CN114457023A

CN114457023A - 一种表达cd28激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用

Info

Publication number: CN114457023A
Application number: CN202011185996.XA
Authority: CN
Inventors: 王淋立; 陈月花; 杨建国; 莫健
Original assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Current assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-05-10

Abstract

本发明公开了一种表达CD28激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD28激活型抗体的表达序列。本发明表达CD28激活型抗体的多能干细胞或其衍生物，可用于自体细胞诱导iPSCs或分化成MSCs这类低免疫源性细胞进行运用，其可在体内持续表达CD28激活型抗体，抑制CTLA‑4的表达，以此降低CTLA‑4与CD28的竞争性，以促使更多的CD28与B7分子配体结合，用于治疗CD28低表达相关肿瘤及相关疾病。

Description

一种表达CD28激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达CD28激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用。

背景技术

CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，对T细胞的活化起到重要作用。它与APC(抗原递呈细胞)上的B7分子结合，介导T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。CD28与T细胞表面的协同抑制性分子受体CD152(CTLA-4)高度同源，通过与相同的配体B7家族分子(CD86(B7-2)和CD80(B7-1))竞争性的结合，传导T细胞激活所必需的共刺激信号。现有技术中已知宿主防御病毒感染和抗肿瘤中发挥关键性作用的是活化的T细胞。T细胞活化的双信号观点认为，第一信号来自由T细胞表面的TCR识别的MHC/抗原肽复合物，第二信号来自抗原呈递细胞表面表达的B7家族分子与T细胞表面CD28的结合。第一信号和第二信号同时存在时T细胞克隆活化并增殖，产生免疫效应。因此，CD28/B7信号对于免疫应答的启动具有相当重要的作用。

另一方面，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。

为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA-A、HLA-B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA-C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA-C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA-C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA-I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA-C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。

此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物；

本发明的另一目的在于提供另一种多能干细胞或其衍生物；

本发明的另一目的在于提供上述两种多能干细胞或其衍生物在制备CD28低表达肿瘤治疗药物中的应用；

本发明的另一目的在于提供一种制剂。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD28激活型抗体的表达序列。

发明人发现，在多能干细胞或其衍生物中导入CD28激活型抗体的表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌CD28激活型抗体，这些CD28激活型抗体能有效促进CD28与其配体的结合，从而能够有效清除肿瘤细胞。

进一步地，上述CD28激活型抗体包括CTLA-4抗体，上述CTLA-4抗体序列如SEQ IDNO.1所示。

更进一步地，上述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，上述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。

更进一步地，上述与免疫应答相关的基因包括：

主要组织相容性复合体基因，包括：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

主要组织相容性复合体相关基因，包括：B2M和CIITA中的至少一种。

更进一步地，上述免疫兼容分子包括以下的至少一种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；

(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；

(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，上述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，上述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。

更进一步地，上述主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.102中的至少一种；主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.14中的至少一种。

更进一步地，上述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子。

其中，shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；上述抗干扰素效应分子为靶向PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种。

在细胞核内的初级miRNA(pri-miRNA)经过复合物Drosha-DGCR8进行微处理，将pri-miRNA裂解成前体miRNA(pre-miRNA)，这时会形成发夹结构。接着，经Exportin-5-Ran-GTP复合物将pre-miRNA转运出核。在胞浆中与双链RNA结合蛋白TRBP(TARBP2)结合的RNaseDicer酶将pre-miRNA分解成成熟的长度，miRNA在这时还处于双链状态。最后被转运进AGO2，形成RISC(RNA诱导沉默复合体)。最终miRNA双链的一条链保留在RISC复合物中，另外一条则排出被迅速降解掉。而DGCR8作为Drosha的主要结合蛋白，可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合，招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切，生产pre-miRNA，pre-miRNA进一步被Dicer和TRBP/PACT加工剪切，形成成熟的miRNA。DGCR8的缺失或异常表达会影响Drosha的剪切活性，进而影响miRNA的活性，导致疾病的发生。TRBP能够招募Dicer复合体miRNA形成RISC Ago2。

更进一步地，上述靶向PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.103～SEQ ID NO.162所示。

更进一步地，上述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、靶向PKR或2-5As或IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T，该shRNA靶序列如上述；

(2)shRNA-miR表达框架：使用上述的shRNA-miR靶序列替换(1)中的shRNA靶序列得到。

更进一步地，上述茎环序列长度为3～9个碱基；上述Poly T长度为5～6个碱基。

更进一步地，上述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子和/或shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达。

更进一步地，上述诱导型基因表达系统包括Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

本发明将tet-Off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。

二聚体关闭表达系统具体指：运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白FKBP12(FKBP与FK506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为FRAP(FRBP-雷帕霉素相关蛋白，即mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶点))有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将DNA结合区域融合到一个或多个FKBP结构域，将转录抑制域融合到FRAP的93位氨基酸部位，称为FRB，这样足以结合FKBP-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与DNA结合区域相结合的位点的基因进行转录。

更进一步地，上述CD28激活型抗体的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法，上述基因编辑的方法包括基因敲入。

更进一步地，上述CD28激活型抗体的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。

更进一步地，上述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

更进一步地，上述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；上述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织；上述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

本发明的第二个方面，提供：

而且，当B2M和CIITA基因被敲除后，其完全消除HLA-I和HLA-II类分子产生的影响，因此，其肿瘤治疗效果最佳。

本发明的第三个方面，提供：

上述两种多能干细胞或其衍生物在制备CD28低表达肿瘤治疗药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供：

一种制剂，该制剂含有上述的多能干细胞或其衍生物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的有益效果是：

1.本发明中的表达CD28激活型抗体的多能干细胞或其衍生物，可用于自体细胞诱导iPSCs或分化成MSCs这类低免疫源性细胞进行运用，其可在体内持续表达CD28激活型抗体，用于治疗CD28低表达肿瘤及相关疾病。

2.本发明中的表达CD28激活型抗体的免疫兼容多能干细胞或其衍生物，由于多能干细胞或其衍生物中的B2M、CIITA基因被敲除，或者其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以克服供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥问题，使得供体细胞能够在受体内长时间持续表达CD28激活型抗体。

3.本发明中的表达CD28激活型抗体的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物的基因组中导入诱导型基因表达系统以及免疫兼容分子表达序列。诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，从而控制疫兼容分子表达序列的表达量。而免疫兼容分子可调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，可以消除或降低供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥应答，使得供体细胞能够长时间在受体中持续表达CD28激活型抗体。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达HLA Ⅰ类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

附图说明

图1为AAVS1 KI Vector(shRNA，Puro，组成型)的质粒图谱；

图2为AAVS1 KI Vector(shRNA，诱导型)的质粒图谱；

图3为AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，组成型)的质粒图谱；

图4为AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，诱导型)的质粒图谱；

图5为sgRNA clone B2M-1质粒图谱；

图6为sgRNA clone B2M-2质粒图谱；

图7为sgRNA clone CIITA-1质粒图谱；

图8为sgRNA clone CIITA-2质粒图谱；

图9为Cas9(D10A)质粒图谱；

图10为sgRNA Clone AAVS1-1质粒图谱；

图11为sgRNA Clone AAVS1-2质粒图谱。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

1.CD28激活型抗体的选择

CD28激活型抗体为CTLA-4抗体，其原理为抑制CTLA-4的表达，以此降低CTLA-4与CD28的竞争性，以促使更多的CD28与B7分子配体结合。

所述CD28激活型抗体的序列如SEQ ID NO.1所示.

所述CD28激活型抗体的序列为：

5’-ATGGGCGTGCTGCTGACCCAGAGGACCCTGCTGAGCCTGGTGCTGGCCCTGCTGTTCCCCAGCATGGCCAGCATGGCCATGCACGTGGCCCAGCCCGCCGTGGTGCTGGCCAGCAGCAGGGGCATCGCCAGCTTCGTGTGCGAGTACGCCAGCCCCGGCAAGGCCACCGAGGTGAGGGTGACCGTGCTGAGGCAGGCCGACAGCCAGGTGACCGAGGTGTGCGCCGCCACCTACATGATGGGCAACGAGCTGACCTTCCTGGACGACAGCATCTGCACCGGCACCAGCAGCGGCAACCAGGTGAACCTGACCATCCAGGGCCTGAGGGCCATGGACACCGGCCTGTACATCTGCAAGGTGGAGCTGATGTACCCCCCCCCCTACTACCTGGGCATCGGCAACGGCACCCAGATCTACGTGATCGACCCCGAGCCCTGCCCCGACAGCGACCAGGAGCCCAAGAGCAGCGACAAGACCCACACCAGCCCCCCCAGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCAGCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG-3’(SEQ ID NO.1)。

2.免疫兼容分子的选择

本发明实施例中使用的免疫兼容分子的种类及序列如表1和表2所示。

表1免疫兼容分子的种类及作用

表2免疫兼容分子的靶序列

3.shRNA/miRNA加工复合体基因和抗干扰素效应分子的选择

(1)shRNA/miRNA加工复合体基因的选择

本发明中使用的shRNA/miRNA加工复合体基因包括可诱导关闭表达的shRNA和/或miRNA加工机器。上述可诱导关闭表达的shRNA和/或miRNA加工机器具体包括：Drosha(Accession number:NM_001100412)、Ago1(Accession number:NM_012199)、Ago2(Accession number:NM_001164623)、Dicer1(Accession number:NM_001195573)、Exportin-5(Accession number:NM_020750)、TRBP(Accession number:NM_134323)、PACT(Accession number:NM_003690)和DGCR8(Accession number:NM_022720)。

上述可诱导关闭表达的shRNA和/或miRNA加工机器在细胞中的具体作用为：

(2)抗干扰素效应分子的选择

本发明中使用的抗干扰素效应分子包括可诱导关闭表达的针对抑制PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7基因的shRNA和/或shRNA-miR表达序列，以降低dsRNA诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。

其中，所述抗干扰素效应分子的靶序列如表3所示。

表3抗干扰素效应分子的靶序列

上述干扰素效应分子PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7在细胞中的具体作用为：

蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent Protein Kinase,PKR)和2’,5’寡腺苷酸合成酶(2,5-Oligoadenylate Synthetase,2-5As)是IFN诱生的过程中细胞信号转导通路的关键因子，这两种酶与dsRNA诱生IFN密切相关。PKR能通过磷酸化真核细胞转录因子，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于G0/G1和G2/M期，并诱导凋亡，而dsRNA可以促进2-5As合成，结果导致RNase即RNaseL的非特异性活化，降解细胞内所有的mRNA，致细胞死亡。I型干扰素的诱导特异性是通过IRF转录因子家族成员实现的，在细胞缺乏IRF-3和IRF-7的表达下，在很多病毒感染情况下I型干扰素是不能被诱导分泌的。

4.构建质粒载体

本发明实施例中使用的质粒载体包括：

(1)Cas9(D10A)质粒：表达Cas 9(D10A)蛋白的质粒，在sgRNA的引导下特异性单链切割基因组DNA。

(2)sgRNA质粒：表达sgRNA的质粒，sgRNA(small guide RNA)是向导RNA(guideRNA，gRNA)，在基因编辑负责引导表达Cas 9(D10A)蛋白的靶向切割。

(3)Donor片段：两头含有重组臂，分别位于基因组DNA断裂位置的左右两边，中间含有需要插入的基因、片段或者表达元件。在Donor片段存在的情况下，细胞在基因组断裂的位置发生同源重组(Homologous recombination，HR)反应。如果不添加Donor片段，细胞的基因组断裂位置发生非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)反应。该片段由KI Vector质粒酶切后回收获取。

上述质粒中的基因编辑均采用CRISPR-Cas9基因编辑系统，使用的Cas 9蛋白为Cas9(D10A)，Cas 9(D10A)与sgRNA结合，sgRNA负责特异识别靶序列(细胞载体的基因组DNA)，然后Cas 9(D10A)对该靶序列进行单链切割。基因组DNA发生双链断裂(DNA DoubleStrand Break,DSB)，必须有两组Cas 9(D10A)/sgRNA分别对细胞载体的基因组DNA的两条链进行切割，且切割的距离不能太远。Cas 9(D10A)/sgRNA方案与Cas 9/sgRNA方案相比，优点是特异性更高，脱靶的概率更低。

其中，所述sgRNA的具体序列为：

sgRNA-B2M-1：5’-CGCGAGCACAGCTAAGGCCACGG-3’(SEQ ID NO.163)；

sgRNA-B2M-2：5’-ACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGG-3’(SEQ ID NO.164)。

sgRNA-CIITA-1：5’-ACCCAGCAGGGCGTGGAGCCAGG-3’(SEQ ID NO.165)；

sgRNA-CIITA-2：5’-GTCAGAGCCCCAAGGTAAAAAGG-3’(SEQ ID NO.166)。

构建上述质粒载体的具体方法为：

(1)Cas9(D10A)质粒：直接从Addgene(Plasmid 41816，Addgene)订购获得。

(2)sgRNA质粒：通过在原始空白质粒(Plasmid 41824，Addgene)中分别放入不同的靶序列构建得到。

其中，放入sgRNA质粒中的靶序列包括上述的免疫兼容分子的序列、shRNA/miRNA加工复合体基因的序列、抗干扰素效应分子的序列。

(3)Donor片段(KI质粒)：

a)设计PCR引物，以pUC18质粒(Takara，Code No.3218)为模板，使用高保真酶(南京诺唯赞生物，P505-d1)通过PCR的方法扩增得到Amp(R)-pUC origin片段；

b)提取人细胞的基因组DNA并设计对应的引物，然后以人的基因组DNA为模板，使用高保真酶通过PCR的方法扩增得到AAVS1或者eGSH重组臂；

c)设计KI(Knock-in)质粒元件的PCR扩增引物，然后以含该KI质粒元件的质粒为模板，使用高保真酶扩增得到KI质粒元件(亚克隆)；

d)使用多片段重组酶(南京诺唯赞生物，C113-02)或overlap PCR连接上述扩增得到的Amp(R)-pUC origin片段、AAVS1或者eGSH重组臂、KI质粒元件，形成一个完整的环状质粒。

本发明实施例制备得到的质粒可根据质粒中的表达框架类型分为组成型质粒和诱导型质粒。

上述组成型质粒中的表达框架包括shRNA组成型表达框架、shRNAmiR组成型表达框架。酶切上述组成型质粒获取的Donor片段，在敲入干细胞载体基因组DNA后，该片段的表达功能不可以进行调控。

上述诱导型质粒中的表达框架包括shRNA诱导型表达框架、shRNAmiR诱导型表达框架。酶切上述诱导型质粒获取的Donor片段，敲入干细胞载体基因组DNA后，该片段的表达功能可以通过添加诱导物的方法来调控，相当于对表达功能添加了一个开启或者关闭的开关。

上述表达框架的具体序列要求与结构组成如下所示。

(1)shRNA组成型表达框架的序列组成为：

5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACgctagcgccacc(SEQ ID NO.167)N₁...N₂₁TTCAAGAGA(SEQ IDNO.168)N₂₂...N₄₂TTTTTT(SEQ ID NO.169)-3’；

其中，

a)N₁...N₂₁为上述靶序列的shRNA靶序列，N₂₂...N₄₂为上述靶序列的shRNA靶序列的反向互补序列；

b)当使用上述shRNA组成型表达框架构建的质粒需要表达多个基因的shRNA时，则每个基因分别对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；

c)当上述shRNA组成型表达框架需要带不同抗性基因时，所述shRNA组成型表达框架中只有抗性基因序列不同，其它序列均保持一样；

d)N表示A或T或G或C碱基。

(2)shRNAmiR组成型表达框架的序列组成为：

5’-GAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO.170)M₁N₁...N₂₁TAGTGAAGCCACAGATGTA(SEQ ID NO.171)N₂₂...N₄₂M₂TGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAAT(SEQ ID NO.172)-3’；

其中，

a)N₁...N₂₁为上述靶序列的shRNAmiR靶序列，N₂₂...N₄₂为上述靶序列的shRNAmiR靶序列的反向互补序列；

b)当使用上述shRNAmiR组成型表达框架构建的质粒需要表达多个基因的shRNAmiR时，则每个基因分别对应一个shRNAmiR表达框架，然后无缝连接起来；

c)当上述shRNAmiR组成型表达框架需要带不同抗性基因时，所述shRNAmiR组成型表达框架中只有抗性基因序列不同，其它序列均保持一样；

d)N表示A或T或G或C碱基，M碱基表示A或C碱基；

e)若N1为G碱基，则M₁为A碱基；否则M₁为C碱基；

f)M₁碱基与M₂碱基互补。

(3)shRNA诱导型表达框架的序列组成为：

5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgctagcgccacc(SEQ ID NO.173)N₁...N₂₁TTCAAGAGAN₂₂...N₄₂TTTTTT-3’；

其中，

d)N表示A或T或G或C碱基。

(4)shRNAmiR诱导型表达框架的序列组成如shRNAmiR组成型表达框架的序列组成所示。

eGSH重组质粒的构建原则和方法与AAVS重组质粒的构建原则和方法相同。

构建完成的质粒框架如图1-11所示。

5.构建干细胞载体

(1)干细胞载体的选择

本发明中的干细胞载体为多能干细胞，所述多能干细胞可选自胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)以及其他形式的多能干细胞，例如hPSCs-MSCs、NSCs、EBs细胞。

其中，所述多能干细胞的制备方法如下：

ESCs：可选用HN4细胞，购自上海中科院。

iPSCs：使用episomal-iPSCs诱导系统(6F/BM1-4C)，pE3.1-OG--KS和pE3.1-L-Myc--hmiR302 cluster经电转进入体细胞中，RM1培养基培养2天，用含2uM Parnate的BioCISO-BM1培养基培养2天，用含2uM Parnate、0.25mM sodium butyrate、3uM CHIR99021和0.5uM PD03254901的BioCISO-BM1培养基培养2天，然后用不含其它物质的BioCISO培养基继续培养至17天左右，挑取iPSCs克隆细胞，所挑取的iPSCs克隆细胞经纯化、消化、传代以获得稳定的iPSCs。具体构建方法参见：Stem Cell Res Ther.2017 Nov 2；8(1):245。

hPSCs-MSCs：将iPSCs用含10uM TGFβ抑制剂SB431542的BioCISO培养基培养25天，直至80-90细胞汇合度时进行消化传代(2mg/mL Dispase)，1:3传代到Matrigel包被的培养板中，接着ESC-MSC培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR、NEAA、双抗、谷氨酰胺、β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF和SB-431542)进行培养，每天换液，连续培养20天，直至80-90细胞汇合度时进行传代(1:3传代)，具体构建方法参见：Proc Natl Acad Sci U S A.2015；112(2):530-535。

NSCs：将iPSCs用诱导培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR，含TGF-β抑制剂，BMP4抑制剂)培养14天，挑取玫瑰花环状的神经细胞至低粘附培养板中进行培养。低粘附培养板中的培养基包括比例为1:1的DMEM/F12(含1％N2，Invitrogen)和Neurobasal培养基(含2％B27，Invitrogen)、以及20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF。使用Accutase进行消化传代。具体构建方法参见：FASEB J.2014；28(11):4642-4656。

EBs细胞：将细胞汇合度达到95％的iPSCs使用BioC-PDE1消化6min，用机械刮传法将细胞刮成块状，沉降细胞团块。将沉降的细胞团块转移到低粘附培养板中使用BioCISO-EB1培养7天，隔天换液。7天后转移到Matrigel包被的培养板中使用BioCISO培养基进行贴壁培养7天，即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(EBs)。具体构建方法参见：StemCell Res Ther.2017 Nov 2；8(1):245。

所述多能干细胞衍生物还包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

(2)在构建的干细胞载体基因组中敲入安全位点

本发明技术方案中，在构建的干细胞载体基因组中敲入的安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点。

AAVS1安全位点(PPP1R2C位点)是位于人类基因组第19号染色体上，是一个经过验证、能够确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录，且该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。

eGSH安全位点位于人类基因组第1号染色体上，是能够确保转入DNA片段预期功能的另一个“安全港”位点。

H11安全位点(Hipp11)，位于人的22号染色体，是Eif4enif1与Drg1这两个基因之间的一个位点。由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。

AAVS1基因敲入的单细胞克隆操作包括以下步骤：

a)电转程序：

供体细胞准备：人多能干细胞

试剂盒：Human Stem Cell

Kit 1

仪器：电转仪

培养基：BioCISO

诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone AAVS1-1、sgRNA clone AAVS1-2、AAVS1 neoVectoⅠ、AAVS1 neo VectorⅡ

其中，若使用eGSH基因敲入，则使用的诱导质粒为：Cas9D10A、sgRNA clone eGSH-1、sgRNA clone eGSH-2、eGSH-neo/eGSH-puro(donor)。其中，使用eGSH基因敲入时，donor质粒与AAVS1基因敲入时相比，只有左右重组臂不一样，其它质粒元件都一样。由于eGSH的基因编辑过程与AAVS1的相同，后述不再重复列举。

b)电转后的人多能干细胞进行含G418和puro的双抗生素培养基进行筛选。

c)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。

d)将获得的单细胞克隆株进行培养。

其中，单细胞克隆株培养试剂包括：

培养基为：BioCISO培养基、300μg/ml G418和0.5μg/ml puro。培养基需提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温，但不可以置于37℃进行预热，以避免生物分子活性降低。

基质胶：hESC级Matrigel。传代或复苏细胞前，将Matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保Matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处Matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，Matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100XMatrigel不能低于0.5小时；1:200X Matrigel不能低于2小时。

消化液：使用DPBS溶解EDTA至终浓度为0.5mM，pH7.4。所述EDTA不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。

冻存液：60％BioCISO、30％ESCs级FBS和10％DMSO。

单细胞克隆株培养步骤采用本领域常规维持传代培养过程。

其中，传代最佳时刻为细胞整体汇合度达到80％～90％。

传代最佳比例为1:4～1:7，传代后次日最佳汇合度应维持在20％～30％。

本发明中的具体传代操作步骤如下：

a)弃去包被好的细胞培养瓶皿中的Matrigel，加入适量上述培养基放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

b)待细胞符合上述传代要求，弃去培养基上清，加入适量的0.5mM EDTA消化液到细胞瓶皿中；

c)将细胞放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可)，吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；

d)离心后，弃去上清，用培养基重悬细胞，反复吹打细胞至混匀，然后将细胞转移至包被有Matrigel的瓶皿中，摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

e)次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基，每天按时换液。

传代获得的单细胞克隆株可直接用于实验或选择冻存处理。

细胞冻存的具体步骤如下：

a)使用0.5mM EDTA消化细胞至大部分细胞收缩变圆但尚未漂浮，吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5ml/支)；

b)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降1℃)；

c)次日立即将细胞转移入液氮。

冻存细胞的细胞复苏的具体步骤如下：

a)准备Matrigel包被的细胞瓶皿(复苏细胞前，弃去Matrigel)，加入适量的BioCISO培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

b)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅快速摇晃，使细胞快速融解，观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；

c)配制10mL DMEM/F12(体积比为1:1)基础培养基，平衡至室温，吸取1ml DMEM/F12(体积比为1:1)基础培养基缓慢加入冻存管中，混匀，转移到准备好的含有9mL DMEM/F12(体积比为1:1)基础培养基的15ml离心管中，200g离心5分钟；

d)弃去上清，加入适量BioCISO培养基混匀细胞，移种至细胞瓶皿中，摇匀镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

e)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则BioCISO培养基更换为上述混合有BioCISO、300μg/ml G418和0.5μg/ml puro的培养基中。

(3)检测细胞载体中AAVS1基因敲入情况

检测原理：

PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子。

检测方法：

在Donor质粒(KI质粒)内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在细胞的基因组(非重组臂部分)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现。

其中，上述引物的具体序列及扩增条件如下表所示。

表4引物的具体序列及扩增条件

eGSH基因敲入情况的检测方法与AAVS1基因敲入检测原理和方法一样。

(4)利用本领域常规技术将选取的质粒敲入干细胞载体基因组

按照下述表5和表6中的分组，分别将CD28激活型抗体的序列、免疫兼容分子的序列、shRNA/miRNA加工复合体基因的序列、抗干扰素效应分子的序列采用本领域常规技术敲入到上述干细胞表达载体(干细胞载体)安全位点中，获得不同类型的组成型干细胞表达载体和诱导型干细胞表达载体，以检测其表达可行性。

表5组成型敲入表达实验分组

其中，“+”号表示基因或核酸序列的敲入，“-”号表示基因敲除。

选取的质粒以及具体的敲入位置情况如下：

总体原则：CD28激活型抗体(CTLA-4抗体)的序列放入对应质粒的MCS2(组成表达)内，其它分子按照shRNA和shRNA-miR放入对应质粒的shRNA或shRNA-miR表达框架，其他基因放入对应质粒的MCS1内。

其中，CD28激活型抗体的序列的前面添加IL-2sig信号肽，具体结构为：信号肽-CD28激活型抗体序列(含终止密码子，所述终止密码子为TGA)。

EMCV IRESwt的序列如SEQ ID NO.183所示；

信号肽的序列为：5’-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCG-3’(SEQ ID NO.182)。

其中sgRNA clone B2M质粒包含sgRNA clone B2M-1和sgRNA clone B2M-2质粒。

sgRNA clone CIITA质粒包含sgRNA clone CIITA-1和sgRNA clone CIITA-2质粒。

(1)A1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，组成型)质粒的MCS2放入CD28激活型抗体序列。

(2)A2分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，组成型)质粒的MCS2放入CD28激活型抗体序列，shRNA表达框架放入其他分子的shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)，MCS1放入其他基因序列。

(3)A3分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，组成型)质粒的MCS2放入CD28激活型抗体序列，shRNA-miR表达框架放入其他分子的shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)，MCS1放入其他基因序列。

(4)A4分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，组成型)质粒的MCS2放入CD28激活型抗体序列，敲除B2M和CIITA，MCS1放入其他基因序列。

(5)A5分组：

(6)A6分组：

其中，在进行免疫兼容改造的时候，可以先在hPSCs上进行进行改造，改造完成后再分化成多能干细胞的衍生物进行运用；也可以在hPSCs分化成多能干细胞的衍生物后再进行免疫兼容改造。

表6诱导型敲入表达实验分组

(1)B1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，诱导型)质粒的MCS2放入CD28激活型抗体序列，shRNA表达框架放入其他分子的shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)，MCS1放入其他基因序列，插入Tet-Off系统。

(2)B2分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，诱导型)质粒的MCS2放入CD28激活型抗体序列，shRNA-miR表达框架放入其他分子的shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)，MCS1放入其他基因序列，插入Tet-Off系统。

(3)B3分组：

(4)B4分组：

本发明中的Tet-Off系统具体为：

在没有四环素存在时，tTA蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tTA蛋白的结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。

Tet-Off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。

(5)表达CD28激活型抗体的多能干细胞或其衍生物表达的CD28激活型抗体表达效果检测

将表5和表6各实验组方案敲入MSCs细胞的基因组安全位点，37℃，0.5％CO₂培养箱培养，收集培养基上清，使用ELISA(竞争法)对多能干细胞表达的CD28激活型抗体进行检测。具体步骤为：将收集的培养基上清与酶标的抗CTLA-4抗体混合(1:1)，再上样至包被有CTLA-4抗原的酶标板上，对照组则加不表达CD28激活型抗体的多能干细胞培养上清，轻轻混匀。封板后，置于37℃温育30min，洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50μL，在450nm读数测量吸光度值(CD28激活型抗体的表达量与颜色深浅成负相关)。

各实验组的检测结果如表7所示。

表7多能干细胞或其衍生物表达的CD28激活型抗体表达结果

分组	OD450	偏差(±)	独立样本T检验(*p<0.01)
				N(对照)	1.312	0.105	-
A1	0.459	0.007	*
				A2	0.453	0.020	*
A3	0.418	0.018	*
				A4	0.437	0.020	*
A5	0.444	0.036	*
				A6	0.420	0.026	*
B1	0.425	0.007	*
				B2	0.457	0.014	*
B3	0.448	0.034	*
				B4	0.453	0.029	*

从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的CD28激活型抗体能够有效激活CD28。而且其表达量在各组中表达相对恒定，所以多能干细胞衍生物所表达的CD28激活型抗体不受细胞分化形态及其他外源基因(免疫兼容改造)所影响。

(6)表达CD28激活型抗体的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果检测

将表6和表7各实验组方案敲入MSCs细胞的基因组安全位点，得到表达CD28激活型抗体细胞。使用CFSE(5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester，羟基荧光素二醋酸盐琥铂酰亚胺酯)测试试验检验其抗肿瘤效果。

具体步骤为：

1)效应细胞的准备：

T细胞分离：使用Ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradientcentrifugation)分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，再使用Dynabeads^TMCD3(Invitrogen^TM，货号：11151D)试剂盒分离出T细胞。将细胞重悬在含10％FBS的RPMI1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1×10⁷细胞/mL。

2)靶细胞的准备：

靶细胞选择为肿瘤细胞(NIC肺癌)，将其消化重悬，通过台盼蓝染色计数细胞，配成1×10⁷细胞/mL的细胞悬液。

3)在靶细胞中加入CFSE工作液(终浓度为5μmol/L CFSE)，于37℃，5％CO₂培养孵育10min，洗涤2次。台盼蓝染色计数后用培养基重悬，配成1×10⁶细胞/mL备用。

4)将靶细胞及效应细胞加入5mL流式管中，每管加100μL靶细胞(1×10⁵ml^-1)及效应细胞(E/T＝1:2、1:5、1:10，E/T为靶细胞与效应细胞T细胞的比)，并以只加靶细胞作为对照。将流式管中的效应细胞与靶细胞轻轻混匀。加入PI(propidium iodide，碘化丙锭)，放置37℃，5％CO₂培养孵育4h。流式细胞检测CFSE⁺PI⁺细胞(死亡的靶细胞)的百分率。

靶细胞死亡率(％)＝加T细胞刺激的靶细胞死亡率(％)-靶细胞自然死亡率(％)

结果如表9所示。

表9各实验组表达的CD28激活型抗体对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响

分组	靶细胞死亡率平均值(％)	偏差(±)	独立样本T检验(*p<0.01)
				N(对照)	30.845	0.960	-
A1	51.185	0.506	*
				A2	52.801	3.082	*
A3	53.250	4.052	*
				A4	55.723	1.357	*
A5	55.842	3.462	*
				A6	54.184	3.621	*
B1	53.653	3.643	*
				B2	54.713	4.023	*
B3	54.198	0.785	*
				B4	54.954	2.471	*

通过以上实验，可以证明本发明制备的表达CD28激活型抗体的干细胞或其衍生物能有效激活T细胞而起到抗肿瘤作用。

(7)表达CD28激活型抗体的多能干细胞在多种肿瘤治疗中进行应用

选择B2M和CIITA基因敲除方案组(A4)的免疫兼容细胞(hPSCs、MSCs、NSCs、EBs)中进行测试。

在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，注射各组实验细胞(能够表达CD28激活型抗体的hPSCs及hPSCs源衍生物(hPSCs-MSCs、hPSCs-NSCs、hPSCs-EBs))，观察其对RCC肾癌，MC结肠癌，NIC肺癌的治疗的效果。为避免免疫兼容问题，使用的免疫细胞与hPSCs及hPSCs源衍生物均来源于同一人的，且采用B2M和CIITA基因敲除的免疫兼容方案。

具体步骤包括：

在人源化NSG小鼠(The Jackson Laboratory(JAX))中，对其右腋下皮下注射5×10⁶肿瘤(RCC肾癌，MC结肠癌，NIC肺癌)细胞，待肿瘤长到60mm³大小时，进行尾静脉注射200uL PBS(含人免疫细胞和10⁶的表达的CD28激活型抗体的多能干细胞衍生物)进行肿瘤治疗，其中只注射含人免疫细胞的组作为对照组。20天后处死小鼠，然后比较各组之间肿瘤大小，并进行差异性统计分析。

N(对照)组是指未注射实验细胞的NSG小鼠肿瘤模型。

结果如表9所示。

表9各实验组多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果

通过以上实验，可以证明本发明制备的表达CD28激活型抗体的干细胞或其衍生物能有效激活CD28而起到抗肿瘤作用。

(8)表达CD28激活型抗体的多能干细胞的免疫兼容性测试

利用MSCs的低免疫源性的特点，在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，对其进行注射能够表达CD28激活型抗体的hPSCs源免疫兼容MSCs，观察其肿瘤(NIC肺癌)治疗的效果。其中，所使用的免疫细胞与hPSCs源MSCs来源于为非同一人。

对照组为未注射MSCs细胞的NSG小鼠肿瘤模型；

加Dox组为：从注射表达CD28激活型抗体的细胞开始，持续在小鼠饮食中添加0.5mg/mL的Dox饲养小鼠，直至试验结束。

免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果如下所示。

表10免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果

以上实验表明：仅表达CD28激活型抗体的MSCs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在一定时间，所以其能够发挥一定的肿瘤治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-11，包括组成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的MSCs在体内存在时间更长(或能做到长期共存)，其发挥肿瘤治疗效果更佳，而组5为B2M和CIITA基因敲除组，其完全消除HLA-I和HLA-II类分子产生的影响，因此其肿瘤治疗效果最佳。但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清除，从而有组8-15方案设定。组12-15中在进行注射表达CD28激活型抗体细胞进入小鼠的同时，对小鼠使用Dox诱导剂(一直使用)，注射表达CD28激活型抗体细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其在体内存在时间与未经免疫兼容改造的MSCs相当，其肿瘤治疗效果也与未经免疫兼容改造的MSCs相当。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 未来智人再生医学研究院（广州）有限公司

王淋立

<120> 一种表达CD28激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用

<130>

<160> 183

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggcgtgc tgctgaccca gaggaccctg ctgagcctgg tgctggccct gctgttcccc 60

agcatggcca gcatggccat gcacgtggcc cagcccgccg tggtgctggc cagcagcagg 120

ggcatcgcca gcttcgtgtg cgagtacgcc agccccggca aggccaccga ggtgagggtg 180

accgtgctga ggcaggccga cagccaggtg accgaggtgt gcgccgccac ctacatgatg 240

ggcaacgagc tgaccttcct ggacgacagc atctgcaccg gcaccagcag cggcaaccag 300

gtgaacctga ccatccaggg cctgagggcc atggacaccg gcctgtacat ctgcaaggtg 360

gagctgatgt accccccccc ctactacctg ggcatcggca acggcaccca gatctacgtg 420

atcgaccccg agccctgccc cgacagcgac caggagccca agagcagcga caagacccac 480

accagccccc ccagccccgc ccccgagctg ctgggcggca gcagcgtgtt cctgttcccc 540

cccaagccca aggacaccct gatgatcagc aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 600

gacgtgagcc acgaggaccc cgaggtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660

cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag cagtacaaca gcacctacag ggtggtgagc 720

gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 780

aacaaggccc tgcccgcccc catcgagaag accatcagca aggccaaggg ccagcccagg 840

gagccccagg tgtacaccct gccccccagc agggacgagc tgaccaagaa ccaggtgagc 900

ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 960

ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccgtgc tggacagcga cggcagcttc 1020

ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag agcaggtggc agcagggcaa cgtgttcagc 1080

tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgagc 1140

cccggcaag 1149

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 2

gggagcagag aattctctta t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 3

ggagcagaga attctcttat c 21

<210> 4

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<212> DNA

<213> human

<400> 4

gagcagagaa ttctcttatc c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 5

gctacctgga gcttcttaac a 21

<210> 6

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<212> DNA

<213> human

<400> 6

ggagcttctt aacagcgatg c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 7

gggtctccag tatattcatc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 8

gcctcctgat gcacatgtac t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 9

ggaagacctg ggaaagcttg t 21

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<212> DNA

<213> human

<400> 10

ggctaagctt gtacaataac t 21

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<213> human

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gcggaatgaa ccacatcttg c 21

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<212> DNA

<213> human

<400> 12

ggccttctct gaaggacatt g 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 13

ggactcaatg cactgacatt g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 14

ggtacccact gctctggtta t 21

<210> 15

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<212> DNA

<213> human

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gctcccactc catgaggtat t 21

<210> 16

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<213> human

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ggtatttctt cacatccgtg t 21

<210> 17

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<212> DNA

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aggagacacg gaatgtgaag g 21

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gctcccactc catgaggtat t 21

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<212> DNA

<213> human

<400> 19

ggtatttcta cacctccgtg t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 20

ggaccggaac acacagatct a 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 21

accggaacac acagatctac a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 22

ggaacacaca gatctacaag g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 23

gaacacacag atctacaagg c 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 24

ttcttacttc cctaatgaag t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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aagttaagaa cctgaatata a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 26

aacctgaata taaatttgtg t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 27

acctgaatat aaatttgtgt t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 28

aagcgttgat ggattaatta a 21

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<400> 29

agcgttgatg gattaattaa a 21

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<213> human

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gggtctggtg ggcatcatta t 21

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ggtctggtgg gcatcattat t 21

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gctttacaaa gctggcaata t 21

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<213> human

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gacaatttaa ggaagaatct t 21

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gatgaccaca ttcaaggaag a 21

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<213> human

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agccaactgt attgcctatt t 21

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<213> human

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gccaactgta ttgcctattt g 21

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<213> human

<400> 73

gggtagcaac tgtcaccttg a 21

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<213> human

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<211> 21

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<213> human

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gcatgtgcta cttcaccaac g 21

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<213> human

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<213> human

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<211> 21

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<213> human

<400> 79

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<211> 21

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gacatatata gtgatccttg g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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ggaaagtcac atcgatcaag a 21

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<213> human

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<213> human

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<213> human

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gcgtttgtac agacgcatag a 21

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ggctggctaa cattgctata t 21

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gctggctaac attgctatat t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gccagtgaac acttaccata g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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<211> 21

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<213> human

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ggatggattt gattatgatc c 21

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<212> DNA

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gctaattctt gctgaacttc t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gctgaacttc ttcatgtatg t 21

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<212> DNA

<213> human

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gcctcatctc tttgttctaa a 21

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<211> 21

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<213> human

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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<212> DNA

<213> human

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ggacaaacat gcaaactata g 21

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<213> human

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<213> human

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<213> human

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<213> human

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ggagagttca tccaggaaat t 21

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<213> human

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gagagttcat ccaggaaatt a 21

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<213> human

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gcctgtcaaa gagagagagc a 21

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<213> human

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<213> human

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<211> 21

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<213> human

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gcatctactg gacaaagtat t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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ggctgaatta cccatgcttt a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 122

gctgaattac ccatgcttta a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gggttggttt atccaggaat a 21

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 124

ggatcagaag agaagccaac g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 125

ggttcaccat ccaggtgttc a 21

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 126

gctctcttct ctggaactaa c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 127

gctagagtga ctccatctta a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

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gctgaccacc aattataatt g 21

<210> 129

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 129

gcagaatatt taaggccata c 21

<210> 130

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 130

gcccacttaa aggcagcatt a 21

<210> 131

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 131

ggtcatcaat accactgtta a 21

<210> 132

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 132

gcattcctcc ttctcctttc t 21

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 133

ggaggaactt tgtgaacatt c 21

<210> 134

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 134

gctgtaagaa ggatgctttc a 21

<210> 135

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 135

gctgcaggca ggattgtttc a 21

<210> 136

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 136

gcagttcgag gtcaagtttg a 21

<210> 137

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 137

gccaattagc tgagaagaat t 21

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 138

gcaggtttac agtgtatatg t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 139

gcctacagag actagagtag g 21

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 140

gcagttgggt accttccatt c 21

<210> 141

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 141

gcaactcagg tgcatgatac a 21

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 142

gcatggcgct ggtacgtaaa t 21

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<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 143

gcctcgagtt tgagagcta 19

<210> 144

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 144

agacattctg gatgagtta 19

<210> 145

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 145

gggtctgtta cccaaagaa 19

<210> 146

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 146

ggtctgttac ccaaagaat 19

<210> 147

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 147

ggaaggaagc ggacgctca 19

<210> 148

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 148

ggaggcagta cttctgata 19

<210> 149

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 149

cgctctagag ctcagctga 19

<210> 150

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 150

ccaccacctc aaccaataa 19

<210> 151

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 151

atttcaagaa gtcgatcaa 19

<210> 152

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 152

gaagatctga ttaccttca 19

<210> 153

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 153

ggacactggt tcaacacctg t 21

<210> 154

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 154

ggttcaacac ctgtgacttc a 21

<210> 155

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 155

acctgtgact tcatgtgtgc g 21

<210> 156

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 156

gctggacgtg accatcatgt a 21

<210> 157

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 157

ggacgtgacc atcatgtaca a 21

<210> 158

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 158

gacgtgacca tcatgtacaa g 21

<210> 159

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 159

acgtgaccat catgtacaag g 21

<210> 160

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 160

acgctatacc atctacctgg g 21

<210> 161

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 161

gcctctatga cgacatcgag t 21

<210> 162

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 162

gacatcgagt gcttccttat g 21

<210> 163

<211> 23

<212> DNA

<213> human

<400> 163

cgcgagcaca gctaaggcca cgg 23

<210> 164

<211> 23

<212> DNA

<213> human

<400> 164

actctctctt tctggcctgg agg 23

<210> 165

<211> 23

<212> DNA

<213> human

<400> 165

acccagcagg gcgtggagcc agg 23

<210> 166

<211> 23

<212> DNA

<213> human

<400> 166

gtcagagccc caaggtaaaa agg 23

<210> 167

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 167

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgctagcgcc acc 253

<210> 168

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 168

ttcaagaga 9

<210> 169

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 169

tttttt 6

<210> 170

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 170

gaggcttcag tactttacag aatcgttgcc tgcacatctt ggaaacactt gctgggatta 60

cttcttcagg ttaacccaac agaaggctaa agaaggtata ttgctgttga cagtgagcg 119

<210> 171

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 171

tagtgaagcc acagatgta 19

<210> 172

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 172

tgcctactgc ctcggacttc aaggggctac tttaggagca attatcttgt ttactaaaac 60

tgaatacctt gctatctctt tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat ggtataaat 119

<210> 173

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 173

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 300

gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 360

agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 420

ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 480

agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 540

tacccgggtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctgctagc gccacc 686

<210> 174

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 174

ccatagctca gtctggtcta tc 22

<210> 175

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 175

tcaggatgat ctggacgaag ag 22

<210> 176

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 176

ccggtcctgg actttgtctc 20

<210> 177

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 177

ctcgacatcg gcaaggtgtg 20

<210> 178

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 178

cgcattggag tcgctttaac 20

<210> 179

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 179

cgagctgcaa gaactcttcc tcac 24

<210> 180

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 180

cacggcactt acctgtgttc tgg 23

<210> 181

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 181

cagtacaggc atccctgtga aag 23

<210> 182

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 182

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

<210> 183

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 183

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg 590

Claims

1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD28激活型抗体的表达序列。

2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述CD28激活型抗体包括CTLA-4抗体，所述CTLA-4抗体序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。

4.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述与免疫应答相关的基因包括：

5.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；

(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.102中的至少一种；主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ IDNO.2～SEQID NO.14中的至少一种。

7.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为靶向PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述靶向PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.103～SEQ ID NO.162所示。

9.根据权利要求6或8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、靶向PKR或2-5As或IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T，所述shRNA靶序列如权利要求6或8所述；

(2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求6或8所述的shRNA-miR靶序列替换所述(1)中的shRNA靶序列得到。

10.根据权利要求9所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述茎环序列长度为3～9个碱基；所述Poly T长度为5～6个碱基。

11.根据权利要求3或7所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子和/或shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达。

12.根据权利要求11所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述诱导型基因表达系统包括Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

13.根据权利要求12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述CD28激活型抗体的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法，所述基因编辑的方法包括基因敲入。

14.根据权利要求13所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述CD28激活型抗体的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。

15.根据权利要求14所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

16.根据权利要求15所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

17.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD28激活型抗体的表达序列，且所述多能干细胞或其衍生物的基因组被敲除了B2M基因和/或CIITA基因。

18.根据权利要求17所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述CD28激活型抗体包括CTLA-4抗体，所述CTLA-4抗体序列如SEQ ID NO.1所示。

19.权利要求1-16任一项所述的多能干细胞或其衍生物和/或权利要求17-18任一项所述的多能干细胞或其衍生物在制备CD28低表达肿瘤治疗药物中的应用。

20.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1-16任一项所述的多能干细胞或其衍生物和/或权利要求17-18任一项所述的多能干细胞或其衍生物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。