IT201800009431A1 - Sistema CRISPR-Cas per l’editing genomico. - Google Patents
Sistema CRISPR-Cas per l’editing genomico. Download PDFInfo
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Sistema CRISPR-Cas per l’editing genomico”
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un sistema atto ad essere impiegato per operare modifiche all’interno di un genoma cellulare. In particolare l’invenzione riguarda un sistema “Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR associated (Cas) (CRISPR-Cas)” mirato verso una sequenza genomica bersaglio in una cellula eucariotica nonché una particella virale comprendente detto sistema. L’invenzione riguarda altresì un procedimento che impiega il summenzionato sistema CRISPR-Cas o la summenzionata particella virale.
Negli ultimi decenni, grazie ai notevoli sviluppi della biologia molecolare e al sequenziamento di numerosi genomi, sono stati conseguiti importanti traguardi nel campo delle tecnologie di editing genomico, ovvero del complesso di metodiche che consentono di operare modifiche del genoma.
Attualmente il sistema Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) rappresenta uno dei metodi più avanzati per operare modifiche mirate nel genoma di cellule bersaglio. La tecnologia CRISPR è in grado di produrre tagli nel doppio filamento del DNA mediante l'impiego di una molecola di RNA, detto RNA guida (gRNA), che guida un enzima endonucleasi verso uno specifico sito bersaglio sul genoma. Tra gli enzimi endonucleasi più comunemente impiegati sono la Cas9 e la Cpf1 (Cas12a) che differiscono essenzialmente per la tipologia di rottura del doppio filamento prodotta nei siti bersaglio. L’enzima Cas9 genera la rottura del doppio filamento lasciando estremità piatte, solitamente riparate nella cellula con un meccanismo di legame non omologo, mentre l’enzima Cpf1 produce estremità coesive che facilitano la riparazione per omologia diretta nella cellula (Zetsche B. et al, “Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system”; (2015) Cell, 163(3):759-71). Più precisamente, la riparazione omologa è un meccanismo di riparazione del DNA basato sulla possibilità di scambiare materiale genetico tra frammenti di DNA che possiedono regioni aventi sequenze nucleotidiche identiche o molto simili. In genere, la riparazione non omologa viene scelta per ottenere knock-out (KO) genico, vale a dire soppressione dell’espressione di un determinato gene, poiché tale modalità di riparazione genera inserzioni e delezioni (indel) nel sito bersaglio, mentre la riparazione per omologia diretta è preferita per esperimenti di knock-in (KI) al fine di integrare la sequenza nucleotidica desiderata nel locus genomico specifico.
Recentemente il sistema CRISPR è entrato nel campo della terapia, con il primo studio CRISPR sull’uomo (NCT02793856) che ha avuto inizio nel 2016 presso l'Ospedale della Cina occidentale dell’Università di Sichuan a Chengdu (Cina) per il trattamento del carcinoma polmonare metastatico non a piccole cellule, patologia per la quale trattamenti quali la chemioterapia e la radioterapia non hanno prodotto effetti significativi. Nel trattamento della leucemia linfatica acuta recidivante e refrattaria, il sistema CRISPR-Cas9 è stato inoltre impiegato nell’ingegnerizzazione genetica delle cellule T ex vivo allo scopo di produrre recettori chimerici di antigene (CAR) che colpiscono specifiche molecole di superficie sulle cellule tumorali. Attualmente sono in corso due ulteriori studi clinici relativi al sistema CRISPR, entrambi con inizio in giugno 2017. Uno dei predetti studi (NCT03166878) è in fase II e si basa sull’impiego di cellule CAR-T contro l’antigene CD19 in pazienti con leucemia o linfoma di tipo B recidivanti o refrattari. Il secondo studio (NCT02706392), ancora in fase I, utilizza cellule CAR-T dirette contro ROR1 (Recettore ad attività Tirosin-Chinasica orfano di ligando) in pazienti con ROR1 leucemia linfatica cronica, linfoma mantellare (MCL), leucemia linfatica acuta, carcinoma polmonare non a piccole cellule in fase IV (NSCLC) o carcinoma mammario triplo negativo metastatico (TNBC).
Tra le applicazioni terapeutiche della tecnologia CRISPR-Cas ricopre dunque un ruolo primario il campo delle patologie neoplastiche.
Tipicamente, durante la sua evoluzione, il tumore acquisisce nuove e particolari mutazioni a livello genetico che diventano marcatori specifici della patologia, consentendo in tal modo di identificare un particolare tipo di tumore e il suo progresso molecolare. Pertanto, attraverso una terapia personalizzata, è possibile agire su una determinata mutazione genica associata specificamente ad un particolare tumore. Tra i geni bersaglio della trasformazione neoplastica, uno dei più colpiti è il gene TP53 che codifica per una proteina, chiamata p53, che svolge funzioni diverse nella cellula umana. La funzione canonica di TP53 come gene oncosoppressore è nota da molti anni, tuttavia la sovra-espressione del gene TP53 mutante, attraverso il meccanismo di guadagno di funzione, comporta l’inversione del suo ruolo in oncogene (funzione non canonica).
Le mutazioni di TP53 nei tumori ematologici e in quelli solidi sono state identificate a diversi livelli a seconda del tipo e dei sottotipi di cancro. In genere, le mutazioni in TP53 si riscontrano in caso di recidiva che porta ad un decorso aggressivo e spesso refrattario della malattia, con una scarsa risposta terapeutica da parte del paziente. Da un punto di vista terapeutico il gene TP53 è quindi considerato un importante bersaglio cui indirizzare il trattamento, specialmente quando altre tipologie di trattamenti farmacologici non risultano efficaci.
La leucemia linfatica cronica di tipo B (LLC-B) è il modello più comune di leucemia negli adulti. Alterazioni nella via di azione della proteina p53 sono frequentemente descritte nella LLC-B e risultano principalmente associate alla delezione del cromosoma 17p13 o alle mutazioni del gene TP53. Mutazioni nel gene TP53 sono riscontrate in circa il 10% dei pazienti con LLC-B e altre neoplasie ematologiche e non-ematologiche, e in questi pazienti la sopravvivenza media a 5 anni è stimata intorno al 20% rispetto ad una sopravvivenza del 70% registrata negli altri pazienti affetti da LLC-B.
Negli ultimi anni gli studi di editing genomico si sono concentrati in particolare su esperimenti di mutagenesi disegnati al fine di conseguire la sostituzione di sequenze geniche mutate con le rispettive sequenze di DNA corrette. Le cellule riparano i danni del doppio filamento di DNA più facilmente utilizzando la ricombinazione non omologa rispetto alla riparazione omologa poiché il suddetto meccanismo è attivo principalmente durante la fase S e G2 del ciclo cellulare mentre la riparazione non omologa funziona in qualsiasi fase del ciclo cellulare. La prevalenza nelle cellule dei meccanismi di riparazione del DNA non omologa comporta pertanto elevate difficoltà nelle applicazioni di mutagenesi. Una strategia diversa è stata seguita finalizzando la metodica di editing genomico non alla correzione di una mutazione in una sequenza di DNA bensì all'integrazione di una specifica sequenza nucleotidica estranea alla cellula nel sito genomico bersaglio. Un approccio di questo tipo è illustrato nell’articolo di Chen ZH e colleghi, che descrive l’impiego di un sistema CRISPR-Cas9 per operare l’integrazione di una sequenza codificante un enzima virale nel genoma di una cellula tumorale (Chen ZH, et al, “Targeting genomic rearrangements in tumor cells through Cas9-mediated insertion of a suicide gene”, (2017) Nat Biotechnol. 35:543-550).
Nonostante i notevoli sviluppi raggiunti dalle metodiche di modificazione del genoma, e in particolare dalla tecnologia CRISPR-Cas, la loro applicazione soffre di importanti limitazioni ascrivibili principalmente al mancato raggiungimento di un’adeguata precisione dei loro meccanismi di azione. Più particolarmente, una delle problematiche maggiori associate al sistema CRISPR-Cas è la possibilità che la molecola di RNA guida impiegata in questa metodica possa riconoscere sul genoma, oltre alla sequenza che deve essere modificata, anche sequenze ad essa molto simili, con conseguente alterazione di un locus genomico diverso da quello bersaglio. Tale evenienza, detta di off-target, potrebbe portare, ad esempio, ad alterazioni indesiderate in un gene oncosoppressore, scatenando così la riproduzione incontrollata delle cellule bersaglio e la loro eventuale trasformazione neoplastica.
In aggiunta all’inconveniente della possibile attività off-target, la tecnica CRISPR-Cas pone anche la problematica di indirizzare il trasferimento dei suoi componenti esclusivamente all’interno della popolazione cellulare su cui operare la modifica genetica, ad esempio una particolare popolazione di cellule malate, onde evitare di agire sulle cellule sane che non necessitano dell’intervento di manipolazione genetica. A tale scopo, sono stati valutati diversi metodi per consentire il corretto rilascio del sistema CRISPR-Cas nelle cellule bersaglio, ivi inclusi sistemi chimici (lipofectamina, polietilenimmina) o l'elettroporazione. Tuttavia, questi metodi funzionano in modo efficiente principalmente negli studi in vitro o ex vivo, mentre negli esperimenti in vivo gli unici approcci attualmente disponibili per il rilascio del CRISPR-Cas sono sistemi di tipo virale che, nei formati in cui sono correntemente impiegati, risultano ancora associati ad una ridotta sicurezza.
Pertanto, esiste la necessità di mettere a disposizione sistemi di editing genomico, in particolare sistemi CRISPR-Cas, dotati di un grado elevato di accuratezza e precisione, rendendo in tal modo tali sistemi idonei ad essere impiegati in ambito clinico e terapeutico. Più particolarmente, si pone la necessità di mettere a disposizione sistemi CRISPR-Cas in grado di operare selettivamente sulle cellule bersaglio, senza influenzare in alcun modo le cellule normali, e allo stesso tempo capaci di mirare specificamente al sito genomico da modificare, abolendo in tal modo o riducendo significativamente l’occorrenza di pericolosi eventi di off-target.
Questa e altre necessità sono soddisfatte dal sistema CRISPR-Cas dell’invenzione come definito nell’annessa rivendicazione 1.
L’invenzione riguarda altresì una particella virale ed una cellula eucariotica isolata che comprendono il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione, un procedimento che impiega detto sistema ed il suo uso terapeutico.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione sono identificati nelle annesse rivendicazioni e illustrati in dettaglio nella descrizione che segue.
Le annesse rivendicazioni indipendenti e dipendenti formano parte integrante della presente descrizione.
Come risulterà chiaramente dalla descrizione dettagliata che segue, la presente invenzione mette a disposizione un sistema CRISPR-Cas non presente in natura o ingegnerizzato, mirato ad almeno una sequenza genomica bersaglio in una cellula bersaglio, che è definito da una combinazione di caratteristiche atte a conferire a detto sistema alta precisione e accuratezza. Il sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione è basato sull’impiego di un vettore virale che consente l’espressione intracellulare dei diversi componenti del suddetto sistema. In generale, un vettore di tipo virale comprende sequenze di DNA o RNA derivate da un virus, atte a consentire l’impacchettamento del virus in una particella virale nonché la sua trasduzione all’interno di una cellula ospite. Preferibilmente, il vettore di espressione secondo la presente invenzione è un vettore lentivirale, retrovirale, adenovirale o virale adeno-associato, più preferibilmente un vettore lentivirale.
Come menzionato in precedenza ed illustrato nel pannello A della Figura 1, il vettore di espressione virale secondo la presente invenzione comprende le sequenze nucleotidiche che codificano rispettivamente per i diversi componenti tipicamente necessari al funzionamento di un sistema CRISPR-Cas, più specificamente un enzima endonucleasi e una o più molecole di RNA guida atte a legare detto enzima ed indirizzarlo verso le sequenze nucleotidiche bersaglio grazie alla capacità di ibridarsi alle suddette. Di conseguenza, l’enzima endonucleasi trasportato dagli RNA guida introduce un taglio sul doppio filamento in corrispondenza delle sequenze bersaglio.
Secondo la presente invenzione, l’enzima endonucleasi è caratterizzato dalla capacità di generare estremità coesive a seguito del taglio del doppio filamento di DNA. La presenza di estremità coesive in un sito di taglio consente vantaggiosamente di poter orientare l’inserimento dei frammenti di DNA, mantenendo in tal modo la corretta cornice di lettura delle sequenze codificanti.
Tra gli enzimi endonucleasi idonei ad essere impiegati nel sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione si citano ad esempio, ma non esclusivamente, l’enzima Cpf1 e suoi mutanti capaci di riconoscere sequenze nucleotidiche “Protospacer Adjacent Motif” (PAM) diverse. E’ ampiamente noto che le sequenze PAM sono brevi sequenze che comprendono da due a sei paia di basi necessarie per il riconoscimento della sequenza bersaglio da parte dei sistemi CRISPR-Cas (Shah S. et al, “Protospacer recognition motifs Mixed identities and functional diversity (2013) RNA Biology 10(5): 891–899).
In una forma di realizzazione preferita, l’endonucleasi del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione è l’enzima Cpf1. Preferibilmente, l’enzima endonucleasi comprende uno o più segnali di localizzazione nucleare idonei a facilitare il trasferimento del complesso CRISP-Cas all’interno del nucleo della cellula bersaglio.
Il vettore di espressione virale secondo l’invenzione comprende inoltre due sequenze nucleotidiche codificanti rispettivamente per un primo ed un secondo RNA guida (gRNA). Il primo gRNA comprende una prima sequenza nucleotidica scaffold atta a legare l’enzima nucleasi ed una prima sequenza nucleotidica guida atta ad ibridarsi ad una prima sequenza nucleotidica bersaglio. Il secondo gRNA comprende una seconda sequenza nucleotidica scaffold atta a legare l’enzima endonucleasi ed una seconda sequenza nucleotidica guida atta ad ibridarsi ad una seconda sequenza nucleotidica bersaglio.
Di conseguenza, quando espressi, il primo ed il secondo gRNA si complessano con l’enzima endonucleasi formando in tal modo un primo ed un secondo complesso CRISPR-Cas. La prima e la seconda sequenza guida indirizzano il legame sequenzaspecifico del primo e secondo complesso CRISPR-Cas verso le rispettive prima e seconda sequenza bersaglio. Come illustrato più in dettaglio nella parte che segue, secondo la presente invenzione, una prima ed una seconda sequenza bersaglio sono situate sul vettore virale di espressione.
Secondo una forma di realizzazione, le sequenze scaffold rispettivamente del primo e secondo gRNA possono essere corrispondenti.
Nell’ambito della presente invenzione, le sequenze nucleotidiche del vettore virale codificanti per l’enzima endonucleasi e per il primo e secondo gRNA sono idonee all’espressione in una cellula ospite in quanto operativamente collegate ad una o più sequenze regolatrici. Sequenze regolatrici idonee ad essere impiegate per l’espressione genica sono note e descritte nello stato della tecnica, per cui la loro scelta e il loro impiego rientrano nelle capacità del tecnico medio del settore. A titolo di esempio non limitativo si citano i promotori, ad esempio i promotori inducibili, nonché elementi potenziatori, siti interni di entrata del ribosoma e/o segnali di terminazione della trascrizione. Ad esempio, le sequenze nucleotidiche codificanti per il primo e per il secondo gRNA possono essere collegate operativamente ad un promotore che viene riconosciuto dalla RNA polimerasi eucariotica III, preferibilmente un promotore U6.
Secondo la presente invenzione, il vettore di espressione virale comprende inoltre una sequenza nucleotidica codificante per una proteina atta a promuovere il processo di morte cellulare. Vantaggiosamente, detta sequenza nucleotidica non è operativamente collegata ad alcuna sequenza regolatrice situata sul vettore in modo tale che la sua espressione sia inibita stabilmente e venga consentita unicamente quando la sequenza nucleotidica è correttamente integrata in un locus genomico bersaglio, corredato degli idonei elementi regolatori.
Esempi di proteine atte a promuovere la morte cellulare includono in maniera non limitativa la timidina chinasi, le telomerasi, le citosine deaminasi, la caspasi, le endonucleasi e gli anticorpi intracellulari specifici induttori di morte cellulare.
Secondo una forma di realizzazione più preferita, la proteina atta a promuovere la morte cellulare è una timidina chinasi (TK).
Nel vettore virale di espressione secondo l’invenzione, sono presenti anche le sequenze nucleotidiche bersaglio del primo e secondo gRNA, situate rispettivamente a valle dell’estremità 3’ (prima sequenza bersaglio) e a monte dell’estremità 5’ (seconda sequenza bersaglio) della sequenza nucleotidica codificante la proteina atta a promuovere la morte cellulare. Al fine di consentire il loro riconoscimento da parte del sistema CRISPR-Cas con conseguente taglio da parte dell’enzima endonucleasi, entrambe le sequenze nucleotidiche bersaglio sono situate a valle dell’estremità 3’ di una sequenza PAM.
La configurazione degli elementi del vettore di espressione virale, come precedentemente illustrato, permette pertanto l’escissione dal vettore della sequenza codificante per la proteina atta a promuovere la morte cellulare mediante un taglio enzimatico sequenza-specifico a monte e a valle di detta sequenza, rendendo in tal modo la sequenza disponibile per l’inserimento in un locus genomico bersaglio in una cellula bersaglio. Si nota che questa caratteristica introduce un ulteriore elemento di controllo nel sistema CRISPR-Cas dell’invenzione quando trasdotto all’interno di una cellula bersaglio in quanto la conformazione aperta del vettore virale, a seguito del taglio endonucleasico, facilita la sua degradazione e rimozione dalla cellula ospite, in particolare dal nucleo cellulare. Viene in tal modo impedito che l’eventuale permanenza del vettore nella cellula porti ad una dannosa sovra-espressione dell’enzima endonucleasi codificato dallo stesso, con conseguenti tagli off-target sul DNA.
Il sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione è inoltre caratterizzato dal fatto che la prima sequenza nucleotidica bersaglio situata sul vettore virale di espressione corrisponde all’almeno una sequenza genomica bersaglio della cellula eucariotica a cui il sistema CRISPR-Cas è mirato. Di conseguenza, un medesimo gRNA, più specificamente il primo gRNA, risulta capace di indirizzare il taglio dell’enzima endonucleasi verso almeno due siti bersaglio distinti, ma contenenti la stessa sequenza bersaglio, situato l’uno sul vettore virale di espressione e l’altro sul genoma cellulare. Pertanto, il frammento di DNA contenente la sequenza codificante la proteina promotrice della morte cellulare, quando escisso dal vettore secondo la modalità descritta in precedenza, può inserirsi mantenendo la cornice di lettura a livello del sito di taglio prodotto dall’enzima endonucleasi in corrispondenza dell’almeno una sequenza genomica bersaglio a cui il sistema CRISPR-Cas è mirato.
Secondo una forma di realizzazione, la prima sequenza nucleotidica bersaglio e la seconda sequenza nucleotidica bersaglio sono scelte in modo tale per cui le porzioni protrudenti a singolo filamento delle rispettive estremità coesive generate a seguito di taglio ad opera dell’enzima endonucleasi siano sequenze complementari. Questa modalità realizzativa risulta particolarmente idonea alle applicazioni in cui l’almeno una sequenza genomica bersaglio, a cui il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione è mirato, contiene una mutazione puntiforme, , ad esempio c.548C>G o p.Ser183*, che genera un codone di stop. L’inserimento della sequenza che codifica la proteina promotrice della morte cellulare avviene in tal caso in corrispondenza della sequenza genomica bersaglio a monte del codone di stop, il che assicura la corretta espressione della suddetta proteina.
Secondo un’altra forma di realizzazione, il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione è mirato ad una prima e ad una seconda sequenza genomica bersaglio. In questa forma di realizzazione, la prima sequenza genomica bersaglio corrisponde alla prima sequenza nucleotidica bersaglio e la seconda sequenza genomica bersaglio corrisponde alla seconda sequenza nucleotidica bersaglio. Ciò favorisce ulteriormente il corretto inserimento nel genoma bersaglio del frammento di DNA contenente la sequenza codificante la proteina promotrice della morte cellulare poiché il taglio mediato da ciascuno dei due gRNA avviene una volta sul vettore e una volta sul genoma.
In una forma di realizzazione, il vettore virale di espressione consiste della sequenza nucleotidica SEQ ID NO.1.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il vettore virale di espressione del sistema dell’invenzione comprende una sequenza nucleotidica codificante per un enzima integrasi mutato, in cui la mutazione provoca l’inibizione dell’attività enzimatica. L’introduzione di tale mutazione ha lo scopo di incrementare le caratteristiche di sicurezza del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione in quanto impedisce l’integrazione del vettore virale nel genoma della cellula ospite nonché l’espressione intracellulare stabile dei componenti del sistema. Ciò è di particolare importanza per salvaguardare le cellule normali non bersaglio se erroneamente trasdotte.
In una forma di realizzazione più preferita, l’enzima integrasi codificato dal vettore di espressione dell’invenzione porta la mutazione puntiforme p.Asp64Val.
L’almeno una sequenza genomica bersaglio della cellula bersaglio a cui il sistema è mirato può comprendere una o più mutazioni geniche. Tra le mutazioni geniche che possono essere presenti nell’almeno una sequenza genomica bersaglio, si citano a titolo esemplificativo ma non limitativo mutazioni del gene TP53, mutazioni dei geni KRAS/BRAF, mutazioni del gene NRAS, mutazioni del gene EGFR nella regione che codifica per il dominio extracellulare del recettore, , amplificazione del gene HER2, traslocazione EML4/ALK e mutazioni nei geni MET, PK3CA e ERB2, e qualsiasi loro combinazione.
Preferibilmente, la mutazione è una mutazione del gene TP53, più preferibilmente una mutazione nonsenso c.548C>G o p.Ser183*, che provoca un arresto precoce della traduzione generando una proteina tronca, o una mutazione missenso c.818G>A o p.Arg273His.
La cellula bersaglio a cui è mirato il sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione può essere una cellula eucariotica, preferibilmente una cellula di mammifero, più preferibilmente una cellula umana, ancor più preferibilmente una cellula umana tumorale.
Allo scopo di trasferire in una cellula bersaglio il sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione, possono essere impiegati, ad esempio, appropriati sistemi virali.
Pertanto, nell’ambito della presente invenzione rientra anche una particella virale che comprende un sistema CRISPR-Cas come sopra definito. Tale particella virale può essere, ad esempio, un lentivirus, un retrovirus, un adenovirus o un virus adeno-associato. Preferibilmente, la particella virale è un lentivirus.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la particella virale dell’invenzione comprende una proteina capsidica chimerica avente un dominio atto a legarsi ad almeno un marcatore espresso sulla superficie della cellula bersaglio del sistema CRISPR-Cas. L’interazione tra il dominio della proteina chimerica così come sopra definita ed il marcatore cellulare di superficie assicura che la particella virale si indirizzi selettivamente verso la cellula bersaglio, evitando in tal modo la possibilità di colpire e arrecare danni a cellule sane non bersaglio.
Preferibilmente, il dominio della proteina capsidica chimerica è un anticorpo, un fattore di crescita o un ligando.
Tra i marcatori cellulari di superficie si citano ad esempio, anche se non esclusivamente, le proteine CD5, CD19, CD20, CD23, CD46 e BCR, e qualsiasi loro combinazione.
Forma oggetto della presente invenzione anche un procedimento in vitro per promuovere la morte cellulare in una cellula bersaglio, come definito nell’annessa rivendicazione 15. Il procedimento dell’invenzione prevede di trasdurre la cellula bersaglio con un sistema CRISPR-Cas e/o almeno una particella virale come definiti in precedenza, e porre la cellula trasdotta in condizioni di coltura idonee ad indurre l’espressione dell’enzima endonucleasi e del primo e secondo gRNA. Tipicamente le condizioni ed i tempi di coltura idonei dipendono dalla cellula bersaglio e possono riguardare, ad esempio, la composizione del mezzo di coltura, il pH, l’umidità relativa, la componente gassosa di O2 e CO2, nonché la temperatura. La selezione delle condizioni e dei tempi di coltura più idonei ad essere impiegati nel procedimento dell’invenzione rientra ampiamente nelle conoscenze e capacità del tecnico medio del settore.
In conseguenza dell’espressione del sistema CRISPR-Cas, nella cellula bersaglio vengono a formarsi un primo complesso macromolecolare che comprende l’enzima endonucleasi associato al primo gRNA e un secondo complesso macromolecolare che comprende l’enzima endonucleasi associato al secondo gRNA. Come descritto in precedenza ed illustrato nella Figura 1, tali complessi macromolecolari agiscono operando l’integrazione nell’almeno una sequenza genomica bersaglio dell’inserto di DNA codificante per la proteina promotrice della morte cellulare mediante i tagli sequenza-specifici sul vettore virale e sul genoma cellulare a livello della prima e della seconda sequenza bersaglio. Più particolarmente, il taglio a livello della prima sequenza bersaglio è operato dal primo complesso macromolecolare mediante ibridazione del primo gRNA con detta prima sequenza, mentre il taglio a livello della seconda sequenza bersaglio è operato dal secondo complesso macromolecolare mediante ibridazione del secondo gRNA con detta seconda sequenza.
Secondo il procedimento dell’invenzione, la sequenza codificante per la proteina promotrice della morte cellulare viene espressa a condizione di essere correttamente inserita nel locus genomico bersaglio mantenendo la corretta cornice di lettura e sotto il controllo di idonei elementi regolatori. Ciò assicura che la successione di processi culminanti con la morte della cellula venga innescata unicamente nella cellula bersaglio.
Preferibilmente, l’integrazione dell’inserto di DNA nella sequenza genomica è mediata dai meccanismi cellulari di riparazione del DNA, ad esempio tramite ligazione dell’estremità dei filamenti di DNA mediante tratti di micro-omologia.
Secondo la forma di realizzazione illustrata nella Figura 1, la proteina atta a promuovere la morte cellulare è l’enzima timidina chinasi (TK). In questa forma di realizzazione, il procedimento secondo l’invenzione preferibilmente prevede in aggiunta il passaggio di mettere la cellula bersaglio a contatto con un substrato della timidina chinasi, più preferibilmente con il substrato ganciclovir. La fosforilazione di questo composto da parte della timidina chinasi e la successiva incorporazione nella molecola di DNA comportano l’inibizione della sintesi della doppia elica con conseguente morte cellulare.
Secondo una forma di realizzazione più preferita, la cellula bersaglio del procedimento dell’invenzione è una cellula umana malata, preferibilmente una cellula umana tumorale.
Nell’ambito della presente invenzione rientra altresì una cellula bersaglio isolata che comprende un sistema CRISPR-Cas o almeno una particella virale come definiti in precedenza.
Preferibilmente, la cellula bersaglio isolata è una cellula eucariotica, preferibilmente una cellula di mammifero, più preferibilmente una cellula umana, ancor più preferibilmente una cellula umana tumorale.
Come descritto in precedenza, la capacità di operare in maniera mirata e selettiva sul genoma di una cellula bersaglio innescandovi il processo di morte cellulare rende il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione particolarmente idoneo all’impiego per le applicazioni in campo clinico-terapeutico, in particolare per le applicazioni che mirano all’eliminazione selettiva di cellule malate.
Pertanto, forma altresì oggetto della presente invenzione il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione o la particella virale dell’invenzione per l’impiego come medicamento. Preferibilmente, ma non a titolo limitativo, l’impiego terapeutico è rivolto al trattamento di una patologia tumorale, più preferibilmente di una patologia scelta tra leucemia linfatica cronica di tipo B, linfoma non Hodgkin, sindromi mielodisplastiche, neoplasie mieloproliferative, mieloma multiplo, leucemia mieloide acuta, leucemia linfoblastica acuta, carcinoma polmonare a cellule squamose, adenocarcinoma polmonare, tumore dell’ovaio, tumore del colon-retto, tumore dell’esofago, tumori della testa e del collo, tumore della laringe, tumore della cute, tumore del pancreas, tumore dello stomaco, tumore della prostata, tumore del fegato, tumore cerebrale, tumore della vescica, tumore della mammella, tumore dell’utero, sarcomi dei tessuti molli, tumore osseo, tumori endocrini e tumore della cervice uterina.
La parte sperimentale che segue è fornita a scopo puramente illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni. Nella parte sperimentale viene fatto riferimento ai disegni annessi, in cui:
la Figura 1 è una rappresentazione schematica del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione. (A) Rappresentazione della struttura del vettore virale di espressione secondo l’invenzione. (B–E) Meccanismo d’azione del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione: (B) trasduzione del vettore virale di espressione nella cellula bersaglio che porta la mutazione genomica bersaglio; (C) (i) espressione di Cpf1 e dei due gRNA (gRNA I e gRNA II), e legame di questi ultimi alla endonucleasi a formare un primo e un secondo complesso macromolecolare; (ii) spostamento del primo e secondo complesso macromolecolare verso le sequenze bersaglio (SEQ BERSAGLIO I e SEQ BERSAGLIO II) presenti sul vettore e sul genoma cellulare, e taglio del DNA in corrispondenza di queste sequenze con escissione della sequenza codificante per l’ enzima TK, opzionalmente legata alla proteina fluorescente verde potenziata (EGFP); (D) inserimento della sequenza codificante per la EGFP-TK nel taglio a doppio filamento sulla sequenza genomica bersaglio mediante riparazione omologa; (E) somministrazione del ganciclovir alla cellula bersaglio modificata, che viene convertito dall’enzima TK in un composto tossico che causa la morte della cellula.
Il grafico della Figura 2 riporta i valori di morte cellulare, determinati mediante analisi FACS, nelle colture di cellule HEK293 transfettate con il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione, dopo trattamento in presenza o assenza di Ganciclovir (GCV, 12 µM) per 4 ore. In presenza di questo composto, si rileva una riduzione del 23% nel numero di cellule in coltura.
ESEMPIO 1: Allestimento del modello sperimentale Dato il ruolo preminente del gene TP53 nella progressione del cancro e nella resistenza ai farmaci, i presenti inventori hanno scelto questo modello sperimentale per verificare l’efficacia e la specificità del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione. Come descritto in precedenza, il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione, mediante trasduzione virale, consente di inserire in una cellula bersaglio, ad esempio una cellula tumorale, un gene che codifica per una proteina promotrice della morte cellulare (ad esempio la timidina chinasi, TK). Gli esperimenti condotti dai presenti inventori hanno utilizzato come bersaglio genomico del sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione le mutazioni del gene TP53 specifiche di patologia tumorale, dimostrando che l’azione di questo sistema induce la morte cellulare soltanto nelle cellule tumorali, senza arrecare alcun danno alle cellule normali. Nella Tabella 1 sono elencate le patologie tumorali associate a mutazioni nel gene TP53.
Tabella 1. Percentuale di mutazioni in TP53 in diversi tipi di tumori.
Per gli studi sperimentali, è stato scelto un tumore ematologico, più specificamente la leucemia linfatica cronica di tipo B. Il sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione è stato dapprima provato in vitro utilizzando cellule HEK293 e MCF7 ingegnerizzate con la mutazione bersaglio del gene TP53 (c.548C>G; p.Ser183*), e cellule LLC-B che portano mutazioni nel gene TP53 isolate da un paziente.
Al fine di incrementare la specificità del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione per le cellule bersaglio LLC-B, è stato disegnato e generato un vettore lentivirale derivato da HIV pseudotipizzato, che ha perso la capacità di integrazione nel genoma cellulare e che è mirato specificamente verso le cellule B mediante l’impiego delle glicoproteine dell'involucro del virus del morbillo e un anticorpo anti-CD20/CD5 (Funke S., et al, “Targeted cell entry of lentiviral vectors, (2008) Mol Ther. 16(8):1427-36). I vari passaggi dell'approccio sperimentale seguito dai presenti inventori sono descritti di seguito.
MATERIALI E METODI
ESEMPIO 2: Isolamento di cellule mononucleate da sangue periferico (PBMC) e condizioni di colture cellulari
Allo scopo di preparare linfociti della leucemia linfatica cronica, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate da campioni di sangue di pazienti leucemici. I campioni di sangue sono stati diluiti con un uguale volume di soluzione salina di fosfato (pH 7,5) (PBS). Il sangue diluito è stato quindi accuratamente stratificato sopra un volume di Pancoll umano (PAN Biotech) uguale al volume originale del campione di sangue. Il campione è stato centrifugato a 350xg per 30 minuti a temperatura ambiente in modo da ottenere la formazione dello strato di PBMC. Dopo la centrifugazione, lo strato di PBMC è stato trasferito nelle provette da 15 ml con PBS. Le PBMC sono state centrifugate di nuovo a 350xg per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, le PBMC sono state risospese nel terreno di crescita completo.
Cellule HEK293 (ATCC CRL 3216), MCF7 (ATCC # HTB-22) e fibroblasti umani primari sono stati mantenuti in Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) (Invitrogen) con 10% di Fetal Bovine Serumheat inactivated (FBS) (Invitrogen) e 2mM di L-glutammina (Invitrogen). I fibroblasti umani primari sono stati isolati da biopsia cutanea di donatori volontari e coltivati con DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 50 unità/ml penicillina (Invitrogen) e 50 g/ml streptomicina (Invitrogen). Le PBMC sono state coltivate in terreno Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 10% FBS e 4mM di L-glutammina.
ESEMPIO 3: Costrutto lentivirale, disegno dei gRNA e clonaggio
Il lentivirus (LV) è stato acquistato da Addgene e successivamente modificato per inserire le sequenze desiderate essenziali per il corretto funzionamento del sistema CRISPR-Cas secondo l’invenzione. Le sequenze del primo e secondo gRNA sono state disegnate e selezionate utilizzando la piattaforma disponibile sul sito web del Massachusetts Institute of Technology (MIT) (http://crispr.mit.edu). Le sequenze nucleotidiche codificanti per il primo e per il secondo gRNA consistono, rispettivamente, della sequenza SEQ ID NO.2 (sequenza scaffold: nucleotidi (nt) 1–20; sequenza guida: nt 21-43) e SEQ ID NO.3 (sequenza scaffold: nt 1–20; sequenza guida: nt 21-43). La sequenza nucleotidica del secondo RNA guida, ossia il gRNA la cui sequenza bersaglio è presente unicamente sul vettore virale, è stata scelta operando una selezione tra le sequenze che sono in grado di ibridarsi esclusivamente in prossimità della sequenza EGFP-HSV-TK e che non sono in grado di ibridarsi ad altre regioni del vettore. Nel vettore virale sono state inserite le seguenti sequenze: le sequenze codificanti per il primo gRNA (SEQ ID NO.2) e per il secondo gRNA (SEQ ID NO.3), la cassetta EGFP-HSV-TK (SEQ ID NO.4), la sequenza codificante l’endonucleasi Cpf1 (SEQ ID NO.5), la prima sequenza nucleotidica bersaglio (SEQ ID NO.6) e la seconda sequenza nucleotidica bersaglio (SEQ ID NO.7). Sono stati inoltre inseriti i seguenti elementi regolatori: la sequenza del promotore U6 (SEQ ID NO.8), a monte delle sequenze codificanti il primo e secondo gRNA, nonché due sequenze PAM, la prima (5’-GATA-3’) a valle della prima sequenza bersaglio e la seconda (5’-TATC-3’) a valle della seconda sequenza bersaglio. L’inserimento delle sequenze sopramenzionate è stato effettuato seguendo un protocollo di clonaggio standard, che tipicamente prevede i seguenti passaggi: taglio della sequenza di DNA mediante enzimi di restrizione specifici, ligazione della sequenza desiderata, controllo della corretta ligazione, trasformazione in cellule batteriche competenti ed estrazione del DNA plasmidico. La cassetta EGFP-HSV-TK è stata interamente sintetizzata ed inserita nel vettore lentivirale utilizzando il sito di restrizione di KpnI. Le sequenze nucleotidiche dei gRNA sono state sintetizzate inizialmente come frammenti di DNA a singolo filamento e successivamente fosforilate ed appaiate per essere poi inserite ai lati della cassetta EGFP-HSV-TK utilizzando i siti di restrizione degli enzimi EcoRI (primo gRNA) e BamHI (secondo gRNA). Per confermare la correttezza del clonaggio, il DNA del vettore virale di espressione così ottenuto è stato interamente sequenziato (sequenza designata come SEQ ID NO.1).
ESEMPIO 4: Trasformazione, selezione e isolamento del DNA del vettore virale ricombinante
Il DNA del vettore virale ricombinante è stato trasformato nelle cellule competenti E. coli DH5α (Invitrogen) seguendo le istruzioni del fornitore e isolato impiegando il kit “EndoFree Plasmid” (Qiagen), seguendo le istruzioni standard del venditore. Le cellule trasformate sono state selezionate mediante antibiotico ampicillina. Come controllo positivo della trasduzione, è stato impiegato il vettore lentivirale EGFP (Addgene, n.21316).
ESEMPIO 5: HEK293 e MCF-7 ingegnerizzate con la mutazione nel gene TP53
Le linee cellulari HEK293 e MCF7 ingegnerizzate, sono state ottenute inserendo in modo casuale nel loro genoma una cassetta che comprende la specifica mutazione nel gene TP53 (c.548C>G; p.Ser183*). La cassetta con la mutazione puntiforme (C>G) e la sequenza mCherry-bsr è stata clonata in un plasmide come precedentemente riportato (Severi F. and Conticello SG. Flowcytometric visualization of C > U mRNA editing reveals the dynamics of the process in live cells. RNA Biol. 2015; 12:389–397). Il vettore è stato transfettato con lipofectamina 2000 (Invitrogen) nelle linee cellulari HEK293 e MCF7, seguendo il protocollo illustrato nella sezione Esempio 3. L'efficienza di transfezione è stata testata tramite l'espressione di mCherry.
ESEMPIO 6: Transfezione e trasduzione virale
Per gli esperimenti di transfezione e trasduzione virale, sono state impiegate 1,2×10<5 >cellule HEK293 e MCF7, entrambe anche nella forma ingegnerizzata. Le cellule sono state coltivate da sole o in co-coltura con fibroblasti primari, e distribuite in una piastra da 24 pozzetti. Dopo 24 ore, le cellule sono state transfettate con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) e con il vettore lentivirale di espressione (2 μg totale) o vettore lentivirale EGFP come controllo seguendo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state quindi analizzate mediante citometria a flusso e mediante saggio di proliferazione cellulare MTT, rispettivamente dopo 48 ore e dopo 6 giorni dalla transfezione. Per generare il vettore retrovirale HIV, circa 5×10<5 >cellule HEK293 sono state cotrasfettate con Lipofectamine 2000 e 200 ng del plasmide di espressione della proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G) e 1 μg di plasmide per l’espressione di GVPol del MLV. Il surnatante contenente il virus è stato raccolto, centrifugato e filtrato 48 ore dopo la trasfezione. Un totale di 5 × 10<5 >cellule e 200 μl di virus sono stati usati per la trasduzione in presenza di 5 μg/ml di polibrene (Sigma).
ESEMPIO 7: Analisi degli off-target
I presenti inventori hanno eseguito apposite analisi allo scopo di rivelare eventi di off-target del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione, ovvero l’occorrenza di modifiche introdotte a livello di un locus genomico diverso da quello bersaglio.
A tale scopo è stato utilizzato il saggio di endonucleasi T7, il sequenziamento ad alta risoluzione, e l’analisi informatica impiegando la piattaforma presente a: http://www.rgenome.net/casoffinder. A seguito di tale analisi, sono state selezionate le sequenze di gRNA con il numero minore di off-target. In breve, il DNA genomico è stato estratto da cellule HEK293 e MCF7 dopo modifica con il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione, ed è stato eseguito un test di endonucleasi T7. In breve, le principali regioni genomiche note come siti di off-target sono state amplificate mediante PCR e, in seguito, i prodotti amplificati sono stati appaiati e digeriti con endonucleasi T7, un enzima che taglia sequenze di DNA in cui si è formato un disappaiamento, cosiddetto mismatch, dovuto al targeting di Cas. Il risultato del test dimostrava l’assenza di molecole di DNA mutate nei siti off-target. Su questo DNA è stata anche effettuata un’analisi con sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing-NGS). L’analisi di NGS non ha rivelato la presenza di indel, ovvero inserzioni e delezioni nel sito bersaglio, o di mutazioni in siti off-target.
ESEMPIO 8: Analisi di citofluorimetria a flusso (FACS) e selezione delle cellule per verificare l’editing della Cas e per individuare i cloni derivati da una singola cellula modificata
Il citofluorimetro di flusso (BD) ha acquisito 50.000 eventi/pozzetto. I dati sono stati analizzati dal software per citofluorimetria FlowJo v7.5. Per l’analisi, le cellule HEK293 modificate geneticamente mediante il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione sono state selezionate in base alle dimensioni e la morfologia; una seconda selezione è stata poi eseguita allo scopo di individuare le cellule GFP positive in cui l’espressione della proteina GFP è indicatrice della corretta integrazione nel genoma cellulare della sequenza HSV-TK.
ESEMPIO 9: Analisi su cellule in vitro
Le cellule sono state distribuite in triplicato in piastre da 48 pozzetti a una densità di 0,8×10<5 >cellule/pozzetto e trasfettate con e senza lentivirus HSV-TK secondo l’invenzione. Dopo 6 giorni, è stato somministrato alle cellule il Ganciclovir (GCV), substrato dell’enzima timidinachinasi, alla concentrazione di 12μM, e lasciato a contatto con le cellule per 4 ore. Il prodotto del gene HSV-TK fosforila il GCV in trifosfato di GCV, che viene incorporato nel DNA durante la replicazione delle cellule, inibendo la sintesi del DNA e determinando così la morte cellulare. Le cellule sono state analizzate successivamente con 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per valutare la percentuale di vitalità cellulare dopo l’aggiunta di Ganciclovir e valutare di conseguenza la mortalità per effetto della somministrazione di questo composto. Il saggio di MTT valuta l'attività metabolica delle cellule poiché il saggio MTT dipende dalla conversione della soluzione MTT giallo solubile in acqua in alcuni cristalli viola insolubili da cellule viventi che denota l'attività dei mitocondri.
RISULTATI ESEMPIO 10: Trasfezione delle cellule HEK293 e MCF7.
Le linee cellulari HEK293 e MCF7, appositamente ingegnerizzate con le mutazioni nel gene TP53, sono state co-coltivate con fibroblasti umani per stabilire una popolazione cellulare eterogenea. Le cellule HEK293 e MCF7 sono state trasfettate mediante impiego di lipofectamina con il vettore lentivirale secondo l’invenzione che porta le sequenze codificanti, rispettivamente, il primo e secondo gRNA, l’enzima Cpf1 e l’enzima TK. Allo scopo di verificare l’avvenuta trasfezione, la sequenza del gene TK è stata collegata, attraverso una sequenza del peptide 2A, ad un marcatore, in particolare alla sequenza che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP). Di conseguenza, le cellule che risultano positive per GFP sono anche positive per TK. Come controllo negli esperimenti di trasfezione, è stato impiegato il vettore lentivirale mancante della cassetta EGFP-TK.
I risultati degli esperimenti in vitro sono stati analizzati tramite FACS dopo 2 giorni dalla trasfezione. Le cellule sono state recuperate al FACS al fine di selezionare le cellule trasfettate positivamente in base all'espressione EGFP, proporzionale alla quantità di cellule in cui l’editing genomico mediato dal sistema CRISPR–Cas dell’invenzione ha avuto successo. L’analisi FACS ha dimostrato un’elevata efficienza del sistema CRISPR–Cas dell’invenzione poiché è stata misurata un'alta percentuale di cellule positive al segnale del marcatore.
Al fine di verificare la corretta integrazione della sequenza del gene codificante la TK nel locus genomico bersaglio, il DNA estratto dalle cellule recuperate al FACS è stato sottoposto ad amplificazione utilizzando un set di primer specifici per la sequenza integrata nel locus genomico. Un amplicone della lunghezza prevista di 822 bp è stato ottenuto solamente nelle reazioni di amplificazione condotte sul DNA estratto dalle linee cellulari ingegnerizzate e trasfettate con il vettore lentivirale secondo l’invenzione, indicando pertanto l’avvenuta corretta integrazione della sequenza del gene codificante la TK nel sito genomico che porta la specifica mutazione bersaglio.
Successivamente, impiegando le cellule HEK293 e MCF7 ingegnerizzate e trasfettate come sopra descritto, sono stati condotti esperimenti volti a verificare la funzionalità del gene codificante la TK dopo integrazione nel sito genomico bersaglio. In breve, sei giorni dopo la trasfezione, sono state selezionate al FACS le cellule EGFP positive. Le cellule recuperate sono state incubate in presenza ed assenza di Ganciclovir ad una concentrazione di 12uM. Da una successiva analisi al FACS effettuata dopo 4 ore di incubazione si è registrato un valore di una morte cellulare pari al 35,8% (Figura 2). Analoghi risultati sono stati ottenuti con il saggio di vitalità MTT. L'analisi colorimetrica MTT ha infatti rivelato che una percentuale significativa di cellule modificate ad opera del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione, rispetto al controllo, muore a seguito del trattamento con ganciclovir, indicando pertanto che la sequenza codificante per la TK si è correttamente integrata nel locus genomico bersaglio e che l’enzima espresso è in grado di convertire il ganciclovir in un composto tossico dannoso per le cellule (Figura 2).
ESEMPIO 11: Coltura e trasduzione dei linfociti leucemici mutati e non mutati nel gene TP53
Dopo aver confermato l'efficienza del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione nelle linee cellulari analizzate, i presenti inventori hanno testato detto sistema su linee cellulari primarie. Come cellule bersaglio sono stati impiegati i linfociti isolati da campioni di sangue di pazienti LLC-B, includendo sia i linfociti leucemici portatori della specifica mutazione nel gene TP53, che rappresenta la sequenza bersaglio genomica del primo gRNA codificato dal vettore lentivirale dell’invenzione che i linfociti leucemici non mutati in TP53. Poiché è noto dalla letteratura che i linfociti B sono difficili da trasfettare e trasdurre, è stato scelto l'elettroporazione come metodo di trasduzione del vettore lentivirale secondo l’invenzione nelle cellule leucemiche B mutate nel gene TP53 e non mutate. L’avvenuta corretta integrazione della cassetta EGFP-TK nel sito genomico mutato esclusivamente nella popolazione di linfociti che portano la mutazione nel gene TP53 è stata dimostrata mediante analisi FACS ed amplificazione del DNA, secondo le modalità illustrate nell’Esempio 8.
ESEMPIO 12: Produzione virale e trasduzione virale Dopo aver dimostrato l'efficienza del sistema CRISPR-Cas dell’invenzione su linee cellulari in vitro, i presenti inventori hanno generato particelle virali capaci di infettare le cellule bersaglio. Le particelle lentivirali (Addgene) sono state prodotte seguendo il protocollo standard per la produzione virale indicato dal produttore. Allo scopo, sono stati trasfettati nelle cellule della linea HEK293 un plasmide che consente l’impacchettamento delle proteine virali, un plasmide che guida la produzione delle proteine dell’envelope virale e il vettore lentivirale di espressione dell’invenzione insieme a un quarto plasmide che codifica per un enzima Cas9 modificato (dCas9) essenziale ad evitare l'auto-degradazione dello stesso vettore lentivirale. Infatti, in assenza della dCas9, il vettore lentivirale, una volta all'interno della cellula, esprime gli RNA guida e l’enzima Cpf1 che, complessati in un sistema macromolecolare, sono in grado di escidere la cassetta EGFP-TK dal vettore con conseguente apertura e degradazione di quest’ultimo. In presenza della dCas9, invece, che ha perso la sua attività catalitica, questo enzima, guidato dalle molecole di gRNA, si lega alle sequenze bersaglio sul vettore impedendone il riconoscimento da parte della Cpf1. Questa endonucleasi non può quindi eseguire il taglio del doppio filamento nei siti bersaglio.
Alternativamente, onde evitare l'autodegradazione del vettore lentivirale, può essere impiegato una endonucleasi modificata (dCpf1). Questa strategia prevede di trasfettare un plasmide codificante per una dCpf1 nelle cellule HEK293, insieme al plasmide che consente l’impacchettamento delle proteine virali e ad un plasmide che guida la produzione delle proteine dell’envelope virale, entrambi essenziali per la produzione del virus. Il ruolo dell'endonucleasi modificata è quello di legarsi alle molecole di RNA guida, sequestrandole, cosicché la Cpf1 funzionante non ha la possibilità di indirizzarsi verso i siti bersaglio a causa della bassa quantità di gRNA liberi disponibili.
I presenti inventori hanno impiegato le particelle virali generate come sopra descritto per infettare linee cellulari HEK293 e MCF7 normali e portatrici di mutazioni nel gene TP53. La presenza della corretta integrazione della cassetta EGFP-TK nel sito genomico bersaglio è stata verificata sottoponendo campioni di cellule ad analisi FACS dopo 2 giorni dall'infezione. I segnali di fluorescenza verde risultavano localizzati esclusivamente nelle cellule bersaglio del sistema CRISPR-Cas, ossia nelle cellule mutate. Questi risultati sono stati confermati mediante amplificazione del DNA genomico estratto dalle cellule, rivelando la presenza della banda attesa di 822 bp soltanto nelle cellule infettate dal virus e recanti la cassetta con la mutazione.
Claims (21)
- RIVENDICAZIONI 1. Sistema “Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR associated (Cas) (CRISPR-Cas)” non presente in natura o ingegnerizzato mirato ad almeno una sequenza genomica bersaglio in una cellula bersaglio, il sistema comprendendo un vettore virale di espressione che comprende: 1) una sequenza nucleotidica codificante per un enzima endonucleasi atto a generare estremità coesive, detta sequenza nucleotidica essendo operativamente collegata ad una o più sequenze regolatrici situate sul vettore; 2) una sequenza nucleotidica codificante per una proteina atta a promuovere la morte cellulare, detta sequenza nucleotidica non essendo operativamente collegata ad alcuna sequenza regolatrice situata sul vettore; 3) una prima sequenza nucleotidica bersaglio e una seconda sequenza nucleotidica bersaglio rispettivamente situate a valle dell’estremità 3’ e a monte dell’estremità 5’ della sequenza nucleotidica codificante per la proteina atta a promuovere la morte cellulare, la prima sequenza nucleotidica bersaglio e la seconda sequenza nucleotidica bersaglio essendo entrambe situate a valle dell’estremità 3’ di una sequenza nucleotidica Protospacer Adjacent Motif (PAM); 4) una sequenza nucleotidica codificante per un primo RNA guida (primo gRNA) operativamente collegata ad una o più sequenze regolatrici situate sul vettore, in cui detto primo gRNA comprende una prima sequenza nucleotidica scaffold atta a legare l’enzima endonucleasi ed una prima sequenza nucleotidica guida atta ad ibridarsi alla prima sequenza nucleotidica bersaglio; e 5) una sequenza nucleotidica codificante per un secondo RNA guida (secondo gRNA) operativamente collegata ad una o più sequenze regolatrici situate sul vettore virale di espressione, in cui detto secondo gRNA comprende una seconda sequenza nucleotidica scaffold atta a legare l’enzima endonucleasi ed una seconda sequenza nucleotidica guida atta ad ibridarsi alla seconda sequenza nucleotidica bersaglio, in cui la prima sequenza nucleotidica bersaglio corrisponde all’almeno una sequenza genomica bersaglio della cellula bersaglio a cui il sistema CRISPR-Cas è mirato.
- 2. Sistema CRISPR-Cas secondo la rivendicazione 1, in cui la prima sequenza nucleotidica bersaglio e la seconda sequenza nucleotidica bersaglio sono scelte in modo tale per cui le porzioni protrudenti a singolo filamento delle rispettive estremità coesive generate a seguito di taglio ad opera dell’enzima endonucleasi siano sequenze complementari.
- 3. Sistema CRISPR-Cas secondo la rivendicazione 1, che è mirato ad una prima sequenza genomica bersaglio e ad una seconda sequenza genomica bersaglio, in cui la prima sequenza genomica bersaglio corrisponde alla prima sequenza nucleotidica bersaglio e la seconda sequenza genomica bersaglio corrisponde alla seconda sequenza nucleotidica bersaglio.
- 4. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui l’enzima endonucleasi è scelto dal gruppo che consiste di Cpf1 e suoi mutanti atti a legare sequenze PAM diverse.
- 5. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui la proteina atta a promuovere la morte cellulare è l’enzima timidina chinasi.
- 6. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui l’almeno una sequenza genomica bersaglio della cellula bersaglio a cui il sistema è mirato comprende una o più mutazioni geniche.
- 7. Sistema CRISPR-Cas secondo la rivendicazione 6, in cui la mutazione genica è scelta dal gruppo che consiste di mutazioni del gene TP53, mutazioni dei geni KRAS/BRAF, mutazioni del gene NRAS, mutazioni del gene EGFR nella regione che codifica per il dominio extracellulare del recettore, amplificazione del gene HER2, traslocazione EML4/ALK e mutazioni nei geni MET, PK3CA e ERB2, e qualsiasi loro combinazione.
- 8. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui il vettore virale di espressione comprende inoltre una sequenza nucleotidica codificante per un enzima integrasi, la sequenza nucleotidica comprendendo una mutazione atta a sopprimere l’attività di detto enzima.
- 9. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, in cui la cellula bersaglio è una cellula eucariotica, preferibilmente una cellula umana.
- 10. Particella virale che comprende un sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9.
- 11. Particella virale secondo la rivendicazione 10, che è scelta dal gruppo che consiste di lentivirus, retrovirus, adenovirus o virus adeno-associati.
- 12. Particella virale secondo la rivendicazione 10 o 11, che comprende una proteina capsidica chimerica, detta proteina capsidica chimerica comprendendo un dominio atto a legarsi ad almeno un marcatore espresso sulla superficie della cellula bersaglio a cui il sistema CRISPR-Cas è mirato.2
- 13. Particella virale secondo la rivendicazione 11, in cui detto dominio è un anticorpo, un fattore di crescita o un ligando.
- 14. Particella virale secondo la rivendicazione 12 o 13, in cui detto marcatore è scelto dal gruppo che consiste della proteina CD5, CD19, CD20, CD23, CD46, BCR e qualsiasi loro combinazione.
- 15. Procedimento in vitro per promuovere l’apoptosi in una cellula bersaglio, detto procedimento comprendendo i passaggi di - trasdurre la cellula bersaglio con un sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9 e/o con almeno una particella virale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 14, e - porre la cellula trasdotta in condizioni di coltura atte a indurre l’espressione dell’enzima endonucleasi e del primo e secondo RNA guida (gRNA) e la formazione di un primo complesso macromolecolare comprendente l’enzima endonucleasi associato a detto primo gRNA e di un secondo complesso macromolecolare comprendente l’enzima endonucleasi associato a detto secondo gRNA.
- 16. Procedimento secondo la rivendicazione 15, in cui la proteina atta a promuovere la morte cellulare è l’enzima timidina chinasi.
- 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16, comprendente inoltre il passaggio di mettere la cellula bersaglio a contatto con un substrato dell’enzima timidina chinasi, preferibilmente il ganciclovir.
- 18. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15 a 17, in cui la cellula bersaglio è una cellula eucariotica, preferibilmente una cellula umana tumorale.
- 19. Cellula bersaglio isolata che comprende un sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9 e/o almeno una particella virale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 14.
- 20. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9 o particella virale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 14, per l’impiego come medicamento.
- 21. Sistema CRISPR-Cas o particella virale secondo la rivendicazione 20, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia scelta dal gruppo che consiste di leucemia linfatica cronica di tipo B, linfoma non Hodgkin, sindromi mielodisplastiche, neoplasie mieloproliferative, mieloma multiplo, leucemia mieloide acuta, leucemia linfoblastica acuta, carcinoma polmonare a cellule squamose, adenocarcinoma polmonare, tumore dell’ovaio, tumore del colon-retto, tumore dell’esofago, tumori della testa e del collo, tumore della laringe, tumore della cute, tumore del pancreas, tumore dello stomaco, tumore della prostata, tumore del fegato, tumore cerebrale, tumore della vescica, tumore della mammella, tumore dell’utero, sarcomi dei tessuti molli, tumore osseo, tumori endocrini e tumore della cervice uterina.
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|---|---|---|---|---|
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-
2018
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-
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- 2019-10-15 WO PCT/IB2019/058760 patent/WO2020079574A1/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016094888A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | James Zhu | Methods and compositions for selectively eliminating cells of interest |
| WO2018009525A1 (en) * | 2016-07-05 | 2018-01-11 | The Johnson Hopkins University | Crispr/cas9-based compositions and methods for treating cancer |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHRISTOPHER A. LINO ET AL: "Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches", DRUG DELIVERY., vol. 25, no. 1, 1 January 2018 (2018-01-01), US, pages 1234 - 1257, XP055573342, ISSN: 1071-7544, DOI: 10.1080/10717544.2018.1474964 * |
| CIA-HIN LAU ET AL: "In vivo genome editing in animals using AAV-CRISPR system: applications to translational research of human disease", F1000RESEARCH, vol. 6, 1 January 2017 (2017-01-01), pages 2153, XP055573337, DOI: 10.12688/f1000research.11243.1 * |
| MARTA MARTINEZ-LAGE ET AL: "CRISPR/Cas9 for Cancer Therapy: Hopes and Challenges", BIOMEDICINES, vol. 6, no. 4, 12 November 2018 (2018-11-12), pages 105, XP055573345, DOI: 10.3390/biomedicines6040105 * |
| ZHANG-HUI CHEN ET AL: "Targeting genomic rearrangements in tumor cells through Cas9-mediated insertion of a suicide gene", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 35, no. 6, 1 May 2017 (2017-05-01), New York, pages 543 - 550, XP055573309, ISSN: 1087-0156, DOI: 10.1038/nbt.3843 * |
Also Published As
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|---|---|
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