１塩基対の長さを有する。
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異は、様々な疾患（例えば、固形がんまたは骨髄異形成症候群などの液性がん）に存在した。例示的ながんとしては、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ、小細胞肺がん、扁平細胞肺がん）、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、膵臓がん、直腸がん、食道扁平上皮癌、消化管間質腫瘍、頭頚部扁平上皮がん、膵管腺癌、多発性骨髄腫、および神経膠腫が挙げられる。一部の実施形態では、がんは、悪性がんまたは進行がんである。本明細書に記載のガイドＲＮＡは、上記疾患のいずれかを処置するために使用することができる（例えば、本明細書に記載の方法によって）。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で存在する。
他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡ（すなわち、ｇＤＮＡ）の形態で存在する。一部の実施形態では、ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡである。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするＤＮＡをさらに含む。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡヌクレアーゼ動員配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列、ｔｒａｃｒ配列、および／またはテール配列をさらに含む。一般に、以下のうちの１つまたは複数を促進するために、ｔｒａｃｒメイト配列はｔｒａｃｒ配列に対して十分な相補性を有する任意の配列を含む：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞におけるｔｒａｃｒメイト配列に挟まれたガイド配列の削除；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズしたｔｒａｃｒメイト配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントを参照し、２つの配列のうちの短い方の長さに沿ったものである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、また、最適なアラインメントにより、ｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列のいずれか内での自己相補性などの二次構造をさらに説明することができる。一部の実施形態では、最適にアラインメントした場合の２つのうちの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列の相補性の程度は、約２５％または約２５％より大きい、約３０％または約３０％より大きい、約４０％または約４０％より大きい、約５０％または約５０％より大きい、約６０％または約６０％より大きい、約７０％または約７０％より大きい、約８０％または約８０％より大きい、約９０％または約９０％より大きい、約９５％または約９５％より大きい、約９７．５％または約９７．５％より大きい、約９９％または約９９％より大きい、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、約１１個または約１１個よりも多く、約１２個または約１２個よりも多く、約１３個または約１３個よりも多く、約１４個または約１４個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約１６個または約１６個よりも多く、約１７個または約１７個よりも多く、約１８個または約１８個よりも多く、約１９個または約１９個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約３０個または約３０個よりも多く、約４０個または約４０個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列は単一のＲＮＡ（本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される）内に含有され、したがって、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列のハイブリダイゼーションにより、ヘアピンなどの二次構造が生じる。ヘアピン構造への使用に好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチドの長さであり、配列ＧＡＡＡを有することが最も好ましい。しかし、より長いまたはより短いループ配列を代替配列として使用することもできる。配列は、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）および追加的なヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含むことが好ましい。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、少なくとも２つまたはそれよりも多くのヘアピンを有する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、２つ、３つ、４つまたは５つのヘアピンを有する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、最大で５つのヘアピンを有する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、転写終結配列をさらに含み、これはポリＴ配列、例えば、６Ｔヌクレオチドであることが好ましい。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、プライマー結合配列および／または所望のＲＮＡ配列（例えば、ガイドＲＮＡの３’末端に）をさらに含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である。ｐｅｇＲＮＡは、プライムエディターと複合体を形成し（改変されたＣａｓ９タンパク質および逆転写酵素を含む融合タンパク質など）、それにより、標的配列のプライム編集が可能になる。例えば、Anzalone & Liu et al., Nature. 2019 Dec;576 (7785):149-157を参照されたい。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の改変（例えば、化学的改変）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、核酸塩基の改変および／または主鎖の改変を含む、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを有する。ガイドＲＮＡに対する例示的な改変としては、これだけに限定されないが、ホスホロチオエート主鎖改変、リボースにおける２’置換（例えば、２’－Ｏ－メチル置換および２’－フルオロ置換）、ＬＮＡ、およびＬ－ＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、核酸塩基または主鎖に対する改変を有さない。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列のアニーリングを促進する部分を含む。一部の実施形態では、部分は、合成ヌクレオチド配列を含み、合成配列は、約１～２００ヌクレオチド、例えば約５～約１００ヌクレオチド、例えば約８～約８０ヌクレオチド、例えば約１０～約５０ヌクレオチド、例えば約１２～約４０ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）は、約２００ヌクレオチド以下、例えば約５～約１００ヌクレオチド、例えば約８～約８０ヌクレオチド、例えば約１０～約５０ヌクレオチド、例えば約１２～約４０ヌクレオチドの長さを有する。
以下のように記載された複合体、ナノ粒子および組成物を含むがこれだけに限定されない上記のガイドＲＮＡのいずれかを含む複合体、ナノ粒子、組成物も本発明で提供される。
これだけに限定されないが、ウイルス、リポソーム、電気穿孔、微量注射およびコンジュゲーションを含む、多くの送達系が、本出願において記載されたガイドＲＮＡ、複合体、ナノ粒子、および組成物のいずれかを送達するために用いられ、ｇＲＮＡの宿主細胞への導入を達成することができる。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用して、核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。このような方法を使用して、本発明のｇＲＮＡをコードする核酸を、培養中、または宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載の構築物の転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、これらは、宿主への送達のためのエピソームゲノムまたは統合ゲノムのいずれかを有する。
核酸の非ウイルス送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微量注射、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、電気穿孔、ナノ粒子、エクソソーム、マイクロベシクル、または遺伝子銃、ネイキッドＤＮＡおよび人工ビリオンを含む。
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、特異的細胞にウイルスを標的化し、ウイルスペイロードを細胞の核に輸送する際に高い効率を有する。
複合体
本出願は、ａ）第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体を提供する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、そのバリアント、その断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号１、３、４、および６～８からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含むＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、および８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、炭水化物部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ）をさらに含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５、２５９～２６０、および２６７～２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含むＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１９からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、炭水化物部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ）をさらに含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５、２５９～２６０、および２６７～２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含むＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３４に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、炭水化物部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ）をさらに含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５、２５９～２６０、および２６７～２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ａ）ＡＤＧＮ－１００ペプチドである第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５、２５９～２６０、および２６７～２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、１５３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、１５４、１５５、１５７、１５８、１６２、１６７～１７０、および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ａ）ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、８１、９２～１０３、１０５～１０７、および１１１～１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ａ）ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ａ）ＡＤＧＮ－１００ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドである第１の細胞透過性ペプチド、ｂ）配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡ；ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＡＤＧＮ－１００ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドである第１の細胞透過性ペプチド、ｂ）配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡ；ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列（例えば、１５３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、例えば、１５４、１５５、１５７、１５８、１６２、１６７～１７０、および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列）を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、８１、９２～１０３、１０５～１０７、および１１１～１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、改変されたＣａｓ９（例えば、触媒的に損なわれたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは融合タンパク質であり、融合タンパク質は、塩基編集またはプライム編集を可能にする第２の酵素をさらに含む。一部の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、およびＧ１２Ｃから選択される少なくとも２つの異なるＫＲＡＳ突然変異を特異的に標的とする少なくとも２つのガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。
一部の実施形態では、ａ）ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号３に記載されている標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第１の細胞透過性ペプチド、ｂ）配列番号３に記載されている標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列（例えば、１５３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、例えば、１５４、１５５、１５７、１５８、１６２、１６７～１７０、および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列）を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、８１、９２～１０３、１０５～１０７、および１１１～１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。
一部の実施形態では、ａ）ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号１９に記載されている標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第１の細胞透過性ペプチド、ｂ）配列番号１９に記載されている標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列（例えば、１５３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、例えば、１５４、１５５、１５７、１５８、１６２、１６７～１７０、および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列）を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、８１、９２～１０３、１０５～１０７、および１１１～１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。
一部の実施形態では、ａ）ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第１の細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）配列番号３４に記載されている標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される第１の細胞透過性ペプチド、ｂ）配列番号３４に記載されている標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列（例えば、１５３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、例えば、１５４、１５５、１５７、１５８、１６２、１６７～１７０、および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列）を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、８１、９２～１０３、１０５～１０７、および１１１～１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。
細胞透過性ペプチド
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ウイルスによらない戦略の有望なものの１つである。ＣＰＰの定義は進化し続けているが、タンパク質またはキメラ配列に由来する３０アミノ酸未満の短いペプチドと一般に説明される。ＣＰＰは、通常、両親媒性であり、正味の正電荷を有する（Langel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis, Boca Raton)；Heitz et al. (2009) Br J Pharmacol 157, 195-206）。ＣＰＰは、種々の生体分子の細胞膜を横断して細胞質内への移動を誘発するため、およびそれらの細胞内経路設定を改善し、それにより、標的との相互作用を容易にするために、生体膜を透過させることができるものである。ＣＰＰは、２つの主要なクラスに細分することができ、第１のクラスはカーゴとの化学的連結を必要とするものであり、第２のクラスは、安定な非共有結合性の複合体の形成を伴うものである。どちらの戦略のＣＰＰも、カーゴの大きなパネル（プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、ペプチド、リポソーム、ナノ粒子．．．）の多種多様な細胞型およびｉｎ ｖｉｖｏモデルへの送達に有利であることが報告されている（Langel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis, Boca Raton)；Heitz et al. (2009) Br J Pharmacol 157, 195-206；Mickan et al. (2014) Curr Pharm Biotechnol 15, 200-209；Shukla et al. (2014) Mol Pharm 11, 3395-3408）。
タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）の概念は、最初に、いくつかのタンパク質、主に転写因子を細胞内におよび１つの細胞から別の細胞にシャトル輸送することができるという観察に基づいて提唱された（総説についてはLangel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis、Boca Raton)；Heitz et al. (2009) Br J Pharmacol 157, 195-206を参照されたい）。最初の観察は１９８８年にＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏによってなされた。彼らは、ＨＩＶ－１の転写トランス活性化（Ｔａｔ）タンパク質が細胞に進入し、核内に場所を移すことができることを示した。１９９１年に、ＰｒｏｃｈｉａｎｔｚのグループがＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインを用いて同じ結論に達し、このドメインが神経細胞によって内部移行することを実証した。これらの研究は、１９９４年の最初のタンパク質導入ドメイン：ペネトラチンと名付けられた、アンテナペディアのホメオドメインの第３のへリックスに由来する１６ｍｅｒペプチドの発見の原点になった。１９９７年には、Ｌｅｂｌｅｕのグループにより、細胞内取り込みに必要なＴａｔの最小配列が同定され、Ｄｏｗｄｙのグループにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＴＤの適用に関する最初の概念実証が小さなペプチドおよび大きなタンパク質の送達に関して報告された（Gump JM, and Dowdy SF (2007) Trends Mol Med 13, 443-448.）。歴史的に、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の概念は１９９８年にＬａｎｇｅｌのグループによって導入され、最初のキメラペプチド担体であるトランスポータンが設計され、これは、スズメバチ毒液ペプチドであるマストパランと連結した神経ペプチドであるガラニンのＮ末端断片に由来するものであった。トランスポータンは元々、培養細胞およびｉｎ ｖｉｖｏの両方におけるＰＮＡ（ペプチド核酸）の送達を改善するためのものとして報告された（Langel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis, Boca Raton)）。１９９７年に、ＨｅｉｔｚおよびＤｉｖｉｔａのグループにより、カーゴの安定であるが非共有結合性の複合体の形成にＣＰＰを伴う新しい戦略が提唱された（Morris et al. (1997) Nucleic Acids Res 25, 2730-2736）。この戦略は、まず、２つのドメイン：親水性（極性）ドメインおよび疎水性（無極性）ドメインからなる短いペプチド担体（ＭＰＧ）に基づくものであった。核酸の送達のためにＭＰＧが設計された。次いで、タンパク質およびペプチドの非共有結合性送達のために、第一次の両親媒性ペプチドＰｅｐ－１が提唱された（Morris et al. (2001)Nat Biotechnol 19, 1173-1176）。次いで、ＷｅｎｄｅｒのグループおよびＦｕｔａｋｉのグループにより、小さな分子および大きな分子を細胞内におよびｉｎ ｖｉｖｏで駆動するためにはポリアルギニン配列（Ａｒｇ８）が十分であることが実証された（Nakase et al. (2004)Mol Ther 10, 1011-1022；Rothbard et al. (2004)J Am Chem Soc 126, 9506-9507）。その後ずっと、天然配列または天然でない配列に由来する多くのＣＰＰが同定されており、その一覧は増え続けている。ペプチドは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質から、カルシトニンから、抗菌薬または毒素ペプチドから、細胞周期の調節に関与するタンパク質から、ならびにポリプロリンリッチペプチドから引き出されている（Heitz et al. (2009)Br J Pharmacol 157, 195-206）。つい最近、第二次の両親媒性ＣＰＰに基づく新しい非共有結合性戦略が記載されている。ＣＡＤＹおよびＶＥＰＥＰ－ファミリーなどのこれらのペプチドは、分子の異なる側面にある親水性残基および疎水性残基を用いてヘリックス形状に自己組織化することができる。ＷＯ２０１４／０５３８７９にはＶＥＰＥＰ－３ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８１にはＶＥＰＥＰ－４ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８２にはＶＥＰＥＰ－５ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１２／１３７１５０にはＶＥＰＥＰ－６ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８０にはＶＥＰＥＰ－９ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１６／１０２６８７にはＡＤＧＮ－１００ペプチドが開示されており、ＵＳ２０１０／００９９６２６にはＣＡＤＹペプチドが開示されており、米国特許第７，５１４，５３０号にはＭＰＧペプチドが開示されている；その開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願のゲノム編集複合体またはナノ粒子内の細胞透過性ペプチドは、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１））、インテグラーゼ（例えば、バクテリオファージインテグラーゼ、例えば、φＣ３１）、および核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、およびドナー核酸）などのゲノム編集システムの種々の分子と安定な複合体およびナノ粒子を形成することができるものである。本明細書に記載の任意のゲノム編集複合体またはナノ粒子の任意の細胞透過性ペプチドは、この節に記載されている任意の細胞透過性ペプチド配列を含み得る、またはそれからなり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドを含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在するゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）と結び付いている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ｇＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ドナー核酸と結び付いている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。ＷＯ２０１４／０５３８７９にはＶＥＰＥＰ－３ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８１にはＶＥＰＥＰ－４ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８２にはＶＥＰＥＰ－５ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１２／１３７１５０にはＶＥＰＥＰ－６ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８０にはＶＥＰＥＰ－９ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１６／１０２６８７にはＡＤＧＮ－１００ペプチドが開示されており、ＵＳ２０１０／００９９６２６にはＣＡＤＹペプチドが開示されており、米国特許第７，５１４，５３０号にはＭＰＧペプチドが開示されている；その開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＥＰＥＰ－３ペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ６Ｘ７Ｘ３Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号４４）を含むＶＥＰＥＰ－３細胞透過性ペプチドを含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－Ａ（「ベータ－アラニン）またはＳであり、Ｘ２は、Ｋ、ＲまたはＬであり（互いに独立に）、Ｘ３は、ＦまたはＷであり（互いに独立に）、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり（互いに独立に）、Ｘ５は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＴまたはＳであり、Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ８は、存在しないか、ＦまたはＷであり、Ｘ９は、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＬであり、Ｘ１１は、Ｋ、ＷまたはＲであり、Ｘ１２は、ＲまたはＦであり、Ｘ１３は、ＲまたはＫである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＷＸ４ＥＸ２ＷＸ４Ｘ６Ｘ７Ｘ３ＰＲＸ１１ＲＸ１３（配列番号４５）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｋ、ＲまたはＬであり、Ｘ３は、ＦまたはＷであり、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＴまたはＳであり、Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ８は、存在しないか、ＦまたはＷであり、Ｘ９は、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＬであり、Ｘ１１は、Ｋ、ＷまたはＲであり、Ｘ１２は、ＲまたはＦであり、Ｘ１３は、ＲまたはＫである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＦＥＲＷＦＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号４６）、Ｘ１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号４７）、Ｘ１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＫ（配列番号４８）、Ｘ１ＲＷＷＥＫＷＷＴＲＷＰＲＫＲＫ（配列番号４９）、またはＸ１ＲＷＹＥＫＷＹＴＥＦＰＲＲＲＲ（配列番号５０）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ここで、細胞透過性ペプチドは、１０位のアミノ酸の非天然アミノ酸による置換え、２位のアミノ酸と３位のアミノ酸の間への非天然アミノ酸の付加、および２つの非天然アミノ酸の間の炭化水素連結の付加によって改変されている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＸ１４ＷＷＥＲＷＷＲＸ１４ＷＰＲＫＲＫ（配列番号５１）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ１４は、非天然アミノ酸であり、また、２つの非天然アミノ酸の間に炭化水素連結が存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＸ５Ｘ１０Ｘ３ＷＸ６Ｘ７ＷＸ８Ｘ９Ｘ１０ＷＸ１２Ｒ（配列番号５２）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｋ、ＲまたはＬであり、Ｘ３は、ＦまたはＷであり、Ｘ５は、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、ＲまたはＳであり、Ｘ７は、ＲまたはＳであり、Ｘ８は、ＦまたはＷであり、Ｘ９は、ＲまたはＰであり、Ｘ１０は、ＬまたはＲであり、Ｘ１２は、ＲまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＲＷＷＲＬＷＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号５３）、Ｘ１ＬＷＷＲＲＷＷＳＲＷＷＰＲＷＲＲ（配列番号５４）、Ｘ１ＬＷＷＳＲＷＷＲＳＷＦＲＬＷＦＲ（配列番号５５）、またはＸ１ＫＦＷＳＲＦＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号５６）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号４４および５２～５６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ここで、細胞透過性ペプチドは、５位および１２位のアミノ酸の非天然アミノ酸による置換え、および２つの非天然アミノ酸の間の炭化水素連結の付加によって改変されている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＲＷＷＸ１４ＬＷＷＲＳＷＸ１４ＲＬＷＲＲ（配列番号５７）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータアラニンまたはセリンであり、Ｘ１４は、非天然アミノ酸であり、また、２つの非天然アミノ酸の間に炭化水素連結が存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－ＡＫＷＦＥＲＷＦＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号５８）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－ＡＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号５９）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列ＡＳＳＬＮＩＡ－Ａｖａ－ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号６０）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列ＬＳＳＲＬＤＡ－Ａｖａ－ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号６１）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＳＹＴＳＳＴＭ－ａｖａ－ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号６２）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内のゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ドナー核酸と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。
ＶＥＰＥＰ－６ペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＶＥＰＥＰ－６細胞透過性ペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ｘ１ＬＸ２ＲＡＬＷＸ９ＬＸ３Ｘ９Ｘ４ＬＷＸ９ＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号６３）、Ｘ１ＬＸ２ＬＡＲＷＸ９ＬＸ３Ｘ９Ｘ４ＬＷＸ９ＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号６４）およびＸ１ＬＸ２ＡＲＬＷＸ９ＬＸ３Ｘ９Ｘ４ＬＷＸ９ＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号６５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＦまたはＷであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｗ、ＣまたはＩであり、Ｘ４は、Ｓ、Ａ、ＮまたはＴであり、Ｘ５は、ＬまたはＷであり、Ｘ６は、ＷまたはＲであり、Ｘ７は、ＫまたはＲであり、Ｘ８は、Ａであるかまたは存在せず、Ｘ９は、ＲまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＬＸ２ＲＡＬＷＲＬＸ３ＲＸ４ＬＷＲＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号６６）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＦまたはＷであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｗ、ＣまたはＩであり、Ｘ４は、Ｓ、Ａ、ＮまたはＴであり、Ｘ５は、ＬまたはＷであり、Ｘ６は、ＷまたはＲであり、Ｘ７は、ＫまたはＲであり、Ｘ８は、Ａであるかまたは存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＬＸ２ＲＡＬＷＲＬＸ３ＲＸ４ＬＷＲＬＸ５Ｘ６ＫＸ７（配列番号６７）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＦまたはＷであり、Ｘ３は、ＬまたはＷであり、Ｘ４は、Ｓ、ＡまたはＮであり、Ｘ５は、ＬまたはＷであり、Ｘ６は、ＷまたはＲであり、Ｘ７は、Ａであるかまたは存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＸ２ＬＷＲＬＬＷＸ３（配列番号６８）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＸ２ＬＷＲＬＬＷＸ３Ａ（配列番号６９）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ４ＲＸ２ＬＷＲＬＷＲＸ３Ａ（配列番号７０）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＸ２ＬＷＲＬＷＲＸ３Ａ（配列番号７１）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ５ＲＡＬＷＲＬＬＷＸ３Ａ（配列番号７２）、およびＸ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ４ＲＮＬＷＲＬＬＷＸ３Ａ（配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＳまたはＴであり、Ｘ３は、ＫまたはＲであり、Ｘ４は、Ｌ、ＣまたはＩであり、Ｘ５は、ＬまたはＩである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号７４）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号７５）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＷＲＫＡ－システアミド（配列番号７６）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＷＲＫＡ－システアミド（配列番号７７）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＡＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号７８）、およびＡｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＮＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号７９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号６３～７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、８位および１２位の２つの残基間に炭化水素連結をさらに含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８０）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＲＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８１）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＳＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８２）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＳＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８３）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８４）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＲＬＬＲＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８５）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＳＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８６）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＲＬＬＳＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８７）、およびＡｃ－Ｘ１ＬＦＡＲＳＬＷＲＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号８８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、また、後に下付きの「Ｓ」が続く残基は、前記炭化水素連結によって連結されている残基である。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号８９）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号９０～１１７のいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号９０）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、レトロインベルソアミノ酸配列ＡＫＷＬＬＲＷＬＳＲＷＬＲＷＬＡＲＷＬＲ（配列番号９１）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－（ＰＥＧ）７－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号９２）またはＡｃ－（ＰＥＧ）２－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号９３）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号９４～１０３のいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－Ａ－Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｖａ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号９６）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－Ａ－Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｕｎ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号９８）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｈｘ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫ－ＮＨ２（配列番号１００）またはＡｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｈｘ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１０１）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－Ａｃ－ＧＹＶＳ－Ａｈｘ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１０２）またはＡｃ－ＹＩＧＳＲ－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１０３）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ステアリル－βＡ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１０４）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１０５～１０７のいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列ＡＬＷＲＡ（ＧａｌＮａｃ）ＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１１１）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＳＹＴＳＳＴＭ－ａｖａ－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１１２）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＴＨＲＰＰＮＷＳＰＶＷＰＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＲＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１１３）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＣＫＴＲＲＶＰＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１１４）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＣＫＴＲＲＶＰ－ａｖａ－ＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２（配列番号１１５）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＣＡＲＰＡＲ－ａｖａ－ＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫ－ＮＨ２（配列番号１１６）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＴＨＲＰＰＮＷＳＰＶ－ａｖａ－ＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＲＷＫ－ＮＨ２（配列番号１１７）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内のゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ｇＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ドナー核酸と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。
ＶＥＰＥＰ－９ペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号１１８）を含むＶＥＰＥＰ－９細胞透過性ペプチドを含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｌであるかまたは存在せず、Ｘ３は、Ｒであるかまたは存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗまたは存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、または存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＲＷＷＬＲＷＡＸ６ＲＷＸ８Ｘ９Ｘ１０ＷＸ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号１１９）を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｌであるかまたは存在せず、Ｘ６は、ＳまたはＰであり、Ｘ８は、ＦまたはＡであり、Ｘ９は、Ｓ、ＬまたはＰであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１２は、ＡまたはＲであり、Ｘ１３は、ＷまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号１２０）、Ｘ１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号１２１）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号１２２）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号１２３）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＰＲＷＦＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号１２４）、およびＸ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号１２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ７Ｘ８ＲＸ１０ＷＷＲ（配列番号１２６）のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ４は、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＴまたはＰであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、ＡまたはＲであり、Ｘ１０は、ＳまたはＲである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＷＷＲＷＷＡＳＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号１２７）、Ｘ１ＷＷＧＳＷＡＴＰＲＲＲＷＷＲ（配列番号１２８）、およびＸ１ＷＷＲＷＷＡＰＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号１２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－ＡＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号１３０）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列ＫＳＹＤＴＹ－ａｖａ－ＡＬＲＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＲ（配列番号１３１）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列ａｃ－ＣＫＲＡＶＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号１３２）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列ベータ－Ａ－ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＲ（配列番号１３３）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列ＫＳＹＤＴＹＡＡＥＴＲＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号１３４）を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内のゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ｇＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ドナー核酸と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。
ＡＤＧＮ－１００ペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１３５）を含むＡＤＧＮ－１００細胞透過性ペプチドを含み、ここで、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２～Ｘ８は、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１３６）を含み、ここで、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、または存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、またはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、Ｖ、またはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号１３７）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号１３８）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号１３９）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号１４０）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、炭化水素連結によって連結した３個または６個の残基によって分離された２つの残基を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＫＷＲＳＳＡＧＷＲＳＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号１４１）、ＫＷＲＳＳＡＧＷＲＷＲＳＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号１４２）、ＫＷＲＳＡＧＷＲＳＷＲＬＷＲＶＲＳＳＷＳＲ（配列番号１４３）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号１４４）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号１４５）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＲＳＳＷＳＲ（配列番号１４６）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＳＲＳＷＳＲ（配列番号１４７）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＳＲＳＷＳＳＲ（配列番号１４８）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号１４９）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号１５０）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＳＡＬＹＳＲ（配列番号１５１）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＳＡＬＹＳＳＲ（配列番号１５２）を含み、ここで、下付き文字「Ｓ」で印づけられた残基は、炭化水素連結によって連結している。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号１５３～１７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ベータ－ＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１５３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ベータ－ＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号１５４）またはベータ－ＡＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号１５５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ＲＳＷＳＲＶＲＷＬＲＷＲＷＧＡＳＲＷＫ（配列番号１５６）のレトロインベルソアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、Ａｃ－（ＰＥＧ）７－ｂＡ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１５７）またはベータ－Ａｃ－（ＰＥＧ）２－βＡ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１５８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ステアリル－βＡ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１５９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号１６０～１６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｖａ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（ａｖａは、５－アミノペンタン酸である）（配列番号１６２）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｈｘ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１６７）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（ＰＥＧ）ｎ－βＡ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（ｎ＝２、４、または７）（配列番号１７０）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＫＷＲＳＡ（ＧＡＬＮＡＣ）ＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１７２）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ａｃ－ＣＡＲＰＡＲＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１７３）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ＲＷＲＬＷＲＷＳＲ（配列番号１６８）のアミノ酸配列を含むコアモチーフを含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＤＨＮＧＷＲＳＡＬＲＷＲＬＷＲＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１７４）またはＡｃ－ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＤＨＮＧ－ａｖａ－ＷＲＳＡＬＲＷＲＬＷＲＷＳＲ－ＮＨ２（配列番号１７５）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内のゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）と結び付いている。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ｇＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ドナー核酸と結び付いている。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。
ＶＥＰＥＰ－４ペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列ＸＷＸＲＬＸＸＸＸＸＸ（配列番号１７６）を含むＶＥＰＥＰ－４細胞透過性ペプチドを含み、ここで、１位のＸは、ベータ－ＡまたはＳである；３位、９位および１０位のＸは、互いに独立に、ＷまたはＦである；６位のＸは、８位のＸがＳの場合にはＲであり、６位のＸは、８位のＸがＲの場合にはＳである；７位のＸは、Ｌであるかまたは存在しない；１１位のＸは、Ｒであるかまたは存在せず、および７位のＸは、１１位のＸが存在しない場合にはＬである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、配列番号１７７～１８０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内のゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ｇＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ドナー核酸と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。
ＶＥＰＥＰ－５ペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列ＲＸＷＸＲＬＷＸＲＬＲ（配列番号１８１）を含むＶＥＰＥＰ－５細胞透過性ペプチドを含み、ここで、２位のＸは、ＲまたはＳであり、４位および８位のＸは、互いに独立に、ＷまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、配列番号１８２～１８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内のゲノム編集複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ｇＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ガイドＲＮＡと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、ドナー核酸と結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。
細胞透過性ペプチドの改変
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ＣＰＰのＮ末端に連結した（例えば、共有結合により連結した）１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＣＰＰのＮ末端に共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、リンカー部分、および標的化部分からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＣＰＰのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ＣＰＰのＣ末端に連結した（例えば、共有結合により連結した）１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基、システイン、チオール、アミド、ニトリロ三酢酸、カルボキシル基、直鎖状または分枝Ｃ１～Ｃ６アルキル基、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、リンカー部分、および標的化部分からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）がステープル留めされている。「ステープル留め」とは、本明細書で使用される場合、ペプチド内の２つの残基間の化学的連結を指す。一部の実施形態では、ＣＰＰはステープル留めされており、ペプチドの２つのアミノ酸間に化学的連結を含む。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸は、３個または６個のアミノ酸によって分離されている。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸は、３個のアミノ酸によって分離されている。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸は、６個のアミノ酸によって分離されている。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸のそれぞれは、ＲまたはＳである。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸のそれぞれは、Ｒである。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸のそれぞれは、Ｓである。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸の一方はＲであり、他方はＳである。一部の実施形態では、化学的連結は、炭化水素連結である。
一部の実施形態では、ＣＰＰは、Ｌ－アミノ酸を含むＬ－ペプチドである。一部の実施形態では、ＣＰＰは、レトロインベルソペプチド（例えば、逆向きの配列のＤ－アミノ酸で構成され、伸長させた場合、その親分子と同様の側鎖トポロジーが想定されるが、アミドペプチド結合が反転しているペプチド）である。一部の実施形態では、レトロインベルソペプチドは、配列番号９１または１５６の配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＰＰは、Ｎ末端から、細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した、アセチル基、標的化部分およびリンカー部分を含む。
標的化部分
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、標的化部分は、ＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１の標的化部分は、ＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしており、第２の標的化部分は、ＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。
一部の実施形態では、標的化部分は、１つまたは複数の臓器を標的とする標的化ペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の臓器は、筋肉、心臓、脳、脾臓、リンパ節、肝臓、肺、および腎臓からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、脳を標的とする。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、筋肉を標的とする。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、心臓を標的とする。
一部の実施形態では、標的化部分は、少なくとも約３個、４個、または５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、約８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、または４個以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、約３個、４個、または５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ＧＹ、ＹＶ、ＶＳ、ＳＫ、ＧＹＶ、ＹＶＳ、ＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＶＳＫ、ＹＩ、ＩＧ、ＧＳ、ＳＲ、ＹＩＧ、ＩＧＳ、ＧＳＲ、ＹＩＧＳ、ＩＧＳＲからなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、配列（例えば、標的化配列）は、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される。
一部の実施形態では、標的化部分は、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される標的化配列を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＳＹＴＳＳＴＭ（配列番号１９６）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＣＫＴＲＲＶＰ（配列番号１９７）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＴＨＲＰＰＮＷＳＰＶ（配列番号１９８）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＤＨＮＧ（配列番号１９９）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＣＡＲＰＡＲ（配列番号２００）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号２０３）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＬＳＳＲＬＤＡ（配列番号２０４）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＫＳＹＤＴＹ（配列番号２０５）を含む。
一部の実施形態では、標的化部分は、本明細書に記載のリンカー部分のいずれか１つなどのリンカー部分を介してＣＰＰとコンジュゲートしている。
リンカー部分
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、リンカー部分を含む。
一部の実施形態では、リンカー部分は、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２個、３個、または４個のグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシ
ン、ＰＥＴ）を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、ＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ポリマーは、ＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１のポリマーがＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしており、第２のポリマーがＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、１５ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、または４０ｋＤａ以下である。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、少なくとも約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ～約４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも約１個、２個、または３個のエチレングリコール単位を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０個以下、９個以下、８個以下または７個以下のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１個、２個、または３個のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１個～８個、または約２個～７個のエチレングリコール単位からなる。
一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４）、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカー部分は、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）を含む。一部の実施形態では、リンカー部分は、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）を含む。一部の実施形態では、リンカー部分は、Ａｈｘ（アミノカプロン酸）を含む。
炭水化物部分
一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、炭水化物部分をさらに含む。一部の実施形態では、炭水化物部分は、ＧａｌＮＡｃである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１０６ペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、炭水化物部分により細胞透過性ペプチド内のアラニンが修飾されている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１１または１７２に記載されている。
細胞透過性ペプチド混合物
一部の実施形態では、ゲノム編集複合体内の細胞透過性ペプチドは、ａ）第１の細胞透過性ペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞透過性ペプチドのいずれか）を含む第１のペプチド、ｂ）第２の細胞透過性ペプチド（例えば、本明細書に記載の細胞透過性ペプチドのいずれか）を含む第２のペプチドの混合物であって、第２のペプチドが第２の細胞透過性ペプチドに共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、かつ第１のペプチドがＰＥＧ部分を有さない、混合物である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドのカーゴ（例えば、必要に応じてＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチドを含むガイドＲＮＡ）に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。
一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比は、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１）である。
一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。
一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、分枝（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＰＥＧである。
カーゴ分子
一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子と複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のうちの少なくとも１つと非共有結合により複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のそれぞれと非共有結合により複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のうちの少なくとも１つと共有結合により複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のそれぞれと共有結合により複合体を形成する。
上記のように、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、上記のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のゲノム編集分子（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）を含む。
ガイドＲＮＡ
本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、「合成ガイドＲＮＡ」の節に記載されているガイドＲＮＡのいずれかなどの突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、突然変異したＫＲＡＳは、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異したＫＲＡＳは、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３ＤおよびＧ１３Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含む。
ＤＮＡヌクレアーゼ
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、そのバリアント、その断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子のゲノム編集系分子（例えば、ＲＧＥＮ）は、タンパク質またはポリペプチドである。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＲＧＥＮ（例えば、Ｃａｓ９）を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、約１０ｋＤａから約２００ｋＤａの間（例えば、おおよそで、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、および２００ｋＤａのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、複数のタンパク質またはポリペプチドを含み、複数のタンパク質またはポリペプチドのそれぞれが、約１０ｋＤａから約２００ｋＤａの間（例えば、おおよそで、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、および２００ｋＤａのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、約２０ｎｔから約２０ｋｂの間（例えば、おおよそで、０．０２ｋｂ、０．０３ｋｂ、０．０４ｋｂ、０．０５ｋｂ、０．０６ｋｂ、０．０７ｋｂ、０．０８ｋｂ、０．０９ｋｂ、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、および２０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、核酸は、ゲノム編集系分子をコードするＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノム編集系分子を発現させるための発現カセットを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、約１ｋｂから約２０ｋｂの間（例えば、おおよそで、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、および２０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、核酸は、ゲノム編集系分子をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約１００ｎｔから約１０ｋｂの間（例えば、おおよそで、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、および１０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。
一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、本明細書に記載の核酸のいずれかなどの複数の核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ｇＲＮＡおよびゲノム編集系分子をコードする核酸（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼをコードするＤＮＡプラスミドまたはｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、複数のゲノム編集系分子をコードする核酸（例えば、複数のゲノム編集系分子をコードする１つまたは複数のＤＮＡプラスミド、または複数のゲノム編集系分子をコードする複数のｍＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書に記載の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンタゴミルの場合では必ずではないが２００ヌクレオチドまで、またはプラスミドＤＮＡの場合では１０００キロ塩基までの様々な長さのいずれかであり得る。
一部の実施形態では、核酸は、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片（例えば、長さが最大約１０００ｂｐのＤＮＡ断片）である。さらに、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、高度にメチル化されたものであっても低度にメチル化されたものであってもよい。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、１つまたは複数の遺伝子をコードし、前記１つまたは複数の遺伝子の発現に必要な調節エレメントを含有し得る。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、選択マーカーをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み得、それにより、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片を妥当な宿主細胞内で維持することが可能になる。
ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである。一般に、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）は、通常、特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて認識された別個のクラスの散在型の短い配列リピート（ＳＳＲ）（Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]；およびNakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]）、および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲは、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおいて同定されている（Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]；Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]；Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]；およびMojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、一般には、短鎖規則的間隔リピート（ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔ）（ＳＲＳＲ）と名付けられたリピートの構造によって、他のＳＳＲとは異なる（Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]；およびMojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]）。一般に、これらのリピートは、実質的に一定の長さの独自の介在配列によって規則的に間隔が空いたクラスターで存在する短いエレメントである（Mojica et al., [2000]、上掲）。リピート配列は系統間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、一般には、系統間で異なる（van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚａｒｃｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａを含むがこれだけに限定されない４０種を超える原核生物において同定されている（例えば、Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002］；およびMojica et al., [2005]を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、そのホモログ、またはその改変バージョン、例えば、誘導性、不活化、または分割Ｃａｓタンパク質などが挙げられる（例えば、Dominguez et al. (2015). Nature Reviews Molecular Cell Biology；Polstein, L. R., & Gersbach, C. A. (2015). Nature chemical biology, 11(3):198-200；Dow et al. (2015). Nature biotechnology, 33(4):390-394；Zetsche et al. (2015). Nature biotechnology, 33(2):139-142；Kleinstiver et al. (2015). Nature. 523:481-485；Bikard et al. (2013). Nucleic acids research, 41(15):7429-7437；Qi et al. (2013). Cell, 152(5):1173-1183を参照されたい）。これらの酵素は、当業者に公知である；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下に見いだすことができ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｕ２ＵＭＱ６の下に見いだすことができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などの、ＤＮＡ切断活性を有する改変されていないＣＲＩＳＰＲ酵素または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９であり得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１であり得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素により、標的配列内および／または標的配列の相補物内などの標的配列の場所における一方または両方の鎖の切断が方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素により、標的配列の最初のヌクレオチドまたは最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれよりも多くの塩基対以内での一方または両方の鎖の切断が方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、対応する野生型酵素に対して突然変異したものであり、その結果、突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン内のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）により、Ｃａｓ９が、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換される。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例としては、限定することなく、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼを、ガイド配列、例えば、それぞれＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用することができる。この組合せにより、両方の鎖にニックを入れ、ＮＨＥＪの誘導に使用することが可能になる。
さらなる例として、Ｃａｓ９の２つまたはそれよりも多くの触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩ）を突然変異させて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠く突然変異Ｃａｓ９を作製することができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ突然変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異した酵素のＤＮＡ切断活性が、その突然変異していない形態に対して約２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満である、またはそれよりも低い場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くとみなされる。他の突然変異も有用でありうる；Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ以外の種に由来するものである場合、対応するアミノ酸の突然変異を行って同様の効果を実現することができる。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）は、Ｎ末端Ｃａｓタンパク質断片、Ｃａｓ（Ｎ）、およびＣ末端Ｃａｓタンパク質断片、Ｃａｓ（Ｃ）を含む分割Ｃａｓタンパク質であり、ここで、Ｃａｓ（Ｎ）は第１の二量体形成ドメインと融合しており、Ｃａｓ（Ｃ）は第２の二量体形成ドメインと融合しており、また、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメインにより、Ｃａｓ（Ｎ）とＣａｓ（Ｃ）の二量体形成が容易になって、機能的なＣａｓヌクレアーゼ活性を有する複合体が形成される。一部の実施形態では、第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメインの二量体形成は、二量体形成剤に対して感受性である。例えば、一部の実施形態では、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメインは、ＦＫ５０６結合性タンパク質１２（ＦＫＢＰ）およびラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）のＦＫＢＰラパマイシン結合性（ＦＲＢ）ドメインを含み、二量体形成剤はラパマイシンである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の複合体またはナノ粒子は、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現のためにコドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む。真核細胞は、これだけに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含めた哺乳動物などの特定の生物体のものまたは特定の生物体に由来するものであり得る。一般に、コドン最適化は、目的の宿主細胞における発現を増強するために、核酸配列を、ネイティブな配列の少なくとも１個のコドン（例えば、約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、またはそれよりも多くのコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって改変する一方で、ネイティブなアミノ酸配列を維持するプロセスを指す。種々の種が特定のアミノ酸に関してある特定のコドンへの特定の偏りを示す。コドンバイアス（生物体間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、今度は翻訳の効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞において選択されるｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、所与の生物体における最適な遺伝子発現のために、遺伝子をコドン最適化に基づいて調整することができる。コドン使用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表をいくつかのやり方で適合させることができる。Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）も利用可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列における１つまたは複数のコドン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、またはそれよりも多く、または全てのコドン）が特定のアミノ酸に関して最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端またはその付近に約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのＮＬＳを含むか、カルボキシ末端またはその付近に約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのＮＬＳを含むか、またはこれらの組合せを含む（例えば、アミノ末端に１つまたは複数のＮＬＳを含み、カルボキシ末端に１つまたは複数のＮＬＳを含む）。１つよりも多くのＮＬＳが存在する場合、それぞれを他のＮＬＳとは独立に選択することができ、したがって、単一のＮＬＳが１つよりも多くのコピー内に存在する可能性もあり、かつ／または、１つまたは複数のコピー内に存在する１つまたは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在する可能性もある。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６個のＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近くのアミノ酸がポリペプチド鎖に沿ってＮ末端またはＣ末端から約１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、４０アミノ酸、５０アミノ酸、またはそれよりも多くのアミノ酸以内にある場合、Ｎ末端またはＣ末端の付近にあるとみなされる。一般には、ＮＬＳは、タンパク質表面に露出した正に荷電したリシンまたはアルギニンの１つまたは複数の短い配列からなるが、他の型のＮＬＳも公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１２）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２１３）を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２１４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２１５）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２１６）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２１７）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２１８）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２１９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２２０）；マウスｃ－ａｂ１ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２２１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２２２）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２２３）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２２４）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２２５）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２２６）；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２２７）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加的なタンパク質配列、および必要に応じて任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素と融合することができるタンパク質ドメインの例としては、限定することなく、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑止活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つまたは複数を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、これだけに限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含めた自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、これだけに限定されないが、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合性ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含めた、ＤＮＡ分子に結合するまたは他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加的なドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００５９５０２に記載されている。一部の実施形態では、タグが付されたＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の場所を同定する。
一部の実施形態では、カーゴは、塩基エディターを含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼをプログラム可能なヌクレオチドデアミナーゼに変換し、それによって、二本鎖切断を誘導せずに、Ｃ～Ｔへの突然変異（Ｃ～Ｕへの脱アミノ化による）またはＡ～Ｇへの突然変異（Ａ～Ｉへの脱アミノ化による）の導入を促進する塩基エディターが開発されている。塩基エディターは、核酸塩基デアミナーゼ酵素に融合したＳｐＣａｓ９（ｎＳｐＣａｓ９、細胞のＤＮＡミスマッチ修復を刺激する）のニッカーゼ形態、およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）などの塩基除去修復の阻害剤を含む。Rees et al., Nature Communications Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery volume 8, Article number: 15790 (2017)；Komor et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016)を参照されたい。
一部の実施形態では、カーゴは、プライムエディターを含む。プライム編集は、新たな遺伝子情報を特定のＤＮＡ部位に直接的に書き込む多様かつ正確なゲノム編集方法である。これは、工学的に作製された逆転写酵素に融合した触媒的に損なわれたＣａｓ９エンドヌクレアーゼからなる融合タンパク質、および標的部位を特定することができ、標的ＤＮＡヌクレオチドを置き換えるための新たな遺伝子情報を提供するプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を使用する。これは、二本鎖切断（ＤＳＢ）もドナーＤＮＡ鋳型も必要とせず、標的化された挿入、欠失、および塩基間変換を媒介する。Anzalone et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature volume 576, pages149-157(2019)を参照されたい。
一部の実施形態では、カーゴは、触媒として機能しないヌクレアーゼ（例えば、触媒として機能しないＣａｓ９エンドヌクレアーゼなど）および逆転写酵素（例えば、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素のペンタ突然変異体など）を含む融合タンパク質を含む。例えば、Anzalone & Liu et al., Nature. 2019 Dec; 576 (7785): 149-157を参照されたい。一部の実施形態では、カーゴは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、カーゴは、触媒不活性化ヌクレアーゼ（例えば、触媒不活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）と核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、核酸塩基デアミナーゼ酵素は、ＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼである。一部の実施形態では、核酸塩基デアミナーゼ酵素は、シチジンデアミナーゼＣＤＡ１である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）である。一部の実施形態では、カーゴは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ＺＦＰおよびＺＦＮ；ＴＡＬ、ＴＡＬＥ、およびＴＡＬＥＮ
一部の実施形態では、カーゴ分子は、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合した、１つまたは複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）または転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質（またはＤＮＡ結合タンパク質／エフェクタータンパク質融合体をコードする核酸）を含む。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。Lloyd et al., Fronteirs in Immunology, 4(221), 1-7 (2013)を参照されたい。一部の実施形態では、本明細書に記載のガイドＲＮＡは、ＺＦＰまたはＴＡＬを標的セットにガイドするＲＮＡをコードするＤＮＡ（すなわち、ガイドＤＮＡ、ｇＤＮＡ）の形態であり得る。
ＺＦＰおよびＺＦＮ
一部の実施形態では、カーゴ分子は、配列特異的にＤＮＡと結合する１つまたは複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される、結合ドメインの中にあるアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーによって配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。
ＺＦＰの中には、個々のフィンガーのアセンブリーによって生成された、特定のＤＮＡ配列、一般には９～１８ヌクレオチドの長さを標的とする人工的なＺＦＰドメインがある。
ＺＦＰには、１個のフィンガードメインがおよそ３０アミノ酸長であり、亜鉛を介して１つのベータターンの２個のシステインと配位する２個の変化しないヒスチジン残基を含有するアルファヘリックスを含有し、２個、３個、４個、５個、または６個のフィンガーを有するＺＦＰが含まれる。一般的に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３、および６）でアミノ酸置換を行うことによって変えられる可能性がある。よって、一部の実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は天然に存在せず、例えば、選択された標的部位と結合するように工学的に作製されている。例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637；Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。これらの全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＤＮＡ切断ドメインに融合して、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および工学的に作製されていても、または工学的に作製されていなくてもよい１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。一部の実施形態では、切断ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼであるＦｏｋ Ｉに由来する。Ｆｏｋ Ｉは、一般に、一方の鎖にあるその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方鎖にあるその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号、ならびにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887；Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]を参照されたい。
一部の実施形態では、ＺＦＮは、標的細胞内に存在する遺伝子を標的とする。一部の態様では、ＺＦＮは、例えば、遺伝子のコード領域内の所定の部位で、二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的に生じる。標的とされる典型的な領域には、エクソン、Ｎ末端領域をコードする領域、第１のエクソン、第２のエクソン、およびプロモーターまたはエンハンサー領域が含まれる。一部の実施形態では、ＺＦＮの一過的発現は、標的細胞の標的遺伝子の高度に効率的かつ永続的な破壊を促進する。特に、一部の実施形態では、ＺＦＮの送達によって、５０％を超える効率で遺伝子の永続的破壊がもたらされる。
多くの遺伝子特異的に工学的に作製されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と協力して、ジンクフィンガー構築に関するプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、研究者がジンクフィンガーの構築および検証を完全に回避することを可能にし、何千ものタンパク質に関して特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供する。Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405。一部の実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるか、またはカスタム仕様にされる。（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＣＳＴＺＦＮＤ、ＣＳＴＺＦＮ、ＣＴＩ１－１ＫＴ、およびＰＺＤ００２０を参照されたい）。
ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮ
一部の実施形態では、カーゴ分子は、例えば、転写アクチベーター様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質におけるように、天然に存在するかまたは工学的に作製された（天然に存在しない）転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含み、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＡＬＥは、１つまたは複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥのその同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、一般に、３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくとも一部の配列相同性を示す。各ＴＡＬＥリピート単位は、一般に、このリピートの１２位および／または１３位に、リピート可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を構成する１個または２個のＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識に関する天然の（カノニカル）コードを、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴ、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合し、非カノニカル（非典型的）ＲＶＤも公知であるように決定した。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。一部の実施形態では、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に対する特異性を有するＴＡＬアレイの設計によって、いずれかの遺伝子に対して標的化され得る。標的配列は、一般に、チミジンで始まる。
一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。一部の態様では、ＴＡＬＥＮは、核酸標的配列を切断するためのＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子内の標的配列に結合するように工学的に作製されている。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、遺伝子内の標的配列を認識および切断する。一部の態様では、ＤＮＡの切断によって、二本鎖の切断がもたらされる。一部の態様では、この切断は、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般に、ＮＨＥＪは、ＤＮＡ配列の切断部位に変化をもたらすことの多い不完全な修復プロセスである。一部の態様では、修復メカニズムは、直接的な再ライゲーション（Critchlow and Jackson, Trends Biochem Sci. 1998 Oct;23(10):394-8）による、またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合による、２つのＤＮＡ末端の残っている部分の再結合に関与する。一部の実施形態では、ＮＨＥＪによる修復は、小さな挿入または欠失をもたらし、これを使用して遺伝子を破壊し、それにより抑制することができる。一部の実施形態では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加であり得る。一部の態様では、切断に誘導される突然変異誘発事象、すなわちＮＨＥＪ事象に連続する突然変異誘発事象が起こった細胞は、当技術分野で周知の方法によって同定および／または選択することができる。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥリピートをアセンブルして、遺伝子を特異的に標的とする。（Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405）。１８，７４０個のヒトのタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリーを構築した（Kim et al., Nature Biotechnology. 31, 251-258 (2013)）。カスタム仕様のＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）から市販されている。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、１つまたは複数のプラスミドベクターによってコードされた導入遺伝子として導入される。一部の態様では、プラスミドベクターは、前記ベクターを受容した細胞の同定および／または選択をもたらす選択マーカーを含有することができる。
ドナー核酸
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ドナー核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ドナー核酸は、例えばＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてのＣＲＩＳＰＲ酵素によってニックを入れられるまたは切断される標的配列内またはその付近での相同組換えの鋳型として機能するように設計される。ドナー核酸は、例えば、約１０個または約１０個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、約７５個または約７５個よりも多く、約１００個または約１００個よりも多く、約１５０個または約１５０個よりも多く、約２００個または約２００個よりも多く、約５００個または約５００個よりも多く、約１０００個または約１０００個よりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さなどの任意の適切な長さのものであってよい。一部の実施形態では、ドナー核酸は、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、ドナー核酸と標的配列を含むポリヌクレオチドを最適にアラインメントした場合、ドナー核酸は、標的配列の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、約１個または約１個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約３０個または約３０個よりも多く、約３５個または約３５個よりも多く、約４０個または約４０個よりも多く、約４５個または約４５個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、約６０個または約６０個よりも多く、約７０個または約７０個よりも多く、約８０個または約８０個よりも多く、約９０個または約９０個よりも多く、約１００個または約１００個よりも多くまたはそれよりも多くのヌクレオチド）と重複する。一部の実施形態では、ドナー核酸と標的配列を含むポリヌクレオチドを最適にアラインメントした場合、相補性の領域内のドナー核酸の最も近くのヌクレオチドは、標的配列から約１ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、７５ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内、５００ヌクレオチド以内、１０００ヌクレオチド以内、５０００ヌクレオチド以内、１００００ヌクレオチド以内、またはそれよりも多くのヌクレオチド以内である。
ＫＲＡＳのＲＮＡｉ標的化突然変異体
一部の態様では、カーゴは、ＫＲＡＳの突然変異形態を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に対する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、または６１に対する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋから選択される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、配列番号２２８～２３４からなる群から選択される。
改変
一部の実施形態では、本明細書に記載されているゲノム編集複合体またはナノ粒子は、標的化部分を含み、標的化部分は、細胞特異的標的化および／または核標的化の可能なリガンドである。細胞膜表面受容体および／または細胞表面マーカーは、前記リガンドに高い親和性、好ましくは高い特異性で結合することができる分子または構造である。前記細胞膜表面受容体および／または細胞表面マーカーは、好ましくは特定の細胞に対して特異的であり、すなわち、これは、一種の細胞において別の細胞種におけるよりも優勢に見いだされる（例えば、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするガラクトシル残基）。細胞膜表面受容体は、細胞標的化およびリガンドの標的細胞（例えば、標的化部分）および結合分子（例えば、本出願の複合体またはナノ粒子）への内在化を促進する。本出願の文脈において使用することができる多数のリガンド部分／リガンド結合パートナーは、文献において広く記載されている。このようなリガンド部分は、本出願の複合体またはナノ粒子に所与の結合パートナー分子または少なくとも１つの標的細胞の表面に局在化したあるクラスの結合パートナー分子と結合する能力を付与することができる。適切な結合パートナー分子としては、限定されないが、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原エピトープおよび腫瘍関連マーカーからなる群から選択されるポリペプチドが挙げられる。さらに、結合パートナー分子は、例えば、１つまたは複数の糖、脂質、糖脂質、抗体分子もしくはその断片、またはアプタマーからなり得る、またはそれらを含み得る。本出願によれば、リガンド部分は、例えば、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＴ）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチンの全てもしくはその一部、ポリペプチドの全てもしくはその一部、例えばＪＴＳ１（ＷＯ９４／４０９５８）など、抗体もしくはその断片、またはこれらの組合せであってもよい。一部の実施形態では、本出願において使用されるリガンド部分は、最小で７アミノ酸長を有するペプチドまたはポリペプチドである。これは、ネイティブなポリペプチドまたはネイティブなポリペプチド由来のポリペプチドのいずれかである。「由来する」は、（ａ）ネイティブな配列に関する１つもしくは複数の改変（例えば、１つまたは複数の残基の付加、欠失および／または置換）、（ｂ）天然に存在しないアミノ酸を含むアミノ酸類似体、（ｃ）置換された連結、または（ｄ）当技術分野で公知の他の改変を含有することを意味する。リガンド部分としての役割を果たすポリペプチドは、例えば、マウス抗体の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を組み合わせるヒト化抗体などの種々の起源の配列を融合させることによって得られたバリアントおよびキメラポリペプチドを包含する。さらに、このようなポリペプチドは、直鎖状または環化構造（例えば、ポリペプチドリガンドの両末端をシステイン残基で挟むことによって）を有し得る。さらに、リガンド部分として使用するポリペプチドは、化学的部分の置換または付加（例えば、グリコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化、スルフヒドリル基などの付加）によるその元の構造の改変を含み得る。本出願は、リガンド部分を検出可能にする改変をさらに企図する。このために、検出可能な部分を有する改変を予想することができる（すなわち、シンチグラフィー標識、放射性標識、または蛍光部分標識、または色素標識など）。このような検出可能な標識は、任意の従来の技法によってリガンド部分に結合することができ、診断目的で（例えば、腫瘍細胞のイメージング）使用することができる。一部の実施形態では、結合パートナー分子は、抗原（例えば、標的細胞特異的抗原、疾患特異的抗原、工学的に作製された標的細胞の表面で特異的に発現される抗原）であり、リガンド部分は、免疫学のマニュアル（例えば、Immunology, third edition 1993, Roitt, Brostoff and Male, ed Gambli, Mosbyを参照されたい）に詳細に記載されたものなどの抗体、その断片または最小認識単位（例えば、抗原特異性を依然として提示する断片）である。リガンド部分は、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗原の多くに結合する多くのモノクローナル抗体は既に公知であり、モノクローナル抗体技術に関して当技術分野で公知の技法を使用して、ほとんどの抗原の抗体を調製することができる。リガンド部分は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）または合成抗体断片（例えば、ＳｃＦｖ）であってもよい。一部の実施形態では、リガンド部分は、全抗体ではなく、抗体断片の中で選択される。全抗体の有効な機能、例えば、相補的結合は除去される。ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、１つまたは複数の他のポリペプチドとの融合体として発現され得る。最小認識単位は、Ｆｖ断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つまたは複数の配列に由来し得る。全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」によって、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することが意味される。対照的に、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片および最小認識単位は、１つの抗原結合部位のみを有する一価である。一部の実施形態では、リガンド部分は、腫瘍細胞への標的化を可能にし、腫瘍の状態に関連する分子、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍細胞において差次的もしくは過剰に発現される細胞タンパク質、またはがん関連ウイルスの遺伝子産物を認識し、それに結合することができる。腫瘍特異的抗原の例としては、これだけに限定されないが、乳がんに関するＭＵＣ－１（Hareuven i et al., 990, Eur. J. Biochem 189, 475-486）、乳がんおよび卵巣がんに関する突然変異したＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子によってコードされている産物（Miki et al, 1994, Science 226, 66-7 1；Fuireal et al, 1994, Science 226, 120- 122；Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792）、結腸がんに関するＡＰＣ（Poiakis, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 66-71）、前立腺がんに関する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（Stamey et al., 1987, New England J. Med. 317, 909）、結腸がんに関する癌胎児抗原（ＣＥＡ）（Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748）、黒色腫に関するチロシナーゼ（Vile et al, 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864）、黒色腫細胞において高度に発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）の受容体、乳がんおよび膵臓がんに関するＥｒｂＢ－２（Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175）、ならびに肝臓がんに関するアルファ－フェトプロテイン（Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 46 1-465）が挙げられる。一部の実施形態では、リガンド部分は、ＭＵＣ－１抗原を認識し、それに結合することができ、よって、ＭＵＣ－１陽性腫瘍細胞を標的とすることができる、抗体の断片である。一部の実施形態では、リガンド部分は、ＭＵＣ－１抗原のタンデムリピート領域を認識するＳＭ３モノクローナル抗体のｓｃＦｖ断片である（Burshell et al., 1987, Cancer Res. 47, 5476-5482；Girling et al., 1989, Int. J. Cancer 43, 1072-1076；Dokurno et al., 1998, J. Mol. Biol. 284, 713-728）。腫瘍細胞において差次的または過剰に発現される細胞タンパク質の例としては、これだけに限定されないが、一部のリンパ系腫瘍において過剰発現されるインターロイキン２（ＩＬ－２）に関する受容体、肺癌細胞、膵臓、前立腺および胃の腫瘍において過剰発現されるＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）（Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体、上皮増殖因子受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ４０受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ２７受容体、ＯＸ－４０、α－ｖインテグリン（Brooks et al, 994, Science 264, 569）、ならびにある特定の血管新生増殖因子に関する受容体（Hanahan, 1997, Science 277, 48）が挙げられる。これらの指標に基づいて、このようなタンパク質を認識し、それに結合することができる適切なリガンド部分を定義することは、当業者の技術の範囲内である。例を挙げて説明すると、ＩＬ－２は、ＴＬ－２受容体と結合するのに適切なリガンド部分である。線維症および炎症に特異的である受容体の場合には、これらは、ＴＧＦベータ受容体またはアデノシン受容体を含み、これらの受容体は、上文で確認され、本出願の組成物の適切な標的である。多発性骨髄腫の細胞表面マーカーは、これだけに限定されないが、ＣＤ５６、ＣＤ４０、ＦＧＦＲ３、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＲ、およびＣＤ３８を含み、本出願の組成物にとって適切な標的である。これらの細胞表面マーカーと結合する適切なリガンド部分としては、これだけに限定されないが、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４０、ＰＲＯ－００１、Ｃｈｉｒ－２５８、ＨｕＬｕｃ６３、抗ＣＤ１３８－ＤＭ１、抗ＩＧＦ１Ｒおよびベバシズマブが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、以下のものを含むがこれだけに限定されない、１つまたは複数の遺伝子を標的とするゲノム編集系の１つまたは複数の分子（例えば、全ゲノム編集系）を含む：アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ａｋｔ、ＡＬＫ、ＡＬＫ／Ｍｅｔ、アンギオポエチン受容体、アンギオテンシンＩＩ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＫ５、アレスチン、ＡＴＦ１、ＡＴＦ－２、Ｂ７－１、Ｂ７－ｈ１（ｐｄｌ－１）、β－カテニン、Ｂｃｌ－２、ＢＣＬ２Ｌ１２、Ｂｃｌ６、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＴＫ、カスパーゼ－２、カスパーゼ－９、ＣＣＬ２、ＣＣＮ１、Ｃｃｎｄ２、ＣＤＫ活性化キナーゼ、ＣＥＢＰＡ、Ｃｈｏｐ、ｃ－Ｊｕｎ、ｃ－Ｍｙｃ、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ１、ＣＳ１、ＣＴＧＦ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＸＣＲ４、サイクリンｄ１～２、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ１～１３）、ＤＥＰＴＯＲ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＰＣ４、ＥＢＯＶポリメラーゼＬ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ｅＩＦ５Ａ、Ｅｌｋ－１、ＥＲ、Ｅｒｂｂ４、ＥＲＫ、ＥＳＲ１、Ｅｔｓ１、ＥＷＳＲ１、ＦＡＫ、ＦＧＦ、ＦＧＦＲ、ＦＯＸＯ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体（ＦＺＤ－１～１０）、Ｆｙｎ、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰ／ｓＧＰ、ＧＳＫ、ＨＢＶ保存配列、ＨＤＡＣ、ＨＤＧＦ、ＨＤＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ヘキソキナーゼＩＩ、ＨＧＦ、ＨＧＦＲ、ＨＩＦ－１、ＨＩＦ－１α、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２、ＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡ、ＨＩＶ Ｔａｔ、ＨＬＡ－Ｂ７／ベータ２－ミクログロブリン、ＨＭＧＡ２、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、Ｈｓｐ２７、ＨＳＰ４７、ヒトＣＣＲ５、Ｉｄｈ１、Ｉｄｈ２、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ、ＩＫＫ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＮＫ４、インターフェロン－ガンマ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ４、ＪＡＫ、ＪＮＫ、ケラチン１６、ケラチン１７、ケラチンＫ６Ａ、ケラチンＫ６Ｂ、ＫＧＦＲ、ＫＬＦ６、ＫＲＡＳ、ＬＭＯ、ＬＭＯ１、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＬＯＸＬ２、ＬＰＬ、ＬＹＬ１、ＭＡＤＲ２、ＭＡＰＫ、Ｍａｘ、Ｍｃｌ－１、ＭＤＡ－７、ＭＤＭ２、ＭＤＲ－１、ＭＤＳ１－ＥＶＩ１、ＭＥＣＬ－１、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＭＫＫ、ＭＬＨ１、ＭＬＳＴ８、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＳＦＲ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩＮ１、ｍＴＯＲ、ＭＵＣ－１、変異型ＤＤＸ３Ｘ、ＭＹＣ、ＮＣＡＰ－Ｄ２、ＮＣＡＰ－Ｄ３、ＮＣＡＰ－Ｇ、ＮＣＡＰ－Ｇ２、ＮＣＡＰ－Ｈ、ＮＣＡＰ－Ｈ２、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＡＴ４、ＮＦ－κＢ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＰＣ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、ｐ５３、ＰＡＩ－１、ＰＡＲＰ－１、パッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＢＸ１、ＰＤＣＤ４、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＫ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＮ３、ＰＬＫ－１、ＰＭＬ、ＰＲ、ＰＲＡＳ４０、ＰＲＤＭ１６、Ｐｒｄｘ１およびＰｒｄｘ２（バーキットリンパ腫）、Ｐｒｅ－ｇｅｎ／Ｐｒｅ－Ｃ、Ｐｒｅ－Ｓ１、Ｐｒｅ－Ｓ２／Ｓ、ＰＴＣ、ＰＴＥＮ、Ｐｙｋ２、Ｒａｄ５１、ＲＡＦ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｂ、ＲＥＴ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＲＰＮ１３、ＲＲＭ２、ＲＳＶヌクレオカプシド、ＲＵＮＸ１、Ｓ６キナーゼ、Ｓａｐ１ａ、ＳＥＴＢＰ１、Ｓｈｃ、ＳＬＡＭＦ７、Ｓｍａｄ、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、ＳＭＣ－２、ＳＭＣ－４、スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）、ＳＯＸ９、ＳＰＡＲＣ、Ｓｐｒｙ２、Ｓｒｃ、β－２アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、β－グロビン、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ、サバイビン、Ｓｙｋ、Ｔａｌ、ＴＡＬ１、ＴＧＦＲ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＴＧＦβ受容体３、ＴＧＦβ１、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭＰ、ＴＮＦ－α、ＴＰ５３、トランスサイレチン、ＴＲＰＶ１、ユビキチンリガーゼ、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＨＬ、ＶＰ２４、ＶＰ３０、ＶＰ３５、ＶＰ４０、ｗｎｔ、ＷＴ１、ＷＴ２、ＸＢＰ１（スプライシングされたものおよびスプライシングされていないもの）、ＸＩＡＰ、およびＺＢＴＢ１６（これらの変異型（例えば、変異型ＰＴＥＮ、変異型ＫＲＡＳ、変異型ｐ５３など）を含む）。例えば、一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＲＧＥＮに基づくゲノム編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集系）の１つまたは複数の分子を含み、ＲＧＥＮに基づくゲノム編集系は、本明細書に記載の遺伝子のうちの１つを標的とするｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＺＦＮに基づくゲノム編集系の１つまたは複数の分子を含み、ＺＦＮは、本明細書に記載の遺伝子のうちの１つを標的とする。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＴＡＬＥＮに基づくゲノム編集系の１つまたは複数の分子を含み、ＴＡＬＥＮは、本明細書に記載の遺伝子のうちの１つを標的とする。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ホーミングエンドヌクレアーゼに基づくゲノム編集系の１つまたは複数の分子を含み、ホーミングエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載の遺伝子のうちの１つを標的とする。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、インテグラーゼに基づくゲノム編集系の１つまたは複数の分子を含み、インテグラーゼは、本明細書に記載の遺伝子のうちの１つを標的とする。
ナノ粒子
本出願は、一態様では、上記のゲノム編集複合体のいずれか１つまたは複数を含むコアを含むナノ粒子を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体を含むコアを含むナノ粒子であって、ゲノム編集送達複合体中の細胞透過性ペプチドが、カーゴと会合している、ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、会合は、共有結合によるものではない。一部の実施形態では、会合は、共有結合によるものである。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、末梢細胞透過性ペプチド（すなわち、ＣＰＰ）で構成される表層（例えば、殻）をさらに含み、殻によってコアがコーティングされている。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰは、コア内のＣＰＰと同じである。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰは、コア内のＣＰＰのいずれとも異なる。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰとしては、これだけに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－４、ＶＥＰＥＰ－５、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、末梢細胞透過性ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、表層内の末梢細胞透過性ペプチドの少なくとも一部が標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子のコアと表層の間の中間層をさらに含む。一部の実施形態では、中間層は、中間ＣＰＰを含む。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、コア内のＣＰＰと同じである。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、コア内のＣＰＰのいずれとも異なる。一部の実施形態では、中間ＣＰＰとしては、これだけに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に記載のガイドＲＮＡのいずれか１つなどの２つまたはそれより多くのガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くのガイドＲＮＡは、２つまたはそれより多くの異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの異なるＫＲＡＳ突然変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１２Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くのガイドＲＮＡは、同じゲノム編集複合体内に含有される。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くのガイドＲＮＡは、異なるゲノム編集複合体内に含有される。
一部の実施形態では、ナノ粒子のコアは、複数のゲノム編集複合体を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子のコアは、所定の比で存在する複数のゲノム編集複合体を含む。一部の実施形態では、所定の比は、以下により詳細に記載されている方法のいずれかにおいて、ナノ粒子の最も効果的な使用を可能にするように選択される。一部の実施形態では、ナノ粒子のコアは、１つもしくは複数の追加的なガイドＲＮＡ、１つもしくは複数の追加的な細胞透過性ペプチド、１つもしくは複数の追加的なゲノム編集ヌクレアーゼ、および／または１つもしくは複数の追加的なドナー核酸をさらに含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的なゲノム編集複合体は、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする少なくとも１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ａ）Ｇ１２Ｄを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｄを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第１のゲノム編集複合体、およびｂ）Ｇ１２Ｖを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｖを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第２のゲノム編集複合体を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ａ）Ｇ１２Ｄを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｄを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第１のゲノム編集複合体、およびｂ）Ｇ１２Ｃを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｃを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第２のゲノム編集複合体を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ａ）Ｇ１２Ｃを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｃを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第１のゲノム編集複合体、およびｂ）Ｇ１２Ｖを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｖを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第２のゲノム編集複合体を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ａ）Ｇ１２Ｄを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｄを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第１のゲノム編集複合体、ｂ）Ｇ１２Ｖを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｖを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第２のゲノム編集複合体、およびｃ）Ｇ１２Ｖを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＧ１２Ｖを標的とするガイドＲＮＡのいずれか１つ）を含む第２のゲノム編集複合体を含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数の追加的な細胞透過性ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な細胞透過性ペプチドとしては、これだけに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な細胞透過性ペプチドの少なくとも一部は、標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。
本明細書に記載のナノ粒子のいずれかに従った一部の実施形態では、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、例えば、約５０ｎｍから約８００ｎｍまで、約７５ｎｍから約６００ｎｍまで、約１００ｎｍから約６００ｎｍまで、および約２００ｎｍから約４００ｎｍまでを含めた、約２０ｎｍから約１０００ｎｍまでである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、約１０００ナノメートル（ｎｍ）以下、例えば、約９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下のいずれかである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約２００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約１５０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約１００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約２０ｎｍ～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約３０ｎｍ～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約４０ｎｍ～約３００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、滅菌濾過可能である。
一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約－３０ｍＶから約６０ｍＶまで（例えば、おおよそで、－３０ｍＶ、－２５ｍＶ、－２０ｍＶ、－１５ｍＶ、－１０ｍＶ、－５ｍＶ、０ｍＶ、５ｍＶ、１０ｍＶ、１５ｍＶ、２０ｍＶ、２５ｍＶ、３０ｍＶ、３５ｍＶ、４０ｍＶ、４５ｍＶ、５０ｍＶ、５５ｍＶ、および６０ｍＶのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、例えば、約－２５ｍＶから約２５ｍＶまで、約－２０ｍＶから約２０ｍＶまで、約－１５ｍＶから約１５ｍＶまで、約－１０ｍＶから約１０ｍＶまで、および約－５ｍＶから約１０ｍＶまでを含めた、約－３０ｍＶから約３０ｍＶまでである。一部の実施形態では、ナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、約０．０５から約０．６まで（例えば、おおよそで、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、および０．６のいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）。一部の実施形態では、ナノ粒子は、実質的に無毒性である。
組成物
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子ならびに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む医薬組成物である。
一部の実施形態では、組成物は、２種またはそれよりも多くのナノ粒子の混合物を含み、ここで、この２種またはそれよりも多くのナノ粒子は、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする異なるガイドＲＮＡを含む。例えば、一部の実施形態では、組成物は、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡを含む上記の第１のナノ粒子、およびｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡを含む第２のナノ粒子を含む。一部の実施形態では、組成物は、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡを含む上記の第１のナノ粒子、およびｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡを含む第２のナノ粒子を含む。一部の実施形態では、組成物は、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡを含む上記の第１のナノ粒子、およびｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡを含む第２のナノ粒子を含む。一部の実施形態では、組成物は、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを特異的に標的とする第１のガイドＲＮＡを含む上記の第１のナノ粒子、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡを含む第３のナノ粒子、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを特異的に標的とする第２のガイドＲＮＡを含む第２のナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子ならびに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む医薬組成物である。一部の実施形態では、組成物中の複合体またはナノ粒子の濃度は、例えば、約１０ｎＭから約５０ｍＭまで、約２５ｎＭから約２５ｍＭまで、約５０ｎＭから約１０ｍＭまで、約１００ｎＭから約１ｍＭまで、約５００ｎＭから約７５０μＭまで、約７５０ｎＭから約５００μＭまで、約１μＭから約２５０μＭまで、約１０μＭから約２００μＭまで、および約５０μＭから約１５０μＭまでを含めた、約１ｎＭから約１００ｍＭまでである。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥されたものである。
「薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むものとする。一般には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、連邦政府の規制当局、州政府、もしくは他の規制当局によって認可された、または米国薬局方もしくはヒトならびに非ヒト哺乳動物を含めた動物における使用に関して他の一般に認められている薬局方に収載されている希釈剤、賦形剤、および／または担体である。希釈剤、賦形剤、および／または「担体」という用語は、医薬組成物を共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬希釈剤、賦形剤、および／または担体は、滅菌された液体、例えば、水、および石油起源、動物起源、野菜起源または合成起源のものを含めた油などであり得る。水、生理食塩溶液および水性ブドウ糖およびグリセロール溶液を特に注射液用の液体希釈剤、賦形剤、および／または担体として使用することができる。適切な医薬希釈剤および／または賦形剤としては、凍結乾燥助剤を含め、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望であれば、組成物は、微量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、持続放出製剤などの形態をとり得る。適切な医薬希釈剤、賦形剤、および／または担体の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martinに記載されている。製剤は、投与形式に適するものであるべきである。妥当な希釈剤、賦形剤、および／または担体は当業者には明らかになり、また、主に投与経路に依存する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子を含む組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、組成物中のゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集のレベルおよび／または組成物中のゲノム編集複合体もしくはナノ粒子によって媒介される細胞内送達の効率に影響を及ぼす。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体によって媒介される凝集および／または送達効率に対する影響の程度および／または方向は、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体の相対量に依存する。
例えば、一部の実施形態では、組成物中に薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体（例えば、塩、糖、化学緩衝剤、緩衝液、細胞培養培地、または担体タンパク質）が１つまたは複数の濃度で存在することは、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＮａＣｌを含めた、塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、スクロース、グルコース、およびマンニトールを含めた、糖である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＨＥＰＥＳを含めた、化学緩衝剤である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＰＢＳを含めた、緩衝液である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＤＭＥＭを含めた、細胞培養培地である。粒子サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によるものなどの、粒子サイズを測定するための当技術分野で公知の任意の手段を使用して決定することができる。例えば、一部の実施形態では、ＤＬＳによって測定されたＺ－平均がゲノム編集複合体またはナノ粒子のＤＬＳによって測定されたＺ－平均よりも１０％大きい凝集体は、ゲノム編集複合体またはナノ粒子よりも１０％大きい。
一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％（例えば、多くとも、おおよそで、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約７５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物中の塩の濃度は、約１００ｍＭ以下（例えば、おおよそで、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、または１ｍＭ以下のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。
一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２５％（例えば、多くとも、おおよそで、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約７５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物中の糖の濃度は、約２０％以下（例えば、おおよそで、１８％以下、１６％以下、１４％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、糖は、スクロースである。一部の実施形態では、糖は、グルコースである。一部の実施形態では、糖は、マンニトールである。
一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％（例えば、多くとも、おおよそで、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約７．５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約３％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集の形成を促進せず、かつ／またはそれに寄与しない濃度で含む。一部の実施形態では、化学緩衝剤は、ＨＥＰＥＳである。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳを、ＨＥＰＥＳを含む緩衝液の形態で組成物に添加する。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳを含む溶液のｐＨは、約５から約９の間（例えば、おおよそで、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、および９のいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、組成物は、ＨＥＰＥＳを、約７５ｍＭ以下（例えば、おおよそで、７０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５５ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下またはそれ未満のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）の濃度で含む。一部の実施形態では、化学緩衝剤は、リン酸である。一部の実施形態では、リン酸を、リン酸を含む緩衝液の形態で組成物に添加する。一部の実施形態では、組成物は、ＰＢＳを含まない。
一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭである。一部の実施形態では、組成物は、ＤＭＥＭを、約７０％以下（例えば、おおよそで、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、またはそれ未満のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）の濃度で含む。
一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２５％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、ゲノム編集複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するゲノム編集複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、担体タンパク質は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物を、静脈内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、局部投与、眼内投与、点眼投与、門脈内投与、頭蓋内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、小胞内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、気管内投与、肺への投与、腔内投与、もしくは経口投与用、または噴霧（ＮＢ）もしくは気管内滴下注入用に製剤化する。
例示的な投薬頻度としては、これだけに限定されないが、３日に１回以下が挙げられる。
調製方法
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子を調製する方法が提供される。
一部の実施形態では、上記のペプチドおよびカーゴ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）を含むゲノム編集複合体を調製する方法であって、ペプチドをカーゴ分子と組み合わせ、それにより、ゲノム編集複合体を形成するステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、上記の通り第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドを含むゲノム編集複合体を調製する方法であって、ａ）第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドとを組み合わせ、それにより、ペプチド混合物を形成するステップと、ｂ）ペプチド混合物をカーゴと組み合わせ、それにより、ゲノム編集複合体を形成するステップとを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、ペプチドまたはペプチド混合物とカーゴ分子をそれぞれ約１：１から約１００：１まで（例えば、およそ約１：１から約５０：１、例えば、約２：１から約５０：１までの間）のモル比で組み合わせる。
一部の実施形態では、方法は、カーゴ分子を含む第１の溶液をペプチドまたはペプチド混合物を含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップを含み、ここで、第３の溶液は、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むまたはそれを含むように調整され、第３の溶液をインキュベートしてゲノム編集複合体を形成させる。一部の実施形態では、第１の溶液は、滅菌水中のカーゴを含み、かつ／または、第２の溶液は、滅菌水中のペプチドまたはペプチド混合物を含む。一部の実施形態では、第３の溶液を、インキュベートしてゲノム編集複合体を形成した後に、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整する。
一部の実施形態では、方法は、ゲノム編集複合体をポアサイズの膜を通して濾過する濾過プロセスをさらに含む。一部の実施形態では、ポアの直径は、少なくとも約０．１μｍ（例えば、少なくとも約０．１μｍ、０．１５μｍ、０．２μｍ、０．２５μｍ、０．３μｍ、０．３５μｍ、０．４μｍ、０．４５μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．１μｍまたは１．２μｍなど）である。一部の実施形態では、ポアの直径は、約１．２μｍ以下、１．０μｍ以下、０．８μｍ以下、０．６μｍ以下、０．５μｍ以下、０．４５μｍ以下、０．４μｍ以下、０．３５μｍ以下、０．３μｍ以下、または０．２５μｍ以下である。一部の実施形態では、ポートの直径は、約０．１μｍ～約１．２μｍ（例えば、約０．１～約０．８μｍ、約０．２～約０．５μｍなど）である。
一部の実施形態では、本出願のカーゴ分子送達複合体またはナノ粒子を含む安定な組成物に関して、複合体またはナノ粒子の平均直径は約１０％よりも大きくは変化せず、また、多分散指数は約１０％よりも大きくは変化しない。
本明細書に記載の細胞透過性ペプチドを含むペプチドのいずれかの調製方法も提供される。
使用方法（例えば、処置方法）
本出願は、一態様では、個体における疾患（例えば、がん）を処置する方法であって、個体に上記のガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体またはナノ粒子を投与するステップを含む方法を提供する。本出願は、別の態様では、細胞における突然変異したＫＲＡＳを改変する方法であって、細胞を上記のガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、個体におけるがん（例えば、膵がん、結腸直腸がんまたは肺がん）を処置する方法であって、個体に、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む、突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体またはナノ粒子を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、個体に静脈内に投与される。
一部の実施形態では、細胞における突然変異したＫＲＡＳを改変する方法であって、細胞を、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む、突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１、３、４、および６～８からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、および８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１９からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的）なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３４に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。
一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、第１の細胞透過性ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、炭水化物部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ）をさらに含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１３５～１７５、２５９～２６０、および２６７～２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドは、配列番号１１８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対するモル比は、約１：１から約８０：１の間（例えば、約５：１から約２０：１の間、例えば、約２：１から約５０：１の間）である。一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のガイドＲＮＡに対するモル比は、約１：１０から約５０：１の間（例えば、約１：１から約１０：１の間）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異を有するがんを処置する方法であって、配列番号１～１４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、配列番号１、３、４、および６～８からなる群から選択される標的配列。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、および８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、組成物は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を有するがんを処置する方法であって、配列番号１５～２８からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１９からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、組成物は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異を有するがんを処置する方法であって、配列番号２９～３７からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３４に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、組成物は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異を有するがんを処置する方法であって、ａ）配列番号１～１４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ、およびｂ）細胞透過性ペプチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、配列番号１、３、４、および６～８からなる群から選択される標的配列。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、および８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を有するがんを処置する方法であって、配列番号１５～２８からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ、およびｂ）細胞透過性ペプチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１９からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異を有するがんを処置する方法であって、配列番号２９～３７からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ、およびｂ）細胞透過性ペプチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３４に記載されている。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異を有するがんを処置する方法であって、ａ）配列番号１～１４からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ、ｂ）細胞透過性ペプチド、およびｃ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、配列番号１、３、４、および６～８からなる群から選択される標的配列。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、および８からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３に記載されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、改変されたＣａｓ９（例えば、触媒的に損なわれたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、塩基編集またはプライム編集を可能にする第２の酵素をさらに含む。一部の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を有するがんを処置する方法であって、ａ）配列番号１５～２８からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ、ｂ）細胞透過性ペプチド、およびｃ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１９からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、改変されたＣａｓ９（例えば、触媒的に損なわれたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、塩基編集またはプライム編集を可能にする第２の酵素をさらに含む。一部の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異を有するがんを処置する方法であって、ａ）配列番号２９～３７からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ、ｂ）細胞透過性ペプチド、およびｃ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３４に記載されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、改変されたＣａｓ９（例えば、触媒的に損なわれたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、塩基編集またはプライム編集を可能にする第２の酵素をさらに含む。一部の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異を有するがんを処置する方法であって、ａ）配列番号１、３、４、および６～８（例えば、配列番号３、６、および８）からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ；ｂ）配列番号８９、９２～１０３、１０５～１０７、１１２～１１４、１３７～１３８、１５４～１５５、１５７～１５８、１６２、１６７、１７０および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチド、ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３に記載されているアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、改変されたＣａｓ９（例えば、触媒的に損なわれたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、塩基編集またはプライム編集を可能にする第２の酵素をさらに含む。一部の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を有するがんを処置する方法であって、ａ）配列番号１５、１６、１９～２１、および２３からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ；ｂ）配列番号８９、９２～１０３、１０５～１０７、１１２～１１４、１３７～１３８、１５４～１５５、１５７～１５８、１６２、１６７、１７０および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチド、ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１９に記載されているアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、改変されたＣａｓ９（例えば、触媒的に損なわれたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、塩基編集またはプライム編集を可能にする第２の酵素をさらに含む。一部の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異を有するがんを処置する方法であって、ａ）配列番号２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ；ｂ）配列番号８９、９２～１０３、１０５～１０７、１１２～１１４、１３７～１３８、１５４～１５５、１５７～１５８、１６２、１６７、１７０および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチド、ならびにｃ）ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集複合体を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３４に記載されているアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、改変されたＣａｓ９（例えば、触媒的に損なわれたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、塩基編集またはプライム編集を可能にする第２の酵素をさらに含む。一部の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。
一部の実施形態では、心臓における疾患または状態を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１４、１５３、１５４、９６、１００、および１０１のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、脳における疾患または状態（例えば、脳腫瘍）を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９７、１１２、および１１３のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、筋肉における疾患または状態を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９５、９８、１１４、１００、および１０１のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、肺における疾患または状態（例えば、肺がん）を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号８９、９０、９２～９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０５～１０７、１１３、１３７、１３８、１５３～１５５、１５７、１５８、１６２、１６４、１６７、および１７０のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、肝臓における疾患または状態（例えば、肝臓がん）を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号８９、９０、９５、９６、９８、１１２、１３７、１３８、１５３～１５５、１５７、１５８、１７２、１６４、１５３、１６２、１６７、１００、および１０１のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号８９、９０、９５、９８、１１２、１３７、１３８、１５３～１５５、１５７、１５８、および１７２のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、腎臓における疾患または状態（例えば、腎臓がん）を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号８９、９０、９３、９６～９８、１３７、１００、１０１、１３８、１５４、１５５、および１７２のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９３、９７、９８、１３７、１００、１０１、１３８、１５４、および１５５のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、膵臓における疾患または状態（例えば、膵臓がん）を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９８、９９、１３７、１３８、１５３、１５４、１５５、および１６２のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９８、９９、１３７、１３８、１５３、１５４、および１５５のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、脾臓における疾患または状態を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９３、１５３、１５４、および１５８のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９３および１５８のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態は、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、腫瘍（例えば、固形腫瘍）における疾患または状態を処置する方法であって、ａ）細胞透過性ペプチド、ならびにｂ）ガイドＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレアーゼもしくはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むゲノム編集複合体を含む組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９４、９６、９８～１０１、１０５～１０７、１５３、１５４、１６２、１６４、１６７、および１７０のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号９４、９６、９８～１０１、１０５～１０７、１６２、１６４、１６７、および１７０のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体は、静脈内、筋肉内、皮下に、または噴霧もしくは気管内滴下注入を介して投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ突然変異（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１２Ｃ突然変異）を標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的）または１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１、３、４、６～８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、６、８、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含むガイドＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変されている。一部の実施形態では、ＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａポリヌクレオチドである。
ＫＲＡＳ異常
一部の実施形態では、がん組織は、ＫＲＡＳ異常を有する。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、コドン１２に対する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、およびＧ１２Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄおよび／またはＧ１２Ｖである。
ＫＲＡＳの遺伝子異常は、試料、例えば、個体由来の試料および／または参照試料に基づいて評価することができる。一部の実施形態では、試料は、組織試料または組織試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、細胞試料（例えば、ＣＴＣ試料）または細胞試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、腫瘍生検である。一部の実施形態では、試料は、腫瘍試料または腫瘍試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、生検試料または生検試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料またはＦＦＰＥ試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、血液試料である。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡが、血液試料から単離される。一部の実施形態では、生体試料は、血漿試料または血漿試料から抽出された核酸である。
ＫＲＡＳの遺伝子異常は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。例えば、Dickson et al. Int. J. Cancer, 2013, 132(7): 1711-1717；Wagle N. Cancer Discovery, 2014, 4:546-553；およびCancer Genome Atlas Research Network. Nature 2013, 499: 43-49を参照されたい。例示的な方法としては、これだけに限定されないが、ゲノムＤＮＡ配列決定、バイサルファイト配列決定またはＳａｎｇｅｒ配列決定もしくは次世代配列決定プラットフォームを使用する他のＤＮＡ配列決定に基づく方法；ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ；ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ；およびＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。個体から単離された試料由来の１つまたは複数の遺伝子のエピジェネティック特色（例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストン結合、またはクロマチン改変）は、対照試料由来の１つまたは複数の遺伝子のエピジェネティック特色と比較され得る。試料から抽出された核酸分子は、参照配列、例えば、ＫＲＡＳの野生型配列と比較した遺伝子異常の存在について配列決定または分析され得る。
一部の実施形態では、ＫＲＡＳの遺伝子異常は、無細胞ＤＮＡ配列決定法を使用して評価される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの遺伝子異常は、次世代配列決定を使用して評価される。一部の実施形態では、血液試料から単離されたＫＲＡＳの遺伝子異常は、次世代配列決定を使用して評価される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの遺伝子異常は、エクソーム配列決定を使用して評価される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの遺伝子異常は、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を使用して評価される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの遺伝子異常は、本明細書に記載の処置方法の開始前に評価される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの遺伝子異常は、本明細書に記載の処置方法の開始後に評価される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの遺伝子異常は、本明細書に記載の処置方法の開始の前および後に評価される。ＫＲＡＳの異常なレベルは、異常な発現レベルまたは異常な活性レベルを指し得る。
疾患（例えば、がん）
一部の実施形態では、疾患は、がんである。一部の実施形態では、疾患は、骨髄異形成症候群である。
一部の実施形態では、がんは、白血病またはリンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
一部の実施形態では、固形腫瘍としては、これだけに限定されないが、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、子宮サクロノーマ滑膜腫（ｕｔｅｒｉｎｅ ｓａｃｒｏｎｏｍａｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏枝神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などが挙げられる。
一部の実施形態では、疾患は、骨髄異形成症候群、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ、小細胞肺がん、扁平上皮肺がん）、結腸直腸がん、急性骨髄性白血病、膵がん、直腸がん、食道扁平上皮癌、消化管間質腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、膵管腺癌、多発性骨髄腫、および神経膠腫からなる群から選択される。
一部の実施形態では、がんは、膵がん（例えば、膵管腺癌）である。
一部の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。
一部の実施形態では、がんは、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）である。
一部の実施形態では、がんは、悪性および／または進行がんである。
併用療法
個体における上で議論した疾患（例えば、がん）を処置するための併用療法であって、ａ）個体に本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子を投与するステップと、ｂ）個体に第２の薬剤または治療を投与するステップとを含む併用療法もまた、本明細書で提供される。本明細書に記載の第２の薬剤は、疾患を処置するために有用な任意の薬物療法または治療（例えば、疾患に対する標準的治療）であり得る。一部の実施形態では、第２の薬剤は、化学療法剤を含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、タキサンを含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、細胞毒性ヌクレオシドアナログを含む。
一部の実施形態では、個体におけるがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、ａ）個体に、本明細書に記載のガイドＲＮＡを有効量で含むゲノム編集複合体またはナノ粒子を投与するステップと、ｂ）個体に、ゲムシタビン、５－ＦＵ、オキサリプラチン、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、アルブミン結合パクリタキセル（例えば、アブラキサン））、カペシタビン（例えば、ゼローダ）、シスプラチン、イリノテカン（例えば、カンプトサル（ｃａｍｐｔｏｓａｒ））、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ）、ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパリブ）、ＮＴＲＫ阻害剤（例えば、ラロトレクチニブ、例えば、エヌトレクチニブ）、およびチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１阻害剤、例えば、ペムブロリズマブ）からなる群から選択される第２の薬剤を有効量で投与するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、第２の薬剤は、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、アルブミン結合パクリタキセル（例えば、アブラキサン））である。一部の実施形態では、第２の薬剤は、アブラキサンである。一部の実施形態では、アブラキサンは、１週間に約１回の頻度で投与される。一部の実施形態では、アブラキサンは、ヒトに約５～２５ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態では、第２の薬剤は、カペシタビン（例えば、ゼローダ）である。一部の実施形態では、カペシタビンは、１週間に約１回の頻度で投与される。一部の実施形態では、カペシタビンは、ヒトに約２５～１００ｍｇの用量で投与される。
一部の実施形態では、個体におけるがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、ａ）個体に、本明細書に記載のガイドＲＮＡを有効量で含むゲノム編集複合体またはナノ粒子を投与するステップと、ｂ）個体に、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）と担体タンパク質（例えば、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン）とを含むナノ粒子組成物を有効量で投与するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がん組織は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を有する。一部の実施形態では、タキサンは、パクリタキセルである。一部の実施形態では、他の薬剤は、ｎａｂ－パクリタキセルである。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。一部の実施形態では、他の薬剤は、ｎａｂ－ラパマイシンである。一部の実施形態では、方法は、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）でコーティングされる。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）とタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）との重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）における各投与のためのナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体におけるがん（例えば、結腸直腸がん）を処置する方法であって、ａ）個体に、本明細書に記載のガイドＲＮＡを有効量で含むゲノム編集複合体またはナノ粒子を投与するステップと、ｂ）個体に、５－ＦＵ、カペシタビン、イリノテカン、オキサリプラチン、トリフルリジン（trifluridein）とチピラシルとの組合せ、血管新生阻害剤（例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲアンタゴニスト、例えば、ベバシズマブ、例えば、ラムシルマブ、例えば、アフリベルセプト）、ならびにチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４阻害剤、例えば、ペムブロリズマブ、例えば、ニボルマブ、例えば、イピリムマブ（lpilimumab））からなる群から選択される第２の薬剤を有効量で投与するステップとを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、個体におけるがん（例えば、結腸直腸がん）を処置する方法であって、ａ）個体に、本明細書に記載のガイドＲＮＡを有効量で含むゲノム編集複合体またはナノ粒子を投与するステップと、ｂ）個体に、細胞毒性ヌクレオシドアナログ（例えば、カペシタビンまたはそのアナログ）を有効量で投与するステップとを含む方法が提供される。「生理的条件下で容易に加水分解可能なラジカル」を含む一連のカペシタビンアナログは、Ｆｕｊｉｕら（米国特許第４，９６６，８９１号）によって特許請求されており、参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｕｊｉｕによって記載されたシリーズには、５’－デオキシ－５－フルオロシチジンのＮ４アルキルおよびアラルキルカルバメートが含まれ、これらの化合物が、通常の生理的条件下での加水分解によって活性化されて、５’－デオキシ－５－フルオロシチジンを提供することが含意される。一部の実施形態では、がん組織は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異を有する。一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）における各投与のためのカペシタビンの用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）における各投与のためのナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）における各投与のためのガイドＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）における各投与のためのガイドＲＮＡの用量は、約０．０１ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２～約１００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２）である。
一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）における各投与のためのＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするポリヌクレオチドの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）における各投与のためのＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするポリヌクレオチドの用量は、約０．０１ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２～約１００ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２）である。
併用療法の投薬およびその投与方法
一部の実施形態では、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療は、同時に投与される。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療は、順次投与される。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療は、同時発生的に投与される。
ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療の投薬頻度は、投与する医師の判断に基づいて、処置の過程にわたって調整され得る。別々に投与される場合、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療は、異なる投薬頻度または間隔で投与され得る。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療の持続連続放出製剤が使用され得る。持続放出を達成するための種々の製剤およびデバイスは、当技術分野で公知である。本明細書に記載の投与構成の組合せもまた使用され得る。
一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子組成物は、１週間に約２回から２週間に約１回（例えば、１週間に約１回）の頻度で個体に投与される。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子組成物は、個体に少なくとも２回投与される。
ゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与され得る。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体または第２の薬剤／治療は、静脈内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、局部投与、眼内投与、点眼投与、門脈内投与、頭蓋内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、小胞内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、気管内投与、肺への投与、腔内投与、もしくは経口投与、または噴霧（ＮＢ）もしくは気管内滴下注入のいずれかによって、個体に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療を、全身または局部投与のために製剤化する。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体もしくはナノ粒子組成物および／または第２の薬剤／治療を、静脈内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、局部投与、眼内投与、点眼投与、門脈内投与、頭蓋内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、小胞内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、気管内投与、肺への投与、腔内投与、もしくは経口投与用、または噴霧（ＮＢ）もしくは気管内滴下注入用に製剤化する。
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象の処置のためのカーゴ中のガイドＲＮＡまたは総核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、およびＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）の投薬量は、各投与について約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。一部の実施形態では、カーゴ中のガイドＲＮＡまたは総核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、およびＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）の例示的な投薬量は、個体における各投与について、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０４ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象の処置のためのカーゴ中のガイドＲＮＡまたは総核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、およびＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）の投薬量は、各投与について約０．０１ｍｇ／ｍ２～約１０００ｍｇ／ｍ２の範囲内である。一部の実施形態では、カーゴ中のガイドＲＮＡまたは総核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、およびＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）の例示的な投薬量は、個体における各投与について、約０．０１ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２～約５ｍｇ／ｍ２、約０．５ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の例示的な有効量としては、これだけに限定されないが、各投与について、約１ｍｇ／ｍ２～１５０ｍｇ／ｍ２のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）が挙げられる。一部の実施形態では、タキサンまたはｍＴＯＲ阻害剤を含むナノ粒子組成物の投薬頻度は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、および１１回にわたって、２日に１回である。一部の実施形態では、投薬頻度は、５回にわたって、２日に１回である。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、少なくとも１０日間の期間にわたって投与され、ここで、各投与間の間隔は、約２日間以下であり、各投与におけるタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、２８日サイクルの１日目、８日目、および１５日目に投与され、各投与におけるタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、２８日サイクルの１日目、８日目、および１５日目に、３０分間にわたって静脈内に投与され、各投与におけるタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、タキサンは、パクリタキセルである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の投薬量は、毎週のスケジュールで与えられる場合、５～１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、８０～１５０ｍｇ／ｍ２、例えば、１００～１２０ｍｇ／ｍ２）の範囲内であり得る。ナノ粒子組成物（例えば、パクリタキセル／アルブミンナノ粒子組成物）の投与のための他の例示的な投薬スケジュールとしては、これだけに限定されないが、中断なしに毎週１００ｍｇ／ｍ２；４週間のうち３週間、毎週７５ｍｇ／ｍ２；４週間のうち３週間、毎週１００ｍｇ／ｍ２；４週間のうち３週間、毎週１２５ｍｇ／ｍ２；３週間のうち２週間、毎週１２５ｍｇ／ｍ２；中断なしに毎週１３０ｍｇ／ｍ２；および１週間に２回２０～１５０ｍｇ／ｍ２が挙げられる。組成物の投薬頻度は、投与する医師の判断に基づいて、処置の過程にわたって調整され得る。一部の実施形態では、個体は、少なくとも約１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の処置サイクルのいずれかにわたって処置される。ナノ粒子組成物中のタキサン（一部の実施形態では、パクリタキセル）の他の例示的な用量としては、これだけに限定されないが、約５０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２、および１５０ｍｇ／ｍ２のいずれかが挙げられる。例えば、ナノ粒子組成物中のパクリタキセルの投薬量は、毎週のスケジュールで与えられる場合、約５０～１５０ｍｇ／ｍ２の範囲内であり得る。
ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療の例示的な投薬頻度としては、これだけに限定されないが、中断なしに毎週；４週間のうち３週間、毎週；３週間に１回；２週間に１回；３週間のうち２週間、毎週が挙げられる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療は、おおよそで、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、または８週間に１回投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療は、１週間に少なくとも約１回、２回、３回、４回、５回、６回、または７回（即ち、毎日）のいずれかで投与される。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約６か月間未満、３か月間未満、１か月間未満、２０日間未満、１５、日間未満、１２日間未満、１０日間未満、９日間未満、８日間未満、７日間未満、６日間未満、５日間未満、４日間未満、３日間未満、２日間未満、または１日間未満のいずれかである。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１か月間よりも長い、２か月間よりも長い、３か月間よりも長い、４か月間よりも長い、５か月間よりも長い、６か月間よりも長い、８か月間よりも長い、または１２か月間よりも長いのいずれかである。一部の実施形態では、投薬スケジュール中に中断は存在しない。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１週間以下である。一部の実施形態では、個体へのガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療の投与のスケジュールは、処置全体を構成する単回投与から、毎日の投与までの範囲である。ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療の投与は、延長された期間、例えば、約１か月間から約７年間までにわたって延長され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療は、少なくとも約２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１８か月間、２４か月間、３０か月間、３６か月間、４８か月間、６０か月間、７２か月間、または８４か月間のいずれかの期間にわたって投与される。
ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療のために要求される用量は、各薬剤が単独で投与される場合に通常要求される用量よりも低くてもよい（必ずではないが）。したがって、一部の実施形態では、治療量以下の量のガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療が投与される。「治療量以下の量」または「治療量以下のレベル」は、治療量よりも少ない量、即ち、ナノ粒子組成物中の薬物および／または他の薬剤が単独で投与される場合に通常使用される量よりも少ない量を指す。低減は、所与の投与で投与される量および／または所与の期間にわたって投与される量（低減された頻度）に関して反映され得る。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療の両方の用量は、単独で投与される場合の各々の対応する通常の用量と比較して低減される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療は、治療量以下のレベルで、即ち、低減されたレベルで投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療の用量は、確立された最大毒性用量（ＭＴＤ）よりも実質的に低い。例えば、ガイドＲＮＡまたは第２の薬剤／治療の用量は、ＭＴＤの約５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満である。
本明細書に記載の投与構成の組合せが使用され得る。本明細書に記載の方法（本明細書に記載の併用療法方法を含む）は、単独で、または別の治療、例えば、化学療法、放射線治療、手術、ホルモン治療、遺伝子治療、免疫療法、化学免疫療法、肝動脈に基づく治療、寒冷療法、超音波治療、肝臓移植、局所的切除治療、高周波アブレーション治療、光線力学的治療などと併せて実施され得る。
さらに、がん（例えば、膵がん）を発生させるリスクがより高いヒトは、疾患の発生を阻害またはおよび／または遅延させるための処置を受けてもよい。
本明細書に記載の組成物は、約２４時間よりも短い注入時間にわたる、個体への組成物の注入を可能にする。例えば、一部の実施形態では、組成物は、約２４時間未満、１２時間未満、８時間未満、５時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分間未満、２０分間未満、または１０分間未満のいずれかの注入期間にわたって投与される。一部の実施形態では、組成物は、約３０分間の注入期間にわたって投与される。
キット
本明細書に記載の方法のために有用なキット、試薬、および製造品もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、キットは、１つのバイアル中に組み合わされて、または異なるバイアル中に別々に、ガイドＲＮＡ、細胞透過性ペプチド、他のゲノム編集分子および／または他の細胞透過性ペプチドを含有するバイアルを含む。患者の処置の時点で、例えば、患者試料の遺伝子発現分析またはプロテオミクスもしくは組織学的分析に基づいて、どの特定の病理を処置するかを最初に決定する。結果を得たら、細胞透過性ペプチドおよび任意の分子（例えば、改変されたＣａｓ９タンパク質または改変されたＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ）および／または細胞透過性ペプチドを、適切な１つまたは複数のガイドＲＮＡとしかるべく組み合わせて、有効な処置のために患者に投与され得る複合体またはナノ粒子を得る。したがって、一部の実施形態では、１）ＣＰＰ、２）ガイドＲＮＡ、および必要に応じて３）１つまたは複数のＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、他のゲノム編集分子および／または他の細胞透過性ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のキットは、ａ）本明細書に記載のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄおよび／もしくはＧ１２Ｖを標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、ｂ）細胞透過性ペプチド、ならびに／またはｃ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、改変されていないまたは改変されたＣａｓ９）をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のキットは、ａ）本明細書に記載のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄおよび／もしくはＧ１２Ｖを標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、ｂ）細胞透過性ペプチド、ならびに／またはｃ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、改変されていないまたは改変されたＣａｓ９）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のキットは、ａ）本明細書に記載のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄおよび／もしくはＧ１２Ｖを標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、ｂ）細胞透過性ペプチド、ならびに／またはｃ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、改変されていないまたは改変されたＣａｓ９）および第２の酵素（例えば、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素）を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のキットは、ａ）本明細書に記載のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄおよび／もしくはＧ１２Ｖを標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、ｂ）細胞透過性ペプチド、ならびに／またはｃ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、改変されていないまたは改変されたＣａｓ９）および第２の酵素（例えば、逆転写酵素または核酸塩基デアミナーゼ酵素）を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、個体におけるＫＲＡＳの突然変異を評価するための薬剤をさらに含む。
本明細書に記載のキットは、本主題の方法を実施するためのキットの構成成分の使用に関する指示（例えば、本明細書に記載の医薬組成物の作製および／または医薬組成物の使用に関する指示）をさらに含み得る。本主題の方法の実施に関する指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基板に印刷されている場合がある。そのように、指示は、キット中に添付文書として、キットの容器のラベルに、またはその構成成分として（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに付随して）などで存在し得る。一部の実施形態では、指示は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子ストレージデータファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示は、キット中には存在しないが、離れた供給源から、例えばインターネットを経由して指示を入手するための手段が提供される。この実施形態の例は、指示を表示することができ、かつ／または指示をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を入手するためのこの手段も適切な基板に記録される。
キットの種々の構成成分は別々の容器内に入っていてよく、容器は、単一の囲い、例えば箱内に含有されていてよい。
例示的実施形態
実施形態１．配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含む、天然に存在しないポリヌクレオチド。
実施形態２．ガイドＲＮＡが、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む、実施形態１に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
実施形態３．標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列が、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される、実施形態１または実施形態２に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
実施形態４．ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的である、実施形態３に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
実施形態５．ヌクレオチド配列が、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的である、実施形態４に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
実施形態６．化学的に改変されている、実施形態１から５までのいずれか１つに記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
実施形態７．ガイドＲＮＡが、約２００ヌクレオチド以下の長さを有する、実施形態１から６までのいずれか１つに記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
実施形態８．ａ）第１の細胞透過性ペプチド、およびｂ）突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体であって、ガイドＲＮＡが、実施形態１から７までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、ゲノム編集複合体。
実施形態９．ＤＮＡヌクレアーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態８に記載のゲノム編集複合体。
実施形態１０．ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、そのバリアント、その断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態９に記載のゲノム編集複合体。
実施形態１１．ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドを含む、実施形態１０に記載のゲノム編集複合体。
実施形態１２．Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９である、実施形態１０または実施形態１１に記載のゲノム編集複合体。
実施形態１３．第１の細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、実施形態８から１２までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態１４．第１の細胞透過性ペプチドが、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分が、アセチル、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖、リンカー部分、および標的化部分からなる群から選択される、実施形態８から１３までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態１５．第１の細胞透過性ペプチドが、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む、実施形態１４に記載のゲノム編集複合体。
実施形態１６．第１の細胞透過性ペプチドが、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む、実施形態１４または実施形態１５に記載のゲノム編集複合体。
実施形態１７．標的化ペプチドが、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される、実施形態１６に記載のゲノム編集複合体。
実施形態１８．第１の細胞透過性ペプチドが、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む、実施形態８から１７までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態１９．ＰＥＧ部分が２個～７個のエチレングリコール単位からなる、実施形態１８に記載のゲノム編集複合体。
実施形態２０．第１の細胞透過性ペプチドが、Ｎ末端から、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した、アセチル基、標的化部分およびリンカー部分を含む、実施形態１４から１９までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態２１．第１の細胞透過性ペプチドが、第１の細胞透過性ペプチドのＣ末端に共有結合により連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分が、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝（ｒａｍｉｆｉｅｄ）Ｃ１～Ｃ６アルキル、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖、リンカー部分および標的化部分からなる群から選択される、実施形態８から２０までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態２２．第１の細胞透過性ペプチドが、そのＣ末端に共有結合により連結したシステアミド基を含む、実施形態２１に記載のゲノム編集複合体。
実施形態２３．第１の細胞透過性ペプチドが、炭水化物部分をさらに含む、実施形態８から２２までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態２４．炭水化物部分が、ＧａｌＮＡｃである、実施形態２３に記載のゲノム編集複合体。
実施形態２５．第１の細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、実施形態８から２４までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態２６．第１の細胞透過性ペプチドが、配列番号４４～１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態８から２５までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態２７．第１の細胞透過性ペプチドが、配列番号１３５～１７５、２５９～２６０および２６７～２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載のゲノム編集複合体。
実施形態２８．第１の細胞透過性ペプチドが、配列番号６３～１１７、２６１～２６６および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載のゲノム編集複合体。
実施形態２９．第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比が、約１：８０から約１：１の間である、実施形態１から２８までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態３０．第１の細胞透過性ペプチドのガイドＲＮＡに対するモル比が、約１：５０から約１：２の間である、実施形態２９に記載のゲノム編集複合体。
実施形態３１．第１の細胞透過性ペプチドのＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に対するモル比が、約１：１から約８０：１の間である、実施形態９から３０までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態３２．第１の細胞透過性ペプチドのＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に対するモル比が、約２：１から約５０：１の間である、実施形態３１に記載のゲノム編集複合体。
実施形態３３．ガイドＲＮＡが第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する、実施形態８から３２までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態３４．ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、第１の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する、実施形態９から３３までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態３５．異なるガイド配列を含む１つまたは複数の追加的なガイドＲＮＡをさらに含む、実施形態８から３４までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態３６．２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、ある単一のＫＲＡＳ突然変異を標的とする、実施形態３５に記載のゲノム編集複合体。
実施形態３７．２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、２つまたはそれより多くの異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする、実施形態３６に記載のゲノム編集複合体。
実施形態３８．２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、および／またはＧ１２Ｃを標的とする、実施形態３６または３７に記載のゲノム編集複合体。
実施形態３９．ゲノム編集複合体の平均直径が、約１０ｎｍから約３００ｎｍの間である、実施形態１から３８までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体。
実施形態４０．実施形態１から３９までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体を含むコアを含むナノ粒子。
実施形態４１．コアが、実施形態１から４０までのいずれか１つに記載の１つまたは複数の追加的なゲノム編集複合体をさらに含む、実施形態４０に記載のナノ粒子。
実施形態４２．１つまたは複数の追加的なゲノム編集複合体が、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする少なくとも１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む、実施形態４１に記載のナノ粒子。
実施形態４３．コアが、第２の細胞透過性ペプチドと複合体を形成する、実施形態４０から４２までのいずれか１つに記載のナノ粒子。
実施形態４４．第２の細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、実施形態４３に記載のナノ粒子。
実施形態４５．第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、実施形態４４に記載のナノ粒子。
実施形態４６．第２の細胞透過性ペプチドが、配列番号４４～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４５に記載のナノ粒子。
実施形態４７．ナノ粒子内の第２の細胞透過性ペプチドが、連結部分によって標的化部分に共有結合により連結している、実施形態４１から４６までのいずれか１つに記載のナノ粒子。
実施形態４８．コアが、末梢細胞透過性ペプチドを含む殻でコーティングされている、実施形態４０から４７までのいずれか１つに記載のナノ粒子。
実施形態４９．末梢細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、実施形態４８に記載のナノ粒子。
実施形態５０．末梢細胞透過性ペプチドが、配列番号４４～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４９に記載のナノ粒子。
実施形態５１．殻内の末梢細胞透過性ペプチドが、連結部分によって標的化部分に共有結合により連結されている、実施形態４０から５０までのいずれか１つに記載のナノ粒子。
実施形態５２．ナノ粒子の平均直径が、約１０ｎｍから約４００ｎｍの間である、実施形態４０から５１までのいずれか１つに記載のナノ粒子。
実施形態５３．実施形態１から７までのいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ、実施形態８から３９までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体、または実施形態４０から５２までのいずれか１つに記載のナノ粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
実施形態５４．２つまたはそれより多くのナノ粒子を含み、２つまたはそれよりも多くのナノ粒子が、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする、異なるガイドＲＮＡを含む、実施形態５３に記載の医薬組成物。
実施形態５５．実施形態８から３９までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体を調製する方法であって、第１の細胞透過性ペプチドをガイドＲＮＡと組み合わせ、それにより、ゲノム編集複合体を形成するステップを含む方法。
実施形態５６．細胞における突然変異したＫＲＡＳを改変する方法であって、細胞に実施形態１から７までのいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ、実施形態８から３９までのいずれか１つに記載のゲノム編集複合体、または実施形態４０から５２までのいずれか１つに記載のナノ粒子を接触させるステップを含む方法。
実施形態５７．個体におけるがんを処置する方法であって、個体に実施形態５３に記載の医薬組成物を有効量で投与するステップを含む方法。
実施形態５８．第２の薬剤を投与するステップをさらに含む、実施形態５７に記載の方法。
以下の実施例は、本出願の純粋な例示を意図しており、したがって、本出願を限定するとは決して解釈すべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、例示として提供されているのであって、限定として提供されているのではない。
（実施例１）
ＫＲＡＳのコドン１２に対する単一ヌクレオチド置換を標的とするｓｇＲＮＡの設計
ＫＲＡＳ癌遺伝子のコドン１２における特定の突然変異（Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｃ）を直接標的とすることによってがん細胞増殖を損なうための、新しい戦略を開発した。ＫＲＡＳ突然変異体の発癌性対立遺伝子を選択的に標的としそれを破壊する選択的ＡＤＧＮ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、ｉｎ ｖｉｖｏ全身投与のために設計し、がん細胞増殖および腫瘍成長の阻害をもたらした。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いて、がん細胞における突然変異体ＫＲＡＳ対立遺伝子を標的とするために、ｃ．３５Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｖ）、ｃ．３５Ｇ＞Ａ（Ｇ１２Ｄ）およびｃ．３４Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｃ）ＫＲＡＳ突然変異を標的とする特異的ガイドＲＮＡを設計し、ＡＤＧＮナノ粒子送達系を使用したときの異なるがん細胞に対するそれらの効力を検証した。次いで、突然変異体ＫＲＡＳの標的化が、ＡＤＧＮナノ粒子を使用して静脈内に投与された場合に、腫瘍成長をｉｎ ｖｉｖｏで抑制できるかどうかを評価した。
主要な発癌性突然変異は、ＫＲＡＳエクソン２のコドン１２に対して生じる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いて、がん細胞における突然変異体ＫＲＡＳ対立遺伝子を標的とするために、以下の単一ヌクレオチドミスセンス置換ｃ．３５Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｖ）、ｃ．３５Ｇ＞Ａ（Ｇ１２Ｄ）およびｃ．３４Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｃ）を標的とする特異的ガイドＲＮＡを同定した。これらの突然変異した標的ヌクレオチドは、ＰＡＭ配列に隣接する領域内に位置するので、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって標的とされるためにこれらを選択した。野生型ＫＲＡＳを標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡＷＴ）もまた、細胞株についての陰性対照として設計した。図１８を参照されたい。
表1. sgRNAは、KRAS G12V突然変異を標的とする。SgRNA c.35G>T
Figure 2023516225000002
Figure 2023516225000003
 表2. sgRNAは、KRAS G12D突然変異を標的とする。SgRNA 35G>A.
Figure 2023516225000004
 表3. sgRNAは、KRAS G12C突然変異を標的とする。SgRNA 34G>T
Figure 2023516225000005
Figure 2023516225000006
 （実施例２）
ＡＤＧＮペプチド／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ複合体の調製
材料
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７転写キット、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット、およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇｒｅｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲミックスは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た。ＡＳＴ／ＡＬＴ／ＢＵＮおよびクレアチニン活性アッセイキットは、Ｓｉｇｍａ（Ｆｒａｎｃｅ）およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た。抗体：ホスホ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３）（ＣＳＴ、＃９２７１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３２９８２５）およびホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（ＣＳＴ、＃４３７０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３１５１１２）は、ＣＳＴからである。
ｍＲＮＡ：ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）Ｃａｓ９ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ（商標）Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）は、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から得た。
ｇＲＮＡ：ルシフェラーゼｇＲＮＡは、Hart, T., et al. (2015). Cell, 163(6), 1515-1526に従って、ｓｇＲＮＡ発現プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７４１９０、プラスミドｐＬＣＫＯ＿Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＿ｓｇＲＮＡ）を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得た。ルシフェラーゼ標的部位：ＡＣＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＡＣＣＧＣＧＣＣ。ｓｇＲＮＡの生成を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され得る、ＰＣＲ産物のための鋳型としてＴ７プロモーターアダプター配列を含有するジェネリックｓｇＲＮＡ発現プラスミドを使用して実施した。Ｔ７プロモーター結合部位とその後の約２０ｂｐのｓｇＲＮＡ標的配列とを含有する直鎖状ＤＮＡ断片を、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７高収量転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の指示に従って使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｇＲＮＡを、エタノールで沈殿させ、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してさらに精製した。
コドン１２におけるＫＲＡＳ突然変異を標的とするＫＲＡＳ ｓｇＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｒａｎｃｅ）およびＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から得た。
ｓｇＲＮＡのストック溶液を、水中に可溶化し、ＵＶ吸光度によって定量化し、－８０℃で貯蔵した。
ＡＤＧＮペプチド：以下のペプチド配列を使用した。
表4.
Figure 2023516225000007
細胞株：全ての細胞株は、ＡＴＣＣから得た。膵がん（ＰＤＡＣ）：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＰＡＮＣ１、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてホモ接合性のＰＫ ４５Ｈ、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＰＫ１、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）についてホモ接合性のＭＩＡ－ＰＡＣＡ
結腸直腸がん（ＣＲＣ）：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）についてホモ接合性のＳＷ４８０、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）についてヘテロ接合性のＳＷ４０３、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＬＳ５１３、ＫＲＡＳについてＷＴであり、ＴＰ５３ ｐ．Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ（ｃ．８１８Ｇ＞Ａ）についてホモ接合性のＨＴ－２９、ＫＲＡＳについてＷＴのＨＴ－２９
肺がん（ＮＳＣＬＣ）：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）についてヘテロ接合性のＮＣＩ Ｈ２３およびＨ３５８、ＫＲＡＳについてＷＴのＨ１２９９
方法：
ｍＲＮＡ：ｇＲＮＡとの複合体形成：ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ粒子を、モル比２０：１：１で調製した。ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ複合体を、０．５μｇのｍＲＮＡ：１．５μｇのｓｇＲＮＡおよび５％グルコースまたはＤＭＥＭ（９６ウェルプレートに関する例）を用いてモル比２０／１／１で調製した。９６ウェルのうち６ウェルのための複合体の最小体積が調製されることが示唆される。予め混合したＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡを室温でガラスバイアル（１～４ｍｌ）中、滅菌水中に調製した。ＡＤＧＮ－ペプチド溶液を４００ｒｐｍでの磁気撹拌下で滴下して（毎秒１滴）、１：２の比を得、室温または３７℃で３０分間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、１５０μｌのグルコースまたはＤＭＥＭを添加し、溶液を４００ｒｐｍでの磁気撹拌下で１分間混合した。次いで、溶液を３７℃で５分間インキュベートした。次いで、複合体を細胞のトランスフェクションまたはＩＶ投与のために準備した。ＩＶ投与の前に、複合体をスクロース５％溶液中に希釈した。
トランスフェクションプロトコール。以下のプロトコールを、２４／４８／９６ウェルプレートフォーマットでのトランスフェクションについて報告する。細胞は、トリプシン処理し、トランスフェクションの前日に播種すべきである。細胞を、２ｍＭのグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン、１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン、１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養した。トランスフェクションの前日に細胞５０，０００個を播種した９６ウェルプレートを６０～８０％集密まで成長させ、トランスフェクションの当日時におよそ７０％集密になっているように設定した。トランスフェクトする前に、細胞をＤＭＥＭ（ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンなし）で２回洗浄する（１００μｌ／ウェル）。次いで、細胞を、２５μｌの複合体溶液で覆い、穏やかに混合し、３７℃＋５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。新鮮なＤＭＥＭ（ＦＢＳおよび抗生物質なし）５０μｌを添加し、細胞を３７℃＋５％ＣＯ２で２時間インキュベートした（曝露時間は、細胞の感度に基づいて調整することができる）。次いで、ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ複合体の覆いを取り除かずに、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳおよび１％抗生物質を含有する）２５０μＬを添加した。次いで、細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、トランスフェクションの４８時間～７２時間後に分析した。
表5.
Figure 2023516225000008
ＡＤＧＮ－ペプチドがＣＡＳ９ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡと安定なナノ粒子を形成する能力を分析した。粒子サイズと凝集のレベルとを、ＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ複合体の平均サイズおよび多分散を２５℃で測定当たり３分間にわたって決定した。データが図１９Ａ～１９Ｂに３回の別々の実験の平均として示されている。
ＡＤＧＮペプチド－ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ複合体を、トランスフェクションの前に動的光散乱（ＤＬＳ Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ）によって特徴付けた。図１９に報告されている通り、ＡＤＧＮペプチドは、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡと安定な高度に均一なナノ粒子を形成し、平均サイズは８０～１００ｎｍにわたり、多分散指数は０．１８３であった。
（実施例３）
がん細胞における突然変異体ＫＲＡＳのコドン１２選択的かつ効率的な破壊における、ＫＲＡＳ突然変異を標的とする、ＡＤＧＮに媒介されるＣＲＩＳＰＲ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いて、がん細胞における突然変異体ＫＲＡＳ対立遺伝子を標的とするために、我々は、ｃ．３５Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｖ）、ｃ．３５Ｇ＞Ａ（Ｇ１２Ｄ）およびｃ．３４Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｃ）ＫＲＡＳ突然変異を標的とする特異的ガイドＲＮＡを同定し、ＡＤＧＮナノ粒子送達系を使用して異なるがん細胞に対するそれらの効力を評価した。ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、および異なるバリアントが製剤化ならびにｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方での評価のために使用されている。
膵がん（ＰＤＡＣ）について、以下の細胞株およびＫＲＡＳ標的を使用した：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＰＡＮＣ１、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてホモ接合性のＰＫ ４５Ｈ、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＰＫ１、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）についてホモ接合性のＭＩＡ－ＰＡＣＡ
結腸直腸がん（ＣＲＣ）について、以下の細胞株およびＫＲＡＳ標的を使用した：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）についてホモ接合性のＳＷ４８０、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）についてヘテロ接合性のＳＷ４０３、およびＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＬＳ５１３。ＫＲＡＳについてＷＴであり、ＴＰ５３ ｐ．Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ（ｃ．８１８Ｇ＞Ａ）についてホモ接合性のＨＴ－２９、ＫＲＡＳについてＷＴのＨＴ－２９を含む対照細胞株と結果を比較した。
肺がん（ＮＳＣＬＣ）について、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）細胞株および突然変異についてヘテロ接合性のＮＣＩ Ｈ２３およびＨ３５８を、対照としてのＫＲＡＳについてＷＴのＨ１２９９と比較した。
ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ｔ突然変異体Ｇ１２Ｖを標的とする９つの異なるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ３５Ｔ１、ｇＲＮＡ３５Ｔ２、ｇＲＮＡ３５Ｔ３、ｇＲＮＡ３５Ｔ４、ｇＲＮＡ３５Ｔ５、ｇＲＮＡ３５Ｔ６、ｇＲＮＡ３５Ｔ７、ｇＲＮＡ３５Ｔ８およびｇＲＮＡ３５Ｔ９（図１８を参照されたい））を、Ｇ１２Ｖ ＫＲＡＳ突然変異を有するＳＷ４０３およびＳＷ４８０がん細胞に対して評価した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（０．１５μｇ）およびｇＲＮＡ（０．２μｇ）を、実験手順に報告されている通り、ＡＤＧＮ－ペプチドと会合させた。ＳＷ４０３、ＳＷ４８０およびＨＴ－２９細胞を、４８ウェルプレートフォーマットで培養し、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体で処置した。内因性標的配列におけるインデル頻度を、トランスフェクションの７２時間後に、Ｔ７Ｅ１法およびディープシーケンシングのいずれかによって評価した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図１Ａに報告されている通り、ｇＲＮＡ３５Ｔ１、３５Ｔ３、３５Ｔ６、３５Ｔ７および３５Ｔ８は、がん細胞において、Ｇ１２Ｖ突然変異体ＫＲＡＳのインデル編集および効率的な破壊を特異的に誘導したが、野生型ＫＲＡＳ ＨＴ２９細胞では誘導しなかった。ディープシーケンシングにより、ＡＤＧＮに媒介されるｇＲＮＡ３５Ｔ３ ｓｇＲＮＡの送達が、３５Ｇ＞Ｔ突然変異についてヘテロ接合性であるＳＷ４０３細胞において６５％のインデル頻度を生じ、３５Ｇ＞Ｔ突然変異についてホモ接合性であるＳＷ４８０細胞において８１％のインデル頻度を生じたことが示された。３５Ｔ６ ｓｇＲＮＡは、ＳＷ４０３細胞において１８％のインデル頻度を生じ、ＳＷ４８０細胞において３９％のインデル頻度を生じた。３５Ｔ１ ｓｇＲＮＡは、ＳＷ４０３細胞において３５％のインデル頻度を生じ、ＳＷ４８０細胞において５７％のインデル頻度を生じた。３５Ｔ８ ｓｇＲＮＡは、ＳＷ４０３細胞において４０％のインデル頻度を生じ、ＳＷ４８０細胞において５１％のインデル頻度を生じた。対照的に、ｇＲＮＡ３５Ｔ２、３５Ｔ５および３５Ｔ９は、１５％未満のＧ１２Ｖ ＫＲＡＳ遺伝子編集を誘導した。しかし、ｇＲＮＡ３５Ｔ４は、有意なＧ１２Ｖ ＫＲＡＳ突然変異体編集を生じ（ＳＷ４０３において２２％、ＳＷ４８０において４１％）、このｓｇＲＮＡ配列は、Ｇ１２Ｖ突然変異体ＫＲＡＳに特異的ではなく、ＨＴ２９細胞においてもＷＴ ＫＲＡＳの破壊を誘導した。
我々は、突然変異体ＫＲＡＳの破壊ががん細胞増殖に影響を及ぼすことができるかどうかを次に決定した。図１Ｂに報告されている通り、ｇＲＮＡ３５Ｔ１、３５Ｔ３、３５Ｔ６および３５Ｔ８は、ＳＷ４８０およびＳＷ４０３細胞の増殖または生存を特異的に阻害するが、ＫＲＡＳ ＷＴを有するＨＴ２９細胞には影響を及ぼさなかった。遺伝子編集結果について報告されたように、最良の応答が、ｇＲＮＡ３５Ｔ３＞ｇＲＮＡ３５Ｔ８＞ｇＲＮＡ３５Ｔ６／３５Ｔ１で得られた。細胞増殖分析により、ｇＲＮＡ３５Ｔ４がＧ１２Ｖ突然変異に特異的ではなく、ＨＴ－２９増殖もまた変更したという事実が確認された。ｇＲＮＡ３５Ｔ３は、ＳＷ４０３およびＳＷ４８０の細胞増殖を７５％遮断し、ｇＲＮＡ３５Ｔ８およびｇＲＮＡ３５Ｔ６よりも１．５倍および２倍効率的である。ｇＲＮＡ３５Ｔ３ガイドは、野生型対立遺伝子を変更することなく、３５Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｖ）突然変異体ＫＲＡＳを効率的に標的とし、これをさらなる評価のために選択した。
ＫＲＡＳ ３５Ｇ＞Ａ突然変異体Ｇ１２Ｄを標的とする９つの異なるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ３５Ａ１、ｇＲＮＡ３５Ａ２、ｇＲＮＡ３５Ａ３、ｇＲＮＡ３５Ａ４、ｇＲＮＡ３５Ａ５、ｇＲＮＡ３５Ａ６；ｇＲＮＡ３５Ａ７、ｇＲＮＡ３５Ａ８、ｇＲＮＡ３５Ａ９）を、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ突然変異を有するＬＳ５１３、Ｐａｎｃ１、ＰＫ－４５Ｈ、およびＰＫ１がん細胞に対して評価した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（０．１μｇ）およびｇＲＮＡ（０．２μｇ）を、モル比２０／１（ペプチド／核酸）でＡＤＧＮ－ペプチドと会合させた。ＬＳ５１３、Ｐａｎｃ１、ＰＫ－４５Ｈ、ＰＫ１、ＨＳ－６８およびＨＴ－２９細胞を、４８ウェルプレートフォーマットで培養し、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体で処置した。内因性標的配列におけるインデル頻度を、トランスフェクションの７２時間後に、Ｔ７Ｅ１法またはディープシーケンシングのいずれかによって評価した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図２Ａに報告されている通り、ｇＲＮＡ３５Ａ２、３５Ａ５、３５Ａ７、３５Ａ６および３５Ａ９は、がん細胞において、Ｇ１２Ｄ突然変異体ＫＲＡＳの効率的な破壊を誘導したが、野生型ＫＲＡＳ細胞（ＨＴ２９またはＨＳ－６８細胞）においては誘導しなかった。対照的に、ｇＲＮＡ３５Ａ３、３５Ａ４および３５Ａ８は、１５％未満のＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ遺伝子編集を誘導し、ｇＲＮＡ３５Ａ１は、Ｇ１２Ｄ突然変異に特異的ではなく、野生型ＫＲＡＳ細胞（ＨＴ－２９およびＨＳ－６８）にも影響を及ぼした。
表6.
Figure 2023516225000009
表６に報告されている通り、ディープシーケンシングにより、ｇＲＮＡ３５Ａ５ ｓｇＲＮＡの送達が、３５Ｇ＞Ａ突然変異についてヘテロ接合性であるＰＫ１細胞において７８％のインデル頻度およびＰＫ－４５Ｈ細胞において７５％のインデル頻度を生じ、３５Ｇ＞Ａ突然変異についてホモ接合性であるＰＡＮＣ－１細胞において６７％のインデル頻度およびＬＳ５１３細胞において４２％のインデル頻度を生じたことが示された。
我々は、突然変異体ＫＲＡＳの破壊ががん細胞増殖に影響を及ぼすことができるかどうかを次に決定した。図２Ｂに報告されている通り、ｇＲＮＡ３５Ａ５、３５Ａ２、３５Ａ１、３５Ａ６および３５Ａ７は、ＰＡＮＣ１、ＰＫ１、ＬＳ５１３およびＰＫ－４５Ｈ細胞の増殖または生存を特異的に阻害するが、ＫＲＡＳ ＷＴを有するＨＴ２９細胞にもＨＳ－６８細胞にも影響を及ぼさない。我々は、野生型対立遺伝子を変更することなく３５Ｇ＞Ａ（Ｇ１２Ｄ）突然変異体ＫＲＡＳを効率的に標的とするｇＲＮＡ３５Ａ５ガイドを選択した。ｇＲＮＡ３５Ａ５は、ＰＡＮＣ１；ＰＫ１、ＬＳ５１３およびＰＫ－４５Ｈの細胞増殖を８０％遮断し、ｇＲＮＡ３５Ａ２およびｇＲＮＡ３５Ａ６よりも２倍および３倍効率的である。
（実施例４）
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異を標的とする、ＡＤＧＮに媒介されるＣＲＩＳＰＲ
ＫＲＡＳ ３４Ｇ＞Ｔ突然変異体Ｇ１２Ｃを標的とする８つの異なるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ３４Ｔ１、ｇＲＮＡ３４Ｔ２、ｇＲＮＡ３４Ｔ３、ｇＲＮＡ３４Ｔ４、ｇＲＮＡ３４Ｔ５、ｇＲＮＡ３４Ｔ６、ｇＲＮＡ３４Ｔ７およびｇＲＮＡ３４Ｔ８）を、ＭＩＡ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３、Ｈ３５８、Ｈ２９およびＰＡＮＣ１細胞に対して評価した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（０．１μｇ）およびｇＲＮＡ（０．２μｇ）を、モル比２０／１（ペプチド／核酸）でＡＤＧＮペプチドと会合させた。ＭＩＡ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３、Ｈ３５８、ＰＡＮＣ１およびＨＴ２９細胞を、４８ウェルプレートフォーマットで培養し、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体で処置した。内因性標的配列におけるインデル頻度を、トランスフェクションの７２時間後に、Ｔ７Ｅ１法またはディープシーケンシングのいずれかによって評価した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図３Ａに報告されている通り、ｇＲＮＡ３４Ｔ１、３４Ｔ３、３４Ｔ５および３４Ｔ６は、がん細胞において、Ｇ１２Ｃ突然変異体ＫＲＡＳのインデル編集および効率的な破壊を誘導したが、ＨＴ２９細胞におけるＷＴ ＫＲＡＳのインデル編集および効率的な破壊もＰＡＮＣ１細胞におけるＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ突然変異のインデル編集および効率的な破壊も誘導しなかった。対照的に、ｇＲＮＡ３４Ｔ２、３４Ｔ４、３４Ｔ７および３４Ｔ８は、野生型ＫＲＡＳに影響を及ぼすにあたり、非効率的であるまたはあまり特異的でない。ディープシーケンシングにより、ｇＲＮＡ３４Ｔ６ ｓｇＲＮＡの送達が、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３およびＨ３５８細胞において、それぞれ７１％、７８％および６７％のインデル頻度を生じたことが示された。３４Ｔ５ ｓｇＲＮＡは、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３およびＨ３５８細胞において、それぞれ７５％、６８％および６７％のインデル頻度を生じた。３４Ｔ３ ｓｇＲＮＡは、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３およびＨ３５８細胞において、それぞれ５１％、４８％および３７％のインデル頻度を生じた。３４Ｔ１ ｓｇＲＮＡは、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３およびＨ３５８細胞において、それぞれ３４％、４１％および２９％のインデル頻度を生じた。
我々は、突然変異体ＫＲＡＳの破壊ががん細胞増殖に影響を及ぼすことができるかどうかを次に決定した。図３Ｂに報告されている通り、ｇＲＮＡ３４Ｔ５、３４Ｔ６、３４Ｔ３および３４Ｔ１は、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３およびＨ３５８細胞の増殖または生存を特異的に阻害するが、ＫＲＡＳがＷＴであるＨＴ２９細胞にもＨＳ－６８細胞にも、Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳ突然変異したＰＡＮＣ１細胞にも影響を及ぼさない。ｇＲＮＡ３４Ｔ６は、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３およびＨ３５８の細胞増殖を７５％遮断し、ｇＲＮＡ３４Ｔ５およびｇＲＮＡ３４Ｔ３よりも２倍および３倍効率的である。我々は、野生型対立遺伝子を変更することなく３４Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｃ）突然変異体ＫＲＡＳを効率的に標的とするｇＲＮＡ３４Ｔ６ガイドを選択した。
（実施例５）
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１２Ｃ突然変異を標的とする、ＡＤＧＮに媒介されるＣＲＩＳＰＲ
Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ突然変異を標的とするｓｇＲＮＡの特異性を確認するために、Ｇ１２Ｖを標的とするｇＲＮＡ３５Ｔ３、Ｇ１２Ｃを標的とするｇＲＮＡ３４Ｔ６、およびＧ１２Ｄを標的とするｇＲＮＡ３５Ａ５を、ＳＷ４０３、ＳＷ４８０、ＰＡＮＣ１、ＰＫ－４５Ｈ、ＰＫ－１、ＭＩＡ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３、Ｈ３５８、ＨＴ－２９、ＨＳ－６８およびＬＳ５１３を含む、異なるＫＲＡＳ突然変異を有するがん細胞の大きいパネルに対して評価した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（０．２μｇ）およびｇＲＮＡ（０．４μｇ）を、モル比２０／１（ペプチド／核酸）でＡＤＧＮペプチドと会合させた。細胞を、４８ウェルプレートフォーマットで培養し、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体で処置した。内因性標的配列におけるインデル頻度を、トランスフェクションの７２時間後に、Ｔ７Ｅ１法のいずれかによって評価し、細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析した。
図４Ａ～４Ｂに報告されている通り、ｇＲＮＡ３５Ａ５は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異したがん細胞に高度に特異的であり、ＰＡＮＣ－１、ＰＫ－１、およびＰＫ－４５Ｈ細胞において、７５％よりも高いインデル頻度をもたらし、Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ突然変異体細胞もＷＴ ＫＲＡＳ細胞も変更しない。ｇＲＮＡ３５Ｔ３は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異したがん細胞に高度に特異的であり、ＳＷ４０３およびＳＷ４８０細胞において、６５％よりも高いインデル頻度をもたらし、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ突然変異体細胞もＷＴ ＫＲＡＳ細胞も変更しない。ｇＲＮＡ３４Ｔ６は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異したがん細胞に高度に特異的であり、Ｍｉａ－ＰＡＣＡ、Ｈ２３およびＨ３５８細胞において７０％よりも高いインデル頻度をもたらし、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖ ＫＲＡＳ突然変異体細胞もＷＴ ＫＲＡＳ細胞も変更しない。
（実施例６）
ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤまたはＧ１２Ｖ突然変異を標的とする、ＡＤＧＮに媒介されるＣＲＩＳＰＲは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびＭＡＰＫ経路を阻害する
ＰＡＮＣ－１およびＳＷ４０３細胞におけるＫＲＡＳシグナル伝達経路に対する、Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ突然変異を標的とするリードｓｇＲＮＡであるｇＲＮＡ３５Ａ５ Ｇ１２ＤおよびｇＲＮＡ３５Ｔ３ Ｇ１２Ｖの特異的効果を検証するために、我々は、ＫＲＡＳによって活性化される下流のシグナル伝達タンパク質のレベルを測定した。我々は、重要なシグナル伝達経路、例えば、ＫＲＡＳ活性化の主要なエフェクター経路であることが公知のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔにおける変化を特に探し求めた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（０．２μｇ）およびｇＲＮＡ（０．２μｇまたは０．５μｇ）を、モル比２０／１（ペプチド／核酸）でＡＤＧＮペプチドと会合させた。ＰＡＮＣ１およびＳＷ４０３細胞を、４８ウェルプレートフォーマットで培養し、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体で処置した。ＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化のレベルを、ホスホ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３）（ＣＳＴ、＃９２７１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３２９８２５）およびホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（ＣＳＴ、＃４３７０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３１５１１２）を使用するウエスタンブロットによって、トランスフェクションの４８時間後に測定した。
図５Ａ～５Ｂに報告されている通り、ウエスタンブロット結果から、両方の場合において、ＫＲＡＳ突然変異体の遺伝子編集が、下流のシグナル伝達経路の特異的変更を引き起こしたことが明らかになった。ｇＲＮＡ３５Ａ５を使用したＫＲＡＳＧ１２Ｄのノックアウトは、ｐ－ＡＫＴのレベルを有意に低減させて、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に影響を及ぼした（図５Ａ）。対照的に、Ｐ－Ｅｒｋのレベルは、１５％低減されるだけである。ｇＲＮＡ３５Ｔ３を使用したＫＲＡＳＧ１２Ｖのノックアウトは、ｐ－Ｅｒｋのレベルに有意に影響を及ぼして、ＭＡＰＫ経路に影響を及ぼし、Ａｋｔリン酸化には不十分に影響を及ぼした（図５Ｂ）。我々の結果は、ＫＲＡＳ突然変異体間の差異が、動物由来の腫瘍において同定されたことを示す以前の結果と一致している。ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤではなくＧ１２Ｖは、ＲＡＦ１と相互作用することができ、ＥＲＫの高いリン酸化を示し、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖは、ＰＩ３Ｋとのその相互作用にもかかわらずＡＫＴを活性化することができなかったが、一方で、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄは、ＡＫＴを強く活性化した（Cespedes M, Sancho F, Guerrero S, Parrenyo M, Casanova I, Pavon M, et al. Carcinogenesis. (2006) 27:2190-200）。
（実施例７）
ＡＤＧＮペプチドは、腫瘍におけるＣＲＩＳＰＲ構成成分の標的送達を媒介した
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドを、腫瘍におけるＣａｓ９の選択的発現を改善し、血清中でのｍＲＮＡの半減期を増加させるために選択した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（１０μｇ）およびｇＲＮＡ（１０μｇ）を、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ７およびＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ７と会合させた。雌性ヌードマウスに、ヒト膵癌を皮下に注射した。腫瘍移植の１０日後、マウスに、遊離Ｃａｓ９またはＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を単回静脈内注射した。注射の２４時間後に、動物を屠殺し、肺、肝臓、脳、腎臓、心臓、脾臓、血液、膵臓および腫瘍を含む組織を収集した。組織をホモジナイズし、Ｃａｓ９発現を、Ｃａｓ９モノクローナル抗体（ＳＢＩクローン７Ａ９）を使用するＥＬＩＳＡによって分析した。
表7.腫瘍におけるCas9発現に使用するためのADGNペプチド
Figure 2023516225000010
図６に示されている通り、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７、ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙ７ペプチドは、腫瘍において高いＣａｓ９発現を促進する。Ｃａｓ－９発現のレベルは、背景レベルの１０倍のレベルで、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドと比較して４～６倍増加する。ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７は、試験した他の組織におけるＣａｓ９タンパク質発現の有意な増加を伴わずに、腫瘍を特異的に標的とする。対照的に、ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙ７は、肺における大きいＣａｓ９発現を伴って、腫瘍および肺の両方を標的とした。この結果から、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７が、腫瘍におけるＣＲＩＳＰＲ構成成分の機能的送達のｉｎ ｖｉｖｏ標的送達のための強力な送達方法を構成することが実証された。
ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７を、さらなるｉｎ ｖｉｖｏ評価のために選択した。６週齢の雌性ヌードマウスに、ＰＡＮＣ１ヒト膵癌細胞を皮下に注射した（群当たりマウス４匹）。腫瘍細胞投与の１０日後および１７日後に、マウスに、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡナノ粒子をＩＶ注射した。異なる組織および腫瘍におけるＣａｓ９発現のレベルを、各注射（Ｄ１およびＤ８）の２４時間後および第２の注射（Ｄ１４）の４／７日後に、ＥＬＩＳＡによって分析した。組織をホモジナイズし、Ｃａｓ９発現を、タンパク質抽出物に対する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に対する抗体を使用するＥＬＩＳＡによって分析した。
図７Ａ～Ｂに報告されている通り、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７はそれぞれ、腫瘍におけるＣａｓ９ ｍＲＮＡの標的化送達を媒介した。Ｃａｓ９タンパク質の高い発現が、背景レベルの１０倍よりも高いレベルで、腫瘍において観察された（図７Ａ～Ｂ）。Ｃａｓ９発現は、背景レベルの約２倍～３倍のレベルで、肺および肝臓においても観察された。Ｃａｓ９タンパク質発現における有意な増加は、試験した他の組織では検出されなかった。組織および腫瘍におけるＣａｓ９発現は、最後の注射の４日後および７日後には、背景レベルに近い。
（実施例８）
ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１００ Ｈｙ７ナノ担体は、血清中でＣａｓ９ ｍＲＮＡを安定化した
我々は、血清中でのＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７ナノ粒子の安定性を次に評価した。雌性ヌードマウスに、ヒト膵癌を皮下に注射した。腫瘍細胞投与の１０日後に、マウスを、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇのＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体で静脈内で処置した。血液中のＣａｓ９ ｍＲＮＡレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎ ｂＤＮＡ法によって分析した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡレベルの定量化のための血漿試料の生物分析を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ－ＵＳＡ）が開発したｍＲＮＡ検出のためのｂＤＮＡ法に従って実施した。血漿試料を、溶解緩衝液中に直接希釈した。シグナル増幅を、酵素アルカリホスファターゼに結合したオリゴヌクレオチドを用いて実施した。ピコグラムでの計算された量を、溶解物中の血漿の量およびプレートに適用された溶解物の量に対して正規化した。図８Ａ～８Ｂに報告されている通り、血液中のＣａｓ９ ｍＲＮＡレベルは、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３およびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ７を使用して、それぞれ４．２時間および５．０時間の中程度の半減期で、用量依存的である。両方の場合において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡレベルは、２４時間で、約１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満に減少した。
（実施例９）
ＫＲＡＳ突然変異体の、ＡＤＧＮに媒介されるＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集は、腫瘍成長をｉｎ ｖｉｖｏで遮断する。
我々は、突然変異体ＫＲＡＳの標的化が、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３ナノ粒子を使用して静脈内に投与した場合に、腫瘍成長をｉｎ ｖｉｖｏで抑制できるかどうかを評価している。６週齢の雌性ヌードマウスに、３５Ｇ＞Ａ突然変異を含むヒト膵癌細胞（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）または３５Ｇ＞Ｔ ＫＲＡＳ突然変異を含むヒト結腸直腸がん細胞（ＳＷ４０３）のいずれかを注射した（２００μｌのＰＢＳ中２０×１０６細胞）。動物を、１２時間／１２時間の明／暗サイクルを用いた２２℃の一定温度の専用部屋において、（動物当たりの推奨される表面積に従って）２～４匹の動物のケージ中で、病原体なしの条件下で維持し、自由に餌と水を与えた。２週間の期間を実験の開始前に経過させて、腫瘍を発生させた。
マウスを、２つの対照群Ｇ０およびＧ１（群当たり動物６匹）ならびに３つの処置群（Ｇ３～Ｇ５）（群当たり動物６匹）を含む５つの群に編成した。異なる群は以下である：
Ｐａｎｃ１－マウスについて：
Ｇ０：未処置対照
Ｇ１：ネイキッドＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ３：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ ０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ４：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ５：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ６ １．０ｍｇ／ｋｇ
ＳＷ－４０３マウスについて
Ｇ０：未処置対照
Ｇ１：ネイキッドＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ５：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ ０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ７：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ６：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ６ １．０ｍｇ／ｋｇ
動物に、１日目および７日目に注射した。マウスに、５％グルコース中の１００μｌのＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体をＩＶ注射した。ＰＡＮＣ－１腫瘍サイズを、生物発光イメージングによって評価した。マウスに、非侵襲性生物発光イメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のための１５０μｇ／ｇのルシフェリンをｉ．ｐ．注射した。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データを、製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を光子／秒（光子／ｓ）として表した。生物発光イメージングを、１週間に１回実施した。次いで、結果を、０日目と比較した値として表した。５０日目に、動物を屠殺し、腫瘍を回収した。ＳＷ４０３腫瘍サイズを、キャリパーを使用して、７日毎に評価した。次いで、結果を、０日目と比較した値として表した。５０日目に、動物を屠殺し、腫瘍を回収した。
図９Ａ～９Ｂに報告されている通り、対照群では、腫瘍サイズは、４８日間の期間かかって、６．１倍増加した。ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ａ５のＩＶ投与は、３５Ｇ＞Ａ（Ｇ１２Ｄ）突然変異体ＫＲＡＳをｉｎ ｖｉｖｏで効率的に標的とし、０．５ｍｇ／ｋｇにおいてＰＡＮＣ１腫瘍成長を６５％低減させる。１ｍｇ／ｋｇの用量では、ＡＤＧＮ／ｇＲＮＡ３５Ａ５は、ＰＡＮＣ１腫瘍成長を無効にし、元のサイズと比較して、腫瘍サイズの５０％の低減をもたらした。対照的に、３４Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｃ）突然変異体ＫＲＡＳを標的とするＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３４Ｔ６は、ＰＡＮＣ１腫瘍成長に影響しない。この結果から、ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙ３が、腫瘍における３５Ｇ＞Ａ（Ｇ１２Ｄ）ＫＲＡＳ突然変異の、効率的なＣＲＩＰＳＲに基づく編集を媒介し、膵臓腫瘍成長を阻害したことが実証された。
図１０に報告されている通り、対照群では、ＳＷ４０３腫瘍サイズは、４８日間の期間かかって、５．９倍増加した。ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ｔ３は、３５Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｖ）突然変異体ＫＲＡＳをｉｎ ｖｉｖｏで効率的に標的とし、０．５ｍｇ／ｋｇにおいてＳＷ４０３腫瘍成長を６５％低減させる。１ｍｇ／ｋｇの用量では、ＡＤＧＮ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３は、ＳＷ４０３腫瘍成長を無効にし、元のサイズと比較して、腫瘍サイズの６２％の低減をもたらした。対照的に、３４Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｃ）突然変異体ＫＲＡＳを標的とするＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３４Ｔ６は、ＳＷ４０３腫瘍成長に影響しない。この結果から、ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙ３が、腫瘍における３５Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｖ）ＫＲＡＳ突然変異の、効率的なＣＲＩＰＳＲに基づく編集を媒介し、結腸直腸腫瘍成長を阻害したことが実証された。
（実施例１０）
第２の薬剤と組み合わせた、ＡＤＧＮに媒介されるＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集
化学療法剤と組み合わせた突然変異体ＫＲＡＳの標的化が、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙ３ナノ粒子を使用して静脈内に投与された場合に、腫瘍成長をｉｎ ｖｉｖｏで抑制できるかどうかもまた評価した。６週齢の雌性ヌードマウスに、３５Ｇ＞Ａ突然変異を含むヒト膵癌細胞（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）、または３５Ｇ＞Ｔ ＫＲＡＳ突然変異を含むヒト結腸直腸がん細胞（ＳＷ４０３）のいずれかを注射した（２００μｌのＰＢＳ中２０×１０６細胞）。動物を、１２時間／１２時間の明／暗サイクルを用いた２２℃の一定温度の専用部屋において、（動物当たりの推奨される表面積に従って）２～４匹の動物のケージ中で、病原体なしの条件下で維持し、自由に餌と水を与えた。２週間の期間を実験の開始前に経過させて、腫瘍を発生させた。
ＰＡＮＣ１腫瘍を注射したマウスについて、マウスを、２つの対照群Ｇ０およびＧ１（群当たり動物６匹）ならびに５つの処置群（Ｇ３～Ｇ７）（群当たり動物６匹）を含む７つの群に編成した。異なる群は以下である：
Ｇ１：未処置対照
Ｇ２：ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／対照ｇＲＮＡ
Ｇ３：Ｇ１２Ｄ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ４：Ｇ１２Ｄ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ用量１．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ５：Ｇ１２Ｄ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ／アブラキサン（５０μｇ）用量０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ６：Ｇ１２Ｄ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ／アブラキサン（５０μｇ）用量１．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ７：アブラキサン（５０μｇ）１週間に１回の用量
ＳＷ４０３腫瘍を注射したマウスについて、マウスを、２つの対照群Ｇ０およびＧ１（群当たり動物６匹）ならびに５つの処置群（Ｇ３～Ｇ７）（群当たり動物６匹）を含む７つの群に編成した。異なる群は以下である：
Ｇ１：対照／未処置
Ｇ２：ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／対照ｇＲＮＡ
Ｇ３：Ｇ１２Ｖ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ４：Ｇ１２Ｖ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ用量１．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ５：カペシタビン（２００μｇ）
Ｇ６：Ｇ１２Ｄ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ／用量１．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ７：Ｇ１２Ｖ標的化ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣＡＳ／ｇＲＮＡ／カペシタビン（２００μｇ）０．５ｍｇ／ｋｇ
動物に、１日目および７日目にＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体を注射した。マウスに、５％グルコース中の１００μｌのＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体をＩＶ注射した。ＰＡＮＣ－１腫瘍サイズを、生物発光イメージングによって評価した。マウスに、非侵襲性生物発光イメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のための１５０μｇ／ｇのルシフェリンをｉ．ｐ．注射した。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データを、製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を光子／秒（光子／ｓ）として表した。生物発光イメージングを、１週間に１回実施した。次いで、結果を、０日目と比較した値として表した。ＳＷ４０３腫瘍サイズを、キャリパーを使用して、７日毎に評価した。次いで、結果を、０日目と比較した値として表した。９０日目に、動物を屠殺し、腫瘍を回収した。
図１１Ａ～１１Ｂに報告されている通り、対照群、およびＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ ＣＡＳ９／対照ｇＲＮＡで処置したマウスでは、腫瘍サイズは、４８日間の期間かかって、６．５倍増加した。ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ３５Ａ５のＩＶ投与は、３５Ｇ＞Ａ（Ｇ１２Ｄ）突然変異体ＫＲＡＳをｉｎ ｖｉｖｏで効率的に標的とし、０．５ｍｇ／ｋｇにおいてＰＡＮＣ１腫瘍成長を３５％低減させる。１ｍｇ／ｋｇの用量では、ＡＤＧＮ／ｇＲＮＡ３５Ａ５は、ＰＡＮＣ１腫瘍成長を無効にした。アブラキサン処置は、ＰＡＮＣ１腫瘍成長を４２％低減させた；アブラキサンとＡＤＧＮ／ｇＲＮＡ３５Ａ５（０．５ｍｇ／ｋｇ）との組合せは、ＰＡＮＣ１腫瘍成長を無効にした；アブラキサンとＡＤＧＮ／ｇＲＮＡ３５Ａ５（１．０ｍｇ／ｋｇ）との組合せは、腫瘍成長を無効にし、初期ＰＡＮＣ１腫瘍のサイズを６０％低減させた。
この結果から、Ｐａｎｃ１腫瘍の処置についてのＡＤＧＮ／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ３５Ａ５とアブラキサンとの相乗効果、および膵臓腫瘍成長の阻害の可能性が実証された。
図１２に報告されている通り、対照群、およびＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ ＣＡＳ９／対照ｇＲＮＡで処置したマウスでは、腫瘍サイズは、４８日間の期間かかって、６．５倍増加した。
９０日目に、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ ０．５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与は、３５Ｇ＞Ｔ（Ｇ１２Ｖ）突然変異体ＫＲＡＳをｉｎ ｖｉｖｏで効率的に標的とし、０．５ｍｇ／ｋｇにおいてＳＷ４０３腫瘍成長を３１％低減させる。１ｍｇ／ｋｇの用量では、ＡＤＧＮ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３は、ＳＷ４０３腫瘍成長を無効にした。カペシタビン処置は、ＳＷ４０３腫瘍成長を３８％低減させた。カペシタビンとＡＤＧＮ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３（０．５ｍｇ／ｋｇ）との組合せは、初期ＳＷ４０３腫瘍のサイズを６０％低減させた。この結果から、ＳＷ４０３腫瘍の処置についてのＡＤＧＮ／ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ３５Ｔ３とカペシタビンとの相乗効果、および結腸直腸腫瘍成長の阻害の可能性が実証された。
（実施例１１）
ｉｎ ｖｉｖｏでのＫＲＡＳ突然変異体の、ＡＤＧＮに媒介される特異的ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集。
ＰＡＮＣ－１およびＳＷ４０３腫瘍細胞におけるそれらの標的に対するｇＲＮＡ３５Ａ５ Ｇ１２ＤおよびｇＲＮＡ３５Ｔ３ Ｇ１２Ｖの特異性が分析されている。６週齢の雌性ヌードマウスに、３５Ｇ＞Ａ突然変異を含むヒト膵癌細胞（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）または３５Ｇ＞Ｔ ＫＲＡＳ突然変異を含むヒト結腸直腸がん細胞（ＳＷ４０３）のいずれかを注射した（２００μｌのＰＢＳ中２０×１０６細胞）。２週間の期間を実験の開始前に経過させて、腫瘍を発生させた。
マウスを、２つの対照群Ｇ０およびＧ１（群当たり動物６匹）ならびに３つの処置群（Ｇ２～Ｇ４）（群当たり動物６匹）を含む５つの群に編成した。異なる群は以下である：
Ｐａｎｃ１－マウスについて
Ｇ０：未処置対照
Ｇ１：ネイキッドＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ２：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ ０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ３：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ａ５ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ４：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ６ １．０ｍｇ／ｋｇ
ＳＷ－４０３マウスについて
Ｇ０：未処置対照
Ｇ１：ネイキッドＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ２：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ ０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ３：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３５Ｔ３ １．０ｍｇ／ｋｇ
Ｇ４：ＡＤＧＮ－１００Ｈｙ３／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ３４Ｔ６ １．０ｍｇ／ｋｇ
動物に、１日目および７日目に注射した。マウスに、５％グルコース中の１００μｌのＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体をＩＶ注射した。５０日目に、動物を屠殺し、組織／腫瘍を回収した。処置の５０日後に、腫瘍、肝臓、脾臓および肺におけるハウスキーピング遺伝子；グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ＨＰＲＴ－１およびミトコンドリアＡＴＰシンターゼ６（ｍＡＴＰｓｙ６）の発現のレベルを、ＰＣＲによって評価した。図１３Ａ～１３Ｂに報告されている通り、処置の５０日後の動物分析は、肝臓、肺、脾臓および腫瘍を含む選択された組織において、ハウスキーピング遺伝子におけるいずれの変化も明らかにしなかった。
我々は、それぞれ、ＰＡＮＣ１（図１４Ａ）およびＳＷ４０３（図１４Ｂ）腫瘍において、ディープシーケンシングによってＫＲＡＳ Ｇ１２ＤまたはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ遺伝子編集のレベルを分析した。図１４Ａ～１４Ｂに示されている通り、ディープシーケンシングから、ＡＤＧＮ－Ｈｙ３／ｓｇＲＮＡ３５Ｔ３ ｓｇＲＮＡおよびＡＤＧＮ－Ｈｙ３／ｓｇＲＮＡ３５Ａ５がそれぞれ、ＳＷ４０３腫瘍において７２％のインデル頻度およびＰＡＮＣ－１腫瘍において７６％のインデル頻度を生じたことが示された。下流のシグナル伝達タンパク質（ｐＡＫＴおよびｐＥＲＫ）のレベルを、ＰＡＮＣ１およびＳＷ４０３腫瘍に対するＥＬＩＳＡによって定量化した。図１５Ａから、ｇＲＮＡ３５Ａ５を使用したＫＲＡＳＧ１２Ｄのノックアウトが、ＰＡＮＣ１腫瘍においてｐ－ＡＫＴおよびｐ－ＥＲＫのレベルを有意に低減させたことが実証された。ｇＲＮＡ３５Ｔ３を使用したＫＲＡＳＧ１２Ｖのノックアウトは、ＳＷ４０３腫瘍においてｐ－ＥＲＫのレベルに有意に影響を及ぼしたが、Ｐ－ＡＫＴのレベルには有意には影響を及ぼさなかった（図１５Ｂ）。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡを使用したＫＲＡＳの標的化が、標的部位またはその近傍において種々の二次的突然変異を誘導し得ることを考慮すると、ディープシーケンシングにより、ＫＲＡＳ－突然変異体がん細胞（ＳＷ４０３／ＰＡＮＣ－１）、または野生型ＫＲＡＳを含む細胞（ＨＴ２９）のいずれにおいても、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、同様のレベルの二次的な発癌性突然変異（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ａ、およびＧ１２Ｓ）が示された。
（実施例１２）
ＡＤＧＮ／ＣＲＩＳＰＲ／ＫＲＡＳ処置は、ｉｎ ｖｉｖｏで十分に忍容性が示される
ＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ａ５およびＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ３５Ｔ３の毒性およびｉｎ ｖｉｖｏ忍容性が評価されている。動物を、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇのＡＤＧＮ／Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体で０日目および７日目に静脈内で処置した。動物体重を、異なる時点で定量化した（図１６Ａ～１６Ｂ）。血液試料を、Ｄ７、Ｄ１５およびＤ３０に、ヘパリン処置した管中に収集し、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血漿濃度について分析した。図１６Ａ～１６Ｂに報告されている通り、全ての処置が十分に忍容性が示され、有意な体重減少は観察されなかった。ＢＵＮ、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびクレアチニンに有意な変動がないことは、処置の高い忍容性と、腎および肝毒性がないこととを示唆した（図１７Ａ～１７Ｄ）。
（実施例１３）
表８に、ＣＲＩＳＰＲ分子（例えば、本明細書に記載のガイドＲＮＡ）の細胞中へのｉｎ ｖｉｖｏでの送達（例えば、静脈内（ＩＶ）投与、筋肉内（ＩＭ）投与、もしくは皮下（ＳＱ）投与、または噴霧（ＮＢ）もしくは気管内滴下注入によって）に関して成功が証明された細胞透過性ペプチドの要約を列挙する。示されたように、細胞透過性ペプチドのほとんどは、１つまたは複数の器官を特異的に標的とすることができた。
表8.
Figure 2023516225000011
Figure 2023516225000012
Figure 2023516225000013
以下の表９は、表８および図６に基づく、ＣＲＩＳＰＲ分子（例えば、本明細書に記載のガイドＲＮＡ）を細胞中にｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、静脈内（ＩＶ）投与、筋肉内（ＩＭ）投与、もしくは皮下（ＳＱ）投与、または噴霧（ＮＢ）もしくは気管内滴下注入によって）送達することができる細胞透過性ペプチドの配列番号を示す。
表9.
Figure 2023516225000014
Figure 2023516225000015
 （実施例１４）
がん細胞株。
全ての細胞株はＡＴＣＣから得、特徴は図２４に報告されている。膵がん（ＰＤＡＣ）：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＰＡＮＣ１、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてホモ接合性のＰＫ ４５Ｈ、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＰＫ１、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）についてホモ接合性のＭＩＡ－ＰＡＣＡ、ＡＳＰＣ－１ ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）
結腸直腸がん（ＣＲＣ）：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）についてホモ接合性のＳＷ４８０、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）についてヘテロ接合性のＳＷ４０３、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）についてヘテロ接合性のＬＳ５１３、ＫＲＡＳについてＷＴであり、ＴＰ５３ ｐ．Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ（ｃ．８１８Ｇ＞Ａ）についてホモ接合性のＨＴ－２９、ＫＲＡＳについてＷＴのＨＴ－２９
肺がん（ＮＳＣＬＣ）：ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）についてヘテロ接合性のＮＣＩ Ｈ２３、ＣＡＬＵ－１、Ｈ－２１２２、Ｈ３５８、ＫＲＡＳについてＷＴのＨ１２９９、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）についてＨ－２４４４、Ｈ－４４１
ＡＤＧＮ－１２１ナノ粒子を使用した、がん細胞株におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異の特異的標的化
我々は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異したがん細胞に高度に特異的なｇＲＮＡ３５Ｔ３ガイドを選択して、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異したがん細胞において７０％よりも高いインデル頻度をもたらしている。ＡＤＧＮ－１２１ナノ粒子は、モル比２０／１（ペプチド／核酸）でＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ３ペプチド）と会合させたｇＲＮＡ３５Ｔ３ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（モル比１／１）に対応する。ＡＤＧＮ－１２１ナノ粒子を、がん細胞の大きいパネルに対して評価した。細胞を、９８ウェルプレートフォーマットで培養し、１日目に、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ－１２１（ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ）複合体（０．１～１０μＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析し、細胞毒性を、処置の７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＧｌｏｗまたはＭＴＴアッセイキットを使用して分析した。
図２０に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１２１（ｇＲＮＡ３５Ｔ３）は、全てのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異したがん細胞の細胞増殖を特異的に阻害する。対照的に、ＡＤＧＮ－１２１は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（ＰＡＮＣ－１、ＬＳ－５１３）、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ（Ｈ－３５８、ＣＡＬＵ－１）突然変異体細胞の増殖もＷＴ ＫＲＡＳ（ＨＴ－２９、Ｈ－１２９９）細胞の増殖も変更しない。図２５に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１２１ナノ粒子は、１０～５０ｎＭのナノモル濃度範囲のＩＣ５０値で、ＮＳＣＬＣおよびＣＲＣ細胞においてＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ編集を誘導した。ＡＤＧＮ－１２１毒性の分析により、ＩＣ５０よりも４５０～１０００倍高い濃度値（７～１５μＭ）で毒性が生じることが示された。
ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙｄｒｏ３ペプチドをこの実験に使用した。ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ３は、同じ効率を有する。
ＡＤＧＮ－１２３ナノ粒子を使用した、がん細胞株におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異の特異的標的化
我々は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異したがん細胞に高度に特異的なｇＲＮＡ３５Ａ５ガイドを選択して、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異したがん細胞において７０％よりも高いインデル頻度をもたらしている。ＡＤＧＮ－１２３ナノ粒子は、モル比２０／１（ペプチド／核酸）でＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ３ペプチド）と会合させたｇＲＮＡ３５Ａ５ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（モル比１／１）に対応する。ＡＤＧＮ－１２３ナノ粒子を、がん細胞の大きいパネルに対して評価した。細胞を、９８ウェルプレートフォーマットで培養し、１日目に、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ－１２３（ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ）複合体（０．１～１０μＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析し、細胞毒性を、処置の７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＧｌｏｗまたはＭＴＴアッセイキットを使用して分析した。
図２１に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１２３（ｇＲＮＡ３５Ａ５）は、全てのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異したがん細胞の細胞増殖を特異的に阻害する。対照的に、ＡＤＧＮ－１２３は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（Ｈ－４４１、ＳＷ－４８０、ＳＷ－４０３）およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ（Ｈ－３５８、ＭＩＡ ＰＡＣＡ）突然変異体細胞もＷＴ（ＨＴ－２９）ＫＲＡＳ細胞も変更しない。図２６に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１２３ナノ粒子は、１０～２５ｎＭのナノモル濃度範囲のＩＣ５０値で、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を有するＰＤＡおよびＣＲＣ細胞においてＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ編集を誘導する。ＡＤＧＮ－１２３毒性の分析により、ＩＣ５０よりも４５０～１０００倍高い濃度値（７～１５μＭのＣＣ５０）で毒性が生じることが示された。
ＡＤＧＮ－１０６ Ｈｙｄｒｏ３ペプチドをこの実験に使用した。ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ３は、同じ効率を有する。
ＡＤＧＮ－１２２を用いた、がん細胞株におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異の特異的標的化
我々は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異したがん細胞に高度に特異的なｇＲＮＡ３４Ｔ６ガイドを選択して、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異したがん細胞において７０％よりも高いインデル頻度をもたらしている。ＡＤＧＮ－１２２ナノ粒子は、モル比２０／１（ペプチド／核酸）でＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ３ペプチド）と会合させたｇＲＮＡ３４Ｔ６ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（モル比１／１）に対応する。ＡＤＧＮ－１２２ナノ粒子を、がん細胞の大きいパネルに対して評価した。細胞を、９６ウェルプレートフォーマットで培養し、１日目に、遊離ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ、またはＡＤＧＮ－１２２（ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡＣａｓ９－ｇＲＮＡ）複合体（０．１～１０μＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析し、細胞毒性を、処置の７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＧｌｏｗまたはＭＴＴアッセイキットを使用して分析した。
図２２に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１２２（ｇＲＮＡ３４Ｔ６）は、全てのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異したがん細胞の細胞増殖を特異的に阻害する。対照的に、ＡＤＧＮ－１２２は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（Ｈ－４４１、ＳＷ－４８０、ＳＷ－４０３）およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（ＰＡＮＣ－１、ＡＳＰＣ－１）突然変異体細胞もＷＴ（Ｈ－１２９９）ＫＲＡＳ細胞も変更しない。図２７に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１２２ナノ粒子は、１０～１６ｎＭのナノモル濃度範囲のＩＣ５０値で、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異を有するＰＤＡおよびＮＳＣＬ細胞においてＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ編集を誘導する。ＡＤＧＮ－１２２毒性の分析により、ＩＣ５０よりも８００～１０００倍高い濃度値（７～１５μＭのＣＣ５０）で毒性が生じることが示された。
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異体細胞株に対する、ＡＤＧＮ－１２２／ＡＭＧ－５１０の比較
Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳを特異的に標的とするＡＭＧ５１０阻害剤は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の前臨床モデルにおいて有効性を示しており、免疫チェックポイント遮断に対する応答を増強することも示されている。しかし、ＡＭＧ－５１０は、Ｇ１２Ｃ突然変異に特異的であり、Ｇ１２Ｄ突然変異体ＫＲＡＳは阻害しない。我々は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異を有する４つの異なるがん細胞株（ＭＩＡ ＰＡＣＡ、Ｈ－３５８、ＣＡＬＵ－１、Ｈ－２１２２）に対する、ＡＤＧＮ－１２２ 対 ＡＭＧ－５１０の効力を評価している。細胞を、処置の２４時間前に、９６ウェルプレートフォーマットでプレートした。細胞を、１日目に、ＡＤＧＮ－１２２またはＡＭＧ－５１０（１～１０００ｎＭ）で処置した。細胞増殖を、ＧｌｏｗＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏｗキットを使用して５日間の期間にわたって分析し、細胞毒性を、処置の７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＧｌｏｗまたはＭＴＴアッセイキットを使用して分析した。
ＡＤＧＮ－１２２効率は、ＭＩＡ ＰＡＣＡ細胞ではＡＭＧ－５１０と同様である。
図２０および図２８に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１２２およびＡＭＧ－５１０は共に、全てのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ突然変異したがん細胞の増殖を特異的に阻害する。ＡＤＧＮ－１２２およびＡＭＧ－５１０は、ＰＤＡ（ＭＩＡ－ＰＡＣＡ）細胞において同様の有効性を有する。ＡＤＧＮ－１２２は、ＮＳＣＬＣ細胞では、ＡＭＧ－５１０よりも効率的である。ＡＤＧＮ－１２２は、ＡＭＧ－５１０、Ｈ－２１２２、Ｈ－３５８およびＣＡＬＵ－１細胞よりも、それぞれ３．７倍、５．７倍および７．１倍強力である。
ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙｄｒｏ３ペプチドをこの実験に使用した。ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ３は、同じ効率を有する。
配列表
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本開示は、別の態様では、個体におけるがんを処置する方法であって、個体に上記の医薬組成物のうちのいずれか１つを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、第２の薬剤を投与するステップをさらに含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含む、天然に存在しないポリヌクレオチド。
(項目２)
前記ガイドＲＮＡが、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
(項目３)
標的配列と実質的に相補的な前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される、項目１または項目２に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
(項目４)
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的である、項目３に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
(項目５)
化学的に改変されている、項目１から４までのいずれか一項に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
(項目６)
前記ガイドＲＮＡが、約２００ヌクレオチド以下の長さを有する、項目１から５までのいずれか一項に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
(項目７)
ａ）第１の細胞透過性ペプチド、およびｂ）突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体であって、前記ガイドＲＮＡが、項目１から６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ゲノム編集複合体。
(項目８)
ＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目７に記載のゲノム編集複合体。
(項目９)
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、そのバリアント、その断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目８に記載のゲノム編集複合体。
(項目１０)
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドを含む、項目９に記載のゲノム編集複合体。
(項目１１)
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９である、項目９または項目１０に記載のゲノム編集複合体。
(項目１２)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、項目７から１１までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目１３)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、前記第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、前記１つまたは複数の部分が、アセチル、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖、リンカー部分、および標的化部分からなる群から選択される、項目７から１２までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目１４)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、前記第１の細胞透過性ペプチドの前記Ｎ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む、項目１３に記載のゲノム編集複合体。
(項目１５)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、前記第１の細胞透過性ペプチドの前記Ｎ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む、項目１３または項目１４に記載のゲノム編集複合体。
(項目１６)
前記標的化ペプチドが、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される、項目１５に記載のゲノム編集複合体。
(項目１７)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む、項目７から１６までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目１８)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、Ｎ末端から、前記第１の細胞透過性ペプチドの前記Ｎ末端に共有結合により連結した、アセチル基、標的化部分およびリンカー部分を含む、項目１３から１７までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目１９)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、炭水化物部分をさらに含む、項目７から１８までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目２０)
前記炭水化物部分が、ＧａｌＮＡｃである、項目１９に記載のゲノム編集複合体。
(項目２１)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、項目７から２０までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目２２)
前記第１の細胞透過性ペプチドが、配列番号８９～１０７、１１１～１１７、および１５３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目７から２１までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目２３)
前記第１の細胞透過性ペプチドの前記ガイドＲＮＡに対するモル比が、約１：１から約８０：１の間である、項目１から２２までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目２４)
前記第１の細胞透過性ペプチドの前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に対するモル比が、約１：１から約８０：１の間である、項目８から２３までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目２５)
異なるガイド配列を含む１つまたは複数の追加的なガイドＲＮＡをさらに含む、項目７から２４までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目２６)
２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、ある単一のＫＲＡＳ突然変異を標的とする、項目２５に記載のゲノム編集複合体。
(項目２７)
前記２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、２つまたはそれよりも多くの異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする、項目２６に記載のゲノム編集複合体。
(項目２８)
前記２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、および／またはＧ１２Ｃを標的とする、項目２６または２７に記載のゲノム編集複合体。
(項目２９)
前記ゲノム編集複合体の平均直径が、約１０ｎｍから約３００ｎｍの間である、項目１から２８までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
(項目３０)
項目１から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体を含むコアを含むナノ粒子。
(項目３１)
項目１から６までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ、項目７から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体、または項目３０に記載のナノ粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(項目３２)
２つまたはそれよりも多くのナノ粒子を含み、前記２つまたはそれよりも多くのナノ粒子が、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする、異なるガイドＲＮＡを含む、項目３１に記載の医薬組成物。
(項目３３)
項目７から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体を調製する方法であって、前記第１の細胞透過性ペプチドを前記ガイドＲＮＡと組み合わせ、それにより、前記ゲノム編集複合体を形成するステップを含む方法。
(項目３４)
細胞における突然変異したＫＲＡＳを改変する方法であって、前記細胞に項目１から６までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ、項目７から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体、または項目３０に記載のナノ粒子を接触させるステップを含む方法。
(項目３５)
個体におけるがんを処置する方法であって、個体に項目３１または３２に記載の医薬組成物を有効量で投与するステップを含む方法。
(項目３６)
第２の薬剤を投与するステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。

Claims (36)

  1. 配列番号１～３７、２４１～２５７および２７１からなる群から選択される標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む特異性決定ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む突然変異したＫＲＡＳを標的とするためのガイドＲＮＡを含む、天然に存在しないポリヌクレオチド。
  2. 前記ガイドＲＮＡが、補助的トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む、請求項１に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
  3. 標的配列と実質的に相補的な前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、６、８、１５、１６、１９～２１、２３、２９、３１、３３、および３４からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
  4. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、１９、および３４からなる群から選択される標的配列と１００％相補的である、請求項３に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
  5. 化学的に改変されている、請求項１から４までのいずれか一項に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
  6. 前記ガイドＲＮＡが、約２００ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
  7. ａ）第１の細胞透過性ペプチド、およびｂ）突然変異したＫＲＡＳを標的とするガイドＲＮＡを含むゲノム編集複合体であって、前記ガイドＲＮＡが、請求項１から６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ゲノム編集複合体。
  8. ＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７に記載のゲノム編集複合体。
  9. 前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、そのバリアント、その断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載のゲノム編集複合体。
  10. 前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドを含む、請求項９に記載のゲノム編集複合体。
  11. 前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９である、請求項９または請求項１０に記載のゲノム編集複合体。
  12. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、請求項７から１１までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  13. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、前記第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端に共有結合により連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、前記１つまたは複数の部分が、アセチル、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖、リンカー部分、および標的化部分からなる群から選択される、請求項７から１２までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  14. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、前記第１の細胞透過性ペプチドの前記Ｎ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む、請求項１３に記載のゲノム編集複合体。
  15. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、前記第１の細胞透過性ペプチドの前記Ｎ末端に共有結合により連結した標的化ペプチドを含む標的化部分を含む、請求項１３または請求項１４に記載のゲノム編集複合体。
  16. 前記標的化ペプチドが、配列番号１９６～２０５および２３５～２４０からなる群から選択される、請求項１５に記載のゲノム編集複合体。
  17. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、ポリグリシンリンカー部分、ＰＥＧ部分、Ａｕｎ、Ａｖａ、およびＡｈｘからなる群から選択されるリンカー部分を含む、請求項７から１６までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  18. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、Ｎ末端から、前記第１の細胞透過性ペプチドの前記Ｎ末端に共有結合により連結した、アセチル基、標的化部分およびリンカー部分を含む、請求項１３から１７までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  19. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、炭水化物部分をさらに含む、請求項７から１８までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  20. 前記炭水化物部分が、ＧａｌＮＡｃである、請求項１９に記載のゲノム編集複合体。
  21. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、請求項７から２０までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  22. 前記第１の細胞透過性ペプチドが、配列番号８９～１０７、１１１～１１７、および１５３～１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７から２１までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  23. 前記第１の細胞透過性ペプチドの前記ガイドＲＮＡに対するモル比が、約１：１から約８０：１の間である、請求項１から２２までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  24. 前記第１の細胞透過性ペプチドの前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に対するモル比が、約１：１から約８０：１の間である、請求項８から２３までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  25. 異なるガイド配列を含む１つまたは複数の追加的なガイドＲＮＡをさらに含む、請求項７から２４までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  26. ２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、ある単一のＫＲＡＳ突然変異を標的とする、請求項２５に記載のゲノム編集複合体。
  27. 前記２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、２つまたはそれよりも多くの異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする、請求項２６に記載のゲノム編集複合体。
  28. 前記２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡのうちの少なくとも２つが、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、および／またはＧ１２Ｃを標的とする、請求項２６または２７に記載のゲノム編集複合体。
  29. 前記ゲノム編集複合体の平均直径が、約１０ｎｍから約３００ｎｍの間である、請求項１から２８までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体。
  30. 請求項１から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体を含むコアを含むナノ粒子。
  31. 請求項１から６までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ、請求項７から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体、または請求項３０に記載のナノ粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  32. ２つまたはそれよりも多くのナノ粒子を含み、前記２つまたはそれよりも多くのナノ粒子が、異なるＫＲＡＳ突然変異を標的とする、異なるガイドＲＮＡを含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 請求項７から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体を調製する方法であって、前記第１の細胞透過性ペプチドを前記ガイドＲＮＡと組み合わせ、それにより、前記ゲノム編集複合体を形成するステップを含む方法。
  34. 細胞における突然変異したＫＲＡＳを改変する方法であって、前記細胞に請求項１から６までのいずれか一項に記載のガイドＲＮＡ、請求項７から２９までのいずれか一項に記載のゲノム編集複合体、または請求項３０に記載のナノ粒子を接触させるステップを含む方法。
  35. 個体におけるがんを処置する方法であって、個体に請求項３１または３２に記載の医薬組成物を有効量で投与するステップを含む方法。
  36. 第２の薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
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