CN114072517A - 工程化的单纯疱疹病毒-1(hsv-1)载体及其用途 - Google Patents

工程化的单纯疱疹病毒-1(hsv-1)载体及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供了包括修饰的HSV‑1基因组的工程化的HSV‑1载体。工程化的HSV‑1载体可用于在体外或体内将基因电路(例如，至多100kb)递送至细胞。还提供了使用本文所述的工程化的HSV‑1载体治疗或诊断疾病(例如，癌症)的方法。

Description

工程化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体及其用途
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2019年3月14日提交的美国临时申请序列号62/818,464的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
病毒载体已被用于在体外和/或体内递送转基因。然而，病毒载体可诱导毒性，干扰转基因表达和/或限制可被递送的转基因的大小。
发明内容
在一些方面中，本文提供的是包括修饰的HSV-1基因组的工程化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体。HSV-1基因组被修饰以减弱病毒，使得它们对转导的细胞没有毒性，但又不至于严重减弱，以便在适当的包装细胞系中可获得高滴度病毒颗粒，并且实现强大的转基因表达。本文所述的工程化的HSV-1载体可用于递送复杂的基因电路(例如，长度至多100kb的基因电路)。本文还提供了用于产生包括工程化的HSV-1载体的HSV-1病毒颗粒的包装细胞。HSV-1病毒颗粒可用于各种应用(例如，治疗或诊断应用)。
相应地，本公开的一些方面提供了含有修饰的HSV-1基因组的工程化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体，所述修饰的HSV-1基因组含有编码感染的细胞蛋白4(ICP4)、感染的细胞蛋白0(ICP0)和毒粒蛋白16(VP16)的基因的缺失。
在一些实施方式中，ICP4的两个拷贝都从修饰的HSV-1基因组中缺失。在一些实施方式中，编码VP16的基因的缺失导致VP16蛋白在氨基酸422处截断。在一些实施方式中，ICP0的两个拷贝都从修饰的HSV-1基因组中缺失。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组进一步包括编码γ34.5、潜伏期相关转录物(LAT)、ICP6、ICP8、ICP27、ICP22和ICP47的一个或多个基因的缺失。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组进一步包括LAT和γ34.5的缺失。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组包括ICP4的两个拷贝、ICP0的两个拷贝的缺失，编码导致VP16蛋白在氨基酸422处截断的VP16的基因的缺失，以及LAT和γ34.5的一个拷贝的缺失。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在一些实施方式中，缺失使得ICP4、ICP0、VP16、γ34.5、LAT、ICP27、ICP22和ICP47中的一个或多个是非功能性的。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组来自HSV-1株F、17或KOS。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组进一步包括一种或多种基因电路。在一些实施方式中，基因电路长度达150kb。在一些实施方式中，基因电路编码输出分子。
在一些实施方式中，输出分子是HSV-1蛋白。在一些实施方式中，HSV-1蛋白选自：VP16、ICP0、ICP27、ICP22、ICP47、ICP6、ICP8、γ34.5。
在一些实施方式中，输出分子是治疗分子。在一些实施方式中，治疗分子是抗癌剂。
在一些实施方式中，输出分子是诊断分子。
在一些实施方式中，输出分子是功能性分子。
在一些实施方式中，输出分子是先天免疫应答的抑制剂。在一些实施方式中，先天免疫应答的抑制剂是靶向先天免疫应答组分的RNA干扰(RNAi)分子。
在一些实施方式中，先天免疫应答的抑制剂是牛痘B18R蛋白质。
在一些实施方式中，工程化的HSV-1载体是质粒。
本公开的其他方面提供了含有本文所述的工程化的HSV-1载体的包装细胞。
在一些实施方式中，将工程化的HSV-1载体整合入包装细胞的基因组。在一些实施方式中，包装细胞进一步包括编码一个或多个HSV-1病毒基因的核酸。在一些实施方式中，一个或多个HSV-1病毒基因编码VP16、ICP0、ICP27、ICP4、ICP22、ICP47、ICP6、ICP8、γ34.5。在一些实施方式中，包装细胞进一步包括编码先天免疫应答的抑制剂的核酸。在一些实施方式中，先天免疫应答的抑制剂是靶向先天免疫应答组分的RNA干扰(RNAi)分子。在一些实施方式中，先天免疫应答的抑制剂是牛痘B18R蛋白质。在一些实施方式中，包装细胞产生至少1蚀斑形成单位的HSV-1病毒颗粒。在一些实施方式中，包装细胞是U2OS细胞。
本公开的其他方面提供了含有工程化的HSV-1载体或由本文所述的包装细胞系产生的工程化的HSV-1病毒颗粒。
本文进一步提供的是治疗疾病的方法，方法包括向需要其的受试者施用有效量的本文所述的工程化的HSV-1病毒颗粒，其中工程化的HSV-1载体包括编码治疗分子的基因电路。
本文进一步提供的是诊断疾病的方法，方法包括向需要其的受试者施用有效量的本文所述的工程化的HSV-1病毒颗粒，其中工程化的HSV-1载体包括编码诊断性分子的基因电路。
在一些实施方式中，工程化的HSV-1病毒颗粒不诱导受试者的免疫应答或与受试者中天然的HSV-1颗粒相比诱导较低的免疫应答。在一些实施方式中，工程化的HSV-1载体感染受试者中的细胞且将基因电路递送入受试者中的细胞。在一些实施方式中，工程化的HSV-1病毒颗粒全身地或局部地施用。在一些实施方式中，工程化的HSV-1病毒颗粒经注射施用。在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌或肺癌。在一些实施方式中，疾病是恶病质。
在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人。在一些实施方式中，哺乳动物是非人灵长类动物。在一些实施方式中，哺乳动物是啮齿动物。
本公开的其他方面提供了将基因电路递送入细胞的方法，其包括用HSV-1载体，或本文所述的工程化的HSV-1病毒颗粒接触细胞，其中工程化的HSV-1载体包括基因电路。在一些实施方式中，接触是在体外。在一些实施方式中，接触是在体内。在一些实施方式中，接触是离体的。
以上总结意思是以非限制性的方式说明本本文公开的技术的一些实施方式、优点、特征和用途。本文公开的技术的其他实施方式、优点、特征和用途将从详细描述、附图、实施例和权利要求中是显而易见的。
附图说明
附图不旨在按比例绘制。为了清楚起见，不是每个组成都在每张附图中标明。
图1A-1B.递送基因电路中的工程化的HSV-1载体和活性。(图1A)具有各种HSV-1基因的缺失的示例性工程化的HSV-1载体的示意图。(图1B)显示由工程化的HSV-1载体在体外递送细胞状态分类器的图表。
图2A-2C.包装细胞系。(图2A)包装细胞系表达HSV-1病毒基因以补充HSV-1基因组的缺失。使用U2OS细胞系构建了几种不同的包装细胞系。(图2B)microRNA传感器被整合入工程化的HSV-1载体中。(图2C)包装细胞系中的病毒产生。
图3.快速、标准化的组装和整合基因电路至HSV-1骨架中，从含有基因电路的HSV-1载体中产生病毒，并且使用HSV-1病毒以治疗小鼠模型中的转移性乳腺癌。
图4.本文所述的工程化的HSV-1载体在用于癌症疗法的用途。
图5A-5C.由本文所述的工程化的HSV-1载体递送的疗法在小鼠癌症模型中的抗癌活性。由工程化的HSV-1载体递送的基因电路的逻辑功能根据高mir-21、低mir-112a、低mir-138和低mir-199a对癌细胞进行分类。(图5A)通过萤火虫荧光素酶(Fluc)成像，监测注射后15天的肿瘤大小。(图5B)有条件复制递送基因电路的工程化的HSV-1载体，提高了2倍以上的存活率。(图5C)在不同的时间点测量转移。血液转移与小鼠的早期死亡相关。
某些实施方式的详细描述
病毒载体已被广泛用于转基因递送。与病毒载体相关的问题包括病毒诱导的毒性、病毒载体对转基因表达的干扰和/或高滴度病毒颗粒产生的困难。为了减少病毒诱导的毒性或病毒对转基因表达的干扰，可以工程化病毒，以获得减弱的变体。然而，减弱也可影响转基因表达和病毒颗粒包装。不同的病毒株也可导致病毒载体的不同性能。
本公开，在一些方面中，涉及包括修饰的HSV-1基因组的工程化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体。工程化的HSV-1载体可用于递送复杂的基因电路，在一些实施方式中，编码转基因。修饰的HSV-1基因组含有所有必要的病毒组分，以提高病毒产生和转基因产生，但对电路性能有低水平的干扰。还提供了允许产生高滴度病毒颗粒的包装细胞系。在一些实施方式中，工程化的HSV-1载体或包装细胞系还具有减少宿主细胞的先天免疫应答的特征。大量包括对其基因组不同修饰的HSV-1变体被筛选，用于鉴定符合期望的标准的变体。这些变体可用于许多体外和体内的应用。
单纯疱疹病毒(HSV)是疱疹病毒科家族的双链线性DNA病毒。单纯疱疹病毒家族的两个成员感染人类--被称为HSV-1和HSV-2。适合根据本公开内容使用的HSV-1株包括但不限于F、17和KOS。
HSV的结构由相对大的、双链的、线性的DNA基因组组成，所述基因组被包裹在称为衣壳的二十面体蛋白质笼子内，该笼子被称为包膜的脂双层包裹。包膜通过内膜的方式与衣壳相连。完整的病毒颗粒被称为毒粒(术语“病毒颗粒”和“毒粒”本文可互换使用)。
HSV(例如，HSV-1)的基因组是复杂的，并且含有两个独特的区域，称为长独特区(UL)和短独特区(US)，并且含有编码参与形成病毒的衣壳、内膜和包膜的各种蛋白质以及控制病毒的复制和感染性的基因。HSV-1基因组含有约85个开放阅读框，其编码4种主要类型的蛋白质：(1)与HSV的最外的脂双层相关的蛋白质(包膜)，(2)内部蛋白质覆盖层(coat)(衣壳)，(3)连接包膜与衣壳覆盖层的中间复合物(内膜)，以及(4)负责复制和感染的蛋白质。
HSV基因的转录是由感染的宿主的RNA聚合酶II催化的。即刻早期基因，其编码调节早期和晚期病毒基因表达的蛋白质，是感染后最先被表达的。接着早期基因表达，以允许参与DNA复制的酶的合成和某些包膜糖蛋白的产生。晚期基因的表达最后发生；该组基因主要是编码形成病毒体的蛋白质。
HSV(例如HSV-1)产生至少49种感染的细胞蛋白质(ICP)，分子量范围15至280kDa(例如，如描述于Honess等，Journal of Virology，第12卷，第6期，1347-1365，1973中的，其通过引用并入本文)。ICP可以是结构蛋白质或非结构蛋白质。可从本文所述的修饰的HSV-1基因组缺失的非限制性、示例性ICP包括：ICP0、ICP4、ICP6、ICP8、ICP22、ICP27、γ34.5(本文也称作ICP34.5)和ICP47。
“感染的细胞蛋白质0(ICP0)”是在感染的最早阶段期间产生的，当病毒最近进入宿主细胞时，阶段被称为病毒基因表达的即刻早期或α阶段。在这些感染的早期阶段期间，ICP0蛋白质被合成并且被运输至感染的宿主细胞的细胞核中。ICP0促进病毒基因的转录，并且与神经元特异性蛋白质组合改变宿主和病毒基因的表达(例如，如Gu等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(21):7571-6,2005；和Pinnoji等，Virol.J.4:56.doi:10.1186/1743-422X-4-56,2007中描述的，通过引用并入本文)。在细胞感染的后期阶段，ICP0重新定位至细胞质中，以并入新的毒粒中(例如，如描述于Sedlackova等，Journal ofVirology.82(1):268-77,2008中，通过引用并入本文)。ICP0与HSV-1即刻早期(IE)蛋白质ICP4协同作用，并且对潜伏疱疹病毒的再激活和病毒复制至关重要。在潜伏感染期间，病毒RNA转录物经反义RNA机制抑制疱疹病毒ICP0基因的表达。RNA转录物由病毒产生，并且在潜伏感染期间在宿主细胞中积累；它被称为潜伏期相关转录物(LAT)。HSV-1的基因组中有两个ICP0拷贝。
“感染的细胞蛋白质4(ICP4)”是HSV-1中与细胞溶解感染相关的基因的重要的反式作用子(例如，如描述于Pinnoji等，Virol.J.4:56.doi:10.1186/1743-422X-4-56,2007中，通过引用并入本文)。围绕ICP4基因的元件结合被称为人神经元蛋白质神经元限制性沉默因子(NRSF)或人压抑元件沉默转录因子(REST)的蛋白质。当结合至病毒DNA元件时，ICP4基因序列顶部发生组蛋白去乙酰化，以阻止该基因的转录启动，从而阻止参与细胞溶解周期的其他病毒基因的转录。ICP0从ICP4基因解离NRSF，并且因此防止病毒DNA的沉默(例如，Roizman等，Cell Cycle.4(8):1019-21,2005，通过引用并入本文)。HSV-1基因组中有两个ICP4拷贝。
“感染的细胞蛋白质6(ICP6)”是病毒核糖核苷酸还原酶(vRR)，其功能允许野生型HSV的复制，以甚至在静息细胞中发生，比如在野生型HSV-1引起的脑炎期间被感染的神经元。没有这种功能，HSV复制在静息细胞中会被严重缩减(例如，如描述于Goldstein等，Virology 166:41-51,1988，通过引用并入本文)。
“感染的细胞蛋白质8(ICP8)”是HSV-1 DNA复制所需的。其能够退火至单链DNA(ssDNA)，以及熔化dsDNA的小片段。它的作用是在复制启动期间使双螺旋DNA不稳定。它与螺旋酶不同，因为它不依赖ATP-和Mg2+。在用HSV-1感染的细胞中，那些细胞中的DNA变成与ICP8共存。ICP8在后期基因转录中是必需的，并且已经发现与细胞RNA聚合酶II全酶相关。
“感染的细胞蛋白质22(ICP22)”主要通过介导宿主RNA聚合酶II上的变化用作细胞和病毒mRNA的一般转录调控子。不依赖UL13的一个变化是快速失去携带Ser-2磷酸化的Pol II形式。依赖UL13的第二个变化是与正常的低磷酸化和高磷酸化形式不同的中间形式的Pol II的出现。这些Pol II修饰立即抑制了宿主基因组转录，导致细胞周期失调和丧失有效的抗病毒应答。ICP22还招募细胞转录延伸因子至病毒基因组中，用于有效转录延伸病毒基因。
“感染的细胞蛋白质27(ICP27)”是HSV-1感染所必需的多功能调节蛋白质。在感染后的早期，ICP27与剪接蛋白质特异性激酶SRPK1相互作用，并且招募这种主要是细胞质激酶至细胞核，在此ICP27然后与被称为SR蛋白质的剪接因子保守家族的成员相互作用(例如，如描述于Sciabica等，EMBO J.22:1608-1619，2003；和Souki等，J.Virol.83:8970-8975，通过引用并入本文)。通过这些相互作用，ICP27介导了SR蛋白质的异常磷酸化，因此，SR蛋白质不能在剪接体组装中发挥它们的作用，从而导致对宿主细胞剪接的抑制。同样在感染后的早期，ICP27通过C-末端结构域(CTD)与细胞RNA聚合酶II(RNAP II)相互作用，并且有助于招募RNAP II至病毒转录/复制位点(例如，如描述于Zhou等，J.Virol.76:5893-5904，2002；和Dai-ju等，J.Virol.80:3567-3581，2006，通过引用并入本文)。随着感染的进展，ICP27从剪接斑点分离，并且与TREX复合物mRNA输出衔接蛋白Aly/REF相互作用，并且招募Aly/REF至病毒复制隔间(例如，如描述于Chen等，J.Virol.79:3949-3961，2005；和Chen等，J.Virol.76:12877-12889，2002，通过引用并入本文)。当与复制隔间相关时，ICP27结合病毒RNA，并且通过核孔复合物护送其结合的RNA货物(cargo)至细胞质(例如，如描述于Corbin-Lickfett等，Nucleic Acids Res.37:7290-7301，2009；和Sandri-Goldin等，GenesDev.12:868-879，1998，通过引用并入本文)。在细胞质中，ICP27通过与翻译起始因子的相互作用增强了一些病毒mRNA的翻译启动(例如，如描述于Ellison等，J.Virol.79:4120-4131，2005；和Fontaine-Rodriguez等，Virology 330:487-492，2004，通过引用并入本文)。ICP27也被证明当其与RNAP II相关时与ICP8相互作用(例如，如描述于Olesky等，Virology331:94-105，2005，通过引用并入本文)。
“感染的细胞蛋白质47(ICP47)”是用作允许入侵的HSV逃避人免疫系统的CD8 T-细胞应答的蛋白质(例如，如描述于Goldsmith等，The Journal of ExperimentalMedicine.187(3):341–8，1998；和Berger等，Journal of Virology.74(10):4465–73，2000，通过引用并入本文)。
感染的细胞蛋白质34.5(ICP34.5)是由γ34.5基因编码的蛋白质，并且其阻断了细胞对病毒感染的应激反应(例如，如描述于Agarwalla等，Methods in MolecularBiology.797:1-19，通过引用并入本文)。当细胞被HSV感染时，蛋白激酶R被病毒的双链RNA激活。然后蛋白激酶R磷酸化称为真核起始因子-2A(eIF-2A)的蛋白质，其使eIF-2A失活。EIF-2A是翻译所必需的，因此通过停止eIF-2A，细胞防止病毒劫持其自己的蛋白质制造机器。病毒反过来进化ICP34.5以打败防御；其激活了使eIF-2A去磷酸化的蛋白磷酸酶-1A，允许翻译再次发生。缺乏γ34.5基因的HSV将不能在正常细胞中复制，因为其不能制造蛋白质。
毒粒蛋白质16(VP16)在HSV感染期间供多种功能，包括转录激活病毒的即刻早期基因和下调毒粒宿主关闭蛋白。此外，VP16还参与了病毒组装和/或成熟的一些方面。
“潜伏期相关转录物(LAT)”是HSV基因组的唯一区域，其在HSV作为与组蛋白相关的圆形游离基因在感觉神经元中建立潜伏期感染后，显示出活跃的转录(例如，如描述于Deshmane等，J.Virol.63:943-947，1989，通过引用并入本文)。LAT区域携带8.3-kb的多腺苷酸化RNA，其经剪接以产生2.0-kb稳定内含子，其在感觉神经元的亚群中大量积累。该2.0-kb内含子在一些神经元中可以可选地被剪接，以产生1.5-kb内含子。虽然LAT区域没有被证明编码任何蛋白质，该区域与许多病原性功能有牵连，包括神经元的生存和抗凋亡、毒力、抑制潜伏的转录、建立潜伏期和从潜伏期重新激活。
HSV蛋白质的其他的非限制性示例包括包膜蛋白质比如UL1(gL)、UL10(gM)、UL20、UL22、UL27(gB)、UL43、UL44(gC)、UL45、UL49A、UL53(gK)、US4(gG)、US5(gJ)、US6(gD)、US7(gI)、US8(gE)、和US10；衣壳蛋白质比如UL6、UL18、UL19、UL35和UL38；内膜蛋白质比如UL11、UL13、UL21、UL36、UL37、UL41、UL45、UL46、UL47、UL48、UL49、US9和US10；和其他蛋白质比如UL2、UL3、UL4、UL5、UL7、UL8、UL9、UL12、UL14、UL15、UL16、UL17、UL23、UL24、UL25、UL26、UL26.5、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL39、UL40、UL42、UL50、UL51、UL52、UL54、UL55、UL56、US1、US2、US3、US81、US11和US12。
表1中提供了在本文所述的修饰的HSV-1基因组中缺失的示例性HSV-1基因和蛋白质的登录号。
表1.HSV-1基因
基因名称 基因登录号 蛋白质登录号
ICP0 2703389 YP_009137074.1
ICP4 2703392 YP_009137135.1
ICP6 2703361 YP_009137114.1
ICP8 2703458 YP_009137104.1
ICP22 2703435 YP_009137136.1
ICP27 24271474 YP_009137130.1
ICP47 2703441 YP_009137148.1
γ34.5(ICP34.5) 2703395 YP_009137073.1
VP16 2703413 YP_009137121.1
LAT 24271498 N/A
VP16氨基酸序列，全长(SEQ ID NO:2)
MQRRTRGASSLRLARCLTPANLIRGDNAGVPERRIFGGCLLPTPEGLLSAAVGALRQRSDDAQPAFLTCTDRSVRLAARQHNTVPESLIVDGLASDPHYEYIRHYASAATQALGEVELPGGQLSRAILTQYWKYLQTVVPSGLDVPEDPVGDCDPSLHVLLRPTLAPKLLARTPFKSGAVAAKYAATVAGLRDALHRIQQYMFFMRPADPSRPSTDTALRLNELLAYVSVLYRWASWMLWTTDKHVCHRLSPSNRRFLPLGGSPEAPAETFARHLDRGPSGTTGSMQCMALRAAVSDVLGHLTRLANLWQTGKRSGGTYGTVDTVVSTVEVLSIVHHHAQYIINATLTGYGVWATDSLNNEYLRAAVDSQERFCRTTAPLFPTMTAPSWARMELSIKAWFGAALAADLLRNGAPSLHYESILRLVASRRTTWSAGPPPDDMASGPGGHRAGGGTCREKIQRARRDNEPPPLPRPRLHSTPASTRRFRRRRADGAGPPLPDANDPVAEPPAAATQPATYYTHMGEVPPRLPARNVAGPDRRPPAATCPLLVRRASLGSLDRPRVWGPAPEGEPDQMEATYLTADDDDDDARRKATHAASARERHAPYEDDESIYETVSEDGGRVYEEIPWMRVYENVCVNTANAAPASPYIEAENPLYDWGGSALFSPPGRTGPPPPPLSPSPVLARHRANALTNDGPTNVAALSALLTKLKREGRRSR
VP16氨基酸序列，氨基酸422处截断的(SEQ ID NO:3)
MQRRTRGASSLRLARCLTPANLIRGDNAGVPERRIFGGCLLPTPEGLLSAAVGALRQRSDDAQPAFLTCTDRSVRLAARQHNTVPESLIVDGLASDPHYEYIRHYASAATQALGEVELPGGQLSRAILTQYWKYLQTVVPSGLDVPEDPVGDCDPSLHVLLRPTLAPKLLARTPFKSGAVAAKYAATVAGLRDALHRIQQYMFFMRPADPSRPSTDTALRLNELLAYVSVLYRWASWMLWTTDKHVCHRLSPSNRRFLPLGGSPEAPAETFARHLDRGPSGTTGSMQCMALRAAVSDVLGHLTRLANLWQTGKRSGGTYGTVDTVVSTVEVLSIVHHHAQYIINATLTGYGVWATDSLNNEYLRAAVDSQERFCRTTAPLFPTMTAPSWARMELSIKAWFGAALAADLLRNGAPSLHYESIL
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)的ICP(例如，ICP0、ICP4、ICP6、ICP8、ICP22、ICP27、ICP47和γ34.5(ICP34.5)、VP16和LAT)的基因中的缺失。基因中的“缺失”意味着从修饰的HSV-1基因组去除的基因的部分或全部。例如，至少10％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％)的基因可被去除。例如，在一些实施方式中，VP16中的缺失意味着编码VP16的基因的完全缺失。在一些实施方式中，VP16基因中的缺失是导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的部分缺失。典型地，完全缺失完全去除基因产物(编码的蛋白质)功能，而部分缺失可导致基因产物功能的完全损失或降低(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％、或至少99％)。在一些实施方式中，缺失使得缺失的基因(例如，ICP4、ICP0、ICP8、ICP6、VP16、γ34.5(ICP34.5)、LAT、ICP27、ICP22和ICP47中的一个或多个)非功能性的。在VP16的情况下，部分缺失导致截断的VP16，其缺乏反式激活结构域，但是截断的VP16保持HSV-1病毒颗粒的必不可少的结构组分。
缺失可以在基因的任何地方。一个基因中可存在一个缺失，或一个基因中存在多个缺失。在一些实施方式中，对于以HSV基因组(例如，ICP0、ICP4、γ34.5和LAT)中多个拷贝(例如，2个拷贝)存在的基因，除非另有说明，否则这种基因中的“缺失”意味着基因的一个或两个拷贝中的缺失。如果基因的两个拷贝都有缺失，缺失可以是相同的或不同的。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括一个或多个编码ICP0、ICP4、γ34.5、VP16和LAT的基因中的缺失。在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括一个或多个编码ICP0(例如，一个或两个拷贝)、ICP4(例如，一个或两个拷贝)、γ34.5(例如，一个或两个拷贝)、LAT(例如，一个或两个拷贝)和VP16的基因中的缺失。在一些实施方式中，当VP16的两个拷贝都具有缺失时，一个拷贝完全地被缺失并且另一个拷贝包括导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码γ34.5(例如，一个或两个拷贝)、LAT(例如，一个或两个拷贝)和ICP0(例如，一个或两个拷贝)的基因中的缺失，和导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、γ34.5(两个拷贝)、LAT(两个拷贝)和ICP0(两个拷贝)的基因中的缺失，和导致VP16蛋白(SEQID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、γ34.5(一个拷贝)、LAT(一个拷贝)和ICP0(一个拷贝)的基因中的缺失，和导致VP16蛋白(SEQID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、γ34.5(一个拷贝)、LAT(一个拷贝)、ICP0(一个拷贝)和ICP27的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(一个拷贝)、γ34.5(一个拷贝)、LAT(一个拷贝)和ICP0(一个拷贝)的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、γ34.5(一个拷贝)、LAT(一个拷贝)和ICP0(一个拷贝)的基因中的缺失，和编码VP16的基因中的完全缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、γ34.5(一个拷贝)、LAT(一个拷贝)和ICP0(两个拷贝)的基因中的缺失，和导致VP16蛋白(SEQID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、γ34.5(一个拷贝)、LAT(一个拷贝)和ICP0(一个拷贝)的基因中的缺失，和导致VP16蛋白(SEQID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)的基因中的缺失，和导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、ICP0(一个拷贝)的基因中的缺失和导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、ICP0(两个拷贝)的基因中的缺失和导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)的基因中的缺失，导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因的一个拷贝中的缺失，和编码VP16的基因的第二拷贝的完全缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、ICP0(一个拷贝)的基因中的缺失，导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因的一个拷贝中的缺失，和编码VP16的基因的第二拷贝的完全缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括编码ICP4(两个拷贝)、ICP0(两个拷贝)的基因中的缺失，导致VP16蛋白(SEQ ID NO:2)在氨基酸422处截断的编码VP16的基因的一个拷贝中的缺失，和编码VP16的基因的第二拷贝的完全缺失。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组包括ICP4的两个拷贝、ICP0的两个拷贝中的缺失，导致VP16蛋白在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失，和LAT的一个拷贝和γ34.5(ICP34.5)的一个拷贝中的缺失。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组包括ICP4的两个拷贝、ICP0的两个拷贝中的缺失，导致VP16蛋白在氨基酸422处截断的编码VP16的基因的一个拷贝中的缺失，编码VP16的基因的另一拷贝的完全缺失，和LAT的一个拷贝和γ34.5(ICP34.5)的一个拷贝中的缺失。
在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组包括ICP4的两个拷贝、ICP0的两个拷贝中的缺失，导致VP16蛋白在氨基酸422处截断的编码VP16的基因中的缺失，和LAT的一个拷贝和γ34.5(ICP34.5)的一个拷贝中的缺失。
在一些实施方式中，本文所述的修饰的HSV-1基因组包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列。例如，修饰的HSV-1基因组可以是与SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的。在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组是与SEQ ID NO:1的核苷酸序列70％、80％、90％、95％或99％同一性的。在一些实施方式中，修饰的HSV-1基因组包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
修饰的HSV-1基因组可并入载体。“载体”指用作媒介物以人工地将遗传物质(例如，基因电路)携带至细胞(在那里，例如，其可以被复制和/或表达)中的核酸(例如，DNA)。在一些实施方式中，载体是游离基因的载体(参见例如，Van Craenenbroeck K.等Eur.J.Biochem.267，5665，2000，通过引用并入本文)。载体的非限制性示例是质粒。质粒是能够在宿主细胞中自动复制的双链大体环状的DNA序列。质粒载体通常含有允许质粒在宿主和转基因插入物中半独立复制的复制原点。质粒可具有更多特征，包括，例如，“多克隆位点”，其包括用于插入核酸插入物的核苷酸悬臂(overhang)，和插入物两侧的多个限制酶共有位点。在一些实施方式中，载体是细菌人工染色体(BAC)。细菌人工染色体(BAC)是DNA构建体，基于功能性生育质粒(或F-质粒)，用于在细菌，通常大肠杆菌中的转化和克隆。
在一些实施方式中，工程化的HSV-1载体进一步包括一种或多种(例如，1、2、3、4、5或更多种)基因电路。如本文使用的“基因电路”指发挥一种或多种功能的工程化的核酸分子(通常是DNA)。这种功能包括但不限于：感应输入信号，产生输出分子，产生控制信号，作为逻辑门运作或调节由其他基因电路感应或产生的信号。在一些实施方式中，基因电路发挥本文所述的功能之一。在一些实施方式中，基因电路发挥多种功能。例如，一种基因电路可以感应输入信号并且在应答中产生输出信号。
在一些实施方式中，本文所述的工程化的HSV-1载体包括一种基因电路，例如，对信号比如环境线索或人工供应的信号应答并且表达输出分子的基因电路。在一些实施方式中，信号是小分子。在一个非限制性示例中，这种基因电路包括可操作地连接至编码输出分子的核苷酸序列的启动子(例如，诱导型启动子)。信号可以是抑制或激活诱导型启动子的信号。
在一些实施方式中，本文所述的工程化的HSV-1载体包括多种基因电路，其中多种基因电路是包括输出分子表达的转录或翻译控制的各个层次的更复杂的基因系统的组成。在这种复杂的基因系统中，使用了不同类型的基因电路，例如，但不限于传感器电路、信号电路、控制电路和/或调节电路。在一些实施方式中，本文所述的工程化的HSV-1载体包括部分基因系统(基因系统中的一些基因电路)或所有基因系统(基因系统中的所有基因电路)。工程化的HSV-1载体包括基因电路，广义上指本文所述的所有情况，例如，其包括是部分或所有基因系统的一种基因电路或多种基因电路。
传感器电路通常包括检测输入信号的区域(例如，小分子信号的结合位点或microRNA信号的靶位点)。在一些实施方式中，传感器电路进一步包括可操作地连接至编码用于系统中的其他电路的调控子(例如转录调控子，如转录抑制器或激活器)的核苷酸序列的启动子。感应输入信号导致调控子的表达或不表达，从而影响下游电路的行为。在一些实施方式中，不同类型的传感器电路用于同时检测不同信号。
信号电路对传感器电路(例如，对传感器电路产生的调控子)作出响应，并且又产生输出分子。在一些实施方式中，信号电路包括可操作地连接至编码输出分子的核苷酸序列的激活型/抑制型启动子。“激活型/抑制型”启动子是可被激活(例如，通过转录激活剂)以驱动可操作地与其连接的核苷酸序列的表达，和可被抑制(例如，通过转录抑制剂)以抑制可操作地与其连接的核苷酸序列的表达的启动子。在一些实施方式中，基因系统中使用了一个以上的信号电路。
在一些实施方式中，基因系统进一步包括另外的调控元件以增强其性能(例如，灵敏性、特异性和/或稳健性)。在一些实施方式中，这种调控元件可以是前馈和/或后馈的转录调节回路。例如，在一些实施方式中，信号电路进一步包括编码调节传感器电路行为的调控子的核苷酸序列，从而形成反馈回路。在一些实施方式中，在基因系统中包括另外的调节电路，经转录和/或翻译控制进一步微调传感器电路和信号电路之间的通信。
控制电路产生独立于输入信号的恒定信号，并且可用于控制除microRNA谱(profile)以外的其他因素引起的变化，例如转染、细胞健康等。在一些实施方式中，控制电路包括可操作地连接至编码与输出信号不同的控制信号的核苷酸序列的组成型启动子。控制信号通常是可检测的分子比如荧光分子。
本公开的工程化的HSV-1载体可用于递送至多100kb长度的基因电路。例如，基因电路可以是至多100kb、至多90kb、至多80kb、至多70kb、至多60kb、至多50kb、至多40kb、至多30kb、至多20kb、至多10kb、至多5kb、至多2kb或至多1kb的长度。在一些实施方式中，基因电路是1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40,40-100、40-90、40-80、40-70、40-60、40-50、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-100、60-90、60-80、60-70、70-100、70-90、70-80、80-100、80-90或90-100kb的长度。在一些实施方式中，基因电路是约1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、60、65、70、75、80、85、90、95或100kb的长度。在一些实施方式中，基因电路是至多33kb的长度。
本领域已经描述了包括多种基因电路的复杂系统。非限制性示例是感应microRNA存在或不存在的细胞状态分类器，如描述于国际申请号PCT/US2017/044643和国际申请公开号WO 20116/040395中，通过引用并入本文。可按照本公开使用的系统的基因电路的其他非限制性示例包括描述于Xie等，Science，第333卷，第6047期，第1307-1311页，2011；Miki等，Cell Stem Cel，第16卷，第6期，第699-711页，2015；Sayeg等，ACS Synth.Biol.，4(7)，第788-795页，2015和Ra等，Front Cell Dev Biol.2017；5:77，2017中的那些。
基因电路是由不同的基因元件组合而构建的。基因元件指在核酸表达中具有作用的特定核苷酸序列(例如，启动子、增强子、终止子、基因组绝缘子、microRNA靶位点或聚腺苷酸化信号)或编码基因电路的离散产物的特定核苷酸序列(例如，激活剂、抑制剂、microRNA或输出分子)。
“microRNA”或“miRNA”是小的非编码RNA分子，其在基因表达的RNA沉默和转录后调节中发挥作用(例如，如描述于Ambros等，Nature 431(7006)：350–5，2004；和Bartel等，Cell.136(2)：215–33，2004中)。microRNA可以是15-30个核苷酸的长度。例如，microRNA可以是15-30、15-25、15-20、20-30、20-25或25-30个核苷酸的长度。在一些实施方式中，microRNA可以是16-24个核苷酸的长度。在一些实施方式中，microRNA可以是20-24个核苷酸的长度。在一些实施方式中，microRNA可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
“microRNA靶位点”是与microRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列。自然地，microRNA靶向位点存在于信使RNA(mRNA)，通常在mRNA的3’非翻译区中。经序列互补性将microRNA与其靶位点的结合，通过降解mRNA或抑制mRNA的翻译(例如，如描述于Bartel等，Cell 136(2):215-33(2009)中，通过引用并入本文)(mRNA含有microRNA结合位点)，导致输出分子的沉默。本文中，当microRNA靶位点在基因电路的背景下(即，在DNA的背景下)被提及时，其意味着在从基因电路产生的mRNA中编码microRNA靶位点的核苷酸序列。
关于已知microRNAs的序列、起源和功能的信息可以在公开地获得的数据库中找到(例如，mirbase.org/，所有版本，如描述于Kozomara等，Nucleic Acids Res 2014 42:D68-D73；Kozomara等，Nucleic Acids Res 2011 39:D152-D157；Griffiths-Jones等，Nucleic Acids Res 2008 36:D154-D158；Griffiths-Jones等，Nucleic Acids Res 200634:D140-D144和Griffiths-Jones等，Nucleic Acids Res 2004 32:D109-D111，包括最近发布的版本miRBase 21，其含有“高置信度”microRNA)。
如本文使用的“激活剂”指转录激活剂。术语“激活剂”或“转录激活剂”本文是互换地使用的。转录激活剂是增加基因或基因组的基因转录的蛋白质。大多数激活剂通过与位于启动子内或附近的DNA位点进行序列特异性结合，并且与一般转录体系(RNA聚合酶和一般转录因子)进行蛋白质-蛋白质相互作用，从而促进一般转录体系与启动子的结合起作用。
如本文使用的“抑制剂”指转录抑制剂。术语“抑制剂”或“转录抑制剂”本文是互换地使用的。转录抑制剂是通过结合至操纵子或相关的沉默子抑制一个或多个基因的表达的DNA-或RNA-结合蛋白质。DNA-结合抑制剂阻断RNA聚合酶与启动子的连接，从而阻止基因转录为信使RNA。RNA-结合抑制剂结合至mRNA并且阻止mRNA翻译成蛋白质。
本领域技术人员能够选择转录激活剂或抑制剂，以便按照本公开使用。公共数据库对于已知的或预测的转录调控子是可获得的，例如transcriptionfactor.org。
“启动子”指核酸序列的控制区域，在这里核酸序列的其余部分的转录的启动和速度被控制。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或转录。启动子也可含有子区域，在这里调节蛋白质和分子可结合，比如RNA聚合酶和其他转录因子。启动子可以是可组成的、可诱导的、可激活的、可抑制的、组织特异性的或其任何组合。当启动子关于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和方向，以控制(“驱动”)该序列的转录启动和/或表达时，启动子被认为是“可操作地连接”。
启动子可以是自然地与基因或序列相关的启动子，如可以通过分离位于给定基因或序列的编码片段的上游的5'非编码序列获得。在一些实施方式中，编码核酸序列可以被定位在重组或异源启动子的控制下，这是指在其自然环境中通常不与所编码的序列相关的启动子。这种启动子可以包括其他基因的启动子；从任何其他细胞中分离的启动子；以及不是“天然存在的”合成启动子或增强子，比如，含有不同转录调控区域的不同元件和/或通过本领域已知的基因工程方法改变表达的突变的那些。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，序列还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括聚合酶链式反应(PCR)(参见美国专利号4,683,202和美国专利号5,928,906)来产生。
在一些实施方式中，启动子是“诱导型启动子”，其指特征在于当存在由诱导剂信号影响或接触的情况下时调节(例如，启动或激活)转录活性的启动子。诱导剂信号可以是内源的或通常外源的条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白质，其与诱导型启动子接触，以此方式以在调节来自诱导型启动子的转录活性方面是起作用的。因此，核酸的“调节转录的信号”指作用于诱导型启动子的诱导剂信号。调节转录的信号可激活转录或使转录失活，其取决于使用的调节系统。转录的激活可涉及直接作用于启动子以驱动转录，或通过使阻止启动子驱动转录的抑制剂失活间接作用于启动子。相反地，转录的失活可涉及直接作用于启动子以防止转录或通过激活随后作用于启动子的抑制剂间接作用于启动子。在一些实施方式中，在基因电路中使用诱导型启动子导致基因产物的条件表达或“延迟”表达。
施用或去除诱导剂信号导致可操作地连接的核酸序列的转录的激活和失活之间的转换。因此，可操作地连接至核酸序列的启动子的激活状态指当启动子积极地调节核酸序列的转录时的状态(即，连接的核酸序列被表达)。相反地，可操作地连接至核酸序列的启动子的失活状态指当启动子未积极地调节核酸序列的转录时的状态(即连接的核酸序列未被表达)。
诱导型启动子可被一种或多种生理学条件诱导(或抑制)，比如光、pH、温度、辐射、渗透压力、盐水梯度、细胞表面结合和一种或多种外在或内在的诱导剂的浓度的变化。外在诱导剂信号或诱导剂可包括但不限于，氨基酸和氨基酸类似物、糖和多糖、核酸、蛋白质转录激活剂和抑制剂、细胞因子、毒素、基于石油的化合物、含有金属的化合物、盐、离子、酶底物类似物、激素或其组合。
诱导型启动子包括本文所述的或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的示例包括但不限于化学/生化调控和物理调控的启动子比如醇-调控的启动子、四环素-调控的启动子(例如，无水四环素(aTc)-反应型启动子和其他四环素-反应型启动子系统，其包括四环素抑制剂蛋白(tetR)、四环素操纵子序列(tetO)和四环素反式作用子融合蛋白(tTA))、类固醇-调控的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、飞蛾蜕皮激素受体的启动子和来自类固醇/视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)、金属-调控的启动子(例如，源自来自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白(结合和鳌合(sequester)金属离子的蛋白质)基因的启动子启动子)、发病机理-调控的启动子(例如，被水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导的)、温度/热-诱导型启动子(例如，热休克启动子)和光-调控的启动子(例如，来自植物细胞的光反应型启动子)。
在一些实施方式中，诱导剂信号是N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)，其是参与细菌群体感应的一类信号传导分子。群体感应是细菌之间的通信方法，其使基于种群密度的群体基行为得到协调。AHL可以扩散穿过细胞膜，并且在pH值范围内在生长媒介中是稳定的。AHL可结合至转录激活剂比如LuxR，并且刺激同源启动子的转录。
在一些实施方式中，诱导剂信号是无水四环素(aTc)，其是四环素的衍生物，其不展示出抗生素活性，并且被设计与四环素控制的基因表达系统一起使用，例如，在细菌中。
在一些实施方式中，诱导剂信号是异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，其是异乳糖的分子模拟物，一种触发lac操纵子转录的乳糖代谢物，并且因此其被用于诱导蛋白质的表达，其中基因是在lac操纵子的控制下。IPTG结合至lac抑制剂，并且以变构的方式将四聚体抑制剂从lac操纵子子中释放，从而允许lac操纵子中的基因的转录，比如编码β-半乳糖苷酶的基因，β-半乳糖苷酶是一种催化β-半乳糖苷水解成单糖的水解酶。硫(S)原子创造了由细胞不可水解的化学键，阻止了细胞对诱导剂代谢或降解。IPTG是有效的蛋白质表达诱导剂，例如，在100μM至1.0mM的浓度范围内。使用的浓度取决于所需的诱导强度，以及使用的细胞或质粒的基因型。如果存在lacIq，一种过度产生lac抑制剂的突变体，那么可能需要更高浓度的IPTG。在蓝-白筛选中，IPTG与X-gal一起使用。蓝-白筛选允许用重组质粒而不是非重组质粒转化的集群(colony)在克隆实验中被鉴定。
其他诱导型启动子系统在本领域中是已知的，并且可按照本公开使用。诱导型启动子的示例包括但不限于噬菌体启动子(例如Pls1con、T3、T7、SP6、PL)和细菌启动子(例如，Pbad、PmgrB、Ptrc2、Plac/ara、Ptac、Pm)或其杂交体(例如PLlacO、PLtetO)。按照本公开使用的细菌启动子的示例包括但不限于正向调控的大肠杆菌启动子比如正向调控的σ70启动子(例如，诱导型pBad/araC启动子、Lux盒式右启动子(cassette right promoter)、修饰的lamdba Prm启动子、plac Or2-62(正)、具有额外的REN位点的pBad/AraC、pBad、P(Las)TetO、P(Las)CIO、P(Rhl)、Pu、FecA、pRE、cadC、hns、pLas、pLux)、σS启动子(例如，Pdps)、σ32启动子(例如，热休克)和σ54启动子(例如，glnAp2)；负向调控的大肠杆菌启动子比如负向调控的σ70启动子(例如，启动子(PRM+)、修饰的lamdba Prm启动子、TetR-TetR-4C P(Las)TetO、P(Las)CIO、P(Lac)IQ、RecA_DlexO_DLacO1、dapAp、FecA、Pspac-hy、pcI、plux-cI、plux-lac、CinR、CinL、葡萄糖控制的、修饰的Pr、修饰的Prm+、FecA、Pcya、rec A(SOS)、RecA(SOS)、EmrR_调控的、BetI_调控的、pLac_lux、pTet_Lac、pLac/Mnt、pTet/Mnt、LsrA/cI、pLux/cI、LacI、LacIQ、pLacIQ1、pLas/cI、pLas/Lux、pLux/Las、具有LexA结合位点pRecA、反向BBa_R0011、pLacI/ara-1、pLacIq、rrnB P1、cadC、hns、PfhuA、pBad/araC、nhaA、OmpF、RcnR)、σS启动子(例如，具有可替选的σ因子σ38的Lutz-Bujard LacO)、σ32启动子(例如，具有可替选的σ因子σ32的Lutz-Bujard LacO)和σ54启动子(例如，glnAp2)；负向调控的枯草芽孢杆菌启动子比如可抑制的枯草芽孢杆菌σA启动子(例如，革兰氏阳性IPTG-可诱导的、Xyl、hyper-spank)和σB启动子。其他诱导型微生物启动子可按照本公开使用。
在一些实施方式中，本公开的诱导型启动子在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)中发挥作用。用于真核细胞的诱导型启动子的示例包括但不限于化学调控的启动子(例如，酒精调控的启动子、四环素调控的启动子、类固醇调控的启动子、金属调控的启动子和发病机理相关(PR)的启动子)和物理调控的启动子(例如，温度调控的启动子和光调控的启动子)。
“基因组绝缘子”指一类DNA序列元件，其拥有共同的能力以保护基因免受来自从他们周围环境，即为基因表达建立边界传出的不适当信号(例如，增强信号或抑制信号)。在一些实施方式中，基因组绝缘子当发挥其功能时具有一种或多种与DNA序列元件相关的蛋白质(例如，如描述于Yang等，Adv Cancer Res.2011；110:43–76；和West等，Genes&Development 16:271–288，2002中，通过引用并入本文)。某些基因组绝缘子，例如，鸡HS4绝缘子(cHS4)已被证明增强由逆转录病毒载体整合入染色体的转基因的表达(例如，如描述于Revilla等，J.Virol.May 2000vol.74no.104679-4687中，通过引用并入本文)。可按照本公开使用的基因组绝缘子可来自不同生物体，例如，酿酒酵母、黑腹果蝇或脊椎动物比如鸡或哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人。可按照本公开使用的各种基因组绝缘子描述于West等，Genes&Development 16:271-288，2002中，通过引用并入本文)。
如本文使用的“增强子”指转录增强子。术语“增强子”和“转录增强子”本文是互换地使用的。增强子是短的(50-1500bp)DNA区域，其可以被激活剂结合以增加特定基因转录发生的可能性。增强子是顺式作用的，并且可以位于离基因至多1Mbp(1,000,000bp)，在转录起始点的上游或下游。增强子在原核生物和真核生物中都能发现。在人基因组中有成千上万种增强子。
如本文使用的“操纵子”指抑制剂所结合的以通过抑制其来调节基因表达的DNA片段。在lac操纵子中，操纵子被定义为启动子和操纵子的基因之间的片段。当被抑制剂结合时，抑制剂蛋白质物理上阻碍RNA聚合酶转录基因，从而抑制基因的转录。
如本文使用的“多腺苷酸化信号”指由RNA裂解复合物识别的序列基序，所述RNA裂解复合物裂解新产生的RNA的3'-最末端部分，并且使通过该裂解产生的末端多腺苷酸化。多腺苷酸化信号的序列在真核生物群体之间不同。大多数人的多腺苷酸化位点含有AAUAAA序列。
转录终止子通常出现在本公开的任何基因电路中的多腺苷酸化信号之后。“转录终止子”是引起转录停止的核酸序列。终止子可以是单向的或双向的。其包括参与通过RNA聚合酶对RNA转录物进行特定终止的DNA序列。终止子序列通过上游启动子防止对下游核酸序列进行转录激活。因此，在某些实施方式中，考虑在结束RNA转录物产生的终止子的本文所述的各种核酸构建体和电路中的内含物(inclusion)。为了实现期望的输出表达水平(例如，低输出水平)或避免某些序列的转录，在体内可能需要终止子。
最常用的终止子类型是正向终止子(forward terminator)。当置于通常转录的核酸序列的下游时，正向转录终止子将引起转录中止。在一些实施方式中，提供了双向转录终止子，其通常引起终止在正向和反向链上的转录。在一些实施方式中，提供了反向转录终止子(reverse transcriptional terminator)，其通常只终止反向链上的转录。
在原核生物系统中，终止子通常分为两类(1)不依赖rho的终止子和(2)依赖rho的终止子。不依赖rho的终止子通常包括回文序列，其形成富含G-C碱基对的茎环，后面是几个T碱基。在不希望被理论束缚的情况下，转录终止的常规模型是茎环引起RNA聚合酶暂停，poly-A尾部的转录引起RNA:DNA双链体解开并且与RNA聚合酶分离。
在真核生物系统中，终止子区域可包括特定DNA序列，其允许对新的转录物进行位点特异性裂解，以便暴露多腺苷酸化位点。这发出专门的内源聚合酶信号，使其在转录物的3'端添加一段约200A的残基(polyA)。以这种polyA尾部修饰的RNA分子似乎更稳定，并且翻译更有效。因此，在涉及真核生物的一些实施方式中，终止子可包括用于裂解RNA的信号。在一些实施方式中，终止子信号促进信息的多腺苷酸化。终止子和/或多腺苷酸化位点元件可用于提高输出核酸水平和/或通过核酸之间最小化读出。
按照本公开使用的终止子包括本文所述的或本领域普通技术人员已知的任何转录终止子。终止子的示例包括但不限于基因的终止序列比如，例如，牛科动物生长激素终止子，和病毒终止序列比如，例如，SV40终止子、spy、yejM、secG-leuU、thrLABC、rrnB T1、hisLGDCBHAFI、metZWV、rrnC、xapR、aspA和arcA终止子。在一些实施方式中，终止信号可以是不能被转录或翻译的序列，比如由序列截断导致的序列。
可以使用不同基因元件构建大量不同的基因电路。基因系统的不同基因电路可包括在一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)核酸分子(例如，HSV-1载体)中，并且引入细胞中。“核酸”是至少两个共价连接在一起的核苷酸，并且在一些情况下，可含有磷酸二酯键(例如，磷酸二酯“骨架”)。核酸可以是DNA、基因组和/或cDNA二者、RNA或杂交体，其中核酸含有脱氧核苷酸和核糖核苷酸的任何组合(例如，人工或天然)，以及碱基的任何组合，碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。本公开的核酸可以用标准的分子生物学方法生产(例如，参见Green和Sambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2012，Cold Spring HarborPress)。
在一些实施方式中，使用GIBSON
Figure BDA0003354501050000231
克隆生产了基因电路(参见，例如，Gibson,D.G.等，Nature Methods，343-345，2009；和Gibson,D.G.等，Nature Methods，901-903，2010，每篇通过引用并入本文)。GIBSON
Figure BDA0003354501050000232
通常在单管反应中使用三种酶活性：5′核酸外切酶、DNA聚合酶的3′延伸活性和DNA连接酶活性。5'外切酶活性拼接(chew back)5'端序列并且暴露互补序列用于退火。然后，聚合酶活性填补了退火区域的空白。然后DNA连接酶封住缺口并且将DNA片段共价连接在一起。相邻片段的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的更长，因此导致正确组装的百分比更高。
在一些实施方式中，基因电路编码输出分子。“输出分子”是由基因电路响应特定输入信号检测而产生的分子。输出分子可以是，例如，但不限于可检测的分子、治疗分子、诊断分子、功能分子、HSV-1病毒蛋白质或抑制先天免疫应答的分子(本文也称为“先天免疫应答的抑制剂”)。
“可检测的分子”指具有可被检测的信号的分子。在一些实施方式中，可检测的分子是荧光分子，例如，是荧光蛋白质或荧光RNA。荧光蛋白质是当暴露于适当波长处的光源(例如，蓝色或紫外线范围内的光)时发射荧光的蛋白质。可按照本公开使用的适当的荧光蛋白质包括但不限于eGFP、eYFP、eCFP、mKate2、mCherry、mPlum、mGrape2、mRaspberry、mGrape1、mStrawberry、mTangerine、mBanana和mHoneydew。荧光RNA是当结合至荧光基团和暴露于适当的波长处的光源(例如，蓝色或紫外线范围内的光)时发射荧光的RNA适配体。可用作本公开的传感器电路中的输出分子的适当的荧光RNA包括但不限于菠菜和西兰花(例如，如描述于Paige等，Science，第333卷，第6042期，第642-646页，2011中，通过引用并入本文)。在一些实施方式中，可检测的分子是水解底物以产生可检测信号(例如，化学发光信号)的酶。这种酶包括但不限于β-半乳糖苷酶(由LacZ编码)、辣根过氧化物酶或荧光素酶。在一些实施方式中，输出分子是荧光RNA。可检测的分子可用于诊断目的并且这些可检测的分子也被称为“诊断分子”。
在一些实施方式中，输出分子是治疗分子。“治疗分子”是对疾病或病况具有治疗作用并且可用于治疗疾病或病况的分子。本公开的治疗分子可以是基于核酸的或基于蛋白质或多肽的。
在一些实施方式中，基于核酸的治疗分子可以是RNA干扰(RNAi)分子(例如，microRNA、siRNA或shRNA)或核酸酶(例如，核酶)。“RNA干扰(RNAi)是生物过程，其中RNA分子通过中和靶向mRNA分子来抑制基因表达或翻译。在一些实施方式中，输出分子是microRNA、小的干扰RNA(siRNA)或短的发夹RNA(shRNA)，它们抑制先天免疫应答的组分的表达。“microRNA”是小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中发挥作用。“siRNA”是常用的RNA干扰(RNAi)工具，用于诱导蛋白质编码基因的短期沉默。siRNA是被设计为特异性靶向特定mRNA用于降解的合成的RNA双链体。“shRNA”是具有紧密的发夹转(hairpin turn)的人工RNA分子，其经RNA干扰(RNAi)可用于沉默靶向基因表达。
RNAi分子及其在沉默基因表达中的使用是本领域技术人员熟悉的。在一些实施方式中，RNAi分子靶向致癌基因。致癌基因是在某些情况下可以将细胞转化为肿瘤细胞的基因。致癌基因可以是编码生长因子或有丝分裂原(例如，c-Sis)、受体酪氨酸激酶(例如，EGFR、PDGFR、VEGFR或HER2/neu)、细胞质酪氨酸激酶(例如，Src家族激酶、Syk-ZAP-70家族激酶或BTK家族激酶)、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶或它们的调节亚基(例如，Raf激酶或细胞周期蛋白依赖性激酶)、调节GTPase(例如，Ras)或转录因子(例如，Myc)的基因。本领域技术人员熟悉可被靶向以治疗癌症的基因。
在一些实施方式中，基于核酸的治疗分子可是引导RNA(gRNA)。本文的“引导RNA”指CRISPR靶向RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的融合，为Cas9核酸酶提供靶向特异性和支架/结合能力。“crRNA”是赋予靶向特异性并且需要tracrRNA与Cas9结合的细菌RNA。“tracrRNA”是将crRNA与Cas9核酸酶连接并且通常可以结合任何crRNA的细菌RNA。CasDNA结合蛋白质的序列特异性是由gRNA决定的，gRNA与靶向DNA序列具有核苷酸碱基配对互补性。天然gRNA包括20个核苷酸(nt)特异性决定序列(SDS)，其指出待靶向的DNA序列，并且紧接着是80nt的支架序列，其将gRNA与Cas9关联起来。在一些实施方式中，本公开的SDS具有15至100个核苷酸或更长的长度。例如，SDS可具有15至90、15至85、15至80、15至75、15至70、15至65、15至60、15至55、15至50、15至45、15至40、15至35、15至30或15至20个核苷酸的长度。在一些实施方式中，SDS是20个核苷酸长。例如，SDS可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长。引导RNA与RNA引导的核酸酶(例如，Cas9核酸酶及其同源物)结合使用，以将RNA引导的核酸酶靶向靶位点。正因如此，当基于核酸的治疗分子是gRNA时，也提供了RNA引导的核酸酶(例如，也由基因电路编码，或在共转染的质粒上提供)。
基于蛋白质或多肽的治疗分子的非限制性示例包括酶、调节蛋白质(例如，免疫调节蛋白质)、抗原、抗体或抗体片段和结构蛋白质。在一些实施方式中，基于蛋白质或多肽的治疗分子用于癌症疗法。
对于本公开的一些实施方式的合适的酶(用于可操作地连接至合成的启动子)包括，例如，氧化还原酶、转移酶、聚合酶、水解酶、裂解酶、合成酶、异构酶和连接酶、消化酶(例如，蛋白酶、脂肪酶、碳水化合物酶和核酸酶)。在一些实施方式中，酶选自由以下组成的组中：乳糖酶、β-半乳糖苷酶、胰腺酶、油降解酶、粘液酶、纤维素酶、异麦芽糖酶、藻酸酶、消化脂肪酶(例如，舌脂肪酶、胰腺脂肪酶、磷脂酶)、淀粉酶、纤维素酶、溶菌酶、蛋白酶(例如，胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶)、酯酶(例如甾醇酯酶)、双糖酶(例如，蔗糖酶、乳糖酶、β-半乳糖苷酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶)、DNases和RNases。
抗体及其片段的非限制性示例包括：贝伐单抗
Figure BDA0003354501050000251
曲妥珠单抗
Figure BDA0003354501050000252
阿仑单抗(
Figure BDA0003354501050000253
适用于B细胞慢性淋巴细胞白血病)、吉妥单抗(
Figure BDA0003354501050000254
hP67.6，抗CD33，适用于白血病比如急性髓系白血病)、利妥昔单抗
Figure BDA0003354501050000255
托西莫单抗(
Figure BDA0003354501050000256
抗CD20，适用于B细胞恶性肿瘤)、MDX-210(同时结合至HER-2/neu癌基因蛋白质产物和免疫球蛋白G(IgG)的I型Fc受体的双特异性抗体(FcγRI))、奥戈伏单抗(
Figure BDA0003354501050000261
适用于卵巢癌)、依决洛单抗
Figure BDA0003354501050000262
达利珠单抗
Figure BDA0003354501050000263
帕利珠单抗(
Figure BDA0003354501050000264
适用于呼吸病症比如RSV感染)、替伊莫单抗(
Figure BDA0003354501050000265
适用于非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗
Figure BDA0003354501050000266
MDX-447、MDX-22、MDX-220(抗TAG-72)、IOR-C5、IOR-T6(抗CD1)、IOR EGF/R3、西洛果瓦(
Figure BDA0003354501050000267
OV103)、依帕珠单抗
Figure BDA0003354501050000268
培妥莫单抗
Figure BDA0003354501050000269
Gliomab-H(适用于脑癌症、黑素瘤)。在一些实施方式中，抗体是抑制免疫检查点蛋白质的抗体，例如，抗PD-1抗体比如培布利珠单抗
Figure BDA00033545010500002610
或尼伏鲁单抗
Figure BDA00033545010500002611
或抗CTLA-4抗体比如伊匹单抗
Figure BDA00033545010500002612
其他抗体和抗体片段可以被可操作地连接至合成的启动子，如本文提供的。
在一些实施方式中，调节蛋白质可以是转录因子或免疫调节蛋白质。非限制性的、示例性的转录因子的包括：NFkB家族的那些，比如Rel-A、c-Rel、Rel-B、p50和p52；AP-1家族的那些，比如Fos、FosB、Fra-1、Fra-2、Jun、JunB和JunD；ATF；CREB；STAT-1、-2、-3、-4、-5和-6；NFAT-1、-2和-4；MAF；甲状腺因子；IRF；Oct-1和-2；NF-Y；Egr-1以及USF-43、EGR1、Sp1和E2F1。其他转录因子可以被可操作地连接至合成的启动子，如本文提供的。
如本文使用的，免疫调节蛋白质是调节免疫应答的蛋白质。免疫调节的非限制性示例包括：抗原、佐剂(例如，鞭毛蛋白、胞壁酰二肽)，细胞因子包括白细胞介素(例如，IL-2、IL-7、IL-15或这些细胞因子的超拮抗剂/突变体形式)、IL-12、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、FLT3-配体)和免疫刺激抗体(例如，抗CTLA-4、抗CD28、抗CD3或这些分子的单链/抗体片段)。其他免疫调节蛋白质可被可操作地连接至合成的启动子，如本文提供的。
如本文所使用的，抗原是被抗体的抗原结合部位结合的分子或部分的分子。在一些实施方式中，抗原是这样的分子或部分，其当向受试者的细胞施用或在受试者的细胞中表达时，会激活或增加特异性结合抗原的抗体的产生。病原体的抗原是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于细菌、病毒和其他微生物的部分(例如，外壳、胶囊、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)。可按照本公开使用的抗原的示例包括但不限于癌症抗原、自体抗原、微生物抗原、过敏原和环境抗原。其他抗原可被可操作地连接至合成的启动子，如本文提供的。
在一些实施方式中，本公开的抗原是癌症抗原。癌症抗原是优先由癌细胞表达的抗原(即，其在癌细胞中的表达水平高于在非癌细胞上的表达水平)，并且在某些情况下，它只由癌细胞表达。癌症抗原可以在癌细胞内或在癌细胞表面上表达。可按照本公开使用的癌症抗原包括但不限于MART-1/Melan-A、gp100、腺苷脱氨酶结合蛋白质(ADAbp)、FAP、亲环蛋白b、结直肠相关的抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链和CD20。癌症抗原可选自由以下组成的组中：MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4和MAGE-C5。癌症抗原可选自由以下组成的组中：GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8和GAGE-9。癌症抗原可选自由以下组成的组中：BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘着蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤样息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig-个体基因型、p15、gp75、GM2神经节苷脂、GD2神经节苷脂、人乳头瘤病毒蛋白质、肿瘤抗原的Smad家族、lmp-1、P1A、EBV-编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、CD20和c-erbB-2。其他癌症抗原可被可操作地连接至合成的启动子，如本文提供的。
在一些实施方式中，治疗分子是抗癌剂。在一些实施方式中，抗癌剂是寡核苷酸(例如，治疗性RNAi，antagomir等)或多肽(例如，抗体)。用于治疗癌症的抗体对本领域技术人员是已知的。例如，抗癌剂可以是免疫检测点抑制剂。“免疫检测点”是增强免疫应答信号(共刺激分子)或减少免疫应答信号的免疫系统中的蛋白质。许多癌症通过利用抑制免疫检查点蛋白质以抑制T细胞信号来保护自己免受免疫系统的伤害。示例性抑制检查点蛋白质包括但不限于细胞毒性T-淋巴细胞相关的蛋白质4(CTLA-4)、程序性死亡1受体(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM3)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、含有V-set结构域的T细胞激活抑制剂1(VTVN1或B7-H4)、分化簇276(CD276或B7-H3)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、半乳凝素-9(GAL9)、检查点激酶1(Chk1)、腺苷A2A受体(A2aR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制因子(VISTA)。
这些免疫检查点蛋白质中的一些需要它们的同源结合伙伴或配体，用于它们的免疫抑制活性。例如，A2AR是腺苷A2A的受体，并且A2A与A2AR的结合激活了负向免疫反馈环。作为另一示例，PD-1与其两个配体PD-L1和PD-L2结合，以通过阻止T细胞的激活来下调免疫系统。PD-1促进淋巴结中抗原特异性T-细胞的程序性细胞死亡，并且同时减少抑制因子T细胞的程序性细胞死亡，从而实现其免疫抑制功能。作为仍另一示例，CTLA4存在于T细胞表面上，并且当结合至抗原呈递细胞(APC)表面上的其结合伙伴CD80或CD86时，其向T细胞递送抑制信号，从而降低免疫应答。
“免疫检查点抑制剂”是防止或削弱免疫检查点蛋白质活性的分子。例如，免疫检查点抑制剂可以抑制免疫检查点蛋白质与其同源结合伙伴，例如，PD-1、CTLA-4或A2aR的结合。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是小分子。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是核酸适配体(例如，靶向任何一种免疫检查点蛋白质的siRNA)。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是重组蛋白质。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗体。在一些实施方式中，抗体包括抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM3、抗LAG3、抗B7-H3、抗B7-H4、抗BTLA、抗GAL9、抗Chk、抗A2aR、抗IDO、抗KIR、抗LAG3、抗VISTA抗体或任何两种或更多种前述抗体的组合。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是单克隆抗体。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂包括抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA-4或任何两种或更多种前述抗体的组合。例如，抗PD-1抗体是培布利珠单抗
Figure BDA0003354501050000281
或尼伏鲁单抗
Figure BDA0003354501050000282
和抗CTLA-4抗体是伊匹单抗
Figure BDA0003354501050000291
因此，在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂包括培布利珠单抗、尼伏鲁单抗、伊匹单抗或两种或更多种前述抗体的任何组合。
在一些实施方式中，基于蛋白质或多肽的治疗分子是融合蛋白质。融合蛋白质是包括经肽键直接地或间接地(例如，经连接体)共价结合至彼此的两种异源蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段的蛋白质。在一些实施方式中，融合蛋白质由核酸编码，所述核酸包括框架中的蛋白质的编码区，所述框架具有另外蛋白质的编码区，而不具有介于中间的(intervening)终止密码子，从而导致其中蛋白质融合在一起的单一蛋白质的翻译。
在一些实施方式中，输出分子是功能性分子。“功能性分子”指能够与其他分子或电路相互作用以发挥功能(例如，转录调节、DNA或RNA裂解或任何活性)的分子。示例性的功能性分子包括但不限于酶(例如，不限于核酸酶)、转录调节剂(例如，不限于激活剂和抑制剂)、RNAi分子(例如，不限于siRNA、miRNA、shRNA)和抗体。在一些实施方式中，功能性分子是核酸酶(例如，位点特异性核酸酶)。
在一些实施方式中，输出分子是HSV-1病毒蛋白质。在一些实施方式中，HSV-1病毒蛋白质可以是从修饰的HSV-1基因组缺失的蛋白质。它们从基因电路中的条件性表达补充了缺失，但是会赋予较少的毒性。在一些实施方式中，HSV-1病毒蛋白质是促进病毒DNA复制和病毒颗粒产生的病毒蛋白。虽然这些基因没有被缺失，其可期望进一步提供处于反式的这些蛋白质以增加这些蛋白质的有效浓度。可用作输出分子的HSV-1病毒蛋白质的非限制性示例包括：VP16、ICP0、ICP27、ICP22、ICP47、ICP6、ICP8和γ34.5(ICP34.5)。
在一些实施方式中，输出分子是先天免疫应答的抑制剂。例如，输出分子可以是靶向先天免疫应答组分的RNAi分子。“先天免疫应答”指通过先天免疫系统的应答。先天免疫系统使用一系列生殖细胞系-编码的受体(“模式识别受体”或“PRR”)，用于识别微生物中存在的保守分子模式。这些分子模式发生在微生物的某些成分中，所述微生物包括：脂多糖，肽聚糖、脂膜酸、磷脂酰胆碱、包括脂蛋白的细菌特异性蛋白质、细菌DNA、病毒单链和双链RNA、未甲基化的CpG-DNA、甘露糖和各种其他细菌和真菌细胞壁组分。这种分子模式也可发生在其他分子比如植物生物碱中。先天免疫识别的这些靶被称为病原体相关分子模式(PAMP)，因为它们是由微生物而不是由感染的宿主生物体产生的。在一些实施方式中，由本文所述的组合物引起的先天免疫应答通过增强对随后刺激的先天免疫应答，对广泛的病原性微生物赋予异源性(“非特异性”)免疫性，这种现象被称为“训练的免疫性”，一种先天记忆的形式，例如，如描述于Netea等(Trained Immunity:An Ancient Way ofRemembering.Cell Host Microbe.2017Mar 8；21(3):297-300中，通过引用并入本文)。
识别PAMP的先天免疫系统的受体被称为模式识别受体(PRR)。(Janeway等，(1989)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.54:1-13；Medzhitov等，(1997)Curr.Opin.Immunol.94:4-9，通过引用并入本文)。PRR结构不同并且属于几种不同蛋白质家族。这些受体的一些直接地识别PAMP(例如，CD14、DEC205、胶原凝集素)，而其他(例如，补体受体)识别通过PAMP识别产生的产物。一般而言，这些受体家族的成员可以被分为三种类型：1)在血浆中循环的体液受体；2)在免疫细胞表面上表达的内吞作用受体和3)可以在细胞表面上或细胞内表达的信号传导受体。(Medzhitov等，(1997)Curr.Opin.Immunol.94:4-9；Fearon等，(1996)Science 272:50-3，通过引用并入本文)。PRR的非限制性示例包括：toll样受体(例如，TLR2)、NOD1/2、RIG-1/MDA-5、C-型凝集素和STING。
细胞PRR在先天免疫系统的效应细胞上表达，包括在适应性免疫中用作专业抗原呈递细胞(APC)的细胞。这种效应细胞包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和表面上皮细胞。这种表达谱允许PRR直接诱导先天效应机制，并且还通过诱导一系列内源信号的表达，比如炎症性细胞因子和趋化因子，包括但不限于：趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，提示宿主生物致病因子的存在。该后者的功能允许有效调动效应子力量来对抗入侵者。
因此，可以靶向的先天免疫系统组分包括但不限于PRR、趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。抑制先天免疫系统组分的表达抑制了先天免疫应答(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多)。
在一些实施方式中，先天免疫应答的抑制剂是已知的病毒蛋白质，其功能是对某些感染的病毒进行免疫规避。这种蛋白质的一个非限制性示例是牛痘B18R蛋白质。从HSV-1表达的某些miRNA也被证明下调先天免疫系统。任何在病毒的免疫规避中发挥作用的已知病毒蛋白质可按照本公开使用，例如，描述于Garcia-Sastre等，Cell Host&Microbe，第22卷，第2期，第176-184页，2017中的那些，通过引用并入本文)。
本公开的其他方面提供了包括本文所述的工程化的HSV-1载体的包装细胞。工程化的HSV-1病毒颗粒被包装在包装细胞中。对于病毒颗粒包装，工程化的HSV-1载体被递送至包装细胞，例如，经任何本领域技术人员已知的方法，比如转染或电穿孔。在一些实施方式中，工程化的HSV-1载体被整合入包装细胞的基因组中(例如，经重组)。
在一些实施方式中，包装细胞被工程化，使得其表达(例如，瞬时地或组成地)从修饰的HSV-1基因组缺失的HSV-1病毒蛋白质或增强病毒复制和病毒颗粒包装的HSV-1病毒蛋白质。例如，包括编码这些HSV-1病毒蛋白质的核苷酸序列的质粒可以与工程化的HSV-1载体共转染，并且HSV-1病毒蛋白质的表达可以置于诱导型启动子的控制下。可用作输出分子的HSV-1病毒蛋白质的非限制性示例包括：VP16、ICP0、ICP27、ICP22、ICP47、ICP6、ICP8和γ34.5(ICP34.5)。在一些实施方式中，包装细胞被工程化，使得其表达(例如，瞬时地或组成地)先天免疫应答的抑制剂。可以使用本文所述的或本领域已知的先天免疫应答的任何抑制剂。
在一些实施方式中，包装细胞产生至少1个蚀斑形成单位(pfu)的HSV-1病毒颗粒。例如，包装细胞可以产生至少1、至少10、至少100、至少1000、至少104、至少105或更多个pfu的HSV-1病毒颗粒。在一些实施方式中，包装细胞产生约1、约10、约100、约1000、约104、约105或更多个pfu的HSV-1病毒颗粒。“约”意味着3％以内，例如，3％更多或3％更少。
任何适合于病毒颗粒包装的细胞都可用作本公开的包装细胞。在一些实施方式中，包装细胞是真核细胞。按照本发明使用的真核细胞的示例包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母)和植物细胞。在一些实施方式中，真核细胞来自脊椎动物。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞来自啮齿动物，比如小鼠或大鼠。按照本公开使用的脊椎动物细胞的示例包括但不限于生殖细胞，其包括精子、卵子和胚胎细胞，以及非生殖细胞，其包括肾、肺、脾、淋巴、心脏、胃、肠、胰腺、肌肉、骨、神经、脑和上皮细胞。也可以使用干细胞，包括胚胎干细胞。典型地，优选使用具有高转染效率和低先天免疫应答的细胞系，用于高的病毒滴度产生。在一些实施方式中，包装细胞是U2OS细胞(
Figure BDA0003354501050000321
HTB-96TM)。
还提供了包括本文所述的工程化的HSV-1载体或由本文所述的包装细胞产生的工程化的HSV-1病毒颗粒。工程化的HSV-1颗粒可用于各种各种应用，例如，用于将基因电路递送至细胞中以及用于其他治疗和诊断目的。因此，提供了将基因电路递送至细胞的方法，方法包括将细胞与本文所述的HSV-1载体或工程化的HSV-1病毒颗粒接触，其中工程化的HSV-1载体包括基因电路。接触可以在体外、体内或离体进行。细胞可以是真核细胞。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞比如人细胞。细胞可从人受试者中分离，并且接触可在体外或离体进行。细胞可以在人受试者中，并且接触在体内进行。
本公开的其他方面提供了治疗疾病的方法，方法包括将有效量的工程化的HSV-1病毒颗粒施用于需要其的受试者，其中工程化的HSV-1载体包括编码治疗分子的基因电路。还提供了诊断疾病的方法，方法包括将有效量的工程化的HSV-1病毒颗粒施用于需要其的受试者，其中工程化的HSV-1载体包括编码诊断分子的基因电路。
在一些实施方式中，与受试者的天然HSV-1颗粒相比，工程化的HSV-1病毒颗粒不诱导受试者中的免疫应答或诱导较低的免疫应答(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％更低)。免疫应答可以通过本领域已知的任何方法来测量，例如，通过测量针对工程化的HSV-1病毒颗粒的抗体滴度，测量施用工程化的HSV-1病毒颗粒后受试者的细胞因子产生或T细胞激活。
在一些实施方式中，工程化的HSV-1感染了受试者的细胞，并且将基因电路递送至受试者的细胞。根据所递送的基因电路的类型和受试者的细胞状态(例如，基因表达谱，如microRNA谱)，可以产生输出分子(例如，诊断分子或治疗分子)，指示疾病状态或向具有疾病的受试者提供治疗。
在一些实施方式中，工程化的HSV-1病毒颗粒可被配制成用于向受试者施用的组合物。在一些实施方式中，组合物是药物组合物。在一些实施方式中，组合物进一步包括另外试剂(例如，用于特定递送、增加半衰期或其他治疗剂)。在一些实施方式中，组合物进一步包括药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触使用，而不具有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。“药学上可接受的载体”是药学上可接受的材料、组合物或媒介，比如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其参与将所述试剂从一个器官或身体的一部分携带或传输至另一个器官或身体的一部分。每种载体必须从与制剂的其他成分相容的意义上说是“可接受的”。
可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括但不限于：(1)糖，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶(tragacanth)；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，比如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；(9)油，比如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，比如丙二醇；(11)多元醇，比如甘油，山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，比如油酸乙酯和乙基月桂酸酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨胀剂，比如肽和氨基酸；(23)血清组分，比如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，比如乙醇；和(25)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。术语比如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等本文是互换地使用的。
“有效量”指单独或与一种或多种其他治疗剂组合使用的，对受试者赋予治疗效果所需的工程化的HSV-1病毒颗粒或包括这种工程化的HSV-1病毒颗粒的组合物的量。如本领域技术人员所认识到的，有效量取决于正被治疗的特定病症、病症的严重程度、个体受试者参数(包括年龄、身体状况、体型(size)、性别和体重)、治疗的持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体的施用途径以及健康从业者知识和专长范围内的类似因素而变化。这些因素对本领域技术人员来说是众所周知的，并且只需进行常规实验就可以解决。一般来说，优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域技术人员将理解，受试者可能会因为医疗原因、心理原因或几乎任何其他原因而坚持使用较低的剂量或可容忍的剂量。
经验上考虑，比如半衰期，一般将有助于剂量的确定。施用频率可在治疗过程中确定和调整，并且一般而言，但不一定是必须，基于疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替选地，试剂的持续的连续的释放制剂可能是适当的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。
有效量的工程化的HSV-1病毒颗粒或包括其的组合物可以向受试者重复地施用(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)。在一些实施方式中，剂量是每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天或每六天。在一些实施方式中，给药频率是每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每个月、每2个月或每3个月或更久一次。该疗法的进展很容易通过常规技术和测定方法进行监测。给药方案(包括使用的试剂)可以随时间变化。
在一些实施方式中，对于正常体重的成年受试者，可施用约0.01至1000mg/kg范围的剂量。在一些实施方式中，剂量在1至200mg之间。特定剂量方案，即剂量、时间和重复，将取决于特定受试者和受试者的病史，以及试剂的特性(比如试剂的半衰期和本领域众所周知的其他考虑)。
对于本公开的目的，如本文所述的工程化的HSV-1病毒颗粒或包括其的组合物的适当剂量将取决于所采用的特定试剂(或其组合物)、制剂和施用途径、疾病的类型和严重程度、先前的疗法、受试者的临床病史和对试剂的反应以及主治医生的判断。通常，临床医生将施用试剂，直到达到实现期望结果的剂量。施用可以是连续的或间歇的，例如，取决于受试者的生理状况，以及熟练从业者已知的其他因素。试剂的施用可以在预先选择的时间段内基本连续进行，或可以在一系列间隔的剂量中进行，例如，在疾病发展之前、期间或之后。
“受试者”指人和非人动物，比如猩猩、猴子、马、牛、绵羊、山羊、狗、猫、兔子、豚鼠、啮齿动物(例如，大鼠和小鼠)。在一个实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是作为疾病模型的实验动物或动物替代品。“需要其的受试者”指具有疾病或紊乱(例如，癌症)或处于疾病或紊乱(例如，癌症)风险的受试者。
工程化的HSV-1病毒颗粒或包含其的组合物可通过本领域已知的任何体内递送方法递送至受试者(例如，哺乳动物受试者，比如人受试者)。例如，工程化的HSV-1病毒颗粒或包括其的组合物可以静脉内递送。在一些实施方式中，工程化的核酸在递送媒介(例如，非脂质体纳米颗粒或脂质体)中递送。在一些实施方式中，工程化的HSV-1病毒颗粒或包括其的组合物被全身地递送至具有癌症或其他疾病的受试者，并且在受试者的癌细胞或病变细胞中特异性地产生治疗分子。在一些实施方式中，工程化的HSV-1病毒颗粒或包括其的组合物被局部地递送至疾病或紊乱的位点(例如，癌症的位点)。
可以使用本文所述的组合物和方法治疗各种疾病。在一些实施方式中，疾病是可通过基因疗法治疗的疾病。本领域技术人员熟悉这种疾病。在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，疾病是恶病质。
可以使用本文所述的组合物和方法治疗的癌症的非限制性示例包括：癌前肿瘤、恶性肿瘤、转移、或任何特征在于不受控制的细胞生长使得其被认为是癌症或癌症前期的疾病或紊乱。癌症可以是原发性或转移性癌症。癌症包括但不限于眼癌、胆道癌、膀胱癌、胸膜癌、胃癌、卵巢癌、脑膜癌、肾癌、包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤的脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、包括急性淋巴细胞和骨髓性白血病的血液肿瘤、多发性骨髓瘤、AIDS相关的白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤、包括鲍恩病和佩吉特病是上皮内肿瘤、肝癌、肺癌、包括霍奇金疾病和淋巴细胞淋巴瘤的淋巴瘤、成神经细胞瘤、包括鳞状细胞癌的口腔癌、包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间质细胞产生的那些的卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌)、睾丸癌(包括比如精原细胞瘤、非精原细胞瘤、畸胎瘤、绒毛膜癌、基质瘤和生殖细胞瘤)、包括甲状腺腺癌和脊髓癌的甲状腺癌、包括腺癌和威尔姆斯瘤的肾癌。常见的癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌和脑癌。在一些实施方式中，肿瘤是黑素瘤、癌、肉瘤或淋巴瘤。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌或肺癌。
实施例
病毒试剂具有大量的治疗和生物技术应用。传统的分子生物学技术通过引入修饰用于治疗基因递送、提高安全性和对靶细胞的趋向性，扩大了病毒的效用。迄今为止，基于腺病毒、牛痘和疱疹病毒(HSV-1)的修饰病毒已经被批准用于人。
然而，复杂基因电路的递送仍然是一个挑战。本文描述的是适合于体外和体内递送大型(例如，至多100kb)、复杂基因线路的工程化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体。递送平台被设计为利用标准化的基因元件库和基于高效分子生物学方法的工作流来快速和模块化构建原型。该库包括治疗基因、用于转录控制的启动子和抑制剂、绝缘子、polyA序列和生物传感器(包括microRNA和环境敏感启动子)，用于构建能够进行组成型或条件型基因表达的转录单元。电路通过将多个转录单元并入具有转录调控的分层级联的平台来构建，以实现对输出的基于逻辑的控制。如本文证明的，使用工程化的HSV-1载体成功地递送了能够感知四种miRNA(1种高和3种低)，加工信息，和有条件地表达输出的多种miRNA输入分类器。
实施例1.工程化的HSV-1载体
已知HSV-1蛋白质上调最小CMV启动子，其是用于工程化的启动子的几种最小启动子之一(例如，如Herrlinger等，J Gene Med.2000Sep-Oct；2(5):379-89，通过引用并入本文)。还已知HSV-1蛋白质导致细胞死亡。为了鉴定电路干扰较少和毒性较小的突变体，产生了HSV-1缺失突变体。HSV-1株F、17和KOS被用于研究。选择的HSV-1株的基因组被克隆至细菌人工染色体(BAC)中，并且通过λred重组进行修饰。在原型包装细胞系中测量了它们的复制效率。选择最优秀的候选人，并且整合了分类器电路，以表征电路行为以及细胞毒性。
表2.HSV-1变体的列表(41种变体，这里没有列出菌株F变体)
Figure BDA0003354501050000371
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Figure BDA0003354501050000401
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Figure BDA0003354501050000431
Figure BDA0003354501050000441
Figure BDA0003354501050000451
*MD300系列：菌株KOS
*MD101和400系列：菌株17
MD417的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)
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实施例2.包装细胞系
为了产生高滴度的工程化的HSV-1，构建了可补充缺失的病毒基因并且支持复制的包装细胞系。病毒基因可对细胞有毒性，因此在病毒颗粒产生期间，它们的表达被置于强力霉素的控制下。U2OS细胞系被用来构建包装细胞系，因为它们可在一定程度上自然地补充VP16和ICP0(例如，如Yao等，Journal of Virology.1995；69(10):6249-6258中描述的，通过引用并入本文)并且能经受ICP27的组成型表达。
实施例3.电路的快速、标准化的组装和整合入HSV-1骨架中
图3描述了电路的快速、标准化的组装和整合入HSV-1骨架中。包括绝缘子、启动子、5’UTR、基因、3’UTR和polyA的各个部分使用BsaI通过MoClo反应与位置载体组装成转录单元。然后，通过Gibson组装反应将不同位置载体中的这些转录单元与载体和适配体骨架组装成电路。使用在温度敏感启动子下编码整合酶的辅助质粒，将该电路整合入基因组上具有着陆垫(landing pad)的HSV-1骨架中。使用在温度敏感启动子下编码Flp的辅助质粒，通过Flp去除整合标记。然后，电路HSV-1 DNA被纯化，并且与表达Cre的质粒共转染至包装细胞中，以重组感染电路HSV-1。重组的电路HSV-1可以被滴定并且注入小鼠模型中，用于HSV-1分类复制的体内表征，如实施例4中描述的。
实施例4.HSV-1分类复制的体内表征
应用之一是病毒递送的多步骤程序化癌症免疫疗法(图4)。程序化治疗病毒经瘤内注射注入原发肿瘤中。病毒仅在肿瘤细胞中选择性复制和传播，并且引起肿瘤细胞的初步细胞死亡，随后募集免疫系统。剩余的肿瘤细胞被免疫系统去除。
为了研究条件复制HSV-1的性能，对五只小鼠的组进行了实验。在注入病毒前的7天，将10,000个表达萤火虫荧光素酶(Fluc)的4T1细胞植入小鼠乳腺脂肪垫。用仅PBS(无处理，第1组)、非复制性毒(第2组)、组成型复制病毒(第3组)、条件复制病毒(第4组)或条件复制病毒与IL-12(第5组)注入五组小鼠中的每组中。输注后15天内，通过成像Fluc监测肿瘤大小(图5A)。生存曲线显示，用条件复制病毒处理的组比其他组存活时间长(图5B)。
有趣地，用条件复制病毒与IL-12处理的组比用条件复制病毒处理的组存活率低。通过在不同时间点检测血液和引流淋巴结中的Fluc信号来测量转移(图5C)。血液转移与小鼠的早期死亡相关。引流淋巴结转移与中间时间死亡反相关。条件复制处理导致低血液和引流淋巴结转移。
方法和材料
表3.辅助质粒
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表4：用于HSV-1修饰的寡核苷酸
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哺乳动物细胞培养
HEK293细胞系购买自Invitrogen。Vero和U2OS细胞系购买自ATCC。从Massachusetts General Hospital的Xandra Breakfield实验室获得Vero 2-2细胞系。在37℃、100％湿度和5％CO2下，HEK293、Vero和Vero 2-2细胞系维持在补充10％FBS的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，Cellgro)中。在37℃、100％湿度和5％CO2下，U2OS细胞系维持在补充10％FBS的McCoy’s 5A中。在37℃、100％湿度和5％CO2下，包装细胞系维持在补充10％、0.5ug/mL的嘌呤霉素和1ug/mL的杀稻瘟菌素(blasticidin)的McCoy’s 5A中。
HSV-1基因组的无标志物修饰：无标志物修饰盒的制备
为了缺失HSV-1基因组中选择的靶区域，构建了辅助质粒，其含有～500-bp同源性区域，随后是卡那霉素抗性基因(KanR)和I-SceI识别位点，用于I-SecI诱导的DSB介导的DNA修复或attP，随后是大观霉素抗性基因(SpecR)和同源的attB位点，用于丝氨酸整合酶介导的DNA切除。对于插入，感兴趣的DNA序列被置于500bp同源区或attP位点之前。使用与靶区域具有50-bp同源区的引物，通过PCR扩增辅助质粒上的这些区域。片段经过凝胶电泳纯化，随后进行柱纯化(Zymo Research，USA)。然后，用DpnI(New England BioLabs，USA)消化纯化的PCR产物，并且通过柱纯化进一步纯化。
HSV-1基因组的无标志物修饰：电感受态细胞的制备
为了制备电感受态细胞，在3ml的补充羧苄西林(Carb，50ug/mL)和氯霉素(Cm，12.5ug/mL)的LB培养基中接种携带pREDI和HSV-1 BAC的大肠杆菌DH10B细胞菌落，并且在30℃生长过夜。第二天，将过夜的培养物在10ml的LB培养基中稀释30倍，并且在30℃生长。3小时后，加入200μL的16％阿拉伯糖并且进一步生长1小时。通过以4000g离心10分钟，收获细胞，并且用冰冷的10％甘油洗涤三次。
HSV-1基因组的无标志物修饰：插入物的转换
为了取代HSV-1基因组的靶向区域，将制备的无标志物修饰盒(400ng)电转化到50μl的制备的制备电感受态细胞中。在30℃在1ml的SOC培养基中孵育电转化的大肠杆菌细胞3小时，铺在含有Carb、Cm和Kan的LB板(25μg/mL)上，用于I-SecI诱导的DSB介导的DNA修复，或含有Cm和Spec的LB板(100μg/mL)上，用于丝氨酸整合酶介导的DNA切除，并且在30℃孵育另外16小时。通过PCR使用一对位于靶向区域的端点两侧的引物和一对对位于靶向区域内的基因特异性的引物验证通过无标志物缺失盒对靶基因组区域的正确取代。
HSV-1基因组的无标志物修饰：使用I-SceI诱导的双链断裂介导的DNA修复去除选择标志物
然后通过由pREDI表达的I-SceI内切核酸酶介导的DSB修复，将如以上所述引入基因组的选择标志物(KanR_I-SceI)从HSV-1基因组中切除。简言之，大肠杆菌细胞在3ml的含有Carb和Cm的LB液体培养基中在30℃生长至OD600＝0.4，然后稀释30倍到3ml的含有Carb、Cm和10mM鼠李糖的新鲜LB液体培养基中，在30℃生长至OD600＝0.4。在五轮具有30倍稀释的连续培养后，将细胞铺在在含有Carb、Cm和10mM鼠李糖的LB板上。然后选择无标志物修饰突变体(对Carb和Cm抗性和对Kan敏感的菌落)。通过PCR验证选择标志物的切除，然后进行测序，使用一对在基因组靶区域的端点侧翼的特定引物。当需要时，通过大肠杆菌在42℃过夜而不使用Carb来去除pREDI。
HSV-1基因组的无标志物修饰：使用丝氨酸整合酶介导的DNA切除去除选择标志物
然后通过丝氨酸整合酶介导的DNA切除将如以上所述引入基因组的选择标志物(attP_SpecR_attB)从HSV-1基因组中切除。简言之，大肠杆菌细胞被同源的辅助质粒转化，并且铺在补充Carb和Cm的LB琼脂平板上。然后接种菌落，并且在3ml的含有Carb和Cm的LB液体培养基中在30℃生长至OD600＝0.4，然后补充60μL的16％阿拉伯糖。在再一轮用阿拉伯糖稀释30倍的连续培养后，将细胞铺在含有Cm的LB板上，在42℃孵育另外16小时。然后选择无标志物修饰突变体(对Cm抗性和对Spec敏感的菌落)。通过PCR验证选择标志物的切除，然后进行测序，使用一对在基因组靶区域的端点侧翼的特定引物。
电路的快速组装：部件组装成转录单元(TU)
为了将部件组装成TU，使用了Golden Gate Assembly反应。简言之，将至多20μl的最终总体积的1μl的BsaI(New England BioLabs，USA)、0.5μl的T4连接酶((New EnglandBioLabs，USA))、0.5μl的T4连接酶缓冲液((New England BioLabs，USA)、2μl的10xBSA(NEB)、40fmol的骨架、适配体、TU和ddH2O放置入PCR管。用于所有组装的热循环仪程序是：1步，在37℃15分钟；然后50个循环，在37℃2分钟，在16℃5分钟；1步，在37℃15分钟；1步，在60℃20分钟；1步，在50℃5分钟；和最后1步，在80℃5分钟。将1.5μL的反应物转化为6μL的Stellar化学感受态细胞(Takara Bio USA,USA)，在60μL的SOC(New England BioLabs，USA)中进行拯救，并且将其30μL铺在补充Carb的LB琼脂板上，随后在37℃孵育过夜。通过限制消化图谱确认正确的克隆。
电路的快速组装：TU组装成电路
为了将TU组装成电路，根据制造商的方案(SGI-DNA，USA)使用Gibson组装反应。1μL的反应物被电穿孔入TransforMaxTMEC100DTMpir+电感受态大肠杆菌(Epicentre，USA)。然后在1mL的SOC(New England BioLabs，USA)中，在37℃拯救1小时。将其30μL放置于补充Kan和Spec的LB琼脂板上，并且在30℃孵育过夜。通过限制消化图谱确认正确的克隆。
使用丝氨酸整合酶介导的DNA插入快速电路整合入HSV-1基因组
为了将电路整合入HSV-1基因组中，将辅助质粒转化入携带HSV-1BAC的大肠杆菌DH10B细胞中，并且将转化体铺在补充Carb和Cm的LB琼脂板上，并且在30℃孵育过夜。随后，将感兴趣的电路电穿孔入携带辅助质粒和HSV-1 BAC的大肠杆菌DH10B细胞中，并且将转化提铺在具有Carb、Cm、Kan和Spec的LB琼脂板上，并且在30℃孵育过夜。将菌落接种在补充Cm、Kan和Spec的LB液体培养基中，并且在42℃孵育20分钟，然后在37℃过夜。过夜培养物在补充Cm、Kan和Spec的LB琼脂上重新划线，并且在42℃孵育过夜。将菌落接种在补充Cm、Kan和Spec的LB液体培养基中，并且纯化BAC DNA以在包装细胞系中重组。
包装细胞系的快速构建：通过慢病毒转导将着陆垫整合入U2OS基因组中
网关系统被用来构建整合载体。慢病毒网关目的载体含有pFUGW(1)(Addgene)骨架和网关盒(包括attR4和attR2重组位点侧翼的氯霉素抗性和ccdB基因)，随后是构成性表达的杀稻瘟菌素或嘌呤霉素抗性标志物。目的载体与携带人延伸因子1α(hEF1a)启动子和mKate2或EBFP2荧光蛋白质的进入载体的LR反应被用来创建以下表达载体：pLV-mKate2-嘌呤霉素和pLV-EBFP2-杀稻瘟菌素。
为了产生慢病毒颗粒，将3mL的DMEM完全培养基中的～2×106HEK293FT细胞(Invitrogen)铺在涂有明胶的60mm盘中(Corning Incorporated)。三小时后，用pLV-hEF1a-attP_BxB1-EYFP-2A-Hygro载体、包装质粒pCMV-dR8.2(Addgene)和包膜质粒pCMV-VSV-G(Addgene)共转染～80％汇合细胞，如之前(1)所述，按照制造商的方案使用Attractene试剂(Qiagen)。在转染后～48h收获含有由转染的HEK293FT细胞产生的病毒颗粒的培养基，并且通过0.45-μm注射器过滤器进行过滤。在感染前立即将1的MOI细胞添加至6孔板中～50％汇合U2OS细胞。在48h后，更换培养基并且补充200μg/mL潮霉素B(InvivoGen)。细胞在选择下维持2周。
包装细胞系的快速构建：电路的BxB1-介导的整合
为了整合电路，使用attractene(Qiagen)将375ng的电路质粒与375ng的pTU1BxB1o在6孔模式中进行共转染。转染后72小时，将细胞转移至6孔板中，并且用0.5μg/mL嘌呤霉素和2μg/mL杀稻瘟素(InvivoGen)补充培养基。细胞在选择下维持2周。
HSV-1::电路的小规模重组和收获
用2ml的0.25％胰蛋白酶使汇合10cm板的U2OS::pBjh3721胰蛋白酶化，并且用10ml的补充1μg/mL强力霉素的新鲜完全培养基进行中和。其2ml等分在6孔板中。虽然在37℃孵育至少30分钟，以允许细胞沉淀下来，通过将3308.8ng的HSV-1 BAC、220.6ng的CAG-Cre和220.6ng的CAG-Flpe与100μL的Optimem混合在2mL微离心管中，制备DNA:Viafect复合物。确保Optimem被加热至室温。Optimem不应该是粉红色的。如果是，其将明显地降低转染效率。将30μL的Optimem添加至DNA中，并且用三个短脉冲涡旋混合物(体积小于50μL可能难以涡旋好)。DNA的总体积不应超过Optimem的10％。2.添加25μL的viafect(使用前涡旋好)，并且立即用三个短脉冲涡旋混合物，在室温孵育5min，并且逐滴地添加至制备的24孔板中。将24孔板摇匀并且放回培养箱中。两天后，在明视野下可以看到包括3-10个细胞的蚀斑，并且其可能显示荧光，也可能不显示荧光。细胞应该通过dox表达EYFP。
HSV-1体外标准
使用锌指核酸酶着陆垫整合。为了创建pLanding_Pad载体，将ZFN切割位点左侧的与AAVS1序列同源的800bp序列克隆至p_TU1位置载体中。将ZFN切割位点右侧的与AAVS1序列同源的800bp序列克隆至p_TU3位置载体中。以下转录单元用金门反应组装到p_TU2位置载体中，所述转录单元含有：来自p_绝缘子的双重cHS4核绝缘子、来自p_启动子的Ubc启动子、来自p_5’UTR的attP BxB1、来自p_基因的EYFP-2A-HygroR、来自p_3’UTR的惰性3’UTR和合成polyAdenylation信号以及来自p_polyA的另一拷贝的双重cHS4核绝缘子。然后将三个验证的位置载体全部组装入穿梭载体中，缺失crt红色操纵子盒。
为了创建锌指核酸酶载体pLV_CAG_CN-2A-CN，合成了由2A标签分开的，编码AAVS1基因座18的两个锌指核酸酶的cDNA(GeneArt,Regensburg,Germany)，并且使用引物oPG608b/oPG609b以attB1/attB2标签进行PCR扩增。凝胶提取后，使用BP clonase(LifeTechnologies，Carlsbad CA)将PCR产物重组入pENTR_L1_L2载体中，产生pENTR_L1_CN-2A-CN_L2载体。在下一步中，使用LR clonase II plus(Life Technologies，Carlsbad CA)将pENTR_L1_CN-2A-CN_L2和pENTR_L1_CAG_L2重组入pLV_R4R2_GTW中，造成pLV_CAG_CN-2A-CN。
为了将着陆垫整合入AAVS1基因座，用等摩尔量的锌指核酸酶载体pLV_CAG_CN-2A-CN和pLanding_pad载体共同转染细胞。克隆是通过多克隆存活群体的连续稀释而创建的。转染后72小时，将细胞培养基补充200μg/ml潮霉素B(Invivogen)，并且在2周的周期内保持选择。通过对存活群体的连续稀释产生克隆细胞系。
双重荧光素酶检测。双重荧光素酶检测根据制造商的说明进行(Promega，cat#N1610，以下列出改进的方案)
将感兴趣的细胞铺在白壁的透明底组织培养板(corning cat#xxx)，以达到80-100％的密度。
在总体积100μL的培养基中用HSV-1对照(KOS-LB或17-LB)或电路病毒感染细胞。优选地对每种病毒进行连续滴定，以达到至少几个具有视觉上可检测的(在Evos荧光显微镜上)病毒蚀斑的稀释点。允许感染以在恒温培养箱中进行至少24小时或至多1周。记录具有视觉上可识别蚀斑的稀释孔。然后将板平衡至室温，靶测量荧光素酶活性。
将与培养基体积相等的ONE-GloTMEX试剂的体积添加至孔中。混合物孵育至少3分钟，优选地在轨道摇床(300-600rpm)上。以适当的采集时间(通常～1秒)和增益来测量发光，以收集检测的线性范围中的信号。
为了测量
Figure BDA0003354501050000861
荧光素酶的活性，将与原始培养体积相等的NanoDLRTMStop&
Figure BDA0003354501050000862
试剂的体积添加至每个孔中，并且充分混合。优选地在轨道摇床上以600-900rpm至少3分钟，或通过移液器上下两次来混合。在至少10分钟(包括混合时间)后，以适当的采集时间(通常～1秒)和增益测量
Figure BDA0003354501050000871
发光，以收集检测的线性范围中的信号。
将编码基因电路的工程化的病毒递送至携带肿瘤的小鼠
麻醉(吸入1-4％异氟烷)的雌性Balb/C小鼠(6-8周龄)在第4个乳腺脂肪垫(最靠近髋和腹股沟淋巴结的那个)中接种105个4T1乳腺癌细胞。注入之前，用浸泡在必妥碘(betadine)中的棉尖涂抹器准备部位。用浸泡在必妥碘中的几个新鲜棉尖以圆形模式(从中心向外)擦洗注入部位，总擦洗时间5分钟。最后，用浸泡在70％异丙醇中的纱布3x3s擦洗部位，并且然后递送注射物(injection)。
麻醉携带肿瘤的小鼠(吸入1-4％的异氟烷)，并且注入至多1x107pfu的工程化的病毒。在注入部位进行外科皮肤预处理(交替必妥碘和酒精擦洗)之后，病毒通过瘤内、皮下、腹膜内或静脉内(眼球后或尾静脉)注入被引入。这种治疗将重复至多3次，以48小时的间隔时间。
与病毒颗粒同时或在延时后递送编码另外抗癌症蛋白质或电路组分的裸核酸(DNA或RNA)。本文所述的病毒颗粒通过缺失病毒基因组内的毒性因子被减弱。裸核酸不含有任何病毒序列。基因疗法载体(10-50μg)被肌内和/或瘤内递送至多5次，以72小时的间隔时间(Huang等，Cancer Research(2002)62:5727-5735)。在一些情况下，电穿孔被用于增强基因疗法载体的递送。麻醉(吸入1-4％的异氟烷)后，从注入部位去除毛发(通过刮剃或使用Nair脱毛膏)。使用浸泡在必妥碘中的棉尖涂抹器制备电穿孔部位。用浸泡在必妥碘中的几个新鲜棉尖以圆形模式(从中心向外)擦洗部位，总擦洗时间5分钟。最后，用浸泡在70％异丙醇中的纱布3x3s擦洗部位。接下来，将Harvard仪器2-针头阵列(ECM830)插入到2-5mm的深度(取决于肿瘤或肌肉的大小)，以包围(encompass)核酸注入部位。使用BTX Caliper电极系统(Nature Materials 12；367-376(2013))对组织进行电穿孔(200V/cm，周期为60毫秒，延迟100毫秒，随后200V/cm的第二脉冲，周期为60毫秒)。
注入病毒后，每24小时监测小鼠痛苦(distress)的迹象。如果小鼠展示出明显的体重减轻(骶髂体评分<2)，或呼吸困难、活动性减少、进食或梳理行为，则将处死小鼠。
病毒和/或4T1细胞携带荧光素酶报告基因，以便Caliper Spectrum IVIS光学成像系统可用于收集一组小鼠的纵向数据(从而减少使用的小鼠的总数量)。施用病毒后，每天监测至多2次发光，持续4天，或每天监测至多1次，持续9天，或每周1-3次，持续至多3个月。在生物发光成像之前，麻醉动物(吸入1-4％的异氟烷)，并且给予饱和剂量的荧光素(165mg/kg)。根据小鼠的体重(10μl荧光素/1g的小鼠体重；例如，20g的小鼠得到200μL)，在颈的颈背处将荧光素(16.5mg/mL，在无菌PBS中)皮下注入。全鼠成像是在Koch Institute的Xenogen生物发光和荧光柜中进行。
当必要的，利用颌下的方法或隐静脉(无麻醉)每周抽血，以监测免疫应答。如果需要更频繁地收集更少量的血液，则从隐静脉每天至多收集2次，持续至多5天。每周收集的血液总量<7.5％的总血液体积(例如20g的小鼠每周100μL)，或如果每隔2周进行血液收集，则<15％的总血液体积。血液样品可用于检测细胞(使用流式细胞术)或体液(通过ELISA检测)免疫应答。
当小鼠满足需要安乐死的标准时，当荧光素酶信号下降时，或在3个月后(以较早者为准)，进行尸体解剖。包括肿瘤、脑、眼睛、肌肉、肺、脾、淋巴结、肝、胸腺、肠道和骨髓的各种器官可以被收获并且从设施中取出，以通过流式细胞术(在Weiss实验室或在KochInstitute FACS核心设施)进行分析，或通过组织学在Koch Institute Histology Lab进行分析。这些样本在动物设施中或在Weiss实验室的生物安全罩中以4％低聚甲醛固定来灭活病毒。残留的组织和/或尸体被装入袋中，用于焚烧，并且将存放在Koch动物设施的尸体冰箱中。
将编码基因电路的工程化的病毒递送至健康小鼠
由于肿瘤调节局部和全身免疫性，并且病毒颗粒引起抗病毒免疫应答，因此其可用于在健康的携带非肿瘤的小鼠中表征病毒编码的抗癌电路的感染性、持久性和分布。在这种情况下，麻醉健康小鼠(吸入1-4％的异氟烷)，并且递送至适合病毒递送途径的外科皮肤预处理，并且用至多1x107pfu的工程化的病毒处理。引入病毒后，如以上进行所述程序。
在一些情况下，在对输注部位进行外科皮肤预处理(交替必妥碘和酒精擦洗)后，通过皮下、腹膜内或静脉内(眼球后或尾静脉)输注引入病毒。在一些情况下，在对闭眼区域进行无菌PBS擦拭后，通过角膜瘢痕化引入病毒。在一些情况下，在对注入部位进行外科皮肤预处理(交替必妥碘和酒精擦洗)后，通过皮下、腹膜内或静脉内(眼眶后或尾静脉)注入引入用工程化的病毒体外预感染的至多1x106原始小鼠细胞(脾细胞或淋巴结细胞)。在一些情况下，在对注入部位进行外科皮肤预处理(交替必妥碘和酒精擦洗)后，通过皮下、腹膜内或静脉内(通过尾静脉，而不是眼眶后)引入用工程化的病毒体外预感染的至多1x10^64T1癌细胞。在一些情况下，在外科皮肤预处理(交替必妥碘和酒精擦洗)、头皮切口、使用微钻头穿孔颅骨和使用Hamilton注射器输注毒粒后通过颅内注入引入病毒。
工程化的电路的小分子调节剂的递送
目的是开发和递送具有治疗程序的基因电路，用于人疾病的小鼠模型的治疗。基因电路感知它们的环境，处理环境输入，并且在正确的环境中以治疗基因的基于逻辑的、控制的表达来应答。在将工程化的病毒递送入小鼠后，用各种无害的小分子处理小鼠以抑制或诱导电路。这些分子被注入(ABA)或在饮用水中给药(伐昔洛韦)。
尸体解剖
根据NIH指导方针，在人道实验终点处从小鼠收集组织。这些组织可以闪电式冷冻，用于免疫组织化学和病理学分析，制备用于基于FACS的单细胞悬浮液分析，制备用于离体荧光素酶活性测定的总分析，或制备用于抗原特异性T细胞功能的离体培养测定。步骤是：
1.收获组织、器官、肿瘤
2.在冰上放置在24孔板中在1ml的冷PBS中
3.在具有10％FBS的RPMI中以1:200稀释胶原酶/DNAse
4.将1ml的稀释的胶原酶/DNAse等分放入新鲜的24孔板中
5.将组织放置入具有胶原酶/DNAse的板中
6.使用细针注射器吸出胶原酶/DNAse并且将其输注入组织中
7.在室温将组织孵育30分钟
8.通过40um的过滤网切碎组织
9.以5-10mL FACS缓冲液(PBS，1％BSA、5mM EDTA、0.1％NaN3)通过过滤器洗涤细胞
10.以300g离心细胞5min
11.吸出悬浮液，在1mL FACS缓冲液中洗涤小球(pellet)
12.以300g离心细胞5min
13.在200μl FACS缓冲液中再悬浮细胞并且转移入具有有蓝色细胞过滤器顶部的5mL FACS管中。
关于引用的每篇的主题，本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都是通过参考并入的，在一些情况下，可涵盖文件的整体。
在本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个/一种”(“a”)和“一个/一种”(“an”)，除非明确指出相反的含义，否则应理解为意味着“至少一个/一种”。
还应理解的是，除非明确指出相反的含义，在包括一个以上的步骤或行为的本文所要求保护的任何方法中，该方法的步骤或行为的顺序不一定限于被叙述的方法的步骤或行为的顺序。
在以上权利要求书以及说明书中，所有过渡性短语，比如“包括”、“包含”(“including”)、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由……构成”等理解为开放式的，即意味着包括但不限于。只有过渡性短语“由……组成”(“consisting of”)和“基本上由……组成”(“consisting essentially of”)应分别是封闭的或半封闭的过渡性短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所规定的。
序列表
<110> 麻省理工学院
<120> 工程化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体及其用途
<130> M0656.70449WO00
<140> 仍未分配
<141> 同时在此
<150> US 62/818,464
<151> 2019-03-14
<160> 58
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 32767
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
gcccgccgcc gccgctttaa agggccgcgc gcgacccccg gggggtgtgt tttggggggg 60
gcccgttttc ggggtctggc cgctcctccc cccgctcctc cccccgctcc tccccccgct 120
cctccccccg ctcctccccc cgctcctccc cccgctcctc cccccgctcc tccccccgct 180
cctccccccg ctcctccccc cgctcctccc cccgctcctc cccccgctcc tccccccgct 240
cctccccccg ctcctccccc cgctcctccc cccgctcctc cccccgctcc tccccccgct 300
cccgcggccc cgccccccac gcccgccgcg cgcgcgcacg ccgcccggac cgccgcccgc 360
cttttttgcg cgcgcgcgcg cccgcggggg gcccgggctg ccacaggtga aaccaacaga 420
gcacggcgca ctccgcacgt cacacgtcac gtcatccacc acacctgccc aacaacacaa 480
ctcacagcga caactcaccg cgcaacaact cctgttcctc atccacacgt caccgcgcac 540
ctcccgctcc tccagacgta ccccggcgca acacaccgct cctgctacac accaccgccc 600
ctccccagcc ccagccctcc ccggccccag ccctccccgg ccccagccct ccccggcccc 660
agccctcccc ggccccagcc ctccccggcc ccagccctcc ccggccccag ccctccccgg 720
ccccagccct ccccggccgc gtcccgcgct ccctcggggg ggttcgggca tctctacctc 780
agtgccgcca atctcaggtc agagatccaa accctccggg ggcgcccgcg caccaccacc 840
gcccctcgcc ccctcccgcc cctcgccccc tcccgcccct cgccccctcc cgcccctcgc 900
cccctcccgc ccctcgcccc ctcccgcccc tcgccccctc ccgcccctcg ccccctcccg 960
cccctcgccc cctcccgccc ctcgccccct cccgcccctc gccccctccc gcccctcgcc 1020
ccctcccgcc cctcgccccc tcccgcccct cgccccctcc cgcccctcgc cccctcccgc 1080
ccctcgcccc ctcccgcccc tcgccccctc ccgcccctcg ccccctcccg cccctcgccc 1140
cctcccgccc ctcgccccct cccgcccctc gaataaacaa cgctactgca aaacttaatc 1200
aggttgttgc cgtttattgc gtcttcgggt ctcacaagcg ccccgccccg tcccggcccg 1260
ttactcacgt taagggattt tgggcttgtt ctccgacgcc atcgccgatg cggggcgatc 1320
ctccggggat acggctgcga cggcggacgt agcacggtag gtcacctacg gactctcgat 1380
ggggggaggg ggcgagaccc acggaccccg acgacccccg ccgtcgacgc ggaactagcg 1440
cggaccggtc gatgcttggg tgggaaaaag gacagggacg gccgatcccc ctcccgcgct 1500
tcgtccgcgt atcggcgtcc cggcgcggcg agcgtctgac ggtctgtctc tggcggtccc 1560
gcgtcgggtc gtggatccgt gtcggcagcc gcgctccgtg tggacgatcg gggcgtcctc 1620
gggctcatat agtcccaggg gccggcggga aggaggagca gcggaggccg ccggcccccc 1680
gcccccccgg cgggcccacc ccgaacggaa ttccattatg cacgaccccg ccccgacgcc 1740
ggcacgccgg gggcccgtgg ccgcggcccg ttggtcgaac ccccggcccc gcccatccgc 1800
gccatctgcc atgggcgggg cgcgagggcg ggtgggtccg cgccccgccc cgcatggcat 1860
ctcattaccg cccgatccgg cggtttccgc ttccgttccg catgctaacg aggaacgggc 1920
agggggcggg gcccgggccc cgacttcccg gttcggcggt aatgagatac gagccccgcg 1980
cgcccgttgg ccgtccccgg gccccccggt cccgcccgcc ggacgccggg accaacggga 2040
cggcgggcgg cccaagggcc gcccgccttg ccgccccccc attggccggc gggcgggacc 2100
gccccaaggg ggcggggccg ccgggtaaaa gaagtgagaa cgcgaagcgt tcgcacttcg 2160
tcccaatata tatatattat tagggcgaag tgcgagcact ggcgccgtgc ccgactccgc 2220
gccggccccg ggggcgggcc cgggcggcgg ggggcgggtc tctccggcgc acataaaggc 2280
ccggcgcgac cgacgcccgc agacggcgcc ggccacgaac gacgggagcg gctgcggagc 2340
acgcggaccg ggagcgggag tcgcagaggg ccgtcggagc ggacggcgtc ggcatcgcga 2400
cgccccggct cgggatcggg atcgcatcgg aaagggacac gcggacgcgg gggggaaaga 2460
cccgcccacc ccacccacga aacacagggg acgcaccccg ggggcctccg acgacagaaa 2520
cccaccggtc cgcctttttt gcacgggtaa gcaccttggg tgggcggagg agggggggac 2580
gcgggggcgg aggagggggg acgcgggggc ggaggagggg ggacgcgggg gcggaggagg 2640
ggggacgcgg gggcggagga ggggggacgc gggggcggag gagggggctc acccgcgttc 2700
gtgccttccc gcaggaggaa cgtcctcgtc gaggcgaccg gcggcgaccg ttgcgtggac 2760
cgcttcctgc tcgtcggggg ggagcatgtc gtgggccctg gaaatggcgg acaccttcct 2820
ggacaccatg cgggttgggc ccaggacgta cgccgacgta cgcgatgaga tcaataaaag 2880
ggggcgtgag gaccgggagg cggccagaac cgccgtgcac gacccggagc gtcccctgct 2940
gcgctctccc gggctgctgc ccgaaatcgc ccccaacgca tccttgggtg tggcacatcg 3000
aagaaccggc gggaccgtga ccgacagtcc ccgtaatccg gtaacccgtt gagtcccggg 3060
tacgaccatc acccgagtct ctgggcggag ggtggttccc ccccgtggct ctcgagatga 3120
gccagaccca acccccggcc ccagttgggc cgggcgaccc agatgtttac ttaaaaggcg 3180
tgccgtccgc cggcatgcac cccagaggtg ttcacgcacc tcgaggacac ccgcgcatga 3240
tctccggacc cccgcaacgg ggtgataatg atcaagcggc ggggcaatgt ggagattcgg 3300
gtctactacg agtcggtgcg gacactacga tctcgaagcc atctgaagcc gtccgaccgc 3360
caacaatccc caggacaccg cgtgttcccc gggagccccg ggttccgcga ccaccccgag 3420
aacctaggga acccagagta ccgcgagctc ccagagaccc cagggtaccg cgtgacccca 3480
gggatccacg acaaccccgg tctcccaggg agccccggtc tccccgggag ccccggtctc 3540
cccgggagcc ccggacccca cgcacccccc gcgaaccacg tacggctcgc gggtctgtat 3600
agcccgggca agtatgcccc cctggcgagc ccagacccct tctccccaca acatggagca 3660
tacgctcggg cccgcgtcgg gatccacacc gcggttcgcg tcccgcccac cggaagccca 3720
acccacacgc acttgcggca agacccgggc gatgagccaa cctcggatga ctcagggctc 3780
taccctctgg acgcccgggc gcttgcgcac ctggtgatgt tgcccgcgga ccaccgggcc 3840
ttctttcgaa ccgtggtcga ggtgtctcgc atgtgcgctg caaacgtgcg cgatcccccg 3900
cccccggcta caggggccat gttgggccgc cacgcgcggc tggtccacac ccagtggctc 3960
cgggccaacc aagagacgtc gcccctgtgg ccctggcgga cggcggccat taactttatc 4020
accaccatgg ccccccgcgt ccaaacccac cgacacatgc acgacctgtt gatggcctgt 4080
gctttctggt gctgtctgac acacgcatcg acgtgttcgt acgcggggct gtactcgacc 4140
cactgcctgc atctgtttgg tgcgtttggg tgtggggacc cggccctaac cccacccctg 4200
tgctagggca atttgtaccc ttaataaatt ttacaaacag attttatcgc atcgtgtctt 4260
attgcggggg agaaaaccga tgtcggcata gaaaaccgcc atgattctaa gacgtccgaa 4320
cgcgagtggg tggggaacaa cccataccgg acagatgccg atgagccacc cgcacccttg 4380
ggtgcgggtg gtacggggtg gtttgttcat cctatggttc cgaccccaca aacagccccc 4440
agagtcggtt tgggtatggt tacattttct gtctggtggt cgggcttgtt tcttccttgc 4500
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cactccccac ccacccactc cccacccacc caaaaatcaa ccgggagaca acattgccaa 4680
tcgaacccaa tttaatgtag ttaaaggctg ggtgcaaatt gcggggtgat gggggggaag 4740
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gagtgttgtg gggacgcgtc ccggaactcc agattgacgg aggccgcctg ccacgccagc 6120
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gaccgccaga gacagaccgt cagacgctcg ccgcgccggg acgccgatac gcggacgaag 17040
cgcgggaggg ggatcggccg tccctgtcct ttttcccacc caagcatcga ccggtccgcg 17100
ctagttccgc gtcgacggcg ggggtcgtcg gggtccgtgg gtctcgcccc ctccccccat 17160
cgagagtccg taggtgacct accgtgctac gtccgccgtc gcagccgtat ccccggagga 17220
tcgccccgca tcggcgatgg cgtcggagaa caagcccaaa atcccttaac gtgagtaacg 17280
ggccgggacg gggcggggcg cttgtgagac ccgaagacgc aataaacggc aacaacctga 17340
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gcgaggggcg ggagggggcg aggggcggga gggggcgagg ggcgggaggg ggcgaggggc 17460
gggagggggc gaggggcggg agggggcgag gggcgggagg gggcgagggg cgggaggggg 17520
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ggagggggcg aggggcggga gggggcgagg ggcgggaggg ggcgaggggc gggagggggc 17640
gaggggcggg agggggcgag gggcgggagg gggcgagggg cgggaggggg cgaggggcgg 17700
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ggcgactcga gggcgttctg cggcgtcgcg ccccaccgag cgacctcgag ccccagcccg 31320
ctccgcttct cgccccagac ggcccgtcga gtgaaaactt ccgtacccag acaataaagc 31380
accaacaggg gttcattcgg tgttggcgtt gcgtgccttt gtttcccaat ccgacgggga 31440
ccgggactgg gtggcggggg gtgggttgga cagccgccct cggttcgcct tcacgtgaca 31500
ggagccaatg tggggggaag tcacgaggta cggggcggcc cgtgcgggtt gcttaaatgc 31560
gtggtggcga ccacgggctg tcattcctcg ggaacggacg gggttcccgc tgcccacttc 31620
cccccataag gtccgtccgg tcctctaacg cgtttggggg ttttctcttc ccgcgccgtc 31680
gggcgtccca cactctctgg gcgggcgggg acgatcgcat caaaagcccg atatcgtctt 31740
tcccgtatca accccaccca atggacctct tggtcgacga gctgtttgcc gacatgaacg 31800
cggacggcgc ttcgccaccg cccccccgcc cggccggggg tcccaaaaac accccggcgg 31860
cccccccgct gtacgcaacg gggcgcctga gccaggccca gctcatgccc tccccaccca 31920
tgcccgtccc ccccgccgcc ctctttaacc gtctcctcga cgacttgggc tttagcgcgg 31980
gccccgcgct atgtaccatg ctcgatacct ggaacgagga tctgttttcg gcgctaccga 32040
ccaacgccga cctgtaccgg gagtgtaaat tcctatcaac gctgcccagc gatgtggtgg 32100
aatgggggga cgcgtacgtc cccgaacgca cccaaatcga cattcgcgcc cacggcgacg 32160
tggccttccc tacgcttccg gccacccgcg acggcctcgg gctctactac gaagcgctct 32220
ctcgtttctt ccacgccgag ctacgggcgc gggaggagag ctatcgaacc gtgttggcca 32280
acttctgctc ggccctgtac cggtacctgc gcgccagcgt ccggcagctg caccgccagg 32340
cgcacatgcg cggacgcgat cgcgacctgg gagaaatgct gcgcgccacg atcgcggaca 32400
ggtactaccg agagaccgct cgtctggcgc gtgttttgtt tttgcatttg tatctatttt 32460
tgacccgcga gatcctatgg gccgcgtacg ccgagcagat gatgcggccc gacctgtttg 32520
actgcctctg ttgcgacctg gagagctggc gtcagttggc gggtctgttc cagcccttca 32580
tgttcgtcaa cggagcgctc accgtccggg gagtgccaat cgaggcccgc cggctgcggg 32640
agctaaacca cattcgcgag caccttaacc tcccgctggt gcgcagcgcg gctacggagg 32700
agccaggggc gccgttgacg acccctccca ccctgcatgg caaccaggcc cgcgcctctg 32760
ggtactt 32767
<210> 2
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Met Gln Arg Arg Thr Arg Gly Ala Ser Ser Leu Arg Leu Ala Arg Cys
1 5 10 15
Leu Thr Pro Ala Asn Leu Ile Arg Gly Asp Asn Ala Gly Val Pro Glu
20 25 30
Arg Arg Ile Phe Gly Gly Cys Leu Leu Pro Thr Pro Glu Gly Leu Leu
35 40 45
Ser Ala Ala Val Gly Ala Leu Arg Gln Arg Ser Asp Asp Ala Gln Pro
50 55 60
Ala Phe Leu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Val Arg Leu Ala Ala Arg Gln
65 70 75 80
His Asn Thr Val Pro Glu Ser Leu Ile Val Asp Gly Leu Ala Ser Asp
85 90 95
Pro His Tyr Glu Tyr Ile Arg His Tyr Ala Ser Ala Ala Thr Gln Ala
100 105 110
Leu Gly Glu Val Glu Leu Pro Gly Gly Gln Leu Ser Arg Ala Ile Leu
115 120 125
Thr Gln Tyr Trp Lys Tyr Leu Gln Thr Val Val Pro Ser Gly Leu Asp
130 135 140
Val Pro Glu Asp Pro Val Gly Asp Cys Asp Pro Ser Leu His Val Leu
145 150 155 160
Leu Arg Pro Thr Leu Ala Pro Lys Leu Leu Ala Arg Thr Pro Phe Lys
165 170 175
Ser Gly Ala Val Ala Ala Lys Tyr Ala Ala Thr Val Ala Gly Leu Arg
180 185 190
Asp Ala Leu His Arg Ile Gln Gln Tyr Met Phe Phe Met Arg Pro Ala
195 200 205
Asp Pro Ser Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ala Leu Arg Leu Asn Glu Leu
210 215 220
Leu Ala Tyr Val Ser Val Leu Tyr Arg Trp Ala Ser Trp Met Leu Trp
225 230 235 240
Thr Thr Asp Lys His Val Cys His Arg Leu Ser Pro Ser Asn Arg Arg
245 250 255
Phe Leu Pro Leu Gly Gly Ser Pro Glu Ala Pro Ala Glu Thr Phe Ala
260 265 270
Arg His Leu Asp Arg Gly Pro Ser Gly Thr Thr Gly Ser Met Gln Cys
275 280 285
Met Ala Leu Arg Ala Ala Val Ser Asp Val Leu Gly His Leu Thr Arg
290 295 300
Leu Ala Asn Leu Trp Gln Thr Gly Lys Arg Ser Gly Gly Thr Tyr Gly
305 310 315 320
Thr Val Asp Thr Val Val Ser Thr Val Glu Val Leu Ser Ile Val His
325 330 335
His His Ala Gln Tyr Ile Ile Asn Ala Thr Leu Thr Gly Tyr Gly Val
340 345 350
Trp Ala Thr Asp Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Arg Ala Ala Val Asp
355 360 365
Ser Gln Glu Arg Phe Cys Arg Thr Thr Ala Pro Leu Phe Pro Thr Met
370 375 380
Thr Ala Pro Ser Trp Ala Arg Met Glu Leu Ser Ile Lys Ala Trp Phe
385 390 395 400
Gly Ala Ala Leu Ala Ala Asp Leu Leu Arg Asn Gly Ala Pro Ser Leu
405 410 415
His Tyr Glu Ser Ile Leu Arg Leu Val Ala Ser Arg Arg Thr Thr Trp
420 425 430
Ser Ala Gly Pro Pro Pro Asp Asp Met Ala Ser Gly Pro Gly Gly His
435 440 445
Arg Ala Gly Gly Gly Thr Cys Arg Glu Lys Ile Gln Arg Ala Arg Arg
450 455 460
Asp Asn Glu Pro Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Leu His Ser Thr Pro
465 470 475 480
Ala Ser Thr Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg Ala Asp Gly Ala Gly Pro
485 490 495
Pro Leu Pro Asp Ala Asn Asp Pro Val Ala Glu Pro Pro Ala Ala Ala
500 505 510
Thr Gln Pro Ala Thr Tyr Tyr Thr His Met Gly Glu Val Pro Pro Arg
515 520 525
Leu Pro Ala Arg Asn Val Ala Gly Pro Asp Arg Arg Pro Pro Ala Ala
530 535 540
Thr Cys Pro Leu Leu Val Arg Arg Ala Ser Leu Gly Ser Leu Asp Arg
545 550 555 560
Pro Arg Val Trp Gly Pro Ala Pro Glu Gly Glu Pro Asp Gln Met Glu
565 570 575
Ala Thr Tyr Leu Thr Ala Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ala Arg Arg Lys
580 585 590
Ala Thr His Ala Ala Ser Ala Arg Glu Arg His Ala Pro Tyr Glu Asp
595 600 605
Asp Glu Ser Ile Tyr Glu Thr Val Ser Glu Asp Gly Gly Arg Val Tyr
610 615 620
Glu Glu Ile Pro Trp Met Arg Val Tyr Glu Asn Val Cys Val Asn Thr
625 630 635 640
Ala Asn Ala Ala Pro Ala Ser Pro Tyr Ile Glu Ala Glu Asn Pro Leu
645 650 655
Tyr Asp Trp Gly Gly Ser Ala Leu Phe Ser Pro Pro Gly Arg Thr Gly
660 665 670
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Ser Pro Ser Pro Val Leu Ala Arg His Arg
675 680 685
Ala Asn Ala Leu Thr Asn Asp Gly Pro Thr Asn Val Ala Ala Leu Ser
690 695 700
Ala Leu Leu Thr Lys Leu Lys Arg Glu Gly Arg Arg Ser Arg
705 710 715
<210> 3
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Met Gln Arg Arg Thr Arg Gly Ala Ser Ser Leu Arg Leu Ala Arg Cys
1 5 10 15
Leu Thr Pro Ala Asn Leu Ile Arg Gly Asp Asn Ala Gly Val Pro Glu
20 25 30
Arg Arg Ile Phe Gly Gly Cys Leu Leu Pro Thr Pro Glu Gly Leu Leu
35 40 45
Ser Ala Ala Val Gly Ala Leu Arg Gln Arg Ser Asp Asp Ala Gln Pro
50 55 60
Ala Phe Leu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Val Arg Leu Ala Ala Arg Gln
65 70 75 80
His Asn Thr Val Pro Glu Ser Leu Ile Val Asp Gly Leu Ala Ser Asp
85 90 95
Pro His Tyr Glu Tyr Ile Arg His Tyr Ala Ser Ala Ala Thr Gln Ala
100 105 110
Leu Gly Glu Val Glu Leu Pro Gly Gly Gln Leu Ser Arg Ala Ile Leu
115 120 125
Thr Gln Tyr Trp Lys Tyr Leu Gln Thr Val Val Pro Ser Gly Leu Asp
130 135 140
Val Pro Glu Asp Pro Val Gly Asp Cys Asp Pro Ser Leu His Val Leu
145 150 155 160
Leu Arg Pro Thr Leu Ala Pro Lys Leu Leu Ala Arg Thr Pro Phe Lys
165 170 175
Ser Gly Ala Val Ala Ala Lys Tyr Ala Ala Thr Val Ala Gly Leu Arg
180 185 190
Asp Ala Leu His Arg Ile Gln Gln Tyr Met Phe Phe Met Arg Pro Ala
195 200 205
Asp Pro Ser Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ala Leu Arg Leu Asn Glu Leu
210 215 220
Leu Ala Tyr Val Ser Val Leu Tyr Arg Trp Ala Ser Trp Met Leu Trp
225 230 235 240
Thr Thr Asp Lys His Val Cys His Arg Leu Ser Pro Ser Asn Arg Arg
245 250 255
Phe Leu Pro Leu Gly Gly Ser Pro Glu Ala Pro Ala Glu Thr Phe Ala
260 265 270
Arg His Leu Asp Arg Gly Pro Ser Gly Thr Thr Gly Ser Met Gln Cys
275 280 285
Met Ala Leu Arg Ala Ala Val Ser Asp Val Leu Gly His Leu Thr Arg
290 295 300
Leu Ala Asn Leu Trp Gln Thr Gly Lys Arg Ser Gly Gly Thr Tyr Gly
305 310 315 320
Thr Val Asp Thr Val Val Ser Thr Val Glu Val Leu Ser Ile Val His
325 330 335
His His Ala Gln Tyr Ile Ile Asn Ala Thr Leu Thr Gly Tyr Gly Val
340 345 350
Trp Ala Thr Asp Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Arg Ala Ala Val Asp
355 360 365
Ser Gln Glu Arg Phe Cys Arg Thr Thr Ala Pro Leu Phe Pro Thr Met
370 375 380
Thr Ala Pro Ser Trp Ala Arg Met Glu Leu Ser Ile Lys Ala Trp Phe
385 390 395 400
Gly Ala Ala Leu Ala Ala Asp Leu Leu Arg Asn Gly Ala Pro Ser Leu
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His Tyr Glu Ser Ile Leu
420
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
ctaaatcagg tcgttgtcgt ttattgcgtc ttcgggtttc gcaagcgccc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
cctcttcgtc ctcgtcgtcc gacgaggacg aggacgacga cggcaacgac taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
gcacatgctt gcctgtcaaa ctctaccacc ccggcacgct ctctgtctcc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
cggtgtggtt caacaaagac gccgcgtttc caggtaggtt agacacctgc taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
gattttggtc ttttatttgg ggacatacaa gggggtcggg gcgaccggac ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
catttcaaac aaatcgcccc acgtgttgtc cttctttgct catggccggc taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
cgtttattgc gtcttcgggt ttcgcaagcg ccccgccccg tcccggcccg ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
gcgcacgttt gcagcgcaca tgcgagacac ctcgaccacg gttcggaaga taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 12
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
gcgcctccac cgagataacg tcatgctggc ctcgggggcc gagtaaccgc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
gacactgaaa tgccaccccc cctgcgggcg gtccattaaa gacaacaaac taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 14
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
ccccaccctc gggttcgtgt atttcctttc cctgtcctta taaaagccgt ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 15
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
gacatccgat aacccgcgtc tatcgccacc atgtcggctc gcgaacccgc taaatacgga 60
aggatctgag 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
gcacatgctt gcctgtcaaa ctctaccacc ccggcacgct ctctgtctcc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 17
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
ctgttggtga ttatcgactg tcgcgccgaa ttttgtgcct accgctttat taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 18
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
cgccccaagg gggcggggcc gccgggtaaa agaagtgaga acgcgaagcg ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
ggcatcggag atttcatcat cgcttgtcgc gctgagatga atctcgagat taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 20
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
ccggcggcga ccgttgcgtg gaccgcttcc tgctcgtcgg gcgggggagc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 21
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
ccgcccagaa acttgggcga tggtcgtacc cgggactcaa cgggttaccg taaatacgga 60
aggatctgag 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
tgctcgtcgg gcggggggaa gccactgtgg tcctccggga cgttttctgg ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 23
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
cggccgcccg ggcccacggg cgccgtccca accgcacagt cccaggtaac ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 24
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
ggttggtcaa aaaagggagg gacgggggcc ggcagaccga cggcgacaac taaatacgga 60
aggatctgag 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
gcgcctccac cgagataacg tcatgctggc ctcgggggcc gagtaaccgc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
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aggatctgag 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
ttattgcgtc ttcgggtttc gcaagcgccc cgccccgtcc cggcccgtta ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
ggccacgggc ccccggcgtg ccggcgtcgg ggcggggtcg tgcataatgg ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
ttataacccc gggggtcatt cccaacgatc acatgcaatc taactggctc taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 30
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
ccggcggcga ccgttgcgtg gaccgcttcc tgctcgtcgg gcgggggagc atgagccaga 60
cccaaccc 68
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
ttattgcgtc ttcgggtctc acaagcgccc cgccccgtcc cggcccgtta ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
ggcccgggcg gccgggggcg gcgggggccg cgatggcggc ggcggcgggc cttgttctcc 60
gacgccatc 69
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
ttattgcgtc ttcgggtttc acaagcgccc cgccccgtcc cggcccgtta ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 34
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
gtgggcccgg gcggccgggg gcggcggggg ccgcgatggc ggcggcgggc cttgttctcc 60
gacgccatc 69
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
cggccgcccg ggcccacggg cgcggtccca accgcacagt cccaggtaac ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 36
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
tttataaccc cggggtcatt cccaacgatc acatgcaatc taactggctc taaatacgga 60
aggatctgag 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
gtggtgtgca gccgtgttcc aaccacggtc acgcttcggt gcctctcccc taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 38
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
ccagacaata aagcaccaac aggggttcat tcggtgttgg cgttgcgtgc taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 39
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
cacggcggtt ctggccgcct cccggtcctc acgccccctt ttattgatct ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 40
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
ccggcggcga ccgttgcgtg gaccgcttcc tgctcgtcgg ggggaaaagc atgagccaga 60
cccaaccc 68
<210> 41
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
ccgcccagag actcgggtga tggtcgtacc cgggactcaa cgggttaccg taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 42
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
ctacgtccgc cgtcgcagcc gtatccccgg aggatcgccc cgcatcggcg ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 43
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
ccacatataa gcccccagcc acacgcaaga acagacacgc agaacggctg taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 44
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
cgcggactcg ggaacgtgga gccactggcg cagcagcagc gaacaagaag ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tggtagtgcc ccaactgggg taac 54
<210> 46
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
cacagatgta atgaaaataa agatatttta ttccaaaatc ccttaacgtg ag 52
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
tggaccgctt cctgctcgtc ggggggaaaa gcatgagcca gacccaaccc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 48
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 49
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
cggccggaga aacgtgtcgc tgcacggata ggggcaggcg gtggagaagc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 50
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
cccaagggcc gcccgccgtc ccgttggtcc cggcgtccgg cgggcgggac ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 51
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
ccacccagcg cccgaccccc ccctccccac aaacacgggg gcgtccctta ttaaatttta 60
atagcagttg 70
<210> 52
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
cggccgcccg ggcccacggg cgcggtccca accgcacagt cccaggtaac gttcgtggta 60
actatgggtg 70
<210> 53
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
ccacccagcg cccgaccccc ccctccccac aaacacgggg gcgtccctta taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 54
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
cgacccccag ggaccctccg tccgcgaccc tccagccgca tacgaccccc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 55
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 55
cacccagcgc ccgacccccc cctccccaca aacacggggg gcgtccctta taaatacgga 60
aggatctgag 70
<210> 56
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 56
cgacccccag ggaccctccg tcagcgaccc tccagccgca tacgaccccc ctcacgttaa 60
gggattttgg 70
<210> 57
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
gactagcgag ttagacaggc aagcactact cgcctctgca cgcacatgct tgcctgtcaa 60
actctaccac cccggcacgc tctctgtctc catggcccgc cgccgccgcc atcgcggccc 120
ccgccgcccc cggccgcccg ggcccacggg cgccgtccca accgcacagt cccaggtaac 180
ctcacgttaa gggattttgg 200
<210> 58
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
ggccaccgcc gcccacccac ccacctcggg atacccagcc ccggtccccc gttccccggg 60
ggccgttatc tccagcgccc cgtccggcgc gccgcccccc gccgctaaac cccatcccgc 120
ccccgggacc ccacatataa gcccccagcc acacgcaaga acagacacgc agaacggctg 180
taaatacgga aggatctgag 200

Claims (50)

1.一种工程化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体，其包括修饰的HSV-1基因组，所述修饰的HSV-1基因组包含编码感染的细胞蛋白质4(ICP4)、感染的细胞蛋白质0(ICP0)和毒粒蛋白质16(VP16)的基因的缺失。
2.根据权利要求1所述的工程化的HSV-1载体，其中ICP4的两个拷贝从修饰的HSV-1基因组缺失。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化的HSV-1载体，其中编码VP16的基因的缺失导致氨基酸422处VP16蛋白质的截断。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的工程化的HSV-1载体，其中ICP0的两个拷贝从修饰的HSV-1基因组缺失。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的工程化的HSV-1载体，其中修饰的HSV-1基因组进一步包括一种或多种编码γ34.5、潜伏期相关转录物(LAT)、ICP6、ICP8、ICP27、ICP22和ICP47的基因的缺失。
6.根据权利要求5所述的工程化的HSV-1载体，其中修饰的HSV-1基因组进一步包括LAT和γ34.5的缺失。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的工程化的HSV-1载体，其中修饰的HSV-1基因组包括ICP4的两个拷贝、ICP0的两个拷贝的缺失、导致在氨基酸422处VP16蛋白的截断的编码VP16的基因的缺失和LAT和γ34.5的一个拷贝的缺失。
8.根据权利要求7所述的工程化的HSV-1载体，其中修饰的HSV-1基因组包括SEQ IDNO:1的核苷酸序列。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的工程化的HSV-1载体，其中缺失使得ICP4、ICP0、VP16、γ34.5、LAT、ICP27、ICP22和ICP47中的一种或多种非功能的。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的工程化的HSV-1载体，其中修饰的HSV-1基因组来自HSV-1菌株F、17或KOS。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的工程化的HSV-1载体，进一步包括一种或多种基因电路。
12.根据权利要求11所述的工程化的HSV-1载体，其中基因电路的长度是至多150kb。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的工程化的HSV-1载体，其中基因电路编码输出分子。
14.根据权利要求13所述的工程化的HSV-1载体，其中输出分子是HSV-1蛋白质。
15.根据权利要求14所述的工程化的HSV-1载体，其中HSV-1蛋白质选自：VP16、ICP0、ICP27、ICP22、ICP47、ICP6、ICP8、γ34.5。
16.根据权利要求13所述的工程化的HSV-1载体，其中输出分子是治疗分子。
17.根据权利要求16所述的工程化的HSV-1载体，其中治疗分子是抗癌剂。
18.根据权利要求13所述的工程化的HSV-1载体，其中输出分子是诊断分子。
19.根据权利要求13所述的工程化的HSV-1载体，其中输出分子是功能性分子。
20.根据权利要求13所述的工程化的HSV-1载体，其中输出分子是先天免疫应答的抑制剂。
21.根据权利要求20所述的工程化的HSV-1载体，其中先天免疫应答的抑制剂是靶向先天免疫应答组分的RNA干扰(RNAi)分子。
22.根据权利要求20所述的工程化的HSV-1载体，其中先天免疫应答的抑制剂是牛痘B18R蛋白质。
23.根据权利要求1-22的任一项所述的工程化的HSV-1载体，其中工程化的HSV-1载体是质粒。
24.一种包装细胞，其包括根据权利要求1-23的任一项所述的工程化的HSV-1载体。
25.根据权利要求24所述的包装细胞，其中工程化的HSV-1载体被整合入包装细胞的基因组。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的包装细胞，其中包装细胞进一步包括编码一种或多种HSV-1病毒基因的核酸。
27.根据权利要求26所述的包装细胞，其中一种或多种HSV-1病毒基因编码VP16、ICP0、ICP27、ICP4、ICP22、ICP47、ICP6、ICP8、γ34.5。
28.根据权利要求24或权利要求25所述的包装细胞，其中包装细胞进一步包括编码先天免疫应答的抑制剂的核酸。
29.根据权利要求28所述的包装细胞，其中先天免疫应答的抑制剂是靶向先天免疫应答组分的RNA干扰(RNAi)分子。
30.根据权利要求28所述的包装细胞，其中先天免疫应答的抑制剂是牛痘B18R蛋白质。
31.根据权利要求24-30的任一项所述的包装细胞，其中包装细胞产生至少1蚀斑形成单位的HSV-1病毒颗粒。
32.根据权利要求24-31的任一项所述的包装细胞，其中包装细胞是U2OS细胞。
33.一种工程化的HSV-1病毒颗粒，其包括根据权利要求1-23的任一项所述的工程化的HSV-1载体，或由根据权利要求24-32的任一项所述的包装细胞系产生。
34.一种治疗疾病的方法，方法包括向需要其的受试者施用有效量的根据权利要求33所述的工程化的HSV-1病毒颗粒，其中工程化的HSV-1载体包括编码治疗分子的基因电路。
35.一种诊断疾病的方法，方法包括向需要其的受试者施用有效量的根据权利要求33所述的工程化的HSV-1病毒颗粒，其中工程化的HSV-1载体包括编码诊断分子的基因电路。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中工程化的HSV-1病毒颗粒不诱导受试者的免疫应答或与受试者中天然的HSV-1颗粒相比诱导较低的免疫应答。
37.根据权利要求34-36的任一项所述的方法，其中工程化的HSV-1载体感染受试者的细胞且将基因电路递送入受试者的细胞。
38.根据权利要求34-37的任一项所述的方法，其中工程化的HSV-1病毒颗粒全身地或局部地施用。
39.根据权利要求34-38的任一项所述的方法，其中工程化的HSV-1病毒颗粒经注射施用。
40.根据权利要求34-39的任一项所述的方法，其中疾病是癌症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中癌症是乳腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌或肺癌。
42.根据权利要求34-39的任一项所述的方法，其中疾病是恶病质。
43.根据权利要求34-42的任一项所述的方法，其中受试者是哺乳动物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中哺乳动物是人。
45.根据权利要求43所述的方法，其中哺乳动物是非人灵长类动物。
46.根据权利要求43所述的方法，其中哺乳动物是啮齿动物。
47.一种将基因电路递送入细胞的方法，包括使细胞与根据权利要求1-23的任一项所述的HSV-1载体或根据权利要求33所述的工程化的HSV-1病毒颗粒接触，其中工程化的HSV-1载体包括基因电路。
48.根据权利要求47所述的方法，其中接触是在体外。
49.根据权利要求47所述的方法，其中接触是在体内。
50.根据权利要求47所述的方法，其中接触是离体的。
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