JP2022526094A - 操作された単純ヘルペスウイルス－１（ｈｓｖ－１）ベクターおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本明細書において提供されるのは、改変されたＨＳＶ－１ゲノムを含む、操作されたＨＳＶ－１ベクターである。操作されたＨＳＶ－１ベクターは、in vitroまたはin vivoで、遺伝子回路（例えば１００ｋｂまで）を細胞に送達するために用いることができる。本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターを用いて疾患（例えばがん）を処置または診断する方法もまた、提供される。

Description

関連出願
本願は、２０１９年３月１４日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／８１８，４６４に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）における優先権を主張し、該仮出願の全内容は、本明細書において参考として援用される。

背景
ウイルスベクターは、in vitroおよび／またはin vivoで導入遺伝子を送達するために用いられてきた。しかし、ウイルスベクターは、毒性を誘導し、導入遺伝子の発現に干渉する場合があり、および／または送達することができる導入遺伝子のサイズが限定される。

要約
本明細書において提供されるのは、いくつかの側面において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムを含む、操作された単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）ベクターである。ＨＳＶ－１ゲノムは、ウイルスを、それらが形質導入された細胞にとって毒性でないように弱毒化し、しかし、適切なパッケージング細胞株において高力価のウイルス粒子が得られ、強力な導入遺伝子の発現が達成されるように、あまりに著しくは弱毒化されないように、改変される。本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターは、複雑な遺伝子回路（例えば、１００ｋｂまでの長さの遺伝子回路）を送達するために用いることができる。本明細書においてまた提供されるのは、操作されたＨＳＶ－１ベクターを含むＨＳＶ－１ウイルス粒子を産生させるための、パッケージング細胞である。ＨＳＶ－１ウイルス粒子は、多様な適用（例えば、治療または診断的適用）のために用いてもよい。

したがって、本開示のいくつかの側面は、感染細胞タンパク質４（ＩＣＰ４）、感染細胞タンパク質０（ＩＣＰ０）およびビリオンタンパク質１６（ＶＰ１６）をコードする遺伝子における欠失を含む、改変されたＨＳＶ－１ゲノムを含む、操作された単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）ベクターを提供する。

いくつかの態様において、ＩＣＰ４の両方のコピーが、改変されたＨＳＶ－１ゲノムから欠失している。いくつかの態様において、ＶＰ１６をコードする遺伝子における欠失は、アミノ酸４２２におけるＶＰ１６タンパク質のトランケーションをもたらす。いくつかの態様において、ＩＣＰ０の両方のコピーが、改変されたＨＳＶ－１ゲノムから欠失している。

いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、γ３４．５、潜伏関連転写物（ＬＡＴ）、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ４７をコードする１つ以上の遺伝子における欠失をさらに含む。
いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＬＡＴおよびγ３４．５における欠失をさらに含む。
いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４の両方のコピーにおける欠失、ＩＣＰ０の両方のコピーにおける欠失、アミノ酸４２２におけるＶＰ１６タンパク質のトランケーションをもたらすＶＰ１６をコードする遺伝子における欠失、ならびにＬＡＴおよびγ３４．５の一方のコピーにおける欠失を含む。
いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様において、欠失は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ０、ＶＰ１６、γ３４．５、ＬＡＴ、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ４７のうちの１つ以上を非機能的にする。
いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＨＳＶ－１株Ｆ、１７またはＫＯＳからのものである。
いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、１つ以上の遺伝子回路をさらに含む。いくつかの態様において、遺伝子回路は、１５０ｋｂまでの長さである。いくつかの態様において、遺伝子回路は、アウトプット分子をコードする。

いくつかの態様において、アウトプット分子は、ＨＳＶ－１タンパク質である。いくつかの態様において、ＨＳＶ－１タンパク質は、ＶＰ１６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、γ３４．５からなる群より選択される。
いくつかの態様において、アウトプット分子は、治療用分子である。いくつかの態様において、治療用分子は、抗がん剤である。
いくつかの態様において、アウトプット分子は、診断用分子である。
いくつかの態様において、アウトプット分子は、機能的分子である。

いくつかの態様において、アウトプット分子は、自然免疫応答の阻害剤である。いくつかの態様において、自然免疫応答の阻害剤は、自然免疫応答の構成成分を標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である。
いくつかの態様において、自然免疫応答の阻害剤は、ワクシニアＢ１８Ｒタンパク質である。
いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、プラスミドである。

本開示の他の側面は、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターを含む、パッケージング細胞を提供する。
いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、パッケージング細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、１つ以上のＨＳＶ－１ウイルス遺伝子をコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様において、１つ以上のＨＳＶ－１ウイルス遺伝子は、ＶＰ１６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、γ３４．５をコードする。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、自然免疫応答の阻害剤をコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様において、自然免疫応答の阻害剤は、自然免疫応答の構成成分を標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である。いくつかの態様において、自然免疫応答の阻害剤は、ワクシニアＢ１８Ｒタンパク質である。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、ＨＳＶ－１ウイルス粒子の少なくとも１つのプラーク形成単位を産生する。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞である。

本開示の他の側面は、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターを含むか、パッケージング細胞株により産生される、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子を提供する。

本明細書においてさらに提供されるのは、疾患を処置する方法であって、該方法は、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、治療用分子をコードする遺伝子回路を含む。

本明細書においてさらに提供されるのは、疾患を診断する方法であって、該方法は、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、診断用分子をコードする遺伝子回路を含む。

いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子は、対象において免疫応答を誘導しないか、または、対象において、天然のＨＳＶ－１粒子と比較して、より低い免疫応答を誘導する。いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、対象において細胞に感染し、対象において細胞中に遺伝子回路を送達する。いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子は、全身で、または局所的に送達される。いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子は、注射を介して投与される。いくつかの態様において、疾患は、がんである。いくつかの態様において、がんは、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、前立腺癌または肺癌である。いくつかの態様において、疾患は、悪液質である。

いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類である。

本開示の他の側面は、遺伝子回路を細胞中に送達する方法を提供し、該方法は、細胞を、本明細書において記載されるＨＳＶ－１ベクターまたは操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子と接触させることを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、遺伝子回路を含む。いくつかの態様において、接触させることは、in vitroでのものである。いくつかの態様において、接触させることは、in vivoでのものである。いくつかの態様において、接触させることは、ex vivoでのものである。

上の要約は、本明細書において開示される技術のいくつかの態様、利点、特徴および用途を、非限定的な様式において説明することを意図される。本明細書において開示される技術の他の側面、利点、特徴および用途は、詳細な説明、図面、例および請求の範囲から明らかであろう。

添付の図面は、原寸で描かれることを意図されない。明確性を目的として、全ての図面において全ての構成成分がラベルされていなくともよい。

操作されたＨＳＶ－１ベクター、および遺伝子回路を送達することにおける活性。（図１Ａ）多様なＨＳＶ－１遺伝子における欠失を有する例示的な操作されたＨＳＶ－１ベクターの模式図。 操作されたＨＳＶ－１ベクター、および遺伝子回路を送達することにおける活性。（図１Ｂ）操作されたＨＳＶ－１ベクターにより分類された細胞の状態のin vitroでの送達を示すグラフ。

パッケージング細胞株。（図２Ａ）パッケージング細胞株は、ＨＳＶ－１ゲノムにおける欠失を補完するためにＨＳＶ－１ウイルス遺伝子を発現する。Ｕ２ＯＳ細胞株を用いて、いくつかの異なるパッケージング細胞株を構築した。 パッケージング細胞株。（図２Ｂ）操作されたＨＳＶ－１ベクター中にｍｉｃｒｏＲＮＡセンサーを組み込む。（図２Ｃ）パッケージング細胞株におけるウイルス産生。

迅速な、標準化された遺伝子回路のアセンブリーおよびＨＳＶ－１骨格中への組み込み、遺伝子回路を含むＨＳＶ－１ベクターからのウイルス産生、ならびにマウスモデルにおいて転移性乳癌を処置するためのＨＳＶ－１ウイルスの使用。 迅速な、標準化された遺伝子回路のアセンブリーおよびＨＳＶ－１骨格中への組み込み、遺伝子回路を含むＨＳＶ－１ベクターからのウイルス産生、ならびにマウスモデルにおいて転移性乳癌を処置するためのＨＳＶ－１ウイルスの使用。

がん治療における使用のための、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターの使用。

マウスがんモデルにおける本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターにより送達された治療剤の抗がん活性。操作されたＨＳＶ－１ベクターにより送達された遺伝子回路の論理機能は、高ｍｉｒ－２１、低ｍｉｒ－１１２ａ、低ｍｉｒ－１３８、および低ｍｉｒ－１９９ａに基づいて癌細胞を分類する。（図５Ａ）腫瘍サイズを、注射後１５日間にわたり、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をイメージングすることによりモニタリングした。（図５Ｂ）遺伝子回路を送達する操作されたＨＳＶ－１ベクターを条件的に複製することは、生存率を２倍より高く改善する。 マウスがんモデルにおける本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターにより送達された治療剤の抗がん活性。操作されたＨＳＶ－１ベクターにより送達された遺伝子回路の論理機能は、高ｍｉｒ－２１、低ｍｉｒ－１１２ａ、低ｍｉｒ－１３８、および低ｍｉｒ－１９９ａに基づいて癌細胞を分類する。（図５Ｃ）様々な時点において転移を測定した。血液転移は、マウスの早期死亡と相関した。

ある態様の詳細な説明
ウイルスベクターは、導入遺伝子送達において広く用いられてきた。ウイルスベクターに関連する問題として、ウイルスにより誘導される毒性、ウイルスベクターによる導入遺伝子の発現への干渉、および／または、高力価ウイルス粒子の産生の困難性が挙げられる。ウイルスにより誘導される毒性またはウイルスによる導入遺伝子の発現への干渉を減少させるために、ウイルスを操作して、弱毒化されたバリアントを得ることができる。しかし、弱毒化はまた、導入遺伝子の発現およびウイルス粒子のパッケージングに影響を及ぼし得る。ウイルス株の差異もまた、ウイルスベクターの性能の差異をもたらし得る。

本開示は、いくつかの側面において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムを含む、操作された単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）ベクターに関する。操作されたＨＳＶ－１ベクターは、いくつかの態様においては導入遺伝子をコードする、複雑な遺伝子回路を送達するために用いることができる。改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ウイルス産生および導入遺伝子産生を増強するために全ての必要なウイルス構成成分を含むが、回路の性能に対しては低いレベルの干渉を有する。高力価ウイルス粒子が産生されることを可能にするパッケージング細胞株もまた提供される。いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ベクターまたはパッケージング細胞株はまた、宿主細胞による自然免疫応答を低下させる特徴を有する。そのゲノムに対する異なる改変を有する多数のＨＳＶ－１バリアントを、所望される基準を満たすバリアントの同定のためにスクリーニングした。これらのバリアントは、多数のin vitroおよびin vivoでの適用のために用いることができる。

単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヘルペスウイルス科における二本鎖の直鎖状ＤＮＡウイルスである。単純ヘルペスウイルスのファミリーのうちの２つのメンバーがヒトに感染し、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２として知られる。本開示に従う使用のために好適なＨＳＶ－１株として、限定することなく、Ｆ、１７およびＫＯＳが挙げられる。

ＨＳＶの構造は、エンベロープと称される脂質二重層中に包まれた、キャプシドと称される正二十面体タンパク質ケージ中に包まれた、比較的大きな二本鎖の直鎖状ＤＮＡゲノムからなる。エンベロープは、テグメントによりキャプシドと連結している。完全なウイルス粒子は、ビリオンとして知られる（用語「ウイルス粒子」および「ビリオン」は、本明細書において交換可能に用いられる）。

ＨＳＶ（例えばＨＳＶ－１）のゲノムは、複雑であり、長ユニーク領域（long unique region：ＵＬ）および短ユニーク領域（short unique region：ＵＳ）と称される２つのユニークな領域を含み、ウイルスのキャプシド、テグメントおよびエンベロープの形成、ならびにウイルスの複製および感染性を制御することに関与する多様なタンパク質をコードする遺伝子を含む。ＨＳＶ－１ゲノムは、約８５個のオープンリーディングフレームを含み、これは、４つの主要なクラスのタンパク質をコードする：（１）ＨＳＶの最も外側の脂質二重層（エンベロープ）に関連するもの、（２）内部タンパク質コーティング（キャプシド）、（３）エンベロープとキャプシドコーティングとを連結する中間の複合体（テグメント）、および（４）複製および感染の原因となるタンパク質。

ＨＳＶ遺伝子の転写は、感染した宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩにより触媒される。ウイルスの初期および後期遺伝子の発現を調節するタンパク質をコードする最初期遺伝子は、感染の後初めに発現される。ＤＮＡの複製および特定のエンベロープ糖タンパク質の産生に関与する酵素の合成を可能にするために、初期遺伝子の発現が続く。後期遺伝子の発現が最後に起こる；この遺伝子の群は、ビリオンを形成するタンパク質を主にコードする。

ＨＳＶ（例えばＨＳＶ－１）は、分子量が１５～２８０ｋＤａの範囲の少なくとも４９個の感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）を産生する（例えば、本明細書において参考として援用されるHoness et al., Journal of Virology, Vol. 12, No. 6, 1347-1365, 1973において記載されるとおりである）。ＩＣＰは、構造タンパク質であっても、非構造タンパク質であってもよい。本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムから欠失していてもよい非限定的な例示的なＩＣＰとして、以下が挙げられる：ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、γ３４．５（本明細書においてまたＩＣＰ３４．５とも称される）、およびＩＣＰ４７。

「感染細胞タンパク質０（ＩＣＰ０）」は、ウイルスが最近宿主細胞に侵入した、感染の最も早いステージの間に産生され、これは、ウイルス遺伝子発現の最初期またはα期として知られるステージである。感染のこれらの初期の間に、ＩＣＰ０タンパク質が合成され、感染した宿主細胞の核に輸送される。ＩＣＰ０は、ウイルス遺伝子からの転写を促進し、ニューロン特異的タンパク質との組み合わせにおける宿主およびウイルスの遺伝子の発現を変更する（例えば、本明細書において参考として援用されるGu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21): 7571-6, 2005；およびPinnoji et al., Virol. J. 4: 56. doi:10.1186/1743-422X-4-56, 2007において記載されるとおりである）。細胞感染のより後期のステージにおいて、ＩＣＰ０は、新しいビリオン中に組み込まれるために、細胞の細胞質に再配置される（例えば、本明細書において参考として援用されるSedlackova et al., Journal of Virology. 82 (1): 268-77, 2008において記載されるとおりである）。ＩＣＰ０は、ＨＳＶ－１の最初期（ＩＥ）タンパク質であるＩＣＰ４と相乗的に作用し、潜伏期ヘルペスウイルスの再活性化およびウイルス複製のために必須である。潜伏感染の間に、ウイルスＲＮＡ転写物は、アンチセンスＲＮＡ機構を介してヘルペスウイルスＩＣＰ０遺伝子の発現を阻害する。ＲＮＡ転写物は、ウイルスにより産生され、潜伏感染の間に宿主細胞において蓄積する；それは、潜伏関連転写物（ＬＡＴ）として知られる。ＨＳＶ－１ゲノムにおけるＩＣＰ０の２つのコピーが存在する。

「感染細胞タンパク質４（ＩＣＰ４）」とは、ＨＳＶ－１における溶菌性の感染に関連する遺伝子の重要なトランス活性化因子である（例えば、本明細書において参考として援用されるPinnoji et al., Virol. J. 4: 56. doi:10.1186/1743-422X-4-56, 2007において記載されるとおりである）。ＩＣＰ４についての遺伝子を囲むエレメントは、ヒト神経タンパク質神経特異的サイレンシング制御因子（ＮＲＳＦ）またはヒトリプレッサーエレメントサイレンシング転写制御因子（ＲＥＳＴ）として知られるタンパク質に結合する。ウイルスＤＮＡエレメントに結合した場合、ＩＣＰ４遺伝子配列においてヒストンの脱アセチル化が起こり、この遺伝子からの転写の開始を妨げ、それにより、溶菌周期に関与する他のウイルス遺伝子の転写を妨げる。ＩＣＰ０は、ＩＣＰ４遺伝子からＮＲＳＦを解離させ、それによりウイルスＤＮＡのサイレンシングを妨げる（例えば、本明細書において参考として援用されるRoizman et al., Cell Cycle. 4 (8): 1019-21, 2005中）。ＨＳＶ－１ゲノムにおいて、２コピーのＩＣＰ４が存在する。

「感染細胞タンパク質６（ＩＣＰ６）」は、野生型ＨＳＶ－１により引き起こされる脳炎の間に感染したニューロンなどの静止状態の細胞においてすら、野生型ＨＳＶの複製が起こることを可能にするように機能する、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼ（ｖＲＲ）である。この機能なしでは、ＨＳＶの複製は、静止状態の細胞においては著しく削減される（例えば、本明細書において参考として援用されるGoldstein et al., Virology 166: 41-51, 1988において記載されるとおりである）。

「感染細胞タンパク質８（ＩＣＰ８）」は、ＨＳＶ－１のＤＮＡ複製のために必要とされる。それは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にアニーリングすることができるだけでなく、ｄｓＤＮＡの小さなフラグメントを融解させることができる。その役割は、複製の開始の間に、二重鎖ＤＮＡを不安定化させることである。それは、ＡＴＰ^－およびＭｇ^２＋に依存しないので、ヘリカーゼとは異なる。ＨＳＶ－１に感染した細胞において、これらの細胞におけるＤＮＡは、ＩＣＰ８と共局在するようになる。ＩＣＰ８は、後期遺伝子転写において必要とされ、細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩのホロ酵素と関連することが見出されている。

「感染細胞タンパク質２２（ＩＣＰ２２）」は、主に宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する変化を媒介することにより、細胞およびウイルスのｍＲＮＡの一般的な転写調節因子として機能する。ＵＬ１３非依存的である１つの変化は、Ｐｏｌ ＩＩのＳｅｒ－２のリン酸化を有する形態の迅速な喪失である。ＵＬ１３依存的である第２の変化は、通常の低リン酸化形態および高リン酸化形態とは異なる、Ｐｏｌ ＩＩの中間形態の出現である。これらのＰｏｌ ＩＩの修飾は、即座に宿主のゲノム転写を阻害し、細胞周期の調節不全および効率的な抗ウイルス応答の喪失をもたらす。ＩＣＰ２２はまた、ウイルス遺伝子の効率的な転写伸長のために、細胞の転写伸長因子をウイルスゲノムに動員する。

「感染細胞タンパク質２７（ＩＣＰ２７）」は、ＨＳＶ－１の感染のために必要とされる多機能な調節性タンパク質である。感染後の早い時点において、ＩＣＰ２７は、スプライシングタンパク質特異的キナーゼであるＳＲＰＫ１と相互作用し、この主に細胞質性のキナーゼを核に動員し、ここで、ＩＣＰ２７は次いで、ＳＲタンパク質と称されるスプライシング因子の保存されたファミリーのメンバーと相互作用する（例えば、本明細書において参考として援用されるSciabica et al., EMBO J. 22:1608-1619, 2003; and Souki et al., J. Virol. 83:8970-8975において記載されるとおりである）。これらの相互作用を通して、ＩＣＰ２７は、ＳＲタンパク質の異常なリン酸化を媒介し、これは、結果として、スプライソソームのアセンブリーにおけるそれらの役割を果たすことができず、宿主細胞のスプライシングの阻害をもたらす。また、感染後の早い時点において、ＩＣＰ２７は、Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）を通して細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩ）と相互作用し、ウイルスの転写／複製部位へのＲＮＡＰ ＩＩの動員を助ける（例えば、本明細書において参考として援用されるZhou et al., J. Virol. 76:5893-5904, 2002; and Dai-ju et al., J. Virol. 80:3567-3581, 2006において記載されるとおりである）。感染が進行するにつれて、ＩＣＰ２７は、スプライシングスペックルから解離し、ＴＲＥＸ複合体ｍＲＮＡ輸送アダプタータンパク質（TREX complex mRNA export adaptor protein）Ａｌｙ／ＲＥＦと相互作用して、Ａｌｙ／ＲＥＦをウイルスの複製コンパートメントに動員する（例えば、本明細書において参考として援用されるChen et al., J. Virol. 79:3949-3961, 2005; and Chen et al., J. Virol. 76:12877-12889, 2002において記載されるとおりである）。複製コンパートメントに関連する一方で、ＩＣＰ２７は、ウイルスＲＮＡに結合して、その結合したＲＮＡカーゴ（cargo）を、核膜孔複合体を通して細胞質へとエスコートする（例えば、本明細書において参考として援用されるCorbin-Lickfett et al., Nucleic Acids Res. 37:7290-7301, 2009; and Sandri-Goldin et al., Genes Dev. 12:868-879, 1998において記載されるとおりである）。細胞質において、ＩＣＰ２７は、翻訳開始因子との相互作用により、一部のウイルスｍＲＮＡの翻訳開始を増強する（例えば、本明細書において参考として援用されるEllison et al., J. Virol. 79:4120-4131, 2005; and Fontaine-Rodriguez et al., Virology 330:487-492, 2004において記載されるとおりである）。ＩＣＰ２７はまた、ＲＮＡＰ ＩＩと会合した場合に、ＩＣＰ８と相互作用することが示されている（例えば、本明細書において参考として援用されるOlesky et al., Virology 331:94-105, 2005において記載されるとおりである）。

「感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７）」は、侵入しているＨＳＶがヒト免疫系のＣＤ８Ｔ細胞応答を逃れることを可能にすることにおいて機能するタンパク質である（例えば、本明細書において参考として援用されるGoldsmith et al., The Journal of Experimental Medicine. 187 (3): 341-8, 1998; and Berger et al., Journal of Virology. 74 (10): 4465-73, 2000において記載されるとおりである）。

感染細胞タンパク質３４．５（ＩＣＰ３４．５）は、γ３４．５遺伝子によりコードされるタンパク質であって、それは、ウイルス感染に対する細胞ストレス応答を遮断する（例えば、例えば、本明細書において参考として援用されるAgarwalla et al., Methods in Molecular Biology. 797: 1-19において記載されるとおりである）。細胞がＨＳＶに感染した場合、ウイルスの二本鎖ＲＮＡによりタンパク質キナーゼＲが活性化される。タンパク質キナーゼＲは、次いで、真核生物翻訳開始因子－２Ａ（ｅＩＦ－２Ａ）と称されるタンパク質をリン酸化し、これがｅＩＦ－２Ａを不活化する。ＥＩＦ－２Ａは翻訳のために必要とされるので、ｅＩＦ－２Ａをシャットダウンすることにより、細胞は、ウイルスが細胞自体のタンパク質作製機構をハイジャックすることを防止する。ウイルスは、今度は、その防御を打ち負かすためにＩＣＰ３４．５を進化させた；それは、ｅＩＦ－２Ａを脱リン酸化させるタンパク質ホスファターゼ－１Ａを活性化させ、これが、翻訳が再び起こることを可能にする。γ３４．５遺伝子を欠失するＨＳＶは、正常な細胞においては、タンパク質を作製することができないので、複製することができない。

ビリオンタンパク質１６（ＶＰ１６）は、ＨＳＶ感染の間に、ウイルス最初期遺伝子の転写の活性化およびビリオン宿主シャットオフ（shutoff）タンパク質の下方調節を含む複数の機能を果たす。さらに、ＶＰ１６は、ウイルスのアセンブリーおよび／または成熟化のいくつかの側面に関与する。

「潜伏期関連転写物（ＬＡＴ）」は、ＨＳＶが感覚ニューロンにおいてヒストンと関連する環状エピソームとして潜伏感染を確立した後で活性な転写を示す、ＨＳＶゲノムの唯一の領域である（例えば、本明細書において参考として援用されるDeshmane et al., J. Virol. 63:943-947, 1989において記載されるとおりである）。ＬＡＴ領域は、８．３ｋｂのポリアデニル化されたＲＮＡを担持し、これは、スプライシングを受けて、感覚ニューロンのサブセットにおいて豊富に蓄積する２．０ｋｂの安定なイントロンを生じる。この２．０ｋｂのイントロンは、一部のニューロンにおいては選択的にスプライシングされて１．５ｋｂのイントロンを生じ得る。ＬＡＴ領域は、いかなるタンパク質をもコードしていることは示されていないが、一方で、この領域は、ニューロンの生存および抗アポトーシス、ビルレンス、潜伏性転写の抑制、潜伏期の確立、および潜伏期からの再活性化を含む、多数の病原性の機能に関連付けられている。

ＨＳＶタンパク質の他の非限定的な例として、ＵＬ１（ｇＬ）、ＵＬ１０（ｇＭ）、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２７（ｇＢ）、ＵＬ４３、ＵＬ４４（ｇＣ）、ＵＬ４５、ＵＬ４９Ａ、ＵＬ５３（ｇＫ）、ＵＳ４（ｇＧ）、ＵＳ５（ｇＪ）、ＵＳ６（ｇＤ）、ＵＳ７（ｇＩ）、ＵＳ８（ｇＥ）およびＵＳ１０などのエンベロープタンパク質；ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ３５およびＵＬ３８などのキャプシドタンパク質；ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ２１、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ４１、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＳ９およびＵＳ１０テグメントタンパク質；ならびに他のタンパク質、例えば、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ５、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１６、ＵＬ１７、ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ５４、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ８１、ＵＳ１１およびＵＳ１２が挙げられる。

本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムにおいて欠失している例示的なＨＳＶ－１遺伝子およびタンパク質のアクセッション番号を、表１において提供する。
表１．ＨＳＶ－１遺伝子

ＶＰ１６のアミノ酸配列、全長（配列番号２）

ＶＰ１６のアミノ酸配列、アミノ酸４２２においてトランケーションを受けたもの（配列番号３）

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ（例えば、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびγ３４．５（ＩＣＰ３４．５）、ＶＰ１６、およびＬＡＴ）のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）をコードする遺伝子において欠失を含む。遺伝子における「欠失」とは、当該遺伝子の一部または全てが、改変されたＨＳＶ－１ゲノムから取り除かれていることを意味する。例えば、遺伝子のうちの、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％）が取り除かれていてもよい。例えば、いくつかの態様において、ＶＰ１６における欠失とは、ＶＰ１６をコードする遺伝子の完全な欠失を意味する。いくつかの態様において、ＶＰ１６遺伝子における欠失は、ＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす、部分的な欠失である（配列番号２）。典型的には、完全な欠失は遺伝子産生（コードされるタンパク質）の機能を完全に取り除くが、一方で、部分的な欠失は、遺伝子産生機能の完全な喪失、または（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の）遺伝子産生機能の減少をもたらし得る。いくつかの態様において、欠失は、欠失した遺伝子（例えば、ＩＣＰ４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ８、ＩＣＰ６、ＶＰ１６、γ３４．５（ＩＣＰ３４．５）、ＬＡＴ、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ４７のうちの、１つ以上）を、非機能的にする。ＶＰ１６の場合、部分的な欠失は、トランス活性化ドメインを失くトランケーションされたＶＰ１６をもたらすが、トランケーションされたＶＰ１６は、ＨＳＶ－１ウイルス粒子の必須の構造構成成分を残している。

欠失は、遺伝子のどこであってもよい。１つの遺伝子において１つの欠失が存在しても、１つの遺伝子において複数の欠失が存在してもよい。いくつかの態様において、ＨＳＶゲノムにおいて複数のコピー（例えば２コピー）で存在する遺伝子（例えば、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、γ３４．５およびＬＡＴ）について、かかる遺伝子における「欠失」とは、別段に特定されない限り、当該遺伝子の一方または両方のコピーにおける欠失を意味する。遺伝子の両方のコピーにおいて欠失が存在する場合、欠失は、同じであっても異なっていてもよい。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、γ３４．５、ＶＰ１６およびＬＡＴをコードする１つ以上の遺伝子における欠失を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ０（例えば、一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（例えば、一方または両方のコピー）、γ３４．５（例えば、一方または両方のコピー）、ＬＡＴ（例えば、一方または両方のコピー）、およびＶＰ１６をコードする遺伝子のうちの１つ以上における欠失を含む。いくつかの態様において、ＶＰ１６の両方のコピーが欠失を有する場合、一方のコピーは、完全に欠失しており、他方のコピーは、ＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失を含む（配列番号２）。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、γ３４．５（例えば、一方または両方のコピー）、ＬＡＴ（例えば、一方または両方のコピー）、およびＩＣＰ０（例えば、一方または両方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、γ３４．５（両方のコピー）、ＬＡＴ（両方のコピー）、およびＩＣＰ０（両方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、γ３４．５（一方のコピー）、ＬＡＴ（一方のコピー）、およびＩＣＰ０（一方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、γ３４．５（一方のコピー）、ＬＡＴ（一方のコピー）、ＩＣＰ０（一方のコピー）、およびＩＣＰ２７をコードする遺伝子における欠失を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（一方のコピー）、γ３４．５（一方のコピー）、ＬＡＴ（一方のコピー）、およびＩＣＰ０（一方のコピー）をコードする遺伝子における欠失を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、γ３４．５（一方のコピー）、ＬＡＴ（一方のコピー）、およびＩＣＰ０（一方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子における完全な欠失を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、γ３４．５（一方のコピー）、ＬＡＴ（一方のコピー）、およびＩＣＰ０（両方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、γ３４．５（一方のコピー）、ＬＡＴ（一方のコピー）、およびＩＣＰ０（一方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）をコードする遺伝子における欠失を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ０（一方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ０（２コピー）をコードする遺伝子における欠失、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子におけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ＶＰ１６をコードする遺伝子の一方のコピーにおけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）、および、ＶＰ１６をコードする遺伝子の第２のコピーの完全な欠失を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ０（一方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ＶＰ１６をコードする遺伝子の一方のコピーにおけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子の第２のコピーの完全な欠失を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ０（両方のコピー）をコードする遺伝子における欠失、ＶＰ１６をコードする遺伝子の一方のコピーにおけるＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４２２におけるトランケーションをもたらす欠失（配列番号２）、ならびにＶＰ１６をコードする遺伝子の第２のコピーの完全な欠失を含む。

いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４の両方のコピーにおける欠失、ＩＣＰ０の両方のコピーにおける欠失、アミノ酸４２２におけるＶＰ１６タンパク質のトランケーションをもたらすＶＰ１６をコードする遺伝子における欠失、ならびにＬＡＴの一方のコピーおよびγ３４．５の一方のコピーにおける欠失（ＩＣＰ３４．５）を含む。
いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４の両方のコピーにおける欠失、ＩＣＰ０の両方のコピーにおける欠失、ＶＰ１６をコードする遺伝子の一方のコピーにおけるアミノ酸４２２におけるＶＰ１６タンパク質のトランケーションをもたらす欠失、ＶＰ１６をコードする遺伝子の他方の完全な欠失、ならびにＬＡＴの一方のコピーおよびγ３４．５の一方のコピーにおける欠失（ＩＣＰ３４．５）を含む。

いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、ＩＣＰ４の両方のコピーにおける欠失、ＩＣＰ０の両方のコピーにおける欠失、アミノ酸４２２におけるＶＰ１６タンパク質のトランケーションをもたらすＶＰ１６をコードする遺伝子における欠失、ならびにＬＡＴの一方のコピーおよびγ３４．５の一方のコピーにおける欠失（ＩＣＰ３４．５）を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記載される改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、配列番号１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であってよい。いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、配列番号１のヌクレオチド配列に対して、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一である。いくつかの態様において、改変されたＨＳＶ－１ゲノムは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

改変されたＨＳＶ－１ゲノムを、ベクター中に組み込んでもよい。「ベクター」とは、遺伝子材料（例えば遺伝子回路）をそれが複製および／または発現されることができる細胞中に人工的に運搬するために、ビヒクルとして用いられる核酸（例えばＤＮＡ）を指す。いくつかの態様において、ベクターは、エピソームベクターである（例えば、本明細書において参考として援用されるVan Craenenbroeck K. et al. Eur. J. Biochem. 267, 5665, 2000を参照）。ベクターの非限定的な例は、プラスミドである。プラスミドは、二本鎖の、一般的に環状のＤＮＡ配列であって、宿主細胞において自動的に複製することができるものである。プラスミドベクターは、典型的には、宿主におけるプラスミドの半独立的な複製を可能にする複製起点、およびまた、導入遺伝子のインサートを含む。プラスミドは、他の特徴、例えば「マルチクローニングサイト（multiple cloning site）」、核酸インサートの挿入のためのヌクレオチドオーバーハング、およびインサートのいずれかの側に対する複数の制限酵素コンセンサス部位を有していてもよい。いくつかの態様において、ベクターは、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）である。バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）は、細菌、通常はE. coliを形質転換およびクローニングするために用いられる、機能的な稔性プラスミド（fertility plasmid）（またはＦ－プラスミド）に基づく、ＤＮＡコンストラクトである。

いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５またはそれより多くの）遺伝子回路をさらに含む。「遺伝子回路」とは、本明細書において用いられる場合、１つ以上の機能を発揮する、操作された核酸分子（典型的にはＤＮＡ）を指す。かかる機能として、限定することなく、以下が挙げられる：インプットシグナルを感知すること、アウトプット分子を産生すること、制御シグナルを生成すること、論理ゲート（logic gate）として機能すること、または感知されたかもしくは他の遺伝子回路により生成されたシグナルを調節すること。いくつかの態様において、遺伝子回路は、本明細書において記載される機能のうちの１つを発揮する。いくつかの態様において、遺伝子回路は、複数の機能を発揮する。例えば、１つの遺伝子回路が、インプットシグナルを感知し、それに応答してアウトプットシグナルを生成してもよい。

いくつかの態様において、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターは、１つの遺伝子回路、例えば、環境的なキューなどのシグナルまたは人工的に供給されるシグナルに応答して、アウトプット分子を発現する遺伝子回路を含む。いくつかの態様において、シグナルは、小分子である。１つの非限定的な例において、かかる遺伝子回路は、アウトプット分子をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーター（例えば誘導性プロモーター）を含む。シグナルは、誘導性プロモーターを抑制または活性化するシグナルであってよい。

いくつかの態様において、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターは、複数の遺伝子回路を含み、ここで、複数の遺伝子回路は、アウトプット分子の発現の転写または翻訳の制御の多様な層を含む、より複雑な遺伝子系の構成成分である。かかる複雑な遺伝子系において、様々な型の遺伝子回路（例えば、限定することなく、センサー回路、シグナル回路、制御回路、および／または調節回路）が用いられる。いくつかの態様において、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターは、遺伝子系の一部（遺伝子系における遺伝子回路のうちのいくつか）、または遺伝子系の全て（遺伝子系における遺伝子回路のうちの全て）を含む。操作されたＨＳＶ－１ベクターは、遺伝子回路を含み、これは、本明細書において記載される全ての状況を広く指し、例えば、それは、１つの遺伝子回路またはある遺伝子系の部分または全てである複数の遺伝子回路を含む。

センサー回路は、典型的には、インプットシグナルを検出する領域（例えば、小分子シグナルのための結合部位またはｍｉｃｒｏＲＮＡシグナルのための標的部位）を含む。いくつかの態様において、センサー回路は、系における他の回路のための調節因子（例えば、転写リプレッサーまたはアクチベーターなどの転写調節因子）をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーターをさらに含む。インプットシグナルを感知することは、調節因子の発現または非発現をもたらし、それにより、下流の回路の挙動に影響を及ぼす。いくつかの態様において、様々なシグナルを同時に検出するために、様々な型のセンサー回路が用いられる。

シグナル回路は、センサー回路に対して（例えば、センサー回路により産生された調節因子に対して）応答し、今度はアウトプット分子を産生する。いくつかの態様において、シグナル回路は、アウトプット分子をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された、活性化可能／抑制可能なプロモーターを含む。「活性化可能／抑制可能」なプロモーターとは、（例えば転写アクチベーターにより）活性化されて、作動的に連結されたヌクレオチド配列の発現を駆動することができる、および（例えば転写リプレッサーにより）抑制されて、作動的に連結されたヌクレオチド配列の発現を抑制することができるプロモーターである。いくつかの態様において、遺伝子系において、１つより多くのシグナル回路が用いられる。

いくつかの態様において、遺伝子系はさらに、その性能（例えば、感受性、特異性、および／または強さ）を増強するためのさらなる調節エレメントを含む。いくつかの態様において、かかる調節エレメントは、フィードフォワードおよび／またはフィードバック転写調節ループであってよい。例えば、いくつかの態様において、シグナル回路はさらに、センサー回路の挙動を調節し、それによりフィードバックループを作製する調節因子をコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、さらなる制御回路が遺伝子系において含まれ、これは、転写および／または翻訳の制御を介して、センサー回路とシグナル回路との間の情報交換をさらに精密に調整する。

制御回路は、インプットシグナルに非依存的に、一定のシグナルを生成し、ｍｉｃｒｏＲＮＡプロフィール以外の他の要因、例えば、遺伝子導入、細胞の健康などにより引き起こされる変動について制御するために用いられてもよい。いくつかの態様において、制御回路は、アウトプットシグナルとは異なる制御シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された、構成的プロモーターを含む。制御シグナルは、典型的には、蛍光分子などの検出可能な分子である。

本開示の操作されたＨＳＶ－１ベクターは、１００ｋｂまでの長さの遺伝子回路を送達するために用いてもよい。例えば、遺伝子回路は、１００ｋｂまで、９０ｋｂまで、８０ｋｂまで、７０ｋｂまで、６０ｋｂまで、５０ｋｂまで、４０ｋｂまで、３０ｋｂまで、２０ｋｂまで、１０ｋｂまで、５ｋｂまで、２ｋｂ、または１ｋｂまでの長さであってよい。いくつかの態様において、遺伝子回路は、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、１０～１００、１０～９０、１０～８０、１０～７０、１０～６０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、２０～３０、３０～１００、３０～９０、３０～８０、３０～７０、３０～６０、３０～５０、３０～４０、４０～１００、４０～９０、４０～８０、４０～７０、４０～６０、４０～５０、５０～１００、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５０～６０、６０～１００、６０～９０、６０～８０、６０～７０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、８０～１００、８０～９０、または９０～１００ｋｂの長さである。いくつかの態様において、遺伝子回路は、約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｋｂの長さである。いくつかの態様において、遺伝子回路は、３３ｋｂまでの長さである。

複数の遺伝子回路を含む複雑な系は、当該分野において記載されている。非限定的な例は、本明細書において参考として援用される国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４４６４３および国際出願効果番号ＷＯ２０１１６／０４０３９５において記載されるようなｍｉｃｒｏＲＮＡの存在または不在を感知する、細胞の状態の分類子（cell state classifier）である。本開示に従って用いることができる系の遺伝子回路の他の非限定的な例として、Xieら、Science、第333巻、第6047号、1307-1311頁、2011年；Mikiら、Cell Stem Cell、第16巻、第6号、699-711頁、2015年；Sayegら、ACS Synth. Biol., 4 (7)、788-795頁、2015年において；およびRaら、Front Cell Dev Biol. 2017; 5: 77, 2017において記載されるものが挙げられる。

遺伝子回路は、様々な遺伝子エレメントを組み合わせることにより構築される。遺伝子エレメントとは、核酸発現においてある役割を有する（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ゲノムインスレーター（genomic insulator）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位、またはポリアデニル化シグナル）か、または遺伝子回路の個別の産物（例えば、アクチベーター、リプレッサー、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またはアウトプット分子）をコードする特定のヌクレオチド配列を指す。

「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節において機能する小さな非コードＲＮＡ分子である（例えば、Ambros et al., Nature 431 (7006): 350-5, 2004；およびBartel et al., Cell. 136 (2): 215-33, 2004において記載されるとおり）。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、１５～３０ヌクレオチドの長さであってよい。例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～３０、２０～２５、または２５～３０ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、１６～２４ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの態様において、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さであってよい。

「ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位」は、ｍｉｃｒｏＲＮＡのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列である。当然、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）において、典型的にはｍＲＮＡ中の３’非翻訳領域において存在する。ｍｉｃｒｏＲＮＡのその標的部位への配列相補性を介する結合は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの分解またはｍＲＮＡの翻訳の抑制のいずれかを介して（例えば、本明細書において参考として援用されるBartel et al., Cell 136 (2): 215-33 (2009)において記載されるとおり）、アウトプット分子のサイレンシングをもたらす。ここで、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位が遺伝子回路に関して（すなわち、ＤＮＡに関して）言及される場合、それは、遺伝子回路から産生されるｍＲＮＡにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位をコードするヌクレオチド配列を意味する。

既知のｍｉｃｒｏＲＮＡの配列、起源および機能についての情報は、公共で利用可能なデータベースにおいて見出すことができる（例えば、mirbase.org/の全てのバージョン、Kozomara et al., Nucleic Acids Res 2014 42:D68-D73；Kozomara et al., Nucleic Acids Res 2011 39:D152-D157；Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res 2008 36:D154-D158；Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res 2006 34:D140-D144；およびGriffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res 2004 32:D109-D111において記載されるとおりであり、これは、「高信頼度」ｍｉｃｒｏＲＮＡを含むmiRBase 21の最新リリースバージョンを含む）。

「アクチベーター」とは、本明細書において用いられる場合、転写アクチベーターを指す。用語「アクチベーター」または「転写アクチベーター」は、本明細書において交換可能に用いられる。転写アクチベーターとは、遺伝子または遺伝子のセットの遺伝子転写を増大させるタンパク質である。ほとんどのアクチベーターは、プロモーター中またはその近傍に位置するＤＮＡの部位に対して配列特異的に結合し、一般的な転写機構（ＲＮＡポリメラーゼおよび一般的な転写因子）とのタンパク質－タンパク質相互作用を作り、それにより一般的な転写機構のプロモーターへの結合を促進することにより機能する。

「リプレッサー」とは、本明細書において用いられる場合、転写リプレッサーを指す。用語「リプレッサー」または「転写リプレッサー」は、本明細書において交換可能に用いられる。転写リプレッサーは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するタンパク質であって、オペレーターまたは関連するサイレンサーに結合することにより１つ以上の遺伝子の発現を阻害するものである。ＤＮＡに結合するリプレッサーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの付着を遮断し、それにより、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡへの転写を妨げる。ＲＮＡに結合するリプレッサーは、ｍＲＮＡに結合して、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を妨げる。当業者は、本開示に従う使用のために、転写アクチベーターまたはリプレッサーを選択することができる。既知の、または予測される転写調節因子についての公共のデータベース、例えば、transcriptionfactor.orgが、利用可能である。

「プロモーター」とは、核酸配列の残りの部分の転写の開始および速度がそこにおいて制御される、核酸配列の制御領域を指す。プロモーターは、それが制御する核酸配列の発現を駆動するか、または転写を駆動する。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節性のタンパク質および分子が結合することができる、部分領域を含んでもよい。プロモーターは、構成的、誘導性、活性化可能、抑制可能、組織特異的、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。プロモーターは、それが、それがその配列の転写開始および／または発現制御（「駆動」）する核酸配列に対して、正確な機能的な配置および配向にある場合に、「作動的に連結され」ているとみなされる。

プロモーターは、遺伝子または配列と天然で関連するものであってもよく、例えば所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得られたものであってもよい。いくつかの態様において、コード核酸配列は、組み換えまたは異種性のプロモーターの制御下に位置するものであってもよい。異種性のプロモーターとは、その天然の環境においては、コードされる遺伝子とは通常は関連しないプロモーターを指す。かかるプロモーターとして、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の細胞から単離されたプロモーター；および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサー、例えば、当該分野において公知の遺伝子操作の方法を通して発現を変える、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または変異を含むものなどが挙げられ得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成で生成することに加えて、配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて生成してもよい（米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第５，９２８，９０６号を参照）。

いくつかの態様において、プロモーターは、「誘導性プロモーター」であり、これは、インデューサーシグナルの存在下において、これに影響を受け、またはこれに接触された場合に、転写活性を調節する（例えば、開始させるかまたは活性化する）ことにより特徴づけられるプロモーターを指す。インデューサーシグナルは、内因的なものであっても、誘導性プロモーターからの転写活性を調節することにおいて活性となるように、通常では外因的な条件（例えば光）、化合物（例えば、化学的もしくは非化学的化合物）または誘導性プロモーターと接触するタンパク質であってもよい。したがって、核酸の「転写を調節するシグナル」とは、誘導性プロモーターに対して作用するインデューサーシグナルを指す。転写を調節するシグナルは、用いられる調節系に依存して、転写を活性化しても、これを不活化してもよい。転写の活性化は、転写を駆動するためにプロモーターに対して直接的に作用すること、またはプロモーターが転写を駆動することを妨げているリプレッサーの不活化によりプロモーターに対して間接的に作用することを含んでもよい。逆に、転写の不活性化は、転写を妨げるためにプロモーターに対して直接的に作用すること、またはリプレッサーを活性化してそれが次いでプロモーターに対して作用することによりプロモーターに対して間接的に作用することを含んでもよい。いくつかの態様において、遺伝子回路において誘導性プロモーターを用いることにより、遺伝子産物の条件的発現または「遅延した」発現がもたらされる。

インデューサーシグナルの投与または除去は、作動的に連結された核酸配列の転写の活性化と不活化との間の切り替えをもたらす。したがって、核酸配列に作動的に連結されたプロモーターの活性な状態とは、プロモーターが核酸配列の転写を能動的に調節している（すなわち、連結された核酸配列が発現される）状態を指す。逆に、核酸配列に作動的に連結されたプロモーターの不活性な状態とは、プロモーターが核酸配列の転写を能動的に調節していない（すなわち、連結された核酸配列が発現されない）状態を指す。

誘導性プロモーターは、光、ｐＨ、温度、放射線照射、浸透圧、食塩勾配、細胞表面結合、および１つ以上の外因的または内因的な誘導剤の濃度の変化などの１つ以上の生理学的状態により誘導（またはそれにより抑制）され得る。外因的なインデューサーシグナルまたは誘導剤は、限定することなく、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、糖および多糖、核酸、タンパク質転写アクチベーターおよびリプレッサー、サイトカイン、トキシン、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモンまたはこれらの組み合わせを含んでもよい。

誘導性プロモーターは、本明細書において記載されるかまたは当業者に公知の任意の誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例として、限定することなく、化学的に／生化学的に調節される、および物理的に調節されるプロモーター、例えばアルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系；これは、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む）、ステロイド調節性プロモーター（例えば、ラット糖質コルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガのエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーター）、金属調節性プロモーター（例えば、酵母、マウスおよびヒトからメタロチオネインの遺伝子から誘導されるプロモーター（金属イオンに結合してこれを封鎖するタンパク質））、病態形成により調節されるプロモーター（例えば、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）により誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、ならびに光調節性プロモーター（例えば、植物細胞からの光応答性プロモーター）が挙げられる。

いくつかの態様において、インデューサーシグナルは、Ｎ－アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）であり、これは、細菌のクオラムセンシングに関与するシグナル伝達分子のクラスである。クオラムセンシングとは、細菌の間の情報伝達の方法であって、集団の密度に基づいて、群ベースの挙動の協調を可能にする。ＡＨＬは、細胞膜を越えて拡散することができ、一定の範囲のｐＨ値にわたって増殖培地中で安定である。ＡＨＬは、ＬｕｘＲなどの転写アクチベーターに結合して、コグネートなプロモーターからの転写を刺激することができる。

いくつかの態様において、インデューサーシグナルは、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）であり、これは、テトラサイクリンの誘導体であって、抗生物質活性を示さず、例えば細菌における、テトラサイクリンにより制御される遺伝子発現系との使用のために設計される。

いくつかの態様において、インデューサーシグナルは、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）であり、これは、ｌａｃオペロンの転写を誘導するラクトース代謝物であるアロラクトースの分子模倣物であり、したがって、遺伝子がｌａｃオペレーターの制御下にある場合にタンパク質発現を誘導するために用いられる。ＩＰＴＧは、ｌａｃリプレッサーに結合し、ｌａｃオペレーターから四量体リプレッサーをアロステリックな様式において放出させ、それにより、ｌａｃオペロンにおける遺伝子、例えばβ－ガラクトシドの単糖への加水分解を触媒する加水分解酵素であるベータ－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、の転写を可能にする。硫黄（Ｓ）原子は、細胞により加水分解不可能な化学結合を作製し、細胞がインデューサーを代謝または分解することを妨げる。ＩＰＴＧは、例えば１００μＭ～１．０ｍＭの濃度範囲において、タンパク質発現の有効なインデューサーである。用いられる濃度は、必要とされる誘導の強さ、ならびに、用いられる細胞またはプラスミドの遺伝子型に依存する。ｌａｃリプレッサーを過剰産生する変異体であるｌａｃＩｑが存在する場合、より高い濃度のＩＰＴＧが必要となる場合がある。青白スクリーニングにおいて、ＩＰＴＧは、Ｘ－ｇａｌと一緒に用いられる。青白スクリーニングは、クローニング実験において、非組み換えのものではなく、組み換えプラスミドにより形質転換されたコロニーが同定されることを可能にする。

他の誘導性プロモーター系は、当該分野において公知であり、本開示に従って用いることができる。誘導性プロモーターの例として、限定することなく、バクテリオファージプロモーター（例えば、Pls1con、T3、T7、SP6、PL）および細菌プロモーター（例えば、Pbad、PmgrB、Ptrc2、Plac/ara、Ptac、Pm）、またはこれらのハイブリッド（例えば、PLlacO、PLtetO）が挙げられる。本開示に従う使用のための細菌プロモーターの例として、限定することなく、以下が挙げられる：正に調節されたE. coliプロモーター、例えば、正に調節されたσ７０プロモーター（例えば、誘導性pBad/araCプロモーター、Lux cassette rightプロモーター、改変ラムダPrmプロモーター、plac Or2-62（正）、余分なREN部位を有するpBad/AraC、pBad、P(Las) TetO、P(Las) CIO、P(Rhl)、Pu、FecA、pRE、cadC、hns、pLas、pLux）、σＳプロモーター（例えば、Pdps）、σ３２プロモーター（例えばヒートショック）およびσ５４プロモーター（例えば、glnAp2）；負に調節されたE. coliプロモーター、例えば、負に調節されたσ７０プロモーター（例えば、Promoter (PRM+)、改変ラムダPrmプロモーター、TetR - TetR-4C P(Las) TetO、P(Las) CIO、P(Lac) IQ、RecA_DlexO_DLacO1、dapAp、FecA、Pspac-hy、pcI、plux-cI、plux-lac、CinR、CinL、グルコースにより制御された改変Pr、改変Prm+、FecA、Pcya、rec A (SOS)、Rec A (SOS)、EmrR_regulated、BetI_regulated、pLac_lux、pTet_Lac、pLac/Mnt、pTet/Mnt、LsrA/cI、pLux/cI、LacI、LacIQ、pLacIQ1、pLas/cI、pLas/Lux、pLux/Las、LexA結合部位を有するpRecA、リバースBBa_R0011、pLacI/ara-1、pLacIq、rrnB P1、cadC、hns、PfhuA、pBad/araC、nhaA、OmpF、RcnR）、σＳプロモーター（例えば、選択的（alternative）シグマ因子σ３８を有するLutz-Bujard LacO）、σ３２プロモーター（例えば、選択的シグマ因子σ３２を有するLutz-Bujard LacO）、およびσ５４プロモーター（例えば、glnAp2）；負に調節されたB. subtilisプロモーター、例えば、抑制可能なB. subtilisのσＡプロモーター（例えば、グラム陽性ＩＰＴＧ誘導性、Ｘｙｌ、hyper-spank）ならびにσＢプロモーター。他の誘導性の微生物プロモーターを、本開示に従って用いることができる。

いくつかの態様において、本開示の誘導性プロモーターは、真核生物細胞（例えば哺乳動物細胞）において機能する。真核生物細胞における使用のための誘導性プロモーターの例として、限定することなく、化学的に調節されるプロモーター（例えば、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、および病態形成関連（ＰＲ）プロモーター）ならびに物理的に調節されるプロモーター（例えば、温度調節性プロモーターおよび光調節性プロモーター）が挙げられる。

「ゲノムインスレーター」とは、遺伝子を、それらの周辺環境から発生する不適切なシグナル（例えば、増強シグナルまたは抑制シグナル）から保護し、すなわち、遺伝子発現の境界を確立する共通の能力を有する、ＤＮＡ配列エレメントのクラスを指す。いくつかの態様において、ゲノムインスレーターは、その機能を発揮する際にＤＮＡ配列エレメントと会合する、１つ以上のタンパク質を有する（例えば、本明細書において参考として援用されるYang et al., Adv Cancer Res. 2011 ; 110: 43-76において；およびWest et al., Genes & Development 16:271-288, 2002において記載されるとおりである）。特定のゲノムインスレーター、例えば、ニワトリＨＳ４インスレーター（ｃＨＳ４）は、レトロウイルスベクターにより染色体中に組み込まれた導入遺伝子の発現を増強することが示されている（例えば、本明細書において参考として援用されるRevilla et al., J. Virol. May 2000 vol. 74 no. 10 4679-4687において記載されるとおりである）。本開示に従って用いることができるゲノムインスレーターは、異なる種、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Drosophila melanogaster、または脊椎動物、例えばニワトリもしくは哺乳動物からのものであってもよい。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。本開示に従って用いることができる多様なゲノムインスレーターは、本明細書において参考として援用されるWest et al., Genes & Development 16:271-288, 2002において記載されるとおりである。

「エンハンサー」とは、本明細書において用いられる場合、転写エンハンサーを指す。用語「エンハンサー」および「転写エンハンサー」は、本明細書において交換可能に用いられる。エンハンサーは、ＤＮＡの短い（５０～１５００ｂｐ）領域であって、アクチベーターにより結合されて特定の遺伝子の転写が起こるであろう可能性を増大させることができるものである。エンハンサーは、シス作動性であり、転写開始部位から上流または下流の、遺伝子から１Ｍｂｐ（１，０００，０００ｂｐ）まで離れた位置にあってよい。エンハンサーは、原核生物および真核生物の両方において見出される。ヒトゲノムにおいては、何十万個ものエンハンサーが存在する。

「オペレーター」とは、本明細書において用いられる場合、リプレッサーが結合して、それを抑制することにより遺伝子発現を調節する、ＤＮＡのセグメントを指す。ｌａｃオペロンにおいて、オペレーターは、オペロンのプロモーターと遺伝子との間のセグメントとして定義される。リプレッサーが結合すると、リプレッサータンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を転写することを物理的に妨害し、それにより遺伝子の転写を抑制する。

「ポリアデニル化シグナル」とは、本明細書において用いられる場合、新たに生成されたＲＮＡの最３’側の部位を切断し、この切断により生じた末端をポリアデニル化するＲＮＡ切断複合体により認識される配列モチーフを指す。ポリアデニル化シグナルの配列は、真核生物の群の間で異なる。ほとんどのヒトポリアデニル化部位は、ＡＡＵＡＡＡ配列を含む。

転写ターミネーターは、典型的には、本開示の遺伝子回路のうちのいずれかにおけるポリアデニル化シグナルの後で生じる。「転写ターミネーター」とは、転写を停止させる核酸配列である。ターミネーターは、一方向性であっても、二方向性であってもよい。それは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列から構成される。ターミネーター配列は、上流のプロモーターによる下流の核酸配列の転写活性化を妨げる。したがって、ある態様においては、本明細書において記載される多様な核酸コンストラクトおよび回路における、ＲＮＡ転写物の産生を終了させるターミネーターの包含が企図される。ターミネーターは、望ましいアウトプット発現レベル（例えば、低いアウトプットレベル）を達成するか、または特定の配列の転写を回避するために、in vivoで必要とされる場合がある。

最も一般的に用いられる型のターミネーターは、順方向ターミネーターである。通常転写される核酸配列の下流に配置される場合、順方向転写ターミネーターは、転写を停止させるであろう。いくつかの態様においては、二方向性転写ターミネーターが提供され、これは、通常は、順方向および逆方向の鎖の両方において、転写を終結させる。いくつかの態様においては、逆方向転写ターミネーターが提供され、これは、通常は、逆方向の鎖においてのみ、転写を終結させる。

原核生物の系において、ターミネーターは、通常は、２つのカテゴリー（１）Ｒｈｏ非依存的ターミネーター、および（２）Ｒｈｏ依存的ターミネーターに該当する。Ｒｈｏ非依存的ターミネーターは、一般に、いくつかのＴ塩基が続くＧ－Ｃ塩基対が豊富なステムループを形成する回文配列から構成される。理論により拘束されることは望まないが、転写終結の従来のモデルは、ステムループがＲＮＡポリメラーゼを停止させ、ポリＡテイルの転写がＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖をほどいてＲＮＡポリメラーゼから解離させるというものである。

真核生物の系において、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるために新たな転写物部位特異的切断を可能にする特異的なＤＮＡ配列を含んでもよい。これは、特化した内在ポリメラーゼに、転写物の３’末端に約２００Ａ残基のストレッチ（ポリＡ）を付加するようにシグナルを与える。このポリＡテイルで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であり、より効率的に翻訳されると考えられる。したがって、真核生物に関するいくつかの態様において、ターミネーターは、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含んでもよい。いくつかの態様において、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進する。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、アウトプット核酸レベルを増強するために、および／または核酸の間のリードスルーを最小限化するために役立ち得る。

本開示に従う使用のためのターミネーターは、本明細書において記載されるかまたは当業者に公知の任意の転写のターミネーターを含む。ターミネーターの例として、限定することなく、例えばウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、ならびに例えばＳＶ４０ターミネーターなどのウイルスの終結配列、ｓｐｙ、ｙｅｊＭ、ｓｅｃＧ－ｌｅｕＵ、ｔｈｒＬＡＢＣ、ｒｒｎＢ Ｔ１、ｈｉｓＬＧＤＣＢＨＡＦＩ、ｍｅｔＺＷＶ、ｒｒｎＣ、ｘａｐＲ、ａｓｐＡおよびａｒｃＡターミネーターが挙げられる。いくつかの態様において、終結シグナルは、転写または翻訳されることができない配列、例えば配列トランケーションから生じるものであってもよい。

様々な遺伝子エレメントを用いて、多数の異なる遺伝子回路を構築することができる。ある遺伝子系の異なる遺伝子回路は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）の核酸分子（例えばＨＳＶ－１ベクター）において含まれ、細胞中に導入されてもよい。「核酸」とは、少なくとも２つのヌクレオチドが、一緒に共有結合により連結したものであり、いくつかの例においては、ホスホジエステル結合（例えば、ホスホジエステル「骨格」）を含んでもよい。核酸は、ゲノムおよび／またはｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであってよく、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド（例えば、人工または天然）の任意の組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の任意の組み合わせを含む。本開示の核酸は、標準的な分子生物学の方法を用いて生成することができる（例えば、GreenおよびSambrook、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、2012年、Cold Spring Harbor Pressを参照）。

いくつかの態様において、遺伝子回路は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）Cloningを用いて生成される（例えば、Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 343-345, 2009；およびGibson, D.G. et al. Nature Methods, 901-903, 2010を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。GIBSON ASSEMBLY（登録商標）は、典型的には、単管反応において、３つの酵素活性：５’エクソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’伸長活性、およびＤＮＡリガーゼ活性を用いる。５’エクソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を消化して、アニーリングのための相補的配列を露出させる。ポリメラーゼ活性は、次いで、アニーリングされた領域におけるギャップを埋める。ＤＮＡリガーゼは、次いで、ニックをシールし、ＤＮＡフラグメントをまとめて共有結合により連結させる。隣接するフラグメントのオーバーラップする配列は、Golden Gate Assemblyにおいて用いられるものよりもはるかに長く、したがって、より高いパーセンテージの正確なアセンブリーをもたらす。

いくつかの態様において、遺伝子回路は、アウトプット分子をコードする. 「アウトプット分子」は、特異的なインプットシグナルの検出に応答して遺伝子回路により産生される分子である。アウトプット分子は、例えば、限定することなく、検出可能な分子、治療用分子、診断用分子、機能的分子、ＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質、または自然免疫応答を阻害する分子（本明細書においてまた「自然免疫応答の阻害剤」としても言及される）であってもよい。

「検出可能な分子」とは、検出されることができるシグナルを有する分子を指す。いくつかの態様において、検出可能な分子は、蛍光分子であり、例えば蛍光タンパク質または蛍光ＲＮＡである。蛍光タンパク質は、適切な波長における光源（例えば、青色または紫外の範囲の光）に暴露された場合に蛍光を放出するタンパク質である。本開示に従って用いることができる好適な蛍光タンパク質として、限定することなく、eGFP、eYFP、eCFP、mKate2、mCherry、mPlum、mGrape2、mRaspberry、mGrape1、mStrawberry、mTangerine、mBananaおよびmHoneydewが挙げられる。蛍光ＲＮＡは、フルオロフォアに結合して適切な波長における光源（例えば、青色または紫外の範囲の光）に暴露された場合に蛍光を放出するＲＮＡアプタマーである。本開示のセンサー回路におけるアウトプット分子として用いることができる好適な蛍光ＲＮＡとして、限定することなく、SpinachおよびBroccoli（例えば、本明細書において参考として援用されるPaige et al., Science、第333巻、第6042号、642-646頁、2011年において記載されるとおりである）が挙げられる。いくつかの態様において、検出可能な分子は、基質を加水分解して検出可能なシグナル（例えば、化学発光シグナル）を生成する酵素である。かかる酵素として、限定することなく、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺによりコードされる）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、またはルシフェラーゼが挙げられる。いくつかの態様において、アウトプット分子は、蛍光ＲＮＡである。検出可能な分子は、診断目的のために用いてもよく、これらの検出可能な分子はまた、「診断用分子」としても言及される。

いくつかの態様において、アウトプット分子は、治療用分子である。「治療用分子」は、疾患または状態に対して治療効果を有する分子であって、疾患または状態を処置するために用いることができるものである。本開示の治療用分子は、核酸に基づくものであっても、タンパク質もしくはポリペプチドに基づくものであってもよい。

いくつかの態様において、核酸に基づく治療用分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ）または核酸酵素（例えば、リボザイム）であってもよい。「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」とは、ＲＮＡ分子が標的となったｍＲＮＡ分子を中和することにより遺伝子の発現または翻訳を阻害する生物学的プロセスである。いくつかの態様において、アウトプット分子は、自然免疫応答の構成成分の発現を阻害するｍｉｃｒｏＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」は、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節において機能する小さい非コードＲＮＡ分子（約２２ヌクレオチドを含む）である。「ｓｉＲＮＡ」は、タンパク質をコードする遺伝子の短期のサイレンシングを誘導するための、一般に用いられるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ツールである。ｓｉＲＮＡは、特定のｍＲＮＡを分解のために特異的にターゲティングするように設計された合成ＲＮＡ二重鎖である。「ｓｈＲＮＡ」は、タイトなヘアピン状の折り返しを有する人工のＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現をサイレンシングするために用いることができるものである。

当業者は、ＲＮＡｉ分子および遺伝子発現をサイレンシングすることにおけるそれらの使用に精通している。いくつかの態様において、ＲＮＡｉ分子は、癌遺伝子を標的とする。癌遺伝子は、特定の状況において、細胞を腫瘍細胞へと変換することができる遺伝子である。癌遺伝子は、増殖因子またはマイトジェン（例えばｃ－Ｓｉｓ）、受容体チロシンキナーゼ（例えばＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕ）、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、Ｓｙｋ－ＺＡＰ－７０ファミリーキナーゼもしくはＢＴＫファミリーキナーゼ）、細胞質セリン／スレオニンキナーゼまたはこれらの調節性サブユニット（例えば、Ｒａｆキナーゼもしくはサイクリン依存性キナーゼ）、調節性ＧＴＰａｓｅ（例えばＲａｓ）、または転写因子（例えばＭｙｃ）をコードする遺伝子であってよい。当業者は、がんの処置のために標的とすることができる遺伝子に精通している。

いくつかの態様において、核酸に基づく治療用分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であってよい。「ガイドＲＮＡ」とは、本明細書において、ＣＲＩＳＰＲ－ターゲティングＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合を指し、Ｃａｓ９についてのターゲティングの特異性とスカフォールディング／結合の能力との両方を提供する。「ｃｒＲＮＡ」は、標的特異性を付与し、Ｃａｓ９に結合するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする細菌ＲＮＡである。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結させる細菌ＲＮＡであって、典型的には、あらゆるｃｒＲＮＡに結合することができる。Ｃａｓ ＤＮＡ結合タンパク質の配列特異性は、標的ＤＮＡ配列に対してヌクレオチド塩基対相補性を有するｇＲＮＡにより決定される。ネイティブなｇＲＮＡは、ターゲティングされるべきＤＮＡ配列を特定する２０ヌクレオチド（ｎｔ）の特異性決定配列（ＳＤＳ）を含み、すぐ後に、ｇＲＮＡをＣａｓ９に会合させる８０ｎｔのスカフォールド配列が続く。いくつかの態様において、本開示のＳＤＳは、１５～１００ヌクレオチドまたはそれより長い長さを有する。例えば、ＳＤＳは、１５～９０、１５～８５、１５～８０、１５～７５、１５～７０、１５～６５、１５～６０、１５～５５、１５～５０、１５～４５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、または１５～２０ヌクレオチドの長さを有していてもよい。いくつかの態様において、ＳＤＳは、２０ヌクレオチド長である。例えば、ＳＤＳは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であってよい。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼを標的部位に対してするために、ＲＮＡによりガイドされたヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびそのオルトログ）と合わせて用いられる。したがって、核酸に基づく治療用分子がｇＲＮＡである場合、ＲＮＡによりガイドされたヌクレアーゼもまた提供される（例えば、これもまた遺伝子回路によりコードされるか。またはコトランスフェクトされたプラスミドにおいて提供される）。

タンパク質またはポリペプチドに基づく治療用分子の非限定的な例として、酵素、調節性タンパク質（例えば、免疫調節性タンパク質）、抗原、抗体または抗体フラグメント、および構造タンパク質が挙げられる。いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドに基づく治療用分子は、がん治療のためのものである。

本開示のいくつかの態様のために好適な酵素（合成プロモーターに作動的に連結するための）として、例えば、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、シンターゼ、イソメラーゼおよびリガーゼ、消化酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼおよびヌクレアーゼ）が挙げられる。いくつかの態様において、酵素は、ラクターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、膵臓酵素、油脂分解酵素、ムチナーゼ、セルラーゼ、イソマルターゼ、アルギナーゼ（alginase）、消化系リパーゼ（例えば、舌リパーゼ、膵臓リパーゼ、ホスホリパーゼ）、アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ）、エステラーゼ（例えば、ステロールエステラーゼ）、ジサッカリダーゼ（例えば、スクラーゼ、ラクターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ）、ＤＮａｓｅｓおよびＲＮａｓｅｓからなる群より選択される。

抗体およびそのフラグメントの非限定的な例として、以下が挙げられる：ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））、トラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））、アレムツズマブ（CAMPATH（登録商標）、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病についての適用が示されている）、ゲムツズマブ（MYLOTARG（登録商標）、ｈＰ６７．６、抗ＣＤ３３、急性骨髄球性白血病などの白血病についての適用が示されている）、リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））、トシツモマブ（BEXXAR（登録商標）、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性腫瘍についての適用が示されている）、ＭＤＸ－２１０（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質産物と免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）についてのＩ型Ｆｃ受容体（ＦｃガンマＲＩ）に同時に結合する二重特異性抗体）、オレゴボマブ（OVAREX（登録商標）、卵巣癌についての適用が示されている）、エドレコロマブ（PANOREX（登録商標））、ダクリズマブ（ZENAPAX（登録商標））、パリビズマブ（SYNAGIS（登録商標）、RSV感染などの呼吸器系の状態についての適用が示されている）、イブリツモマブチウキセタン（ZEVALIN（登録商標）、非ホジキンリンパ腫についての適用が示されている）、セツキシマブ（ERBITUX（登録商標））、MDX-447、MDX-22、MDX-220（抗ＴＡＧ－７２）、IOR-C5、IOR-T6（抗ＣＤ１）、IOR EGF/R3、セロゴバブ（celogovab）（ONCOSCINT（登録商標）OV103）、エプラツズマブ（LYMPHOCIDE（登録商標））、ペムツモマブ（pemtumomab）（THERAGYN（登録商標））、Gliomab-H（脳がん、メラノーマについての適用が示されている）。いくつかの態様において、抗体は、免疫チェックポイントタンパク質を阻害する抗体、例えば、ペムブロリズマブ（KEYTRUDA（登録商標））もしくはニボルマブ（OPDIVO（登録商標））などの抗ＰＤ－１抗体、またはイピリムマブ（YERVOY（登録商標））などの抗ＣＴＬＡ－４抗体である。他の抗体および抗体フラグメントを、本明細書において提供されるように、合成プロモーターに作動的に連結させてもよい。

調節性タンパク質は、いくつかの態様において、転写因子または免疫調節性タンパク質であってよい。非限定的な例示的な転写因子として、以下が挙げられる：ＮＦｋＢファミリーのもの、例えばＲｅｌ－Ａ、ｃ－Ｒｅｌ、Ｒｅｌ－Ｂ、ｐ５０およびｐ５２；ＡＰ－１ファミリーのもの、例えばＦｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ－１、Ｆｒａ－２、Ｊｕｎ、ＪｕｎＢおよびＪｕｎＤ；ＡＴＦ；ＣＲＥＢ；ＳＴＡＴ－１、－２、－３、－４、－５および－６；ＮＦＡＴ－１、－２および－４；ＭＡＦ；甲状腺因子；ＩＲＦ；Ｏｃｔ－１および－２；ＮＦ－Ｙ；Ｅｇｒ－１；ならびにＵＳＦ－４３、ＥＧＲ１、Ｓｐ１およびＥ２Ｆ１。他の転写因子を、本明細書において提供されるように、合成プロモーターに作動的に連結させてもよい。

本明細書において用いられる場合、免疫調節性タンパク質は、免疫応答を調節するタンパク質である。免疫調節性のものの非限定的な例として、以下が挙げられる：抗原、アジュバント（例えば、フラゲリン、ムラミルジペプチド）、インターロイキンを含むサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５またはこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト（superagonist）／変異体の形態）、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＦＮ－アルファ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３－リガンド）、および免疫刺激性抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、またはこれらの分子の単鎖／抗体フラグメント）。他の免疫調節性タンパク質を、本明細書において提供されるように、合成プロモーターに作動的に連結させてもよい。

本明細書において用いられる場合、抗原とは、抗体の抗原結合部位により結合される分子または分子の部分である。いくつかの態様において、抗原とは、対象の細胞に投与されるかまたは細胞において発現された場合に、抗原に特異的に結合する抗体の産生を活性化するかまたはこれを増大させる、分子または部分である。病原体の抗原は、当業者に周知であり、これらに限定されないが、細菌、ウイルスおよび他の微生物の部分（例えば、外被、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛および毒素）を含む。本開示に従って用いることができる抗原の例として、限定することなく、がん抗原、自己抗原、微生物抗原、アレルゲンおよび環境抗原が挙げられる。他の抗原を、本明細書において提供されるように、合成プロモーターに作動的に連結させてもよい。

いくつかの態様において、本開示の抗原は、がん抗原である。がん抗原とは、癌細胞により優先的に発現される抗原であって（すなわち、それは、癌細胞において非癌細胞よりも高いレベルで発現される）、いくつかの場合においては、それは、癌細胞においてのみ発現される。がん抗原は、癌細胞内で発現されても、癌細胞の表面において発現されてもよい。本開示に従って用いることができるがん抗原として、限定することなく、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、大腸癌関連抗原（colorectal associated antigen：ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ－１、ＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、ＰＳＡ－３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３－ゼータ鎖およびＣＤ２０が挙げられる。がん抗原は、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４およびＭＡＧＥ－Ｃ５からなる群より選択することができる。がん抗原は、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８およびＧＡＧＥ－９からなる群より選択することができる。がん抗原は、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ－イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、Ｓｍａｄファミリーの腫瘍抗原、ｌｍｐ－１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）－１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－３、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１およびＣＴ－７、ＣＤ２０およびｃ－ｅｒｂＢ－２からなる群より選択することができる。他のがん抗原を、本明細書において提供されるように、合成プロモーターに作動的に連結させてもよい。

いくつかの態様において、治療用分子は、抗がん剤である。いくつかの態様において、抗がん剤は、オリゴヌクレオチド（例えば、治療用ＲＮＡｉ、アンタゴミルなど）またはポリペプチド（例えば抗体）である。がんを処置するために用いられる抗体は、当業者に公知である。例えば、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。「免疫チェックポイント」とは、免疫系におけるタンパク質であって、免疫応答シグナルを増強するもの（共刺激分子）、または免疫応答シグナルを低下させるものである。多くのがんは、Ｔ細胞シグナルを阻害するために阻害性の免疫チェックポイントタンパク質を利用することにより、免疫系からそれら自身を保護する。例示的な阻害性チェックポイントタンパク質として、限定することなく、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム死１受容体（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、Ｖ－セットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＶＮ１またはＢ７－Ｈ４）、表面抗原分類２７６（ＣＤ２７６またはＢ７－Ｈ３）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ガレクチン－９（ＧＡＬ９）、チェックポイントキナーゼ１（Ｃｈｋ１）、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ａＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、ならびにＴ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。

これらの免疫チェックポイントタンパク質のうちのいくつかは、それらの免疫阻害活性のために、それらのコグネートな結合パートナーまたはリガンドを必要とする。例えば、Ａ２ＡＲは、アデノシンＡ２Ａの受容体であり、Ａ２ＡのＡ２ＡＲへの結合は、負の免疫フィードバックループを活性化する。別の例として、ＰＤ－１は、その２つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２と会合して、Ｔ細胞の活性化を妨げることにより免疫系を下方調節する。ＰＤ－１は、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞のプログラム細胞死を促進し、同時に、サプレッサーＴ細胞のプログラム細胞死を減少させ、それにより、その免疫阻害機能を達成する。さらに別の例として、ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の表面上に存在し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のその結合パートナーであるＣＤ８０またはＣＤ８６に結合した場合、それは、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達し、それにより免疫応答を低下させる。

「免疫チェックポイント阻害剤」とは、免疫チェックポイントタンパク質の活性を妨げるかまたはこれを弱める分子であって、例えば、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質の、そのコグネートな結合パートナー、例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４またはＡ２ａＲへの結合を阻害してもよい。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、小分子である。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、核酸アプタマーである（例えば、免疫チェックポイントタンパク質のうちのいずれか１つを標的とするｓｉＲＮＡ）。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、組み換えタンパク質である。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体である。いくつかの態様において、抗体は、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ３、抗ＬＡＧ３、抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＢＴＬＡ、抗ＧＡＬ９、抗Ｃｈｋ、抗Ａ２ａＲ、抗ＩＤＯ、抗ＫＩＲ、抗ＬＡＧ３、抗ＶＩＳＴＡ抗体、または前述の抗体のうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、または前述の抗体のうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む。例えば、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（KEYTRUDA（登録商標））またはニボルマブ（OPDIVO（登録商標））であり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（YERVOY（登録商標））である。したがって、いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、または前述の抗体のうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドに基づく治療用分子は、融合タンパク質である。融合タンパク質とは、直接的にまたは間接的に（例えばリンカーを介して）、ペプチド結合を介して、互いに共有結合した２つの異種のタンパク質、タンパク質ドメインまたはタンパク質フラグメントを含むタンパク質である。いくつかの態様において、融合タンパク質は、あるタンパク質のコード領域をさらなるタンパク質のコード領域と共に介在する停止コドンなしでインフレームで含み、それによりタンパク質が一緒に融合した単一のタンパク質の翻訳をもたらす、核酸によりコードされる。

いくつかの態様において、アウトプット分子は、機能的分子である。「機能分子」とは、他の分子または回路と相互作用して、機能（例えば、転写の調節、ＤＮＡもしくはＲＮＡの切断、または任意の酵素活性）を発揮することができる分子を指す。例示的な機能的分子として、限定することなく、酵素（例えば、限定することなく、ヌクレアーゼ）、転写調節因子（例えば、限定することなく、アクチベーターおよびリプレッサー）、ＲＮＡｉ分子（例えば、限定することなく、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ならびに抗体が挙げられる。いくつかの態様において、機能的分子は、ヌクレアーゼ（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ）である。

いくつかの態様において、アウトプット分子は、ＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質である。いくつかの態様において、ＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質は、改変されたＨＳＶ－１ゲノムから欠失しているものであってよい。遺伝子回路からのそれらの条件的発現は、欠失を補完するが、より低い毒性を付与するであろう。いくつかの態様において、ＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製およびウイルス粒子産生を促進するウイルスのタンパク質である。これらの遺伝子は欠失していないが、一方で、これらのタンパク質の有効濃度を増大させるために、これらのタンパク質をトランスでさらに提供することが望ましい場合がある。アウトプット分子として用いることができるＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質の非限定的な例として、以下が挙げられる：ＶＰ１６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８およびγ３４．５（ＩＣＰ３４．５）。

いくつかの態様において、アウトプット分子は、自然免疫応答の阻害剤である。例えば、アウトプット分子は、自然免疫応答の構成成分を標的とするＲＮＡｉ分子であってよい。「自然免疫応答」とは、自然免疫系による応答を指す。自然免疫系は、微生物中に存在する保存された分子パターンの認識のために、生殖細胞系列によりコードされる受容体（「パターン認識受容体」または「ＰＲＲ」）のセットを用いる。これらの分子パターンは、微生物の特定の構成要素において起こり、これは以下を含む：リポ多糖、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、ホスファチジルコリン、リポタンパク質を含む細菌特異的タンパク質、細菌ＤＮＡ、ウイルスの一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧ－ＤＮＡ、マンナンならびに多様な他の細菌および真菌の細胞壁構成成分。かかる分子パターンはまた、植物アルカロイドなどの他の分子においても起こり得る。これらの自然免疫認識の標的は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と称される。なぜならば、それらは、微生物により産生されるが、感染した宿主生物によっては産生されないからである。いくつかの態様において、本明細書において記載される組成物により引き起こされる自然免疫応答は、その後の刺激に対する自然免疫応答を増強することにより、広範囲の病原性微生物に対する異種性の（「非特異的な」）免疫を付与し、これは、例えばNeteaら（Trained Immunity: An Ancient Way of Remembering. Cell Host Microbe. 2017 Mar 8;21(3):297-300；これは、本明細書において参考として援用される）において記載されるような、自然記憶の一形態である「訓練された免疫（trained immunity）」として知られる現象である。

自然免疫系の受容体であって、ＰＡＭＰを認識するものは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）と称される（本明細書において参考として援用されるJaneway et al. (1989) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54: 1-13；Medzhitov et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 94: 4-9）。ＰＲＲは、構造が多様であり、いくつかの異なるタンパク質ファミリーに属する。これらの受容体のうちのいくつかは、ＰＡＭＰを直接的に認識し（例えば、ＣＤ１４、ＤＥＣ２０５、コレクチン）、一方、他のもの（例えば、補体受容体）は、ＰＡＭＰの認識により生じる生成物を認識する。これらの受容体ファミリーのメンバーは、一般に、３つの型に分けることができる：１）血漿中を循環する体液性受容体；２）免疫細胞表面上に発現するエンドサイトーシス性受容体、および３）細胞表面上または細胞内のいずれかにおいて発現されることができるシグナル伝達受容体（本明細書において参考として援用されるMedzhitov et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 94: 4-9；Fearon et al. (1996) Science 272: 50-3）。ＰＲＲの非限定的な例として、以下が挙げられる：ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ２）、ＮＯＤ１／２、ＲＩＧ－１／ＭＤＡ－５、Ｃ型レクチンおよびＳＴＩＮＧ。

細胞のＰＲＲは、適応免疫においてプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する細胞を含む、自然免疫系のエフェクター細胞上に発現される。かかるエフェクター細胞として、これらに限定されないが、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球および表面上皮が挙げられる。この発現プロフィールにより、自然エフェクター機構を直接的に誘導することが可能となり、およびまた、限定することなくケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカインおよび腫瘍壊死因子を含む炎症性サイトカインおよびケモカインなどの内因性シグナルのセットの発現を誘導することにより宿主生物に感染病原体の存在に対して注意を促すことも可能となる。この後者の機能により、侵入者と戦うエフェクター力の効率的な動態化が可能となる。

したがって、標的とすることができる自然免疫系の構成成分として、限定することなく、ＰＲＲ、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカインおよび腫瘍壊死因子が挙げられる。自然免疫系の構成成分の発現を阻害することは、自然免疫応答を（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く）弱める。

いくつかの態様において、自然免疫応答の阻害剤は、既知のウイルスのタンパク質であって、特定の感染性ウイルスの免疫回避において機能するものである。かかるタンパク質の１つの非限定的な例は、ワクシニアＢ１８Ｒタンパク質である。ＨＳＶ－１から発現される特定のｍｉＲＮＡはまた、自然免疫系を下方調節することが示されている。ウイルスの免疫回避において役割を果たす任意の既知のウイルスのタンパク質を、本開示に従って用いることができる（例えば、本明細書において参考として援用されるGarcia-Sastre et al., Cell Host & Microbe, VOLUME 22, ISSUE 2, P176-184, 2017において記載されるもの）。

本開示の他の側面は、本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターを含むパッケージング細胞を提供する。操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子は、パッケージング細胞においてパッケージングされる。ウイルス粒子のパッケージングのために、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、例えば遺伝子導入またはエレクトロポレーションなどの当業者に公知の任意の方法を介して、パッケージング細胞に送達される。いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、パッケージング細胞のゲノム中に組み込まれる（例えば、組み換えを介して）。

いくつかの態様において、パッケージング細胞は、それが、改変されたＨＳＶ－１ゲノムから欠失しているＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質、またはウイルスの複製およびウイルス粒子パッケージングを増強するＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質を、（例えば、一過性に、または構成的に）発現するように操作される。例えば、これらのＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを、操作されたＨＳＶ－１ベクターと共にコトランスフェクトすることができ、ＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質の発現を、誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。アウトプット分子として用いることができるＨＳＶ－１ウイルスのタンパク質の非限定的な例として、ＶＰ１６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、およびγ３４．５（ＩＣＰ３４．５）が挙げられる。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、それが、（例えば、一過性に、または構成的に）自然免疫応答の阻害剤を発現するように操作される。本明細書において記載されるかまたは当該分野において公知の自然免疫応答の阻害剤のうちの任意のものを用いることができる。

いくつかの態様において、パッケージング細胞は、少なくとも１つのプラーク形成単位（ｐｆｕ）のＨＳＶ－１ウイルス粒子を産生する。例えば、パッケージング細胞は、少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、またはそれより多いｐｆｕのＨＳＶ－１ウイルス粒子を産生してもよい。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、約１、約１０、約１００、約１０００、約１０^４、約１０^５、またはそれより多いｐｆｕのＨＳＶ－１ウイルス粒子を産生する。「約」とは、３％以内、例えば、３％多く、または３％少なくを意味する。

ウイルス粒子パッケージングのために好適な任意の細胞を、本開示のパッケージング細胞として用いてよい。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、真核細胞である。本発明に従う使用のための真核細胞の例として、限定することなく、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiae）および植物細胞が挙げられる。いくつかの態様において、真核細胞は、脊椎動物からのものである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、マウスまたはラットなどのげっ歯類からのものである。本開示に従う使用のための脊椎動物細胞の例として、限定することなく、精子、卵子および胚細胞を含む生殖細胞、ならびに腎臓、肝臓、脾臓、リンパ系、心臓、胃、腸、膵臓、筋肉、骨、神経、脳および上皮の細胞を含む非生殖細胞が挙げられる。胚性幹細胞を含む幹細胞もまた、用いることができる。典型的には、高いウイルス力価の産生のために、好ましくは、高い遺伝子導入効率および低い自然免疫応答を有する細胞株を用いるべきである。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－９６（商標））である。

本明細書において記載される操作されたＨＳＶ－１ベクターを含むか、または本明細書において記載されるパッケージング細胞により産生される操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子もまた提供される。操作されたＨＳＶ－１粒子は、多様な用途において、例えば遺伝子回路を細胞中に送達するために、および他の治療および診断の目的のために用いることができる。したがって、遺伝子回路を細胞中に送達する方法が提供され、該方法は、細胞を、本明細書において記載されるＨＳＶ－１ベクターまたは操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子と接触させることを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、遺伝子回路を含む。接触させることは、in vitro、in vivo、またはex vivoであってよい。細胞は、真核細胞であってよい。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。細胞は、ヒト対象から単離されたものであってよく、接触させることは、in vitroまたはex vivoでのものであってもよい。細胞は、ヒト対象であってよく、接触させることは、in vivoでのものである。

本開示の他の側面は、疾患を処置する方法を提供し、該方法は、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、治療用分子をコードする遺伝子回路を含む。疾患を診断する方法もまた提供され、該方法は、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、診断用分子をコードする遺伝子回路を含む。

いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子は、対象において免疫応答を誘導しないか、または、対象において天然のＨＳＶ－１粒子と比較してより低い免疫応答（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低い）を誘導する。免疫応答は、当該分野において公知の任意の方法により、例えば、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子に対する抗体力価を測定すること、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子を投与した後の対象におけるサイトカイン産生またはＴ細胞活性化を測定することにより、測定することができる。

いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１は、対象において細胞に感染し、遺伝子回路を対象における細胞に送達する。送達される遺伝子回路の型および対象における細胞の状態（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡプロフィールなどの遺伝子発現プロフィール）に依存して、アウトプット分子（例えば、診断用分子または治療用分子）が産生され得、これが、疾患の状態を示すか、または疾患を有する対象に治療を提供する。

いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子は、対象に投与するための組成物において処方されてもよい。いくつかの態様において、組成物は、医薬組成物である。いくつかの態様において、組成物は、さらなる剤（例えば、特異的送達、半減期を増大させるための、または他の治療剤）をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得るキャリアをさらに含む。用語「薬学的に許容し得る」とは、健全な医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、妥当な利益／リスク比と釣り合って、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用のために好適である、化合物、材料、組成物および／または投与形態を指す。「薬学的に許容し得るキャリア」は、対象の剤を１つの器官または体の部分から、別の器官または体の臓器に運搬または輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルである。各々のキャリアは、処方物の他の材料と適合性であるという意味において「許容し得る」ものでなければならない。

薬学的に許容し得るキャリアとして役立つことができる材料のいくつかの例として、限定することなく、以下が挙げられる：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの潤滑剤；（８）カカオバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油脂；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ペプチドおよびアミノ酸などの嵩高剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；（２４）エタノールなどのＣ２－Ｃ１２アルコール；ならびに（２５）医薬処方物において使用される他の非毒性の適合性の物質。湿潤化剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘未剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、処方物中に存在することができる。「賦形剤」、「キャリア」、「薬学的に許容し得るキャリア」などの用語は、本明細書において交換可能に用いられる。

「有効量」とは、単独で、または１つ以上の他の治療剤と組み合わせて、対象に対して治療効果を付与するために必要とされる、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子またはかかるものを含む組成物の量を指す。有効量は、当業者により認識されるように、処置されている特定の状態、状態の重篤度、年齢、身体的条件、サイズ、性別および体重を含む個々の対象のパラメーター、処置の期間、併用治療（あれば）の性質、投与の特定の経路、および健康管理者の知識及び専門知識の範囲内の類似の要因に依存して、変化する。これらの要因は、当業者に周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。個々の構成成分またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最も高い安全な用量が用いられることが、一般に好ましい。当業者により理解されるであろうが、対象は、医学的理由、心理学的理由または実質的に全ての他の理由のために、より低い用量または耐容可能な用量を主張する場合がある。

半減期などの経験的考察は、一般に、投与量の決定に寄与するであろう。投与の頻度は、治療の経過にわたり決定され、調整され得、一般に、必ずしもではないが、障害の処置、および／または抑制、および／または寛解、および／または遅延に基づく。あるいは、剤の持続的な連続放出処方物が適切である場合がある。持続放出を達成するための多様な処方物およびデバイスは、当該分野において公知である。

操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子またはかかるものを含む組成物の有効量は、対象に繰り返し（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれより多く）投与してもよい。いくつかの態様において、投与量は、毎日、１日おき、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回である。いくつかの態様において、投与頻度は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、または１か月に１回、２か月に１回、もしくは３か月に１回、またはそれより長い周期である。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。投与レジメン（用いられる剤を含む）は、経時的に変化し得る。

いくつかの態様において、通常の体重の成人の対象について、約０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与してもよい。いくつかの態様において、用量は、１～２００ｍｇである。特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の対象およびその対象の病歴、ならびに剤の特性（剤の半減期など、および当該分野において周知の他の考慮点）に依存するであろう。

本開示の目的のために、本明細書において記載されるような操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子またはかかるものを含む組成物の適切な投与量は、使用される特定の剤（またはその組成物）、処方、および投与の経路、障害の型および重篤度、先の治療、対象の臨床歴および剤に対する応答、ならびに主治医の慎重さに依存するであろう。典型的には、医師は、所望される結果を達成する投与量に到達するまで、剤を投与するであろう。投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、および熟練した医師に公知の他の要因に依存して、連続的であっても間欠的であってもよい。剤の投与は、予め選択された期間にわたり、本質的に連続的であってよく、または、一連の間隔を空けた用量、例えば、障害を発症する前、その間、またはその後のいずれかであってもよい。

「対象」とは、ヒト、ならびに非ヒト動物、例えば類人猿、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、げっ歯類（例えば、ラットおよびマウス）を指す。一態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、実験動物または疾患モデルとしての動物置換物である。「それを必要とする対象」とは、疾患または障害（例えばがん）を有するかまたはそのリスクがある対象を指す。

操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子またはかかるものを含む組成物は、当該分野において公知の任意のin vivoの送達方法により、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に送達してもよい。例えば、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子またはかかるものを含む組成物は、静脈内で送達されてもよい。いくつかの態様において、操作された核酸は、送達ビヒクル（例えば、非リポソーム性ナノ粒子またはリポソーム）中で送達される。いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子またはかかるものを含む組成物は、がんまたは他の疾患を有する対象に、全身で送達され、対象の癌細胞または疾患細胞において特異的に治療用分子を産生する。いくつかの態様において、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子またはかかるものを含む組成物は、疾患または障害の部位（例えば、がんの部位）に局所的に送達される。

本明細書において記載される組成物および方法を用いて、多様な疾患を処置することができる。いくつかの態様において、疾患は、遺伝子治療により処置することができる疾患である。当業者は、かかる疾患に精通している。いくつかの態様において、疾患は、がんである。いくつかの態様において、疾患は、悪液質である。

本明細書において記載される組成物および方法を用いて処置することができるがんの非限定的な例として、前悪性新生物、悪性腫瘍、転移、または癌性または前癌性であると考えられるような、制御されない細胞増殖により特徴づけられる任意の疾患または障害が挙げられる。がんは、原発性がんであっても転移性がんであってもよい。がんとして、これらに限定されないが、以下が挙げられる：眼の癌、胆管癌、膀胱癌、胸膜癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、髄膜癌、腎臓癌、神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌（gastric cancer）、急性リンパ球性および骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫を含む血液腫瘍、ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内腫瘍、肝臓癌、肺癌、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽腫、扁平上皮癌を含む口腔癌、上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫、メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む皮膚癌、セミノーマ、非セミノーマ、奇形腫、絨毛癌、間質性腫瘍および生殖細胞腫瘍などの胚性腫瘍を含む精巣癌、甲状腺の腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌、ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌。一般的に遭遇するがんとして、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および脳癌が挙げられる。いくつかの態様において、腫瘍は、メラノーマ、細胞腫、肉腫、またはリンパ腫である。いくつかの態様において、がんは、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、前立腺癌または肺癌である。

例
ウイルス剤は、多くの治療的およびバイオテクノロジー的用途を有する。古典的な分子生物学技術は、治療用遺伝子送達、安全性の増大、および標的細胞への向性のための改変を導入することにより、ウイルスの有用性を拡大してきた。今日まで、アデノウイルス、ワクシニア、およびヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）に基づく改変されたウイルスが、ヒトにおける使用のために承認されている。

しかし、複雑な遺伝子回路の送達は、なお課題である。本明細書において記載されるのは、大きな（例えば１００ｋｂまでの）複雑な遺伝子回路のin vitroおよびin vivoの両方での送達のために好適な、操作された単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）ベクターである。送達プラットフォームは、標準化された遺伝子エレメントのライブラリー、ならびにプロトタイプの迅速なモジュラー構築のための効率的な分子生物学方法に基づくワークフローを利用するように設計された。ライブラリーは、治療用遺伝子、転写制御のためのプロモーターおよびリプレッサー、インスレーター、ポリＡ配列、ならびに構成的または条件的な遺伝子発現を行うことができる転写単位の構築のためのバイオセンサー（ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび環境感受性プロモーターを含む）を含む。回路は、論理に基づくアウトプットの制御を達成するために、転写調節の多層カスケードと共に、複数の転写単位をプラットフォーム中に組み込むことにより構築される。本明細書において示されるように、４つのｍｉＲＮＡ（１つは高く３つは低い）を感知することができ、情報を処理し、条件的にアウトプットを発現することができる、複数のｍｉＲＮＡインプット分類子が、操作されたＨＳＶ－１ベクターを用いて首尾よく送達された。

例１．操作されたＨＳＶ－１ベクター
ＨＳＶ－１タンパク質は、操作されたプロモーターにおいて用いられるいくつかの最小プロモーターのうちの１つである最小ＣＭＶプロモーターを上方調節することが知られている（例えば、本明細書において参考として援用されるHerrlinger et al., J Gene Med. 2000 Sep-Oct;2(5):379-89において記載されるとおりである）。ＨＳＶ－１タンパク質はまた、細胞死を引き起こすことが知られている。より低い回路の干渉およびより低い毒性を有する変異体を同定するために、ＨＳＶ－１欠失変異体を作製した。ＨＳＶ－１株Ｆ、１７およびＫＯＳを研究のために用いた。選択されたＨＳＶ－１株のゲノムを、細菌人工染色体（ＢＡＣ）中にクローニングして、ラムダレッド組み換えにより改変した。それらの複製効率を、プロトタイプのパッケージング細胞株において測定した。最上の候補を選択し、回路の挙動ならびに毒性を特徴づけるために、識別子回路を組み込んだ。

表２．ＨＳＶ－１バリアントのリスト（４１バリアント、株Ｆバリアントはここには列記されない）

ＭＤ４１７のヌクレオチド配列（配列番号１）

例２．パッケージング細胞株
操作されたＨＳＶ－１を高力価で産生させるために、欠失したウイルス遺伝子を補完して複製を支持することができるパッケージング細胞株を構築した。ウイルス遺伝子は、細胞にとって毒性であり得、したがって、それらの発現を、ウイルス粒子産生の間、ドキシサイクリンの制御下に置いた。パッケージング細胞株を構築するために、Ｕ２ＯＳ細胞株を用いた。なぜならば、それらは、天然に、ＶＰ１６およびＩＣＰ０をある程度まで補完することができ（例えば、本明細書において参考として援用されるYao et al., Journal of Virology. 1995;69(10):6249-6258において記載されるとおりである）、ＩＣＰ２７の構成的発現に耐えることができるからである。

例３．迅速な標準化された回路のアセンブリーおよびＨＳＶ－１骨格中への組み込み
迅速な標準化された回路のアセンブリーおよびＨＳＶ－１骨格中への組み込みを、図３において表す。インスレーター、プロモーター、５’ＵＴＲ、遺伝子、３’ＵＴＲ、およびポリＡを含む個々の部分は、ＢｓａＩを用いるＭｏＣｌｏ反応により、位置ベクター（position vector）と共に転写単位へと組み立てられる。異なる位置ベクターにおけるこれらの転写単位を、次いで、Gibsonアセンブリー反応により、キャリアおよびアダプター骨格と共に回路へと組み立てる。温度感受性プロモーター下においてインテグラーゼをコードするヘルパープラスミドを用いて、この回路を、ゲノム上のランディングパッドと共に、ＨＳＶ－１骨格中に組み込む。温度感受性プロモーター下においてＦｌｐをコードするヘルパープラスミドを用いて、Ｆｌｐにより組み込みマーカーを取り除く。回路ＨＳＶ－１のＤＮＡを、次いで精製し、Ｃｒｅを発現するプラスミドと共にパッケージング細胞中にコトランスフェクトして、感染性回路ＨＳＶ－１を再構築する。再構築された回路ＨＳＶ－１を力価測定し、例４において記載されるように、分類されたＨＳＶ－１の複製のin vivoでの特徴づけのためにマウスモデル中に注射する。

例４．分類されたＨＳＶ－１の複製のin vivoでの特徴づけ
適用のうちの１つは、ウイルスにより送達される多段階にプログラムされた癌免疫治療である（図４）。プログラムされた治療用ウイルスを、腫瘍内注射を介して原発腫瘍中に注射する。ウイルスを、選択的に複製し、腫瘍細胞においてのみ拡散させ、腫瘍細胞の初期死と、その後の免疫系の動員を引き起こす。残りの腫瘍細胞は、免疫系により取り除かれる。
条件的に複製されるＨＳＶ－１の性能を研究するために、５つのマウスの群に対して実験を行った。ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）を発現する１０，０００個の４Ｔ１細胞を、マウスの乳房脂肪体中に移植し、７日後にウイルスを注射した。５群のマウスの各々に、ＰＢＳのみ（処置なし、群１）、非複製性ウイルス（群２）、構成的に複製するウイルス（群３）、条件的に複製するウイルス（群４）、または条件的に複製するウイルスおよびＩＬ－１２（群５）を注射した。Ｆｌｕｃをイメージングすることにより、注射後１５日間にわたり腫瘍サイズをモニタリングした（図５Ａ）。生存曲線は、条件的に複製するウイルスにより処置された群が、他の群よりも長く生存したことを示す（図５Ｂ）。
興味深いことに、条件的に複製するウイルスおよびＩＬ－１２により処置された群は、条件的に複製するウイルスにより処置された群よりも短く生存した。異なる時点において血液および流入領域リンパ節におけるＦｌｕｃシグナルを検出することにより、転移を測定した（図５Ｃ）。血液転移は、マウスの早い時期の死亡と相関した。流入領域リンパ節の転移は、中間の時点における死亡と逆相関した。条件的に複製する処置は、より低い血液および流入領域リンパ節の転移をもたらした。

方法及び材料
表３．ヘルパープラスミド

表４：ＨＳＶ－１改変のために用いられたオリゴ

哺乳動物細胞培養物
ＨＥＫ２９３細胞株は、Invitrogenから購入した。ＶｅｒｏおよびＵ２ＯＳ細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。Ｖｅｒｏ ２－２細胞株は、Massachusetts General HospitalにおけるXandra Breakfield研究室から得た。ＨＥＫ２９３、ＶｅｒｏおよびＶｅｒｏ ２－２細胞株は、１０％ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Cellgro）中で、３７℃、１００％の湿度および５％のＣＯ_２で維持した。Ｕ２ＯＳ細胞株は、１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ中で、３７℃、１００％の湿度および５％のＣＯ_２で維持した。パッケージング細胞株は、１０％、０．５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン、および１ｕｇ／ｍＬのブラストサイジンを補充したマッコイ５Ａ中で、３７℃、１００％の湿度および５％のＣＯ_２で維持した。

ＨＳＶ－１ゲノムのマーカーレス改変：マーカーレス改変カセットの調製
ＨＳＶ－１ゲノムの選択された標的領域を欠失させるために、約５００ｂｐの相同性領域と、その後に続くカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびＩ－ＳｅｃＩにより誘導されるＤＳＢにより媒介されるＤＮＡ修復のためのＩ－ＳｃｅＩ認識部位、またはａｔｔＰと、その後に続くスペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳｐｅｃＲ）およびセリンインテグラーゼにより媒介されるＤＮＡの切り出しのためのコグネートなａｔｔＢ部位を含む、ヘルパープラスミドを構築した。挿入のために、目的のＤＮＡ配列を、５００ｂｐの相同性領域またはａｔｔＰ部位の前に配置した。ヘルパープラスミド上のこれらの領域を、標的領域に対して５０ｂｐの相同性領域を有するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。フラグメントを、ゲル電気泳動とその後のカラム精製（Zymo Research, USA）により精製した。精製したＰＣＲ生成物を、次いでＤｐｎＩ（New England BioLabs, USA）で消化し、カラム精製によりさらに精製した。

ＨＳＶ－１ゲノムのマーカーレス改変：エレクトロコンピーテント細胞の調製
エレクトロコンピーテント細胞の調製のために、ｐＲＥＤＩおよびＨＳＶ－１ ＢＡＣを保有するE. coli ＤＨ１０Ｂ細胞のコロニーを播種して、カルベニシリン（Ｃａｒｂ、５０ｕｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（Ｃｍ、１２．５ｕｇ／ｍＬ）を補充した３ｍｌのＬＢ培地中で一晩３０℃で増殖させた。翌日、一晩培養物を、１０ｍＬのＬＢ培地中で３０倍に希釈し、３０℃で増殖させた。３時間後、２００μＬの１６％アラビノース、およびさらに１時間にわたり増殖させた。細胞を、４０００ｇでの１０分間にわたる遠心分離により採取し、氷冷１０％グリセロールで３回洗浄した。

ＨＳＶ－１ゲノムのマーカーレス改変：インサートの形質転換
ＨＳＶ－１ゲノムのターゲティングされた領域の置き換えのために、調製されたマーカーレス改変カセット（４００ｎｇ）で、５０μｌの調製されたエレクトロコンピーテント細胞を電気的に形質転換した。電気的に形質転換されたE. coli細胞を、１ｍｌのＳＯＣ培地中で、３０℃で３時間にわたりインキュベートし、Ｉ－ＳｅｃＩにより誘導されるＤＳＢにより媒介されるＤＮＡ修復のためのＣａｒｂ、ＣｍおよびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）、またはセリンインテグラーゼにより媒介されるＤＮＡの切り出しのためのＣｍおよびＳｐｅｃ（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上に広げ、３０℃でさらなる１６時間にわたりインキュベートした。マーカーレス欠失カセットによる標的ゲノム領域の正確な置き換えを、ターゲティングされた領域のエンドポイントを挟む一対のプライマーおよびターゲティングされた領域内に存在する遺伝子に対して特異的な一対のプライマーを用いたＰＣＲにより検証した。

ＨＳＶ－１ゲノムのマーカーレス改変：Ｉ－ＳｃｅＩにより誘導される二本鎖の切断により媒介されるＤＮＡ修復を用いた選択マーカーの除去
上記のようにゲノム中に導入された選択マーカー（ＫａｎＲ＿Ｉ－ＳｃｅＩ）を、次いで、ｐＲＥＤＩから発現されるＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼにより媒介されるＤＳＢ修復により、ＨＳＶ－１ゲノムから切り出した。簡単に述べると、E. coli細胞を、３０℃で、ＣａｒｂおよびＣｍを含む３ｍｌのＬＢ液体培地中で、ＯＤ_６００＝０．４まで増殖させ、次いで、Ｃａｒｂ、Ｃｍおよび１０ｍＭのラムノースを含む３ｍｌのフレッシュなＬＢ液体培地中で３０倍に希釈し、３０℃でＯＤ_６００＝０．４まで増殖させた。３０倍希釈による５回の連続培養の後で、細胞を、Ｃａｒｂ、Ｃｍおよび１０ｍＭのラムノースを含むＬＢプレート上に播種した。次いで、マーカーレス改変変異体（Ｃａｒｂ耐性およびＣｍ耐性であり、Ｋａｎ感受性であるコロニー）を選択した。選択マーカーの切り出しは、ゲノム標的領域のエンドポイントを挟む一対の特異的プライマーを用いたＰＣＲとその後の配列決定により検証した。所望される場合、E. coliを４２℃で一晩Ｃａｒｂなしで増殖させることにより、ｐＲＥＤＩを取り除いた。

ＨＳＶ－１ゲノムのマーカーレス改変：セリンインテグラーゼにより媒介されるＤＮＡの切り出しを用いた選択マーカーの除去
上記のようにゲノム中に導入された選択マーカー（ａｔｔＰ＿ＳｐｅｃＲ＿ａｔｔＢ）を、次いで、セリンインテグラーゼにより媒介されるＤＮＡの切り出しにより、ＨＳＶ－１ゲノムから切り出した。簡単に述べると、E. coli細胞をコグネートなヘルパープラスミドにより形質転換し、ＣａｒｂおよびＣｍを補充したＬＢ寒天プレート上に播種した。コロニーを、次いで播種し、ＣａｒｂおよびＣｍを含む３ｍｌのＬＢ液体培地中で、次いで６０μＬの１６％アラビノースを補充して、３０℃でＯＤ_６００＝０．４まで増殖させた。アラビノースを含む３０倍希釈による１回以上の連続培養の後で、細胞を、Ｃｍを含むＬＢプレート上に播種し、４２℃でさらなる１６時間にわたりインキュベートした。次いで、マーカーレス改変変異体（Ｃｍ耐性でありＳｐｅｃ感受性であるコロニー）を選択した。選択マーカーの切り出しは、ゲノム標的領域のエンドポイントを挟む一対の特異的プライマーを用いたＰＣＲとその後の配列決定により検証した。

迅速な回路のアセンブリー：転写単位（ＴＵ）への部分のアセンブリー
部分をＴＵへと組み立てるために、ゴールデンゲートアセンブリー反応を用いた。簡単に述べると、１μｌのＢｓａＩ（New England BioLabs, USA）、０．５μｌのＴ４リガーゼ（New England BioLabs, USA）、０．５μｌのＴ４リガーゼバッファー（New England BioLabs, USA）、２μｌの１０×ＢＳＡ（NEB）、４０ｆｍｏｌの骨格、アダプター、ＴＵ、および２０μｌの最終合計容積までのｄｄＨ_２Ｏを、ＰＣＲチューブ中に入れた。全てのアセンブリーのために用いられたサーモサイクラープログラムは、以下の通りであった：１ステップの３７℃で１５分間；次いで５０サイクルの３７℃で２分間、次いで１６℃で５分間；１ステップの３７℃で１５分間、１ステップの６０℃で２０分間、１ステップの５０℃で５分間、および１回の最終ステップの８０℃で５分間。１．５μＬの反応を、６μＬのStellarケミカルコンピーテント細胞（Takara Bio USA, USA）中に形質転換し、６０μＬのＳＯＣ（New England BioLabs, USA）中でレスキューし、そのうちの３０μＬを、Ｃａｒｂを補充したＬＢ寒天プレート上に播種し、その後３７℃で一晩インキュベートした。制限酵素消化マッピングにより、正確なクローンを確認した。

迅速な回路のアセンブリー：ＴＵの回路へのアセンブリー
ＴＵを回路に組み立てるために、Gibsonアセンブリー反応を製造者のプロトコルに従って用いた（SGI-DNA, USA）。１μＬの反応を、TransforMax（商標）EC100D（商標）pir+ Electrocompetent E. coli（Epicentre, USA）中に電気穿孔した。それを、次いで、１ｍＬのＳＯＣ（New England BioLabs, USA）中で３７℃で１時間にわたりレスキューした。そのうちの３０μＬを、ＫａｎおよびＳｐｅｃを補充したＬＢ寒天プレート上に播種し、３０℃で一晩インキュベートした。制限酵素消化マッピングにより、正確なクローンを確認した。

セリンインテグラーゼ媒介ＤＮＡ挿入を用いるＨＳＶ－１ゲノム中への迅速な回路組み込み
ＨＳＶ－１ゲノム中への回路の組み込みのために、ＨＳＶ－１ ＢＡＣを保有するE. coli ＤＨ１０Ｂ細胞をヘルパープラスミドで形質転換し、形質転換体を、ＣａｒｂおよびＣｍを補充したＬＢ寒天プレート上に播種し、３０℃で一晩インキュベートした。その後、目的の回路を、ヘルパープラスミドおよびＨＳＶ－１ ＢＡＣを保有するE. coli ＤＨ１０Ｂ細胞中に電気穿孔し、Ｃａｒｂ、Ｃｍ、ＫａｎおよびＳｐｅｃと共にＬＢ寒天プレート上に播種し、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーを、Ｃｍ、ＫａｎおよびＳｐｅｃを補充したＬＢ液体培地中に播種し、４２℃で２０分間、その後３７℃で一晩インキュベートした。一晩培養物を、Ｃｍ、ＫａｎおよびＳｐｅｃを補充したＬＢ寒天上で再画線し、４２℃で一晩インキュベートした。コロニーを、Ｃｍ、ＫａｎおよびＳｐｅｃを補充したＬＢ液体培地中に播種し、ＢＡＣ ＤＮＡを、パッケージング細胞株において再構成するために精製した。

パッケージング細胞株の迅速な構築：レンチウイルス形質導入によるＵ２ＯＳゲノム中へのランディングパッドの組み込み
gateway系を用いて、組み込みベクターを構築した。レンチウイルスgatewayデスティネーションベクターは、pFUGW (1)（Addgene）骨格およびgatewayカセット（ａｔｔＲ４およびａｔｔＲ２組み換え部位に挟まれたクロラムフェニコール耐性およびｃｃｄＢ遺伝子を含む）と、それに続く構成的に発現されるブラストサイジンまたはピューロマイシン耐性マーカーを含む。デスティネーションベクターと、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１ａ）プロモーターおよびｍＫａｔｅ２またはＥＢＦＰ２のいずれかの蛍光タンパク質を担持するエントリーベクターとのＬＲ反応を用いて、以下の発現ベクターを作製した：pLV-mKate2-PuromycinおよびpLV-EBFP2-Blasticidin。

レンチウイルス粒子の産生のために、３ｍＬのＤＭＥＭ完全培地中の約２×１０^６個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Invitrogen）を、ゼラチンコートされた６０ｍｍディッシュ（Corning Incorporated）中に播種した。３時間後、約８０％コンフルエントの細胞を、先に記載されるように（１）Attractene試薬（Qiagen）を製造者のプロトコルに従って用いて、pLV-hEF1a-attP_BxB1-EYFP-2A-Hygroベクター、パッケージングプラスミドpCMV-dR8.2（Addgene）およびエンベローププラスミドpCMV-VSV-G（Addgene）でコトランスフェクトした。遺伝子導入されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞から産生されたウイルス粒子を含む培地を、トランスフェクションの約４８時間後に収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通してろ過した。１のＭＯＩを、感染の直前に播種された６ウェルプレート中の約５０％コンフルエントなＵ２ＯＳ細胞に加えた。４８時間後、培地を交換し、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（InvivoGen）を補充した。細胞を、２週間にわたり選択下で維持した。

パッケージング細胞株の迅速な構築：ＢｘＢ１により媒介される回路の組み込み
回路を組み込むために、３７５ｎｇの回路プラスミドを、３７５ｎｇのｐＴＵ１ ＢｘＢ１ｏと共に、attractene（Qiagen）を用いて、６ウェルフォーマットにおいてコトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を、６ウェルプレートの０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンおよび２μｇ／ｍＬのブラストサイジン（InvivoGen）を補充した培養培地に移した。細胞を、２週間にわたり選択下で維持した。

スモールスケール再構成およびＨＳＶ－１：：Ｃｉｒｃｕｉｔの収集
コンフルエントな１０ｃｍプレートのＵ２ＯＳ：：ｐＢｊｈ３７２１を、２ｍＬの０．２５％トリプシンでトリプシン処理し、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充した１０ｍＬのフレッシュな完全培地で中和した。そのうちの２ｍＬのを、６ウェルプレート中に分取した。細胞を落ち着かせるために少なくとも３０分間にわたり３７℃でインキュベートする一方で、２ｍＬの微量遠心分離管中で３３０８．８ｎｇのＨＳＶ－１ ＢＡＣ、２２０．６ｎｇのＣＡＧ－Ｃｒｅ、および２２０．６ｎｇのＣＡＧ－Ｆｌｐｅを１００μＬのOptimemと混合することにより、ＤＮＡ：Ｖｉａｆｅｃｔ複合体を調製した。必ずOptimemを室温まで加温すること。Optimemはピンク色であるべきではない。そうである場合は、それは遺伝子導入効率を著しく低下させるであろう。３０μＬのOptimemをＤＮＡに添加し、混合物を、３回の短いパルスでボルテックスした（５０μＬ未満の容積は、良好にボルテックスすることが困難な場合がある）。ＤＮＡの総容積は、Optimemの１０％を超えるべきではない。２．２５μＬのviafect（使用前によくボルテックスする）を添加し、混合物をすぐに３回の短いパルスでボルテックスし、５分間にわたり室温でインキュベートし、調製された２４ウェルプレートに滴加した。２４ウェルプレートをよく振盪し、インキュベーターに戻した。２日後に、明視野下において３～１０細胞から構成されるプラークが可視され、それは、蛍光を示しても示さなくともよい。細胞は、ｄｏｘによりＥＹＦＰを発現しているべきである。

ＨＳＶ－１のin vitroでの特徴づけ
ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いるランディングパッドの組み込み。pLanding_Padベクターを作製するために、ＺＦＮ切断部位の左側のＡＡＶＳ１配列に対して相同な８００ｂｐの配列を、p_TU1位置ベクター中にクローニングした。ＺＦＮ切断部位の右側のＡＡＶＳ１配列に対して相同な８００ｂｐの配列を、p_TU3位置ベクター中にクローニングした。以下の転写単位を、p_InsulatorからのダブルｃＨＳ４コアインスレーター、p_PromoterからのＵｂｃプロモーター、p_5’UTRからのａｔｔＰ ＢｘＢ１、p_GeneからのＥＹＦＰ－２Ａ－ＨｙｇｒｏＲ、p_3’UTRからの不活性な３’ＵＴＲ、および合成ポリアデニル化シグナル、ならびにp_polyAからのダブルｃＨＳ４コアインスレーターの別のコピーを含むゴールデンゲート反応により、p_TU2位置ベクターに組み立てた。３つの検証された位置ベクターを、次いで一緒にシャトルベクターに組み立て、ｃｒｔ ｒｅｄオペロンカセットを欠失させた。

ジンクフィンガーヌクレアーゼベクター、pLV_CAG_CN-2A-CNを作製するために、２Ａタグにより分けられたＡＡＶＳ１遺伝子座^１８についての２つのジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするｃＤＮＡを合成し（GeneArt, Regensburg, Germany）、ａｔｔＢ１／ａｔｔＢ２タグと共にプライマーｏＰＧ６０８ｂ／ｏＰＧ６０９ｂを用いてＰＣＲ増幅した。ゲル抽出の後で、ＰＣＲ産物を、BP clonase（Life Technologies, Carlsbad CA）を用いてpENTR_L1_L2ベクター中に組み換え、pENTR_L1_CN-2A-CN_L2ベクターを得た。次のステップにおいて、pENTR_L1_CN-2A-CN_L2およびpENTR_L1_CAG_L2を、LR clonase II plus（Life Technologies, Carlsbad CA）を用いてpLV_R4R2_GTWに組み替えて、pLV_CAG_CN-2A-CNを生じた。

ランディングパッドをＡＡＶＳ１遺伝子座中に組み込むために、細胞に、等モル量のジンクフィンガーヌクレアーゼベクターpLV_CAG_CN-2A-CNおよび等モル量のpLanding_padベクターをコトランスフェクトした。ポリクローナルの生存する集団の連続希釈により、クローンを作製した。遺伝子導入の７２時間後に、細胞培養培地に、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Invivogen）を補充し、２週間にわたり選択を維持した。生存する集団の連続希釈により、クローン細胞株を作製した。

二重ルシフェラーゼアッセイ。二重ルシフェラーゼアッセイを、製造者の指示に従って行った（Promega、cat# N1610、改変プロトコルを以下に列記する）
目的の細胞を、白壁、透明底の組織培養プレート（corning cat# xxx）に播種して、８０～１００％の密度を達成する。
細胞に、ＨＳＶ－１対照（ＫＯＳ－ＬＢもしくは１７－ＬＢ）または回路ウイルスを、１００μＬの合計容積の培地中で感染させる。好ましくは、各々のウイルスの連続タイトレーションを行って、可視的に検出可能な（Evos蛍光顕微鏡）ウイルスのプラークを有する少なくともいくつかの希釈点を達成する。定温インキュベーター中で、少なくとも２４時間にわたり、または１週間まで、感染を進行させた。可視的に同定可能なプラークを有する希釈ウェルを記述した。プレートを、次いで室温まで平衡化し、ルシフェラーゼ活性を測定した。

培養培地の容積と等しい容積のONE-Glo（商標）EX試薬を、ウェルに添加した。混合物を、少なくとも３分間にわたり、好ましくはオービタルシェイカー（３００～６００ｒｐｍ）上でインキュベートした。適切な取得時間（通常約１秒間）で蛍光を測定し、線形の検出の範囲においてシグナルを得てこれを収集した。
NanoLuc（登録商標）ルシフェラーゼ活性を測定するために、元の培養容積と等しい容積のNanoDLR（商標）Stop＆Glo（登録商標）試薬を各々のウェルに添加し、よく混合した。好ましくはオービタルシェイカー上で６００～９００ｒｐｍで少なくとも３分間にわたり、または上下に２回ピペッティングすることにより混合する。少なくとも１０分間（混合時間を含む）の後、適切な取得時間（通常約１秒間）でNanoLuc（登録商標）発光を測定し、線形の検出の範囲においてシグナルを得てこれを収集した。

腫瘍担持マウスへの遺伝子回路をコードする操作されたウイルスの送達
麻酔された（１～４％のイソフルラン吸入）メスＢａｌｂ／Ｃマウス（６～８週齢）に、第４乳房脂肪体（臀部および鼠径リンパ節に最も近いもの）において１０^５個の４Ｔ１乳癌細胞を播種する。注射の前に、Betadineに浸漬した綿のチップアプリケーターを用いて、部位を調製する。注射部位を、Betadineに浸漬したいくつかのフレッシュな綿のチップで、合計５分間の擦り洗い時間にわたり、円形のパターンで（中心から外側へ）擦り洗いする。最後に、部位を、７０％のイソプロピルアルコールに浸漬したガーゼ３×３ｓでリンスし、注射を送達する。

腫瘍担持マウスを麻酔し（１～４％のイソフルラン吸入）、１ｘ１０^７ｐｆｕの操作されたウイルスを注射する。注射部位の外科的皮膚調製（交互にBetadineおよびアルコールによる擦り洗い）の後で、腫瘍内、皮下、腹腔内または静脈内（後眼窩または尾静脈）注射によりウイルスを導入する。この処置は、４８時間の間隔を空けて３回まで繰り返されるであろう。

さらなる抗癌タンパク質または回路の構成成分をコードするネイキッド核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、ウイルス粒子と同時に、または時間的遅延の後で、送達される。本明細書において記載されるウイルス粒子は、ウイルスゲノム内のビルレンス因子の欠失を通して弱毒化される。ネイキッド核酸は、いかなるウイルスの配列をも含まない。遺伝子治療用ベクター（１０～５０μｇ）は、筋肉内および／または腫瘍内で、７２時間の間隔を空けて５回まで送達される（Huang et al, Cancer Research (2002) 62:5727-5735）。いくつかの例において、遺伝子治療用ベクターの送達を増強するために、エレクトロポレーションを用いる。麻酔（１～４％のイソフルラン吸入）の後で、注射部位から体毛を除去する（剃毛により、またはNair脱毛クリームを用いて）。エレクトロポレーション部位は、Betadineに浸漬した綿のチップアプリケーターを用いて調製する。部位を、Betadineに浸漬したいくつかのフレッシュな綿のチップで、合計５分間の擦り洗い時間にわたり、円形のパターンで（中心から外側へ）擦り洗いする。最後に、部位を、７０％のイソプロピルアルコールに浸漬したガーゼ３×３ｓでリンスする。次に、Harvard Apparatus 2- Needle Array（ECM 830）を、２～５ｍｍの深度まで（腫瘍または筋肉のサイズに依存して）挿入して、核酸注射部位を取り囲む。組織を、エレクトロポレーションに供する（２００Ｖ／ｃｍを６０ミリ秒間の期間、１００ミリ秒間の遅延、その後、BTX Caliper電極システムを用いて１秒間の２００Ｖ／ｃｍのパルスを６０ミリ秒間の期間）（Nature Materials 12; 367-376 (2013)）。

ウイルスの注射の後で、マウスを２４時間ごとに苦痛の徴候についてモニタリングする。明白な体重減少（仙腸関節（sacroileac）ボディスコア＜２）、または呼吸困難、活動、採餌またはグルーミング行動の減少を示した場合には、マウスを安楽死させる。
ウイルスおよび／または４Ｔ１細胞は、ルシフェラーゼレポーターを担持するので、Caliper Spectrum IVIS工学イメージングシステムを用いて、１セットのマウスに対して長期データを収集する（したがって、用いられるマウスの全体数を減少させる）ことができる。ウイルスの投与の後で、１日あたり２回まで４日間にわたり、または１日あたり１回まで９日間にわたり、または１週間あたり１～３回、３か月間まで、発光をモニタリングする。生物発光イメージングの前に、動物に麻酔し（１～４％のイソフルラン吸入）、飽和用量のルシフェリン（１６５ｍｇ／ｋｇ）を与える。ルシフェリン（無菌ＰＢＳ中１６．５ｍｇ／ｍＬ）を、マウスの体重に従って（マウスの体重１ｇあたり１０μｌのルシフェリン；例えば、２０ｇのマウスは、２００μＬを得る）、頸の項部に皮下注射する。Koch研究所におけるXenogen生物発光および蛍光キャビネットにおいて、マウス全体のイメージングを行う。

必要である場合、免疫応答をモニタリングするための毎週の採血のために、顎下の方法または伏在静脈（麻酔なし）を利用する。より頻繁な少量の血液の採集が必要とされる場合、それは、１日あたり２回まで、伏在静脈から、５日間までにわたり採集される。１週間あたりの採集される血液の合計量は、合計血液容積の＜７．５％（例えば、２０ｇのマウスについては１週間あたり１００μＬ）、または、採血が２週間の間隔を空けて行われる場合には、合計血液容積の＜１５％である。血液試料は、細胞性（フローサイトメトリーを用いて）または体液性（ＥＬＩＳＡアッセイにより）の免疫応答についてアッセイすることができる。

マウスが安楽死を必要とする基準に合致した場合、ルシフェラーゼシグナルが低下した場合、または３か月後のいずれか早い方に、剖検を行う。腫瘍、脳、眼、筋肉、肺、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腸および骨髄を含む多様な臓器を、採取して、施設から持ち去り、フローサイトメトリー（Weiss研究室において、またはKoch研究所のＦＡＣＳコア施設において）、またはKoch研究所組織学研究室において組織学により分析することができる。これらの試料は、動物施設においてまたはWeiss研究室においてバイオセーフティーフードにおいて、４％パラホルムアルデヒド中で固定してウイルスを不活化する。残りの組織および／または遺体は、焼却のためにバッグに入れ、Koch動物施設における遺体保冷庫に預ける。

健康なマウスへの遺伝子回路をコードする操作されたウイルスの送達
腫瘍は局所および全身の免疫を調節し、ウイルス粒子は抗ウイルスの免疫応答を誘発するので、健康な腫瘍を担持しないマウスにおけるウイルスによりコードされる抗がん回路の感染性、残留性および分布を特徴づけることは、有用であり得る。このシナリオにおいて、健康なマウスに麻酔し（１～４％のイソフルラン吸入）、ウイルスの送達の経路のために適切な外科的な皮膚調製に供し、１ｘ１０^７ｐｆｕまでの操作されたウイルスで処置する。ウイルスの導入の後で、上記のように手順を行う。

いくつかの例において、注射部位の外科的な皮膚調製（交互にBetadineおよびアルコールによる擦り洗い）の後で、皮下、腹腔内または静脈内（後眼窩または尾静脈）注射により、ウイルスを導入することができる。いくつかの例において、閉じた眼の領域の無菌ＰＢＳによるふき取りの後で、角膜乱刺によりウイルスを導入する。いくつかの例において、注射部位の外科的な皮膚調製（交互にBetadineおよびアルコールによる擦り洗い）の後で、in vitroで操作されたウイルスを予め感染させた１×１０^６までのマウス初代細胞（脾細胞またはリンパ節細胞）を、皮下、腹腔内または静脈内（後眼窩または尾静脈）注射により導入する。いくつかの例において、注射部位の外科的な皮膚調製（交互にBetadineおよびアルコールによる擦り洗い）の後で、in vitroで操作されたウイルスを予め感染させた１×１０＾６までの４Ｔ１癌細胞を、皮下、腹腔内または静脈内（後眼窩または尾静脈）注射により導入する。いくつかの例において、外科的な皮膚調製（交互にBetadineおよびアルコールによる擦り洗い）の後の頭蓋内注射、頭皮切開、マイクロドリルビットを用いる頭蓋骨の穿孔、ならびにHamiltonシリンジを用いるビリオンの注射により、ウイルスを導入する。

操作された回路の小分子調節因子の送達
ゴールは、ヒト疾患のマウスモデルにおける処置のための治療用プログラムを有する遺伝子回路を開発および送達することである。遺伝子回路は、それらの環境を感知し、環境のインプットを処理し、正確なセッティングにおいて論理に基づく制御された治療用遺伝子の発現により応答する。マウス中への操作されたウイルスの送達の後で、回路を阻害または誘導するために、マウスを多様な有害でない小分子で処置する。これらの分子は、注射される（ＡＢＡ）か、または飲用水中で投与される（バラシクロビル）。

剖検
ＮＩＨガイドラインに従う人道的な実験のエンドポイントにおいて、組織をマウスから収集する。これらの組織は、免疫組織化学および病理学分析のためにフレッシュ凍結するか、シングルセル懸濁物のＦＡＣＳに基づく分析のために調製するか、ex vivoルシフェラーゼ活性アッセイのバルク分析のために調製するか、または抗原特異的Ｔ細胞の機能についてのex vivo培養アッセイのために調製することができる。ステップは、以下のとおりである：
１．組織、臓器、腫瘍を採取する
２．２４ウェルプレート中で、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ中に置く
３．コラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで１：２００に希釈する
４．１ｍｌの希釈したコラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅをフレッシュな２４ウェルプレート中に分取する
５．組織をコラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅを含むプレート中に置く
６．微細な針シリンジを用いてコラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅを吸引し、それを組織中に注射する
７．組織を３０分間にわたり室温でインキュベートする
８．４０ｕｍのろ過器を通して組織を刻む
９．ろ過器を通して５～１０ｍＬのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＮａＮ３）で細胞を洗浄する
１０．細胞を３００ｇで５分間にわたり遠心分離する
１１．上清を吸引する。１ｍＬのＦＡＣＳバッファー中でペレットを洗浄する
１２．細胞を３００ｇで５分間にわたり遠心分離する
１３．細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファー中で再懸濁して、青色のセルストレイナーを最上部にして５ｍＬのＦＡＣＳ管中に移す

本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して参考として援用され、それは、いくつかの場合においては、文書の全体を包含する場合がある。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書において、明細書において、および請求の範囲において用いられる場合、明らかに逆であることが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。

また、明らかに逆であることが示されない限り、本明細書において請求される１つより多くのステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、当該ステップまたは行為が列記される順序に限定されないことが、理解されるべきである。
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、「含むこと（comprising）」、「含むこと（including）」、「担持すること（carrying）」、「有すること（having）」、「含むこと（containing）」、「含むこと（involving）」、「保持すると（holding）」、「～から構成されること（composed of）」などの全ての移行句、および類似のものは、オープンエンドであること、すなわち、それらを含むがそれらに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧、セクション２１１１．０３．において記載されるように、移行句「～からなる（consisting of）」および「～から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれクローズまたはセミクローズの移行句であるべきである。

Claims (50)

1. 感染細胞タンパク質４（ＩＣＰ４）、感染細胞タンパク質０（ＩＣＰ０）、およびビリオンタンパク質１６（ＶＰ１６）をコードする遺伝子における欠失を含む、改変されたＨＳＶ－１ゲノムを含む、操作された単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）ベクター。
2. ＩＣＰ４の両方のコピーが、改変されたＨＳＶ－１ゲノムから欠失している、請求項１に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
3. ＶＰ１６をコードする遺伝子における欠失が、アミノ酸４２２におけるＶＰ１６タンパク質のトランケーションをもたらす、請求項１または請求項２に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
4. ＩＣＰ０の両方のコピーが、改変されたＨＳＶ－１ゲノムから欠失している、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
5. 改変されたＨＳＶ－１ゲノムが、γ３４．５、潜伏関連転写物（ＬＡＴ）、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ４７をコードする１つ以上の遺伝子における欠失をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
6. 改変されたＨＳＶ－１ゲノムが、ＬＡＴおよびγ３４．５における欠失をさらに含む、請求項５に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
7. 改変されたＨＳＶ－１ゲノムが、ＩＣＰ４の両方のコピーにおける欠失、ＩＣＰ０の両方のコピーにおける欠失、アミノ酸４２２におけるＶＰ１６タンパク質のトランケーションをもたらすＶＰ１６をコードする遺伝子における欠失、ならびにＬＡＴおよびγ３４．５の一方のコピーにおける欠失を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
8. 改変されたＨＳＶ－１ゲノムが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
9. 欠失が、ＩＣＰ４、ＩＣＰ０、ＶＰ１６、γ３４．５、ＬＡＴ、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ４７のうちの１つ以上を非機能的にする、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
10. 改変されたＨＳＶ－１ゲノムが、ＨＳＶ－１株Ｆ、１７またはＫＯＳからのものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
11. １つ以上の遺伝子回路をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
12. 遺伝子回路が、１５０ｋｂまでの長さである、請求項１１に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
13. 遺伝子回路が、アウトプット分子をコードする、請求項１１または請求項１２に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
14. アウトプット分子が、ＨＳＶ－１タンパク質である、請求項１３に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
15. ＨＳＶ－１タンパク質が、ＶＰ１６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、γ３４．５からなる群より選択される、請求項１４に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
16. アウトプット分子が、治療用分子である、請求項１３に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
17. 治療用分子が、抗がん剤である、請求項１６に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
18. アウトプット分子が、診断用分子である、請求項１３に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
19. アウトプット分子が、機能的分子である、請求項１３に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
20. アウトプット分子が、自然免疫応答の阻害剤である、請求項１３に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
21. 自然免疫応答の阻害剤が、自然免疫応答の構成成分を標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である、請求項２０に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
22. 自然免疫応答の阻害剤が、ワクシニアＢ１８Ｒタンパク質である、請求項２０に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
23. 操作されたＨＳＶ－１ベクターが、プラスミドである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクター。
24. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクターを含む、パッケージング細胞。
25. 操作されたＨＳＶ－１ベクターが、パッケージング細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項２４に記載のパッケージング細胞。
26. パッケージング細胞が、１つ以上のＨＳＶ－１ウイルス遺伝子をコードする核酸をさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載のパッケージング細胞。
27. １つ以上のＨＳＶ－１ウイルス遺伝子が、ＶＰ１６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ６、ＩＣＰ８、γ３４．５をコードする、請求項２６に記載のパッケージング細胞。
28. パッケージング細胞が、自然免疫応答の阻害剤をコードする核酸をさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載のパッケージング細胞。
29. 自然免疫応答の阻害剤が、自然免疫応答の構成成分を標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である、請求項２８に記載のパッケージング細胞株。
30. 自然免疫応答の阻害剤が、ワクシニアＢ１８Ｒタンパク質である、請求項２８に記載のパッケージング細胞株。
31. パッケージング細胞が、ＨＳＶ－１ウイルス粒子の少なくとも１つのプラーク形成単位を産生する、請求項２４～３０のいずれか一項に記載のパッケージング細胞。
32. パッケージング細胞が、Ｕ２ＯＳ細胞である、請求項２４～３１のいずれか一項に記載のパッケージング細胞。
33. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作されたＨＳＶ－１ベクターを含むか、または請求項２４～３２のいずれか一項に記載のパッケージング細胞株により産生される、操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子。
34. 疾患を処置する方法であって、請求項３３に記載の操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、治療用分子をコードする遺伝子回路を含む、前記方法。
35. 疾患を診断する方法であって、請求項３３に記載の操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、診断用分子をコードする遺伝子回路を含む、前記方法。
36. 操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子が、対象において免疫応答を誘導しないか、または、対象において、天然のＨＳＶ－１粒子と比較して、より低い免疫応答を誘導する、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
37. 操作されたＨＳＶ－１ベクターが、対象における細胞に感染し、対象における細胞中に遺伝子回路を送達する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子が、全身で、または局所的に送達される、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子が、注射を介して投与される、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 疾患が、がんである、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. がんが、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、前立腺癌または肺癌である、請求項４０に記載の方法。
42. 疾患が、悪液質である、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
43. 対象が、哺乳動物である、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 哺乳動物が、ヒトである、請求項４３に記載の方法。
45. 哺乳動物が、非ヒト霊長類である、請求項４３に記載の方法。
46. 哺乳動物が、げっ歯類である、請求項４３に記載の方法。
47. 遺伝子回路を細胞中に送達する方法であって、細胞を、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＨＳＶ－１ベクターまたは請求項３３に記載の操作されたＨＳＶ－１ウイルス粒子と接触させることを含み、ここで、操作されたＨＳＶ－１ベクターは、遺伝子回路を含む、前記方法。
48. 接触させることが、in vitroである、請求項４７に記載の方法。
49. 接触させることが、in vivoである、請求項４７に記載の方法。
50. 接触させることが、ex vivoである、請求項４７に記載の方法。

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