CN114350611A

CN114350611A - 表达靶向pd-1/pd-l1的效应rna分子的多能干细胞及其衍生物

Info

Publication number: CN114350611A
Application number: CN202011042564.3A
Authority: CN
Inventors: 王淋立; 陈月花; 杨建国; 莫健
Original assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Current assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明公开了一种表达靶向PD‑1/PD‑L1的效应RNA分子的多能干细胞及其衍生物。多能干细胞或其衍生物的基因组中导入PD‑1和/或PD‑L1阻断物的表达序列，所述PD‑1阻断物为靶向PD‑1的shRNA和/或shRNA‑miR中的至少一种；所述PD‑L1阻断物为靶向PD‑L1的shRNA和/或shRNA‑miR中的至少一种。多能干细胞或其衍生物表达的PD‑1和/或PD‑L1阻断物被外泌体包裹后，外泌体携带PD‑1和/或PD‑L1阻断物与靶细胞结合，释放其包含的PD‑1和/或PD‑L1阻断物，从而阻断PD‑1/PD‑L1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。

Description

表达靶向PD-1/PD-L1的效应RNA分子的多能干细胞及其衍生物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种表达靶向PD-1/PD-L1的效应RNA分子的多能干细胞及其衍生物，以及相关的应用。

背景技术

PD-1是程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-1属I型跨膜蛋白，由胞外段、跨膜锚定区以及胞内信号转导区三部分构成，主要诱导表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞表面。PD-1的配体是B7-H1(PD-L1)和B7-DC(PD-L2)，二者结合后抑制T细胞增殖活化，对T细胞应答起负调节作用，属于抑制性受体。肿瘤细胞表面常表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞增殖活化，实现免疫逃逸。目前市场上已经有PD-1和PD-1抗体，阻断肿瘤细胞对T细胞的抑制作用。在人体内除了存在跨膜结合蛋白PD-1，也存在可溶性PD-1(sPD-1)，sPD-1保留了模型分子的胞外Ig V-Ig C样结构域，能够结合于配体PD-L1和PD-L2。最初有关sPD-1的研究多与自身免疫疾病相关，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重度肌无力等自身免疫疾病均被证明与sPD-1有关，sPD-1也被认为是在自身免疫疾病中，由免疫细胞在促炎症刺激因子的作用下产生。同样，sPD-1具有与PD-L1结合的能力，起到促进T细胞活性的功能。PD-1，PD-L1已成为治疗肿瘤的新靶点，目前国外已上市的抗PD-1抗体药物有百时美施宝贵的Nivolumab、默沙东的Keytruda等。但是这类抗体药物的作用时间短，需要长期进行注射，对于病人来说需要花费高昂的费用。因此，研发一种可以在人体内源源不断地表达PD-1/PD-L1阻断物的多能干细胞或其衍生物，对于癌症治疗来说具有极为重要的意义。

外泌体是指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。目前已经尝试用外泌体携带siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。

另一方面，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR。

本发明的第二个目的在于提供一种免疫兼容的多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR。其中一个方案是将多能干细胞或其衍生物基因组中的B2M和/或CIITA基因敲除；其中另一个方案是在多能干细胞或其衍生物的基因组敲入免疫兼容分子的表达序列。

本发明的第三个目的在于提供一种免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR。

本发明所采取的技术方案是：

一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列；所述PD-1阻断物为靶向PD-1的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种；所述PD-L1阻断物为靶向PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种。

本发明研究发现，在多能干细胞或其衍生物中导入靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shRNA-miR表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌的外泌体中包含高丰度的靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shmiRNA以及加工成熟的siRNA，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，然后将其释放，从而阻断PD-1/PD-L1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。

作为优选的：

所述靶向PD-1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示；

所述靶向PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.20所示。

作为本发明的另一个优选技术方案：所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。

作为本发明的另一个优选技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。

所述与免疫应答相关的基因包括：

(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种；

所述所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；

(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；

(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。

作为优选的：

所述靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ IDNO.34～SEQ ID NO.121中的至少一种；

所述靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.33中的至少一种。

作为优选的：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Dhrosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为靶向PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。

作为优选的：所述靶向PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.122～SEQ ID NO.181中的至少一条。

作为优选的：所述靶向PD-1、PD-L1、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA或shRNA-miR的表达框架如下：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子。

作为优选的，所述shRNA表达框架中的环序列长度为3～9个碱基；所述poly T长度为5～6个碱基。

(2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求7或9所述shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。

上述表达框架可根据需要在5’端加上组成型启动子或诱导型启动子，例如U6启动子、H1启动子，以及配套的启动子调控元件。

作为本发明的另一个优选技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子和/或shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达，从而得到一种免疫兼容可逆的表达PD-1和/或PD-L1阻断物的多能干细胞或其衍生物。

作为优选的：所述诱导型基因表达系统包括Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

作为优选的，所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因，所述外泌体加工合成基因包括STEAP3、Syndevan-4、L-天冬氨酸氧化酶片段、CD63-L7Ae和Cx43 S368A中的至少一种。

在干细胞或其衍生物的基因组中导入外泌体加工合成基因可以提高外泌体的分泌效率，及其对shRNA、shmiRNA和加工成熟的siRNA的包裹效率。

作为优选的：以上所述PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法，所述基因编辑的方法包括基因敲入。

作为优选的：以上所述PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列、外泌体加工合成基因、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子以及诱导型基因表达系统的导入位点为基因组安全位点。

作为优选的：所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

作为优选的：

以上所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；

以上所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

以上所述的多能干细胞或其衍生物在制备PD-1或PD-L1高表达肿瘤治疗药物中的应用。

一种制剂，其含有权利要求1-17任一项所述的多能干细胞或其衍生物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

以上所述的多能干细胞或其衍生物分泌得到的装载PD-1和/或PD-L1阻断物的外泌体。

本发明的有益效果是：

本发明的方案1：一种表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物，可应用于自体细胞诱导的iPSCs或者是MSCs这类低免疫源性细胞。在自体细胞诱导的iPSCs基因组中导入靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shRNA-miR的表达序列后，iPSCs能够大量表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shRNA-miR，并被细胞分泌的外泌体包裹。外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断PD-1/PD-L1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

本发明的方案2：一种免疫兼容的表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物，可应用于同种异体细胞治疗。由于多能干细胞或其衍生物中的B2M、CIITA基因被敲除，或者其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。移植物可以在受体内源源不断地表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shRNA-miR，这些效应RNA分子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断PD-1/PD-L1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

本发明的技术方案3：一种免疫兼容可逆的表达靶向PD-1和/或PD-L1的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物。此技术方案中的多能干细胞或其衍生物的基因组中导入了诱导型基因表达系统和免疫兼容分子的表达序列，诱导型基因表达系统可以调控免疫兼容分子的表达，而诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，进一步控制疫兼容分子表达序列的表达量，从而实现多能干细胞或其衍生物免疫兼容的可逆性调控。当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，从而使得进行同种异体细胞治疗时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高供体细胞与受体之间的免疫兼容能力。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达HLAⅠ类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，进而受体免疫系统通过识别不匹配的HLAⅠ类分子或通过交叉HLAⅠ类分子抗原提呈(经典非兼容HLA之间的抗原提呈/识别)突变的分子，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

此外，还可以通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间，让移植物逐步表达低浓度的HLA分子来刺激受体，使得受体对移植物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。此时，即使移植物细胞表面表达不匹配的HLAⅠ类分子，也能够被受体免疫系统兼容，这样可以使得在诱导关闭移植物细胞中免疫兼容分子的表达后，受体免疫系统一方面能够重新识别移植物中HLAⅠ类分子提呈的有基因突变的细胞，清除病变细胞；另一方面，未发生突变的部分由于被上述诱导物训练产生同种异体HLAⅠ类分子耐受而不会被受体免疫系统清除。从而使受体免疫系统仅清除有害突变的移植物，保留正常功能的移植物，当有害的移植物清除后，又可以转入移植物细胞表面HLAⅠ类分子沉默的模式。由外源诱导物介导的移植物免疫耐受程序还可以在受体彻底耐受后，植入无诱导或其他方式诱导开启或关闭HLAⅠ类分子表面表达的移植物。

附图说明

图1，AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒图谱。

图2，AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒图谱。

图3，AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒图谱。

图4，AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒图谱。

图5，sgRNA clone B2M-1质粒图谱。

图6，sgRNA clone B2M-2质粒图谱。

图7，sgRNA clone CIITA-1质粒图谱。

图8，sgRNA clone CIITA-2质粒图谱。

图9，Cas9(D10A)质粒图谱。

图10，sgRNA Clone AAVS1-1质粒图谱。

图11，sgRNA Clone AAVS1-2质粒图谱。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

1实验材料与方法

1.1 PD-1、PD-L1阻断物

1.1.1 PD-1阻断物为：靶向PD-1的shRNA或shRNA-miR。

1.1.2 PD-L1阻断物为：靶向PD-L1的shRNA或shRNA-miR。

1.1.3靶向PD-1或PD-L1的shRNA、shRNA-miR的靶序列如表1所示。

表1 靶向PD-1/PD-L1的shRNA或shRNA-miR的靶序列

下面表6-表8的实验方案中，各实验组别敲入的PD-1阻断物或PD-L1阻断物均为采用表1中的靶序列1构建得到的shRNA或shRNA-miR。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的PD-1阻断物或PD-L1阻断物同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

1.2干细胞或其衍生物

多能干细胞可选自胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)以及其他形式的多能干细胞，例如hPSCs-MSCs、NSCs、EBs细胞。其中：

ESCs：可选用HN4细胞，购自上海中科院。

iPSCs：使用我们所建立的第三代高效安全的episomal-iPSCs诱导系统(6F/BM1-4C)，pE3.1-OG--KS和pE3.1-L-Myc--hmiR302 cluster经电转进入体细胞中，RM1培养2天，含2uM Parnate的BioCISO-BM1培养2天，含2uM Parnate、0.25mM sodium butyrate、3uMCHIR99021和0.5uM PD03254901的BioCISO-BM1培养2天，在用干细胞培养基BioCISO培养到17天左右即可挑取iPSCs克隆，所挑取的iPSCs克隆经纯化、消化、传代以获得稳定的iPSCs。具体构建方法参见：Stem Cell Res Ther.2017Nov 2；8(1):245。

hPSCs-MSCs：将iPSCs使用干细胞培养基(BioCISO，含10uM TGFβ抑制剂SB431542)培养25天，期间80-90汇合度进行消化传代(2mg/mL Dispase消化)，1:3传代到Matrigel包被的培养板中，接着ESC-MSC培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR、NEAA、双抗、谷氨酰胺、β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF和SB-431542)进行培养，每天换液，80-90汇合度进行传代(1:3传代)，连续培养20天即可。具体构建方法参见：Proc Natl Acad Sci U S A.2015；112(2):530-535。

NSCs：将iPSCs使用诱导培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR，含TGF-β抑制剂，BMP4抑制剂)培养14天，挑取玫瑰花环状的神经细胞到低粘附培养板中进行培养，培养基使用比例为1:1的DMEM/F12(含1％N2，Invitrogen)和Neurobasal培养基(含2％B27，Invitrogen)，还含有20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF，进行培养，消化使用Accutase进行消化传代即可。具体构建方法参见：FASEB J.2014；28(11):4642-4656。

EBs细胞：将汇合度达到95％的iPSCs使用BioC-PDE1消化6min后使用机械刮传法将细胞刮成块状，沉降降细胞团块，沉降的细胞团块转移到低粘附培养板中使用BioCISO-EB1培养7天，隔天换液。7天后转移到Matrigel包被的培养板中继续使用BioCISO进行贴壁培养，7天后即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(EBs)。具体构建方法参见：StemCell Res Ther.2017Nov 2；8(1):245。

所述多能干细胞衍生物还包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

1.3基因组安全位点

本发明技术方案中，基因敲入的基因组安全位点可选自AAVS1安全位点、eGSH安全位点，或者其它安全位点：

(1)AAVS1安全位点

AAVS1位点(别名“PPP1R2C位点”)位于人类基因组第19号染色体上，是一个经过验证、能够确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录，且该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。

(2)eGSH安全位点

eGSH安全位点位于人类基因组第1号染色体上，是一个经过论文验证、能够确保转入DNA片段预期功能的另一个“安全港”位点。

(3)其它安全位点

H11安全位点(也叫Hipp11)，位于人的22号染色体，是Eif4enif1与Drg1这两个基因之间的一个位点，由Simon Hippenmeyer于2010年发现并命名，由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。H11位点被验证是一个基因间的安全的转录激活区域，是AAVS1、eGSH位点之外的一个新的“安全港”位点。

1.4诱导型基因表达系统

本发明技术方案中，诱导型基因表达系统可选自：tet-Off系统或者二聚体关闭表达系统：

(1)tet-Off系统

在没有四环素存在时，tTA蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tTA蛋白的结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。

本发明将tet-Off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。

(2)二聚体关闭表达系统

二聚体介导的基因表达调控系统：化学调控靶基因转录的方法有很多种，最常见的是利用影响转录因子活性的别构调节物进行调控。其中的一个方法是运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白FKBP12(FKBP与FK506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为FRAP【FRBP-雷帕霉素相关蛋白，即mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶点)】有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将DNA结合区域融合到一个或多个FKBP结构域，将转录抑制域融合到FRAP的93位氨基酸部位，称为FRB，这样足以结合FKBP-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与DNA结合区域相结合的位点的基因进行转录。

1.5免疫兼容分子的选择

所述免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中同种异体免疫排斥相关基因的表达。具体免疫兼容分子的种类及序列如表1所示：

表2 免疫兼容分子

以上shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子的靶序列如表3所示：

表3 shRNA或shRNA-miR的靶序列

下面表6-表8的实验方案中，各实验组别的敲入的shRNA或shRNA-miR类免疫兼容分子均为采用表3中的靶序列1构建得到的shRNA或shRNA-miR。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

上述免疫兼容分子的shRNA或shRNA-miR的通用框架序列与上述PD-1/PD-L1阻断物的相同。

1.6 shRNA/miRNA加工复合体基因和抗干扰素效应分子

在细胞核内的初级miRNA(pri-miRNA)经过复合物Drosha-DGCR8进行微处理，将pri-miRNA裂解成前体miRNA(pre-miRNA)，这时会形成发夹结构。接着，经Exportin-5-Ran-GTP复合物将pre-miRNA转运出核。在胞浆中与双链RNA结合蛋白TRBP(TARBP2)结合的RNaseDicer酶将pre-miRNA分解成成熟的长度，miRNA在这时还处于双链状态。最后被转运进AGO2，形成RISC(RNA诱导沉默复合体)。最终miRNA双链的一条链保留在RISC复合物中，另外一条则排出被迅速降解掉。而DGCR8作为Drosha的主要结合蛋白，可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合，招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切，生产pre-miRNA，pre-miRNA进一步被Dicer和TRBP/PACT加工剪切，形成成熟的miRNA。DGCR8的缺失或异常表达会影响Drosha的剪切活性，进而影响miRNA的活性，导致疾病的发生。TRBP能够招募Dicer复合体miRNA形成RISC Ago2。

本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点敲入可诱导关闭表达的针对HLA I类分子和HLA II类分子等的shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的shRNA和/或miRNA加工机器包括Dhrosha(Accession number:NM_001100412)、Ago1(Accessionnumber:NM_012199)、Ago2(Accession number:NM_001164623)、Dicer1(Accessionnumber:NM_001195573)、Exportin-5(Accession number:NM_020750)、TRBP(Accessionnumber:NM_134323)、PACT(Accession number:NM_003690)和DGCR8(Accession number:NM_022720)，以便细胞不占用其他miRNA的加工，影响细胞功能。

此外，在IFN诱生的过程中，双链RNA所依赖的蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent Protein Kinase,PKR)，它是整个细胞信号转导通路的关键因子，同时还有2’,5’寡腺苷酸合成酶(2,5-Oligoadenylate Synthetase,2-5As)，这两种酶与dsRNA诱生IFN密切相关。PKR能通过磷酸化真核细胞转录因子，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于G0/G1和G2/M期，并诱导凋亡，而dsRNA可以促进2-5As合成，结果导致RNase即RNaseL的非特异性活化，降解细胞内所有的mRNA，致细胞死亡。I型干扰素的诱导特异性是通过IRF转录因子家族成员实现的，在细胞缺乏IRF-3和IRF-7的表达下，在很多病毒感染情况下I型干扰素是不能被诱导分泌的。缺乏IFN的应答，要使其恢复，需要上述两种蛋白质的共表达才行。

本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点处敲入免疫兼容分子shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的针对抑制PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7基因的shRNA和/或shRNA-miR表达序列，降低dsRNA诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。

shRNA/miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、免疫兼容分子在基因组的位置没有限定，它们之间可以以任何次序排列，而不会相互干扰或者影响基因组其它基因的结构和功能。

具体的抗干扰素效应分子的靶序列如表4所示。

表4 抗干扰素效应分子的靶序列

下面表6-表8的实验方案中，各实验组别敲入的抗干扰素效应分子均为采用表4中的靶序列1构建得到的shRNA或shRNA-miR。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的shRNA或shRNA-miR类抗干扰素效应分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

1.7 shRNA或shRNA-miR的表达框架

(1)shRNA组成型表达框架为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.182)-N₁...N₂₁-TTCAAGAGA(SEQ IDNO.183)-N₂₂...N₄₂-TTTTTT

其中：

a、N₁...N₂₁为对应基因的shRNA靶序列，N₂₂...N₄₂为对应基因的shRNA靶序列的反向互补序列；

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA，则每个基因分对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、N表示A或T或G或C碱基；

e、SEQ ID NO.182为U6启动子序列；

f、SEQ ID NO.183为茎环序列。

(2)shRNA诱导型表达框架为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgctagcgccacc(SEQ ID NO.184)-N₁...N₂₁-TTCAAGAGA(SEQ ID NO.185)-N₂₂...N₄₂-TTTTTT

其中：

c、带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；d、N表示A或T或G或C碱基；

e、SEQ ID NO.184为H1 TO启动子序列；

f、SEQ ID NO.185为茎环序列。

(3)shRNA-miR组成型或诱导型表达框架为：

以shRNA-miR靶序列替换microRNA-155中的靶序列得到，具体序列如下：

GCATACACAAACATTTCTTTCTCTCTTGCAGGTGGCACAAACCAGGAAGGGGAAATCTGTGGTTTAAATTCTTTATGCCTCATCCTCTGAGTGCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATGC(SEQ ID NO.186)-M₁N₁...N₂₁-TAGTGAAGCCACAGATGTA(SEQ ID NO.187)

-N₂₂...N₄₂M₂-GTGTATGATGCCTGTTACTAGCATTCACATGGAACAAATTGCTGCCGTGGGAGGATGACAAAGAAGCATGAGTCACCCTGCTGGATAAACTTAGACTTCAGGCTTTATCATTTTTCAAT(SEQ ID NO.188)

其中：

a、N₁...N₂₁为对应基因的shRNA-miR靶序列，N₂₂...N₄₂为对应基因的shRNA-miR靶序列的反向互补序列；

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA-miR，则每个基因分对应一个shRNA-miR表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA-miR质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、M碱基表示A或C碱基，N表示A或T或G或C碱基；

e、如果N1为G碱基，则M1为A碱基；否则M1为C碱基；

f、M1碱基与M2碱基互补。

1.8外泌体加工合成基因

外泌体加工合成基因选自STEAP3(NM_182915)、Syndecan-4(NM_002999)、L-天冬氨酸氧化酶片段(SEQ ID NO.189)、CD63-L7Ae(SEQ ID NO.190)和Cx43S368A中的至少一种。其中，Cx43 S368A由Cx43(NM_000165)的第368位的S(丝氨酸)突变为A(丙氨酸))所得。

1.9基因编辑系统、基因编辑方法及检验方法

一、基因编辑系统

本专利的基因编辑技术采用CRISPR-Cas9基因编辑系统。使用的Cas 9蛋白为Cas9(D10A),Cas 9(D10A)与sgRNA结合，sgRNA负责特异识别靶序列(基因组DNA)，然后Cas9(D10A)对该靶序列进行单链切割。基因组DNA发生双链断裂(DNA Double Strand Break,DSB)，必须有两组Cas 9(D10A)/sgRNA分别对基因组DNA的两条链进行切割，且切割的距离不能太远。Cas 9(D10A)/sgRNA方案与Cas 9/sgRNA方案相比，优点是特异性更高，脱靶的概率更低。本基因编辑系统使用的质粒或Donor片段分别为：Cas9(D10A)质粒、sgRNA clone质粒、Donor片段。

(1)Cas9(D10A)质粒：表达Cas 9(D10A)蛋白的质粒，在sgRNA的引导下特异性单链切割基因组DNA。

(2)sgRNA质粒：表达sgRNA的质粒，sgRNA(small guide RNA)是向导RNA(guideRNA，gRNA)，在基因编辑负责引导表达Cas 9(D10A)蛋白的靶向切割。

(3)Donor片段：两头含有重组臂，分别位于基因组DNA断裂位置的左右两边，中间含有需要插入的基因、片段或者表达元件。在Donor片段存在的情况下，细胞在基因组断裂的位置发生同源重组(Homologous recombination，HR)反应。如果不添加Donor片段，细胞的基因组断裂位置发生非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)反应。该片段由KI Vector质粒酶切后回收获取。

二、组成型质粒和诱导型质粒

组成型质粒：从组成型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能不可以进行调控。

诱导型质粒：从诱导型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能可以通过添加诱导物的方法来调控，相当于对表达功能添加了一个开启或者关闭的开关。

三、质粒构建方法

(1)Cas9(D10A)质粒。该质粒不再需要构建，直接从Addgene(Plasmid 41816,Addgene)订购。

(2)sgRNA质粒。原始的空白质粒从Addgene(Plasmid 41824,Addgene)订购，然后在网站(URL:https://cctop.cos.uni-heidelberg.de)输入DNA序列设计靶序列，最后把不同的靶序列分别放入空白的sgRNA质粒完成构建。

(3)KI Vector质粒。

a.Amp(R)-pUC origin片段的获取。设计PCR引物，以pUC19质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把该片段扩增出来并回收。

b.AAVS1或者eGSH重组臂的获取。提取人细胞的基因组DNA并设计对应的引物，然后以人的基因组DNA为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把这类片段扩增出来并回收。

c.各个质粒元件的获取。设计各元件的PCR扩增引物，然后以含该元件的质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，分别把各个质粒元件扩增出来并回收。

d.组装成完整质粒。使用多片段重组酶(南京诺唯赞生物,C113-02)把前面步骤获取的片段连接起来，形成一个完整的质粒。

四、基因编辑过程

1.AAVS1基因敲入的单细胞克隆操作步骤

(1)电转程序：

供体细胞准备：人多能干细胞

试剂盒：Human Stem Cell

Kit 1

仪器：电转仪

培养基：BioCISO

诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone AAVS1-1、sgRNA clone AAVS1-2、AAVS1 neoVectoⅠ、AAVS1 neo VectorⅡ

注：eGSH基因敲入使用的诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone eGSH-1、sgRNA cloneeGSH-2、eGSH-neo/eGSH-puro(donor)这里的donor质粒与AAVS1的比较，只有左右重组臂不一样，其它元件都一样。由于eGSH的基因编辑过程与AAVS1的相同，后面就不再重复列举。

(2)电转后的人多能干细胞进行含G418和puro的双抗生素培养基进行筛选

(3)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。

2.AAVS1基因敲入的单细胞克隆株培养试剂

(1)培养基：BioCISO+300μg/ml G418+0.5μg/ml puro

(应提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温。注意：不应将BioCISO置于37℃进行预热，避免生物分子活性降低。)

(2)基质胶：hESC级Matrigel

(传代或复苏细胞前，将Matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保Matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处Matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，Matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100X Matrigel不能低于0.5小时；1:200X Matrigel不能低于2小时。)

(3)消化液：使用DPBS溶解EDTA至终浓度为0.5mM，pH7.4

(注意：EDTA不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。)

(4)冻存液：60％BioCISO+30％ESCs级FBS+10％DMSO

(冻存液最好现配现用。)

3.常规维持传代培养过程

(1)传代的最佳时刻以及传代比例

a.传代最佳时刻：细胞整体汇合度达80％～90％。

b.传代最佳比例：1:4～1:7传代，次日最佳汇合度应维持在20％～30％。

(2)传代过程

a.事先将包被好的细胞培养瓶皿中的Matrigel吸走弃掉，加入适量培养基(BioCISO+300μg/ml G418+0.5μg/ml puro)，并放入37℃、5％CO2培养箱中孵育；

b.待细胞符合传代的要求，吸掉培养基上清，加入适量的0.5mM EDTA消化液到细胞瓶皿中；

c.将细胞放入37℃、5％CO2培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可，轻柔吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；

d.离心后，弃上清，用培养基重悬细胞，轻柔反复吹打细胞数次至混匀，然后将细胞转移至事先准备好包被Matrigel的瓶皿中；

e.细胞转移至细胞瓶皿后，前后左右水平摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养；

f.次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基每天正常按时换液。

4.细胞冻存

(1)按照常规传代的操作步骤，使用0.5mM EDTA消化细胞至大部分细胞收缩变圆但尚未漂浮，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5ml/支)；

(2)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降1℃)；

(3)次日立即将细胞转移入液氮。

5.细胞复苏

(1)提前准备好Matrigel包被的细胞瓶皿，复苏细胞前，吸掉Matrigel，向细胞瓶皿中加入适量的BioCISO，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育；

(2)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃，使细胞快速融解，仔细观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；

(3)提前加入10ml DMEM/F12(1:1)基础培养基至15ml离心管，并平衡至室温，使用巴氏吸管吸取1ml DMEM/F12(1:1)缓慢加入冻存管中，轻柔混匀，将细胞悬液转移到准备好的含有DMEM/F12(1:1)的15ml离心管中，200g离心5分钟；

(4)小心弃掉上清，加入适量BioCISO，轻轻混匀细胞，种到提前准备好的细胞瓶皿中，水平前后左右摇匀后，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO2培养箱中培养；

(5)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则BioCISO更换为BioCISO+300μg/ml G418+0.5μg/ml puro。

五、AAVS1基因敲入检测方法

1.单细胞克隆AAVS1基因敲入检测

(1)AAVS1基因敲入检测说明

a.试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子；

b.试验方法:首先在Donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组PPP1R12C(非重组臂部分)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现)；

c.试验方案引物序列及PCR方案如表5所示：

表5 试验方案引物序列及PCR方案

注：eGSH基因敲入的检测方法跟AAVS1基因敲入检测原理和方法一样，这里不再描述。

六、在基因组安全位点敲入基因方法的检验方法

(1)试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子。

(2)试验方法：首先在Donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组(非重组臂部分)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现。

1.10表达PD-1/PD-L1阻断物及外泌体的多能干细胞或其衍生物对PD-1/PD-L1的阻断效果检测

利用外泌体提取试剂盒(BestBio，lot#BB-3901)提取培养表达被外泌体包裹的PD-1/PD-L1阻断物的多能干细胞及其衍生物后的培养上清中的外泌体。培养上清4℃条件下3000g离心15min，收集上清后在4℃条件下10000g离心20min，收集上清，按4:1比例加入提取液A，上下颠倒1min，4℃过夜。4℃条件下10000g离心60min，收集外泌体沉淀即可。接着在培养外源表达PD-1的CHO细胞的培养基中添加含PD-1阻断物的外泌体进行培养48h，然后进行QPCR检测，检测PD-1的表达量。同理在培养表达PD-L1的CHO细胞的培养基中添加含PD-L1阻断物的外泌体进行培养48h，然后进行QPCR检测，检测PD-L1的表达量。

1.11 ⁵¹Cr释放法检测PD-/PD-L1阻断物对T细胞杀伤肿瘤的影响

1)效应细胞的准备：

T细胞分离：使用Ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradientcentrifugation)分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，再使用Dynabeads^TM CD3(Invitrogen^TM，货号：11151D)试剂盒分离出T细胞。将细胞重悬在含10％FBS的RPMI1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1×10⁷细胞/mL。

2)靶细胞的准备

肿瘤(NIC肺癌)细胞，将其消化重悬，通过台盼蓝染色计数细胞，配成1×10⁷细胞/mL的细胞悬液。

3)⁵¹Cr释放试验

肿瘤细胞先用表达PD-L1阻断物的多能干细胞的培养基上清培育48h，再与T细胞接触时，T就会攻击肿瘤细胞造成细胞裂解死亡。而未经表达PD-L1阻断物的多能干细胞的培养基上清培育的会发生肿瘤细胞不被T细胞所识别，会发生免疫逃逸。所以通过检测培养基中⁵¹Cr的量，即可反应出T细胞杀伤肿瘤的能力。⁵¹Cr的释放到培养液中的量越少，肿瘤细胞越容易发生免疫逃逸。同理，用PD-1阻断物孵育T细胞。

定量检测细胞介导的细胞毒作用，以放射性同位素⁵¹Cr标记靶细胞，与效应分子或细胞共孵育，根据靶细胞裂解所释放的⁵¹Cr放射脉冲数(cpm)而判断细胞毒活性。

a.将靶细胞用100μCi(Ci,放射性活度单位)的Na⁵¹CrO₄在37℃标记120min，每15分钟震摇一次，标记后再用清洗液离心清洗5次，最后重悬于培养液中，配成1×10⁶细胞/mL备用。

b.将靶细胞及T细胞加入96孔培养板中，每孔加100μl靶细胞(2.5×10³个)及100μl效应细胞(E/T＝1:2、1:5、1:10，E/T为靶细胞与效应细胞T的比)，同时设立自然释放对照孔(100μl靶细胞+100ul培养基)和最大释放孔(100μl靶细胞+100ul 2％SDS)。放置37℃，5％CO₂培养孵育4h。取出后用移液器吸出各孔上清液后，离心取上清液100μl，用γ计数仪测量cpm值。

注：一般要求⁵¹Cr自然释放率<10％

c.结果计算：根据公式计算⁵¹Cr自然释放率和T细胞的活性：

1.12小鼠肿瘤治疗方法

在人源化NSG小鼠(The Jackson Laboratory(JAX))中，对其右腋下皮下注射5×10⁶肿瘤(RCC肾癌，MC结肠癌，NIC肺癌)细胞，待肿瘤长到60mm³大小时，进行尾静脉注射200uL PBS(含人免疫细胞和10⁶的表达被外泌体包裹的PD-1/PD-L1阻断物的多能干细胞衍生物)进行肿瘤治疗，其中只注射含人免疫细胞的组作为对照组。20天后处死小鼠，然后比较各组之间肿瘤大小，并进行差异性统计分析。

2实验方案

将PD-1和/或PD-L1阻断物、外泌体加工合成基因、一个或多个免疫兼容分子、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子敲入到多能干细胞基因组安全位点的实验方案如表6-表8所示，其中，“+”号表示基因或核酸序列的敲入，“-”号表示基因敲除。

表6 组成型表达实验方案1

表7 组成型表达实验方案2

选取的质粒以及具体的敲入原则如下：

靶向PD-1/PD-L1的shRNA放入对应质粒的shRNA表达框架2(组成表达)，靶向PD-1/PD-L1的shRNA-miR放入对应质粒的shRNA-miR表达框架2(组成表达)，其他分子的shRNA放入对应质粒的shRNA表达框架1内，其他分子的shRNA-miR放入对应质粒的shRNA-miR表达框架1内，其它基因放入对应质粒的MCS的位置。

sgRNA clone B2M质粒包含sgRNA clone B2M-1和sgRNA clone B2M-2质粒。

sgRNA clone CIITA质粒包含sgRNA clone CIITA-1和sgRNA clone CIITA-2质粒。

(1)Aa1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的shRNA表达框架2放入PD-1/PD-L1的shRNA靶序列，shRNA表达框架1放入其他分子的shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)，MCS放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt(SEQ ID NO.199)连接起来，下同)。

(2)Aa2分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的shRNA表达框架2放入PD-1/PD-L1的shRNA靶序列，shRNA表达框架1放入其他分子的shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)，MCS放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的shRNA-miR表达框架1放入shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。

(4)Aa3分组：

sgRNA clone B2M质粒的靶序列放入B2M的sgRNA靶序列(SEQ ID NO.200和SEQ IDNO.201)；

sgRNA clone CIITA质粒的靶序列放入CIITA的sgRNA靶序列(SEQ ID NO.202和SEQ ID NO.1203)。

(4)Aa4分组：

(同Aa1分组的方法)

(5)Aa5分组：

(同Aa2分组的方法)

(6)Ab1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入PD-1/PD-L1的shRNA-miR的靶序列，shRNA-miR表达框架1放入其他分子的shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)，MCS放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的shRNA表达框架1放入shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。

(7)Ab2分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入PD-1/PD-L1的shRNA-miR靶序列，shRNA-miR表达框架1放入其他分子的shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)，MCS放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

(8)Ab3分组：

sgRNA clone B2M质粒的靶序列放入B2M的sgRNA靶序列，

sgRNA clone CIITA质粒的靶序列放入CIITA的sgRNA靶序列。

(9)Ab4分组：(同Ab1分组的方法)

(10)Ab5分组：(同Ab2分组的方法)

(11)Ac1分组：(同Aa1分组的方法)

(12)Ac2分组：(同Aa2分组的方法)

(13)Ac3分组：(同Aa3分组的方法)

(14)Ac4分组：(同Aa1分组的方法)

(15)Ac5分组：(同Aa2分组的方法)

(16)Ad1分组：(同Ab1分组的方法)

(17)Ad2分组：(同Ab2分组的方法)

(18)Ad3分组：(同Ab3分组的方法)

(19)Ad4分组：(同Ab1分组的方法)

(20)Ad5分组：(同Ab2分组的方法)

(21)Ae1分组：AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的shRNA表达框架2放入PD-1/PD-L1的shRNA靶序列，MCS放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的shRNA-miR表达框架1放入其他分子的shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。

(22)Ae2分组：(同Ab2分组的方法)

(23)Ae3分组：(同Ae1分组的方法)

(24)Ae4分组：(同Ab2分组的方法)

表8 诱导型表达(免疫兼容可逆)实验方案

(1)Ba1分组：(靶向shRNA、shRNA、shRNA-miR、基因)

AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒的shRNA表达框架2放入PD-1/PD-L1的shRNA靶序列，shRNA表达框架1放入其他分子的shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)，MCS放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒的shRNA-miR表达框架1放入其他分子的shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。

(2)Ba2分组：(同Ba1分组的方法)

(3)Bb1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入PD-1/PD-L1的shRNA-miR靶序列，shRNA-miR表达框架1放入其他分子的shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)，MCS放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。

AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒的shRNA表达框架1放入其他分子的shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。

(4)Bb2分组：(同Bb1分组的方法)

(5)Bc1分组：(同Ba1分组的方法)

(6)Bc2分组：(同Ba1分组的方法)

(7)Bd1分组：(同Bb1分组的方法)

(8)Bd2分组：(同Bb1分组的方法)

3实验结果

实施例1多能干细胞或其衍生物表达的装载PD-1/PD-L1阻断物的外泌体对PD-1/PD-L1的阻断效果检测

将表6-表8各实验组方案敲入iPSCs、MSCs、NSCs、EBs细胞的基因组安全位点，37℃，0.5％CO₂培养箱培养，收集培养基上清，利用外泌体提取试剂盒(BestBio，lot#BB-3901)提取培养上清中的外泌体。培养上清4℃条件下3000g离心15min，收集上清后在4℃条件下10000g离心20min，收集上清，按4:1比例加入提取液A，上下颠倒1min，4℃过夜。4℃条件下10000g离心60min，收集外泌体沉淀即可。接着在培养外源表达PD-1的CHO细胞的培养基中添加含PD-1阻断物的外泌体进行培养72h，然后进行QPCR检测，检测PD-1的表达量。

N(对照)组是指没有添加含PD-1阻断物的外泌体进行培养的表达PD-1的CHO细胞。

表9 QPCR检测CHO/hPD-1细胞的PD-1表达结果

从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的PD-1阻断物能有效抑制靶细胞的PD-1蛋白的表达，从而达到阻断PD-1/PD-L1效果。

表10 QPCR检测CHO/hPD-L1细胞的PD-L1表达结果

从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的PD-L1阻断物能有效抑制靶细胞的PD-L1蛋白的表达，从而达到阻断PD-1/PD-L1效果。

实施例2表达PD-1和/或PD-L1阻断物的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果

将表6-表8各实验组方案敲入iPSCs、MSCs、NSCs、EBs细胞的基因组安全位点，得到表达PD-1/PD-L1阻断物细胞，使用⁵¹Cr释放试验检验其抗肿瘤效果。

表11 各实验组表达的PD-1阻断物对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响

注：N(对照)组是指未用表达PD-1阻断物的多能干细胞的培养基上清处理T细胞。独立样本T检验(*p<0.01)。

表12 各实验组表达的PD-L1阻断物对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响

注：N(对照)组是指未用表达PD-L1阻断物的多能干细胞的培养基上清处理的肿瘤细胞。独立样本T检验(*p<0.01)。

通过以上实验，可以证明本发明制备的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的PD-1和/或PD-L1能够有效阻断PD-1与其配体PD-L1的结合起到抗肿瘤作用。

实施例3 PD-1/PD-L1阻断物在多种肿瘤治疗中进行应用

我们选择B2M和CIITA基因敲除方案组(Aa3、Ab3、Ac3、Ad3)的免疫兼容细胞(hPSCs、MSCs、NSCs、EBs)中进行测试。

在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，我们对其进行注射各组实验细胞，观察其对RCC肾癌，MC结肠癌，NIC肺癌的治疗的效果。为避免免疫兼容问题，我们所使用的免疫细胞与hPSCs及hPSCs源衍生物均来源于同一人的。

实施例4免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试

通过上述实施例，表达PD-1/PD-L1阻断物的hPSCs及hPSCs源衍生物能有效阻断PD-1与其配体PD-L1的结合起到抗肿瘤作用。我们还必须考虑hPSCs及hPSCs源衍生物的免疫兼容问题。因此我们选取一个合适的组合对免疫兼容进行测试。

我们利用MSCs的低免疫源性的特点，在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，对其进行注射能够表达PD-1/PD-L1阻断物(靶向PD-1的shRNA)的hPSCs源免疫兼容MSCs，观察其肿瘤(NIC肺癌)治疗的效果。注:所使用的免疫细胞与hPSCs源MSCs来源于为非同一人。

对照组是指未注射表达阻断物的组成型免疫兼容MSCs的NSG小鼠肿瘤模型。

加Dox组别的处理是：在小鼠饮食中添加0.5mg/mL的Dox，进行饲养小鼠，从注射表达阻断物细胞开始，一直使用，直到试验结束。

表14 免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果

以上实验表明：仅表达阻断物的MSCs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在一定时间，所以其能够发挥一定的肿瘤治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-9，包括组成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的MSCs在体内存在时间更长，其发挥肿瘤治疗效果更佳，而组5为B2M和CIITA基因敲除组，其完全消除HLA-I和HLA-II类分子产生的影响，因此其肿瘤治疗效果最佳。但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清除，从而有组8-11方案设定。组10-11中在进行注射表达阻断物细胞进入小鼠的同时，对小鼠使用Dox诱导剂(一直使用)，注射表达阻断物细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其在体内存在时间与未经免疫兼容改造的MSCs相当，其肿瘤治疗效果也与未经免疫兼容改造的MSCs相当。

以上实施例仅为本发明的优选案例，本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，对这些实施例所进行的同等效果的修改和替换，均落入本发明权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 未来智人再生医学研究院（广州）有限公司；王淋立

<120> 表达靶向PD-1/PD-L1 的效应RNA分子的多能干细胞及其衍生物

<130>

<160> 203

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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ggctgcaact aacttcaaat a 21

<210> 122

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 122

ggatggattt gattatgatc c 21

<210> 123

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 123

ggaccttgga acaatggatt g 21

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 124

gctaattctt gctgaacttc t 21

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 125

gctgaacttc ttcatgtatg t 21

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 126

gcctcatctc tttgttctaa a 21

<210> 127

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 127

gctctggaga agatatattt g 21

<210> 128

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 128

gctcttgagg gaactaatag a 21

<210> 129

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 129

gggacggcat taatgtattc a 21

<210> 130

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 130

ggacaaacat gcaaactata g 21

<210> 131

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 131

gcagcaacca gctaccattc t 21

<210> 132

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 132

gcagttctgt tgccactctc t 21

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 133

gggagagttc atccaggaaa t 21

<210> 134

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 134

ggagagttca tccaggaaat t 21

<210> 135

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 135

gagagttcat ccaggaaatt a 21

<210> 136

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 136

gcctgtcaaa gagagagagc a 21

<210> 137

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 137

gctcagcttc gtactgagtt c 21

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 138

gcttcacaga actacagaga g 21

<210> 139

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 139

gcatctactg gacaaagtat t 21

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 140

ggctgaatta cccatgcttt a 21

<210> 141

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 141

gctgaattac ccatgcttta a 21

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 142

gggttggttt atccaggaat a 21

<210> 143

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 143

ggatcagaag agaagccaac g 21

<210> 144

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 144

ggttcaccat ccaggtgttc a 21

<210> 145

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 145

gctctcttct ctggaactaa c 21

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 146

gctagagtga ctccatctta a 21

<210> 147

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 147

gctgaccacc aattataatt g 21

<210> 148

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 148

gcagaatatt taaggccata c 21

<210> 149

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 149

gcccacttaa aggcagcatt a 21

<210> 150

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 150

ggtcatcaat accactgtta a 21

<210> 151

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 151

gcattcctcc ttctcctttc t 21

<210> 152

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 152

ggaggaactt tgtgaacatt c 21

<210> 153

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 153

gctgtaagaa ggatgctttc a 21

<210> 154

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 154

gctgcaggca ggattgtttc a 21

<210> 155

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 155

gcagttcgag gtcaagtttg a 21

<210> 156

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 156

gccaattagc tgagaagaat t 21

<210> 157

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 157

gcaggtttac agtgtatatg t 21

<210> 158

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 158

gcctacagag actagagtag g 21

<210> 159

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 159

gcagttgggt accttccatt c 21

<210> 160

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 160

gcaactcagg tgcatgatac a 21

<210> 161

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 161

gcatggcgct ggtacgtaaa t 21

<210> 162

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 162

gcctcgagtt tgagagcta 19

<210> 163

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 163

agacattctg gatgagtta 19

<210> 164

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 164

gggtctgtta cccaaagaa 19

<210> 165

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 165

ggtctgttac ccaaagaat 19

<210> 166

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 166

ggaaggaagc ggacgctca 19

<210> 167

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 167

ggaggcagta cttctgata 19

<210> 168

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 168

cgctctagag ctcagctga 19

<210> 169

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 169

ccaccacctc aaccaataa 19

<210> 170

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 170

atttcaagaa gtcgatcaa 19

<210> 171

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 171

gaagatctga ttaccttca 19

<210> 172

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 172

ggacactggt tcaacacctg t 21

<210> 173

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 173

ggttcaacac ctgtgacttc a 21

<210> 174

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 174

acctgtgact tcatgtgtgc g 21

<210> 175

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 175

gctggacgtg accatcatgt a 21

<210> 176

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 176

ggacgtgacc atcatgtaca a 21

<210> 177

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 177

gacgtgacca tcatgtacaa g 21

<210> 178

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 178

acgtgaccat catgtacaag g 21

<210> 179

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 179

acgctatacc atctacctgg g 21

<210> 180

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 180

gcctctatga cgacatcgag t 21

<210> 181

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 181

gacatcgagt gcttccttat g 21

<210> 182

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 182

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgctagcgcc acc 253

<210> 183

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 183

ttcaagaga 9

<210> 184

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 184

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 300

gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 360

agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 420

ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 480

agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 540

tacccgggtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctgctagc gccacc 686

<210> 185

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 185

ttcaagaga 9

<210> 186

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 186

gcatacacaa acatttcttt ctctcttgca ggtggcacaa accaggaagg ggaaatctgt 60

ggtttaaatt ctttatgcct catcctctga gtgctgaagg cttgctgtag gctgtatgc 119

<210> 187

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 187

tagtgaagcc acagatgta 19

<210> 188

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 188

gtgtatgatg cctgttacta gcattcacat ggaacaaatt gctgccgtgg gaggatgaca 60

aagaagcatg agtcaccctg ctggataaac ttagacttca ggctttatca tttttcaat 119

<210> 189

<211> 1607

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 189

atgaatactc tccctgaaca ttcatgtgac gtgttgatta tcggtagcgg cgcagccgga 60

ctttcactgg cgctacgcct ggctgaccag catcaggtca tcgttctaag taaggccggt 120

aacgaggttc aacattttat gcccagggcg gtattgccgc cgtgtttgat aaactgacag 180

cattgactcg catgtggaag acacattgat tgccggggct ggtatttgcg atcgccatgc 240

agttgaattt gtcgccagca atgcacgatc ctgtgtgcaa tggctaatcg accagggggt 300

gttgtttgat acccacattc aaccgaatgg cgaagaaagt taccatctga cccgtgaagg 360

tggacatagt caccgtcgta ttcttcatgc cgccgacgcc accggtagag aagtagaaac 420

cacgctggtg agcaaggcgc tgaaccatcc gaatattcgc gtgctggagc gcagcaacgc 480

ggttgatctg attgtttctg acaaaattgg cctgccgggc acgcgacggg ttgttggcgc 540

gtgggtatgg aaccgtaata aagaaacggt ggaaacctgc cacgcaaaag cggtggtgct 600

ggcaaccggc ggtgcgtcga aggtttatca gtacaccacc aatccggata tttcttctgg 660

cgatggcatt gctatggcgt ggcgcgcagg ctgccggttg ccaatctcga tttaatcagt 720

tccaccctac cgcgctatat cacccacagg cacgcaattt cctgttaaca gaagcactgc 780

gcggcgaggc gcttatctca agcgcccgga tggtacgcgt ttatccgatt ttgatgagcg 840

cggcgaactg ccccgcgcga tattgtcgcc cgcgccattg accatgaaat gaaacgcctc 900

ggcgcagatt gtatgttcct tgatatcagc cataagcccg ccgattttat tcgccagcat 960

ttcccgatga tttatgaaaa gctgctcggg ctgggattga tctcacacaa gaaccggtac 1020

cgattgtgcc tgctgcacat tatacctgcg gtggtgtaat ggttgatgat catgggcgta 1080

cggacgtcga gggcttgtat gccattggcg aggtgagtta taccggctta cacggcgcta 1140

accgcatggc ctcgaattca ttgctggagt gtctggtcta tggctggtcg gcggcggaag 1200

atatcaccag acgtatgcct tatgcccacg acatcagtac gttaccgccg tgggatgaaa 1260

gccgcgttga gaaccctgac gaacggtagt aattcagcat aactggcacg agctacgtct 1320

gtttatgtgg gattacgttg gcattgtgcg cacaacgaag cgcctggaac gcgccctgcg 1380

gcggataacc atgctccaac aagaaataga cgaatattac gcccatttcc gcgtctcaaa 1440

taatttgctg gagctgcgta atctggtaca ggttgccgag ttgattgttc gctgtgcaat 1500

gatgcgtaaa gagagtcggg gttgcatttc acgctggatt atccggaact gctcacccat 1560

tccggtccgt cgatccttcc cccggcaatc attacataaa cagataa 1607

<210> 190

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 190

ggaagtggtg ccggcaccgg cggcatgtac gtgcgcttcg aggtgcccga ggacatgcag 60

aacgaggccc tgagcctgct ggaaaaagtg cgcgagagcg gcaaagtgaa gaagggcacc 120

aacgaaacca ccaaggccgt ggaacggggc ctggccaagc tggtgtatat cgccgaggac 180

gtggaccccc ccgagattgt ggcccatctg cccctgctgt gcgaagagaa gaacgtgccc 240

tacatctacg tgaagtccaa gaacgacctg ggcagagccg tgggcatcga ggtgccatgt 300

gcctctgccg ccatcatcaa cgagggcgag ctgcggaaag aactgggcag cctggtggaa 360

aagatcaagg gcctgcagaa gggttccggt ggatccggtt ccggacgggc t 411

<210> 191

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 191

ccatagctca gtctggtcta tc 22

<210> 192

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 192

tcaggatgat ctggacgaag ag 22

<210> 193

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 193

ccggtcctgg actttgtctc 20

<210> 194

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 194

ctcgacatcg gcaaggtgtg 20

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 195

cgcattggag tcgctttaac 20

<210> 196

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 196

cgagctgcaa gaactcttcc tcac 24

<210> 197

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 197

cacggcactt acctgtgttc tgg 23

<210> 198

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 198

cagtacaggc atccctgtga aag 23

<210> 199

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 199

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg 590

<210> 200

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 200

ccgtggcctt agctgtgctc gcg 23

<210> 201

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 201

actctctctt tctggcctgg agg 23

<210> 202

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 202

cctggctcca cgccctgctg ggt 23

<210> 203

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 203

gtcagagccc caaggtaaaa agg 23

Claims

1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列；所述PD-1阻断物为靶向PD-1的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种；所述PD-L1阻断物为靶向PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

(1)靶向PD-1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示；

(2)靶向PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20所示。

3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。

4.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。

5.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：

(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；

7.根据权利要求6所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所述靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ IDNO.21～SEQ ID NO.33中的至少一种。

8.根据权利要求1-7任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Dhrosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为靶向PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。

9.根据权利要求8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.122～SEQ ID NO.181中的至少一种。

10.根据权利要求2、7或9所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向PD-1、PD-L1、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA或shRNA-miR的表达框架如下：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T，所述shRNA靶序列如权利要求2、7或9所述；

(2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求2、7或9所述的shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。

11.根据权利要求10所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述茎环序列长度为3～9个碱基；所述poly T长度为5～6个碱基。

12.根据权利要求4或8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子和/或shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达。

13.根据权利要求12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述诱导型基因表达系统包括Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

14.根据权利要求1-13任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因，所述外泌体加工合成基因包括STEAP3、Syndevan-4、L-天冬氨酸氧化酶片段、CD63-L7Ae和Cx43S368A中的至少一种。

15.根据权利要求1-14任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述

PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/

或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法，所述基因编辑的方法包括基因敲入。

16.根据权利要求1-15任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述

PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列、外泌体加工合成基因、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入位点为基因组安全位点。

17.根据权利要求16所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

18.根据权利要求1-17任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；

所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

19.权利要求1-18任一项所述的多能干细胞或其衍生物在制备PD-1或PD-L1高表达肿瘤治疗药物中的应用。

20.一种制剂，其含有权利要求1-18任一项所述的多能干细胞或其衍生物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

21.由权利要求1-18任一项所述的多能干细胞或其衍生物分泌得到的包含PD-1和/或PD-L1阻断物的外泌体。