JP2022521462A - ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒシステム - Google Patents

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Abstract

真核細胞の標的ゲノム配列を標的とする、および該細胞の死を促進し得るゲノム編集システム、特にＣＲＩＳＰＲシステムが記載される。ＣＲＩＳＰＲシステムを含むウイルス粒子および単離された真核細胞、そのシステムを使用する方法、およびそのシステムの医薬品としての使用、特に腫瘍性疾患の処置における使用についても記載される。

Description

本発明は細胞内のゲノムに改変を入れるために使用し得るシステムに関する。特に、本発明は、真核細胞の標的ゲノム配列を対象とした”規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連の（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）”システム、およびこのシステムを含むウイルス粒子に関する。さらに本発明は当該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、または当該ウイルス粒子を用いる方法に関する。
ここ数十年において、分子生物学の目覚ましい発展および大量のゲノムシークエンスのおかげで、ゲノム編集技術の分野における重要な目標が達成された。それはゲノムにおける改変を可能にする方法の組み合わせである。
近頃では、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）システムが、標的細胞のゲノム内で標的となる改変を行うための最も進んだ方法の一つである。ＣＲＩＳＰＲ技術では、エンドヌクレアーゼ酵素をゲノム上の特定の標的部位に誘導する、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ分子を用いることで、二本鎖ＤＮＡを切断することができる。最も一般的に用いられるエンドヌクレアーゼ酵素のなかには、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａ（旧称Ｃｐｆ１）があり、両者は標的部位で行う二本鎖切断の様式において本質的に異なる。Ｃａｓ９酵素は平滑末端を残して二本鎖を切断し、平滑末端は通常、細胞内で非相同末端結合機構により修復される、一方Ｃａｓ１２ａ酵素は細胞内で相同組み換え修復を促進する粘着末端を作り出す（Zetsche B. et al, “Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system”; (2015) Cell, 163(3):759-71）。より正確には、相同修復は、ヌクレオチド配列が一致するまたは非常に近い領域をもつＤＮＡ断片間で、遺伝子情報を交換できる可能性に基づくＤＮＡ修復機構である。一般的に、非相同修復は遺伝子ノックアウト（ＫＯ）、すなわち、対象遺伝子の発現抑制を得るために選ばれる。なぜなら、この修復様式は標的部位における挿入および欠失（インデル）を生成するためである。一方、相同組み換え修復は特定のゲノム部位に目的のヌクレオチド配列を組み込むためのノックイン（ＫＩ）実験のために好適である。
最近では、ＣＲＩＳＰＲシステムは医療分野にも進出している。ヒトにおけるＣＲＩＳＰＲによる最初の試験（ＮＣＴ０２７９３８５６）は、２０１６年に成都（中国）にある四川大学附属西中病院で始まった、化学療法や放射線治療などの処置では大きな効果を得られなかった転移性非小細胞肺がんの処置である。再発および難治性の急性リンパ性白血病の処置においても、ＣＲＩＳＰＲシステムは、腫瘍細胞上の特定の表面分子を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生産するためのｅｘ ｖｉｖｏでのＴ細胞の遺伝子操作に用いられた。さらに２つのＣＲＩＳＰＲシステムに関する臨床試験が現在進行しており、どちらも２０１７年の６月に開始した。前述の試験の１つ目（ＮＴ０３１６６８７８）は第２相であり、再発性または難治性のＢ細胞性白血病またはリンパ腫の患者におけるＣＤ１９抗原に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の使用に基づく。２つ目の試験（ＮＣＴ０２７０６３９２）はまだ第１相であり、ＲＯＲ１＋慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病、第ＩＶ相非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または転移性トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の患者におけるＲＯＲ１（受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体）を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の使用である。
このように、ＣＲＩＳＰＲ技術の治療への応用の中でも、腫瘍性疾患の分野が主要な役割を果たしている。
典型的には、発達の過程で、腫瘍は新規のおよび特別な遺伝子変異を獲得し、それは疾患の特異的なマーカーとなるため、腫瘍の各々の種類および分子的な進行度を特定することが可能である。このため、特定の腫瘍と特に関連するある遺伝子変異は個別化治療をする上での標的となり得る。腫瘍性形質転換の標的遺伝子の中でも、もっとも影響があるも
の一つがＴＰ５３遺伝子であり、ｐ５３と呼ばれる、ヒトの細胞内で様々な役割を果たすタンパク質をコードする。腫瘍抑制遺伝子としてのＴＰ５３の標準的な機能が長年知られてきたが、しかし変異型ＴＰ５３遺伝子の過剰発現は、機能獲得メカニズムによって、その役割ががん原遺伝子へと逆転する結果となる（非標準的機能）。
血液性および固形の腫瘍におけるＴＰ５３の変異はがんの種類やサブタイプに応じて異なるレベルで識別されてきた。一般的に、ＴＰ５３の変異は再発性の場合に検出され、これは攻撃的およびしばしば難治性の病状を引き起こし、患者の治療への応答性が低くなる。治療の観点からみると、ＴＰ５３遺伝子はよって特にほかの種類の薬物的な処置が効果的でないときの重要な処置のための標的と考えられる。
Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）は成人における白血病の最も一般的なモデルである。ｐ５３タンパク質の経路における変更がＢ－ＣＬＬにおいてしばしば報告され、主として染色体１７ｐ１３の欠失またはＴＰ５３遺伝子の変異と関連付けられている。ＴＰ５３遺伝子の変異はＢ－ＣＬＬおよびほかの血液性、非血液性悪性腫瘍の患者のおおよそ１０％において見つかり、他のＢ－ＣＬＬ患者の生存率が７０％と報告されるのに対して、これらの患者の平均５年生存率は約２０％と推算される。
近年、ゲノム編集研究は、変異した遺伝子配列と各々の正しいＤＮＡ配列との置き換えを達成するために設計された変異導入実験に特に注目している。細胞は二本鎖損傷を相同修復よりも非相同組み換えを用いてより簡易的に行う、というのも、相同修復機構は細胞周期のＳおよびＧ２期の間に主に活性化するが、一方、非相同修復は細胞周期のどの段階でも起こり得るためである。細胞において非相同ＤＮＡ修復機構が主流であるため、変異導入の適用には大きな困難が生じる。異なる戦略では、ゲノム編集の方法論をＤＮＡ配列の変異の修正へ向けるのではなく、特定の外来ヌクレオチド配列の標的ゲノム部位への組み込みへと向ける。このような手法は、Ｃｈｅｎ ＺＨと同僚による、ウイルス酵素をコードする配列を腫瘍細胞のゲノムに組み込むためのＣＲＩＳＰＲシステムの使用について記した論文で説明されている（Chen ZH, et al, “Targeting genomic rearrangements in tumor cells through Cas9-mediated insertion of a suicide gene”, (2017) Nat Biotechnol. 35:543-550）。
ゲノムを変更する方法、特にＣＲＩＳＰＲ技術によって、顕著な進歩が達成されたにもかかわらず、それらの応用は、それらの作用機構の十分な正確性を得られないことに起因する大きな制限を受けている。より詳細には、ＣＲＩＳＰＲシステムに関する大きな問題点の一つは、この方法で用いるガイドＲＮＡ分子は、ゲノム上の改変するべき配列だけでなく、そこによく似た配列も認識し得るため、結果的に標的とは違うゲノム部位を改変する可能性があることである。オフターゲットと呼ばれるこの出来事は、例えば、腫瘍抑制遺伝子内に望まない改変を引き起こし、したがって、標的細胞の制御不能な複製や、有り得る腫瘍性形質転換の引き金をとなり得る。
オフターゲット作用の可能性という不都合に加えて、ＣＲＩＳＰＲ技術はまた遺伝子操作を必要としない健康な細胞への影響を避けるために、自身の成分の輸送を、遺伝子改変を実行する細胞集団、例えば特に疾患細胞集団にのみ向かわせるという問題を提示する。このために、化学的システム（リポフェクタミン、ポリエチレンイミン）、またはエレクトロポレーション法を含む、標的細胞内でＣＲＩＳＰＲシステムの正しい放出を可能にするような異なる方法が評価されてきた。しかしながら、これらの方法は主にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの研究においては効果的に働くが、ｉｎ ｖｉｖｏの実験において、ＣＲＩＳＰＲを放出するために現在利用できる唯一の手法は、現在のその使用方式においては、いまだ安全性が低いとされるウイルスシステムのみである。
外来コーディングヌクレオチド配列を細胞内ゲノムに組み込むためのＣＲＩＳＰＲ技術の使用もまた、標的ゲノム部位が終止コドンを導くようなナンセンス変異、これは外来配列がコードするタンパク質の翻訳を停止する原因となり得る、を有している場合に該配列の発現の保護という問題を提示する。したがって、高水準の正確性と精度をもつゲノム編集システム、特にＣＲＩＳＰＲシステムを提供し、よってこれらのシステムを臨床や治療の場での使用に適したものにすることが要求される。より詳細には、通常細胞に何の影響も与えず、標的細胞選択的に機能することができるＣＲＩＳＰＲシステム、および同時に、細胞のエンドヌクレアーゼ作用への暴露を減らし、よって危険なオフターゲット事象の発生をなくす、または大きく減らすことができるＣＲＩＳＰＲシステムの提供が要求される。
さらに、変異した標的ゲノム配列においても外来ヌクレオチド配列の挿入、および正常な発現を達成できるようなゲノム編集機能をもつＣＲＩＳＰＲシステムの提供が要求される。
これらの要求には、添付の請求項１で定義するような本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって応えられる。
本発明はまた、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムを含むウイルス粒子、および単離された真核細胞、このシステムを使用する方法、ならびにその治療への使用に関する。
本発明のさらなる特徴および利点を添付の請求項で特定し、以下の明細書中で詳細に説明する。
添付した独立請求項および従属請求項は本明細書の重要な部分を構成する。
以下の詳細な説明で明らかにするように、本発明は非自然的に発生、または操作したＣＲＩＳＰＲシステムであって、該システムに高い正確性と精度を提供するのに適切な特徴の組み合わせにより定義される、標的細胞内の少なくとも一つの標的ゲノム配列を標的とするＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。本発明におけるＣＲＩＳＰＲシステムは、当該システムの様々な成分の細胞内発現を可能にするウイルスベクターの使用に基づいている。一般に、ウイルスベクターは、ウイルスがウイルス粒子に包まれる、および宿主細胞へと導入されることを可能にするように設計されている、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。好ましくは、本発明に係る発現ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターであり、さらに好ましくはレンチウイルスベクターである。
前述のように、および図１のパネルＡに示すように、本発明におけるウイルス発現ベクターは、典型的にＣＲＩＳＰＲシステムが機能するために要求される様々な成分をそれぞれコードするようなヌクレオチド配列を含み、より詳細には、エンドヌクレアーゼ酵素、ならびに該酵素に結合し得るおよび当該配列とのハイブリダイズ能によって該酵素を標的配列に向かわせ得る１以上のガイドＲＮＡ分子、をコードするようなヌクレオチド配列を含む。結果として、ガイドＲＮＡにより運ばれたエンドヌクレアーゼ酵素は標的配列において二本鎖を切断する。
本発明において、エンドヌクレアーゼ酵素は二本鎖ＤＮＡの切断後に粘着末端を生成する能力を持つ特徴がある。切断部位における粘着末端の存在は、有利にＤＮＡ断片の挿入に方向性をもたせることができ、よってコーディング配列の正しい読み枠を維持することができる。
本発明におけるＣＲＩＳＰＲシステムにおいて使用するのに適したエンドヌクレアーゼ酵素は、以下に限定するものではなく、例として、異なる”プロトスペーサー隣接モチーフ”（ＰＡＭ）塩基配列を認識できるＣａｓ１２ａ酵素およびその変異体を含む。ＰＡＭ配列は２～６塩基対を含む短い配列で、ＣＲＩＳＰＲシステムが標的配列を認識するために必要であることはよく知られている（Shah S. et al, “Protospacer recognition motifs Mixed identities and functional diversity (2013) RNA Biology 10(5): 891-899）。
好ましい実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ａ酵素である。好ましくは、エンドヌクレアーゼ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の標的細胞核内への移行を促進するのに適した、１以上の核移行シグナルを含む。
本発明におけるウイルス発現ベクターは、さらに第１および第２ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）それぞれをコードする２つのヌクレオチド配列を含む。第１ｇＲＮＡはヌクレアーゼ酵素と結合できる第１足場ヌクレオチド配列、および第１標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第１ガイドヌクレオチド配列、を含む。第２ｇＲＮＡはエンドヌクレアーゼ酵素と結合できる第２足場ヌクレオチド配列、および第２標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第２ガイド塩基配列、を含む。
結果として、発現すると、第１および第２ｇＲＮＡはエンドヌクレアーゼ酵素と複合体を形成し、第１および第２ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。第１および第２ガイド配列は、第１および第２ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的な結合を第１および第２標的配列各々に向かわせる。以下の部分でさらに詳細に説明するように、本発明において、第１および第２標的配列はウイルス発現ベクター上に位置している。
一つの実施形態において、第１および第２ｇＲＮＡの足場配列はそれぞれ、互いに一致していてもよい。
本発明の範囲内で、エンドヌクレアーゼ酵素ならびに、第１および第２ｇＲＮＡをコードするウイルスベクターのヌクレオチド配列は、１以上の調節配列と作動可能に接続しているため、宿主細胞における発現に適している。遺伝子発現への使用のために適した調節配列は当技術分野で知られており、記載されているため、それらの選択および使用は十分に当業者の技術領域内にある。プロモーター、例として誘導可能プロモーター、およびエンハンサー、配列内リボソーム侵入部位、および／または、転写終結シグナルが、非制限的な例として知られている。例えば、第１および第２ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーター、好ましくはＵ６プロモーターと作動可能に接続し得る。
本発明において、ウイルス発現ベクターはさらに、細胞死過程を促進可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。有利には、該ヌクレオチド配列は、ベクター上に位置するいかなる調節配列とも作動可能に接続しておらず、そのためその発現は恒常的に阻害されており、このヌクレオチド配列が標的ゲノム部位に正しく組み込まれる、および適切な調節因子を備えたときのみ発現できる。
細胞死を促進し得る典型的なタンパク質は、以下に限定するものではなく、チミジンキナーゼ、テロメラーゼ、シトシンデアミナーゼ、カスパーゼ、エンドヌクレアーゼ酵素、および特定の細胞死誘導性細胞内抗体を含む。
より好ましい実施形態において、細胞死を促進し得るタンパク質はチミジンキナーゼ（ＴＫ）である。
本発明におけるウイルス発現ベクターにおいて、第１および第２ｇＲＮＡの標的ヌクレオチド配列はどちらも存在し、細胞死を促進し得るタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’末端の下流（第１標的配列）、および５’末端の上流（第２標的配列）にそれぞれ位置する。ＣＲＩＳＰＲシステムがこれらを認識し、結果的にエンドヌクレアーゼ酵素による切断が起こるために、両者の標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ配列の３’末端の下流に位置する。
このように、前述のようなウイルス発現ベクターの要素の構成は、細胞死を促進し得るタンパク質をコードする塩基配列を該配列の上流と下流を酵素によって配列特異的に切断することでベクターから切り出すことが可能であり、よって該配列は標的細胞の標的ゲノム部位への挿入に利用可能になる。注目すべきことに、この特徴は細胞内に導入された際に、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムにさらなる制御要因をもたらす。というのも、エンドヌクレアーゼによる切断の結果としてのウイルスベクターの構造の開裂は、自身の分解、および宿主細胞からの除去、特にその細胞核からの除去を促進するためである。このようにして、細胞内にベクターが残留し得ることによる、結果的にＤＮＡのオフターゲット切断を誘導するような、同じベクターにコードされたエンドヌクレアーゼ酵素の有害な過剰発現が防がれる。
本発明におけるＣＲＩＳＰＲシステムはまた、ウイルス発現ベクター上の第１標的ヌクレオチド配列が、ＣＲＩＳＰＲシステムの標的となる真核細胞の少なくとも一つの標的ゲノム配列と一致するという特徴を持つ。よって、同じｇＲＮＡ、より詳細には第１ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ酵素による切断を少なくとも２つの区別できる標的部位、－同じ標的配列を含んでいるが－１つはウイルス発現ベクター上に、もう一つは細胞のゲノム上に、向かわせ得る。よって、上記の方法においてベクターから切り出された場合に、細胞死を促進し得るタンパク質をコードする塩基配列を含んだＤＮＡ断片は、ＣＲＩＳＰＲシステムの標的となる少なくとも一つの標的ゲノム配列においてエンドヌクレアーゼ酵素が作り出した切断部位に、読み枠を残したまま挿入され得る。
一つの実施形態において、ウイルス発現ベクター上の、細胞死を促進するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’末端の下流、および５’末端の上流それぞれに位置する第１、および第２標的ヌクレオチド配列は、同一であるように、およびエンドヌクレアーゼ酵素による切断で生成されるそれぞれの粘着末端が、相補的な一本鎖突出部分を持つように選択される。
他の実施形態において、ウイルス発現ベクター上の、細胞死を促進するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’末端の下流、および５’末端の上流それぞれに位置する第１、および第２標的ヌクレオチド配列は、異なるように、およびエンドヌクレアーゼ酵素による切断で生成されるそれぞれの粘着末端が、相補的な一本鎖突出部分を持つように選択される。この実施形態では、末端が異なるコーディングヌクレオチド配列を使用でき、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムが標的とする少なくとも一つの標的ゲノム配列が、例えばｃ．５４８Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｓｅｒ１８３＊）のような、終止コドンを生成する点変異を含む場合への適用に特に適している。実際、このような状況では、同一であって、および変異した標的ゲノム配列と一致している第１および第２標的ヌクレオチド配列が本発明のＣＲＩＳＰＲシステムで用いられた場合、第１および第２標的ヌクレオチド配列どちらもが結果的に、ＣＲＩＳＰＲシステムの標的となるナンセンス変異を含み得る。よって、例えばＣａｓ１２ａ酵素のようなエンドヌクレアーゼ酵素による標的ゲノム配列における切断、ならびに続いて起こる、同一である、およびどちらもナンセンス変異を持つ第１および第２標的ヌクレオチド配列を使用してベクター上から切り出された細胞死を促進するタンパク質をコードする配列の挿入による修復は、この変異組成物のコーディング配列５’末端への挿入を誘導し、よって細胞死を促進するタンパク質の発現を阻害し得る。図３の略図に示すように、異なるが、相補的な一本鎖突出部を持つ第１および第２標的ヌクレオチド配列を使用することで、終止コドンを含まないように、標的ヌクレオチド配列のコーディング配列の５’末端を変更できる。このことは、一度細胞死を促進するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が標的ゲノム配列に挿入されると、終止コドンが唯一、コーディング配列の下流に存在することを確実にし、よって細胞死を促進するタンパク質の正常な発現を保証する。
他の実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムは第１および第２の標的ゲノム配列を対象とする。この実施形態では、第１標的ゲノム配列は第１標的ヌクレオチド配列に相当し、第２標的ゲノム配列は、第２標的ヌクレオチド配列と相当する。これはさらに、２つのｇＲＮＡそれぞれを介した切断がベクター上で１度およびゲノム上で１度のみ生じるため、細胞死を促進するタンパク質をコードする配列を含んだＤＮＡ断片の標的ゲノムへの正しい挿入を促進する。
一つの実施形態では、ウイルス発現ベクターは配列番号１からなる。
好ましい実施形態において、本発明のシステムのウイルス発現ベクターは、酵素活性を阻害するような変異が入った変異インテグラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。このような変異を導入することで、ウイルスベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込み、およびシステム成分の恒常的な細胞内発現を阻害することによる、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの安全性を向上させる狙いがある。これは特に、通常の、非対象細胞に間違って導入された場合の安全装置として重要である。
より好ましい実施形態では、本発明の発現ベクターにコードされたインテグラーゼ酵素は、ｐ．Ａｓｐ６４Ｖａｌの点変異をもつ。
本システムの標的となる、標的細胞の少なくとも一つの標的ゲノム配列は１以上の遺伝子変異を含み得る。少なくとも一つの標的ゲノム配列に存在し得る遺伝子変異は、非限定的な例を挙げると、ＴＰ５３遺伝子の変異、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ遺伝子の変異、ＮＲＡＳ遺伝子の変異、受容体の細胞外ドメインをコードする領域におけるＥＧＦＲ遺伝子の変異、ＨＥＲ２遺伝子の増幅、ＥＭＬ４／ＡＬＫ遺伝子の転座、およびＭＥＴ、ＰＫ３ＣＡ、およびＥＲＢ２遺伝子の変異、ならびにそのいかなる組み合わせを含む。
好ましくは、変異はＴＰ５３遺伝子の変異であり、より好ましくは、転写の早期終結を引き起こし、よって短縮型のタンパク質を生成する、ｃ．５４８Ｃ＞Ｇまたはｐ．Ｓｅｒ１８３＊のナンセンス変異、またはｃ．８１８Ｇ＞Ａまたはｐ．Ａｒｇ２７３Ｈｉｓのナンセンス変異である。
本発明に係るＣＲＩＳＰＲシステムの標的細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳類の細胞、より好ましくはヒトの細胞、さらに好ましくはヒト腫瘍細胞であり得る。
例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムを標的細胞に導入するために、適切なウイルスシステムを使用し得る。
よって、上記に定義するＣＲＩＳＰＲシステムを含むウイルス粒子もまた、本発明の範囲にある。ウイルス粒子は、例として、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスであり得る。好ましくは、ウイルス粒子はレンチウイルスである。
好ましい実施形態において、本発明のウイルス粒子は、ＣＲＩＳＰＲシステムの標的細胞表面に発現する少なくとも一つのマーカーと結合可能なドメインを含むキメラカプシドタンパク質を含む。上記のキメラタンパクドメインと細胞表面のマーカー間の相互作用は、ウイルス粒子が選択的に標的細胞を標的とすることを確実にし、よって健康な、非標的の細胞に影響し、損傷させる可能性を回避する。
好ましくはキメラカプシドタンパク質のドメインは抗体、成長因子、またはリガンドである。
例えば、限定的ではなく、タンパク質ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、 ＣＤ４６、および、ＢＣＲ、およびそのどの組み合わせも、前述の細胞表面のマーカーである。
標的細胞において細胞死を促進するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法もまた、添付の請求項１５で定義するように、本発明の対象である。本発明の方法は、上記に定義するように、標的細胞にＣＲＩＳＰＲシステム、および／または、少なくとも一つのウイルス粒子を導入すること、ならびに、エンドヌクレアーゼ酵素、および、第１および第２ｇＲＮＡの発現を誘導するのに適切な条件下で導入後の細胞を培養することを含む。典型的に、適切な培養条件や時間は標的細胞に依存し、例えば、培地の組成、ｐＨ、相対湿度、Ｏ２およびＣＯ２の気体成分、および温度と相関し得る。本発明の方法に用いた最適な培養条件や時間の選択は十分に当業者の技術領域内である。
ＣＲＩＳＰＲシステムの発現の結果として標的細胞内で第１ｇＲＮＡと関連するエンドヌクレアーゼ酵素を含む第１高分子複合体、および第２ｇＲＮＡと関連するエンドヌクレアーゼ酵素を含む第２高分子複合体が形成される。前述のように、および図１で示すように、これらの高分子複合体は、ウイルスベクター、および細胞ゲノム上の第１および第２標的配列における配列特異的な切断によって、細胞死を促進するタンパク質をコードするＤＮＡ挿入断片の少なくとも一つの標的ゲノム配列への組み込みに機能する。より詳細には、第１標的配列における切断は、第１高分子複合体によって第１ｇＲＮＡの該第１配列とのハイブリダイゼーションを介して実行され、一方、第２標的配列における切断は、第２高分子複合体によって、第２ｇＲＮＡの該第２配列とのハイブリダイゼーションを介して実行される。
本発明の方法において、細胞死を促進するタンパク質をコードする配列は、正しい読み枠を維持したまま正しく標的ゲノム部位に挿入されるような条件のもと、適切な調節要素の制御下に発現する。これにより、細胞死に至る一連のプロセスは、標的細胞でのみ引き起こされることが確実になる。
好ましくは、ＤＮＡ挿入断片のゲノム配列への組み込みは、例えば、微小相同性領域を用いたＤＮＡ鎖の結合などの、細胞内ＤＮＡ修復機構によって仲介される。
図１に示す実施形態において、細胞死を促進し得るタンパク質はチミジンキナーゼ（ＴＫ）酵素である。この実施形態では、本発明における方法は好ましくはさらに、標的細胞をチミジンキナーゼの基質、より好ましくは、ガンシクロビル基質と接触させる工程を含む。チミジンキナーゼによるこの成分のリン酸化と、続くＤＮＡ分子への取り込みが、二重螺旋の合成を阻害し、細胞死に至らせる。
より好ましい実施形態においては、本発明の方法における標的細胞は、疾患ヒト細胞、好ましくはヒト腫瘍細胞である。
上記で定義されたＣＲＩＳＰＲシステム、またはウイルス粒子を含む単離された標的細胞もまた本発明の範囲に含まれる。
好ましくは、単離された標的細胞は真核細胞であり、好ましくは哺乳類の細胞であり、より好ましくはヒト細胞であり、さらに好ましくは、ヒト腫瘍細胞である。
上記のように、標的細胞のゲノムにおいて、標的化されたおよび選択的なやり方で、細胞死過程の誘因を実行する能力によって、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムは特に臨床治療応用、特に、疾患細胞の選択的な除去を目的とした応用における使用に適している。
よって、本発明のさらなる目的は、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、または本発明のウイルス粒子の薬剤としての利用である。好ましくは、しかし限定的にではなく、治療としての使用は、腫瘍性疾患の処置を目的としており、より好ましくは、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、肺扁平上皮がん、肺腺がん、卵巣がん、大腸がん、食道がん、頭頸部がん、喉頭がん、皮膚がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、乳がん、子宮がん、軟部組織肉腫、骨がん、内分泌腫瘍、子宮頸がんなどから選択される疾患である。
以下の実験に関する節は唯一説明の目的のために提供され、添付の請求項で定義する発明の範囲を制限するものではない。実験に関する節では、添付の図面を参照し、以下のように説明する。
図１は本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの模式図である。（Ａ）本発明におけるウイルス発現ベクターの構造を示した。（Ｂ－Ｅ）本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの作用機序：（Ｂ）ウイルス発現ベクターの標的ゲノム変異をもつ標的細胞へのトランスダクション；（Ｃ）（ｉ）Ｃａｓ１２ａ酵素および二つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡIおよびｇＲＮＡII）の発現、ならびに第１および第２高分子複合体形成のため後者のエンドヌクレアーゼ酵素への結合；（ｉｉ）第１および第２高分子複合体のベクター上および細胞ゲノム上に存在する標的配列（第１標的配列および第２標的配列）への移行、ならびに緑色蛍光強化タンパク質（ＥＧＦＰ）が付加的に接続したＴＫ酵素をコードする配列の切り出しを伴う、それらの配列におけるＤＮＡの切断；（Ｄ）ＥＧＦＰ－ＴＫをコードする配列の、標的ゲノム配列で切断された二本鎖への相同性修復による挿入；（Ｅ）変更された細胞へのガンシクロビルの投与。ガンシクロビルはＴＫ酵素により、細胞死を引き起こす毒性のある組成物へと変換される。
図２は、ＦＡＣＳ解析により決定した細胞死の数値を示したグラフである。ガンシクロビル（ＣＣＶ）存在下（＋）および非存在下（－）における、標的変異をもつように操作した培養ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）および野生型培養ＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）について、レンチウイルスベクターを導入（ＬＶ＋ＴＫ）、何も導入しない（ＣＴＲ）、ＥＧＦＰ－ＴＫカセットを除いたレンチウイルスベクターを導入（ＬＶ－ＴＫ）、ＥＧＦＰ－ＴＫ配列を構成的にコードするレンチウイルスベクターを導入（ｐＥＧＦＰ－ＴＫ）。ガンシクロビル処置（ＧＣＶ，０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在、または非存在下で３日間経過後、細胞数の７０％の減少が本発明のＣＲＩＳＰＲシステムを導入した変異型ＨＥＫ２９３細胞において検出され、８０％の減少が構成的にＥＧＦＰ－ＥＫ配列をコードするレンチウイルスベクターを導入した変異型および野生型ＨＥＫ２９３細胞において検出された。
図３はＣａｓ１２ａ酵素によるレンチウイルスベクター、および標的ゲノム上における切断過程の模式図であって、終止コドンを導入する変異が、自殺遺伝子の翻訳を可能にするために、ＥＧＦＰ－ＴＫ配列（コーディングカセット）の該コーディング配列の３’（下流）の標的ゲノムへの正常な組み込み後も残留することを示している。２つの異なるｇＲＮＡがＣａｓ１２ａ酵素を標的配列に誘導するために用いられる。ｇＲＮＡ（ａ）：コーディングカセットの５’領域に特異的な任意の配列；ｇＲＮＡ（ｂ）：変異遺伝子およびコーディングカセットの３’領域に特異的な変異を含む配列。（Ａ）レンチウイルスベクター内に存在するＥＧＦＰ－ＴＫ配列（コーディングカセット）の詳細。粘着末端を生じるＣａｓ１２ａ酵素の切断部位を点線で示した；（Ｂ）標的変異を含むＴＰ５３ゲノム配列の詳細。粘着末端を生じるＣａｓ１２ａ酵素の切断部位を点線で示した。ＴＧＡ終止コドンを枠線で囲み、アスタリスクをつけて示した。（Ｃ）Ｃａｓ１２ａ酵素によりレンチウイルスベクターから切り出されたコーディングカセットの、標的変異を含むＴＰ５３ゲノム配列内への挿入の模式図。
図４はＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、野生型インテグラーゼを感染させた場合と不活性型インテグラーゼを導入した場合を比較した結果を示す。（Ａ）野生型インテグラーゼを特徴とするレンチウイルスに感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は感染から４、８、１１、１５、および１８日後でもＧＦＰレポータータンパク質が変わらず発現することを示す。（Ｂ）一方、不活性型インテグラーゼを特徴とするレンチウイルスに感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、感染から８日後ですでにＧＦＰレポータータンパク質の発現減少を示し、１１日後には、未処置のコントール（Ｃ）と同様であり、完全に除去されたことを示す。
図５はＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、感染から４８時間後のＣａｓ１２ａ酵素の発現量を測定するために実行したｑＰＣＲの結果を示し、（Ａ）野生型インテグラーゼを持つウイルスに感染させた場合と（Ｂ）不活性型インテグラーゼを持つウイルスに感染させた場合を比較した。ＬＶ－ＴＫ：ＥＧＦＰ－ＴＫカセットを持たないレンチウイルスベクターで、カセットの切り出しを誘導する標的配列を含まない。ＬＶ＋ＴＫ：ＥＧＦＰ－ＴＫカセットを持つレンチウイルスベクターで、カセットの切り出しを誘導する配列を含む。（Ａ）ＬＶ－ＴＫまたはＬＶ＋ＴＫをもつ野生型インテグラーゼウイルスに感染後、Ｃａｓ１２ａ酵素の発現に違いは見られない。（Ｂ）ＬＶ－ＴＫまたはＬＶ＋ＴＫをもつ不活性型インテグラーゼウイルスに感染後、Ｃａｓ１２ａ酵素の発現に顕著な違いが見られる。野生型および不活性型インテグラーゼを持つＧＦＰウイルスはネガティブコントロールとして用いた、なぜなら、ＧＦＰベクターはＣａｓ１２ａ酵素をコードする配列を含まないためである。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）：ハウスキーピング遺伝子。
実施例１：実験的モデルの構築
がんの進行や薬剤耐性においてＴＰ５３遺伝子が重要な役割をはたしていることから、本発明者らは、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの有効性と特異性を評価するために、この実験モデルを選択した。前述のように、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムは、ウイルスのトランスダクションを通じて、細胞死を促進するタンパク質（例えば、チミジンキナーゼ、ＴＫ）をコードする遺伝子を、例えば腫瘍細胞といった標的細胞に挿入することができる。本発明者によって行われた実験は、ＴＰ５３遺伝子の腫瘍特異的な変異を本発明のＣＲＩＳＰＲシステムにおけるゲノム標的として用い、通常細胞にはいかなる損傷も引き起こさず、腫瘍細胞においてのみ細胞死を誘導するという本システムの作用を実証した。表１にＴＰ５３遺伝子の変異に関連する腫瘍を示した。
Figure 2022521462000001
実験的な研究のために、血液性腫瘍、さらに特には、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病を選択した。本発明におけるＣＲＩＳＰＲシステムを初めに、ＴＰ５３遺伝子の標的変異（ｃ．５４８Ｃ＞Ｇ；ｐ．Ｓｅｒ１８３）をもつように操作したＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７、および患者から単離したＴＰ５３遺伝子変異をもつＢ－ＣＬＬ細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。
本発明のＣＲＩＳＰＲシステムのＢ－ＣＬＬ標的細胞に対しての特異性を増すために、シュードタイプＨＩＶ由来レンチウイルスベクターを設計、作成したが、これは細胞ゲノムに組み込む能力を持たず、麻疹ウイルスのエンベロープ糖タンパク質および抗ＣＤ２０／ＣＤ５抗体を用いることでＢ細胞を特異的に標的とする（Funke S., et al, “Targeted cell entry of lentiviral vectors, (2008) Mol Ther. 16(8):1427-36）。本発明者がおこなった様々な実験的方法の段階を以下で説明する。
材料と方法
実施例２：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離と細胞培養条件
慢性リンパ性白血病のリンパ球を準備するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を白血病患者の血液サンプルから単離した。血液サンプルは等量のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）（ＰＢＳ）で希釈した。希釈した血液を元の血液の量と等しい量のヒトＰａｎｃｏｌｌ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の上に注意深く重層した。ＰＢＭＣ層を形成させるため、このサンプルを３５０ｘｇで３０分間、室温で遠心分離した。遠心分離後、ＰＢＭＣ層をＰＢＳで１５ｍｌチューブに移した。ＰＢＭＣｓは３５０ｘｇで２０分間、室温で再度遠心分離した。つづいて、ＰＢＭＣは完全培養液に再懸濁させた。
ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ３２１６）、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ－２２）および初代ヒト線維芽細胞を１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。初代ヒト線維芽細胞は、ボランティアの提供者の皮膚生検から単離し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５０ユニット／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ＰＢＭＣは、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地、１０％ＦＢＳ、４ｍＭ Ｌ－グルタミンで培養した。
実施例３：レンチウイルスの構築、ｇＲＮＡの設計およびクローニング
レンチウイルス（ＬＶ）はＡｄｄｇｅｎｅ社より購入し、その後本発明におけるＣＲＩＳＰＲシステムが正常に機能するために必須の希望の配列を挿入するために変更した。第１および第２ｇＲＮＡ配列はマサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）で利用可能なプラットフォームを用いて設計、および選択した。第１および第２ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２（足場配列：ヌクレオチド（ｎｔ）１－２０；ガイド配列：ｎｔ２１－４３）、および配列番号３（足場配列：ｎｔ１－２０；ガイド配列：ｎｔ２１－４３）からなる。第２ガイドＲＮＡ、すなわち標的配列がウイルスベクター上にのみ存在しているｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、ベクターの他の領域ではなく、ＥＧＦＰ－ＨＳＶ－ＴＫ配列の近傍で排他的にハイブリダイズできる配列の中から選択した。以下の配列をウイルスベクターに挿入した：第１ｇＲＮＡ（配列番号２）および第２ｇＲＮＡ（配列番号３）をコードする配列、ＥＧＦＰ－ＨＳＶ－ＴＫカセット（配列番号４）、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ（配列番号５）、第１標的ヌクレオチド配列（配列番号６）、および第２標的ヌクレオチド配列（配列番号７）をコードする配列。以下の調節配列も同様に挿入した：Ｕ６プロモーター配列（配列番号８）を第１および第２ｇＲＮＡをコードする配列の上流に、および２つのＰＡＭ配列、第１ＰＡＭ配列（５’－ＧＡＴＡ－３’）を第１標的配列の下流に、第２ＰＡＭ配列（５’－ＴＡＴＣ－３’）を第２標的配列の下流に。当該配列の挿入は以下の標準的なクローニング手順で行った、典型的に以下の手順からなる：特異的な制限酵素によるＤＮＡ配列の切断、希望の配列の連結、正しい連結の確認、コンピテントな微生物細胞への形質転換、プラスミドＤＮＡの抽出。ＥＧＦＰ－ＨＳＶ－ＴＫカセットを全合成し、ＫｐｎＩ制限部位を用いてレンチウイルスベクターに挿入した。ｇＲＮＡの塩基配列は初めに、一本鎖ＤＮＡ断片として合成し、その後、続くＥｃｏＲI（第１ｇＲＮＡ）および、ＢａｍＨI（第２ｇＲＮＡ）酵素制限部位を用いてのＥＧＦＰ－ＨＳＶ－ＴＫカセット隣側への挿入のために、リン酸化、二本鎖化した。クローニングの正しさを確かめるために、このようにして得られたウイルス発現ベクターのＤＮＡをすべてシークエンスした（配列番号１として示す配列）。
実施例４：組み換えウイルスベクターの形質転換、選択、単離
組み換えウイルスベクターのＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、販売元の説明書に従って形質転換した、および“ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ”ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、販売元の説明書に従って単離した。形質転換された細胞はアンピシリン抗生物質で選択された。ＥＧＦＰレンチウイルスベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ，ｎｏ．２１３１６）はトランスダクションのポジティブコントロールとして用いた。
実施例５：ＴＰ５３遺伝子変異操作ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７
操作したＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞株は特定のＴＰ５３遺伝子変異（ｃ．５４８Ｃ＞Ｇ； ｐ．Ｓｅｒ１８３＊）を含むカセットをこれらのゲノムに無作為に挿入する事で得られた。点変異（Ｃ＞Ｇ）、およびｍＣｈｅｒｒｙ－ｂｓｒ配列を持つこのカセットを以前に報告のあるプラスミドに複製した（Severi F. and Conticello SG. Flow-cytometric visualization of C > U mRNA editing reveals the dynamics of the process in live cells. RNA Biol. 2015; 12:389-397）。ベクターは、実施例３節で説明した手順に沿って、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞株に導入した。トランスフェクション効率はｍＣｈｅｒｒｙ発現により検証した。
実施例６：ウイルス性トランスフェクションおよびトランスダクション
どちらも操作された形態の１．２×１０５ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞をウイルス性トランスフェクションおよびトランスダクションの実験に用いた。細胞は単独、または初代線維芽細胞と共培養し、２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、販売元の説明書に従って、細胞はレンチウイルス発現ベクター（全量２μｇ）、またはコントロールとしてＥＧＦＰレンチウイルスベクターをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した。細胞はトランスフェクションから４８時間、６日後にそれぞれフローサイトメトリーおよびＭＴＴ細胞増殖アッセイで解析した。ＨＩＶレトロウイルスベクターを生産するため、約５×１０５個のＨＥＫ２９３細胞に対し２００ｎｇの水泡口炎ウイルスＧタンパク質発現プラスミド（ＶＳＶ－Ｇ）および１μｇのＭＬＶＧＶｐｏｌ発現プラスミドをリポフェクタミン２０００で共導入した。トランスフェクションから４８時間後、ウイルスを含む上清を回収し、遠心およびろ過した。５μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）存在下で、総じて５×１０５個の細胞と２００μｌのウイルスをトランスダクションに用いた。
実施例７：オフターゲット解析
細胞のＣａｓ１２ａ酵素への暴露を小さくすることが本発明のＣＲＩＳＰＲシステムにおいて効果的であることを実証するために、本発明者は特異性実験を行った。初めの実験では、不活性型のインテグラーゼを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞と野生型インテグラーゼシステムを感染させた細胞を比較してレンチウイルスゲノムの持続性を解析した。ＧＦＰタンパク質をシステムのレポーターとして用い、野生型インテグラーゼを用いた、感染から１８日後の１００％ＧＦＰを発現する細胞と比較して、この実験は感染後一週間以内にウイルスゲノムが培養細胞からほとんど完全に除去されることを実証した（図４）。変異型または野生型インテグラーゼ存在下で、カセットの切断を誘導する標的配列を除去した等量のプラスミドから仲介されるＣａｓ１２ａの発現量と、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムに仲介されるＣａｓ１２ａの発現量も比較した。この比較は本発明の目標ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ１２ａの発現量が、異なるコントロールの条件と比較して顕著に減少することを示した（図５）。
実施例８：フローサイトフルオロメトリー解析（ＦＡＣＳ）およびＣａｓ編集の検証および単一変更細胞由来のクローン検出のための細胞選択
フローサイトフルオロメーター（ＢＤ）は５００００事象／ウェル取得した。そのデータはＦｌｏｗｊｏ ｖ７．５サイトフルオロメトリーソフトウェアによって解析された。この解析のために、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって遺伝子的に変更されたＨＥＫ２９３細胞を大きさおよび形態に基づいて選択した；そして、２度目の選択は、ＧＦＰポジティブな細胞を検出するために行われた、ここで、ＧＦＰタンパク質の発現は、細胞ゲノムにＨＳＶ－ＴＫ配列が正常に組み込まれたことを示す。
実施例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞解析
細胞は４８ウェルプレートに３連で、０．８×１０５細胞／ウェルの濃度で播種され、本発明におけるＨＳＶ－ＴＫレンチウイルス有りおよび無しで導入された。６日後、ガンシクロビル（ＧＣＶ）、チミジンキナーゼ基質、は１２μＭの濃度で細胞に投与され、細胞に接触した状態で４時間置いた。ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子はＧＣＶリン酸をＧＣＶ３リン酸へ変換するが、ＧＣＶ３リン酸は細胞複製の間にＤＮＡに取り込まれることで、ＤＮＡ合成を阻害し、細胞死を誘導する。細胞はその後、ガンシクロビル添加後の細胞生存率およびこの化合物の投与による死亡率を評価するために、３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）で解析された。ＭＴＴアッセイは細胞の代謝活性を推定する、なぜなら、ＭＴＴアッセイはミトコンドリアの活性を示す、生細胞における水溶性の黄色ＭＴＴ溶液の不溶性の紫色結晶への変換に基づいているためである。
結果
実施例１０：ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞におけるトランスフェクション
特にＴＰ５３遺伝子変異型に操作されたＨＥＬ２９３およびＭＣＦ７細胞株は異種細胞集団形成のためにヒト線維芽細胞と共培養した。ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞に、第１および第２ｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ａおよびＴＫ酵素をそれぞれコードする配列を持つ本発明におけるレンチウイルスベクターを、リポフェクタミンを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの成功を確認するために、ＴＫ遺伝子配列は、マーカーとして特に緑色蛍光強化タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する配列と、２Ａペプチド配列を挟んで接続した。よって、ＧＦＰポジティブな細胞は、ＴＫポジティブでもある。ＥＧＦＰ－ＴＫカセットを除いたレンチウイルスベクターおよび構成的にＥＧＦＰ－ＴＫ配列をコードするレンチウイルスベクターを、トランスフェクション実験のコントロールとして用いた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の結果はトランスフェクションの３日後にＦＡＣＳを用いて解析された。ポジティブに導入された細胞を選択するために、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって仲介されるゲノム編集が成功した細胞の量に比例するＥＧＦＰの発現に基づいて、細胞をＦＡＣＳによって回収した。マーカーシグナルにポジティブな細胞が高い割合で観察されたため、ＦＡＣＳ解析は、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが高い効率を持つことを実証した。
ＴＫ遺伝子をコードする配列の標的ゲノム部位への正しい組み込みを確認するために、ＦＡＣＳで回収された細胞から抽出されたＤＮＡは、ゲノム部位に組み込まれる配列特異的なプライマーを用いて増幅された。長さ８２２ｂｐと予測した増幅産物は、唯一本発明におけるレンチウイルスベクターを導入した、操作された細胞株由来ＤＮＡ抽出物に対して行った増幅反応液中から得られ、これは、特異的な標的変異を持つゲノム部位へのＴＫ遺伝子をコードする配列の組み込みの成功を示している。
つづいて、実験は、標的ゲノム部位に組み込まれたＴＫをコードする遺伝子の機能性を評価するために、上記のように導入した遺伝子操作したＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７、野生型ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７を用いて行われた。簡単に記載すると、トランスフェクションから６日後、ＥＧＦＰポジティブな細胞をＦＡＣＳにより選択した。回収された細胞は、ガンシクロビル０．１ｍｇ／ｍｌの濃度での存在下、および非存在下でインキュベートした。インキュベーションから３日後に次のＦＡＣＳ解析を行ったところ、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムを導入した変異型ＨＥＫ２９３細胞では７０％の細胞死の値が報告され、構成的にＥＧＦＰ－ＴＫ配列をコードするレンチウイルスベクターを導入した変異型および野生型ＨＥＫ２９３サンプルでは８０％の細胞死の値を検出した（図２）。ＭＴＴ細胞生存アッセイからも類似の結果が得られた。実際、ＭＴＴ比色解析は、コントロールと比較して本発明のＣＲＩＳＰＲシステムで変更された細胞の顕著な割合がガンシクロビル処置で死ぬことを明らかにし、これはＴＫをコードする配列が正しく標的ゲノム部位に組み込まれ、発現した酵素がガンシクロビルを細胞に有害な毒性化合物に変換することができたことを示している。
実施例１１：ＴＰ５３遺伝子変異および非変異の白血病リンパ球の培養およびトランスダクション
解析された細胞株において本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの効率性が確かめられた後、本発明者は該システムを初代細胞株において検証した。Ｂ－ＣＬＬ患者の血液サンプルから単離された白血病リンパ球であって、本発明のレンチウイルスベクターにコードされた第１ｇＲＮＡの標的ゲノム配列を提示する特定のＴＰ５３遺伝子変異を持つ白血病リンパ球およびＴＰ５３非変異白血病リンパ球の両者を含むリンパ球を標的細胞として用いた。Ｂリンパ球はトランスフェクションおよびトランスダクションが難しいことが文献から知られているため、本発明におけるレンチウイルスベクターをＴＰ５３遺伝子変異および非変異白血病Ｂ細胞にトランスダクションする方法として、エレクトロポレーション法を選んだ。ＴＰ５３遺伝子変異を持つリンパ球集団のみにおいて、ＥＧＦＰ－ＴＫカセットの変異ゲノム部位への組み込みが成功していることを、実施例８に説明する方法における、ＦＡＣＳ解析およびＤＮＡ増幅によって実証した。
実施例１２：ウイルス生産およびトランスダクション
本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの効率性をｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株において実証した後で、本発明者は標的細胞に感染することができるウイルス粒子を生産した。レンチウイルス粒子（Ａｄｄｇｅｎｅ）は販売元に指示された標準的なウイルス産生手順に従って生産した。この目的のため、ＨＥＫ２９３細胞株の細胞に、ウイルスタンパク質のパッケージングが可能なプラスミド、ウイルスのエンベロープタンパク質の産生を駆動するプラスミド、および本発明のレンチウイルス発現ベクター、一緒にレンチウイルスベクター自身の自己分解を避けるために必要な変更Ｃａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）をコードする四つ目のプラスミド、を導入した。実際に、ｄＣａｓ９が存在しない場合、一度細胞内に入ったレンチウイルスベクターは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ａ酵素を発現し高分子システムに複合体化することで、ＥＧＦＰ－ＴＫカセットをベクターから切り出し得るため、後者が開裂および分解される結果となる。一方で、触媒活性を失活しているｄＣａｓ９が存在すると、ｇＲＮＡ分子に誘導されたこの酵素は、ベクター上の標的配列に結合し、Ｃａｓ１２ａがそれらを認識することを防ぐ。よってこのエンドヌクレアーゼは標的部位の二本鎖を切断できない。
代わりとして、レンチウイルスベクターの自己分解を避けるために、変更エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ１２ａ）を使用し得る。この戦略はｄＣａｓ１２ａをコードするプラスミドを、ウイルスタンパク質のパッケージングが可能なプラスミドおよびウイルスエンベロープタンパク質の産生を駆動するプラスミド、両者ともにウイルス生産に必須である、と共にＨＥＫ２９３細胞に導入することを含む。変更エンドヌクレアーゼの役割は、ガイドＲＮＡ分子と結合し、それらを隔離することであり、よって使用できる遊離ｇＲＮＡの量が少ないために作用可能なＣａｓ１２ａが標的部位を標的とできなくなる。
本発明者は上記のように生産したウイルス粒子を通常およびＴＰ５３変異型ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞株に感染するように使用した。標的ゲノム部位における正常なＥＧＦＰ－ＴＫカセットの組み込みの存在を、感染から２日後、細胞サンプルをＦＡＣＳ解析の対象とすることで評価した。緑色蛍光シグナルがＣＲＩＳＰＲシステムの標的細胞、すなわち変異型細胞にのみ局在した。これらの結果は細胞から抽出したゲノムＤＮＡを増幅し、期待される８２２ｂｐのバンドの存在が、変異を持つカセットを持つウイルスに感染した細胞でのみ検出されたことから確認された。

Claims (21)

  1. 標的細胞内の少なくとも一つの標的ゲノム配列を標的とする、非自然的に発生または操作された「規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連の（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）」システムであって、このシステムは以下を含むウイルス発現ベクターを含む：
    １）粘着末端を生成し得るエンドヌクレアーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であって、ベクター上に位置する１以上の調節配列と作動可能に接続している該ヌクレオチド配列；
    ２）細胞死を促進し得るタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ベクター上に位置するいかなる調節配列とも作動可能に接続していない該ヌクレオチド配列；
    ３）細胞死を促進し得るタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３’末端の下流および５’末端の上流にそれぞれ位置する第１標的ヌクレオチド配列および第２標的ヌクレオチド配列であって、両者がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ヌクレオチド配列の３’末端の下流に位置する第１標的ヌクレオチド配列および第２標的ヌクレオチド配列；
    ４）ベクター上に位置する１以上の調節配列と作動可能に接続している第１ガイドＲＮＡ（第１ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該第１ｇＲＮＡがエンドヌクレアーゼ酵素と結合できる第１足場ヌクレオチド配列および第１標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第１ガイドヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列；および
    ５）ウイルス発現ベクター上に位置する１以上の調節配列と作動可能に接続している第２ガイドＲＮＡ（第２ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該第２ｇＲＮＡがエンドヌクレアーゼ酵素と結合できる第２足場ヌクレオチド配列および第２標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第２ガイドヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、ここで、第１標的ヌクレオチド配列はＣＲＩＳＰＲシステムの標的となる標的細胞内の少なくとも一つの標的ゲノム配列に相当する。
  2. 第１標的ヌクレオチド配列および第２標的ヌクレオチド配列が同一または異なる、ならびに第１標的ヌクレオチド配列および第２標的ヌクレオチド配列がエンドヌクレアーゼ酵素による切断で生成されるそれぞれの粘着末端の一本鎖突出部分が相補的な配列であるように選択される、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲシステム。
  3. 第１標的ゲノム配列および第２標的ゲノム配列を標的とする請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲシステムであって、第１標的ゲノム配列が第１標的ヌクレオチド配列に相当する、および第２標的ゲノム配列が第２標的ヌクレオチド配列に相当する、ＣＲＩＳＰＲシステム。
  4. エンドヌクレアーゼ酵素が異なるＰＡＭ配列に結合し得るＣａｓ１２ａおよびその変異体からなる群より選択される、請求項１～３の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステム。
  5. 細胞死を促進し得るタンパク質がチミジンキナーゼ酵素である、請求項１～４の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステム。
  6. ＣＲＩＳＰＲシステムの標的となる標的細胞内の少なくとも一つの標的ゲノム配列が１以上の遺伝子変異を含む、請求項１～５の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステム。
  7. 遺伝子変異が、ＴＰ５３遺伝子の変異、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ遺伝子の変異、ＮＲＡＳ遺伝子の変異、受容体の細胞外ドメインをコードする領域におけるＥＧＦＲ遺伝子の変異、ＨＥＲ２遺伝子の増幅、ＥＭＬ４／ＡＬＫの転座、およびＭＥＴ、ＰＫ３ＣＡおよびＥＲＢ２遺伝子の変異、およびそのいかなる組み合わせ、からなる群より選択される、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲシステム。
  8. ウイルス発現ベクターがさらに、インテグラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であって、
    該酵素の活性を抑制し得る変異を含んだヌクレオチド配列を含む、請求項１～７の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステム。
  9. 標的細胞が真核細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項１～８の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステム。
  10. 請求項１～９の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステムを含むウイルス粒子。
  11. レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される、請求項１０に記載のウイルス粒子。
  12. キメラカプシドタンパク質を含む請求項１０または１１に記載のウイルス粒子であって、該キメラカプシドタンパク質がＣＲＩＳＰＲシステムの標的となる標的細胞表面に発現した少なくとも一つのマーカーに結合可能なドメインを含む、ウイルス粒子。
  13. 該ドメインが抗体、成長因子、またはリガンドである、請求項１２に記載のウイルス粒子。
  14. 該マーカーが、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＢＣＲタンパク質、およびそのいかなる組み合わせ、からなる群より選択される、請求項１２または１３に記載のウイルス粒子。
  15. 標的細胞におけるアポトーシスを促進するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であり、該方法が以下の手順を含む：
    －標的細胞に請求項１～９の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステム、および／または請求項１０～１４の何れかに記載の少なくとも一つのウイルス粒子を導入する、および
    －エンドヌクレアーゼ酵素および第１および第２ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現を誘導するため、ならびに第１ｇＲＮＡと関連するエンドヌクレアーゼ酵素を含む第１高分子複合体および第２ｇＲＮＡと関連するエンドヌクレアーゼ酵素を含む第２高分子複合体の形成を得るために、適切な条件下で導入細胞を培養する。
  16. 細胞死を促進し得るタンパク質がチミジンキナーゼ酵素である、請求項１５に記載の方法。
  17. さらに標的細胞にチミジンキナーゼの基質、好ましくはガンシクロビルを接触させる手順を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 標的細胞が真核細胞、好ましくはヒト腫瘍細胞である、請求項１５～１７の何れかに記載の方法。
  19. 請求項１～９の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステムおよび／または請求項１０から１４の何れかに記載の少なくとも一つのウイルス粒子を含む、単離された標的細胞。
  20. 医薬品としての使用のための、請求項１～９の何れかに記載のＣＲＩＳＰＲシステム、または請求項１０から１４の何れかに記載のウイルス粒子。
  21. Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、肺扁平上皮がん、肺腺がん、卵巣がん、大腸がん、食道がん、頭頸部がん、喉頭がん、皮膚がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、乳がん、子宮がん、軟部組織肉腫、骨がん、内分泌腫瘍、および子宮頸がんからなる群より選択される疾患の治療処置における使用のための、請求項２０に記載のＣＲＩＳＰＲシステムまたはウイルス粒子。
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