JP2019520394A - 癌を処置するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９ベースの組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

対象においてがんを予防、阻害または処置するための方法が、本明細書に記載されている。がん細胞などの細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法もまた、本明細書に提供されている。かかる方法は、コンパクトなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされた、双方向ＨＩプロモーターと癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に方向付けられたｇＲＮＡとを含むクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）（ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）などの修飾ヌクレアーゼシステムを利用することを含み得る。かかる方法は、組換えアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を、ヌクレアーゼシステムと共投与することまたは同時に提供することを含み得る。

Description

相互参照
本出願は、２０１６年７月５日に出願された米国仮出願番号第６２／３５８，３３９号の利益を主張しており、この仮出願の全体は、参考として本明細書によって援用される。
政府支援の陳述
本発明は、国立がん研究所によって授与されたＲ０１ＣＡ１５７５３５の下の政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
背景
がん関連またはがん特異的分子（例えば、遺伝子、タンパク質、酵素）の首尾よく、かつ有効な標的化の主要な課題の１つは、特異性の欠如である。前臨床検証中の現在の化学療法薬および薬剤は、選択された分子の阻害において有効であるが、標的に対して特異的ではない。これは、実際に、化学療法薬を用いて一般に経験される望まれないおよび望ましくない毒性の主要な原因因子である。遺伝子治療戦略、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、分子標的に対して非常に特異的であるが、腫瘍へのそれらの選択的送達は、主要な課題である。さらに、ｓｉＲＮＡは、腫瘍への特異的ＲＮＡの一定かつ高レベルの送達を必要とする、１：１の比で標的を不活性化または中和することの制限を有する。他方で、ｓｈＲＮＡは、腫瘍中に導入されると、宿主ゲノム中に組み込まれ得、特異的標的を妨げ得る一連のアンチセンスオリゴを産生し得る。
前臨床報告は、がんの分子標的化が、治療有効性を顕著に改善することを示している（Gharwan, H.およびGroninger, H. Nat. Rev. Clin. Oncol.（２０１５年））。しかし、大部分の抗がん剤の首尾よい臨床移転は、いまだ課題のままである（Rothenberg, MLら、Nat. Rev. Cancer. ３巻、３０３〜３０９頁（２００３年）；Le Tourneau, Cら、Target Oncol. ５巻、６５〜７２頁（２０１０年））。核酸ベースのアンチセンス治療手法（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）は、分子特異性および有効な阻害において優位性を享受しているが、ある特定の固有の制限が、臨床適用に向かう成功を阻んでいる（Ganapathy-Kanniappan Sら、Mol Cancer. ２０１３年；１２巻：１５２頁、4598-12-152.、Pecot, CVら、Nat. Rev. Cancer. １１巻、５９〜６７頁（２０１１年））。
したがって、がんの処置において増強された標的特異性を有する革新的な治療戦略および組成物を開発することが強く必要とされている。
Gharwan, H.およびGroninger, H. Nat. Rev. Clin. Oncol.（２０１５年）。 Rothenberg, MLら、Nat. Rev. Cancer. ３巻、３０３〜３０９頁（２００３年） Le Tourneau, Cら、Target Oncol. ５巻、６５〜７２頁（２０１０年） Ganapathy-Kanniappan Sら、Mol Cancer. ２０１３年；１２巻：１５２頁、4598-12-152 Pecot, CVら、Nat. Rev. Cancer. １１巻、５９〜６７頁（２０１１年）
要旨
本発明の実施は、典型的には、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来の技術を使用する。ある特定のこれらの技術の非限定的な記載は、以下の刊行物中に見出される：Ausubel, F.ら（編）、Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols in Immunology、Current Protocols in Protein ScienceおよびCurrent Protocols in Cell Biology、全てJohn Wiley & Sons、N.Y.、２００８年１２月時点の版；Sambrook、RussellおよびSambrook、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、２００１年；Harlow, E.およびLane, D.、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、１９８８年；Freshney, R. I.、「Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique」、第５版、John Wiley & Sons、Hoboken、N.J.、２００５年。治療剤およびヒト疾患に関する非限定的な情報は、GoodmanおよびGilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics、第１１版、McGraw Hill、２００５年、Katzung, B.（編）Basic and Clinical Pharmacology、McGraw-Hill/Appleton & Lange 第１０版（２００６年）または第１１版（２００９年７月）中に見出される。遺伝子および遺伝障害に関する非限定的な情報は、McKusick, V. A.：Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore：Johns Hopkins University Press、１９９８年（第１２版）またはより最近のオンラインデータベース：ワールドワイドウェブ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/上で入手可能な、２０１０年５月１日時点のOnline Mendelian Inheritance in Man、OMIM（商標）. McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine、Johns Hopkins University（Baltimore、Md.）およびNational Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine（Bethesda、Md.）、ならびにワールドワイドウェブ：http://omia.angis.org.au/contact.shtml上で入手可能な、動物種（ヒトおよびマウス以外）における遺伝子、遺伝性障害および形質のデータベースであるOnline Mendelian Inheritance in Animals（ＯＭＩＡ）中に見出される。本明細書で言及されている全ての特許、特許出願および他の刊行物（例えば、科学論文、書籍、ウェブサイトおよびデータベース）は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書と組み込まれた参考文献のいずれかとの間に矛盾がある場合、本明細書（組み込まれた参考文献に基づき得るその任意の補正を含む）が支配するものとする。特に示さない限り、用語の標準的な当該分野で受容された意味が本明細書で使用される。種々の用語の標準的な略号が本明細書で使用される。
がんを処置するための方法が、本明細書に記載されている。これらの方法は、癌遺伝子突然変異を治療的に標的化するためまたは欠損腫瘍抑制遺伝子を修復するための、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などの修飾ヌクレアーゼシステムを使用する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集は、がんを引き起こす癌遺伝子突然変異を不活性化または修正し、それによって、がんの根底にある原因を処置するための遺伝子治療手法を提供するために使用され得る。
したがって、本発明の一態様は、対象においてがんを予防、阻害または処置するための方法であって、ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）と、少なくとも１つの標的化ゲノム配列、例えば、発癌突然変異または腫瘍抑制遺伝子を含むガイドＲＮＡとを含むヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法に関する。この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで組換えアデノ随伴ウイルスをパッケージングする能力を有するアデノウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス；「Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ」）を、本明細書に記載されているｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧと併せてまたは同時に共投与するステップをさらに含み得る。
本発明の別の態様は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの修飾を含む組成物を利用する、がんを予防、阻害または処置するための方法を提供する。かかる修飾は、例えば、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡもしくはＩＤＨ１、または腫瘍抑制遺伝子中の突然変異であるがこれらに限定されないがんの発癌突然変異を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この組成物は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）を含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このヌクレアーゼシステムを含有するアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される。Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋはまた、ヌクレアーゼ−ｇＲＮＡシステムをコードしないが、腫瘍の破壊または免疫系による腫瘍の認識の増加を促進する遺伝子をその代わりにコードするｒＡＡＶと一緒に使用され得る。例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶＰａｃｋは、導入遺伝子、例えば、インターフェロン−αまたは野生型ｐ５３をコードするコンパニオンｒＡＡＶのパッケージングを方向付けし得る。例えば、ＡＡＶ−ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはＡＡＶ−ＴＳＧは、単独で、またはＡｄ−ｒＡＡＶＰａｃｋとタンデムに送達され得る。対照的に、Ａｄ−ｒＡＡＶＰａｃｋは、ヌクレアーゼ−ｇＲＮＡを送達するように操作されていてもいなくても、任意のｒＡＡＶと共に使用され得る。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
本発明の別の態様は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された修飾された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。かかる修飾は、例えば、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡもしくはＩＤＨ１、または腫瘍抑制遺伝子であるがこれらに限定されない発癌突然変異を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）を含む組成物を細胞中に導入するステップを含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このヌクレアーゼシステムを含有するアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
本発明の一態様は、それを必要とする対象においてがんを予防、阻害または処置するための方法であって、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の癌遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；および（ｂ）治療有効量のこのシステムを対象に投与するステップを含む、方法に関する。
一部の実施形態では、この方法は、組換えアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を提供するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、このＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、ヌクレアーゼシステムと同時に提供され、または共投与される。
一部の実施形態では、このシステムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である。
一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。
一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルス遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む。
一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される。
一部の実施形態では、このパッケージングウイルスはアデノウイルス血清型５である。
一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される。
一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子はＥ３である。
一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。
一部の実施形態では、このプロモーターはＨ１プロモーターである。
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは双方向性である。このＨ１プロモーターは、ｐｏｌ ＩＩおよびｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの両方である。
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
一部の実施形態では、このゲノム標的化ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質である。
一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。
一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、この標的配列は、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である。
一部の実施形態では、この標的配列は、少なくとも１つの突然変異を含む癌遺伝子である。
一部の実施形態では、この標的配列は、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である。
一部の実施形態では、この標的配列は、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である。
一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＫＲＡＳである。
一部の実施形態では、このＫＲＡＳは、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む。
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＰＩＫ３ＣＡである。
一部の実施形態では、このＰＩＫ３ＣＡは、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む。
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＩＤＨ１である。
一部の実施形態では、このＩＤＨ１は、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む。
一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、全身投与を介して投与される。
一部の実施形態では、この全身投与は、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される。
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、腫瘍内または腫瘍周囲投与される。
一部の実施形態では、この対象は、少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される。
一部の実施形態では、この抗がん剤は、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この対象は、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される。
一部の実施形態では、この抗がん療法は、放射線療法、化学療法または手術である。
一部の実施形態では、このがんは固形腫瘍である。
一部の実施形態では、このがんは、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される。
一部の実施形態では、このがんは脳がんである。
一部の実施形態では、この対象は哺乳動物である。
一部の実施形態では、この哺乳動物はヒトである。
一部の実施形態では、この対象において細胞増殖は阻害または低減される。
一部の実施形態では、この対象において悪性腫瘍は阻害または低減される。
一部の実施形態では、この対象において腫瘍壊死は増強または増加される。
本発明の別の態様は、細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、（ｉ）ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更するステップを含む方法に関する。
一部の実施形態では、この方法は、組換えアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を提供するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、このＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、このヌクレアーゼシステムと同時に提供され、または共投与される。
一部の実施形態では、このシステムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である。
一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。
一部の実施形態では、このパッケージングウイルスは、アデノウイルス遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む。
一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される。
一部の実施形態では、このアデノウイルスパッケージングウイルスはアデノウイルス血清型５である。
一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される。
一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子はＥ３である。
一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。
一部の実施形態では、このプロモーターはＨ１プロモーターである。
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは双方向性である。
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
一部の実施形態では、このゲノム標的化ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質である。
一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。
一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、この標的配列は、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である。
一部の実施形態では、この標的配列は、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣからなる群から選択される、がんドライバー遺伝子である。
一部の実施形態では、この標的配列は、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である。
一部の実施形態では、標的配列は、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である。
一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＫＲＡＳである。
一部の実施形態では、このＫＲＡＳは、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む。
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＰＩＫ３ＣＡである。
一部の実施形態では、このＰＩＫ３ＣＡは、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む。
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＩＤＨ１である。
一部の実施形態では、このＩＤＨ１は、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む。
一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
一部の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞または非真核生物細胞である。
一部の実施形態では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
一部の実施形態では、この真核生物細胞はがん性細胞である。
一部の実施形態では、この細胞において細胞増殖は阻害または低減される。
一部の実施形態では、この細胞においてアポトーシスは増強または増加される。
本開示の主題によって全体的にまたは部分的に扱われる本開示の主題のある特定の態様が本明細書で上記されているが、他の態様は、以下に本明細書に最良に記載されている添付の実施例および図面と関連して解釈すると、説明が進むにつれて明らかになる。
このように本開示の主題を一般に述べたところで、必ずしも一定の縮尺で描かれたものではない添付の図面を参照する：
図１は、ＡｄとＡＡＶの間の関係を示す。野生型ＡＡＶは、Ａｄに感染した細胞だけ繁殖することができる。野生型ＡＡＶのコンパクトな一本鎖ＤＮＡゲノムは、逆位末端反復（ＩＴＲ）が隣接する２個の遺伝子を有する（右）。ＡＡＶ複製のために必要な遺伝子エレメントの残部は、Ａｄによってトランスで提供される。野生型Ａｄは、自己限定性の細胞溶解性感染を引き起こすが、修飾されたウイルスは、導入遺伝子送達のためのベクターとして、しばしば使用される。
図２は、二重ウイルス遺伝子送達システムを示す。組換えウイルスＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、ＡＡＶ複製に必要な他のトランス因子に加えて、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐを発現する。したがって、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、共感染したｒＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏ複製を容易にする。これらのコンパニオンｒＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９エレメントまたは腫瘍抑制因子などの導入遺伝子を備えることができる。２種類のウイルスシステムが、任意のタイプのｒＡＡＶをｉｎ ｖｉｖｏで繁殖させるために使用され得る。
図３は、腫瘍溶解療法のための二重ウイルス手法を示す。Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、腫瘍に特異的なドライバー突然変異を標的にするようにプログラムされたコンパニオンｒＡＡＶで、腫瘍に適用される。ｒＡＡＶは、突然変異を有さない腫瘍には効果がない。Ｅ１Ｂ突然変異により課せられた宿主範囲制限のために、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、腫瘍の細胞内で選択的に繁殖する。Ｅ１Ｂにおけるいくつかの突然変異が、この宿主範囲の制限を与えることが示されている。一部の実施形態では、ｓｕｂ１９と呼ばれる４つのアミノ酸突然変異が使用される（Chahalら（２０１３年） ８７巻：４４３２〜４４頁）。Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋに増殖感染した細胞は溶解し、新しい複製されたＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋおよびｒＡＡＶを局所環境中に導入する。ｒＡＡＶだけが感染した細胞は、ドライバー遺伝子の喪失のために増殖阻害される。かかる細胞は、腫瘍の免疫原性を増大させ得る。
図４は、ＫＲＡＳについて発癌性不活性化のためにＲＮＡに方向付けられたヌクレアーゼの使用を示す３つのパネルＡ、Ｂ、およびＣを含む。 同上。 同上。
図５は、ＰＩＫ３ＣＡについて発癌性不活性化のためにＲＮＡ方向付けられたヌクレアーゼの使用を示す２つのパネルＡおよびＢを含む。 同上。
詳細な説明
ここで、本開示の主題は、本開示の主題の一部であるが全てではない実施形態が示される添付の図面を参照して、以下により完全に記載される。あらゆる場所で、同様の番号は同様の要素を指す。本開示の主題は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満足するように提供される。実際、本明細書に示される本開示の主題の多くの修飾および他の実施形態は、前述の説明および添付の図面に示される教示の利益を有する、本開示の主題が関連する分野の当業者に想起される。したがって、本開示の主題が、開示されている具体的な実施形態に限定されないこと、ならびに修飾および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる意図であることを理解すべきである。
ゲノム編集技術、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（PorteusおよびBaltimore（２００３年）Science ３００巻：７６３頁；Millerら（２００７年）Nat. Biotechnol. ２５巻：７７８〜７８５頁；Sanderら（２０１１年）Nature Methods ８巻：６７〜６９頁；Woodら（２０１１年）Science ３３３巻：３０７頁）および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（Woodら（２０１１年）Science ３３３巻：３０７頁；Bochら（２００９年）Science ３２６巻：１５０９〜１５１２頁；MoscouおよびBogdanove（２００９年）Science ３２６巻：１５０１頁；Christianら（２０１０年）Genetics １８６巻：７５７〜７６１頁；Millerら（２０１１年）Nat. Biotechnol. ２９巻：１４３〜１４８頁；Zhangら（２０１１年）Nat. Biotechnol. ２９巻：１４９〜１５３頁；Reyonら（２０１２年）Nat. Biotechnol. ３０巻：４６０〜４６５頁）は、標的化されたゲノム修飾を生成する能力を与え、疾患突然変異を正確に修正する能力を提供する。有効ではあるが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ対は共に、所与のＤＮＡ標的部位のために大きい独自の認識タンパク質を合成することを必要とするので、これらの技術は、実務上の制限によって妨げられる。いくつかのグループが、これらの重要な制限を回避する操作されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を介した高効率ゲノム編集を最近報告している（Congら（２０１３年）Science ３３９巻：８１９〜８２３頁；Jinekら（２０１３年）eLife ２巻：ｅ００４７１頁；Maliら（２０１３年）Science ３３９巻：８２３〜８２６頁；Choら（２０１３年）Nat. Biotechnol. ３１巻：２３０〜２３２頁；Hwangら（２０１３年）Nat. Biotechnol. ３１巻：２２７〜２２９頁）。比較的時間がかかり作製が困難であるＺＦＮおよびＴＡＬＥＮとは異なり、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とカップリングされたＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に依存するＣＲＩＳＰＲ構築物は、合成が単純かつ迅速であり、多重化され得る。しかし、それらの合成が比較的容易であるにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９自体の特性およびそのｇＲＮＡの合成の両方の関数である、標的化可能なゲノム空間へのアクセスに関する技術的制限を有する。
ＣＲＩＳＰＲシステムによる切断は、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列へのｇＲＮＡの相補的塩基対合および標的部位に対して３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする（Jinekら（２０１２年）Science ３３７巻：８１６〜８２１頁）。理論上は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してゲノム中の任意の独自のＮ２０−ＰＡＭ配列を標的化することができる。使用される特定のＣａｓ９の起源の種に依存して変動するＰＡＭ配列のＤＮＡ結合特異性は、制約を与える。現在、制限が最小であり最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であり、これは、配列ＮＧＧを認識し、したがって、ゲノム中の、２つのグアノシンヌクレオチドが後に続く任意の独自の２１ヌクレオチド配列（Ｎ２０ＮＧＧ）が標的化され得る。タンパク質構成要素によって課される利用可能な標的化空間の増大は、変更されたＰＡＭ要件を有する新規Ｃａｓ９タンパク質の発見および使用に制限され（Congら（２０１３年）Science ３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）、または突然変異誘発もしくは定向進化を介した新規Ｃａｓ９バリアントの生成を待っている。ＣＲＩＳＰＲシステムの第２の技術的制約は、５’グアノシンヌクレオチドにおけるｇＲＮＡ発現の開始から生じる。ＩＩＩ型クラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの使用は、ｇＲＮＡ発現のために特に受け入れられてきたが、それは、これらの短い非コード転写物が十分に規定された末端を有し、１＋ヌクレオチドを除く転写に必要な全てのエレメントが上流プロモーター領域中に含有されるからである。しかし、一般的に使用されるＵ６プロモーターは、転写を開始するためにグアノシンヌクレオチドを必要とするので、Ｕ６プロモーターの使用は、ゲノム標的化部位をＧＮ１９ＮＧＧへとさらに制約している（Maliら（２０１３年）Science ３３９巻：８２３〜８２６頁；Dingら（２０１３年）Cell Stem Cell １２巻：３９３〜３９４頁）。代替的手法、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写もまた、開始グアノシンヌクレオチド（複数可）を必要とする（Adhyaら（１９８１年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ７８巻：１４７〜１５１頁；Meltonら（１９８４年）Nucleic Acids Res. １２巻：７０３５〜７０５６頁；Pleissら（１９９８年）RNA ４巻：１３１３〜１３１７頁）。
本開示の主題は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１９５６１）を発現させるためにＨ１プロモーターを使用する、発癌突然変異または腫瘍抑制遺伝子を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの修飾に関する。組換えアデノ随伴パッケージングウイルスと組み合わせた、かかる修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、より高い有効性、安全性および正確さで、がんにおける発癌突然変異を正確に標的化できるまたは欠損腫瘍抑制遺伝子の修復を促進できる。さらに、この修飾は、既存のＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガー技術を超えた、癌遺伝子のより高解像度の標的化を可能にするコンパクトなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを提供する。
したがって、本発明の一態様は、コンパニオン組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の複製およびパッケージングに必要なトランスエレメントを全て含有する複製コンピテントなアデノウイルス（Ａｄ）に関する。この二重ウイルスシステムは、タンデムな両方のウイルスの複製を可能にし、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏ投与の部位におけるｒＡＡＶの局所的繁殖を促進する。一部の実施形態では、このシステムは、がん細胞への部分的制限のためにＡｄ Ｅ１Ｂ遺伝子中に突然変異を含み、したがって、がん細胞増殖を妨害するように設計されたドライバー遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲまたは他の遺伝的エレメントを備えたｒＡＡＶの腫瘍特異的繁殖を促進する。
任意の使用のための二重Ａｄ−ＡＡＶシステムの適用は、報告されていない。このシステムの新規性は、均一に非複製性の治療的ｒＡＡＶが、複製コンピテントにされ得ることである。
本発明の別の態様は、多数の型のがんの成長に寄与することが公知の機能獲得型突然変異を標的化し得る組成物に関する。一般的ながんにおいて見出された発癌突然変異の多くは、事実上反復性である、すなわち、正確な同じ突然変異が、所与の型のがんにおいて高い割合で存在する。反復性の癌遺伝子突然変異を標的化するための現在の試みは、小分子阻害剤、またはＤＮＡ損傷に対する合成致死性を達成するための戦略を共通して使用する。例えば、最も高頻度の癌遺伝子であるＫＲＡＳは、首尾よく標的化されておらず、「アンドラッガブルな（undrugable）」ままである。かかる組成物は、最も一般的に突然変異した部位のいくつかの効率的なヌクレアーゼ（すなわち、Ｃａｓ９）媒介性切断を方向付けるｇＲＮＡを含んだ。特に、ｇＲＮＡを含むこれらの組成物は、変異型アレルに対して高度に特異的であり、したがって、野生型対立遺伝子を保有する細胞に対してほとんど影響を有さない。
Ｉ．Ｈ１プロモーターを使用するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの発現。
Ａ．組成物
一部の実施形態では、がんを予防、阻害または処置するための、本明細書に開示されている方法は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの修飾を含む組成物を利用する。かかる修飾は、例えば、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡもしくはＩＤＨ１、または腫瘍抑制遺伝子であるがこれらに限定されない発癌突然変異を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この組成物は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）を含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このヌクレアーゼシステムを含有するアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される（すなわち、二重ウイルスパッケージングシステム）。一部の実施形態では、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子は、パッケージングアデノウイルスなしに使用される。一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、１１のヒトアデノ随伴ウイルス血清型（例えば、血清型１〜１１）のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、このアデノウイルス（ＡＡＶ）は、５１のヒトアデノウイルス血清型のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏパッケージングのためのアデノウイルス（すなわち、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス）は、アデノウイルス遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む。一部の実施形態では、このパッケージングアデノウイルスは、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される。一部の実施形態では、このアデノ随伴パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルス血清型５である。一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される。一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子はＥ３である。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、この標的配列は、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、少なくとも１つの突然変異を含む癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣからなる群から選択されるがんドライバー遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＫＲＡＳである。一部の実施形態では、このＫＲＡＳは、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＰＩＫ３ＣＡである。一部の実施形態では、このＰＩＫ３ＣＡは、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＩＤＨ１である。一部の実施形態では、このＩＤＨ１は、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む。一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この二重ウイルスパッケージングシステムは、治療的ｒＡＡＶがｉｎ ｖｉｖｏで反復して複製されるのを可能にする。一部の実施形態では、この二重ウイルスパッケージングシステムは、野生型ＡＡＶ由来のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子がＡｄ Ｅ３遺伝子を置き換える、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋと呼ばれるアデノウイルス５を含む。Ａｄ Ｅ３は通常、ウイルスが宿主の免疫系を回避するのを可能にするように機能するが、ＡＡＶの溶解感染にもパッケージングにも必要とされない。ｒｅｐ−ｃａｐカセットは、Ｅ３遺伝子よりも約１ｋｂしか大きくないので、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋの総サイズは、公開されたＡｄパッケージング能力の十分に範囲内である。このＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、コンパニオンｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−ＴＳＧまたはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲ）の複製およびパッケージングに必要なトランスエレメントを全て有する。Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋおよび治療的ｒＡＡＶによる標的組織の共感染は、ｒＡＡＶがｉｎ ｖｉｖｏで繁殖するのを可能にし、導入遺伝子送達の効率を潜在的に増加させる。
一部の実施形態では、がんを予防、阻害または処置するための、本明細書に開示されている方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用する。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含有するアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される。
一部の実施形態では、本開示の主題は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、真核生物細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、真核生物細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、真核生物細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを提供する。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含有するアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
本開示の主題は、双方向Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムも提供し、ここで、双方向Ｈ１プロモーターは：ａ）真核生物細胞中で発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、真核生物細胞中のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ｇＲＮＡが、標的配列を標的としてハイブリダイズして、Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡ分子を切断し、それにより１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される、タイプ−ＩＩのＣａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含むアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞（例えば、真核生物細胞）の核中の検出可能な量でのＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を駆動するのに十分な強度の、１つまたは複数の核局在化配列を含む。理論に束縛されることは望まないが、核局在化配列は、真核生物におけるＣＲＩＳＰＲ複合体活性には必要ないが、かかる配列を含むことは、特に、核において核酸分子を標的化することについて、このシステムの活性を増強すると考えられている。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム酵素である。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素である。一部の実施形態では、このＣａｓ９酵素は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９であり、これらの生物に由来する突然変異したＣａｓ９を含み得る。この酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」は、３６−ｋｂのゲノムを有するＤＮＡウイルスである。他の公知のアデノウイルスの血清型に対する抗血清による中和に対するそれらの抵抗に基づいて区別されてきた５１のヒトアデノウイルスの血清型がある。アデノウイルスのベクターの大部分は、血清型２および５から誘導されるが、タイプ３５などの他の血清型も使用することができる。野生型アデノウイルスのゲノムは、前期（Ｅ１からＥ４）および後期（Ｌ１からＬ５）遺伝子に分割される。アデノウイルスベクターは、複製能コンピテントであるまたは非複製であるように調製され得る。外来遺伝子は、アデノウイルスゲノムの３領域（Ｅ１、Ｅ３、またはＥ４）中に、ならびに主要な後期プロモーターの後に挿入され得る。アデノウイルスゲノムのアデノウイルスの産生を方向付ける能力は、Ｅ１における配列に依存する。
腫瘍抑制に関与するタンパク質の例は、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症突然変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（表皮性増殖因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４を含むこともできる。
有効に編集することができる腫瘍抑制遺伝子の例は、Ｒｂ、Ｐ５３、ＩＮＫ４ａ、ＰＴＥＮ、ＬＡＴＳ、Ａｐａｆ１、カスパーゼ８、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＫＬＦ６、ＧＳＴＰ１、ＥＬＡＣ２／ＨＰＣ２、ＮＫＸ３．１、ＡＴＭ、ＣＨＫ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ／ＰＫ、ＸＲＣＣ４、神経線維腫症タイプ１、神経線維腫症タイプ２、結腸腺腫ポリポーシス、ウィルムス腫瘍抑制タンパク質、Ｐａｔｃｈｅｄ、ＳＴＡＧ２、およびＦＨＩＴである。
本発明に有用な組換え癌遺伝子の例は、Ｈｅｒ２、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ギャップ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶＭＴ抗原、およびＳＶ４０Ｔ抗原を含む。好ましい癌遺伝子は、Ｈｅｒ２、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−ＣＡおよびＡＫＴ、およびＨｅｒ２（ｎｅｕまたはＥｒｂＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）としても公知）である。
本明細書で使用される場合、「がんドライバー遺伝子」は、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣを含むが、これらに限定されないがん遺伝子を包含する。Vogelsteinら（２０１３年） Science ３３９巻：１５４６頁中の包括的なリストも参照されたい。
一般に、本明細書を通じて、用語「ベクター」とは、それが連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖である核酸分子；１つまたは複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない核酸分子（例えば、環状）；ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方を含む核酸分子；および当該分野で公知のポリヌクレオチドの他の変種が含まれるがこれらに限定されない。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが標準的な分子クローニング技術などによってその中に挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ウイルスに由来するＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、宿主細胞中へのトランスフェクションのためにウイルスによって運搬されるポリヌクレオチドもまた含む。
ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結した遺伝子の発現を方向付けることが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で本開示の主題の核酸を含み得、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動的に連結した、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つまたは複数の調節エレメントを含むことを意味する。
組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結した」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおける、またはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞における）を可能にする様式で、調節エレメント（複数可）に連結したことを意味する意図である。
用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）を含む意図である。かかる調節エレメントは、例えば、Goeddel（１９９０年）Gene Expression Technology: Methods in Enzymology １８５巻、Academic Press、San Diego、Calif.に記載されている。調節エレメントには、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるエレメント、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるエレメント（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、目的の所望の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）における発現を主に方向付け得る。調節エレメントはまた、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的様式または発生段階依存的様式で発現を方向付け得、これは、組織特異的または細胞型特異的であってもなくてもよい。
一部の実施形態では、ベクターは、１つもしくは複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、１つもしくは複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター、１つもしくは複数のｐｏｌ Ｉプロモーター、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、Ｕ６およびＨ１プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例には、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Boshartら（１９８５年）Cell ４１巻：５２１〜５３０頁）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Takebeら（１９８８年）Mol. Cell. Biol.８巻：４６６〜４７２頁）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列（O'Hareら（１９８１年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ７８巻（３号）：１５２７〜３１頁）もまた、用語「調節エレメント」によって包含される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望される発現のレベルなどの因子に依存し得ることが、当業者に理解される。ベクターは、宿主細胞中に導入され得、それによって、本明細書に記載されている核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異体形態、それらの融合タンパク質など）を含む転写物、タンパク質またはペプチドを産生する。有利なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、かかるベクターの型は、特定の型の細胞を標的化するためにも選択され得る。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から規定された遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド構成要素が割り込み得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾され得る。
本開示の主題の態様では、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一のガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」とは、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」とは、当業者が理解する当該分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から識別されて天然に存在する、生物、系統、遺伝子または特徴の典型的な型を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、天然に存在するものから外れたパターンを有する質の提示を意味すると解釈すべきである。
用語「天然に存在しない」または「操作された」は、互換的に使用され、人の手の関与を示す。これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、その核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で天然に関連するおよび自然界で見出される少なくとも１つの他の構成要素を、少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「相補性」とは、伝統的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型または他の非伝統的な型のいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）し得る、核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続する残基が全て、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である相補性の程度を指す、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションについて「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対する相補性を有する核酸がその標的配列と優勢にハイブリダイズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に、配列依存的であり、いくつかの因子に依存して変動する。一般に、配列が長くなるほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen（１９９３年）、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes 第１部、第２章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier、N.Y.に詳細に記載されている。
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合によって、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数本鎖の複合体を形成する３つもしくはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より詳細なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズすることが可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、「遺伝子産物」と集合的に呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直鎖または分岐鎖であり得、修飾アミノ酸を含み得、このポリマーには、非アミノ酸が割り込み得る。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションもまた包含する。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む、天然のおよび／または非天然もしくは合成のアミノ酸を含む。
本開示の主題の実施は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技術を使用する（Sambrook、FritschおよびManiatis（１９８９年）Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版；Ausubelら編（１９８７年）Current Protocols in Molecular Biology）；MacPhersonら編（１９９５年）Methods in Enzymology （Academic Press, Inc.）: PCR 2: A Practical Approach）；HarlowおよびLane編（１９８８年）Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney編（１９８７年）Animal Cell Culture）。
本開示の主題のいくつかの態様は、１つもしくは複数のベクターを含むベクターシステム、またはそのようなベクターに関する。ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質または酵素）の発現のために設計され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Goeddel（１９９０年）Gene Expression Technology: Methods in Enzymology １８５巻、Academic Press、San Diego、Calif.でさらに議論されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。
ベクターは、原核生物中に導入され、そこで繁殖され得る。一部の実施形態では、原核生物は、真核生物細胞中に導入されるベクターのコピーを増幅するため、または真核生物細胞中に導入されるベクターの産生（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）における中間体ベクターとして、使用される。一部の実施形態では、原核生物は、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つまたは複数のタンパク質の源を提供するために、ベクターのコピーを増幅し、１つまたは複数の核酸を発現させるために使用される。原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を方向付ける構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて実施される場合が最も多い。
融合ベクターは、それらがコードするタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させるため；および（ｉｉｉ）親和性精製における配位子として作用することによって組換えタンパク質の精製を補助するためなどの、１つまたは複数の目的を果たし得る。しばしば、融合発現ベクター中には、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との接合部において導入されて、融合タンパク質の精製に引き続く、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例には、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；SmithおよびJohnson（１９８８年）Gene ６７巻：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が含まれる。
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Amrannら（１９８８年）Gene ６９巻：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ １１ｄ（Studierら（１９９０年）Gene Expression Technology: Methods in Enzymology １８５巻、Academic Press、San Diego、Calif.）が含まれる。
一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldariら（１９８７年）EMBO J. ６巻：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（KuijanおよびHerskowitz（１９８２年）Cell ３０巻：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら（１９８７年）Gene ５４巻：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞における１つまたは複数の配列の発現を駆動することが可能である。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Seed（１９８７年）Nature ３２９巻：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら（１９８７年）EMBO J. ６巻：１８７〜１９５頁）が含まれる。哺乳動物細胞で使用する場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つまたは複数の調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、ならびに本明細書で開示されるおよび当該分野で公知の他のウイルスに由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適切な他の発現システムについては、例えば、Sambrookら（１９８９年）Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.の第１６章および第１７章を参照のこと。
一部の実施形態では、この組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に、核酸の発現を方向付けることが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸を発現させるために使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら（１９８７年）Genes Dev. １巻：２６８〜２７７頁）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton（１９８８年）Adv. Immunol. ４３巻：２３５〜２７５頁）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore（１９８９年）EMBO J. ８巻：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリンのプロモーター（Baneijiら（１９８３年）Cell ３３巻：７２９〜７４０頁；QueenおよびBaltimore（１９８３年）Cell ３３巻：７４１〜７４８頁）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle（１９８９年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６巻：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら（１９８５年）Science ２３０巻：９１２〜９１６頁）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（KesselおよびGruss（１９９０年）Science ２４９巻：３７４〜３７９頁）およびα−フェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman（１９８９年）Genes Dev. ３巻：５３７〜５４６頁）もまた包含される。
一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントの発現を駆動するように、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントに作動可能に連結している。一般に、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（SPacer Interspersed Direct Repeat））としても公知のＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート）は、特定の細菌種に対して通常特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。このＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて認識された別個のクラスの散在型の短い配列リピート（ＳＳＲ）（Ishinoら（１９８７年）J. Bacteriol.、１６９巻：５４２９〜５４３３頁；およびNakataら（１９８９年）J. Bacteriol.、１７１巻：３５５３〜３５５６頁）、および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲは、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＡｎａｂａｅｎａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおいて同定されている（Groenenら（１９９３年）Mol. Microbiol.、１０巻：１０５７〜１０６５頁；Hoeら（１９９９年）Emerg. Infect. Dis.、５巻：２５４〜２６３頁；Masepohlら（１９９６年）Biochim. Biophys. Acta １３０７巻：２６〜３０頁；およびMojicaら（１９９５年）Mol. Microbiol.、１７巻：８５〜９３頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、短鎖規則的間隔リピート（short regularly spaced repeat）（ＳＲＳＲ）と名付けられたリピートの構造によって、他のＳＳＲとは異なる（Janssenら（２００２年）OMICS J. Integ. Biol.、６巻：２３〜３３頁；およびMojicaら（２０００年）Mol. Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。一般に、これらのリピートは、実質的に一定の長さの独自の介在配列によって規則的に間隔があいたクラスターで存在する短いエレメントである（Mojicaら（２０００年）Mol. Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。リピート配列は系統間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、系統によって異なる（van Embdenら（２０００年）J. Bacteriol.、１８２巻：２３９３〜２４０１頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｑｕｉｆｒｘ、Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚａｒｃｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａが含まれるがこれらに限定されない、４０を上回る原核生物において同定されている（例えば、Jansenら（２００２年）Mol. Microbiol.、４３巻：１５６５〜１５７５頁；およびMojicaら（２００５年）J. Mol. Evol. ６０巻：１７４〜８２頁）。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するもしくはその活性を方向付ける転写物および他のエレメント、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連では、「スペーサー」とも呼ばれる）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物を、集合的に指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連では、プロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成との関連では、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対する相補性を有するように設計される配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在する限り、完全な相補性は必ずしも必要ではない。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質中に位置する。一部の実施形態では、この標的配列は、真核生物細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体内にあり得る。標的配列を含む標的化される遺伝子座中への組換えに使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。本開示の主題の態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型と呼ばれ得る。本開示の主題のある態様では、この組換えは相同組換えである。
一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの挿入部位）が、１つまたは複数のベクターの１つまたは複数の配列エレメントの上流および／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物が、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために使用され得る。例えば、単一のベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれよりも多くのガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのかかるガイド配列含有ベクターが提供され得、任意選択で細胞に送達され得る。
一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結した調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが含まれる。これらの酵素は公知である；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて見出され得る。一部の実施形態では、未修飾のＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９であり得る。
一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補体内での、一方または両方の鎖の切断を方向付ける。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれよりも多くの塩基対以内での、一方または両方の鎖の切断を方向付ける。一部の実施形態では、突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、ベクターは、対応する野生型酵素に関して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核生物細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。この真核生物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌもしくは非ヒト霊長類が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物などの特定の生物のものであり得るまたはそれに由来し得る。一般に、コドン最適化とは、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０またはそれよりも多くのコドン）を、ネイティブアミノ酸配列を維持したままその宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞における増強された発現のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関する場合が多く、これは次に、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適応され得る。Nakamuraら（２０００年）Nucl. Acids Res. ２８巻：２９２頁を参照のこと。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムもまた入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、Ｐａ．）もまた入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つまたは複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれよりも多くの、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンと対応する。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を方向付けるのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインした場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムの使用によって決定され得、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（soap.genomics.org.cnにおいて入手可能）およびＭａｑ（maq.sourceforge.netにおいて入手可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５またはそれよりも多くのヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長未満である。
標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を方向付けるガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって調査され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、その後、例えば、本明細書に記載されているＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって、標的配列内の優先的な切断が調査される。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間で、標的配列における結合、または切断の速度を比較することによって、試験管中で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に明らかである。
ガイド配列は、任意の標的配列を標的として選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列は、標的ゲノムにおける固有のものを含む。ガイド配列は、任意の標的配列を標的として選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列は、標的ゲノムにおける固有のものを含む。例えば、一部の実施形態では、標的配列は癌遺伝子（例えば、発癌突然変異を有する）または腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、少なくとも１つの突然変異を含む癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣからなる群から選択されるがんドライバー遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＫＲＡＳである。一部の実施形態では、このＫＲＡＳは、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＰＩＫ３ＣＡである。一部の実施形態では、このＰＩＫ３ＣＡは、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＩＤＨ１である。一部の実施形態では、このＩＤＨ１は、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む。一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１〜１８に示されるヌクレオチド配列に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％相同であり得る。
用語「相同な」とは、「％相同性」を指し、本明細書で、本明細書の用語「％同一性」と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインした場合の、核酸配列同一性のレベルに関する。
例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性とは、規定されたアルゴリズムによって決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列のホモログは、所与の配列の長さにわたって、８０％よりも高い配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルには、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列に対する約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％またはそれよりも高い配列同一性が含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および任意選択で、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性のうち１つまたは複数を有するタンパク質ドメインが含まれるがこれらに限定されない：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が含まれるがこれらに限定されない、ＤＮＡ分子を結合するまたは他の細胞性分子を結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００５９５０２に記載されている。一部の実施形態では、タグ化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置を同定するために使用される。
本開示の主題のある態様では、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるがこれらに限定されないレポーター遺伝子は、遺伝子産物の発現の変更または修飾を測定するためのマーカーとして機能する遺伝子産物をコードするために、細胞中に導入され得る。本開示の主題のさらなる実施形態では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子は、ベクターを介して細胞中に導入され得る。本開示の主題の好ましい実施形態では、この遺伝子産物はルシフェラーゼである。本開示の主題のさらなる実施形態では、この遺伝子産物の発現は減少する。
一般に、本開示の主題のプロモーター実施形態は、以下を含む：１）ＴＡＴＡボックス、近位配列エレメント（ＰＳＥ）および遠位配列エレメント（ＤＳＥ）を含む、完全なＰｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに２）リバース配向でＤＳＥの５’末端に融合したＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター。そのヌクレオチド配列にちなんで名付けられたＴＡＴＡボックスは、Ｐｏｌ ＩＩＩ特異性の主要な決定因子である。これは通常、転写される配列に対してヌクレオチド−２３と−３０との間の位置に位置し、転写される配列の開始の主要な決定因子である。ＰＳＥは通常、ヌクレオチド−４５と−６６との間に位置する。ＤＳＥは、基本的Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの活性を増強する。Ｈ１プロモーター中には、ＰＳＥとＤＳＥとの間にギャップは存在しない。
双方向プロモーターは、以下からなる：１）３つの外部制御エレメント：ＤＳＥ、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含有する、完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに２）リバース配向でＤＳＥの５’末端に融合したＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター。ＴＡＴＡ結合タンパク質によって認識されるＴＡＴＡボックスは、プロモーター領域にＰｏｌ ＩＩＩを動員するために重要である。ＴＡＴＡボックスへのＴＡＴＡ結合タンパク質の結合は、ＳＮＡＰｃとＰＳＥとの相互作用によって安定化される。合わせると、これらのエレメントは、Ｐｏｌ ＩＩＩが発現される配列を転写できるように、Ｐｏｌ ＩＩＩを正確に位置付ける。ＤＳＥはまた、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの完全な活性に重要である（Murphyら（１９９２年）Mol. Cell Biol. １２巻：３２４７〜３２６１頁；Mittalら（１９９６年）Mol. Cell Biol. １６巻：１９５５〜１９６５頁；FordおよびHernandez（１９９７年）J.Biol.Chem.、２７２巻：１６０４８〜１６０５５頁；Fordら（１９９８年）Genes, Dev.、１２巻：３５２８〜３５４０頁；Hovdeら（２００２年）Genes Dev. １６巻：２７７２〜２７７７頁）。転写は、転写因子Ｏｃｔ−１および／またはＳＢＦ／Ｓｔａｆと、ＤＳＥ内のそれらのモチーフとの相互作用によって、最大１００倍増強される（KunkelおよびHixon（１９９８年）Nucl. Acid Res.、２６巻：１５３６〜１５４３頁）。フォワードおよびリバース配向の基本的プロモーターは、二本鎖ＤＮＡ鋳型の対向する鎖上の配列の転写を方向付けるので、リバース配向の基本的プロモーターのプラス鎖は、ＤＳＥのマイナス鎖の５’末端に付け加えられる。Ｈ１プロモーターの制御下で発現された転写物は、４Ｔまたは５Ｔの連続した配列によって終結される。
Ｈ１プロモーター中では、ＤＳＥは、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接する（Myslinskiら（２００１年）Nucl. Acid Res. ２９巻：２５０２〜２５０９頁）。配列反復を最小化するために、リバース方向での転写がＵ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付け加えることによって制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによって、このプロモーターを双方向性にした。双方向Ｈ１プロモーターの構築を促進するために、小さいスペーサー配列もまた、リバース配向の基本的プロモーターとＤＳＥとの間に挿入され得る。
Ｂ．方法
一部の実施形態では、本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された修飾された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。かかる修飾は、例えば、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡもしくはＩＤＨ１、または腫瘍抑制遺伝子であるがこれらに限定されない発癌突然変異を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）を含む組成物を細胞中に導入するステップを含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このヌクレアーゼシステムを含有するアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される（すなわち、二重ウイルスパッケージングシステム）。一部の実施形態では、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子は、パッケージングアデノウイルスなしに使用される。一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、１１のヒトアデノ随伴ウイルス血清型（例えば、血清型１〜１１）のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、このアデノウイルス（ＡＡＶ）は、５１のヒトアデノウイルス血清型のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルスの遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む。一部の実施形態では、パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５、またはアデノウイルス血清型３５から選択される。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングウイルスはアデノウイルス血清型５である。一部の実施形態では、アデノウイルスの遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、またはＬ５から選択される。一部の実施形態では、システムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、プロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、標的配列は、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、標的配列は、少なくとも１つの突然変異を含む癌遺伝子である。一部の実施形態では、標的配列は、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ギャップ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶＭＴ抗原、およびＳＶ４０Ｔ抗原からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的配列は、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣからなる群から選択される、がんドライバー遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＫＲＡＳである。一部の実施形態では、このＫＲＡＳは、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＰＩＫ３ＣＡである。一部の実施形態では、このＰＩＫ３ＣＡは、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＩＤＨ１である。一部の実施形態では、このＩＤＨ１は、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む。一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本開示の主題は、細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更するステップを含む方法もまた提供する。
一部の実施形態では、本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、真核生物細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更されるステップを含む方法もまた提供する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらに別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、双方向Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップであって、この双方向Ｈ１プロモーターは、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメントであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメント；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントであって、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される、制御エレメントを含むステップを含む方法もまた提供する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらに別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
一部の態様では、本開示の主題は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、例えばまたは本明細書に記載されている１つもしくは複数のベクター、１つもしくは複数のその転写物、および／またはそれから転写された１つもしくは複数のタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、本開示の主題は、かかる方法によって産生された細胞、およびかかる細胞を含むまたはかかる細胞から産生される生物（例えば、動物、植物または真菌）をさらに提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（任意選択でガイド配列と複合体化した）ＣＲＩＳＰＲ酵素が、細胞に送達される。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法が、哺乳動物細胞または標的組織中に核酸を導入するために使用され得る。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素をコードする核酸を、培養物中または宿主生物中の細胞に投与するために使用され得る。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されているベクターの転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソーム性のゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療手順のレビューについては、Anderson（１９９２年）Science ２５６巻：８０８〜８１３頁；NabelおよびFelgner（１９９３年）TIBTECH １１巻：２１１〜２１７頁；MitaniおよびCaskey（１９９３年）TIBTECH １１巻：１６２〜１６６頁；Dillon（１９９３年）TIBTECH １１巻：１６７〜１７５頁；Miller（１９９２年）Nature ３５７巻：４５５〜４６０頁；Van Brunt（１９９８年）Biotechnology ６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁；Vigne（１９９５年）Restorative Neurology and Neuroscience ８巻：３５〜３６頁；KremerおよびPerricaudet（１９９５年）British Medical Bulletin ５１巻（１号）：３１〜４４頁；Haddadaら（１９９５年）Current Topics in Microbiology and Immunology. DoerflerおよびBohm（編）；ならびにYuら（１９９４年）Gene Therapy １巻：１３〜２６頁を参照のこと。
核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により増強されるＤＮＡ取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン性および中性の脂質には、Felgner、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４の脂質が含まれる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）への送達であり得る。
標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体、例えば、イムノリピド（immunolipid）複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal（１９９５年）Science ２７０巻：４０４〜４１０頁；Blaeseら（１９９５年）Cancer Gene Ther. ２巻：２９１〜２９７頁：Behrら（１９９４年）Bioconjugate Chem. ５巻：３８２〜３８９頁；Remyら（１９９４年）Bioconjugate Chem. ５巻：６４７〜６５４頁；Gaoら（１９９５年）Gene Therapy ２巻：７１０〜７２２頁；Ahmadら（１９９２年）Cancer Res. ５２巻：４８１７〜４８２０頁；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号）。
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、身体中の特異的細胞にウイルスを標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処置するために使用され得、修飾された細胞は、患者に任意選択で投与され得る（ｅｘ ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。宿主ゲノムにおける組み込みは、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じる場合が多い、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を用いて可能である。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を取り込み、標的細胞の潜在的標的集団を増大させることによって変更され得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させ、典型的には高いウイルス力価を生じることができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性の長末端リピートで構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これらのベクターは次いで、恒久的な導入遺伝子発現を提供するために、標的細胞中に治療遺伝子を組み込むために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくベクターが含まれる（例えば、Buchscherら（１９９２年）J. Virol. ６６巻：２７３１〜２７３９頁；Johannら（１９９２年）J. Virol. ６６巻：１６３５〜１６４０頁；Sommnerfeltら（１９９０年）J. Virol. １７６巻：５８〜５９頁；Wilsonら（１９８９年）J. Virol. ６３巻：２３７４〜２３７８頁；Millerら（１９９１年）J. Virol. ６５巻：２２２０〜２２２４頁；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００）。一過的な発現が好まれる適用では、アデノウイルスベースのシステムが使用され得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価およびレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生できる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療手順のために、細胞を標的核酸で形質導入するためにも使用され得る（例えば、Westら（１９８７年）Virology １６０巻：３８〜４７頁；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin（１９９４年）Human Gene Therapy ５巻：７９３〜８０１頁；Muzyczka（１９９４年）J. Clin. Invest. ９４巻：１３５１頁）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら（１９８５年）Mol. Cell. Biol. ５巻：３２５１〜３２６０頁；Tratschinら（１９８４年）Mol. Cell. Biol. ４巻：２０７２〜２０８１頁；HermonatおよびMuzyczka（１９８４年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ８１巻：６４６６〜６４７０頁；ならびにSamulskiら（１９８９年）J. Virol. ６３巻：０３８２２〜３８２８頁を含むいくつかの刊行物中に記載されている。
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することによって生成される。これらのベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主中への引き続く組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチド（複数可）のための発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング、導入遺伝子発現、および宿主ゲノム中への組み込みに必要な、ＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系においてパッケージングされる。この細胞系には、ヘルパーとしてのアデノウイルスが感染し得る；２９３細胞およびそれらの誘導体はアデノウイルスＤＮＡを含有し、そして、したがって、ＡＡＶパッケージングのためにアデノウイルス感染を必要としない。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減され得る。細胞への核酸の送達のためのさらなる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００３００８７８１７を参照のこと。
一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターで一過的または非一過的にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、対象中に天然に存在しながらトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取される。一部の実施形態では、この細胞は、対象から採取された細胞、例えば細胞系に由来する。組織培養のための広範な種々の細胞株が、当該分野で公知である。細胞株の例には、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−ＭｅＩ １−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が含まれるがこれらに限定されない。細胞株は、当業者に公知の種々の源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ、Ｖａ．）を参照のこと）。一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターでトランスフェクトされた細胞は、１つまたは複数のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素で一過的にトランスフェクトされ（例えば、１つもしくは複数のベクターの一過的なトランスフェクション、またはＲＮＡによるトランスフェクションによって）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を介して修飾された細胞は、修飾を含有するが任意の他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つもしくは複数のベクターで一過的もしくは非一過的にトランスフェクトされた細胞、またはかかる細胞に由来する細胞株は、１つまたは複数の試験化合物を調査する際に使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターは、非ヒトトランスジェニック動物を産生するために使用される。一部の実施形態では、このトランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラットまたはウサギである。ある特定の実施形態では、生物または対象は植物である。トランスジェニック動物を産生するための方法は、当該分野で公知であり、一般に、本明細書に記載されているような細胞トランスフェクションの方法で始まる。
一態様では、本開示の主題は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る、真核生物細胞において標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ヒトまたは非ヒト動物から細胞または細胞の集団を試料採取するステップ、および細胞（単数または複数）を修飾するステップを含む。培養するステップは、任意の段階でｅｘ ｖｉｖｏで行われ得る。細胞（単数または複数）はさらに、非ヒト動物中に再導入され得る。
一態様では、本開示の主題は、真核生物細胞において標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすために標的ポリヌクレオチドにＣＲＩＳＰＲ複合体を結合させ、それによって、標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
一態様では、本開示の主題は、真核生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現を修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、結合がポリヌクレオチドの発現の増加または減少を生じるように、ポリヌクレオチドにＣＲＩＳＰＲ複合体を結合させるステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
一態様では、本開示の主題は、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントを使用するための方法を提供する。本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを修飾するための有効な手段を提供する。本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多様な細胞型において標的ポリヌクレオチドを修飾（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）することを含む広範な種々の有用性を有する。このように、本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患診断および予後判定において、広範な適用を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核生物細胞にとって内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、この標的ポリヌクレオチドは、真核生物細胞の核中に存在するポリヌクレオチドであり得る。この標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に束縛されることは望まないが、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列と会合すべきであると考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に依存して異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対の配列である。ＰＡＭ配列の例は、以下の実施例のセクションで与えられ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素との使用のためのさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。
標的ポリヌクレオチドの例には、生化学的シグナル伝達経路と関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが含まれる。標的ポリヌクレオチドの例には、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが含まれる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織または細胞と比較して、疾患罹患組織に由来する細胞において異常なレベルまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じている、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルで発現される遺伝子であり得る；これは、異常に低いレベルで発現される遺伝子であり得、ここで、変更された発現は、疾患の出現および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の原因を直接担うまたは疾患の原因を担う遺伝子（複数可）と連鎖不平衡である、突然変異（複数可）または遺伝的変異を保有する遺伝子もまた指す。転写されたまたは翻訳された産物は、既知または未知であり得、正常または異常なレベルであり得る。
本開示の主題の実施形態は、遺伝子をノックアウトすること、遺伝子を増幅すること、およびＤＮＡ反復不安定性および神経学的障害と関連する特定の突然変異を修復することに関する方法および組成物にも関する（Robert D. Wells、Tetsuo Ashizawa、Genetic Instabilities and Neurological Diseases、第２版、Academic Press、２０１１年１０月１３日-Medical）。タンデムリピート配列の特定の態様は、２０よりも多いヒト疾患を担うことが見出されている（McIvorら（２０１０年）RNA Biol. ７巻（５号）：５５１〜８頁）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ゲノム不安定性のこれらの欠損を修正するために利用され得る。
Ｃ．製剤化
一態様において、本発明は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と一緒に製剤化された、二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を含む薬学的に許容される組成物を提供する。別の態様において、組成物は、そのままかまたは薬学的に許容される担体との混合物で投与することができ、他の抗がん療法、例えば化学療法剤、スカベンジャー化合物、放射線療法、生物学的療法などと合わせて投与することもできる。連結療法は、したがって、最初の投与の治療効果が完全に消失しない時に、次の化合物が投与される、組成物の、同時のおよび別々の、または共投与を含む。
下で詳細に記載するように、本発明の医薬組成物は、以下の：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、バッカル、舌下、および全身的吸収、ボーラス、散剤、顆粒、舌に適用するためのペーストを目標とするもの；（２）非経口投与、例えば、皮下、筋肉、静脈内または硬膜外の注射による、例えば、滅菌溶液または懸濁液のような、または徐放性製剤化；（３）局所的適用、例えば、皮膚に適用される、クリーム、軟膏、または制御された放出のパッチまたは噴霧のような；（４）膣内にまたは直腸内に、例えば、ペッサリー、クリームまたはフォームのような；（５）舌下に；（６）目に；（７）経皮的に；または（８）鼻に適合されるものを含む、固体または液体の形態で投与されるために、特に製剤化することもできる。
上で説明したように二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物の、ある特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含むこともでき、したがって、薬学的に許容される酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの塩は、ｉｎ ｓｉｔｕで、投与ビヒクル中で、または剤形製造プロセスで、または精製された本発明の化合物を、その遊離塩基形態で適当な有機または無機酸と別々に反応させて、このようにして形成された塩を、後に続く精製中に単離することにより調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシレート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシレート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオネート、およびラウリルスルホン酸塩等が含まれる（例えば、Bergeら（１９７７年）「Pharmaceutical Salts」、J. Pharm. Sci.６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
対象化合物の薬学的に許容される塩は、無毒性有機または無機酸からの、例えば、該化合物の従来の無毒性の塩または第四級アンモニウム塩を含む。例えば、かかる従来の無毒性の塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導された塩；および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製された塩を含む。
他の場合で、本発明の二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を含む組成物は、１つまたは複数の酸性官能基を含むこともでき、したがって、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの塩は、投与ビヒクル中または剤形製造プロセス中にｉｎ ｓｉｔｕで、または精製された化合物をその遊離酸の形態で、適当な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機一級、二級または三級アミンと別々に反応させることにより、同様に調製することができる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩等を含む。塩基添加塩の形成のために有用な代表的な有機アミンは、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等を含む（例えば、Bergeら、前出を参照されたい）。
加湿剤、乳化剤および潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、着香料および香料、防腐剤および抗酸化剤も、組成物中に存在することができる。
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化されたヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化されたヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）製剤を含む組成物は、腫瘍内部、経口、経鼻、局所（バッカルおよび舌下を含む）、直腸、膣内および／または非経口投与のために適当なものを含む。製剤は、単位剤形で提供することができて便利であり、調薬の当業者に周知の任意の方法によって調製することができる。単一剤形を生産するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変化する。単一剤形を生産するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般的に、治療効果を生ずる化合物のその量となる。
ある特定の実施形態では、二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を含む組成物の製剤は、より大きい安定性、ｉｎ ｖｉｖｏにおける異なる放出性、特定の部位を標的とすること、または二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）の対象または対象中の標的へのより効果的な送達を可能にする任意の他の所望の特性を可能にする他の担体、例えば、これらに限定されないが、リポソーム、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子、泡沫、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ酸無水物などの担体を含むことができる。ある特定の実施形態では、上記の製剤は、本発明の化合物を、経口的に生体利用可能にする。
二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）の液体の投薬製剤は、薬学的に許容されるエマルション剤、マイクロエマルション剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシルを含む。有効成分に加えて、液体の剤形は、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、ピーナッツ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物などを含むこともできる。
不活性希釈剤の他に、経口組成物は、アジュバント、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、着香料、着色剤、香料および防腐剤なども含むことができる。
懸濁液は、有効化合物に加えて、例えば、エトキシル化されたイソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびそれらの混合物のような懸濁剤を含むこともできる。
経口投与のために適当な製剤は、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、ロゼンジ（味を付けた基剤、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを使用する）、散剤、顆粒の形態で、または水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油または油中水の液体エマルションとして、またはエリキシル剤またはシロップ剤として、またはトローチ剤（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどを使用する）として、および／またはうがい薬として等の形態であってもよく、各々所定の量の有効成分を含む。本発明の二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を含む組成物は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与されてもよい。
固体の剤形（例えば、カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、散剤、顆粒等）では、有効成分は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたは二リン酸カルシウムなど、および／または以下のいずれかと混合される：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど；（３）湿潤剤、例えば、グリセロールなど；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、および炭酸ナトリウムなど；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィンなど；（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物など；（７）加湿剤、例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート、および非イオン性界面活性剤など；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイなど；（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合には、組成物は、緩衝剤も含むことができる。同様なタイプの固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖類、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する、軟質および硬質の殻のあるゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。
錠剤は、圧縮または型成形によって、任意選択で１つまたは複数の副成分と共に作製することもできる。圧縮された錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムデンプングリコレートまたは架橋されたナトリウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性剤または分散剤を使用して調製することもできる。型成形された錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化された化合物の混合物を、適当な機械で型成形することにより作製することもできる
錠剤、および他の固体の剤形、例えば糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒などは、任意選択で芯にするかまたはコーティングおよび殻、例えば、腸内コーティングおよび医薬製剤化の技術分野で周知の他のコーティングを用いて調製することもできる。それらは、その中の有効成分の遅延または制御された放出を提供するように、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを、所望の放出プロファイルを提供するように比率を変えて使用して製剤化することもできる。組成物は、急速な放出のために、例えば、凍結乾燥して製剤化することもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することにより、または滅菌剤を、使用直前に滅菌水もしくは何らかの他の滅菌注射用媒体に溶解され得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことにより滅菌することもできる。これらの組成物は、任意選択で乳白剤を含んでいてもよく、それらが有効成分（単数または複数）だけを、または胃腸管のある特定の部分で優先的に、任意選択で遅延様式で放出する組成物であってもよい。使用され得る包埋する組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを含む。有効成分は、適当であれば、１つまたは複数の上記の賦形剤でマイクロカプセル化された形態であることもできる。
直腸または膣内投与のための製剤は、座剤として提供することもでき、それは、本発明の１つまたは複数の化合物と１つまたは複数の適当な非刺激性賦形剤、または例えば、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣内空洞で溶融して、有効化合物を放出するココアバター、ポリエチレングリコール、座剤ワックスもしくはサリチレートを含む担体と混合することにより調製することもできる。
膣内投与のために適当な製剤は、当技術分野で適当であることが公知である担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡沫剤または噴霧の製剤も含む。
本発明の二重ウイルスパッキングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を含む組成物の局所または経皮投与のための剤形は、散剤、噴霧剤、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、貼付剤および吸入剤を含む。有効化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされることがある任意の防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合することができる。
軟膏、ペースト、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の有効化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物および植物の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などを含むこともできる。
散剤および噴霧剤は、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、カルシウムシリケートおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などを含むことができる。噴霧剤は、それらに加えて、通例の噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素および揮発性で非置換の炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパンなどを含むことができる。
経皮貼付剤は、制御された送達を身体に提供する追加の利点を有する。かかる剤形は、化合物を、適当な媒体に溶解または分散することにより作製することができる。皮膚を越える化合物の流束を増大させるために、吸収増強剤を使用することもできる。かかる流束の速度は、速度制御膜を提供するか、または化合物をポリマーマトリックスもしくはゲル中に分散するかのいずれかにより制御することができる。
眼科用製剤、眼の軟膏、散剤、溶液等も、本発明の範囲内であると考えられる。
非経口または腫瘍内投与のために適当な医薬組成物は、滅菌された等張の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、または使用直前に、糖類、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい滅菌注射用溶液または分散液中で再構成することができる滅菌散剤を含むことができる。
本発明の医薬組成物中で使用することができる適当な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）および適当なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレエートなどの注射用有機エステルが含まれる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には、必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
ある特定の実施形態では、上記の医薬組成物は、当技術分野で公知の他の薬学的に有効な化合物（「第２の有効な薬剤」）と、本明細書で提供される方法および組成物により組み合わせることができる。第２の有効な薬剤は、大きい分子（例えば、タンパク質）または小さい分子（例えば、合成無機、有機金属、または有機分子）であることができる。一実施形態では、第２の有効な薬剤は、がんの処置を独立にまたは相乗的に助ける。
例えば、化学療法剤は、抗がん剤である。化学療法剤という用語は、白金系薬物、例えば、カルボプラチンおよびシスプラチンなど；窒素マスタードアルキル化剤；ニトロソウレアアルキル化剤、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）および他のアルキル化剤など；メトトレキセートなどの抗代謝剤；プリンアナログ抗代謝剤；ピリミジンアナログ抗代謝剤、例えば、フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビンなど；ホルモンの抗新生物剤、例えば、ゴセレリン、リュープロリド、およびタモキシフェンなど；天然抗新生物剤、例えば、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、アルデスロイキン、インターロイキン−２、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）など；抗生物質の天然抗新生物剤、例えば、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびミトマイシンなど；およびビンカアルカロイドの天然抗新生物剤、例えばビンブラスチンおよびビンクリスチンなどを含むが、これらに限定されない。
さらに、以下の薬物は、たとえそれ自体が抗新生物剤と考えられなくても、抗新生物剤との組合せで使用することができる：ダクチノマイシン；ダウノルビシンＨＣｌ；ドセタキセル；ドキソルビシンＨＣｌ；エポエチンアルファ；エトポシド（ＶＰ−１６）；ガンシクロビルナトリウム；ゲンタマイシン硫酸塩；インターフェロンアルファ；リュープロリド酢酸塩；メペリジンＨＣｌ；メタドンＨＣｌ；ラニチジンＨＣｌ；ビンブラスチン硫酸塩；およびジドブジン（ＡＺＴ）。例えば、フルオロウラシルは、最近、エピネフリンおよびウシコラーゲンと共に製剤化されて、特に効果的な組合せを形成した。
さらになお、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、および他の大分子の以下のリストも使用されてよい：突然変異体およびアナログを含むインターロイキン１〜１８、；インターフェロンα、β、およびγなどのインターフェロンまたはサイトカイン；ホルモン、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）およびアナログ、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）など；増殖因子、例えば、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、増殖ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、表皮性増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子相同性因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびインスリン増殖因子（ＩＧＦ）など；腫瘍壊死因子−α＆β（ＴＮＦ−α＆β）；侵襲阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１〜７（ＢＭＰ１〜７）；ソマトスタチン；ザイモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管新生因子；抗原性材料；およびプロドラッグ。
本明細書に記載されている処置の組成物および方法で使用するための化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミドなど；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなど；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethiylenethiophosphoramide）およびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質、例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマｌＩおよびカリケアマイシンオメガｌ１など；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシンなど；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アンスラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキソドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、例えば、ミトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシンン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；抗代謝物、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリニン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル；クロラムブシル；ゲミシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロミチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；および上記の薬学的に許容される塩、酸または任意の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本発明の組成物は、治療用薬物またはプロドラッグ、例えば、他の化学療法剤、スカベンジャー化合物、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗炎症薬、血管収縮薬および抗凝血薬、がんワクチン適用のために有用な抗原または対応するプロドラッグを含む他の生物学的に活性な物質を含むこともできる。
例示的なスカベンジャー化合物は、チオール含有化合物、例えば、グルタチオン、チオ尿素、およびシステインなど；アルコール、例えば、マンニトール、置換されたフェノールなど；キノン、置換されたフェノール、アリールアミンおよびニトロ化合物を含むが、これらに限定されない。
化学療法剤および／または他の生物学的に活性な薬剤の種々の形態が使用され得る。これらは、生物学的に活性な非荷電分子、分子錯体、塩、エーテル、エステル、アミド等のような形態を含むが、これらに限定されない。
ＩＩ．がんを処置するための方法
本開示の主題は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）において、がんを予防、阻害、または処置するための方法を提供する。この方法は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞（例えば、がん細胞）においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の癌遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）を提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更するまたは不活性化する、ステップ；および（ｂ）治療有効量のこのシステムを対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（例えば、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）は、このヌクレアーゼシステムを含むアデノ随伴ウイルスと同時にまたは共投与される（すなわち、二重ウイルスパッケージングシステム）。一部の実施形態では、該システムは単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージされ、パッケージングアデノウイルスなしで使用される。一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、１１のヒトアデノ随伴ウイルス血清型（例えば、血清型１〜１１）のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、アデノ随伴パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルスの遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む。一部の実施形態では、パッケージングアデノウイルスは、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５、またはアデノウイルス血清型３５から選択される。一部の実施形態では、パッケージングウイルスはアデノウイルス血清型５である。一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される。一部の実施形態では、このアデノウイルス遺伝子はＥ３である。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、この標的配列は、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、少なくとも１つの突然変異を含む癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣからなる群から選択されるがんドライバー遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＫＲＡＳである。一部の実施形態では、このＫＲＡＳは、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＰＩＫ３ＣＡである。一部の実施形態では、このＰＩＫ３ＣＡは、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は癌遺伝子であり、前記癌遺伝子はＩＤＨ１である。一部の実施形態では、このＩＤＨ１は、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む。一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、全身投与を介して投与される。一部の実施形態では、この全身投与は、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、腫瘍内または腫瘍周囲投与される。一部の実施形態では、対象が少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される、請求項１に記載の方法。一部の実施形態では、この抗がん剤は、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される。一部の実施形態では、この対象は、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される。一部の実施形態では、この抗がん療法は、放射線療法、化学療法または手術である。一部の実施形態では、このがんは固形腫瘍である。一部の実施形態では、このがんは、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、このがんは脳がんである。一部の実施形態では、この対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、この哺乳動物はヒトである。一部の実施形態では、この対象において細胞増殖は阻害または低減される。一部の実施形態では、この対象において悪性腫瘍は阻害または低減される。一部の実施形態では、この対象において腫瘍壊死は増強または増加される。
Ｅ１Ｂ欠損アデノウイルスの腫瘍細胞に増殖感染し溶解する能力が公表されている。このがん細胞の親和性の根底にある機構は、最初に考えられたよりも複雑であることが証明されたが、Ｏｎｙｘにより開発された腫瘍崩壊性アデノウイルス（Ｏｎｙｘ−０１５として公知）は、一部の臨床試験で十分に実施されて、現在、中国でＯｎｃｏｒｉｎｅとして販売されている。ＯＮＹＸ−０１５と対照的に、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、ウイルスが、感染に対する生来の免疫応答を抑制することを防止する微妙なＥ１Ｂの突然変異で設計されているが、ウイルスのＲＮＡの細胞原形質への輸送を方向付ける能力は保持している。インターフェロンにより媒介されるこの応答は、典型的には多くのがん細胞で失われている。
Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋのがんに対する適用は、いくつかの戦略的選択肢を提供する。コンパニオンｒＡＡＶは、コンパクトな腫瘍抑制因子、またはインターフェロンのような免疫刺激因子を含むことができた。あるいはコンパニオンｒＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム（例えばＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲシステム）を備えることができた。かかるｒＡＡＶに含まれるｇＲＮＡは、発癌突然変異を特異的に標的とするように、または欠陥のある腫瘍抑制遺伝子の修復を助長するようにプログラムすることができた。
がん療法に対して二重ウイルスシステムがｒＡＡＶ単独に優ると予測される利点は、標的とされる遺伝子送達／標的とされる遺伝子変更の程度および持続時間である。治療用ｒＡＡＶの１回の投与量の投与は、到達可能な腫瘍中の多くの細胞をおそらく標的とすることができた。このように修飾された細胞の比率は、疾患の経過に大きく影響するためには十分でない事象で、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋを、ｒＡＡＶと組み合わせることもできる。腫瘍自体の複製の潜在能力と合わせることにより二重ウイルスパッケージングシステムは、より長い時間のスケールで、より大きい比率のがん細胞を標的とする独特の機会を提供することができる。理論にとらわれることは望まず、この二重ウイルス腫瘍溶解療法がどのように働き得るかの例を図３に示す。
発癌突然変異を標的とするために、コンパニオンｒＡＡＶは、反復性の発癌突然変異を高度に特異的な様式で不活性化するように設計することができた。ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＩＤＨ１のがん関連の癌遺伝子形態を選択的に破壊することができるｇＲＮＡのパネルが、本明細書で提供される。まとめると、ＫＲＡＳおよびＰＩＫ３ＣＡにおけるこれらの特異的突然変異は、肺においておよびＧＩ管全体にわたって大部分のがんに見出される。ＩＤＨ１ Ｒ１３２の突然変異は、神経膠腫の約３０％で見出される。これらの脳腫瘍は、従来の全ての形態の治療に対して特に難治性である。これらのｇＲＮＡの各々は、残りの野生型対立遺伝子でオフターゲット効果を惹起しないで、主として突然変異型対立遺伝子を標的とする。
用語「投与する」は、医薬または組成物を対象に提供することを意味して、医学の専門家による投与および自己投与を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「障害」とは一般に、同定された標的もしくは経路のうち１つに対する化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量によって処置され得る任意の疾患、障害または状態を含む、同定された標的または経路のうち１つに対する化合物による処置から利益を得る任意の状態を指す。
用語「がん」は、本明細書で使用される場合、制御されない様式で増殖して、一部の場合に、転移する（広がる）傾向がある細胞の異常な増殖を指す。がんのタイプは、転移があるかまたはない疾患の任意のステージにおける、固形腫瘍（膀胱、腸、脳、乳房、子宮内膜、心臓、腎臓、肺、子宮、リンパ組織（リンパ腫）、卵巣、膵または他の内分泌器官（甲状腺）、前立腺、皮膚の腫瘍（黒色腫または基底細胞がんなど）または血液の腫瘍（白血病およびリンパ腫など）を含むが、これらに限定されない。
がんの追加の例には、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）、急性リンパ性白血病、急性骨髄腫白血病、副腎皮質の癌腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫様／桿状の腫瘍、基底細胞癌腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん（骨肉腫および悪性の線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳および脊髄腫瘍、乳房がん、気管腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸がん、結直腸のがん、頭蓋咽頭腫、皮膚のＴ細胞リンパ腫、胚性腫瘍、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、眼のがん、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃（胃）がん、胃腸類癌腫腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃腸間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、神経膠腫、毛様細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭のがん、眼内黒色腫、ランゲルハンス島細胞腫瘍（内分泌の膵）、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄腫白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、皮膚のＴ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、中皮腫、口腔がん、慢性骨髄性白血病、骨髄腫白血病、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性の潜在性腫瘍、膵がん、乳頭腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、松果体の中間分化実質性腫瘍、松果体芽細胞腫および小脳テント上初生神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、血漿細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺の芽細胞腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎臓細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、肉腫、カポジ、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮癌腫、胃（胃）がん、小脳テント上初生神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺の癌腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣内がん、外陰部のがん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「処置」は、かかる用語が適用される疾患、障害もしくは状態、またはかかる疾患、障害もしくは状態（例えば、がん）の１つもしくは複数の症状または発現の進行を逆行、緩和、阻害し、尤度を予防または低減することを含むことができる。一部の実施形態では、処置はがん細胞を減少させる。例えば、処置は、がん細胞を、処置を受ける前の対象または処置を受けない対象におけるがん細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて減少させることができる。一部の実施形態では、処置は、対象におけるがん細胞を完全に阻害する。
一部の実施形態では、このシステムは、対象に投与するステップの前に、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。処置、投与または治療は、継続的または間欠性であり得る。継続的な処置、投与または治療とは、１または複数日の処置の中断を伴わない、少なくとも毎日の処置を指す。間欠性の処置もしくは投与、または間欠性様式での処置もしくは投与とは、継続的ではなく事実上周期性の処置を指す。本明細書に開示されている方法に従う処置は、疾患、障害もしくは状態の完全な解放もしくは治癒、または疾患、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の部分的寛解を生じ得、一時的または恒久的であり得る。用語「処置」は、予防、治療および治癒も包含する意図である。
用語「有効量」または「治療有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、対象および処置されている疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうち１つまたは複数に依存して変動し得、これらは、当業者によって容易に決定され得る。この用語は、本明細書に記載されているイメージング方法のいずれか１つによって検出のためのイメージを提供する用量にも適用される。具体的な用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、イメージングされる組織、それが運搬される物理的送達システムのうち１つまたは複数に依存して変動し得る。この技術分野における当業者により認識されているように、薬剤の有効量は、所望の生物学的終点、送達されるべき薬剤、医薬組成物の組成、標的の組織または細胞など因子に依存して変化し得る。さらに特に、用語「有効量」は、所望の効果、例えば、疾患、障害、または状態、またはそれらの１つもしくは複数の症状の重症度、持続時間、進行、または開始を低減もしくは緩和；疾患、障害、もしくは状態の進行の予防、疾患、障害、または状態の退縮の惹起；疾患、障害、もしくは状態と関連する症状の再発、開発、開始もしくは進行の予防；または別の療法の予防もしくは治療の効果（単数または複数）の増強もしくは改善を生ずるために十分な量を指す。
用語「阻害する（inhibit）」または「阻害する（inhibits）」とは、未処置の対照対象、細胞、生物経路もしくは生物活性と比較して、または対象が処置される前の対象における、固体の悪性腫瘍の成長などの標的と比較して、固体の悪性腫瘍の成長などの、疾患、障害もしくは状態の発達もしくは進行、生物経路の活性、または生物活性を、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはさらには１００％減少、抑制、減弱、減退、停止または安定化することを意味する。用語「減少」とは、がん疾患、障害または状態の症状を阻害、抑制、減弱、減退、停止または安定化することを意味する。除外されるわけではないが、疾患、障害または状態を処置することは、疾患、障害、状態またはそれらと関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。
「薬学的に許容される」というフレーズは、本明細書では、信頼できる医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題または合併症がなくて合理的なベネフィット／リスク比が釣り合った、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するために適当なこれらの化合物、材料、組成物、および／または剤形を指して使用される。
語句「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で使用される場合、１つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部へと対象化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒カプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者にとって傷害性でないという意味で「許容される」べきである。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬製剤において使用される他の非毒性の適合性物質。
「薬学的に許容される塩」とは、化合物の比較的非毒性の無機および有機の酸付加塩を指す。
用語「予防する（prevent）」、「予防する（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的（prophylactic）処置」などは、疾患、障害もしくは状態を有してはいないが、疾患、障害もしくは状態を発達させるリスクがあるまたはそれに対して感受性の対象において、疾患、障害もしくは状態を発達させる確率を低減させることを指す。
用語「対象」および「患者」は、本明細書で互換的に使用される。その多くの実施形態において本明細書に開示されている方法によって処置される対象は、望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載されている方法は、用語「対象」に含まれることが意図される全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解すべきである。したがって、「対象」は、医学的目的、例えば、既存の状態もしくは疾患の処置、または状態もしくは疾患の発症を予防するための予防的処置のためにはヒト対象、あるいは医学的、獣医学的目的のため、または開発目的のためには動物対象を含み得る。適切な動物対象には、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿など；ウシ（bovine）、例えば、ウシ（cattle）、雄ウシ（oxen）など；ヒツジ（ovine）、例えば、ヒツジ（sheep）など；ヤギ（caprine）、例えば、ヤギ（goat）など；ブタ（porcine）、例えば、ブタ（pig）、雄ブタ（hog）など；ウマ（equine）、例えば、ウマ（horse）、ロバ、シマウマなど；ヤマネコおよびイエネコを含むネコ（feline）；イヌ（dog）を含むイヌ（canine）；ウサギ、ノウサギなどを含むウサギ類；ならびにマウス、ラットなどを含むげっ歯類が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物が含まれる。動物は、トランスジェニック動物であり得る。一部の実施形態では、この対象は、胎児、新生児、乳児、若年および成人対象が含まれるがこれらに限定されないヒトである。さらに、「対象」は、状態もしくは疾患に罹患しているまたは状態もしくは疾患に罹患していることが疑われる患者を含み得る。
用語「それを必要とする対象」は、治療または処置が必要と同定された対象を意味する。
用語「全身的投与」、「全身的に投与」、「末梢投与」および「周辺に投与」は、中枢神経系中に直接でなく、それが患者の系に入り、したがって、代謝および他の類似のプロセスを受けるような、化合物、薬物または他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。
用語「治療剤」または「医薬」は、宿主に対して所望の生物学的効果を有し得る薬剤を指す。化学療法および遺伝毒性の薬剤は、生物学的に対して、起源が化学的であるか、または特定の作用機構により治療効果を生ずることが、それぞれ、一般的に公知である治療剤の例である。生物起源の治療剤の例は、増殖因子、ホルモン、およびサイトカインを含む。種々の治療剤が当技術分野で公知であり、それらの効果により同定され得る。ある治療剤は、細胞の増殖および分化を調節することができる。例には、化学療法ヌクレオチド、薬物、ホルモン、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）に結合する非特異的（例えば非抗体）タンパク質、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、およびペプチド模倣体が含まれる。
用語「治療効果」とは、薬理学的に活性な物質によって引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より特にはヒトにおける局所的または全身的効果を指す。
用語「治療有効量」および「有効量」とは、本明細書で使用される場合、任意の医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で、動物中の細胞の少なくとも下位集団においていくらかの所望の治療効果を生じるのに有効な、本発明の化合物、物質、または化合物を含む組成物の量を意味する。
用語「腫瘍」、「悪性固体」、または「新生物」は、細胞の異常なまたは調節されない増殖により形成された病変を指す。好ましくは、腫瘍は悪性であり例えば、がんによって形成されるものである。
上で記載された組成物、キット、ならびに検出、診断および予知の方法は、適当な処置のレジメンの選択を助けるために、およびより積極的な治療から利益を受けると思われる個体を同定するために使用することができる。
上で言及したように、がんを処置するための手法は、手術、免疫療法、化学療法、放射線療法、化学療法と放射線療法または生物学的療法の組合せを含む。癌腫の処置で使用されてきた化学療法剤は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、イホスファミド、およびコルチコステロイド（プレドニゾン）を含むが、これらに限定されない。しばしば、これらの薬剤は、それらの有効性を向上させるために組合せで与えられる。がんを処置するために使用される組合せは、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシドおよびシクロホスファミドの組合せ、ならびにシスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミドおよびビンクリスチンの組合せを含む。
したがって、上で記載された方法は、初期ステージのがん患者のために適当な処置の選択に特定の使用を見出す。疾患の初期ステージでがんと診断された個体の大部分は、手術および／または放射線療法後に、さらなる補助療法なしで長期生存を楽しむ。しかしながら、有意のパーセンテージのこれらの個体が、疾患再発を患うかまたは死亡して、一部のまたは全ての初期ステージのがん患者が補助療法（例えば、化学療法）を受けるべきであるという臨床の勧告を導く。本発明の方法は、初期ステージのがんを有する個体のうちのこの高いリスク、不幸な予後集団を同定することができ、それにより、どの患者が継続するおよび／またはもっと積極的な治療ならびに処置後の密接なモニタリングから利益を得るかを決定するために使用することができる。例えば、初期ステージのがんを有して、本明細書で開示された方法により不幸な予後を有すると調査された個体は、手術および／または放射線処置後に化学療法などのさらに積極的な補助療法のために選択されてもよい。特定の実施形態で、本発明の方法は、標準手順および処置と合わせて使用されてもよく、医師が、より多くの情報を得てがんの処置を決定することを可能にする。
用語「がん療法に対する応答」または「がん療法の成果」は、がん療法に対する過剰増殖障害（例えば、がん）の任意の応答に関し、好ましくは、新補助または補助的化学療法の開始後の腫瘍の質量および／または体積における変化に関する。過剰増殖障害の応答は、例えば、有効性について、または新補助療法または補助療法の状況で調査することができ、そこで、全身的介入後の腫瘍のサイズを、初期サイズおよびＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波または触診により測定された寸法と比較することができる。応答は、固形がんについては、生検または外科的切除後に腫瘍のカリパス測定または病理学的検査によっても調査することができる。応答は、腫瘍体積におけるパーセンテージの変化のような定量的様式で、または「病理学的完全奏効」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）または他の定性的基準のような定性的様式で記録されてもよい。過剰増殖障害の応答のアセスメントは、新補助または補助療法の開始後の初期、例えば、２〜３時間、２〜３日、２〜３週間後または好ましくは２〜３ヵ月後に行われてもよい。応答のアセスメントの典型的な終点は、新補助化学療法の停止時または残存腫瘍細胞および／または腫瘍床の外科的除去時である。これは典型的には新補助療法の開始後３ヵ月である。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療的処置の臨床有効性は、臨床利益率（ＣＢＲ）を測定することにより決定することができる。臨床利益率は、療法の終了から少なくとも６ヵ月の時点で、完全寛解（ＣＲ）にある患者、部分寛解（ＰＲ）にある患者の数および安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数のパーセンテージの合計を決定することにより測定される。この式のための省略表現は、６ヵ月間についてＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定のがん治療レジメンに対するＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれを超える。
がん療法に対する応答を評価するための追加の基準は、以下の全てを含む「生存」に関係する：全生存期間としても公知である死亡までの生存（前記死亡は、原因に関わらずまたは腫瘍が関係したのいずれでもよい）；「再発のない生存」（ここで、再発という用語は、局在化されたおよび遠隔の再発の両方を含むべきである）；転移のない生存；疾患のない生存（ここで、疾患という用語は、がんおよびそれと関連する疾患を含むべきである）。前記生存の長さは、規定された開始点（例えば、診断時または処置の開始時）および終点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算することができる。それに加えて、処置の有効性の基準は、所与の期間内の化学療法に対する応答、生存の確率、転移の確率、および腫瘍再発の確率を含むように拡大することができる。例えば、適当な閾値を決定するために、特定のがん治療レジメンを、対象の集団に投与することができ、結果を、任意のがん療法の投与前に決定された本明細書に記載されている１つまたは複数のＳＮＰまたはインデルのコピー数、発現のレベル、活性のレベル、その他と関係づけることができる。結果の測定は、新補助療法の設定で与えられた治療に対する病理学的応答であってもよい。あるいは、全生存期間および疾患のない生存などの結果の測定は、測定値が公知のがん療法後の対象について、期間中を通じてモニタリングすることができる。ある特定の実施形態では、同じ用量のがん療法剤が各対象に投与される。関係する実施形態で、投与される用量は、がん療法剤について当技術分野で公知の標準用量である。対象がモニタリングされる期間は変化し得る。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヵ月間モニタリングされることもある。結果は、「ハザード比」（１つの患者群の別の群との死亡率の比；ある時点における死の尤度を提供する）、「全生存期間」（ＯＳ）、および／または「進行のない生存」に関して測定することもできる。ある特定の実施形態では、予後は、１年、２年、３年、４年、または任意の他の適当な時点における全生存率の尤度を含む。本発明の全ての態様における不幸な結果の予後と関連する有意性は、当技術分野で公知の技法によって測定される。例えば、有意性は、オッズ比の計算で測定することもできる。さらなる実施形態では、有意性はパーセンテージにより測定される。一実施形態では、有意の不幸な結果のリスクは、０．８またはそれ未満または、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０および４０．０を含むが、これらに限定されない少なくとも約１．２のオッズ比として測定される。さらなる実施形態では、関連する結果（例えば、正確さ、感度、特異性、５年生存、１０年生存、転移のない生存、ステージ予測等）に関して、リスクの有意の増大または低下は、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびそれを超える、またはその間の任意の範囲であるが、これらに限定されない少なくとも約２０％である。さらなる実施形態では、リスクの有意の増大は、少なくとも約５０％である。したがって、本発明は、本発明の異なる態様および実施形態に従って、がん患者の予後を予知する方法を実施して、次に、がん患者のための処置の経過を決定することにおける、他の公知の臨床および病理学的リスク因子に照らして、結果をよく考えて、がん患者のために処置を決定する方法をさらに提供する。例えば、本発明の方法によって、組合せの化学療法の処置により不幸な結果のリスクが増大することが示されたがん患者は、放射線療法、末梢血液幹細胞移植、骨髄移植、または新規または臨床研究中の実験療法を含むが、これらに限定されない、より積極的な治療で処置することができる。それに加えて、がん療法の応答は、本明細書に記載されている方法により、増強された感度および／または特異性の基準によって予測することができることが理解されるであろう。例えば、感度および／または特異性は、少なくとも０．８０、．８１、．２、．８３、．８４、．８５、．８６、．８７、．８８、．８９、．９０、．９１、．９２、．９３、．９４、．９５、．９６、．９７、．９８、．９９またはそれを超える、その間の任意の範囲であり、または感度および特異性の各々について任意の組合せであり得る。
用語「感受性にする」は、がん療法（例えば、化学療法または放射線療法）による関連するがんのより効果的な処置を可能にするように、がん細胞または腫瘍細胞を変更することを意味する。一部の実施形態では、正常細胞は、正常細胞ががん療法（例えば、化学療法または放射線療法）により不当に損傷される程度に影響されない。治療的処置に対して増大した感度または低下した感度は、特定の処置について当技術分野で公知の方法、および本明細書で下に記載した方法；細胞増殖アッセイ（Tanigawa N、Kern D H、Kikasa Y、Morton D L、Cancer Res １９８２年；４２巻：２１５９〜２１６４頁）、細胞死アッセイ（Weisenthal L M、Shoemaker R H、Marsden J A、Dill P L、Baker J A、Moran E M、Cancer Res １９８４年；９４巻：１６１〜１７３頁；Weisenthal L M、Lippman M E、Cancer Treat Rep １９８５年；６９巻：６１５〜６３２頁；Weisenthal L M、;Kaspers G J L、Pieters R、Twentyman P R、Weisenthal L M、Veerman A J P、編、Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma; Langhorne、P A: Harwood Academic Publishers、１９９３年：４１５〜４３２頁；Weisenthal L M、Contrib Gynecol Obstet １９９４年；１９巻：８２〜９０頁）を含むが、これらに限定されない方法に従って測定される。感度または耐性は、ある期間、例えば、ヒトについては６ヵ月およびマウスについては４〜６週間を通じた腫瘍サイズの減少を測定することにより動物でも測定することができる。組成物または方法は、かかる組成物または方法の不在における処置の感度または耐性と比較して、処置の感度における増大または耐性における低下が、２５％またはそれを超えれば、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれを超えて、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍またはそれを超えれば、治療的処置に対する応答を感受性にする。治療的処置に対する感度または耐性の決定は、当技術分野で日常的であり、通常の熟練した臨床医の技術のうちである。がん療法の有効性を増強するための本明細書に記載されている任意の方法が、過剰増殖または他の状態のがん性細胞（例えば、耐性細胞）をがん療法に対して感受性にする方法に均等に適用され得ることが理解されるべきである。
用語「生存」は以下の全てを含む：全生存期間としても公知である死亡までの生存（前記死亡は、原因に関わらずまたは腫瘍が関係したのいずれでもよい）；「再発のない生存」（ここで、再発という用語は、局在化されたおよび遠隔の再発の両方を含むべきである）；転移のない生存；疾患のない生存（ここで、疾患という用語は、がんおよびそれと関連する疾患を含むべきである）。前記生存の長さは、規定された開始点（例えば、診断時または処置の開始時）および終点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算することができる。それに加えて、処置の有効性の基準は、所与の期間内の化学療法に対する応答、生存の確率、転移の確率、および腫瘍再発の確率を含むように拡大することができる。
本発明は、がん性腫瘍を含むがんを予防、遅延、低減、および／または処置する新規な治療的方法をさらに提供する。一実施形態では、処置の方法は、対象（例えば、それを必要とする対象）に、有効量の二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧを、単独で投与することを含む。それを必要とする対象は、例えば、前がん腫瘍、がんを含む腫瘍を有すると診断された対象、または以前の処置で難治性であった対象を含む、処置されたことのある対象を含むこともできる。
本発明の方法は、任意のがん性または前がん性腫瘍を処置するために使用することができる。ある特定の実施形態では、がん性腫瘍は、脳、大腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、前立腺、膵、肝臓、食道、胃、造血性、乳房、胸腺、精巣、卵巣、皮膚、骨髄および／または子宮の組織から選択される組織に位置し得る。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、任意のがんを処置するために使用することができる。本発明の方法および組成物により処置され得るがんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、大腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽腔、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮のがん細胞を含むが、これらに限定されない。それに加えて、がんは、特に、以下の組織学的タイプのものであることがあるが、これらに限定はされない：悪性の新生物；癌腫；未分化癌腫；巨細胞およびスピンドル細胞癌腫；小細胞癌腫；乳頭癌腫；扁平上皮癌腫；リンパ上皮性癌腫；基底細胞癌腫；毛質性上皮腫癌腫；移行性細胞癌腫；乳頭移行性細胞癌腫；腺癌；悪性のガストリン産生腫瘍；胆管癌；肝細胞癌腫；合体した肝細胞癌腫および胆管癌；小柱腺癌；アデノイド嚢胞性癌腫；腺腫ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性結腸ポリポーシス；固形癌腫；悪性の類癌腫腫瘍；気管支肺胞の腺癌；乳頭腺癌；非染色性癌腫；好酸性細胞癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；透明細胞腺癌；顆粒状細胞癌腫；濾胞性腺癌；乳頭および濾胞性腺癌；非カプセル化硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；皮脂様腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌腫；浸潤管癌腫；延髄癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；乳腺のパジェット病；腺房細胞；腺扁平上皮癌腫；腺癌ｗ／扁平上皮異形成；悪性胸腺腫；悪性の卵巣癌腫間質腫瘍；悪性の莢膜細胞腫；悪性の顆粒膜細胞腫瘍；および悪性の芽細胞腫（roblastoma）；セルトリ細胞癌腫；悪性のライディッヒ細胞腫瘍；悪性の脂質細胞腫瘍；悪性の傍神経節腫、；悪性の乳房外傍神経節腫、；好クロム細胞腫；血管球肉腫；悪性黒色腫；無メラニン性黒色腫；表在性拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性の線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；肺胞の横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性の混合腫瘍；ミュラーの混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性の葉状腫瘍；滑液肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛上皮腫；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；皮質の近接部骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉系の軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；悪性の歯原腫瘍、；エナメル芽細胞歯肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル芽細胞線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星細胞腫；原形質星細胞腫；原繊維性星細胞腫；星状膠芽細胞腫；乏突起膠腫；希突起膠腫；未熟神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経線維腫；悪性顆粒状細胞腫瘍；悪性のリンパ腫；ホジキン病；ホジキンのリンパ腫；側肉芽腫；悪性のリンパ腫、小さいリンパ球性；大細胞びまん性の悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫、；菌状息肉症；他の特化非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖小腸疾患；白血病；リンパ白血病；血漿細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄腫白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球の白血病；骨髄腫肉腫；および毛様細胞白血病。
本明細書に記載されている組成物は、経口的に、経鼻的に、経粘膜的に、眼に、直腸に、膣内に；筋肉、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑液内、肝内、病巣内、脳内、腹腔内、鼻腔内、または眼内の注射、小脳延髄槽内を含む非経口的に；散剤、軟膏または液滴（点眼薬を含む）により局所的に；頬側におよび舌下にを含み；吸入スプレーを通して、または当技術分野で公知の他の送達様式で経皮的に；を含む任意の適当な投与経路により送達されてもよい。
用語「全身的投与」、「全身的に投与」、「末梢に投与」、および「周辺に投与」は、本明細書で使用される場合、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧの、それが患者の系に入り、したがって、代謝および他の類似のプロセスを受けやすいような単独投与を意味する。
用語「非経口投与」および「非経口的に投与」は、本明細書で使用される場合、腸内および局所投与以外の、通常、注射による投与様式を意味して、静脈内、筋肉、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射、腫瘍内部注射、および点滴を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、全身的に（例えば、経口または非経口投与により）送達される。ある他の実施形態では、医薬組成物は、腫瘍中に直接注射または腫瘍の血液供給（例えば、動脈または静脈の血液供給）中に直接注射を通して局所的に送達される。一部の実施形態では、医薬組成物は、全身的および局所投与の両方により送達される。例えば、腫瘍を有する対象は、本明細書に記載されている組成物を含む組成物を腫瘍または腫瘍の血液供給中に直接注射することを、本発明の医薬組成物の経口投与と組み合わせることにより処置することもできる。局所および全身的両方の投与が使用される場合には、局所投与は、全身的投与の前に、それと同時におよび／またはその後で行うことができる。
ある特定の実施形態では、がん性または前がん性腫瘍の処置を含む本発明の処置の方法は、本明細書に記載されている組成物を、第２の薬剤および／または療法との組合せで対象に投与することを含む。「との組合せで」により、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧの単独と、１つまたは複数の治療剤とを、同時に、順次に、またはそれらの組合せのいずれかで投与することが意味される。したがって、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧを、単独で、および／または治療剤との組合せで投与される対象は、両方の薬剤の組合せの効果が対象で達成される限り、本明細書に記載されている二重ウイルスパッケージングシステムを含む組成物、および１つまたは複数の治療剤を、同じ時に（すなわち、同時に）または異なる時に（すなわち、同じ日に、または異なる日にいずれかの順で）受けることができる。順に投与される場合に、薬剤は、互いに、１、５、１０、３０、６０、１２０、１８０、２４０分以内に、またはそれを超えて投与することができる。他の実施形態では、順次投与される薬剤は、互いに、１、５、１０、１５、２０日以内に、またはそれを超えて投与することができる。
組合せで投与される場合、薬剤の各々の、特定の生物学的応答を引き出すために効果的な濃度は、単独で投与される場合の各薬剤の効果的な濃度未満であってもよく、それにより、１つまたは複数の薬剤の投与量を、該薬剤が単剤で投与されるならば必要とされる投与量に対して低減することを可能にする。複数の薬剤の効果は、相加的または相乗的であることもあるが、その必要はない。薬剤は、複数回投与されてもよい。かかる組合せ療法で、第１の投与薬剤の治療効果が、次の薬剤（単数または複数）の順次、同時のまたは別々の投与によって減殺されることはない。
かかる方法は、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている組成物を含む医薬組成物を、１つまたは複数の化学療法剤および／または、本明細書に記載されている化学療法剤を含むスカベンジャー化合物、ならびに当技術分野で公知の他の薬剤と共に投与することを含む。連結療法は、後続の化合物が投与される時に、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物の投与の治療効果が完全に消失していないように、組成物を、順次、同時および別々、または一緒に投与することを含む。一実施形態では、第２の薬剤は化学療法剤である。別の実施形態では、第２の薬剤はスカベンジャー化合物である。別の実施形態では、第２の薬剤は放射線療法である。さらなる実施形態では、放射線療法は、組成物に加えて適用されてもよい。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、別々の医薬組成物で共製剤化されてもよい。
一部の実施形態では、本発明の対象の医薬組成物は、予防的または治療的処置の一部として組み込まれた治療剤または他の材料の治療有効量を、患者に送達するために十分な量で送達されるべき物質（単数または複数）を組み込む。粒子中の有効化合物の所望の濃度は、薬物の吸収、不活性化、および排泄の速度ならびに化合物の送達速度に依存する。投薬量の値は、緩和されるべき状態の重症度で変化することもあることが注意されるべきである。任意の特定の対象のために、特定の投薬量のレジメンは、個体の必要および投与するかまたは組成物の投与を管理する人物の専門的判断に従って、時間をかけて調整されるべきであることが、さらに理解されるべきである。典型的には、投薬は、当業者に公知の技法を使用して決定される。
投薬量は二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧを単独で含む組成物の、患者の体重１ｋｇ当たりの量に基づいてもよい。例えば、その中にカプセル化された組成物または化合物の量の範囲は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００または２５０ｍｇまたはそれを超える上記の組成物を含むと考えられる。他の量は、当業者に公知であり、容易に決定されるであろう。
ある特定の実施形態では二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧを単独で含む組成物の投薬量は、一般的に、体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約２５０ｍｇの範囲内、詳細には体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇから約２００ｍｇの範囲内、およびより詳細には体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇから約２００ｍｇの範囲内となる。一実施形態では、投薬量は、体重１ｋｇ当たり約１５０ｍｇから約２５０ｍｇの範囲内である。別の実施形態では、投薬量は体重１ｋｇ当たり約２００ｍｇである。
一部の実施形態では、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧを、単独で、医薬組成物中に含む組成物のモル濃度は、約２．５Ｍ、２．４Ｍ、２．３Ｍ、２．２Ｍ、２．１Ｍ、２Ｍ、１．９Ｍ、１．８Ｍ、１．７Ｍ、１．６Ｍ、１．５Ｍ、１．４Ｍ、１．３Ｍ、１．２Ｍ、１．１Ｍ、１Ｍ、０．９Ｍ、０．８Ｍ、０．７Ｍ、０．６Ｍ、０．５Ｍ、０．４Ｍ、０．３Ｍまたは０．２Ｍ未満であるかまたはそれと等しい。一部の実施形態では、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧを、単独で含む組成物の濃度は、約０．１０ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．０３ｍｇ／ｍｌまたは０．０２ｍｇ／ｍｌ未満またはそれと等しい。
本発明の組成物中の有効成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者のための所望の治療の応答、組成物、および投与様式を、患者に毒性でなく達成するために効果的な有効成分の量を得るように変化させることもできる。
選択された投薬量レベルは、使用される製剤中の特定の治療剤、またはそれらのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与の時、使用される特定の治療剤の排泄または代謝の速度、処置の持続時間、使用される特定の化合物との組合せで使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および前の病歴を含む種々の因子、および医学技術で周知の同様な因子に依存する。
当技術分野で通常の技術を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、医師または獣医ならば、医薬組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるより低いレベルで処方および／または投与して、所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増大させることができる。
一般的に、本発明の化合物の適当な１日の用量は、治療効果を生ずるために効果的な最低の投与量である化合物のその量となる。かかる効果的な投与量は、一般的に、上で記載された因子に依存する。
所望であれば、有効化合物の効果的な１日の用量は、２、３、４、５、６回またはそれを超えて、１日を通して適当な間隔で、別々に投与される部分用量として、任意選択で、単位剤形で投与されてもよい。
与えられる患者で最も効果的な処置を生ずる任意の特定の化合物の投与の正確なタイミングおよび量は、特定の化合物の活性、薬物動態、およびバイオアベイラビリティー、患者の生理学的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよびステージ、一般的な身体の状態、与えられる投薬量に対する応答性および薬物療法のタイプを含む）、投与経路等に依存する。本明細書で提供される指針は、処置を最適化するために、例えば、投与の最適の時および／または量を決定するために使用することができ、それは、対象のモニタリングおよび投薬量および／またはタイミングの調整からなる日常的実験を超えることを必要としない。
対象が処置される間、患者の健康は、２４時間中所定時に、１つまたは複数の関係のある指標を測定することによりモニタリングされ得る。サプリメント、量、投与時および製剤を含む処置の全ての態様は、かかるモニタリングの結果によって最適化され得る。患者は、周期的に再評価されて、同じパラメーターを測定することにより、改善の程度を決定することができ、最初のかかる再評価は、典型的には、治療の開始から４週間の終わりに行われ、その後の再評価は、治療中４から８週間毎に、次にその後３ヵ月毎に行われる。療法は、数ヵ月または数年さえ継続されることもあり、最小１ヵ月がヒトのための療法の典型的な長さである。例えば、薬剤投与の量（単数または複数）および投与のタイミングの調整は、これらの再評価に基づいて行うことができる。
処置は、化合物の最適投与量未満の投薬量で開始することができる。その後、投薬量を、最適の治療効果が達成されるまで、小刻みで増大させることができる。
上で記載されたように、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））またはｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧを、単独で含む組成物を、放射線療法との組合せで投与することもできる。最適化された放射線療法の線量を、対象に１日の線量として与えることができる。放射線療法の最適化された１日の線量は、例えば、約０．２５から０．５Ｇｙ、約０．５から１．０Ｇｙ、約１．０から１．５Ｇｙ、約１．５から２．０Ｇｙ、約２．０から２．５Ｇｙ、および約２．５から３．０Ｇｙであってもよい。例示的な１日の線量は、例えば、約２．０から３．０Ｇｙであってもよい。例えば、腫瘍が放射線の低めの線量に対して耐性であれば、放射線のより高い線量が照射されてもよい。高線量の放射線は、例えば、４Ｇｙに達することもある。さらに、処置のコースを通じた放射線投与の合計線量は、例えば、約５０から２００Ｇｙの範囲であってもよい。例示的な実施形態では、処置のコースを通じた放射線投与の合計線量は、例えば、約５０から８０Ｇｙの範囲である。ある特定の実施形態では、放射線の線量は、ある時間間隔で、例えば、１、２、３、４、または５分の間隔で与えられることもあり、時間の長さは、放射線源の線量率に依存する。
ある特定の実施形態では、最適化された放射線の１日の線量は、例えば、１週間に４または５日、約４から８週間の間投与されてもよい。別の実施形態では、最適化された放射線の１日の線量は、１週間に７日毎日、約４から８週間の間投与されてもよい。ある特定の実施形態では、放射線の１日の線量は、単回の線量で与えられてもよい。あるいは、放射線の１日の線量は、複数回の線量として与えられてもよい。さらなる実施形態では、放射線の最適化された線量は、毎日のベースで患者によって耐え得るより高い放射線の線量であることもある。それなりに、高線量の放射線が、患者に投与されることもあるが、頻度が比較的低い線量のレジメンである。
がん処置で使用され得る放射線のタイプは、当技術分野において周知であり、リニア加速器またはコバルトもしくはセシウム、陽子、および中性子などの放射線源からの電子ビーム高エネルギー光子を含む。例示的なイオン化放射線はＸ線の放射線である。
放射線を適用する方法は、当技術分野において周知である。例示的な方法は、外照射、内部照射、および放射性医薬を含むが、これらに限定されない。外部照射では、リニア加速器が高エネルギーＸ線を、がんに影響されている身体の領域に送達するために使用される。放射線源が身体の外側を起点とするので、外照射は、身体の広い領域を、放射線の均一な投与量で処置するために使用することができる。内部放射線療法は、小線源療法としても公知であり、身体における特定の部位に高線量の放射線を送達することを含む。内部照射療法の２種の主要なタイプは、放射線源が影響される組織に置かれる組織内照射、および放射線源が、影響される領域から短い距離の身体空洞内に置かれる腔内照射を含む。放射性材料は、腫瘍特異的抗体との連結により腫瘍細胞に送達することもできる。内部照射療法で使用される放射性材料は、典型的には、小さいカプセル、ペレット、ワイヤー、チューブ、またはインプラントに含まれる。対照的に、放射性医薬は、経口的に、静脈内または身体空洞中に直接与えられてもよい密封されていない放射線源である。
放射線療法は、定位的手術または定位的放射線療法も含むことができ、その方法では、精密な量の放射線を、リニア加速器またはガンマナイフおよび３次元の原体照射療法（３ＤＣＲＴ）を使用して、小さい腫瘍領域に送達することができ、それは、照射処置の前に腫瘍の位置決めのマッピングを行うコンピューター援用療法である。
対象化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するための細胞培養または実験動物における標準の薬事手順によって決定することができる。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。一部の実施形態で、ＬＤ５０（致死的投薬量）を測定することができ、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ単独と比較して、本明細書に記載されている二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物で、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれを超えて低減することができる。同様に、ＥＤ５０（すなわち、症状の最高の阻害の半分を達成する濃度）を測定することができ、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ単独と比較して、本明細書に記載されている二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物では、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれを超えて増大することができる。同様に、ＩＣ５０（すなわち、がん細胞に対する最高の細胞傷害性または細胞分裂抑制効果の半分を達成する濃度）も、測定することができ、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ、単独と比較して、本明細書に記載されている二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物では、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれを超えて増大することができる。毒性の副作用を示す化合物を使用することもできるが、副作用を低下させるために、化合物が所望の部位を標的とするように、送達システムを設計するように注意するべきである。
一部の実施形態では、本明細書で開示された方法は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらに１００％のがん細胞増殖阻害をアッセイで生ずる。
上記の方法のいずれかで、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物の投与は、対象における固体の悪性腫瘍において、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物の投与前の固体の悪性腫瘍と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらに１００％の減少を生ずることができる。
一部の実施形態では、二重ウイルスパッケージングシステム（すなわち、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｏｎｃｏ−ＣＲＩＳＰＲまたはｒＡＡＶ−ＴＳＧ）およびＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ））を含む組成物の治療有効量は、対象における固体の悪性腫瘍の形成を予防するために、予防的に投与される。
一部の実施形態では、対象はヒトである。他の実施形態では、対象は哺乳動物などの非ヒトである。
細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られたデータは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を製剤化することに使用することもできる。任意の補完物、またはあるいはその中の任意の構成要素の投薬量は、好ましくは、毒性が殆どまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の薬剤について、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで製剤化されてもよい。かかる情報は、ヒトで有用な用量をより正確に決定するために使用することもできる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
ＩＶ．一般的定義
本明細書で具体的な用語が使用されているが、これらは、一般的で記述的な意味でのみ使用され、限定目的で使用されるのではない。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の主題が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
長年の特許法の慣習に従い、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「この（the）」とは、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、「１つの（a）対象」に対する言及は、文脈が明らかに逆（例えば、複数の対象）を指さない限り、複数の対象を含む、などである。
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、文脈上他のものを要求しない限り、非排他的な意味で使用される。同様に、用語「含む（include）」およびその文法的変化形は、リスト中の項目の列挙が、列挙された項目を置換し得るまたは列挙された項目に追加され得る他の同様の項目の排除にならないように、非限定的であることを意図する。
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、特に示さない限り、量、サイズ、寸法、割合、形状、処方、パラメーター、パーセンテージ、パラメーター、数量、特徴を表す全ての数字、ならびに本明細書および特許請求の範囲において使用される他の数値は、用語「約」がその値、量または範囲と共に明示的に出現していない場合であっても、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解すべきである。したがって、逆が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数的パラメーターは、正確ではなく正確である必要もないが、許容範囲、変換係数、四捨五入、測定誤差など、および本開示の主題によって得ることが求められる所望の特性に依存する当業者に公知の他の因子を反映して、おおよそ、および／または所望よりも大きいもしくは小さくてもよい。例えば、用語「約」は、値に言及する場合、特定された量から、一部の実施形態では±１００％、一部の実施形態では±５０％、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０．５％、および一部の実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し得、したがって、変動は、開示されている方法を実施するためまたは開示されている組成物を使用するために適切である。
さらに、用語「約」は、１つまたは複数の数字または数的範囲と合わせて使用される場合、ある範囲内の全ての数字を含む全てのかかる数字を指し、示された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を修飾すると理解すべきである。終点による数的範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数、例えば、それらの分数を含む全整数（例えば、１〜５の列挙は、１、２、３、４および５、ならびにそれらの分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などを含む）、およびその範囲内の任意の範囲を含む。
以下の実施例は、当業者に本開示の主題の代表的な実施形態を実施するための手引きを提供するために含めたものである。本開示および当業者の一般的なレベルに照らして、当業者には、以下の実施例が単に例示的なものであること、ならびに、本開示の主題の範囲から逸脱することなく多数の変化、修飾、および変更を使用することができることが理解されよう。総合的な説明およびそれに従う特定の実施例は、単に例証するためのものであり、本開示の化合物を他の方法によって作製することをいかなる様式でも限定すると解釈されるものではない。
（実施例１）
治療用アデノ随伴ウイルスのｉｎ ｖｉｖｏにおける複製のための二重ウイルスパッケージングシステム。
背景：組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、組織特異的な、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法のために好ましいベクターである。これらのコンパクトなウイルスは非病原性であり、増殖性および静止した細胞の両方の集団に、高い有効性で感染することができる。野生型ＡＡＶは、デペンドパルボウイルス属に属し、最初、アデノウイルス（Ａｄ）に感染した細胞で発見された。これらの単純ウイルスは、ただ２種の遺伝子、ｒｅｐおよびｃａｐだけを含む（図１）。ＡＡＶの感染サイクルのために必要な残余の遺伝子は、Ａｄによりトランスで提供される。治療用ｒＡＡＶの設計で、野生型ウイルス遺伝子が導入遺伝子により置き換えられる。したがって、ｒＡＡＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングされなければならない。標準ｒＡＡＶパッケージングシステムでは、数種の必要なトランス因子は、元々は、ヒト胚の腎臓細胞をアデノウイルスＤＮＡを用いて形質転換することにより創り出された細胞系２９３をパッケージングすることにより提供される。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むトランス因子の残余は、ウイルスの導入遺伝子構築物と一緒に共トランスフェクトされるプラスミドにのせて送達される。「実質のない（ｇｕｔｌｅｓｓ）」ｒＡＡＶに保持されたウイルスの遺伝的エレメントだけは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）である。結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングにより生成された感染性ウイルス粒子は、複製に欠陥がある。
導入遺伝子は、ｒＡＡＶにより組織に効率的に送達され得るが、これは「１回限り」のプロセスであり；新しいウイルスが、注射部位の近傍に生成することはない。多くの適用のために、ｒＡＡＶの単回投与は、有意の臨床応答を得るために十分な比率の標的細胞を修飾することができる。他の適用のために、単回のｒＡＡＶ処置により修飾され得る細胞の比率は、所望の応答を得るために不十分であることがある。この限界は、組織が障害されて標的細胞の数が増大する傾向がある新生物の疾患に対するｒＡＡＶの治療的使用に特に関係する。
治療用ｒＡＡＶがｉｎ ｖｉｖｏで繰り返し複製され得るウイルスシステムが本明細書で提供される。このシステムの核心に、野生型ＡＡＶからのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子がＡｄのＥ３遺伝子を置き換えているＡｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋと呼ばれるアデノウイルス５の新規誘導体がある（図２）。ＡｄのＥ３は、通常はウイルスが宿主の免疫応答を逃れることを可能にするように機能するが、溶解性の感染のためにもＡＡＶのパッケージングのためにも必要ではない。ｒｅｐ−ｃａｐカセットは、Ｅ３遺伝子よりも約１ｋｂだけ大きいにすぎないので、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋの合計サイズは、十分、公表されているＡｄパッケージ容量内である。
Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋは、コンパニオンｒＡＡＶの複製およびパッケージングのために必要な全てのトランスエレメントを有する。したがって、Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋおよび治療用ｒＡＡＶによる標的組織の共感染は、ｒＡＡＶがｉｎ ｖｉｖｏで繁殖し、導入遺伝子送達の有効性を、可能性として、向上させることを可能にする。最終的に、二重感染の程度は、宿主免疫応答により限定されることもある。
（実施例２）
方法
プラスミドの構築；Ｈ１の双方向性の構築物を生成するために、ヒトのコドン最適化されたＣａｓ９遺伝子、およびＳＶ４０ターミネーターを、ｐｏｌＩＩ転写物が内因性で見出される（マイナス鎖）２３０ｂｐのＨ１プロモーターに融合した。Ｈ１プロモーターおよびｇＲＮＡスキャフォールドの間に、標的とする配列の挿入を可能にするようにＡｖｒＩＩ部位を操作した。次に、ＳＶ４０［ｒｅｖ］：：ｈｃａｓ９［ｒｅｖ］：：Ｈ１：：ｇＲＮＡスキャフォールド：：ｐｏｌＩＩＩターミネーター配列をＮｄｅＩ／ＸｂａＩ消化ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングした。この研究で使用される種々のｇＲＮＡを生成するために、重複するオリゴをアニールして、２ステップ増幅ＰｈｕｓｉｏｎフラッシュＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用するＰＣＲにより増幅し、その後、２×体積の２５％ＰＥＧおよび１．５Ｍ ＮａＣｌと混合したカルボキシレートで修飾されたＳｅｒａ−Ｍａｇ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物を、次にＨ２Ｏに再懸濁して、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。わずかな修飾を有する、ｇＲＮＡを発現している構築物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して生成した（Gibsonら（２００９年）Nature Methods ６巻：３４３〜３４５頁）。反応体積の合計は２０μｌから２μｌに減少した。
ヒト胚の腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中５％ＣＯ２／２０％Ｏ２の下に３７℃で維持した。
ゲノム修飾のためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよび配列分析：Ｓｕｒｖｅｙｏｒ分析のために、細胞をＱｕｉｃｋ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に再懸濁することにより、ゲノムＤＮＡを抽出し、６５℃で１５分間、次に９８℃で１０分間インキュベートした。抽出溶液を、ＤＮＡ ＣｌｅａｎおよびＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して清浄化して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量した。ＣＲＩＳＰＲの標的部位の周囲のゲノム領域を、１００ｎｇのゲノムＤＮＡからＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して増幅した。複数の独立のＰＣＲ反応物をプールして、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎカラムをメーカーのプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従って使用して精製した。１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６２．５ｍＭ ＫＣｌおよび１．８７５ｍＭ ＭｇＣｌ２中に４００ｎｇのＰＣＲ産物を含む８μｌの体積を変性して、ゆっくりと再アニールしてヘテロ二本鎖の形成を可能にした：９５℃で１０分間、９５℃から８５℃に−１．０℃／秒で下げ、８５℃で１秒間、８５℃から７５℃に−１．０℃／秒で下げ、７５℃で１秒間、７５℃から６５℃に−１．０℃／秒で下げ、６５℃で１秒間、６５℃から５５℃に−１．０℃／秒で下げ、５５℃で１秒間、５５℃から４５℃に−１．０℃／秒で下げ、４５℃で１秒間、４５℃から３５℃に−１．０℃／秒で下げ、３５℃で１秒間、３５℃から２５℃に−１．０℃／秒で下げ、次に４℃に保った。１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーおよび１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）を各反応混合物に加えて、４２℃で６０分間インキュベートし、その後、１μｌの停止溶液を反応混合物に加えた。１μｌの反応混合物を、ＤＮＡ１０００ ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで定量した。ゲル分析のために、２μｌの６×緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を残余の反応混合物に加えて、臭化エチジウムを含む３％アガロースゲルに搭載した。ゲルをＧｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）で可視化して、ＩｍａｇｅＪ ｖ．１．４６． ＮＨＥＪ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓを使用して定量し、二項式で誘導された方程式：
（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンドを差し引いた後の切断された断片の積分された領域に等しく、「ｃ」は、バックグラウンドを差し引いた後の切断されていないＰＣＲ産物の積分された領域に等しい（Guschinら（２０１０年）Methods in Molecular Biology６４９巻：２４７〜２５６頁））
を使用して計算した。
ソフトウェアは、社内で開発して（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、反復性の癌遺伝子の突然変異をアニールする独自のｇＲＮＡを設計した。これらのｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介されるこれらの突然変異型対立遺伝子の破壊を方向付けることができる。これらのｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と一緒に腫瘍内部に送達すると、これらの突然変異を有する腫瘍の増殖を阻害することができる。この様式で標的とされる特定の癌遺伝子は、以下の通りである。
まとめると、ＫＲＡＳおよびＰＩＫ３ＣＡにおけるこれらの特異的突然変異は、肺におけるがんの大部分およびＧＩ管全体にわたって見出される。ＩＤＨ１ Ｒ１３２の突然変異は、神経膠腫の約３０％で見出される。これらの脳腫瘍は、全て従来の形態の治療に対して特に難治性である。これらのｇＲＮＡの各々は、突然変異型対立遺伝子を主に標的とする。
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：野生型ＫＲＡＳ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１１）
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTTGTGGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１２）
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTGATGGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１３）
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTGGTGACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１４）
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：野性型ＰＩＫ３ＣＡ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１５）
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４５Ｋ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCTCTCTCTGAAATCACTAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１６）
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４９Ｎ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCAAGATTTTCTATGGAGTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１７）
ヒトのＨ１：：標的：ｇＲＮＡスキャフォールド
標的：ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCCAAATGAATGATGCACGTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC（配列番号１８）
参考文献
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示の主題が関係する分野の当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献のそれぞれが具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じくものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。いくつもの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書で言及されているが、かかる参考文献は、これらの文書のいずれも当技術分野における共通する一般的知見の一部を形成することの容認を構成するものではないことが理解されよう。
前述の主題は理解を明瞭にするために図表および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変化および修飾を行うことができることが当業者には理解されよう。
前述の主題は理解を明瞭にするために図表および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変化および修飾を行うことができることが当業者には理解されよう。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
それを必要とする対象においてがんを予防、阻害または処置するための方法であって、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子は、前記細胞において発現される１つまたは複数の癌遺伝子産物をコードする、プロモーター；および
ｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；ならびに
（ｂ）治療有効量の前記システムを前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
（項目２）
組換えアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を提供するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋが、前記ヌクレアーゼシステムと同時に提供され、または共投与される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記システムがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスが、アデノウイルス遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記パッケージングウイルスがアデノウイルス血清型５である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される、項目６から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記アデノウイルス遺伝子がＥ３である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記プロモーターがＨ１プロモーターである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、項目１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記標的配列が、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記標的配列が、少なくとも１つの突然変異を含む癌遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記標的配列が、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記標的配列が、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＫＲＡＳである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ＫＲＡＳが、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記標的配列が、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目２３から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＰＩＫ３ＣＡである、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記ＰＩＫ３ＣＡが、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記標的配列が、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＩＤＨ１である、項目２２に記載の方法。
（項目３０）
前記ＩＤＨ１が、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記ヌクレアーゼシステムが、全身投与を介して投与される、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記全身投与が、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ヌクレアーゼシステムが、腫瘍内または腫瘍周囲投与される、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記抗がん剤が、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記抗がん療法が、放射線療法、化学療法または手術である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記がんが固形腫瘍である、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記がんが、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４１）
前記がんが脳がんである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記対象が哺乳動物である、項目１に記載の方法。
（項目４３）
前記哺乳動物がヒトである、項目３３に記載の方法。
（項目４４）
前記対象において細胞増殖が阻害または低減される、項目１に記載の方法。
（項目４５）
前記対象において悪性腫瘍が阻害または低減される、項目１に記載の方法。
（項目４６）
前記対象において腫瘍壊死が増強または増加される、項目１に記載の方法。
（項目４７）
細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、前記方法は、
（ｉ）ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、前記細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを前記細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ
を含む、方法。
（項目４８）
組換えアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を提供するステップをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋが、前記ヌクレアーゼシステムと同時に提供され、または共投与される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記システムがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
前記パッケージングウイルスが、アデノウイルス遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５３）
前記アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記アデノウイルスパッケージングウイルスがアデノウイルス血清型５である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される、項目５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記アデノウイルス遺伝子がＥ３である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、項目４７に記載の方法。
（項目５８）
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、項目４７に記載の方法。
（項目５９）
前記プロモーターがＨ１プロモーターである、項目４７に記載の方法。
（項目６０）
前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、項目４７に記載の方法。
（項目６３）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、項目５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記標的配列が、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である、項目４７に記載の方法。
（項目６６）
前記標的配列が、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣからなる群から選択される、がんドライバー遺伝子である、項目４７に記載の方法。
（項目６７）
前記標的配列が、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である、項目６４から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記標的配列が、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である、項目１８に記載の方法。
（項目６９）
前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＫＲＡＳである、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記ＫＲＡＳが、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記標的配列が、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目６９から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＰＩＫ３ＣＡである、項目６６に記載の方法。
（項目７３）
前記ＰＩＫ３ＣＡが、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む、項目７０に記載の方法。
（項目７４）
前記標的配列が、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目７０から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＩＤＨ１である、項目６６に記載の方法。
（項目７６）
前記ＩＤＨ１が、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む、項目７３に記載の方法。
（項目７７）
前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目７８）
前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、項目４７に記載の方法。
（項目７９）
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、項目４７に記載の方法。
（項目８０）
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記真核生物細胞ががん性細胞である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記細胞において細胞増殖が阻害または低減される、項目４７に記載の方法。
（項目８３）
前記細胞においてアポトーシスが増強または増加される、項目４７に記載の方法。

Claims (83)

  1. それを必要とする対象においてがんを予防、阻害または処置するための方法であって、
    （ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子は、前記細胞において発現される１つまたは複数の癌遺伝子産物をコードする、プロモーター；および
    ｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
    を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；ならびに
    （ｂ）治療有効量の前記システムを前記対象に投与するステップ
    を含む、方法。
  2. 組換えアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を提供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋが、前記ヌクレアーゼシステムと同時に提供され、または共投与される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記システムがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項１に記載の方法。
  6. 前記アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスが、アデノウイルス遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記パッケージングウイルスがアデノウイルス血清型５である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記アデノウイルス遺伝子がＥ３である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項１に記載の方法。
  13. 前記プロモーターがＨ１プロモーターである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記Ｈ１プロモーターが、
    ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
    ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
    を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記標的配列が、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  20. 前記標的配列が、少なくとも１つの突然変異を含む癌遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  21. 前記標的配列が、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記標的配列が、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＫＲＡＳである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＫＲＡＳが、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記標的配列が、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＰＩＫ３ＣＡである、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記ＰＩＫ３ＣＡが、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記標的配列が、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＩＤＨ１である、請求項２２に記載の方法。
  30. 前記ＩＤＨ１が、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  32. 前記ヌクレアーゼシステムが、全身投与を介して投与される、請求項１に記載の方法。
  33. 前記全身投与が、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ヌクレアーゼシステムが、腫瘍内または腫瘍周囲投与される、請求項１に記載の方法。
  35. 前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される、請求項１に記載の方法。
  36. 前記抗がん剤が、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される、請求項１に記載の方法。
  38. 前記抗がん療法が、放射線療法、化学療法または手術である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記がんが固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
  40. 前記がんが、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  41. 前記がんが脳がんである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
  43. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
  44. 前記対象において細胞増殖が阻害または低減される、請求項１に記載の方法。
  45. 前記対象において悪性腫瘍が阻害または低減される、請求項１に記載の方法。
  46. 前記対象において腫瘍壊死が増強または増加される、請求項１に記載の方法。
  47. 細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、前記方法は、
    （ｉ）ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
    ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、前記細胞において作動可能な調節エレメント
    を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを前記細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ
    を含む、方法。
  48. 組換えアデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルス（Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋ）を提供するステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記Ａｄ−ｒＡＡＶｐａｃｋが、前記ヌクレアーゼシステムと同時に提供され、または共投与される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記システムがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項４７に記載の方法。
  52. 前記パッケージングウイルスが、アデノウイルス遺伝子中に少なくとも１つの欠失を含む、請求項４７に記載の方法。
  53. 前記アデノ随伴ウイルス−パッケージングアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記アデノウイルスパッケージングウイルスがアデノウイルス血清型５である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記アデノウイルス遺伝子がＥ３である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項４７に記載の方法。
  58. 前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項４７に記載の方法。
  59. 前記プロモーターがＨ１プロモーターである、請求項４７に記載の方法。
  60. 前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記Ｈ１プロモーターが、
    ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
    ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
    を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
  63. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、請求項５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記標的配列が、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子である、請求項４７に記載の方法。
  66. 前記標的配列が、ＥＰ３００、ＦＢＸＷ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＰＴＣＨ１、ＳＭＯ、ＳＰＯＰ、ＳＵＦＵ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＰ３００、ＦＡＭ１２３Ｂ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＮＦ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＳＯＸ９、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＰ３００、ＥＺＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＭＥＮ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＲ１、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＢＰ１、ＳＫＰ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＰＯＰ、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＲ、ＢＣＯＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＡＸＸ、ＤＩＣＥＲ１、ＧＡＴＡ３、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ４、ＬＭＯ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＦ６、ＰＲＤＭ１、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＡＢＬ１、ＢＣＬ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＳＰ８、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＹＬＤ、ＤＡＸＸ、ＦＵＢＰ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＰＭ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＲＢ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ７、ＴＰ５３、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＩＣ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＦ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＶＨＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＣ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＮＫＸ２１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＤＨ５、ＳＤＨ８、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＴＫ１１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＡＳ、ＣＲＬＦ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＳＯＣＳ１、ＶＨＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＢＰＡ、ＥＲＫ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＮＫＸ２１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＳＨＲ、ＷＡＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＮＡＳ、ＥＰ３００、ＭＥＤ１２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＨＥＫ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＮＢＳ１、ＰＡＬＢ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＣＱＬ４、ＳＴＡＧ２、ＴＰ５３、ＷＲＮ、ＸＰＡ、およびＸＰＣからなる群から選択される、がんドライバー遺伝子である、請求項４７に記載の方法。
  67. 前記標的配列が、Ｈｅｒ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＤＭ２、ＴＧＦ−β、ＲｈｏＣ、ＡＫＴ、ｃ−ｍｙｃ、β−カテニン、ＰＤＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ−１１０α、ＣＤＫ４、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、エストロゲン受容体遺伝子、プロゲステロン受容体遺伝子、ＥｒｂＢ１（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＥｒｂＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＰＬＫ３、ＫＩＲＲＥＬ、ＥｒｂＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ＴＧＦα、ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ２、ＰｙＶ ＭＴ抗原およびＳＶ４０ Ｔ抗原からなる群から選択される癌遺伝子である、請求項６４から６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記標的配列が、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＩＤＨ１から選択される癌遺伝子である、請求項１８に記載の方法。
  69. 前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＫＲＡＳである、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記ＫＲＡＳが、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｄから選択される突然変異を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記標的配列が、配列番号１１〜１４、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６９から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＰＩＫ３ＣＡである、請求項６６に記載の方法。
  73. 前記ＰＩＫ３ＣＡが、Ｅ３４５Ｋ、Ｄ５４９ＮまたはＨ１０４７Ｒから選択される突然変異を含む、請求項７０に記載の方法。
  74. 前記標的配列が、配列番号１５〜１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７０から７１のいずれか一項に記載の方法。
  75. 標的配列が癌遺伝子であり、前記癌遺伝子がＩＤＨ１である、請求項６６に記載の方法。
  76. 前記ＩＤＨ１が、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含む、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１〜１０に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  78. 前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、請求項４７に記載の方法。
  79. 前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、請求項４７に記載の方法。
  80. 前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記真核生物細胞ががん性細胞である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記細胞において細胞増殖が阻害または低減される、請求項４７に記載の方法。
  83. 前記細胞においてアポトーシスが増強または増加される、請求項４７に記載の方法。
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