KR102337860B1 - 슈와크만-보디안-다이아몬드 증후군 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 치료제 효율 증진용 조성물 - Google Patents

슈와크만-보디안-다이아몬드 증후군 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 치료제 효율 증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유방암 치료제의 효율을 증진시킬 수 있는 신규한 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 슈와크만-보디안-다이아몬드 증후군(Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome, SBDS) 유전자의 발현을 억제함으로써 항암제 내성 종양에 대한 아포토시스(apoptosis) 유도 효율을 증진시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유방암 치료제 효율 증진용 조성물의 제공으로, 기존의 항암제에 대한 민감도(sensitivity)가 떨어지거나 항암제의 효능(efficacy)이 잘 나타나지 않는 유방암을 치료함에 있어, 항암제의 치료 효율을 획기적으로 향상시킬 수 있게 되므로, 난치병인 유방암을 치료하는데 있어 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

슈와크만-보디안-다이아몬드 증후군 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 치료제 효율 증진용 조성물 {Composition for enhancing the sensitivity of anti-breast cancer drug, comprising the expression inhibitor of Shwachman-Bodian-Diamond syndrome gene as an active ingredient}
본 발명은 유방암 치료제 효율 증진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 슈와크만-보디안-다이아몬드 증후군(Shwachman-Bodian-Diamond syndrome) 유전자의 발현을 억제를 유효성분으로 포함하는 유방암 치료제의 효율 증진용 조성물, 상기 SBDS 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 물질을 포함하는 유방암 예후 진단용 조성물, 및 유방암 치료제 스크리닝용 조성물 등에 관한 것이다.
유방암이란 유방의 세포에서 발생하는 악성종양을 말한다. 유방암의 원인에 대해 명확하게 밝혀진 것은 없지만, 여성 호르몬, 가족력, 과거력, 출산력, 식생활 습관 등의 다양한 인자들이 거론되고 있다. 유방암의 5년 생존율은 100%인 0기 암에 비해 4기일 경우 20% 미만으로 알려져 있다. 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 최근 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있으며, 이러한 유방암의 발생빈도 및 유방암으로 인한 사망률의 증가는 현재의 서구화 실태로 보아 앞으로도 상당기간 지속될 것으로 예상된다.
유방암과 같은 고형 종양의 암 진행에는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 경직(stiffen)이 수반된다. 형태학에서 유전자 발현에 이르기까지, 암 진행에 따른 세포외기질의 경직도(rigidity) 증가와 그에 따른 기계적 신호는 암세포가 환경에 따라 다르게 반응하도록 한다. 이전의 연구에 따르면, 기질의 경직은 암세포의 증식 및 침윤과 관련된 유전자 발현에 특히 관여하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 경직된 기질에서 SPC25(spindle pole body component 25) 동족체(homolog) 유전자의 상향조절은 유사분열 중기(metaphase)에서 염색체 정렬의 접근성을 증가시킴으로써 H1299 폐 선암종(adenocarcinoma) 세포의 증식에 관여한다. 그러나 암세포가 산화 스트레스, 대사 스트레스 등과 같은 수많은 스트레스에 노출되어 있음에도, 세포의 스트레스 반응에 대한 세포외기질 경직의 영향은 거의 밝혀진 바가 없다.
아포토시스(apoptosis)는 주요한 세포예정사(programmed cell death)로서, 세포 스트레스에 대한 반응 중 하나이다. 고도로 조절되는 상기 과정은 DNA의 손상 또는 성장 인자(growth factor) 결핍과 같은 세포성 신호에 의해 활성화된다. 아포토시스는 2가지 주요 경로를 통해 개시되는데, 내인성 경로 및 외인성 경로로 지칭되는 미토콘드리아-매개 및 사멸수용체(death receptor)-매개 경로가 그것이다. 내인성 경로는 세포 내 신호에 의해 유도된다. 이 신호는 미토콘드리아 시토크롬 C를 세포기질(cytosol)로 방출시키고 카스파제 9/3 캐스케이드(cascade)를 촉발시킨다. 외인성 경로는 Fas 수용체를 포함하는 사멸수용체에 의해 받아들여지는 세포 외 신호로 시작되며, 이는 카스파제 8/3 캐스케이드를 통해 아포토시스를 유도한다. 암은 몇 가지 메커니즘에 의해 아포토시스를 회피하는 것으로 유명하기 때문에, 아포토시스의 조절은 암 치료에 결정적인 것으로 여겨져 왔다.
한편, 슈와크만-보디안-다이아몬드 증후군(Shwarchman-Bodian-Diamond syndrome) 단백질은 유전자의 변이에 의해 골수(bone marrow) 부전으로 특징지어지는 선천성 장애인 슈와크만-다이아몬드 증후군(Shwachman-Diamond syndrome; SDS)을 유발하는 단백질로 처음 확인되었다. SBDS 단백질의 정확한 기능은 알려져 있지 않지만, 리보솜의 생합성, 성숙 및 번역 활성화에 기여하는 것으로 시사되어 왔다. 또한, SBDS 단백질은 Fas 수용체 매개 경로에 의한 아포토시스로부터 세포를 보호하는 데 관여하는 것으로 드러났다. SBDS 단백질 결핍 HeLa 세포는 원형질막에서 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 수용체 패밀리의 일원인 Fas 수용체의 축적 및 아포토시스 가속을 모두 겪는 것으로 나타났다. SBDS 단백질은 이의 유전자 돌연변이가 백혈병 발병 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있으나, 유방암을 포함한 고형 종양과의 연관성에 대해서는 알려진 바 없다.
A. Rice et al., Matrix stiffness induces epithelial-mesenchymal transition and promotes chemoresistance in pancreatic cancer cells, Oncogenesis, 6 (2017) e352.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 슈와크만-보디안-다이아몬드 증후군(Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome, 이하 'SBDS'라 함) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 효율 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SBDS 유전자의 발현 억제제 및 유방암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SBDS 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 효율 증진용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SBDS 유전자의 발현 수준 또는 SBDS 단백질의 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 SBDS (Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 효율 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 SBDS 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 발현 억제제는 SBDS 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin, shRNA), 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA), 및 리보자임(ribozyme)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 작은 간섭 RNA는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 유방암 치료제는 항유사분열제(antimitotic reagent) 또는 유전자독성물질(genotoxic reagent)인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 항유사분열제 또는 유전자독성물질은 파클리탁셀(paclitaxel), 에리불린(eribulin), 및 시스플라틴(cisplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 조성물은 경직된 세포외기질(extracellular matrix)에서 유방암 세포에 대한 유방암 치료제의 접근성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 유방암은 악성 유방암인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 악성 유방암은 침윤성 유관암, 침윤성 소엽암, 유관 상피내암, 소엽 상피내암, 및 파제트(Paget)병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, SBDS 유전자의 발현 억제제 및 유방암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, SBDS 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 효율 증진용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은, SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 제제는 SBDS 유전자에 상보적인 염기서열을 포함하는 프라이머, 항-SBDS 단백질 항체 및 상기 항체의 항원결합부위로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유방암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, SBDS 유전자의 발현 수준 또는 SBDS 단백질의 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유방암 치료제의 효율 증진용 조성물을 이용하는 경우, 세포외기질의 경직 및 SBDS의 상향 조절에 의해 항암제 내성을 갖는 유방암을 치료함에 있어 항암제에 대한 민감도 및 접근성을 높일 수 있으므로, 유방암에 대한 기존 약물의 치료 효율을 극대화 할 수 있다. 또한, 유방암에서 SBDS가 상향 조절된다는 사실에 기반하여 SBDS 유전자의 발현 수준 또는 SBDS 단백질의 수준을 비교함으로써, 유방암 환자의 예후를 예측하거나 유방암 치료제를 스크리닝 하는데 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 내지 도 1e는 경직된 기질 환경에서 유방암 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스가 감소됨을 나타내는 도면이다: (도 1a) 실험 방법의 개략도; (도 1b) 연질 또는 경직된 기질 환경에서 MDA-MB-231 세포의 대표 이미지(좌, scale bar, 50μm) 및 투영 면적 비교 그래프(우, n=100); (도 1c) MDA-MB-231 세포의 live/dead 염색 이미지(scale bar, 100μm); (도 1d) PI 염색을 통한 PAG 기질 또는 플라스틱 디쉬 상 MDA-MB-231 세포의 세포주기 프로파일; (도 1e) 아넥신 V/PI 염색을 통한 PAG 기질 또는 플라스틱 디쉬 상의 총 사멸 세포 비율을 나타낸 도.
도 2a 내지 도 2d는 SBDS의 발현이 경직된 기질에서 상향 조절됨을 나타내는 도면이다: (도 2a) 연질 또는 경직된 기질에서 아포토시스 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준 비교 그래프; (도 2b) 유방암 환자에서 SBDS, CYC1, BCL2, BAX, 및 CFLAR의 위험비 비교 그래프; (도 2c) 정상 유방 세포 및 유방암 세포주에서 SBDS의 기질 경직-의존성 mRNA의 발현 수준 비교 그래프; (도 2d) TCGA-BRCA 데이터 세트의 SBDS 발현과 관련된 평균 수명 분석 곡선.
도 3a 내지 도 3d는 유방암 세포에서 SBDS 침묵에 의해 기질 경직-의존성 아포토시스가 촉진됨을 나타내는 도면이다: (도 3a) 야생형, 대조군 siRNA, 및 두 가지의 SBDS siRNA로 형질감염된 MDA-MB-231 세포에서 SBDS mRNA의 발현 수준을 비교한 그래프; (도 3b) SBDS 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석 이미지; (도 3c) 연질 기질에서 세포의 아넥신 V/PI 염색 분석 그래프; (도 3d) 경직된 기질에서 세포의 아넥신 V/PI 염색 분석 그래프.
도 4a 내지 도 4d는 SBDS의 결핍이 카스파제 8 매개 아포토시스 경로를 활성화 시킴을 나타내는 도면이다: (도 4a) 경직된 기질에서 야생형, 대조군 siRNA, 및 두 가지의 SBDS siRNA로 형질감염된 세포에 Z-IETD-FMK 또는 Z-LEHD-FMK를 처리한 후 아넥신 V/PI 염색을 통해 아포토시스를 비교한 그래프; (도 4b) 야생형, 대조군, 및 두 가지의 SBDS siRNA로 형질감염된 세포에서 절단된 카스파제 3, 절단된 카스파제 8, 및 절단된 카스파제 9의 웨스턴 블롯 분석 이미지; (도 4c) 야생형, 대조군 siRNA, 및 두 가지의 SBDS siRNA로 형질감염된 세포에서 파클리탁셀, 에리불린, 또는 시스플라틴 처리에 따른 세포 생존력 분석 그래프; (도 4d) 기질 경직도-의존성 아포토시스에 대한 SBDS-매개 조절의 메커니즘을 설명하는 개략도.
도 5는 연질 기질에서 Z-IETD-FMK 또는 Z-LEHD-FMK로 처리된 야생형 세포를 아넥신 V/PI 염색으로 분석한 도면이다.
본 발명자들은, 경직된 기질에서 SBDS 단백질의 발현이 항암제를 포함한 외부의 스트레스에 의해 유발되는 세포자살(apoptosis)에 대한 세포 보호 효과를 부여한다는 사실의 발견에 기초하여, 이를 응용하면 항암제 내성을 갖는 유방암을 치료함에 있어서 항암제의 효율을 증진시킬수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 경직된 기질 상에서 배양된 유방암 세포는 연질 기질상에서 배양된 유방암 세포보다 혈청 고갈에 의해 유도된 아포토시스가 더 적게 진행됨을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 기질이 경직됨에 따라 아포토시스 관련 유전자인 SBDS의 전사 수준이 유의하게 상향조절되고, 이러한 현상은 정상 세포가 아닌 암세포에서만 특이적으로 나타나는 현상임을 확인하였다. 또한, 유방암 환자에서 상기 SBDS 유전자의 위험비(hazard ratio)는 가장 높게 나타났다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 아포토시스와 관련된 유전자 중 하나인 SBDS 유전자의 넉다운(knockdown)은 경직된 기질에서 배양된 암세포에서 혈청 고갈에 의해 유도된 아포토시스를 유의하게 증가시킴을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 카스파제(caspase) 8 억제제에 의해 경직된 기질에서 SBDS 넉다운 세포의 아포토시스가 유의하게 억제되었는데, 이는 SBDS 넉다운에 의한 카스파제 8 경로의 활성화가 경직된 기질에서 암세포의 아포토시스에 결정적임을 확인한 것이다(실시예 5 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, SBDS의 하향 조절이 파클리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin) 및 에리불린(Eribulin)을 포함한 항암제에 의해 유도된 아포토시스를 효과적으로 증가시킨다는 것을 발견하였다(실시예 6 참조).
따라서, SBDS의 발현 억제는 경직된 세포외기질 환경에서 악성 유방암에 대한 더욱 효과적인 항암 치료를 가능하게 한다. 본 발명에 따른 유방암 치료제 효율 증진용 조성물은 SBDS(Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) 유전자의 발현을 억제함으로써, SBDS 단백질의 아포토시스에 대한 보호 효과를 감소시키킬 수 있다.
본 발명에 따른 SBDS 유전자는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 번역되는 것을 특징으로 하나, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2는 예시일 뿐, 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 SBDS 유전자는 바람직하게는 인간 SBDS 유전자를 의미하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 이루어지나, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 SBDS 단백질을 포함한다. 아미노산 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 아미노산 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "효율 증진"이란, 치료제 또는 항암제에 의해 종양 세포의 사멸을 유도하는 경우에 있어서 상기 치료제 또는 항암제에 의한 종양 세포의 사멸률이 상승되는 것 내지는 치료제 또는 항암제에 대한 종양세포의 민감도(sensitivity)가 증가하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발현 억제"란, 목적 유전자인 RNA의 발현 수준이 제거 또는 감소된 것을 의미하고, 바람직하게는 RNA의 절단(cleavage)을 통해 일어나는 RNA 간섭(RNA interference) 현상에 의한 것을 말하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 SBDS 유전자의 발현 억제제는 SBDS 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin, shRNA), 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA), 및 리보자임(ribozyme)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, SBDS 유전자의 발현을 억제시키기 위한 목적이라면 상기 열거한 억제제에 제한되는 것은 아니다.
상기 작은 간섭 RNA는 예를 들어, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 RNA 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 RNA일 수 있으나, 이는 SBDS mRNA의 염기서열을 바탕으로 선택될 수 있는 것으로 상기 열거한 RNA로 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 3 또는 4로 표시되는 작은 간섭 RNA는 그 활성을 저하시키지 않는 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 shRNA의 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는다.
상기 작은 간섭 RNA의 제조방법은 특별히 한정되지 않는다. 상기 작은 간섭 RNA는 직접 화학적으로 합성하거나, 벡터(vector)를 이용하여 합성하는 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 유방암 치료제는 항유사분열제(antimitotic reagent) 또는 유전자독성물질(genotoxic reagent)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항유사분열제 또는 유전자독성물질은 파클리탁셀(paclitaxel), 에리불린(eribulin), 및 시스플라틴(cisplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 유방암 세포의 사멸을 유도하는 것이라면 상기 열거한 제제에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 경직된 세포외기질에서 유방암 세포에 대한 유방암 치료제의 접근성을 증가시킬 수 있다. 여기서 "접근성"이란 상기 치료제가 유방암 세포에 작용하여 세포사멸을 유도할 수 있을 정도로 침투하는 것을 의미하며, 이는 후술할 실시예에서 증명한 바와 같이 SBDS 단백질의 암세포 보호 효과를 차단함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유방암은 악성 유방암일 수 있으며, 상기 악성 유방암은 침윤성 유관암, 침윤성 소엽암, 유관 상피내암, 소엽 상피내암, 및 파제트(Paget)병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 유방에 형성되는 고형 종양이라면 상기 열거한 유방암종에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 SBDS 유전자의 발현 억제제 및 유방암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 공지된 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 공지된 문헌에 개시되어 있는 것을 이용할 수 있다. 상기 조성물 또는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.
상기 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 비경구투여는 피부외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 여기서 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 개별적으로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 SBDS 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 효율 증진용 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다. 상기 제제로는 SBDS 유전자에 상보적인 염기서열을 포함하는 프라이머, 항-SBDS 단백질 항체 및 상기 항체의 항원결합부위로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 선택될 수 있으나, SBDS 단백질의 발현 수준을 측정하려는 목적이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 SBDS 유전자의 발현 수준 또는 SBDS 단백질의 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로, 유방암 환자에게 유방암 치료제 후보 물질을 투여하고, 투여 전·후의 SBDS 유전자 발현 수준 또는 SBDS 단백질의 수준을 비교하여 치료 효과를 나타내는 후보 물질을 스크리닝 할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 실험 재료 및 방법
1.1. 세포 배양(cell culture)
인간 유방암 MDA-MB-231 세포주는 한국세포주은행(대한민국)에서 구입하였다. MDA-MB-231 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; 영인프런티어, 대한민국), 100 units/ml 페니실린 및 100 units/ml 스트렙토마이신(Welgene, 대한민국)이 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(Gibco-BRL, 미국)에서 유지하였다. 세포는 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다.
1.2. PAG(polyacrylamide gel) 기질(matrix)의 제조
PAG 기질, 플라스틱 디쉬, 및 유리 커버슬립을 사용하여 연질 및 경직된 기질 환경을 모방하였다. 원하는 탄성(elasticity)을 갖는 PAG 기질을 제작하기 위해, 아크릴아마이드(acrylamide) 및 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide)를 적절한 비율로 혼합하였다. 상기 혼합물을 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란[(3-aminopropyl)triethoxysilane; Sigma-Aldrich, 독일]으로 활성화시킨 25 mm 커버슬립(coverslip)에 놓아두었다. 이어서, 기질을 0.5 mg/ml Sulfo-SANPAH [sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate; ProteoChem, 미국]로 코팅하고 50 μg/ml 콜라겐과 함께 4℃에서 밤새 배양 하였다. PAG 기질의 경직도는 원자력현미경(NX10, Park systems Corp., 대한민국)에 의해 측정되었다.
1.3. 세포 생존력(cell viability) 분석
세포 생존력은 Live/DeadTM Viability/Cytotoxicity 키트(Invitrogen, 미국)를 사용하여 평가하였다. 구체적으로는, 12 mm 커버슬립에 시딩된 MDA-MB-231 세포를 2 μM 칼세인(calcein) AM(acetoxymethyl) 및 4 μM EthD-1(ethidium homodimer-1)과 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 커버슬립을 슬라이드 글라스에 위에 얹혀 형광 현미경으로 관찰하였다. 모든 세포에서 적색 형광 세포의 백분율을 평가함으로써 세포 생존력을 분석하였다. 항암제가 처리된 세포의 생존력을 결정하기 위해, MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석을 수행하였다. 96-well 플레이트에 SBDS-넉다운 및 대조군 세포 모두를 각각 3개(triplicate)씩 플레이팅하였다. 흡광도는 마이크로 플레이트 리더(Bio-Tek Instrument, Inc., 미국)를 사용하여 570nm에서 측정하였다.
1.4. 아포토시스(apoptosis) 분석
세포의 DNA 함량을 측정하기 위해, 70% 에탄올을 이용하여 고정하고, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, 이하 'PI'라 함)로 염색하였다. BD accuriTM C6 플러스(BD Biosciences, 미국)를 이용하여 사멸된(apoptotic) 세포를 나타내는 서브-G1 집단을 평가하였다. 또 다른 아포토시스 분석을 위해, ApoScreen® Annexin V 아포토시스 키트-FITC(Southern Biotech, 미국)를 사용하였다. 세포를 아넥신 V-FITC와 PI로 염색한 후 유세포 분석기(flow cytometer)로 분석하였다. 사멸된 세포의 총 개수는 아넥신 V+/PI- (초기 아포토시스) 세포 및 아넥신 V+/PI+ (후기 아포토시스) 세포의 합으로 결정하였다.
1.5. RNA 분리 및 qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)
총 RNA는 RNAiso Plus 시약(TaKaRa, 일본)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 상보적 DNA(cDNA)는 PrimeScriptTM 역전사효소 및 리보뉴클레아제(ribonuclease) 억제제(TaKaRa)를 사용하여 합성하였다. qRT-PCR은 Quant Studio 3 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, 미국)을 활용하여 TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)로 수행하였다. 데이터는 2-ΔΔCt 방법에 따라 분석하였고, GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 Ct 값으로 정규화(normalize)하였다.
1.6. RNA-매개 넉다운(knockdown)
SBDS를 표적화하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) 및 대조군의 mock siRNA를 사용하였다. SBDS를 표적화하는 siRNA 서열은 하기와 같다:
siRNA #1, 5'-AAGCUUGGAUGAUGUUCCUGAUUUU-3' (서열번호 3);
siRNA #2, 5'-AACAUGCUGCCAUAACUUAGAU-3' (서열번호 4)
siRNA를 올리고펙타민 형질감염시약(Invitrogen)을 사용하여 형질감염시키고 24 시간 동안 배양하였다.
1.7. 통계적 분석
통계적 유의성은 GraphPad PRISM(Graphpad Software, 미국)을 사용하여 스튜던트 t-테스트(student's t-test)로 그룹 간의 차이를 분석하였다. 모든 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 얻은 후, 평균(average)±평균의 표준오차(standard error of the mean; SEM)로 나타내었다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 판단되었다(*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001).
실시예 2: 악성 유방암 세포의 기질 경직에 따른 아포토시스(apoptosis) 저항성 평가
세포외기질 경직도의 증가는 대부분의 고형암 조직에서 암의 진행을 동반한다. 이러한 높은 경직도를 갖는 암 미세환경은 다양한 세포 신호 전달을 자극하여 세포의 증식 및 침윤을 유도한다. 그리고, 공격적인 암의 전형적인 특징 중 하나는 영양소 고갈과 같은 외부의 스트레스에 의해 유발되는 아포토시스에 대한 내성을 얻는 것이다.
본 발명자들은 유방암 세포의 기질 경직(rigidity)-의존성 아포토시스를 평가하기 위해, 혈청 기아에 의해 유도된 세포 스트레스 하에서 MDA-MB-231 세포를 연질(0.5kDa 이하의 PAG) 또는 경직된 기질(플라스틱 또는 글래스)상에서 배양하였다(도 1a). 유방암 세포는 연질 기질보다 경직된 기질에서 더 많이 펼쳐지므로 세포의 투영 면적이 증가하였다(도 1b).
우선, 기질 경직에 따른 아포토시스의 변화를 알아보기 위해, 사멸한 세포의 비율을 live/dead 염색법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 도 1c에서 나타난 바와 같이, 48시간 후 연질 기질에서 죽은 세포의 비율은 경직된 기질에서 보다 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 그리고, 이러한 세포의 사멸이 아포토시스에 의해 유도되었는지를 알아보기 위해, 아포토시스 비율을 PI 염색 및 아넥신 V/PI 이중 염색 모두를 사용하여 평가하였다. 그 결과 도 1d에 나타난 바와 같이, 아포토시스에 의해 사멸된 세포임을 나타내는 서브-G1 상(phase) 세포의 백분율은 연질 기질보다 경직된 기질에서 약 16% 감소하였다. 아포토시스에 의해 사멸된 세포(Annexin V+/PI- 및 Annexin V+/PI+)의 비율은 또한 연질 기질에 비해 경직된 기질에서 대략 15% 감소한 것으로 나타났다(도 1e).
상기 결과들은 유방암 세포의 아포토시스가 경직된 기질에서 하향 조절됨을 나타내는 것이다. 또한, 이러한 결과들은 세포의 아포토시스 조절에 있어서 기질 강직도(stiffness)-의존적 메커니즘의 가능성을 시사하는 것이다.
실시예 3: 암 환경에서 SBDS 유전자의 전사 수준 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 경직된 기질 환경에서 배양된 세포는 아포토시스가 덜 일어나는 것을 관찰하였다. 이와 관련하여, 유방암에서 아포토시스 관련 유전자의 전사 수준 및 위험비를 조사함으로써 세포외기질 경직-의존성 아포토시스를 조절하는 유전자를 확인하고자 하였다. 아포토시스 경로는 미토콘드리아-매개의 내인성 경로 및 사멸 수용체(Fas 수용체, TNF 수용체)-매개의 외인성 경로를 통해 개시되는 것으로 알려져 있다. 경직-의존성 아포토시스를 조절하는 핵심 분자를 확인하기 위해, 기질의 경직도에 따른 아포토시스 관련 유전자 FAS, CFLAR, CASP8, SBDS, TP53, CYC1, BAX 및 BCL2 의 전사 수준을 조사하였다.
그 결과 도 2a에 나타난 바와 같이, 상기 유전자 중에서 5개의 유전자 CFLAR, SBDS, CYC1, BAX 및 BCL2의 발현이 경직된 기질에서 유의하게 상향 조절되었고, 음성 조절 인자로서 SBDS 및 BLC2에 대한 유전자의 발현 수준은 다른 것보다 상대적으로 더 높았다(도 2a).
이들 유전자의 위험비(hazard ratio)는 297명의 유방암(BRCA) 환자 데이터베이스(https://portal.gdc.cancer.gov/projects/TCGA-BRCA)에 기초하여 조사하였다. 그 결과 도 2b에 나타난 바와 같이, 유방암 환자 297명 (http://genomics.jefferson.edu/proggene/)을 기반으로 조사한 SBDS의 위험비는 상기 5개의 유전자 중에서 가장 높았다. SBDS의 mRNA 발현이 다른 유방 세포주에서도 증가하는지 여부를 확인하기 위해, 정상 유방 세포주 184A1, 및 두 가지의 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-361에서 SBDS의 기질 경직-의존성 발현을 조사하였다. 그 결과 도 2c에 나타난 바와 같이, 경직된 기질에서 SBDS의 전사 수준은 정상 세포주가 아닌 두 가지의 암 세포주에서만 독점적으로 상향 조절되었다. SBDS 발현의 증가는 또한 유방암 환자에 대한 좋지 못한 예후와 관련이 있는 것으로 나타났다(도 2d). 따라서, 상기와 같은 결과는 SBDS가 기질 경직-의존성 아포토시스를 조절할 가능성이 있음을 시사하는 것이다.
실시예 4: 유방암 세포에서의 SBDS 넉다운(knockdown) 효과 분석
경직된 기질 상의 유방암 세포에서 mRNA 발현이 상향 조절되는 SBDS의 기능을 연구하기 위해, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로 SBDS의 유전자를 넉다운하였다. 도 3a에 나타난 바와 같이, SBDS를 표적으로하는 두 가지 상이한 siRNA는 SBDS의 mRNA 수준을 약 70 내지 84%까지 성공적으로 침묵시켰다. 상기 siRNA에 의한 SBDS의 하향 조절은 웨스턴 블롯(western blot) 분석에 의해 단백질 수준에서도 확인되었다(도 3b).
SBDS가 기질의 경직에 따라 아포토시스를 조절하는지 여부를 결정하기 위해, 연질 및 경직된 기질 모두에서 아넥신 V/PI 이중 염색을 이용하여 아포토시스에 대한 SBDS siRNA의 효과를 평가하였다. 그 결과 연질 기질에서는, 야생형(wild-type), 대조군 siRNA로 형질감염(transfection)된 세포, 및 두 가지의 SBDS siRNA로 형질감염된 세포의 아포토시스 속도는 유의한 차이를 보이지 않았다(도 3c). 반대로, 경직된 기질에서는, 두 녹다운 세포의 아포토시스 속도는 각각 약 16% 및 13% 증가하였(도 3d). 이러한 결과는, 상기 실시예 3의 도 2c에 나타난 결과와 일맥상통하는 것으로서, SBDS의 mRNA 발현이 상대적으로 더 높은 경직된 기질에서만 SBDS의 하향 조절에 의해 독점적으로 아포토시스를 증가시킴을 나타내는 것이다. 따라서, 경직된 기질에서 SBDS의 상향 조절은 외부의 스트레스에 따른 아포토시스에 대한 세포 저항성에 중요한 역할을 담당하고 있음을 확인하였다.
SDS(Shwachman-Diamond syndrome) 환자에서 유전자의 변이가 발견된 SBDS는 리보솜 생합성을 매개하는 것으로 알려져 있다. 그러나 SBDS와 암의 연관성에 대한 추가 연구는 보고된 바가 없었다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 유방암 세포에서 SBDS의 mRNA 발현이 경직된 기질에서 상향 조절되었음을 확인하였다. 또한, siRNA를 이용한 SBDS의 넉다운은 연질 기질이 아닌 경직된 기질에서 아포토시스가 상향 조절되도록 하였다. 이에 더하여, SBDS는 유방암 환자의 생존과 음의 상관 관계가 있었다. 이는 SBDS가 유방암 세포에서 경직-의존성 아포토시스의 주요 조절인자임을 암시하는 것이다.
실시예 5: SBDS 의 경직(stiffness)-의존성 아포토시스 매개 경로 탐색
외인성 및 내인성 아포토시스 경로는 각각 카스파제 8 및 9를 통해 진행되고, 그 결과 카스파제 3의 활성화로 수렴되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 SBDS 억제에 의해 어떤 경로의 활성화가 유도되는지를 확인하기 위해, 카스파제 8 또는 9 억제제인 Z-IETD-FMK 또는 Z-LEHD-FMK를 사용하였다. 상기 실시예 4의 도 3c에서 나타난 결과와 유사하게, 두 가지의 SBDS 넉다운 세포의 아포토시스 속도는 대조군 세포와 비교하여 약 40 내지 43% 증가하였다. 또한, 도 4a에서 나타난 바와 같이 SBDS 넉다운 세포에 카스파제 9 억제제가 아닌 카스파제 8 억제제를 처리한 경우, 아포토시스가 대략 9 내지 13% 감소하는 결과를 보였다. 이러한 결과는 SBDS 넉다운에 의한 아포토시스의 증가가 카스파제 8 경로에 의해 매개될 가능성이 있음을 의미한다.
SBDS가 카스파제 8 경로를 억제하는지 여부를 추가로 확인하기 위해, 카스파제의 활성화된 형태의 수준을 조사하였다. 카스파제 8 및 9 경로의 공통적인 다운스트림(downstream) 조절제인 카스파제 3의 절단은 SBDS 넉다운에 의해 증가되었다. SBDS가 하향 조절된 세포에서 카스파제 8의 활성화는 카스파제 9보다 약간 더 높았으며(도 4b), 이는 경직된 기질에서 SBDS의 상향 조절이 카스파제 8-매개 경로를 억제함으로써 아포토시스에 대한 억제 역할을 할 수 있음을 시사하는 것이다.
또한, 본 발명자들은 연질 기질에서 카스파제 8 경로가 아포토시스에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위해, live/dead 염색법을 사용하여 연질 기질에서 카스파제 8 또는 9 억제제가 처리된 세포의 사멸률을 조사하였다. 상기 억제제 처리 48시간 후, 대조군 세포의 사멸 세포 비율은 대략 20% 증가한 반면, 카스파제 8 억제제가 처리된 세포의 사멸 세포 비율은 단지 10% 정도만 증가하였을 뿐이었다(도 5). 흥미롭게도, 카스파제 9 억제제가 처리된 세포의 사멸 세포 비율의 증가는 대조군과 유사하였는데(도 5), 이는 카스파제 8 경로가 기질 경직-의존성 아포토시스에 중요하다는 것을 암시하는 것이다.
아포토시스는 미토콘드리아의 내인성 경로 또는 사멸 수용체-매개 외인성 경로를 통해 진행된다. 내인성 경로 및 외인성 경로는 각각 카스파제 9 및 카스파제 8이 관여하고, 이들은 카스파제 3으로 수렴된다. SBDS 유전자를 침묵시키는 경우, Fas 수용체는 원형질막에 축적된다. 본 발명자들은 상기에서 카스파제 8 억제제가 SBDS 침묵에 의해 야기된 아포토시스를 효과적으로 차단함을 밝혀냈다. 또한, SBDS의 넉다운은 카스파제 8을 활성화시켰으며, 이는 SBDS가 카스파제 8 경로를 저해함으로써 아포토시스를 억제하고 있음을 나타내는 것이다.
실시예 6: SBDS의 항암제에 의한 아포토시스 억제 효과
항암제에 대한 내성은 암 치료의 주요 문제이다. 이전의 연구에 따르면 암의 진행으로 주변 기질이 경직됨에 따라 항암제에 대한 내성이 증가하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 마우스 유방 암종(mouse mammary carcinoma, MMC) 세포와 인간 유방 선암종(MDA-MB-231) 세포는 단단한 기질에서 유전독성시약(genotoxic reagent)인 독소루비신(doxorubicin)에 대한 화학저항(chemoresistance)이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 SBDS 넉다운을 통한 아포토시스의 상향 조절이 경직된 기질에 존재하는 암 세포에 대한 약물의 접근성(accessibility)을 용이하게 할 수 있다고 가정하였다. 이를 증명하기 위해, 본 발명자들은 경직된 기질에서 항유사분열제(antimitotic reagent) 또는 유전자독성 시약인 파클리탁셀(paclitaxel), 에리불린(eribulin), 및 시스플라틴(cisplatin)에 대한 SBDS-고갈 세포의 민감도(sensitivity)를 조사하였다.
그 결과 도 4c에서 나타난 바와 같이, SBDS 넉다운 세포는 저농도의 항암제의 존재 하에서 효과적으로 세포 사멸을 유도하였다. 이러한 결과는 경직된 세포외기질과 같은 공격적인 암 미세환경에 위치한 진행성 악성 암 세포에 대하여 항암 약물의 효과적인 처리를 위해 SBDS의 억제가 필요함을 나타내는 것이다.
종합하면, 본 발명자들은 혈청 기아와 같은 특정 스트레스에 반응한 MDA-MB-231 세포의 아포토시스가 경직된 기질에서 감소함을 발견하였다. 그리고 아포토시스 조절자(regulator)의 경직-의존적 mRNA 발현 및 유방암 환자의 위험비에 대한 스크리닝을 통해 SBDS 단백질이 유망한 조절자임이 확인되었다. 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)에 의한 SBDS 유전자 침묵은 연질 기질이 아닌 오직 경직된 기질에서만 아포토시스를 촉진시켰으며, 이는 SBDS 단백질이 경직에 의존적인 아포토시스를 조절함을 시사하는 것이다. 또한, 본 발명자들은 카스파제 8 매개 아포토시스 경로가 상기 과정에 관련되어 있음을 확인하였다. 나아가, SBDS 유전자의 넉다운(knockdown)은 유방암 세포를 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin) 및 에리불린(eribulin)을 포함한 항암제에 민감하게 만들었다. 따라서, 상기와 같은 결과들을 통해 경직된 기질에서 SBDS 단백질의 mRNA 발현이 상향 조절되고, 이로 인해 카스파제 8-매개 경로가 차단됨으로써 아포토시스의 감소가 초래되는 것임을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다. 나아가 상기 결과들을 종합하면, SBDS는 유방암 환자의 잠재적 예후 마커 및 치료 표적이 될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (15)

  1. SBDS(Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 효율 증진용 조성물로서,
    상기 발현 억제제는 SBDS 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin, shRNA), 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA), 및 리보자임(ribozyme)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
    상기 유방암 치료제는 항유사분열제(antimitotic reagent) 또는 유전자독성물질(genotoxic reagent)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 SBDS 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 작은 간섭 RNA는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항유사분열제 또는 유전자독성물질은 파클리탁셀(paclitaxel), 에리불린(eribulin), 및 시스플라틴(cisplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 경직된 세포외기질(extracellular matrix)에서 유방암 세포에 대한 유방암 치료제의 접근성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 유방암은 악성 유방암인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 악성 유방암은 침윤성 유관암, 침윤성 소엽암, 유관 상피내암, 소엽 상피내암, 및 파제트(Paget)병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. SBDS 유전자의 발현 억제제 및 유방암 치료제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 발현 억제제는 SBDS 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin, shRNA), 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA), 및 리보자임(ribozyme)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
    상기 유방암 치료제는 항유사분열제(antimitotic reagent) 또는 유전자독성물질(genotoxic reagent)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. SBDS 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 효율 증진용 조성물의 제조방법으로서,
    상기 발현 억제제는 SBDS 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin, shRNA), 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA), 및 리보자임(ribozyme)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
    상기 유방암 치료제는 항유사분열제(antimitotic reagent) 또는 유전자독성물질(genotoxic reagent)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  12. SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제제는 SBDS 유전자에 상보적인 염기서열을 포함하는 프라이머, 항-SBDS 단백질 항체 및 상기 항체의 항원결합부위로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유방암 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  14. SBDS 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝용 조성물.
  15. 분리된 유방암 세포에 유방암 치료제 후보 물질을 처리하고, SBDS 유전자의 발현 수준 또는 SBDS 단백질의 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 치료제 스크리닝 방법.
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