CN111961670A - 特异性靶向Pd-l1基因的sgRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异性靶向Pd‑l1基因的sgRNA及其应用，本发明公开了具有较高切割活性以及特异性的sgRNA，本发明同时公开了构建敲除PD‑L1的细胞的方法及由该方法构建的细胞株；本发明同时还公开了包含sgRNA或其表达载体的药物组合物。

Description

特异性靶向Pd-l1基因的sgRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及特异性靶向Pd-l1基因的sgRNA及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，随着其诊断和治疗手段不断改善，患者的生存率有了明显提高。但三阴性乳腺癌作为最难治疗的乳腺癌亚型之一，仍然严重威胁着患者的生命健康。三阴性乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体均为阴性的乳腺癌，约占乳腺癌的15％～20％，其恶性程度高、缺乏有效的早期诊断和病程监测标志物、缺少特异性治疗靶点且预后不良(Chavan SS,Pavlov VA,Tracey KJ.Mechanisms andTherapeutic Relevance of Neuro-immune Communication.Immunity.2017.46(6):927-942；Pavlov VA,Chavan SS,Tracey KJ.Molecular and Functional Neuroscience inImmunity.Annu Rev Immunol.2018.36:783-812)。超过三分之一的三阴性乳腺癌患者会出现远处转移(Jensen DD,Lieu T,Halls ML,et al.Neurokinin 1receptor signaling inendosomes mediates sustained nociception and is a viable therapeutic targetfor prolonged pain relief.Sci Transl Med.2017.9(392).)，远处转移是患者死亡的主要原因之一，肺脏是乳腺癌最常见的转移部位。

现今，在肿瘤临床治疗中，使用阻断免疫细胞表面的免疫检查点抗体进行的免疫治疗是常用的治疗手段。免疫检查点(Immune Checkpoints)是调节系统性免疫稳态与耐受的信号通路。诸多研究表明，肿瘤细胞表面高表达免疫检查点配体，通过结合免疫细胞的免疫检查点达到抑制肿瘤免疫的效果。这一效果在肿瘤抗原特异性的效应T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的肿瘤抑制中尤为突出。特定的免疫检查点的阻断，比如PD-1，能够增强抗肿瘤免疫反应。但是，利用免疫检查点抗体的治疗并非对所有癌症均有效果。有些恶性肿瘤虽然过表达PD-L1，但对抗PD-1/PD-L1抗体治疗不敏感(Llorián-Salvador M,Pevida M,González-Rodríguez S,et al.Analgesic effects evoked by aCCR2 antagonist or an anti-CCL2 antibody in inflamed mice.Fundam

Clin Pharmacol.2016.30(3):235-47.)，且还存在抗体药物作用的短效性、免疫检查点的多样性、药物研发时间过长、抗体价格昂贵等诸多不利因素。

设计和制备出具有精确性和特异性靶向免疫检查点基因的sgRNA，敲除表面免疫检查点相关基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种新的策略。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供靶向Pd-l1基因的sgRNA及其在敲除Pd-l1基因以及构建敲除PD-L 1基因的细胞中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了特异性敲除Pd-l1基因的sgRNA，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1-12所示的序列的任意一种或几种。

进一步，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1～4所示的序列。

本发明的第二方面提供了一种包含本发明第一方面所述的sgRNA的表达载体。

本发明的第三方面提供了构建敲除PD-L1细胞株的方法，所述方法利用CRISPR/Cas9技术向目标细胞中引入本发明第一方面所述的sgRNA，得到PD-L1敲除的细胞株。

进一步，包括步骤：

1)构建携带Pd-l1基因sgRNA寡核苷酸的重组质粒；

2)构建过表达Cas9的4T1-luc稳转细胞株；

3)sgRNA重组质粒转染过表达Cas9的4T1-luc细胞；

4)用T7ENI酶切检测，或TA克隆测序验证敲除效率和基因修饰的具体模式。

进一步，1)包括步骤：

a.扩增含有sgRNA的片段；

b.将扩增产物与质粒连接；

c.将连接产物进行转化、鉴定。

进一步，a中所述sgRNA为多重sgRNA；优选地，多重sgRNA为表1所示的sgRNA1/sgRNA2。

进一步，扩增多重sgRNA的引物序列如SEQ ID NO.15～16所示。

进一步，扩增sgRNA的模板为pUC57-U6-sgRNA。

进一步，b中的连接质粒为pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro。

进一步，2)中通过使用pLenti-CMV-blasticidin-P2A-3Flag-Cas9慢病毒感染4T1-luc构建过表达Cas9的4T1-luc稳转细胞株。

进一步，4)中所述T7ENI酶切检测包括使用扩增sgRNA识别位点的DNA片段的引物。

进一步，所述引物序列如SEQ ID NO.13～14所示。

本发明的第四方面提供了一种敲除PD-L1的细胞，所述细胞使用本发明第三方面所述的方法构建。

进一步，所述细胞为三阴乳腺癌细胞。

本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的sgRNA或本发明第二方面所述的表达载体。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明第一方面所述的sgRNA在敲除Pd-l1基因或构建敲除PD-L1的细胞中的应用；

2)本发明第二方面所述的表达载体在敲除Pd-l1基因或构建敲除PD-L1的细胞中的应用；

3)本发明第一方面所述的sgRNA在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用；

4)本发明第二方面所述的表达载体在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用；

5)本发明第一方面所述的sgRNA在制备治疗PD-L1相关疾病中的药物中的应用；

6)本发明第二方面所述的表达载体在制备治疗PD-L1相关疾病中的药物中的应用；

7)本发明第三方面所述的方法在制备敲除PD-L1细胞系中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果和优点：

本发明通过对sgRNA序列的筛选条件进行限定，并且结合一对sgRNA组合物进行基因敲除，大大减少了脱靶效率，提高了基因编辑效率以及临床使用的可行性，并且降低了安全风险。

本发明提供了转移性降低的三阴性乳腺癌细胞株，该细胞株除了转移性降低，增殖、凋亡等性能与野生型相比，并无显著变化。

附图说明

图1是Western blot检测细胞Cas9表达水平图；

图2是小鼠三阴性乳腺癌细胞PD-L1敲除效率检测图；其中，图A是流式细胞术检测单克隆细胞PD-L1表达水平的代表性图；图B是Western blot检测单克隆细胞PD-L1表达水平的代表性图；

图3是随机选择的3个4T1/Pd-l1 KO单克隆细胞突变模式示意图。

图4小动物活体成像法检测敲除PD-L1对小鼠乳腺癌细胞在Balb/c小鼠中肺转移的影响图；其中，图A是体内成像的代表性图；图B是肺部荧光强度统计分析图；

图5是大体标本观察敲除PD-L1对小鼠乳腺癌细胞在Balb/c小鼠中肺转移的影响图；

图6是CCK-8实验检测敲除PD-L1对小鼠三阴性乳腺癌细胞体外增殖能力的影响图；

图7是平板克隆形成实验检测PD-L1的表达对小鼠三阴性乳腺癌细胞克隆形成能力的影响图；其中，图A是平板克隆形成实验的代表性图；图B是每个复孔中克隆形成数量统计分析图；

图8是通过皮下瘤生长情况判断敲除PD-L1对小鼠三阴性乳腺癌细胞体内增殖能力的影响图，其中，图A是皮下瘤体积统计分析图；图B是皮下瘤大体标本照片；图C是皮下瘤瘤重统计分析图；

图9是划痕实验检测敲除PD-L1或使用抗PD-L1抗体对小鼠三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响图；其中，图A是划痕实验代表性图；图B是划痕愈合速度统计分析图；

图10是流式细胞术检测敲除PD-L1对三阴性乳腺癌细胞抗失巢凋亡能力的影响图，其中，图A是流式细胞术检测细胞凋亡率的代表性图；图B是细胞凋亡率的统计分析图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，设计了具有较高切割效率的sgRNA，并对sgRNA进行

构建了多重sgRNA表达载体。以此载体转染小鼠三阴性乳腺癌细胞系4T1构建并获得敲除Pd-l1的细胞株，所述细胞株的迁移能力降低，但是增殖、克隆形成、凋亡能力无显著变化。

术语“sgRNA”即“单一引导RNA(Single-guide RNA，sgRNA)”，其是基于“目标基因上的靶位点”设计，其包含的序列足以与内切核酸酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA双链断裂。

术语“表达载体”是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

如本文所用，术语“载体”是指能够在适当的宿主细胞中表达靶蛋白质的表达载体和包含基因插入序列以可表达的方式可操作地连接的基本调节元件的基因构建体。

如本文所用，术语“Cas9蛋白”是指CRISPR/Cas9系统的主要蛋白质元素，其与crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(反式激活性crRNA)形成复合物以形成活化的内切核酸酶或切口酶。CRISPR/Cas9系统是一种RNA引导的基因工程工具，它能够引起靶点特异性的DNA双链断裂，这种断裂能够激发内源性的DNA修复机制，包括NHEJ和同源重组(Homologydirected repair，HDR)等。NHEJ是一种低保真度的DNA修复，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，实现剪接的改变。

此外，Cas9蛋白质不仅可包括野生型Cas9，还可包括失活的Cas9(dCas9)或Cas9变体诸如Cas9切口酶。其中，失活的Cas9可为包含与dCas9结合的FokI核酸酶结构域的RFN或与转录激活因子或阻遏物结构域结合的dCas9；Cas9切口酶可为D10ACas9或H840ACas9，但不限于此。

本发明的Cas9蛋白在其来源上不受限制。例如，Cas9蛋白可以来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜肺性军团病杆菌(Legionellapneumophila)、无害李斯特(氏)菌(Listeria innocua)或变形链球菌(Streptococcus mutans)。

作为本发明可选择的实施方式，靶向PD-L1的sgRNA如sgRNA1～6所示，每条sgRNA包括配对的两条链(正义链和反义链)，序列分别如SEQ ID NO.1～12所示。

作为一种优选地实施方式，所述靶向PD-L1的sgRNA如sgRNA1～2所示，每条sgRNA包括配对的两条链(正义链和反义链)，序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。作为本发明的优选地实施方式，上述sgRNA的序列所导向的位置是非常合适的，能够高效地引导Cas9酶进行DNA双链的断裂，引发PD-L1功能受损。更特别地，所述的sgRNA能够产生更高的打靶效率和更丰富的突变模式。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物是包括藉由CRISPR/Cas9基因编辑法破坏PD-L1的试剂。

所述的药物组合物中，还可含有药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例sgRNA的设计及

1、sgRNA设计与序列合成

在UCSC Genome Browser Home网站搜索鼠源Pd-l1基因CDS序列，设计针对CDS区的组成性外显子的sgRNA，共设计6条配对sgRNA(sgRNA序列见表1)。为了形成粘性末端，以便与Bsa I酶切后的pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接，在sgRNA正义链的5'端添加ACCG，反义链的5'端添加AAAC。sgRNA由金唯智公司合成。

表1 6条靶向Pd-l1基因的sgRNA序列

2、sgRNA重组质粒构建

(1)构建带有粘性末端的sgRNA双链片段：将反向互补的两条寡核苷酸单链热变性、退火。PCR反应体系：sgRNA正义链2μl(100μmol/L)，sgRNA反义链2μl(100μmol/L)，NEBufferⅡ2μl，去离子水补至20μl；PCR反应条件：95℃，5min；95℃，1s(-2℃/循环)，共6个循环；85℃，1s(-0.1℃/循环)，共601个循环；

(2)将sgRNA双链片段与Bsa I单酶切后的pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接。连接反应体系：酶切后的载体12ng，双链sgRNA片段2μl，5×T4 DNA连接酶缓冲液1μl，T4 DNA连接酶0.5μl，去离子水补至5μl。PCR反应条件：16℃，2h；

(3)连接产物进行转化，挑克隆，提质粒，送公司测序。

3、转化、挑克隆、提质粒

3.1转化

(1)将DH5α感受态细胞和连接产物置于冰上；

(2)在无菌操作台内取出1.5ml离心管，将10μl感受态细胞和5μl连接产物加入离心管中并吹打混匀，冰上静置30min；

(3)将装有感受态细胞和连接产物的1.5ml离心管放入42℃水浴锅内热激90s；

(4)立即将离心管插入冰上静置2min；

(5)加入100μl无菌LB培养基，吹打混匀，倾斜放于37℃摇床中，200rpm摇40min；

(6)将含氨苄抗生素的细菌培养板和无菌钢珠从4℃拿出，在室温下复温，摇菌结束后吸取50μl菌液滴加在细菌培养板上，倒入适量无菌钢珠，轻轻晃动培养板，使菌液均匀涂抹于细菌培养板上；

(7)倒扣培养板，使培养板胶面朝上，置于37℃恒温培养箱内培养12h后观察克隆生长情况。

3.2挑克隆、摇菌

(1)在无菌操作台中取出15ml离心管，在其中加入3ml无菌LB培养基和3μl浓度为50mg/ml的氨苄抗生素，吹打混匀；

(2)用无菌镊子夹取小白枪头，将生长良好且边缘清楚的克隆轻轻挑出，放入准备好的15ml离心管内；

(3)盖上离心管盖子但不要拧紧，以保持气体交换，用胶布固定盖子，倾斜放于37℃摇床内摇12h，转速为200rpm。

3.3质粒提取

(1)将菌液吸入1.5ml离心管中，离心10000g，1min，弃上清，菌液量大时分次收集；

(2)加入250μl无色重悬溶液(Resuspension Buffer)和2.5μl RNase A(10mg/ml)，充分吹打混匀；

(3)加入250μl裂解溶液(Lysis Buffer)，温和地上下翻转离心管，使菌体充分裂解，颜色由半透亮变为透亮蓝色时提示完全裂解(不宜超过5min)；

(4)裂解结束立即加入350μl黄色中和溶液(Neutralization Buffer)，温和地翻转混合多次，直至形成紧实的黄色凝集块(颜色由蓝色完全变成黄色，提示中和完全)，室温静置2min；

(5)12000g离心5min，小心吸取上清加入离心柱中；

(6)12000g离心1min，流出液再次过柱离心(防止损失)，然后弃流出液；

(7)向离心柱中加入650μl洗液(Wash Buffer)，12000g离心1min，弃流出液；

(8)12000g再次离心2min，彻底去除残留的洗液；

(9)将离心柱小心移入一干净的1.5ml离心管中，在柱的中央加入30μl预热的去离子水，室温静置3min；

(10)10000g离心1min，洗脱DNA，为防止损失，再将洗脱下来的DNA溶液过柱1次，10000g离心，2min；

(11)测取260nm紫外线下光密度(OD值)，测定所提质粒浓度，做好标记并于-20℃保存。

3.4琼脂糖凝胶电泳

(1)配制1％琼脂糖凝胶：0.6g琼脂糖粉末溶于60ml 1×TAE中，放入微波炉中用中高火加热3min，待溶液稍冷却，加入5μl溴化乙锭溶液(10mg/ml)，晃匀后倒入制胶板内，室温静置30min；

(2)加样：在第一个孔内加入5μl Marker用于指示目的条带大小，将DNA样品与6×DNA Loading Buffer按比例混合均匀后按顺序加入后面的凝胶孔内；

(3)电泳：恒压160V，20min，当溴酚蓝移动到胶面下1/3处停止电泳；

(4)电泳完毕后取出凝胶，在成像仪中成像。

4、细胞转染

(1)转染前24h，将NIH 3T3细胞按1×10⁵/孔接种于12孔板中；

(2)转染前1h更换预热的800μl新鲜培养基；

(3)稀释待转质粒：用100μl 1×Opti-MEM I培养基稀释待转质粒，质粒总质量为2μg，其中Cas9表达载体与sgRNA重组质粒的质量比为2:1，吹打混匀；

(4)稀释Lipofectamine 2000：Lipofectamine 2000颠倒混匀后吸取5μl加入100μl 1×Opti-MEM I培养基，充分混匀后室温静置5min；

(5)将Lipofectamine 2000稀释液逐滴加入质粒稀释液中，轻柔吹打混匀，室温静置20min；

(6)将混合液均匀滴加入对应孔中，每加完一个孔立即轻轻晃动培养板，对照组加200μl1×Opti-MEM I培养基补齐体系，放入孵箱中培养；

(7)转染6h后，将培养基更换为新鲜培养基；

(8)转染24h后，加入1μg/ml的嘌呤霉素进行药物筛选；

(9)转染72h后提基因组DNA。

5、T7EN I酶切检测sgRNA介导的切割效率

(1)设计T7EN I检测引物：设计合适的T7ENI检测引物，使之能扩增出含有sgRNA识别位点的DNA片段。引物序列：

上游引物5’-TAGGTGCAATCCCAACACCAG-3’(SEQ ID NO.13)，下游引物5’-TGATTCGCTTGTAGTCCGCA-3’(SEQ ID NO.14)，扩增片段长度为712bp。

(2)PCR扩增：反应体系为，基因组DNA 200ng，T7EN I检测引物4μl(10μmol/L)，

FastPfu Fly Buffer 20μl，dNTPs 8μl，

FastPfu Fly DNAPolymerase 2μl，去离子水补至100μl。反应条件为，95℃2min；95℃20s，60℃20s(-0.2℃/循环)，72℃1min，共30个循环；72℃5min。

(3)T7EN I酶切：退火体系：纯化后的PCR产物200ng，10×T7EN I Buffer2μl，去离子水将体系补至20μl。反应条件：95℃，5min；95℃，1s(-2℃/循环)，共6个循环；85℃，1s(-0.1℃/循环)，共601个循环。反应结束后，立即将产物取出置于冰上，在体系中补加0.5μlT7EN I酶，37℃孵育25min。

(4)进行琼脂糖凝胶电泳，并分析成像结果，选择切割效率较高的sgRNA。

表2单一sgRNA切割效率

6、设计多重sgRNA引物

根据T7EN I酶切结果(表2)和多重sgRNA设计原则，筛选出切割活性高的2条配对sgRNA(分别为sgRNA1和sgRNA2)。以pUC57-U6-sgRNA载体为模板，设计含有这两条配对sgRNA的多重sgRNA引物序列，引物序列如下所示。

正向引物：

5’-ATGCGTCTCAACCGCCACCACGTACAAGTCCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’(SEQ IDNO.15)；

反向引物：

5’-ATGCGTCTCGAAACGCTCCCGTTCTACAGGGAACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG-3’(SEQ IDNO.16)。

7、多重sgRNA重组质粒的构建

多重sgRNA重组质粒的构建

(1)扩增含有sgRNA1/sgRNA2的片段：以pUC57-U6-sgRNA载体为模板，用多重sgRNA引物扩增出含有sgRNA1/sgRNA2的PCR产物，PCR反应体系：pUC57-U6-sgRNA 10ng，引物2μl(10μmol/L)，dNTPs 4μl，

FastPfu Fly Buffer 10μl，

FastPfuFly DNA Polymerase 1μl，去离子水补至50μl。PCR反应条件：95℃2min；95℃20s，60℃20s(-0.2℃/循环)，72℃40s，共30个循环；72℃5min。

(2)酶切、连接：将纯化后的PCR产物与pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体进行酶切、连接，反应体系：纯化后的PCR产物200ng，pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体200ng，5×T4 DNA连接酶缓冲液3μl，T4 DNA连接酶1μl，Esp3 I 1μl，去离子水补至20μl。反应条件：37℃10min，16℃15min，共10个循环；37℃20min；85℃10s。

(3)转化、挑克隆、提质粒，步骤见3，测序正确的克隆用于后续实验。

8、构建过表达Cas9的4T1-luc稳转细胞株

(1)将4T1-luc细胞按照1×10⁵/孔接种于12孔细胞培养板中，细胞接种2个孔，分别为感染孔和对照孔，培养24h；

(2)待细胞融合度达50％左右感染pLenti-CMV-blasticidin-P2A-3Flag-Cas9慢病毒，按MOI＝40计算所需病毒储液体积：(MOI值×细胞个数)/病毒滴度(TU/ml)，将所需病毒和工作浓度为5μg/ml的Polybrene加入500μl完全培养基中，充分混匀，配成感染复合物；

(3)弃掉细胞的培养上清，将步骤(2)配置的感染复合物加入培养的细胞中；

(4)感染24h后补加500μl完全培养基；

(5)感染48h后弃掉含病毒的培养基，加入1ml含BSD基因筛选抗生素(blasticidin)5μg/ml的新鲜培养基；

(5)加入筛选抗生素48h后，对照孔细胞全部死亡，弃去感染孔内培养上清，加入1ml含2.5μg/ml blasticidin的新鲜培养基；

(6)感染病毒后第6天，转染多重sgRNA重组质粒，转染前通过Western blot检测Cas9表达水平。

9、多重sgRNA重组质粒转染过表达Cas9的4T1-luc细胞

(1)转染前24h，将4T1-luc-Cas9细胞按3×10⁵/孔接种于6孔细胞培养板中；

(2)转染前1h更换预热的1800μl新鲜培养基；

(3)分别用100μl 1×Opti-MEM I培养基稀释2.5μg的待转质粒和7.5μlLipofectamine 2000脂质体，将Lipofectamine 2000稀释液逐滴加入待转质粒稀释液中，轻轻吹打混匀，室温静置20min。将200μl转染复合物均匀滴加至相应孔中，对照孔加入200μl 1×Opti-MEM I培养基补齐体系，放入培养箱培养；

(4)转染6h后，将6孔板中的液体更换为新鲜培养基；

(5)转染24h后，加入4μg/ml的嘌呤霉素进行药物筛选；

(6)48h后对照孔细胞全部死亡，转染孔换成含2μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基；

(7)96h后进行单克隆分选，按每孔1个细胞接种于96孔培养板中，放入细胞培养箱中培养。

10、TA克隆测序验证4T1-luc细胞PD-L1敲除情况

(1)用100ng/ml IFN-γ刺激单克隆细胞22h，诱导PD-L1表达上调，通过流式细胞术和Western blot检测各单克隆细胞PD-L1表达情况。在PD-L1完全敲除的4T1-luc细胞(4T1/Pd-l1 KO细胞)和PD-L1未敲除的4T1-luc细胞(4T1/WT细胞)中各随机选择3个单克隆用于后续实验。在进行后续实验前，通过TA克隆测序，从基因水平检测Pd-l1编辑情况；

(2)用覆盖了多重sgRNA的T7EN I检测引物扩增细胞基因组，T7EN I检测引物序列见5，PCR反应体系：基因组DNA 200ng，T7EN I检测引物4μl(10μmol/L)，

PCRSuperMix 50μl，去离子水补至100μl；PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，63℃30s(-0.2℃/循环)，72℃2min，共30个循环；72℃10min；

(3)纯化PCR产物后末端加“A”：取20μl纯化后的PCR产物与20μl

PCRSuperMix均匀混合后72℃反应30min；

(4)T载体连接：反应体系：SolutionⅠ2.5μl，pMD19-T Vector 0.5μl，加“A”后的DNA片段100ng，去离子水补至5μl；反应条件：16℃孵育1h；

(5)连接产物进行后续的转化、挑克隆并送公司测序，步骤见3。

11、蛋白提取及浓度检测

11.1细胞蛋白提取

(1)配制裂解液：1×RIPA、25×PI、100×磷酸酶抑制剂、100×PMSF按100:4:1:1的比例混合均匀，冰上暂存；

(2)将培养细胞的6孔板置于冰上，弃培养上清，用预冷的1×PBS洗2次细胞(PBS需要贴壁加，轻轻晃动，小心地贴壁吸弃，尽量弃干净)；

(3)将裂解液吹打混匀，加入60μl裂解液至6孔板中，晃匀，使板底细胞可以充分接触裂解液；

(4)加完裂解液的6孔板置于冰上，用干净的细胞刮板充分、全面地把贴壁细胞刮下来，用枪将裂解液吸入标记好的离心管；

(5)漩涡震荡30s，冰上静置5min，重复3次；

(6)离心，4℃，12000g，15min；

(7)将上清转移到新的标记好的离心管中，留5μl左右用于蛋白定量，过程始终在冰上进行；

(8)将蛋白样品与5×Loading Buffer严格按照4:1的比例加入，充分混合均匀，置于100℃的金属加热器中加热10min；

(9)离心，5000rpm，5min，离心后蛋白样品保存于-20℃；

11.2蛋白浓度的检测

(1)根据BCA蛋白检测试剂盒说明书稀释标准蛋白液，加入96孔板中，绘制标准曲线；

(2)用去离子水将待检测的蛋白液稀释5倍，每孔10μl加入96孔板中；

(3)根据试剂盒说明书配制BCA工作液，每孔200μl加入96孔板中，混合均匀后放入37℃孵箱避光静置30min；

(4)用酶标仪在562nm波长下测定蛋白标准品和待检测蛋白液的吸光度。

12、Western blot

(1)配胶：彻底清洗玻璃胶板和胶条，晾干后安装好玻璃胶板，固定，使之与胶条紧密贴合。根据目的蛋白的分子量配制相应浓度的分离胶，小心地加水液封。待分离胶凝固后，倒去胶上层的水，并用吸水纸吸干。配制适量的浓缩胶加到分离胶上方，尽快插入梳子，并避免气泡的产生，静置30min左右待浓缩胶彻底凝固后备用；

(2)电泳：将胶板放入电泳槽中，加入电泳液，垂直拔出梳子，按设计的顺序加入等量蛋白样品。电泳条件：100V恒压持续约90min，待溴酚蓝接近凝胶底部时终止电泳；

(3)转印：提前准备好转印液(10×转印液、双蒸水和甲醇按1:7:2的比例配制)放入4℃冰箱预冷。用预冷的转印液浸湿滤纸并激活NC膜，按照滤纸、NC膜、凝胶、滤纸的顺序由下至上置于半干转仪上，注意避免气泡的产生。转印条件：180mA持续65min(目的分子量大时可以适当延长转印时间)；

(4)封闭：用新鲜配制的含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭NC膜1h；

(5)一抗孵育：取出NC膜并吸干膜上封闭液，根据需要裁剪成宽度合适的条带，置于塑料膜中塑封，加入适当比例稀释的一抗，4℃孵育过夜；

(6)洗膜：弃掉一抗，用1×TBST洗膜3次，每次10min；

(7)二抗孵育：取出NC膜并吸干膜上洗液，置于塑料膜中塑封，加入适当比例稀释的相应的二抗，室温孵育1h；

(8)洗膜：弃掉二抗，用1×TBST洗膜3次，每次10min；

(9)用ECL显影液显色。

13、敲除PD-L1对小鼠乳腺癌细胞在Balb/c小鼠中肺转移的影响

分别将随机选择的3个4T1/Pd-l1 KO单克隆细胞(39#克隆、40#克隆、44#克隆)和随机选择的3个4T1/WT单克隆细胞(6#克隆、9#克隆、41#克隆)按1:1:1混合培养后进行后续动物实验，以排除克隆异质性对结果的影响。我们选取10只6周龄Balb/c雌鼠，随机分为4T1/WT组和4T1/Pd-l1 KO组，每组各5只。小鼠经尾静脉分别接种4T1/WT细胞和4T1/Pd-l1KO细胞4×10⁵/只，接种肿瘤细胞后的第6天进行小动物活体成像，观察肿瘤肺转移情况。

将小鼠处死后机械分离出的肺组织用Bouin’s固定液处理，观察肺组织表面肉眼可见肿瘤转移结节。

14、CCK-8法检测敲除PD-L1对4T1-luc细胞增殖的影响

(1)将4T1/Pd-l1 KO细胞和4T1/WT细胞按5×10³/100μl/孔接种于96孔板中，每组细胞设3个复孔，边缘孔用培养基补齐。

(2)从细胞贴壁开始，分别在0h、24h、48h和72h换液，每孔加入100μl含10μl CCK-8试剂的培养基。孵育0.5-4h，酶标仪测定在450nm处的吸光度。空白组只加培养基和CCK-8试剂，没有细胞。

(3)计算不同时间点每组细胞的增殖情况。

15、平板克隆实验检测敲除PD-L1对4T1-luc细胞克隆形成能力的影响

(1)实验分为3组，分别为4T1/Pd-l1 KO组、4T1/WT组和4T1/WT+anti-PD-L1组。细胞按5×10²/ml接种于6孔板中，每组设3个复孔；

(2)正常培养至克隆形成，每2天换液，约14天后，弃培养基，1×PBS轻柔洗涤2次后用4％多聚甲醛室温固定20min，结晶紫染色1min，蒸馏水冲洗，晾干；

(3)计数大于50个细胞的集落数量。

16、敲除PD-L1对4T1-luc细胞体内增殖能力的影响

(1)将4T1/Pd-l1 KO细胞和4T1/WT细胞分别消化、重悬，用1×PBS洗2遍，并计数至1×10⁷/ml；

(2)6周龄雌性NCG小鼠前肢腋下皮下注射0.1ml细胞悬液；

(3)从皮下瘤生长到可测量的大小开始，每隔一天用游标卡尺测量并记录皮下瘤的最大径L和最小径W，计算皮下瘤体积(V＝0.5×L×W²)；

(4)皮下接种肿瘤第7天，处死小鼠后剥离皮下瘤，称量皮下瘤重量并统计。

17、划痕实验检测敲除PD-L1对4T1-luc细胞迁移能力的影响

(1)实验分为3组，分别为4T1/Pd-l1 KO组、4T1/WT组和4T1/WT+anti-PD-L1antibody组。细胞按5×10⁵的数量接种于6孔板中，每组设3个复孔，正常培养24h；

(2)细胞划痕：用200μl移液枪的枪头在单层细胞中直线划痕，用PBS洗2遍以去除划掉的细胞，拍照后继续培养；

(3)48h后弃培养上清，用PBS洗2遍，加入新鲜培养基，显微镜下拍照；

(4)Image J软件测量细胞迁移距离。

18、敲除PD-L1对小鼠三阴性乳腺癌细胞抗失巢凋亡的能力的影响图

将4T1/WT细胞和4T1/Pd-l1 KO细胞种入普通6孔细胞培养板和超低吸附细胞培养板中，在细胞种入培养板中0h、3h、6h和12h检测PD-L1敲除前后肿瘤细胞的凋亡情况。

19、数据统计分析

实验数据采用统计软件SPSS16.0进行统计学处理。使用GraphPad Prism5.0软件绘制统计图。数值以平均数±标准误(mean±SEM)表示。两组间比较采用t检验。多组间比较采用单因素方差分析，取α＝0.05为检验水准。所有结果均以*P<0.05表示差异有统计学意义，**P<0.01表示有显著性差异。

20、结果

1)构建的4T1-luc-Cas9细胞的结果如图1所示，从图中可以看出Cas9蛋白在4T1-luc-Cas9过表达，说明已成功构建过表达Cas9的4T1-luc稳转细胞株。

2)PD-L1的敲除结果显示，构建的4T1-luc-Cas9-PD-L1-sgRNA单克隆细胞共40个，其中完全敲除PD-L1表达的单克隆细胞共30个，仍存在PD-L1表达的单克隆细胞共10个，PD-L1敲除率高达75％。图2显示了部分单克隆细胞PD-L1表达水平检测的代表性图。流式细胞术和Western blot检测出的PD-L1表达情况一致。这些实验结果提示，靶向Pd-l1基因的多重sgRNA策略可以获得比单一sgRNA更高的打靶效率；已经成功构建敲除PD-L1的小鼠三阴性乳腺癌细胞。

3)TA克隆测序结果显示(图3)，随机选择的3个4T1/WT单克隆细胞(6#克隆、9#克隆、41#克隆)Pd-l1基因CDS区未发生编辑，而随机选择的3个4T1/Pd-l1 KO单克隆细胞(39#克隆、40#克隆、44#克隆)Pd-l1基因均发生突变，且突变位点和模式均不相同，CDS区破坏严重，说明靶向Pd-l1基因的多重sgRNA策略可以获得比单一sgRNA更高的打靶效率和更丰富的突变模式；已经成功构建敲除PD-L1的小鼠三阴性乳腺癌细胞。

4)敲除PD-L1对小鼠乳腺癌细胞在Balb/c小鼠中肺转移中的影响如图4所示，4T1/WT组肺部平均荧光值为3.16×10⁶ph/s，4T1/Pd-l1 KO组平均值为6.05×10⁴ph/s，两组间差别具有统计学意义(P<0.05)，这些实验结果说明，敲除PD-L1抑制小鼠乳腺癌细胞在Balb/c小鼠中肺转移。

5)肺组织表面肿瘤转移结节情况如图5所示，4T1/WT组小鼠肺组织表面已经布满肿瘤转移结节，且肿瘤转移结节已经融合，无法计数统计；而4T1/Pd-l1KO组小鼠肺组织表面肿瘤转移结节明显较少，瘤灶尚未融合

6)CCK-8实验检测敲除PD-L1对小鼠三阴性乳腺癌细胞体外增殖能力的影响结果如图6所示，在细胞培养的0h，24h，48h和72h，这5组细胞的吸光度值无明显差异(P>0.05)。这些实验结果提示，敲除PD-L1不影响小鼠三阴性乳腺癌细胞的体外增殖能力。

7)平板克隆的检测结果显示，4T1/WT组平均每个复孔中形成256个克隆，4T1/Pd-l1 KO组平均每个复孔中形成229个克隆，4T1/WT+anti-PD-L1组平均每个复孔中形成226个克隆，3组间形成的克隆数无明显差别(P>0.05)(图7)，说明，PD-L1的表达不影响小鼠三阴性乳腺癌细胞的克隆形成能力。

8)体内增殖实验显示，4T1/WT组小鼠皮下瘤瘤重平均为0.19g，4T1/Pd-l1KO组平均0.21g，两组小鼠的皮下瘤瘤重差别无统计学意义(P>0.05)(图8)。这些实验结果提示，敲除PD-L1对小鼠三阴性乳腺癌细胞的体内增殖能力无明显影响。

9)划痕实验显示，敲除PD-L1或使用抗PD-L1抗体可以抑制小鼠三阴性乳腺癌细胞的迁移能力(图9)，这可能是敲除PD-L1及使用抗PD-L1抗体通过免疫检查点非依赖的途径抑制小鼠三阴性乳腺癌细胞肺转移的机制之一。

10)流式细胞检测结果显示，悬浮培养相同时间的4T1/WT细胞和4T1/Pd-l1KO细胞，其失巢凋亡率无明显差别(P>0.05)(图10)，说明敲除PD-L1不影响小鼠三阴性乳腺癌细胞抗失巢凋亡的能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 徐州医科大学

南京国际医院有限公司

<120> 特异性靶向Pd-l1基因的sgRNA及其应用

<141> 2020-09-02

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaccacgta caagtcctt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggacttgt acgtggtgg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttccctgtag aacgggagc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcccgttc tacagggaa 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtacaccact aacgcaagc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttgcgtta gtggtgtac 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagtttgtgg caggagagg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctctcctgc cacaaactg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttgctgtgc tgaggctta 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taagcctcag cacagcaac 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caaaggacca gcttttgaa 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttcaaaagct ggtcctttg 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taggtgcaat cccaacacca g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgattcgctt gtagtccgca 20

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgcgtctca accgccacca cgtacaagtc cttgttttag agctagaaat agcaag 56

<210> 16

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgcgtctcg aaacgctccc gttctacagg gaacggtgtt tcgtcctttc cacaag 56

Claims (10)

1.特异性敲除Pd-l1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1-12所示的序列的任意一种或几种；

优选地，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1～4所示的序列。

2.一种包含权利要求1所述的sgRNA的表达载体。

3.构建敲除PD-L1细胞株的方法，其特征在于，所述方法利用CRISPR/Cas9技术向目标细胞中引入权利要求1所述的sgRNA，得到PD-L1敲除的细胞株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括步骤：

1)构建携带Pd-l1基因sgRNA寡核苷酸的重组质粒；

2)构建过表达Cas9的4T1-luc稳转细胞株；

3)sgRNA重组质粒转染过表达Cas9的4T1-luc细胞；

4)用T7ENI酶切检测，或TA克隆测序验证敲除效率和基因修饰的具体模式。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，1)包括步骤：

a.扩增含有sgRNA的片段；

b.将扩增产物与质粒连接；

c.将连接产物进行转化、鉴定；

优选地，所述sgRNA为多重sgRNA；

优选地，扩增多重sgRNA的引物序列如SEQ ID NO.15～16所示；

优选地，扩增sgRNA的模板为pUC57-U6-sgRNA；

优选地，连接质粒为pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro。

6.根据权利要求4所述的方法，2)中通过使用pLenti-CMV-blasticidin-P2A-3Flag-Cas9慢病毒感染4T1-luc构建过表达Cas9的4T1-luc稳转细胞株。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，4)中所述T7ENI酶切检测包括扩增sgRNA识别位点的DNA片段的引物；优选地，所述引物序列如SEQ ID NO.13～14所示。

8.一种敲除Pd-l1基因的细胞，其特征在于，所述细胞使用权利要求4-8任一项所述的方法构建；

优选地，所述细胞为三阴乳腺癌细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的表达载体。

10.如下任一项所述的应用：

1)权利要求1所述的sgRNA在敲除Pd-l1基因或构建敲除Pd-l1基因的细胞中的应用；

2)权利要求2所述的表达载体在敲除Pd-l1基因或构建敲除Pd-l1基因的细胞中的应用；

3)权利要求1所述的sgRNA在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用；

4)权利要求2所述的表达载体在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用；

5)权利要求1所述的sgRNA在制备治疗PD-L1相关疾病中的药物中的应用；

6)权利要求2所述的表达载体在制备治疗PD-L1相关疾病中的药物中的应用；

7)权利要求3-8任一项所述的方法在制备敲除PD-L1细胞系中的应用。

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