KR20210030902A - 영양요구 조절가능 세포를 사용한 유전자 요법 방법 및 조성물 - Google Patents

영양요구 조절가능 세포를 사용한 유전자 요법 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20210030902A
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제임스 패터슨
매튜 포르테우스
볼커 윕킹
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 발명의 개시는 영양요구 인자의 투여를 포함하는 개선된 유전자 요법을 위해 변형된 영양요구 숙주 세포를 생성하고 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

영양요구 조절가능 세포를 사용한 유전자 요법 방법 및 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 국제 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2018년 5월 10일에 출원된 가출원 U.S. 62/669,848호에 대한 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 2158_1001PCT_SL.txt라는 제목의 서열 목록 파일은 2019년 5월 10일에 생성되었으며, 1,970 바이트 크기이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본원의 개시는 개선된 효능 및 안전성을 갖는 유전자 요법 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
세포 요법은 유망한 치료법을 제공하는 것으로 나타났다. 그러나, 변형된 세포를 인간 숙주로 재도입하는 것은 면역 반응, 악성 형질전환, 또는 트랜스진(transgene)의 과잉생산 또는 제어 부족을 포함하는 위험을 수반한다.
유전 공학의 여러 접근법은 세포 신호전달, 증식 또는 아폽토시스와 같은 인간 세포의 기능을 제어할 수 있게 하며(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bonifant, et al. Mol. Ther. - Oncolytics 3, 16011 (2016); Sockolosky et al., (2018). Science (80-. ). 359, 1037-1042 Tey, (2014) Clin. Transl. Immunol. 3, e17] 참조), 세포 요법의 심각한 부작용도 제어할 수 있게 한다(Bonifant et al., 2016). 이들 발전에도 불구하고, 세포로의 유전적으로 인코딩된 제어 메커니즘의 도입에 의존하는 제어 시스템이 다수의 제한을 갖는다는 사실(Tey, 2014)로 인해 다른 적용은, 예를 들어, 재생 의학을 위한 조작된 다능성 세포의 사용과 같은 광범위한 적용을 얻지 못하였다(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Ben-David and Benvenisty, 2011, Nat. Rev. Cancer 11, 268-277.; Lee et al., 2013, Nat. Med. 19, 998-1004; Porteus, M. (2011) Mol. Ther. 19, 439-441] 참조).
발생할 수 있는 주요한 문제 중 두 가지는 "누출(leakiness)", 즉, 트리거의 부재하에서의 메커니즘의 낮은 수준의 활성(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Ando et al. (2015) Stem Cell Reports 5, 597-608] 참조), 및 외부 제어로부터의 여러 회피 메커니즘으로 인한 메커니즘의 활성화시 전체 세포 집단의 제거 부족(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Garin et al. (2001) Blood 97, 122-129; Di Stasi et al. (2011) N Engl J Med 365, 1673-1683; Wu et al. (2014) N Engl J Med 365, 1673-1683; Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485] 참조)이다. 예를 들어, 바이러스 형질도입에 의해 도입된 트랜스진은 세포에 의한 발현으로부터 침묵될 수 있거나(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sulkowski et al. (2018) Switch. Int. J. Mol. Sci. 19, 197] 참조), 세포는 효과기 메커니즘에 대한 내성이 발달할 수 있다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485] 참조). 또 다른 우려는 유전적 불안정성을 갖는 세포 유형, 예를 들어, 연장된 기간 동안 배양되는 세포주 또는 종양 세포주에서 트랜스진의 돌연변이이다(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Merkle et al. (2017) Nature 545, 229-233; D'Antonio et al. (2018) Cell Rep. 24, 883-894]). 또한, 일차 세포 집단은 종종 생체 외 배양에서 제한된 시간 동안만 이의 기능을 유지하며, 많은 유형이 클론 분리에 의해 정제될 수 없다.
기존의 안전 스위치 모드는 또한 (1) 세포주의 종양원성 형질전환을 발생시키는 종양 억제인자로의 트랜스진 삽입, 및 (2) 발현 및 이에 따른 효능의 부족을 발생시키는 후성적으로 침묵된 영역으로의 트랜스진 삽입 또는 삽입 후의 트랜스진의 후속 후성적 침묵과 같은 다수의 위험을 갖는다. 유전체 불안정성은 세포의 종양원성 형질전환에서 흔한 표현형이다. 또한, 외인성 자살 스위치의 점 돌연변이 또는 유전적 손실이 신속하게 선택되고 증폭될 것이다. 세포의 신호전달 경로 표적화를 기반으로 하는 안전 스위치는 세포의 생리학에 좌우된다. 예를 들어, "생존 촉진(pro-survival)" 모드인 세포는 카스파제 억제제를 발현하여 자살 스위치 유도시 세포 사멸을 방지할 수 있다.
유전자 요법의 특히 매력적인 적용은 유전자 생성물의 불충분에 의해 유발되거나 유전자 생성물, 예를 들어, 치료 단백질, 항체 또는 RNA의 증가된 발현에 의해 치료될 수 있는 장애의 치료를 포함한다.
최근의 발전은 인간 세포의 유전체의 정확한 변형을 가능하게 한다. 이러한 유전 공학은 광범위한 적용을 가능하게 하지만, 세포 거동을 제어하기 위한 새로운 방법이 또한 필요하다. 세포에 대한 대안적 제어 시스템은 대사에서 유전자를 표적화하여 조작될 수 있는 영양요구성이다. 이러한 개념은 미생물에 대해 연구되었으며(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Steidler et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789] 참조), 효모 유전학자에 의해 거의 보편적인 연구 도구로 광범위하게 사용되었다. 이는 복잡한 제어 메커니즘의 도입 대신 유전자의 넉아웃에 의해 생성되고, 영양요구성이 세포의 내인성 대사의 일부인 무독성 화합물을 향하는 경우 포유동물 세포에서 특히 강력할 것이다. 이는 대사 경로에서 필수 유전자의 파괴에 의해 달성될 수 있으며, 상기 경로의 생성물이 외부적으로 공급되고 환경으로부터 세포에 의해 흡수되는 경우에만 세포가 기능하도록 한다. 또한, 각각의 유전자가 또한 세포독성제의 활성화에도 관여하는 경우, 유전자 넉아웃(KO)은 세포가 상기 약물에 내성이 되도록 하여 변형되지 않은 세포의 고갈 및 세포 집단에서 조작된 세포의 정제를 가능하게 한다. 대사물의 공급에 의해 대사의 몇 가지 단일유전자 선천 오류가 치료될 수 있으며, 따라서 인간 영양요구의 모델로 볼 수 있다.
일부 구현예에서, (a) 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성이거나 상기 영양요구성 유도 유전자좌의 상보체에 상동성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 선택적으로 발현 제어 서열에 연결된 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 공여체 주형이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 공여체 주형은 단일 가닥이다. 일부 예에서, 공여체 주형은 이중 가닥이다. 일부 예에서, 공여체 주형은 플라스미드 또는 DNA 단편 또는 벡터이다. 일부 예에서, 공여체 주형은 선택적으로 프로모터 및 3' UTR을 포함하는 복제에 필요한 요소를 포함하는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, (a) 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성이거나 상기 영양요구성 유도 유전자좌의 상보체에 상동성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 일부 예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 예에서, 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 벡터는 바이러스 벡터의 복제에 필요한 유전자를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 트랜스진의 양쪽 측면에 영양요구성 유도 유전자좌의 단편 또는 이의 상보체에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 측접하였다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 영양요구 인자의 합성, 재활용 또는 구제에 관여하여 단백질을 인코딩하는 유전자이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 표 1의 유전자 내에 있거나 표 1의 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 홀로카르복실라제 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성인 뉴클레오티드 서열은 영양요구성 유도 유전자좌의 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 98% 동일하다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성인 뉴클레오티드 서열은 인간 우리딘 모노포스페이트 신세타제 또는 홀로카르복실라제 신세타제 또는 표 1의 임의의 유전자의 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 98% 동일하다. 일부 예에서, 공여체 주형 또는 벡터는 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 조직 특이적 발현 제어 서열이다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 프로모터 또는 인핸서이다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 유도성 프로모터이다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 항시성 프로모터이다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 전사 후 조절 서열이다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 마이크로 RNA이다. 일부 예에서, 공여체 주형 또는 벡터는 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 마커 유전자는 적어도 NGFR 또는 EGFR의 단편, 적어도 CD20 또는 CD19의 단편, Myc, HA, FLAG, GFP, 항생제 내성 유전자를 포함한다. 일부 예에서, 트랜스진은 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, Fc 융합 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 혈액 인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질, 수용체, 세포 표면 항원, 수용체 길항제 및 공동 자극 인자, 구조 단백질, 세포 표면 항원, 이온 채널, 후성 개질제 또는 RNA 편집 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 트랜스진은 T 세포 항원 수용체를 인코딩한다. 일부 예에서, 트랜스진은 RNA, 선택적으로 조절성 마이크로 RNA를 인코딩한다.
일부 구현예에서, cas9 단백질 및 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 가이드 RNA를 포함하는 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 메가뉴클레아제를 포함하는 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 메가뉴클레아제는 ZFN 또는 TALEN이다. 일부 예에서, 뉴클레아제 시스템은 본원에 개시된 공여체 주형 또는 벡터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 생체 외 변형된 숙주 세포가 본원에 개시되며, 상기 변형된 숙주 세포는 영양요구 인자에 대해 영양요구성이고 치료 인자를 발현할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 인간 세포이다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 배아 줄기 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 다능성 줄기 세포, 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, 체세포 줄기 세포, 분화된 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포, 지방 줄기 세포, 각질세포, 골격 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 섬유모세포, NK 세포, B 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 변형된 숙주 세포로 치료될 대상체의 세포로부터 유래된다.
일부 구현예에서, (a) 영양요구성 유도 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제 시스템 또는 상기 하나 이상의 뉴클레아제 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산, 및 (b) 본원에 개시된 공여체 주형 또는 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 변형된 포유동물 숙주 세포를 생성시키는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 방법은 제2 유전체 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 제2 뉴클레아제 또는 제2 가이드 RNA 또는 상기 제2 뉴클레아제 또는 제2 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 (b) 제2 공여체 주형 또는 벡터를 도입하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 포유동물 세포와 본원에 개시된 공여체 주형 또는 벡터, 및 뉴클레아제를 접촉시키는 것을 포함하는 생체 외 포유동물 세포에서 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 뉴클레아제는 ZFN이다. 일부 예에서, 뉴클레아제는 TALEN이다.
일부 구현예에서, (a) Cas9 폴리펩티드 또는 상기 Cas9 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, (b) 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 (c) 본원에 개시된 공여체 주형 또는 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 변형된 포유동물 숙주 세포를 생성시키는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법은 (a) 제2 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 제2 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 (b) 제2 공여체 주형 또는 벡터를 상기 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 포유동물 세포와 본원에 개시된 공여체 주형 또는 벡터, cas9 폴리펩티드, 및 가이드 RNA를 접촉시키는 것을 포함하는 생체 외 포유동물 세포에서 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 가이드 RNA는 키메라 RNA이다. 일부 예에서, 가이드 RNA는 2개의 하이브리드화된 RNA를 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구성 유도 유전자좌 내에서 하나 이상의 단일 가닥 파괴를 생성시킨다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구성 유도 유전자좌 내에서 이중 가닥 파괴를 생성시킨다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 상기 공여체 주형 또는 벡터를 사용하는 상동성 재조합에 의해 변형된다. 일부 예에서, 단계 (a) 및 (b)는 상기 세포를 확장하기 전 또는 후에, 선택적으로 상기 세포를 배양하기 전 또는 후에 수행된다. 일부 예에서, 상기 방법은 (c) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 트랜스진을 함유하는 세포를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 선택은 (i) 생존을 위해 영양요구 인자를 필요로 하는 세포를 선택하고, 선택적으로 (ii) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 트랜스진을 포함하는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제를 인코딩하는 유전자이고, 세포는 5-FOA와의 접촉에 의해 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 공여체 주형 또는 벡터, 또는 상기 뉴클레아제 시스템, 및 멸균수 또는 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 멸균 조성물이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 변형된 포유동물 숙주 세포 및 멸균수 또는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 멸균 조성물이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 선택적으로 용기 또는 바이알에, 상기 청구항 중 임의의 청구항의 상기 공여체 주형 또는 벡터 또는 뉴클레아제 시스템 또는 변형된 숙주 세포, 또는 이들의 조합물을 함유하는 키트가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, (a) 변형된 숙주 세포를 투여하고, (b) 선택적으로 변형된 세포가 생착되도록 하는 컨디셔닝 요법을 투여하고, (c) 영양요구 인자를 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 치료 인자를 발현시키는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포 및 영양요구 인자는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 변형된 숙주 세포 및 영양요구 인자는 순차적으로 투여된다. 일부 예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 치료 인자의 발현을 촉진하기에 충분한 기간 동안 정기적으로 계속된다. 일부 예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 치료 인자의 발현을 감소시키기 위해 감소된다. 일부 예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 치료 인자의 발현을 증가시키기 위해 증가된다. 일부 예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 변형된 숙주 세포의 성장 억제 또는 사멸을 발생시키는 조건을 생성시키기 위해 중단된다. 일부 예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 변형된 숙주 세포의 성장 억제를 발생시키는 조건을 생성시키기 위해 일시적으로 중단된다. 일부 예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 대상체에서 치료 효과를 발휘하기에 충분한 기간 동안 계속된다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 재생성 숙주 세포이다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포의 투여는 국소화된 전달을 포함한다. 일부 예에서, 영양요구 인자의 투여는 전신 전달을 포함한다. 일부 예에서, 변형 전의 숙주 세포는 치료할 대상체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, (a) 상기 변형된 숙주 세포 및 (b) 치료량의 치료 인자의 발현을 발생시키기에 충분한 양의 상기 영양요구 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 질병, 장애 또는 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 질병, 장애 또는 질환은 암, 파킨슨병, 이식편 대 숙주병(GvHD), 자가면역 질환, 과증식 장애 또는 질환, 악성 형질전환, 간 질환, 유전적 유전 결함을 포함하는 유전 질환, 소아 발병 당뇨병 및 안구 구획 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 질병, 장애 또는 질환은 근육 계통, 골격계, 순환계, 신경계, 림프계, 호흡기 내분비계, 소화계, 배설계 및 생식계로 구성된 군으로부터 선택되는 신체의 적어도 하나의 계에 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 질환의 치료를 위한 본원에 개시된 변형된 숙주 세포의 용도가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 인간으로의 투여에 사용되거나, 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 개시된 변형된 숙주 세포가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 변형된 인간 숙주 세포를 받은 인간에게 투여하는 데 사용하기 위한 영양요구 인자가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, (a) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 변형된 숙주 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 변형된 숙주 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성인, 조성물; 및 (b) 단백질의 치료적 발현을 생성시키기에 충분한 양의 영양요구 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 장애의 완화 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 완화시키거나 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 우리딘이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 홀로카르복실라제 신세타제(HLCS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 비오틴이다. 일부 예에서, 단백질은 효소이다. 일부 예에서, 단백질은 항체이다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 배아 줄기 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 다능성 줄기 세포, 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, 체세포 줄기 세포, 분화된 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포, 지방 줄기 세포, 각질세포, 골격 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 섬유모세포, NK 세포, B 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 변형된 숙주 세포로 치료될 대상체로부터 유래된다. 일부 예에서, 조성물 및 영양요구 인자는 동시에 투여된다. 일부 예에서, 조성물 및 영양요구 인자는 순차적으로 투여된다. 일부 예에서, 조성물은 영양요구 인자 전에 투여된다. 일부 예에서, 조성물 및 영양요구 인자는 동시에 투여된다. 일부 예에서, 영양요구 인자의 투여는 단백질의 치료적 발현을 촉진하기에 충분한 기간 동안 정기적으로 계속된다. 일부 예에서, 영양요구 인자의 투여는 단백질의 발현을 감소시키기 위해 감소된다. 일부 예에서, 영양요구 인자의 투여는 단백질의 발현을 증가시키기 위해 증가된다. 일부 예에서, 영양요구 인자의 중단된 투여는 변형된 숙주 세포의 성장 억제 또는 세포 사멸을 유도한다. 일부 예에서, 영양요구 인자의 투여는 대상체에서 치료 효과를 발휘하기에 충분한 기간 동안 계속된다. 일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 재생성 숙주 세포이다. 일부 예에서, 조성물의 투여는 국소화된 전달을 포함한다. 일부 예에서, 영양요구 인자의 투여는 전신 전달을 포함한다. 일부 예에서, 질병은 리소좀 축적병(LSD)이다. 일부 예에서, LSD는 고셔병(유형 1/2/3), MPS2(헌터)병, 폼페병, 파브리병, 크라베병, 저인산증, 니만-픽병 유형 A/B, MPS1, MPS3A, MPS3B, MPS3C, MPS3, MPS4, MPS6, MPS7, 페닐케톤뇨증, MLD, 잔트호프병, 테이-삭스병 또는 바텐병이다. 일부 예에서, 효소는 글루코세레브로시다제(Glucocerebrosidase), 이두르설파제(Idursulfase), 알글루코시다제 알파(Alglucosidase alfa), 아갈시다제 알파/베타(Agalsidase alfa/beta), 갈락토실세라미다제(Galactosylceramidase), 아스포타제 알파(Asfotase alfa), 산 스핑고미엘리나제(Acid Sphingomyelinase), 라로니다제(Laronidase), 헤파란 N-설파타제(heparan N-sulfatase), 알파-N-아세틸글루코사미니다제(alpha-N-acetylglucosaminidase), 헤파란-α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제(heparan-α-glucosaminide N-acetyltransferase), N-아세틸글루코사민 6-설파타제(N-acetylglucosamine 6-sulfatase), 엘로설파제 알파(Elosulfase alfa), 글라설페이트(Glasulfate), B-글루코로니다제(B-Glucoronidase), 페닐알라닌 하이드록실라제(Phenylalanine hydroxylase), 아릴설파타제 A(Arylsulphatase A), 헥소스아미니다제-B(Hexosaminidase-B), 헥소스아미니다제-A(Hexosaminidase-A), 또는 트리펩티딜 펩티다제 1(tripeptidyl peptidase 1)이다. 일부 예에서, 질병은 프리드리히 운동실조, 유전성 혈관부종 또는 척추 근육 위축이다. 일부 예에서, 단백질은 프라탁신(frataxin), C1 에스테라제 억제제(HAEGAARDA® 피하 주사로도 언급될 수 있음) 또는 SMN1이다.
본원에 기재된 다양한 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 인간 숙주 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나 종양의 성장 속도를 감소시키는 방법을 제공한다.
참조로서의 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물, 특허, 및 특허 출원이 특별히 및 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 지정되는 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명의 개시에 포함되는 주제의 특징은 첨부된 청구항에서 구체적으로 기재된다. 본 발명의 개시의 특징 및 장점의 더 나은 이해는 본원의 개시에 포함되는 주제의 원리가 이용되는 예시적 구현예 및 첨부된 도면을 설명하는 하기 상세한 설명을 참조하여 획득될 것이다:
도 1a 및 도 1b는 전기천공 후 최적 회복에 대한 혈청의 효과를 예시한다. 도 1a는 최적 전기천공 회복 조건을 결정하기 위해 사용되는 검정의 예시적인 개략도이다. 전기천공 후, 세포는 혈청, 5-플루오로오로트산(5-FOA) 또는 외인성 우라실 공급원(우리딘)이 공급되거나 공급되지 않았다. 도 1b는 표시된 배지 조건에서 전기천공 후 4일의 회복 후 CytoFLEX 흐름세포측정기(Beckman Coulter)에 의한 세포 수를 예시한다. 도면은 혈청이 투여된 세포, 혈청이 없이 5-FOA로 처리된/처리되지 않은 모의 편집 세포, 및 혈청 없이 5-FOA로 처리된/처리되지 않은 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS) 넉아웃 세포를 제시한다.
도 2a-도 2f는 UMPS InDel 함유 세포의 유지 및 성장이 외인성 우라실 공급원을 필요로 한다는 것을 예시한다. 도 2a는 전기천공 및 회복 후 UMPS 또는 모의 편집 T 세포의 성장에 대한 검정에 사용되는 절차의 예시적인 개략도이다. 도 2b는 표시된 배양 조건에서 UMPS InDel의 분해에 의한 indel 추적(TIDE) 분석을 예시한다. TIDE 분석은 올리고뉴클레오티드 UMPS-O-1 및 UMPS-O-2를 사용한 UMPS 유전자좌의 생거 시퀀싱에 대해 수행되었다. 도 2c는 8일에 수행된 TIDE에 의해 분석된 프레임시프트 InDel을 함유하는 대립유전자의 백분율을 예시한다. 도 2d는 TIDE에 의해 확인된 대립유전자를 함유하는 8일에서의 예측된 세포의 절대 수를 예시한다. 도 2e는 UMP가 있거나 없는 세포 수의 시간 경과를 예시한다. 도 2f는 우리딘이 있거나 없는 세포 수의 시간 경과를 예시한다.
도 3a-도 3c는 5-FOA가 UMPS 표적화 세포주에서 독성이 덜함을 예시한다. 도 3a는 5-FOA 선택 절차의 예시적 개략도이다. 도 3b 및 도 3c는 표시된 배양 조건에서 5-FOA 선택의 4일 후 세포 수를 예시한다. 도 3b 및 도 3c에서, 모의 결과는 각각의 배양 조건에 대해 좌측 막대로 표현되고, UMPS-7에 대한 결과는 각각의 배양 조건에 대해 우측 막대로 제시된다.
도 4a-도 4d는 5-FOA 선택된 UMPS 표적화 세포주가 외인성 우라실 공급원의 존재하에서만 최적 성장을 나타내는 것을 예시한다. 도 4a는 우라실 영양요구의 입증을 위한 프로토콜의 예시적 개략도이다. 5-FOA에서 4일 선택 후 세포 배양물이 시험 배지로 분할되었고, 세포 계수 전에 추가 4일 동안 성장되었다. 도 4b-도 4d는 외인성 우라실(UMP 또는 우리딘) 함유 또는 결핍 배지에서의 5-FOA 선택된 세포의 세포 수를 예시한다.
도 5a는 ICE 분석에 의해 UMPS 유전자좌에서 수행된 InDel 정량화를 예시한다. 도 5b는 모의 처리, CCR5 넉아웃 또는 UMPS 넉아웃 후의 T 세포의 증식을 예시한다. 도 5c는 UMP 또는 우리딘을 이용하거나 이용하지 않은 UMPS 넉아웃을 갖는 T 세포의 증식을 예시한다. 도 5d는 상이한 배양 조건으로 UMPS 넉아웃 후 8일에서의 InDel 빈도를 예시한다. 도 5e는 프레임시프트로 이어질 것으로 예측되는 InDel의 빈도를 예시한다.
도 6a는 UMPS 유전자좌의 표적화를 위한 DNA 공여체 작제물을 예시한다. 도 6b는 K562 세포의 표적화 후 표면 마커의 발현을 예시한다. 도 6c는 나노루시페라제(Nanoluciferase) 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 HBB 유전자좌에 통합하기 위한 표적화 접근법을 예시한다. 도 6d는 세포 분류 전에 K562 세포에서 3개의 통합된 마커의 발현을 예시한다. 도 6e는 상이한 우리딘 농도의 존재하에서 배양되는 경우 8일에서의 K562 세포 성장 및 세포 수를 예시한다. 도 6f는 5-FOA를 이용한 배양 동안 UMPS KO/KO 세포의 선택을 예시한다. 도 6g는 5-FOA의 존재하에서 UMPS KO/KO 세포의 증식을 예시한다.
도 7a는 T 세포의 UMPS 표적화 후 표면 마커 발현을 예시한다. 도 7b는 UMPS KO 또는 야생형(WT) T 세포의 영양요구 성장을 예시한다. 도 7c는 5-FOA가 UMPS 넉아웃을 갖는 T 세포를 선택함을 예시한다.
그룹은 Prism 7(GraphPad)을 사용하여 표시된 바와 같은 통계 시험으로 비교되었다. 별표는 통계적 유의성의 수준을 나타낸다: * = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p<0.001, 및 **** = p<0.0001.
I. 서문
최근의 발전은 인간 세포의 유전체의 정확한 변형을 가능하게 한다. 이러한 유전 공학은 광범위한 적용을 가능하게 하지만, 세포 거동을 제어하기 위한 새로운 방법이 또한 필요하다. 세포에 대한 대안적 제어 시스템은 대사에서 유전자를 표적화하여 조작될 수 있는 영양요구성이다. 대사의 중심 유전자의 파괴에 의한 유전 공학 영양요구성의 본원에 기재된 접근법은 인간 세포에 대해 탐구되지 않은 세포 기능에 대한 외부 제어 메커니즘을 생성시키는 대안적인 패러다임이다. 피리미딘 대사에서 핵심 유전자를 파괴함으로써, 수동적 봉쇄 시스템이 생성되었으며(Steidler et al., 2003), 이는 이전에 언급된 한계를 우회하는 인간 세포에 대한 시스템의 이미 존재하는 도구상자에 대한 추가 및 대안이다. 이는 무독성 물질인 우리딘의 첨가 또는 중지를 통해 인간 세포의 성장을 제어할 수 있다. 영양요구성은, 예를 들어, 조작된 유전자 회로의 도입에 의해 비천연 물질을 향해(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Kato, Y. (2015) An engineered bacterium auxotrophic for an unnatural amino acid: a novel biological containment system. PeerJ 3, e1247] 참조) 또는 박테리아 유전자의 넉아웃에 의해 피리미딘을 향해(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Steidler et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789] 참조) 미생물에서 이전에 조작된 적이 있다. 후자의 개념은 복잡한 발현 카세트의 도입 대신 유전자의 넉아웃에 의존하여 세포를 유전적 변형의 역전 또는 내성 메커니즘의 발달로부터 방해하고 따라서 대안적 시스템의 상기 난제를 해결하기 때문에 매력적이다. 피리미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드가 DNA 및 RNA 합성, 에너지 전달, 신호 전달 및 단백질 변형을 포함하는 다양한 세포 과정에서 필수적인 역할을 한다는 사실(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[van Kuilenburg, A.B.P. and Meinsma, R. (2016). Biochem. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1862, 1504-1512] 참조)은 이들의 합성 경로를 이론적으로 매력적인 표적으로 만든다.
인간 세포는 외부 공급원 또는 공생 유기체로부터 획득해야 하는 아미노산과 같은 특정 화합물에 대해 자연적으로 영양요구성이다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Murray, P.J. (2016). Nat. Immunol. 17, 132-139] 참조). 추가로, 영양요구성은, 예를 들어, 세포가 영양요구성인 대사물의 차별적 공급 또는 고갈에 의해 면역 세포의 기능을 조절하는 천연 메커니즘이다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Grohmann et al., (2017). Cytokine Growth Factor Rev. 35, 37-45] 참조). 세포 영양요구성은 또한, 예를 들어, 아르기닌을 제거함으로써 종양 성장을 억제하는 대식세포의 경우 악성 성장에 대한 방어 메커니즘에서 중요한 역할을 한다(Murray, 2016). 또한, 여러 악성 세포 유형은 특정 대사물에 대해 영양요구성인 것으로 나타났으며(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Fung, M.K.L. and Chan, G.C.F. (2017). J. Hematol. Oncol. 10, 144] 참조), 이는 백혈병 환자의 치료를 위한 아스파라긴의 치료적 고갈에 의해 이용된다(문헌[Hill et al., (1967). JAMA 202, 882] 참조).
미생물에 대한 이전에 개발된 봉쇄 전략에 더하여, Cas9 리보핵단백질(RNP)/rAAV6에 기반한 유전자 편집을 사용하는 본원에 기재된 접근법은 일차 및 치료적 관련 인간 세포 유형의 매우 효율적인 조작을 가능하게 한다. 영양요구성 및 5-FOA에 대한 내성은 UMPS 유전자의 완전한 파괴를 갖는 모든 세포에 내재되어 있지만, 개념 증명을 제시하기 위해, 선택 마커의 표적화된 통합에 의한 이중-대립유전자 넉아웃으로 집단의 확인이 촉진되었다. 대사 영양요구성의 확립과 함께 일차 인간 세포의 효율적인 표적화된 변형을 가능하게 하는 방법의 최근 개발(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bak et al. (2017). Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. Elife 6, e27873; Bak, et al. (2018). Nat. Protoc. 13, 358-376; Porteus, M.H. and Baltimore, D. (2003). Science (80-. ). 300, 763-763])은, 예를 들어, 특정 효과기 기능 및 감소된 면역원성을 갖는 줄기 세포 또는 줄기 세포 유래 조직 또는 기타 자가 체세포의 사용에서 인간 세포의 사용이 필요한 환경에서 치료적 접근법의 추가 개발을 위한 토대를 마련한다. 특히, 신속한 임상 번역을 촉진하는 작제물 및 시약, 예를 들어, 면역원성을 피하는 표적화 작제물의 선택 마커 tNGFR 및 tEGFR, 및 FDA 승인 프로드러그를 사용하여 생체 내 모델에서 공급되는 우리딘이 사용되었다.
세포 기능을 제어하기 위한 조작된 메커니즘은 제어 메커니즘을 매개하는 단백질을 발현하는 세포의 완전히 순수한 집단을 선택하는 추가 난제를 갖는다. 세포독성제에 내성을 부여하여 조작된 세포를 선택할 가능성은 무독성 물질을 사용하여 제어될 수 있는 매우 순수한 세포 집단의 생성을 가능하게 하여 효율을 크게 증가시킬 수 있고 중요한 대사 경로의 기능에 중요한 유전자의 제거는 세포가 회피 메커니즘이 발달하는 것을 방지하므로 특히 매력적이다. 따라서, 이러한 방법은 유전적 불안정성 및 악성 형질전환의 위험이 작용하고, 격리로부터 회피하는 세포의 적은 수조차도, 예를 들어, 체세포 또는 다능성 줄기 세포의 사용에서 재앙적 영향을 미칠 수 있는 환경에서 기존의 제어 메커니즘에 비해 여러 이점을 제공한다.
이러한 개념은 미생물에 대해 탐구되었으며(Steidler et al., 2003), 효모 유전학자에 의해 거의 보편적인 연구 도구로 광범위하게 사용되었다. 이는 복잡한 제어 메커니즘의 도입 대신 유전자의 넉아웃에 의해 생성되고, 영양요구성이 세포의 내인성 대사의 일부인 무독성 화합물을 향하는 경우 포유동물 세포에서 특히 강력할 것이다. 이는 대사 경로에서 필수 유전자의 파괴에 의해 달성될 수 있으며, 상기 경로의 생성물이 외부적으로 공급되고 환경으로부터 세포에 의해 흡수되는 경우에만 세포가 기능하도록 한다. 또한, 각각의 유전자가 또한 세포독성제의 활성화에도 관여하는 경우, 유전자 넉아웃(KO)은 세포가 상기 약물에 내성이 되도록 하여 변형되지 않은 세포의 고갈 및 세포 집단에서 조작된 세포의 정제를 가능하게 한다. 대사물의 공급에 의해 대사의 몇 가지 단일유전자 선천 오류가 치료될 수 있으며, 따라서 인간 영양요구성의 모델로 볼 수 있다.
특정 구현예에서, 영양요구성은 유전체 편집을 통해 새로운(de novo) 피리미딘 합성 경로에서 UMPS를 파괴함으로써 인간 세포에 도입된다. 이는 세포의 기능이 외인성 우리딘의 존재에 의존하게 만든다. 또한, 이는 5-플루오로오로트산을 5-FU로 대사하는 세포의 능력을 폐지하며, 이는 온전한 UMPS 대립유전자를 갖는 나머지 세포의 고갈을 가능하게 한다. 대사물을 사용하여 유전적으로 조작된 영양요구성에 의한 인간 세포의 기능에 영향을 미치고 다른 세포를 고갈시키는 능력은 제어 가능한 세포의 순수한 집단이 필요한 다양한 적용에 대한 상기 접근법의 개발을 제공한다.
한 가지 예는 UMPS 유전자의 돌연변이가 고용량의 우리딘을 이용한 보충에 의해 치료될 수 있는 기능장애를 발생시키는 유전성 오로트산뇨증이다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Fallon et al (1964). N. Engl. J. Med. 270, 878-881] 참조). 이러한 개념을 관심 세포 유형으로 옮기면, 인간 세포에서 UMPS 유전자를 넉아웃시키기 위해 세포를 우리딘에 대해 영양요구성이고 5-플루오로오로트산(5-FOA)에 대해 내성으로 만드는 유전 공학이 사용된다. 본 발명자는 UMPS -/- 세포주 및 일차 세포가 시험관 내에서 우리딘의 존재하에서만 생존하고 증식하며, UMPS 조작 세포 증식은 생체 내에서 우리딘의 보충 없이 억제되는 것을 제시한다. 또한, 세포는 5-FOA의 존재하에서 배양함으로써 혼합 집단으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 영양요구성은 유전체 편집을 통해 새로운 피리미딘 합성 경로에서 UMPS를 파괴함으로써 인간 세포에 도입된다. 이는 세포의 기능이 외인성 우리딘의 존재에 의존하게 만든다. 또한, 이는 5-플루오로오로트산을 5-FU로 대사하는 세포의 능력을 폐지하며, 이는 온전한 UMPS 대립유전자를 갖는 나머지 세포의 고갈을 가능하게 한다. 대사물을 사용하여 유전적으로 조작된 영양요구성에 의한 인간 세포의 기능에 영향을 미치고 다른 세포를 고갈시키는 능력은 제어 가능한 세포의 순수한 집단이 필요한 다양한 적용에 대한 상기 접근법의 개발을 제공한다.
영양요구성의 한 예는 UMPS 유전자의 돌연변이가 고용량의 우리딘을 이용한 보충에 의해 치료될 수 있는 기능장애를 유발하는 유전성 오로트산뇨증이다(Fallon et al., 1964). 이러한 개념을 관심 세포 유형으로 옮기면, 인간 세포에서 UMPS 유전자를 넉아웃시키기 위해 세포를 우리딘에 대해 영양요구성이고 5-플루오로오로트산(5-FOA)에 대해 내성으로 만드는 유전 공학이 사용되었다. UMPS -/- 세포주 및 일차 세포가 시험관 내에서 우리딘의 존재하에서만 생존하고 증식하며, UMPS 조작 세포 증식은 생체 내에서 우리딘의 보충 없이 억제되는 것이 본원에서 제시된다. 또한, 세포는 5-FOA의 존재하에서 배양함으로써 혼합 집단으로부터 선택될 수 있다.
II. 특정 구현예의 조성물 및 사용 방법
유전자 요법에서 사용하기 위한 방법 및 조성물의 일부 구현예가 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 방법은 변형된 숙주 세포를 영양요구성으로 만들고, 트랜스진 발현을 통한 유전자 요법의 개선된 효능, 역가 및/또는 안전성을 제공할 수 있는 방식으로 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 숙주 세포로 전달하는 것을 포함한다. 특정 영양요구성 유도 유전자좌로의 트랜스진의 전달은, 예를 들어, 유전자의 파괴 또는 넉아웃 또는 유전자 활성의 하향조절을 통해 영양요구 세포를 생성시키는데, 이는 이제 성장 및 생식을 위해 영양요구 인자의 지속적인 투여에 의존한다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구성 유도 유전자좌를 표적으로 하는 뉴클레아제 시스템, 트랜스진을 삽입하기 위한 공여체 주형 또는 벡터, 키트, 영양요구성이고 도입된 트랜스진을 발현할 수 있는 변형된 세포를 생성시키기 위해 상기 시스템, 주형 또는 벡터를 사용하는 방법을 포함한다.
또한, 일부 구현예에서, 변형된 숙주 세포의 사용을 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에 개시되며, 여기에는 변형된 세포의 성장 및 생식을 조절(증가, 감소 또는 중단)하고 트랜스진의 발현을 제어하고 치료 인자의 수준을 제어하기 위한 약학적 조성물, 치료 방법 및 영양요구 인자의 투여 방법이 포함된다.
일부 예에서, 원하는 유전자좌로의 트랜스진의 전달은 상동성 재조합과 같은 방법을 통해 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 "상동성 재조합(HR)"은 상동성 특이적 복구 메커니즘을 통해 DNA에서 이중 가닥 파괴의 복구 동안 뉴클레오티드 서열의 삽입을 나타낸다. 이러한 과정은 이중 가닥 파괴를 복구하기 위한 주형으로서 파괴 영역의 뉴클레오티드 서열과 상동성을 갖는 "공여체" 분자 또는 "공여체 주형"을 사용한다. 이중 가닥 파괴의 존재는 공여체 서열의 통합을 촉진한다. 공여체 서열은 물리적으로 통합되거나, 상동성 재조합을 통한 파괴의 복구를 위한 주형으로 사용될 수 있으며, 이는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부의 도입을 발생시킨다. 이러한 과정은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템과 같은 메가뉴클레아제와 같은 이중 가닥 파괴를 생성시키는 다수의 상이한 유전자 편집 플랫폼에 의해 사용된다.
일부 구현예에서, 유전자는, 예를 들어, 다중 치료 인자의 발현을 위해 또는 합성 조절인자로서 작용하거나 특정 계통에 대해 변형된 세포를 편향시키는 작용을 하는(예를 들어, 제2 유전자좌로부터 전사 인자를 발현함에 의함) 제2 유전자의 도입을 위해 2개 이상의 유전자좌로 전달된다. 일부 구현예에서, 유전자는 2개 이상의 영양요구성 유도 유전자좌에 전달된다. 예를 들어, 상이한 유전자 또는 동일한 유전자의 제2 카피는 제2 영양요구성 유도 유전자좌로 전달된다.
일부 구현예에서, 세포는 영양요구 인자를 생성하는 능력을 더이상 갖지 않으므로 세포는 영양요구성이다. 본원에서 사용되는 "세포", "변형된 세포" 또는 "변형된 숙주 세포"는 동일한 세포로부터 유래된 세포 집단을 나타내며, 집단의 각각의 세포는 유사한 유전적 구성을 갖고 동일한 변형을 유지한다.
일부 구현예에서, 영양요구 인자는 1개 또는 2개 또는 그 초과의 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도, 비-유기 분자, 비-필수 아미노산, 또는 변경된 농도의 모이어티(정상 생리학적 농도에 비함), 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에서 영양요구 인자에 대한 모든 언급은 다수의 인자의 투여를 고려한다. 본원에 기재된 임의의 구현예에서, 영양요구 인자는 변형된 숙주 세포를 유지하기에 충분한 농도로 대상체에서 독성이 없거나 생체 이용 가능하지 않은 영양소 또는 효소이며, 본 출원 전체에 걸친 "영양요구 인자"에 대한 임의의 언급은 영양소 또는 효소에 대한 언급을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 예에서, 변형된 세포에 영양요구 인자가 지속적으로 공급되지 않는 경우, 세포는 증식을 중단하거나 사멸한다. 일부 예에서, 변형된 세포는 종양원성 형질전환을 포함하는 다른 세포 기반 요법과 관련된 위험을 감소시키는 안전 스위치를 제공한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 다수의 이점, 예를 들어, 렌티바이러스를 이용하는 것과 같은 무작위 통합보다는 동일한 유전자좌로 통합함으로 인한 일관된 결과 및 조건; 고유 프로모터 또는 인핸서를 갖는 영역 또는 침묵되는 영역이 회피되기 때문에 트랜스진의 일정한 발현; 푸아송 분포가 아닌 1 또는 2개의 카피의 통합의 일관된 카피수; 및 종양원성 형질전환의 제한된 기회를 제공한다. 일부 예에서, 본 발명의 개시의 변형된 세포는 렌티벡터 또는 다른 바이러스 벡터에 의해 조작된 생성물보다 덜 불균일하다.
일부 구현예에서, 비-영양요구 상태로의 회귀 확률을 제한하는 100% 영양요구성인 세포 집단을 생성시키기 위한 역선택(counter selection) 방법이 본원에 개시된다. 현재의 안전 스위치는 트랜스진의 삽입에 의존하며, 변형된 세포는 트랜스진의 돌연변이 또는 이의 발현의 후성 침묵을 통해 회피할 수 있다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Wu et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 1:14053 (2014)] 참조). 따라서, 트랜스진 삽입과 영양요구 메커니즘의 생성의 조합은 일반적으로 장기적으로 더 안전하다.
일부 구현예에서, 영양요구 인자 투여를 낮은 수준으로 감소시키는 것은 변형된 세포가 죽지 않고 정지 상태로 진입하게 하여 숙주에 이미 존재하는 세포를 이용한 요법의 일시적 중단 및 재개를 허용할 수 있다. 이는 숙주 세포를 재편집하고 변형된 숙주 세포를 재도입해야 하는 것에 비해 이점이 될 것이다.
일부 구현예에서, 영양요구 인자 투여를 중단하면 그것이 바람직한 경우, 예를 들어, 이상 증식 또는 종양원성 형질전환이 검출된 경우 또는 치료의 중단이 바람직한 경우에 변형된 세포의 사멸을 발생시킬 것이다.
일부 구현예에서, 영양요구 인자 투여를 증가시키는 것은 변형된 세포의 성장 및 생식을 증가시키고, 트랜스진의 증가된 발현을 발생시키고, 이에 따라 치료 인자의 증가된 수준을 발생시킨다. 일부 예에서, 영양요구 인자 투여는 유전자 생성물의 투여량을 제어하기 위한 수단을 제공한다.
영양요구성 기반 안전 메커니즘은 현재의 세포 요법과 관련된 환자에 대한 많은 위험을 피한다. 치료 과정 동안 정의된 영양요구 인자로 환자를 보충하고 치료 중단 또는 일부 다른 안전 기반 징후시 인자를 제거함으로써, 세포 성장은 물리적으로 제한된다. 일부 예에서, 영양요구 인자가 더 이상 세포에서 이용 가능하지 않은 경우, 세포는 분열을 멈추고 내성 발달에 대한 자명한 메커니즘을 갖지 않는다. 영양요구 인자의 수준을 조작함으로써 생체 내 세포의 성장 속도가 제어된다. 별도의 영양요구성을 사용하여 다수의 세포주가 생체 내에서 독립적으로 제어될 수 있다. 위치 특이적 성장은 영양소를 방출하고 세포 회피를 방지하는 생체적합성 장치 내에서 투여되는 외인성 성장 췌장 B 세포와 같은 국소화된 영양소 방출에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 생체 내에서 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포의 활성에 대한 보다 정의된 제어를 가능하게 하기 위해 CAR-T 세포 기술과 함께 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 조성물은 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 데 사용된다. 예를 들어, 영양요구 인자(예를 들어, 우리딘 또는 비오틴)의 중단은 종양 퇴행으로 이어질 수 있다.
상당한 수의 장애는 유전자 생성물의 불충분으로 인해 발생하거나 치료 인자, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 항체 또는 RNA의 증가된 발현에 의해 치료 가능하다. 일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 관심 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 변형된 숙주 세포를 포함하는 조성물이 본원에 개시되며, 상기 변형된 숙주 세포는 영양요구 인자에 대해 영양요구성이다. 일부 구현예에서, 인자의 치료적 발현을 발생시키기에 충분한 양의 영양요구 인자를 제공함으로써 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하기 위해 본 발명의 개시의 조성물을 사용하는 방법이 본원에 추가로 개시된다.
예시적 치료 인자
하기 구현예는 영양요구 숙주 세포에서 치료 인자를 생성시킴으로써 치료될 질환을 제공한다.
예를 들어, 응고 장애는 응고 캐스케이드의 인자가 부재하거나 돌연변이로 인해 감소된 기능을 갖는 매우 흔한 유전 장애이다. 이들은 혈우병 A(인자 VIII 결핍), 혈우병 B(인자 IX 결핍) 또는 혈우병 C(인자 XI 결핍)를 포함한다.
알파-1 항트립신(A1AT) 결핍은 혈액 및 폐에서 부적절한 A1AT 수준을 발생시키는 알파 1-항트립신의 생성 결함으로 인해 발생하는 보통염색체 열성 질병이다. 이는 만성폐쇄폐병(COPD) 및 간 장애의 발병과 관련될 수 있다.
유형 I 당뇨병은 췌장 베타 세포의 면역 매개 파괴가 인슐린 생성의 현저한 결핍을 발생시키는 장애이다. 합병증은 허혈성 심장병(협심증 및 심근 경색), 뇌졸중 및 말초 혈관 질병, 당뇨 망막병증, 당뇨 신경병증 및 당뇨 신장병증을 포함하며, 이는 투석이 필요한 만성 신장 질병을 발생시킬 수 있다.
항체는 특정 유형의 세포(예를 들어, 암세포, 자가면역 질병의 특정 면역 세포, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), RSV, 독감, 에볼라, CMV 등과 같은 바이러스에 감염된 세포)를 매우 선택적으로 사멸시킬 뿐만 아니라 질병을 유발하는 표적 단백질의 중화 또는 청소에 사용되는 분비 단백질 생성물이다. 항체 요법은 종양학, 류머티즘학, 이식 및 안구 질병을 포함하는 많은 인간 질환에 널리 적용되었다. 일부 예에서, 본원에 개시된 조성물에 의해 인코딩되는 치료 인자는 암, 감염성 질병 및 자가면역 질병과 같은 질환을 예방하거나 치료하는 데 사용되는 항체이다. 특정 구현예에서, 암은 대상체에서 종양의 성장 속도를 감소시키거나 종양의 크기를 감소시킴으로써 치료된다.
치료적 용도에 대해 FDA에 의해 승인된 모노클로날 항체는 아달리무맙(Adalimumab), 베즐로톡수맙(Bezlotoxumab), 아벨루맙(Avelumab), 두필루맙(Dupilumab), 두르발루맙(Durvalumab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 브로달루맙(Brodalumab), 레슬리주맙(Reslizumab), 올라라투맙(Olaratumab), 다라투무맙(Daratumumab), 엘로투주맙(Elotuzumab), 네시투무맙(Necitumumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오빌톡사시맙(Obiltoxaximab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 세쿠키누맙(Secukinumab), 메폴리주맙(Mepolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 알리로쿠맙(Alirocumab), 이다루시주맙(Idarucizumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 디누툭시맙(Dinutuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 실툭시맙(Siltuximab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine), 페르투주맙(Pertuzumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오비노투주맙(Obinutuzumab), 브렌툭시맙(Brentuximab), 락시바쿠맙(Raxibacumab), 벨리무맙(Belimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 데노수맙(Denosumab), 데노수맙(Denosumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 베실레소맙(Besilesomab), 토실리주맙(Tocilizumab), 카나키누맙(Canakinumab), 골리무맙(Golimumab), 우스테키누맙(Ustekinumab), 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol), 카투막소맙(Catumaxomab), 에쿨리주맙(Eculizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 카투막소맙(Catumaxomab), 베바시주맙(Bevacizumab), 오말리주맙(Omalizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 에팔리주맙(Efalizumab), 이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan), 파놀레소맙(Fanolesomab), 아달리무맙(Adalimumab), 토시투모맙(Tositumomab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 젬투주맙 오조가미신(Gemtuzumab ozogamicin), 인플릭시맙(Infliximab), 팔리비주맙(Palivizumab), 네시투무맙(Necitumumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 리툭시맙(Rituximab), 보투무맙(Votumumab), 술레소맙(Sulesomab), 아르시투모맙(Arcitumomab), 이미시로맙(Imiciromab), 카프로맙(Capromab), 노페투모맙(Nofetumomab), 압식시맙(Abciximab), 사투모맙(Satumomab) 및 무로모납-CD3(Muromonab-CD3)를 포함한다. 치료적 용도에 대해 FDA에 의해 승인된 이중특이적 항체는 블리나투모맙(Blinatumomab)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 HIV 또는 다른 감염성 질병을 예방하거나 치료하는 데 사용된다. HIV의 치료에서 사용하기 위한 항체는 인간 모노클로날 항체(mAb) VRC-HIVMAB060-00-AB(VRC01); mAb VRC-HIVMAB080-00-AB(VRC01LS); mAb VRC-HIVMAB075-00-AB(VRC07-523LS); mAb F105; mAb C2F5; mAb C2G12; mAb C4E10; 항체 UB-421(T-림프구 및 단핵구의 CD4 분자(도메인 1) 상의 HIV-1 수용체를 표적화함); Ccr5mab004(Ccr5에 대한 인간 모노클로날 IgG4 항체); mAb PGDM1400; mAb PGT121(HIV 외피 단백질의 V1V2(PGDM1400) 및 V3 글리칸-의존적(PGT121) 에피토프 영역을 표적화 하는 재조합 인간 IgG1 모노클로날 항체); KD-247(인간화된 모노클로날 항체); PRO 140(모노클로날 CCR5 항체); mAb 3BNC117; 및 PG9(항-HIV-1 gp120 모노클로날 항체)를 포함한다.
치료 RNA는 안티센스, siRNA, 앱타머, 마이크로RNA 모방체/항-miRs 및 합성 mRNA를 포함하며, 이들 중 일부는 트랜스진에 의해 발현될 수 있다.
LSD는 효소 결핍의 결과로서 신체 세포에서의 다양한 독성 물질의 비정상적 축적을 특징으로 하는 유전적 대사 질병이다. 이들 장애는 전부 거의 50개에 달하며, 이들은 골격, 뇌, 피부, 심장 및 중추신경계를 포함하는 신체의 상이한 부분에 영향을 미친다. 일반적인 예로는 스핑고리피드증, 파버병(ASAH1 결핍), 크라베병(갈락토실세라미다제 또는 GALC 결핍), 갈락토시알리도시스, 강글리오시드증, 알파-갈락토시다제, 파브리병(α-갈락토시다제 결핍-GLA, 또는 아갈시다제 알파/베타), 쉰들러병(알파-NAGA 결핍), GM1 강글리오시드증, GM2 강글리오시드증(베타-헥소스아미니다제 결핍), 잔트호프병(헥소스아미니다제-B 결핍), 테이-삭스병(헥소스아미니다제-A 결핍), 고셔병 유형 1/2/3(글루코세레브로시다제 결핍-유전자 명칭: GBA), 월만병(LAL 결핍), 니만-픽병 유형 A/B(스핑고미엘린 포스포디에스테라제 1 결핍--SMPD1 또는 산 스핑고미엘리나제), 설파티도증(Sulfatidosis), 이염색 백색질장애, 헐러 증후군(알파-L 이두로니다제 결핍--IDUA), 헌터 증후군 또는 MPS2(이두로네이트-2-설파타제 결핍-이두르설파제 또는 IDS), 산필리포 증후군, 모르퀴오, 마로토-라미 증후군, 슬라이 증후군(β-글루쿠로니다제 결핍), 점액지질증, I-세포병, 지질증, = 신경 세로이드 리포푸스신증, 바텐병(트리펩티딜 펩티다제-1 결핍), 폼페(알글루코시다제 알파 결핍), 저인산증(아스포타제 알파 결핍), MPS1(라로니다제 결핍), MPS3A(헤파린 N-설파타제 결핍), MPS3B(알파-N-아세틸글루코사미니다제 결핍), MPS3C(헤파린-a-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제 결핍), MPS3D(N-아세틸글루코사민 6-설파타제 결핍), MPS4(엘로설파제 알파 결핍), MPS6(글라설페이트 결핍), MPS7(B-글루코로니다제 결핍), 페닐케톤뇨증(페닐알라닌 하이드록실라제 결핍) 및 MLD(아릴설파타제 A 결핍)를 포함한다. 집합적으로, LSD는 7000명의 출생 중 약 1명의 인구에서의 발생률을 가지며, 조기 사망을 포함하는 심각한 영향을 미친다. 이들 질병 중 일부에 대한 가능한 치료법에 대한 임상 시험이 진행 중이지만, 현재 많은 LSD에 대해 승인된 치료법이 없다. 전부는 아닌 일부 LSD에 대한 현재의 치료 옵션은 효소 대체 요법(ERT)을 포함한다. ERT는 신체에 부족하거나 부재하는 효소를 대체하는 의학적 치료법이다. 일부 예에서, 이는 환자에게 효소를 함유하는 용액의 정맥내(IV) 주입을 제공함으로써 수행된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물을 사용하여 개별 효소 대체 요법을 제공하는 것을 포함하는 LSD의 치료를 필요로 하는 개체에서 LSD를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 효소를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 생체 외 변형된 숙주 세포를 포함하며, 상기 변형된 숙주 세포는 영양요구 인자에 대해 영양요구성이고 개체에서 결핍된 효소를 발현하고 이에 의해 개체에서 LSD를 치료할 수 있다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 표 1의 유전자 내에 있거나 표 1의 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 우리딘이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 홀로카르복실라제 신세타제(HLCS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 비오틴이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 아스파라긴 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아스파라긴이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 아스파테이트 트랜스아미나제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아스파테이트이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 알라닌 트랜스아미나제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 알라닌이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 시스타티오닌 베타 신타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 시스테인이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 시스타티오닌 감마-리아제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 시스테인이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 글루타민 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 글루타민이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 세린 또는 글리신이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 글리신 신타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 글리신이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 포스포세린 트랜스아미나제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 세린이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 포스포세린 포스파타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 세린이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 페닐알라닌 하이드록실라제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 티로신이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 아르기니노숙시네이트 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아르기닌이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 아르기니노숙시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아르기닌이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 디하이드로폴레이트 환원효소를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 폴레이트 또는 테트라하이드로폴레이트이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물을 사용하여 개별 단백질 대체 요법을 제공하는 것을 포함하는 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 추가로 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 생체 외 변형된 숙주 세포를 포함하며, 상기 변형된 숙주 세포는 영양요구 인자에 대해 영양요구성이고 개체에서 결핍된 단백질을 발현하고 이에 의해 개체에서 질병 또는 장애를 치료할 수 있다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 표 1의 유전자 내에 있거나 표 1의 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 우리딘이다. 일부 예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 홀로카르복실라제 신세타제(HLCS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 비오틴이다. 일부 예에서, 질병은 프리드리히 운동실조이고, 단백질은 프라탁신이다. 일부 예에서, 질병은 유전성 혈관부종이고, 단백질은 C1 에스테라제 억제제(예를 들어, HAEGAARDA® 피하 주사)이다. 일부 예에서, 질병은 척추 근육 위축이고, 단백질은 SMN1이다.
III. 변형된 세포를 제조하기 위한 조성물 및 방법
A. 세포
일부 구현예에서, 영양요구성이 되도록 유전적으로 조작되고(영양요구성 유도 유전자좌에서 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진의 삽입을 통함) 치료 인자를 발현할 수 있는 변형된 숙주 세포, 바람직하게는 인간 세포를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내 변형된 동물 세포, 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포가 고려된다. 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 래트와 같은 상업적으로 관련된 포유동물을 포함하는 포유동물; 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함하는 조류의 세포가 또한 포함된다.
일부 구현예에서, 세포는 배아 줄기 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 다능성 줄기 세포, 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, 체세포 줄기 세포, 분화된 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 중간엽 간질 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포, 지방 줄기 세포, 각질세포, 골격 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 섬유모세포, NK 세포, B 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 예를 들어, 세포는 CAR을 발현하도록 조작되어 CAR-T 세포를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포주는 영양요구성이 되도록 유전적으로 조작된 T 세포이다. 조작된 영양요구 T 세포는 영양요구 인자와 함께 암을 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 암의 파괴시, 영양요구 영양소가 제거되어 조작된 영양요구 T 세포의 제거를 발생시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포주는 영양요구성이 되도록 유전적으로 조작된 다능성 줄기 세포이다. 조작된 영양요구 다능성 줄기 세포는 영양요구 인자와 함께 환자에게 투여될 수 있다. 조작된 영양요구 다능성 줄기 세포의 암 세포로의 전환시, 영양요구 인자는 제거되어 암 세포 및 조작된 영양요구 다능성 줄기 세포의 제거를 발생시킬 수 있다.
대상체에 투여되는 경우 변형된 세포의 면역 거부를 방지하기 위해, 변형될 세포는 바람직하게는 대상체 자신의 세포로부터 유래된다. 따라서, 바람직하게는 포유동물 세포는 변형된 세포로 치료할 대상체로부터 유래된다. 일부 예에서, 포유동물 세포는 자가 세포가 되도록 변형된다. 일부 예에서, 포유동물 세포는 동종이형 세포가 되도록 추가로 변형된다. 일부 예에서, 변형된 T 세포는, 예를 들어, T 세포 수용체 유전자좌를 비활성화시킴으로써 동종이형이 되도록 추가로 변형될 수 있다. 일부 예에서, 변형된 세포는, 예를 들어, 세포의 표면에서 MHC 클래스 I을 제거하기 위해 B2M을 결실시키거나, B2M를 결실시킨 후 HLA-G-B2M 융합체를 표면에 다시 첨가하여 표면에 MHC 클래스 I을 갖지 않는 세포의 NK 세포 거부를 방지함으로써 동종이형이 되도록 추가로 변형될 수 있다.
세포주는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 U.S. 8,945,862호에 제시된 바와 같이 하기 기술을 사용하여 유지되고 분화된 줄기 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포가 아니다. 또한, 세포주는 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO 2003/046141호 또는 문헌[Chung et al. (Cell Stem Cell, February 2008, Vol. 2, pages 113-117)]에 개시된 기술에 의해 제조된 줄기 세포를 포함할 수 있다.
예를 들어, 세포는 상피, 연골, 뼈, 평활근, 가로무늬근, 신경 상피, 중층 편평 상피 및 신경절 중 임의의 것의 재생 의료 치료에서 사용하기 위해 대상체로부터 분리된 줄기 세포일 수 있다. 파킨슨병 및 소아 발병 당뇨병과 같은 하나 또는 몇 가지 세포 유형의 사멸 또는 기능 장애로부터 발생하는 질병은 또한 일반적으로 줄기 세포를 사용하여 치료된다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Thomson et al., Science, 282:1145-1147, 1998]을 참조한다).
일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수확되고, 특정 세포 유형을 선택하고, 선택적으로 세포를 확장하고, 선택적으로 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있고, 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 트랜스진을 함유하는 세포를 선택하는 것을 선택적으로 포함할 수 있는 본원에 개시된 방법에 따라 변형된다.
B. 트랜스진을 삽입하기 위한 공여체 주형 또는 벡터
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 트랜스진을 영양요구성 유도 유전자좌에 삽입하기 위한 공여체 주형 또는 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 공여체 주형은 (a) 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성이거나 상기 영양요구성 유도 유전자좌의 상보체에 상동성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 선택적으로 발현 제어 서열에 연결된 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함한다. 예를 들어, DNA를 절단하기 위해 뉴클레아제 시스템이 사용된 후, 공여체 주형의 도입은 상동성 특이적 복구 메커니즘을 이용하여 DNA에서의 파괴의 복구 동안 트랜스진 서열을 삽입할 수 있다. 일부 예에서, 공여체 주형은 공여체 주형이 파괴에 인접한 영역에 하이브리드화되고 파괴를 복귀하기 위한 주형으로 사용되도록 하는 파괴의 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상동성인 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 트랜스진의 양쪽 측면에 영양요구성 유도 유전자좌의 단편 또는 이의 상보체에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 측접한다.
일부 예에서, 공여체 주형은 단일 가닥, 이중 가닥, 플라스미드 또는 DNA 단편이다.
일부 예에서, 플라스미드는 프로모터 및 선택적으로 3' UTR을 포함하여 복제에 필요한 요소를 포함한다.
(a) 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성이거나 상기 영양요구성 유도 유전자좌의 상보체에 상동성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 개시된다.
벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스(통합 적격 및 통합 결함 렌티바이러스 벡터 둘 모두), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 복제에 필요한 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 작제물은 (1) 바이러스를 생성시키기 위한 바이러스 벡터 백본, 예를 들어, AAV 백본; (2) 표적 부위에 대해 적어도 200 bp 상동성이지만, 이상적으로는 상기 부위에 대한 높은 수준의 재현 가능한 표적화를 보장하기 위해 각각의 측면에서 400 bp 상동성인 아암(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Porteus, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 56:163-190 (2016)] 참조); (3) 치료 인자를 인코딩하고 치료 인자를 발현할 수 있는 트랜스진; (4) 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열; 및 선택적으로 (5) 변형된 숙주 세포의 농축 및/또는 모니터링을 가능하게 하는 추가 마커 유전자를 포함한다.
적합한 마커 유전자는 당 분야에 공지되어 있으며, Myc, HA, FLAG, GFP, 트렁케이션된 NGFR, 트렁케이션된 EGFR, 트렁케이션된 CD20, 트렁케이션된 CD19, 뿐만 아니라 항생제 내성 유전자를 포함한다.
당 분야에 공지된 임의의 AAV가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 일차 AAV 혈청형은 AAV6이다.
임의의 상기 구현예에서, 공여체 주형 또는 벡터는 영양요구성 유도 유전자좌의 단편, 선택적으로 하기 표 1의 임의의 유전자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 영양요구성 유도 유전자좌의 적어도 200, 250, 300, 350 또는 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85, 88, 90, 92, 95, 98 또는 99% 동일하고; 최대 400개의 뉴클레오티드는 일반적으로 정확한 재조합을 보장하기에 충분하다. 예를 들어, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일한 상기 파라미터의 임의의 조합이 구상된다.
본원의 개시내용은 또한 상기 공여체 주형 또는 벡터, cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하기 위한 시스템을 고려한다.
본원의 개시는 상기 공여체 주형 또는 벡터 및 상기 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 메가뉴클레아제를 포함하는 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하기 위한 시스템을 추가로 고려한다. 메가뉴클레아제는, 예를 들어, ZFN 또는 TALEN일 수 있다.
삽입된 작제물은 또한 급성 독성으로 인해 세포의 신속한 제거가 필요할 수 있는 상황에서 유전자좌로의 표준 자살 유전자(예를 들어, iCasp9)와 같은 다른 안전 스위치를 포함할 수 있다. 본 발명의 개시는 영양요구 인자의 제거에 의해 신체에 이식된 임의의 조작된 세포가 제거될 수 있도록 강력한 안전 스위치를 제공한다. 이는 조작된 세포가 암세포로 형질전환된 경우 특히 중요하다.
일부 예에서, 공여체 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 선택적으로 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 제어 서열은 프로모터 또는 인핸서, 유도성 프로모터, 항시성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 발현 제어 서열, 전사 후 조절 서열 또는 마이크로RNA이다.
C. 뉴클레아제 시스템
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 영양요구성 유도 유전자좌를 표적화하는 뉴클레아제 시스템을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 개시는 (a) 상기 영양요구성-유도 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 메가뉴클레아제, 또는 (b) 상기 메가뉴클레아제를 발현시키기 위한 벡터 시스템을 포함하여 상기 메가뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 고려한다. 일 예로서, 메가뉴클레아제는 (i) 영양요구성 유도 유전자좌에 결합하는 전사 활성화제 유사 효과기(TALE) DNA 결합 도메인으로서, TALE DNA 결합 단백질이 복수의 TALE 반복 단위를 포함하고, 각각의 TALE 반복 유닛이 영양요구성 유도 유전자좌에서 표적 서열의 뉴클레오티드에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는, TALE DNA 결합 도메인, 및 (ii) DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질인 TALEN이다.
또한, (a) Cas(예를 들어, Cas9) 또는 Cpf1 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 및 (b) 상기 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적으로 하이브리드화되는 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 상기 영양요구성 유도 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템이 본원에 개시된다. 자연적으로, Cas9 시스템은 cas9 폴리펩티드, crRNA 및 전이활성 crRNA(tracrRNA)로 구성된다. 본원에서 사용되는 "cas9 폴리펩티드"는 천연 발생 cas9 폴리펩티드 또는 DNA의 적어도 하나의 가닥을 절단하는 능력을 보유하는 변형된 cas9 폴리펩티드를 나타낸다. 변형된 cas9 폴리펩티드는, 예를 들어, 천연 발생 Cas9 폴리펩티드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일할 수 있다. 상이한 박테리아 종으로부터의 Cas9 폴리펩티드가 사용될 수 있으며; S. 피오게네스(S. pyogenes)는 일반적으로 상업적으로 판매된다. cas9 폴리펩티드는 일반적으로 이중 가닥 파괴를 생성하지만, HNH 또는 RuvC 도메인에 불활성화 돌연변이를 도입시킴으로써 DNA의 단일 가닥만 절단(즉, "단일 가닥 파괴"를 생성)하는 닉카제로 전환될 수 있다. 유사하게, 천연 발생 tracrRNA 및 crRNA는 계속 하이브리드화하고 원하는 DNA를 표적화하는 능력 및 cas9에 결합하는 능력을 유지하는 한 변형될 수 있다. 가이드 RNA는 2개의 RNA가, 예를 들어, 인공 루프와 함께 융합된 키메라 RNA일 수 있거나, 가이드 RNA는 2개의 하이브리드화된 RNA를 포함할 수 있다. 메가뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템은, 예를 들어, 오버행을 포함하는 절단된 말단을 생성하기 위해 영양요구성 유도 유전자좌 내에서 이중 가닥 파괴 또는 하나 이상의 단일 가닥 파괴를 생성할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 뉴클레아제 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 공여체 주형을 추가로 포함한다.
예를 들어, 유전자 넉아웃 또는 유전자의 발현이 하향조절되도록 하는 핵산 편집을 위한 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 또는 이들의 조합과 같은 다양한 뉴클레아제 시스템이 핵산을 편집하는 데 사용되는 것으로 당 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 개시에서 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 전형적으로 연장되거나 융합된 DNA 인지 서열을 갖는 천연 발생 제한 효소의 변형된 버전이다.
CRISPR/Cas 시스템은, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO 2013/176772호, WO 2014/093635호 및 WO 2014/089290호에 상세히 기재되어 있다. T 세포에서의 이의 사용은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO 2014/191518호에서 제안되어 있다. T 세포의 CRISPR 조작은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 EP 3004349호에 논의되어 있다.
돌연변이체(넉아웃, 넉인 또는 유전자 대체) 세포주의 생성을 위한 시간 제한 요인은 CRISPR/Cas9 플랫폼의 개발 전의 클론 스크리닝 및 선택이었다. 본원에서 사용되는 용어 "CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템"은 Cas9에 대한 결합 부위를 갖는 가이드 RNA(gRNA) 서열 및 변형될 영역에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 유전 공학 도구를 나타낸다. Cas9은 gRNA에 결합하여 표적 영역에 결합하고 이를 절단하는 리보핵단백질을 형성한다. CRISPR/Cas9은 다중 유전자 편집의 용이한 다중화를 허용한다. 일부 구현예에서, gRNA는 SEQ ID NO:1의 핵산 서열을 포함한다.
CRISPR/Cas9 플랫폼(유형 II CRISPR/Cas 시스템임) 외에도, 유형 I CRISPR/Cas 시스템, 유형 III CRISPR/Cas 시스템 및 유형 V CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 대안적 시스템이 존재한다. 몇 가지 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas9(StCas9), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9(CjCas9) 및 나이세리아 시네레아(Neisseria cinerea) Cas9(NcCas9)를 포함하는 다양한 CRISPR/Cas9 시스템이 개시되었다. Cas 시스템에 대한 대안은 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cpf1(FnCpf1), 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) Cpf1(AsCpf1) 및 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 Cpf1(LbCpf1) 시스템을 포함한다. 상기 CRISPR 시스템 중 임의의 것이 본원에 개시된 세포주를 생성하는 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 CRISPR 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템, 예를 들어, S. 피오게네스 CRISPR/Cas9 시스템일 수 있다.
IV. 변형된 숙주 세포를 생성하는 방법
일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 표 1에 개시된 것으로부터 선택된 표적 유전자, 또는 상기 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 UMPS(우라실에 대한 영양요구성 세포주 생성) 및 홀로카르복실라제 신세타제(비오틴에 대한 영양요구성 세포주 생성)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 영양요구 인자는 비오틴, 알라닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 세린, 우라실 및 콜레스테롤로부터 선택된다.
(a) 영양요구성 유도 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제 시스템의 성분, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 예를 들어, ZFN 또는 TALEN, 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제, 예를 들어, CRISPR/Cas9, 및 (b) 본원에 기재된 바와 같은 공여체 주형 또는 벡터를 세포에 도입시키는 것을 포함하는 본원에 기재된 변형된 숙주 세포를 생성시키기 위해 상기 뉴클레아제 시스템을 사용하는 방법이 본원에 추가로 개시된다. 각각의 성분은 세포에 직접 도입될 수 있거나, 상기 하나 이상의 뉴클레아제 시스템의 성분을 인코딩하는 핵산을 도입함으로써 세포에서 발현될 수 있다. 상기 방법은 또한 제2 뉴클레아제 시스템, 예를 들어, 제2 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 제2 메가뉴클레아제 또는 제2 CRISPR/Cas 뉴클레아제, 또는 제2 유전자좌에서 DNA를 표적화하는 제2 가이드 RNA, 또는 상기 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산, 및 (b) 제2 공여체 주형 또는 벡터를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 제2 공여체 주형 또는 벡터는 상이한 트랜스진 또는 동일한 트랜스진의 제2 카피를 함유할 수 있으며, 이는 이후 상기 방법에 따라 제2 유전자좌에 통합될 것이다.
상기 방법은 생체 외 숙주 세포에서 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진의 통합을 표적화할 것이다.
상기 방법은 (a) 선택적으로 상기 세포를 확장한 후 또는 선택적으로 상기 세포를 확장하기 전에 공여체 주형 또는 벡터를 세포에 도입하고, (b) 선택적으로 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 개시는 (a) Cas9 폴리펩티드 또는 상기 Cas9 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, (b) 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 (c) 본원에 기재된 바와 같은 공여체 주형 또는 벡터를 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는 변형된 포유동물 숙주 세포를 생성시키는 방법을 고려한다. 상기 방법은 또한 (a) 제2 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 제2 가이드 RNA 및 (b) 제2 공여체 주형 또는 벡터를 도입시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 가이드 RNA는 키메라 RNA 또는 2개의 하이브리드화된 RNA일 수 있다.
임의의 이들 방법에서, 뉴클레아제는 영양요구성 유도 유전자좌 내에서 하나 이상의 단일 가닥 파괴, 또는 영양요구성 유도 유전자좌 내에서 이중 가닥 파괴를 생성시킬 수 있다. 이들 방법에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 상기 공여체 주형 또는 벡터와의 상동성 재조합에 의해 변형되어 유전자좌에 트랜스진의 삽입을 발생시킨다.
상기 방법은 (c) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 트랜스진을 함유하는 세포를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 선택 단계는 (i) 생존을 위해 영양요구 인자를 필요로 하는 세포를 선택하고, 선택적으로 (ii) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 트랜스진을 포함하는 세포를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제를 인코딩하는 유전자이고, 세포는 이들을 5-FOA와 접촉시킴으로써 선택된다. UMPS 유전자는 5-FOA를 5-FUMP로 대사하는 데 필요하며, 이는 RNA/DNA로의 이의 통합으로 인해 세포에 대해 독성이다. 따라서, UMPS 유전자에서 파괴를 갖는 세포는 5-FOA 처리에서 생존할 것이다. 모든 세포가 트랜스진을 함유할 수 있는 것은 아니지만, 결과로서 발생되는 세포는 모두 영양요구성일 것이다. 트랜스진에 대한 후속 양성 선택은 영양요구성이고 트랜스진을 또한 발현할 수 있는 변형된 숙주 세포만 분리할 것이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시는 (a) 세포의 푸울(pool)을 획득하는 단계, (b) 예를 들어, 유전자의 발현을 넉아웃시키거나 하향조절함으로써 영양요구성 유도 유전자좌에 트랜스진을 도입하기 위해 뉴클레아제를 사용하는 단계, (c) 영양요구성에 대해 스크리닝하는 단계, 및 (d) 트랜스진의 존재에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 변형된 인간 숙주 세포를 생성시키는 방법을 제공한다.
스크리닝 단계는 표 1에 개시된 영양요구 인자 중 하나와 함께 또는 없이 세포를 배양함으로써 수행될 수 있다.
기능성 인자, 항체 및 세포 표면 수용체를 발현할 수 있는 큰 트랜스진을 포함하는 트랜스진의 삽입을 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bak and Porteus, Cell Rep. 2017 Jul 18; 20(3): 750-756(EGFR의 통합); Kanojia et al., Stem Cells. 2015 Oct;33(10):2985-94(항-Her2 항체의 발현); Eyquem et al., Nature. 2017 Mar 2;543(7643):113-117(CAR의 부위 특이적 통합); O'Connell et al., 2010 PLoS ONE 5(8): e12009(인간 IL-7의 발현); Tuszynski et al., Nat Med. 2005 May;11(5):551-5(섬유모세포에서의 NGF의 발현); Sessa et al., Lancet. 2016 Jul 30;388(10043):476-87(MLD를 치료하기 위한 생체 외 유전자 요법에서의 아릴설파타제 A의 발현); Rocca et al., Science Translational Medicine 25 Oct 2017: Vol. 9, Issue 413, eaaj2347(프라탁신의 발현); Bak and Porteus, Cell Reports, Vol. 20, Issue 3, 18 July 2017, Pages 750-756(단일 유전자좌로의 큰 트랜스진 카세트 통합), Dever et al., Nature 17 November 2016: 539, 384-389(변형된 세포를 선택하고 농축시키기 위한 조혈 줄기 세포(HSC) 및 HSPC로 tNGFR 첨가)] 참조).
A. 영양요구성 유도 유전자좌 및 영양요구 인자
일부 구현예에서, 단일 유전자의 파괴는 원하는 영양요구성을 유발한다. 대안적 구현예에서, 다중 유전자의 파괴는 원하는 영양요구성을 생성한다.
일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 영양요구 인자를 생성하기 위한 경로의 상류에 있는 단백질을 포함하는 영양요구 인자를 생성하는 단백질을 인코딩하는 유전자이다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자(및 상응하는 영양요구 인자는 우라실임) 또는 홀로카르복실라제 신세타제를 인코딩하는 유전자(및 상응하는 영양요구 인자는 비오틴임)이다. 일부 구현예에서, 영양요구성 유도 유전자좌는 표 1의 하기 유전자로부터 선택된다. 표 1의 유전자는 사카로마이세스 유전체 데이터베이스(SGD)의 효모 표현형 온톨로지 데이터베이스로부터의 "화학(Chemical)" 데이터와 함께 다운로드된 "영양요구성(Auxotrophy)"으로 주석이 달린 표현형을 갖는 S. 세레비지에 유전자를 선택함으로써 대조되었다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Cherry et al. 2012, Nucleic Acids Res. 40:D700-D705] 참조). 이들 유전자는 YeastMine® 데이터베이스 또는, 대안적 구현예에서, 사카로마이세스 유전체 데이터베이스(SGD)를 사용하여 인간 동족체로 전환되었다. 유전자는 ENSEMBL 데이터베이스(www.ensembl.org)에서 발견되는 ENSEMBL 유전자 기호 및 ENSG 식별자로 확인된다. ENSG 식별자의 처음 5개의 0(예를 들어, ENSG00000)이 제거되었다.
표 1. 영양요구성 유도 유전자좌
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Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
CCBL1은 또한 KYAT1으로 언급될 수 있다. CCBL2는 또한 KYAT3으로 언급될 수 있다. DHFRL1은 또한 DHFR2로 언급될 수 있다. PYCRL은 또한 PYCR3로 언급될 수 있다. HRSP12는 또한 RIDA로 언급될 수 있다.
영양요구 인자는 1개 또는 2개 또는 그 초과의 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도, 비-유기 분자, 비-필수 아미노산, 또는 변경된 농도의 모이어티(정상 생리학적 농도에 비함), 또는 이들의 조합일 수 있다. 본원에서 영양요구 인자에 대한 모든 언급은 다수의 인자의 투여를 고려한다. 임의의 인자는 대상체에게 독성이 없고, 변형된 숙주 세포의 성장 및 생식을 유지하기 위해 미처리된 대상체에서 생물학적으로 이용 가능하지 않거나 충분한 농도로 존재하지 않는 한 적합하다.
예를 들어, 영양요구 인자는 증식에 필요한 물질이거나 변형된 숙주 세포의 대사에서 보조인자로 기능하는 영양소일 수 있다. 다양한 영양요구 인자가 표 1에 개시되어 있다. 특정 구현예에서, 영양요구 인자는 비오틴, 알라닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 세린, 우라실, 발린 및 콜레스테롤로부터 선택된다. 비타민 B7으로도 공지된 비오틴은 세포 성장에 필요하다. 일부 예에서, 발린은 조혈 줄기 세포의 증식 및 유지에 필요하다. 일부 예에서, 본원에 개시된 조성물은 발린 보충에 대한 필요성을 완화하고 이에 의해 발린이 변형되지 않은 세포에 비해 식이에서 제거되는 경우 이들 세포에 선택적 이점을 제공하는 HSC에서 효소를 발현시키는 데 사용된다.
B. 트랜스진
변형된 숙주 세포의 유전체에 의해 인코딩된 치료적 실체는 분자 트래피킹, 세포 사멸 유도, 추가 세포 모집 또는 세포 성장과 같은 치료 효과를 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 치료 단백질의 발현이다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 종양 세포의 세포 사멸을 포함하는 유도된 세포 사멸이다.
C. 트랜스진 발현의 제어
일부 예에서, 트랜스진은 유전자의 내인성 프로모터, 또는 이종성 항시성 또는 유도성 프로모터, 인핸서, 조직 특이적 프로모터, 또는 전사 후 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 제어 서열에 선택적으로 연결된다. 예를 들어, 트랜스진 발현을 유도하기 위해 조직 특이적 프로모터(전사 표적화)를 사용하거나, 특정 조직에서의 발현을 피하기 위해(전사 후 표적화) RNA에 조절 서열(마이크로RNA(miRNA) 표적 부위)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 정상 개체에서와 동일한 발현 패턴(생리학적 발현)에 따라 치료 트랜스진을 발현하는 기능을 한다(프로모터 및 조절 서열에 대한 참조를 위해 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Toscano et al., Gene Therapy (2011) 18, 117-127 (2011)] 참조).
항시성 포유동물 프로모터는 다음 유전자에 대한 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스페라제(HPTR), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, α-액틴 프로모터 및 기타 항시성 프로모터. 진핵생물 세포에서 항시적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는, 예를 들어, 원숭이 바이러스, 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스로부터의 프로모터, 몰로니 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복(LTR), 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터/인핸서, EF1a(신장 인자 1a), SV40(원숭이 바이러스 40), 닭 β-액틴 및 CAG(CMV, 닭 β-액틴, 토끼 β-글로빈), 유비퀴틴 C 및 PGK를 포함하는 일반적으로 사용되는 프로모터는 모두 대부분의 세포 유형에서 항시적으로 활성인 높은 수준의 유전자 발현을 제공한다. 다른 항시성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.
유도성 프로모터는 유도제의 존재하에서 활성화된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재하에서 전사 및 번역을 증가시키기 위해 활성화된다. 다른 유도성 프로모터는 알콜-조절, 테트라사이클린-조절, 스테로이드-조절, 금속-조절, 영양소-조절 프로모터, 및 온도-조절 프로모터를 포함한다.
간-특이적 표적화의 경우: 천연 및 키메라 프로모터 및 인핸서는 바이러스 및 비-바이러스 벡터에 통합되어 간세포에 대한 인자 VIIa, 인자 VIII 또는 인자 IX의 발현을 표적화하였다. 알부민 및 인간 α1 항트립신(hAAT)과 같은 간 특이적 유전자로부터의 프로모터 영역은 천연 프로모터의 좋은 예이다. 대안적으로, 키메라 프로모터는 특이성 및/또는 벡터 효율을 증가시키기 위해 개발되었다. 좋은 예는 간-특이적 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 조합의 4개의 카피를 갖는 (ApoE)4/hAAT 키메라 프로모터/인핸서 및 hAAT 프로모터의 1개의 카피 및 α(1)-마이크로글로불린 인핸서의 2개의 카피로 구성되는 DC172 키메라 프로모터이다.
근육 특이적 표적화의 경우: 천연(크레아틴 키나제 프로모터-MCK, 데스민) 및 합성(α-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7)) 프로모터가 효율적이고 특이적인 근육 발현을 달성하기 위해 바이러스 및 비-바이러스 벡터에 포함되었다.
내피-특이적 표적화의 경우, 천연(vWF, FLT-1 및 ICAM-2) 및 합성 프로모터 둘 모두가 내피 특이적 발현을 유도하기 위해 사용되었다.
골수 세포 표적화의 경우, 과립구 분화 동안 고도로 발현되는 골수 전사 인자 CAAT 상자 인핸서-결합 패밀리 단백질(C/EBP) 및 PU.1에 대한 결합 부위를 함유하는 합성 키메라 프로모터가 주로 골수 세포에서 트랜스진 발현을 지시하는 것으로 보고되었다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Santilli et al., Mol Ther. 2011 Jan;19(1):122-32] 참조). CD68은 골수성 표적화에도 사용될 수 있다.
유전적 질병의 유전자 요법을 위한 조직 특이적 벡터의 예는 표 2에 제시된다.
표 2. 조직 특이적 벡터
Figure pct00005
Figure pct00006
유전적 질병의 유전자 요법을 위한 생리학적 조절 벡터의 예는 표 3에 제시된다.
표 3. 생리학적 조절 벡터
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조직 특이적 및/또는 생리학적 조절 발현은 또한 트랜스진의 mRNA 안정성 및/또는 번역 효율(전사 후 표적화)을 변형시킴으로써 추구될 수 있다. 대안적으로, 발현된 mRNA로의 miRNA 표적 인지 부위(miRT)의 통합은 특정 조직 또는 세포 유형에서 트랜스진 발현(탈표적화)을 차단하기 위해 내인성 숙주 세포 기계를 동원하는 데 사용되었다. miRNA는 miRT로 언급되는 특정 mRNA의 3' UTR 영역에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 약 22개의 뉴클레오티드인 비코딩 RNA이다. 특정 miRT에 대한 miRNA의 결합은 번역 감쇠/불활성화 및/또는 분해를 촉진한다. miRNA를 통한 발현의 조절은 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Geisler and Fechner, World J Exp Med. 2016 May 20, 6(2): 37-54; Brown and Naldini, Nat Rev Genet. 2009 Aug, 10(8):578-85; Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 Nov, 80(5):393-403]에 기재되어 있다. 특정 miRNA 세포 유형에 의해 인지되는 miRT-벡터를 조작하는 것은 원하지 않는 세포 유형에서 치료 유전자의 발현을 넉다운하기 위한 효과적인 방식인 것으로 나타났다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Toscano et al., 상기] 참조).
D. 약학적 조성물
일부 구현예에서, 변형된 세포의 사용을 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에 개시되며, 여기에는 변형된 세포의 성장 및 생식을 조절(증가, 감소 또는 중단)하고 트랜스진에 의한 치료 인자의 발현을 제어하기 위한 영양요구 인자의 약학적 조성물, 치료 방법 및 투여 방법이 포함된다.
변형된 포유동물 숙주 세포는 영양요구 인자와 별도로 또는 영양요구 인자와 조합하여 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 제공된 약학적 조성물의 설명은 주로 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 임의의 동물에 투여하기에 적합하다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
약학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 포유동물, 예를 들어, 상업적으로 관련된 포유동물, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 래트, 조류, 예를 들어, 상업적으로 관련된 조류, 예를 들어, 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상체에 투여된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 (i) 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도 및 니치(niche) 환경이 대상체에 존재하지 않도록 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도, 모이어티의 변경된 농도 및/또는 니치(niche) 환경에 대해 영양요구성인 세포주를 생성시키고; (ii) 대상체를 단계 (i)의 생성된 영양요구 세포주와 접촉시키고; (iii) 영양요구 인자가 영양요구 시스템 또는 요소를 활성화시켜 대상체에 대해 세포주의 성장 및/또는 하나 이상의 치료적 실체의 발현을 발생시키도록 (ii)의 대상체와 영양소, 효소, pH 및/또는 온도를 변경시키는 모이어티, 및 대상체의 세포 니치 환경으로부터 선택되는 영양요구 인자를 접촉시키는 것을 포함하는 대상체의 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 방법에서 사용된다.
본원의 개시의 약학적 조성물은 또한 (a) 본원의 개시에 따른 변형된 숙주 세포를 대상체에 투여하고, (b) 변형된 숙주 세포의 성장을 촉진하기에 충분한 양으로 영양요구 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
영양소 영양요구 인자를 포함하는 조성물은 또한 본원의 개시의 변형된 숙주 세포를 포함하는 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있다.
V. 제형
A. 세포 공학 제형
변형된 숙주 세포는 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 영양요구성 유도 유전자좌에 삽입하도록 유전적으로 조작된다. 원하는 유전자좌를 표적으로 하는 Cas9 단백질/gRNA 리보핵단백질 복합체(Cas9 RNP)의 전달은 리포솜 매개 형질감염, 전기천공 또는 핵 국소화에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 숙주 세포는 전기천공 후 혈청 함유 배지와 접촉된다. 일부 구현예에서, 변형된 숙주 세포는 전기천공 후 감소된 혈청을 함유하거나 혈청을 함유하지 않는 배지와 접촉된다.
B. 치료 제형
본원의 개시의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 (1) 안정성을 증가시키고/시키거나; (2) 생체분포(예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 세포주 표적화)를 변경시키고/시키거나; (3) 인코딩된 치료 인자의 방출 프로파일을 변경시키고/시키거나; (4) 영양요구 인자의 흡수를 개선시키기 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 개시의 제형은 염수, 리포솜, 지질 나노입자, 중합체, 펩티드, 단백질 및 이들의 조합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 적어도 하나의 활성 성분 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 나타낸다. 본 발명의 개시의 약학적 조성물은 멸균 약학적 조성물일 수 있다.
일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "활성 성분"은 일반적으로 (a) 영양요구성 유도 유전자좌에 삽입된 치료 인자를 발현할 수 있는 트랜스진을 포함하는 변형된 숙주 세포 또는 공여체 주형, 또는 (b) 상응하는 영양요구 인자, 또는 (c) 영양요구성 유도 유전자좌 내의 절단을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템을 나타낸다.
본원에 기재된 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자 및 약학적 조성물의 제형은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 개시에 따른 약학적 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조되고/되거나, 패키징되고/되거나, 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 별개의 양을 나타낸다.
본 발명의 개시에 따른 약학적 조성물 중 활성 성분(예를 들어, 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자), 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대량은 치료되는 대상체의 정체, 크기 및/또는 상태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 99%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100%, 예를 들어, 0.5 내지 50%, 1 내지 30%, 5 내지 80%, 또는 적어도 80%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
C. 부형제 및 희석제
일부 구현예에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 인간 용도 및 수의학적 용도로 승인된 것이다. 일부 구현예에서, 부형제는 미국 식품의약국에 의해 승인될 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 약학적 등급일 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준을 충족할 수 있다.
본원에서 사용되는 부형제는 원하는 특정 투여 형태에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 기타 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 약학적 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006] 참조). 임의의 통상적인 부형제 매질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 그렇지 않으면 유해한 방식으로 약학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 상호작용하는 것과 같이 물질 또는 이의 유도체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고는 통상적인 부형제 매질의 사용이 본 발명의 개시의 범위 내에서 고려될 수 있다.
예시적인 희석제는 칼슘 카르보네이트, 소듐 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 포스페이트 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말 설탕 등, 및/또는 이들의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
D. 비활성 성분
일부 구현예에서, 제형은 적어도 하나의 비활성 성분을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비활성 성분"은 제형에 포함된 약학적 조성물의 활성 성분의 활성에 기여하지 않는 하나 이상의 제제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 제형에서 사용될 수 있는 비활성 성분의 전부 또는 일부는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인될 수 있거나, 비활성 성분은 FDA에 의해 승인되지 않을 수 있다.
E. 약학적으로 허용되는 염
영양요구 인자는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물이 기존 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환(예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴에 의함)시켜 변형되도록 하는 개시된 화합물의 유도체를 나타낸다. 약학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대표적 산 부가염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠 설폰산, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실 설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발러레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등 뿐만 아니라 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다. 본 발명의 개시의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 무독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 무독성 염을 포함한다.
VI. 투약 및 투여
상기 기재된 약학적 조성물에 포함된 본 발명의 개시의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 임의의 전달 경로, 전신 전달 또는 국소 전달에 의해 투여될 수 있으며, 이는 치료적으로 효과적인 결과를 발생시킨다. 이들은 장내(장으로), 위장, 경막외(경질막으로), 경구(입을 통해), 경피, 뇌내(대뇌로), 뇌실내(뇌실로), 표피(피부 상의 적용), 피내(피부 자체로), 피하(피부 아래), 비강 투여(코를 통해), 정맥내(정맥으로), 정맥내 볼루스, 정맥내 점적, 동맥내(동맥으로), 근육내(근육으로), 심장내(심장으로), 골내 주입(골수로), 수막강내(척주관으로), 실질내(뇌 조직으로), 복강내(복막으로의 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내(눈을 통해), 해면내 주사(병리 강으로), 강내(음경의 기저로), 질내 투여, 자궁내, 양막외 투여, 경피(전신 분포를 위해 온전한 피부를 통한 확산), 경점막(점막을 통한 확산), 경질, 흡입법(코흡입), 설하, 구순하, 관장, 점안액(결막 위) 또는 귀물약, 귀(귀에 또는 귀를 통해), 협측(뺨쪽으로 향함), 결막, 피부, 치아(치아 또는 치아들로), 전기삼투, 자궁경내막, 부비동내, 기관내, 체외, 혈액투석, 침윤, 사이질, 복강내, 양막내, 관절내, 담도내, 기관지내, 활액낭내, 연골내(연골 내), 미추내(말총 내), 수조내(소뇌연수조 내), 각막내(각막 내), 덴탈 인트라코르날(dental intracornal), 관상동맥내(관상동맥 내), 해면체내(음경의 음경해면체의 확장 가능한 공간 내), 층판내(디스크 내), 관내(샘의 관 내), 십이지장내(십이지장 내), 경막내(경막 내 또는 아래), 표피내(표피로), 식도내(식도로), 위내(위 내), 치은내(치은 내), 회장내(소장의 원위 부분 내), 병변내(국소 병변 내 또는 직접 도입), 관내(관의 내강 내), 림프내(림프 내), 척수내(뼈의 골수강 내), 수막내(수막 내), 심근내(심근 내), 안구내(안구 내), 난소내(난소 내), 심낭내(심낭막 내), 흉강내(흉막 내), 전립선내(전립선 내), 폐내(폐 또는 이의 기관지 내), 부비동내(비강 또는 안와주위 부비동 내), 척주내(척주 내), 활액내(관절의 활액강 내), 건내(건 내), 고환내(고환 내), 수막강내(임의의 수준의 뇌척수 축에서 뇌척수액 내), 흉곽내(흉곽 내), 세뇨관내(장기의 세뇨관 내), 종양내(종양 내), 고실내(중이 내), 혈관내(혈관 또는 혈관들 내), 심실내(심실 내), 이온삼투요법(용해성 염의 이온이 신체 조직으로 이동하는 전류에 의함), 관류(개방 상처 또는 체강을 씻거나 플러싱함), 후두(후두에 직접), 비위(코를 통해 위까지), 폐쇄 드레싱 기술(국소 경로 투여 후 해당 부위를 막는 드레싱으로 덮음), 안구(외부 눈에), 입인두(입 및 인두에 직접), 비경구, 경피, 관절주위, 경질막주위, 신경주위, 치주, 직장, 호흡기(국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강으로 흡입함에 의한 기도 내), 눈뒤(교뇌 뒤 또는 안구 뒤), 연조직, 지주막하, 결막하, 점막하, 국소, 경태반(태반을 통하거나 가로지름), 경기관(기관 벽을 통함), 경고실(고실을 가로지르거나 통함), 요관(요관으로), 요도(요도로), 질, 미추 차단, 진단, 신경 차단, 담도 관류, 심장 관류, 광분반술, 및 척추를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
A. 비경구 및 주사 투여
일부 구현예에서, 변형된 숙주 세포는 비경구로 투여될 수 있다.
주사용 제조물, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제조물은, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 용액으로서 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 및/또는 용매 중의 멸균 주사 용액, 현탁액 및/또는 에멀젼일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, U.S.P., 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 용매 또는 현탁 매질로서 멸균 고정유가 통상적으로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 부드러운 고정유가 사용될 수 있다. 주사제의 제조에서 지방산, 예를 들어, 올레산이 사용될 수 있다.
주사용 제형은, 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과 및/또는 사용 전에 멸균수 또는 기타 멸균 주사용 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 멸균제를 혼입시킴에 의해 멸균될 수 있다.
활성 성분의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 활성 성분의 흡수를 늦추는 것이 종종 바람직하다. 이는 불량한 수 용해도를 갖는 결정성 또는 무정형 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 활성 성분의 흡수 속도는 용해 속도에 좌우되며, 이는 차례로 결정 크기 및 결정 형태에 좌우될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여되는 약물 형태의 지연 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다. 주사 가능한 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생물분해성 중합체에서 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성시킴으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용되는 특정 중합체의 특성에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생물분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(언하이드라이드)를 포함한다. 데포 주사 가능 제형은 약물을 신체 조직과 양립되는 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 포획하여 제조된다.
B. 데포 투여
본원에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 연장된 방출을 위해 데포에서 제형화된다. 일반적으로, 특정 기관 또는 조직("표적 조직")이 투여를 위해 표적화된다. 일부 구현예에서, 국소화된 방출은 생체적합성 장치의 사용을 통해 영향을 받는다. 예를 들어, 생체적합성 장치는 대상체에서 세포주의 확산을 제한할 수 있다.
본원의 개시의 일부 양태에서, 본 발명의 개시의 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 표적 조직 내에 또는 그 부근에서 공간적으로 보유된다. 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물이 표적 조직에서 실질적으로 유지되도록(이는 조성물의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 초과가 표적 조직에 유지됨을 의미함) 하는 조건하에서 표적 조직(하나 이상의 표적 세포를 포함함)과 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물을 접촉시킴으로써 포유동물 대상체의 표적 조직에 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 대상체에 투여되는 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물의 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과는 투여 후 일정 기간 동안 존재한다.
본 발명의 개시의 특정 양태는 표적 조직을 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물이 상기 표적 조직에서 실질적으로 유지되도록 하는 조건하에서 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물과 접촉시킴으로써 포유동물 대상체의 표적 조직에 본 발명의 개시의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 관심 효과가 적어도 하나의 표적 세포에서 생성되도록 하는 충분한 활성 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 세포 침투제를 포함하지만, 약학적으로 허용되는 부형제를 갖거나 갖지 않는 "네이키드" 제형(예를 들어, 세포 침투제 또는 다른 제제가 없음)이 또한 고려된다.
C. 치료 방법
본 발명의 개시는 약학적 조성물 또는 제형의 일부로서 포함되는 상기 기재된 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자 중 임의의 것을 포유동물 대상체를 포함하는 대상체에 전달하는 방법을 추가로 제공한다.
D. 용량 및 요법
본 발명의 개시는 본 발명의 개시에 따른 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 방법을 제공한다. 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물 및 본 발명의 개시의 조성물은 질병, 장애 및/또는 질환을 예방하거나, 치료하거나, 관리하거나, 진단하는 데 효과적인 임의의 양 및 임의의 투여 경로를 사용하여 대상체에 투여될 수 있다. 필요한 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 및 전반적 상태, 질병의 중증도, 특정 조성물, 이의 투여 방식, 이의 활성 방식 등에 따라 대상체마다 다양할 것이다. 대상체는 인간, 포유동물 또는 동물일 수 있다. 임의의 특정 개체에 대한 특정 치료적 유효, 예방적 유효 또는 적절한 진단 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 페이로드의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별 및 식이; 영양요구 인자의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자와 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 널리 공지된 유사한 요인을 포함하는 다양한 요인에 좌우될 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 개시에 따른 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자 약학적 조성물은 원하는 치료적, 진단적 또는 예방적 효과를 획득하기 위해 하루에 1회 이상 하루에 대상체 체중 기준으로 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.005 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.005 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg를 전달하기에 충분한 투여량 수준으로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 개시에 따른 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자 약학적 조성물은 약 10 내지 약 600 μl/부위, 50 내지 약 500 μl/부위, 100 내지 약 400 μl/부위, 120 내지 약 300 μl/부위, 140 내지 약 200 μl/부위, 약 160 μl/부위로 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 50 μl/부위 및/또는 150 μl/부위로 투여될 수 있다.
본 발명의 개시의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자의 원하는 투여량은 단지 1회, 하루에 3회, 하루에 2회, 하루에 1회, 격일, 3일마다, 매주, 2주마다, 3주마다 또는 4주마다 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 원하는 투여량은 다중 투여(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14회 이상의 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
본 발명의 개시의 변형된 숙주 세포의 원하는 투여량은 1회 또는 다수의 횟수로 투여될 수 있다. 영양요구 인자는 일정 기간 동안 설정된 빈도로 정기적으로, 또는 "지속적인 흐름"으로 지속적으로 투여된다. 24시간 기간 동안 제공되거나 처방되는 양인 전체 1일 용량은 이들 방법 중 임의의 방법에 의해 또는 이들 방법의 조합으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체로의 본 발명의 개시의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자의 전달은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 또는 10년 초과 동안 치료적 효과를 제공한다.
변형된 숙주 세포는 순차적으로 또는 동시에 하나 이상의 다른 치료적, 예방적, 연구 또는 진단 제제 또는 의료 절차와 조합하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 각각의 제제는 그 제제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 일정으로 투여될 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 생체이용률을 개선시키고/시키거나, 대사를 감소시키고/시키거나 변형시키고/시키거나, 배출을 억제하고/하거나, 신체 내의 분포를 변형시킬 수 있는 제제와 조합된 약학적, 예방적, 연구 또는 진단 조성물의 전달을 포함한다.
예를 들어, 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 치료에 대해 표적화된 영역에서 생체이용률을 증가시키기 위해 대상체에서의 확산을 제한하는 생체적합성 장치로서 투여된다. 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 또한 국소 전달에 의해 투여될 수 있다.
본원의 개시는 (a) 상기 변형된 세포를 투여하고, (b) 선택적으로 변형된 세포가 생착되도록 하는 컨디셔닝 요법을 투여하고, (c) 상기 영양요구 인자를 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 치료 인자를 발현시키는 방법을 고려한다.
용어 "컨디셔닝 요법"은 환자가 줄기 세포 이식 전에 받는 요법 과정을 나타낸다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식 전, 환자는 줄기 세포가 동일한 환자에서 유래한 경우에도 줄기 세포 이식 거부를 방지하기 위해 골수절제 요법, 비-골수절제 요법 또는 감소된 강도 컨디셔닝을 받을 수 있다. 컨디셔닝 요법은 세포독성제의 투여를 포함할 수 있다. 컨디셔닝 요법은 또한 면역억제, 항체 및 방사선조사를 포함할 수 있다. 다른 가능한 컨디셔닝 요법은 항체 매개 컨디셔닝(예를 들어, 문헌[Czechowicz et al., 318(5854) Science 1296-9 (2007); Palchaudari et al., 34(7) Nature Biotechnology 738-745 (2016); Chhabra et al., 10:8(351) Science Translational Medicine 351ra105 (2016)] 참조) 및 CAR-T 매개 컨디셔닝(예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Arai et al., 26(5) Molecular Therapy 1181-1197 (2018)] 참조)을 포함한다. 컨디셔닝은 조작된 HSC로부터 유래된 미세아교세포가 관심 단백질을 전달하기 위해 이동하기 위해 뇌에 공간을 만드는 데 사용되어야 한다(ALD 및 MLD에 대한 최근의 유전자 요법 시험). 컨디셔닝 요법은 또한 이식된 세포가 체내에서 생착 및 증식하는 장소를 갖는 것을 가능하게 하도록 니치 "공간"을 생성하도록 설계된다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식에서, 컨디셔닝 요법은 이식된 조혈 줄기 세포가 생착될 골수에 니치 공간을 만든다. 컨디셔닝 요법 없이, 이식된 조혈 줄기 세포는 생착될 수 없다. 일부 구현예에서, 세포주는 영양요구성이 되도록 유전적으로 조작된 T 세포이다. 조작된 영양요구 T 세포는 살아 있는 약물로서 작용하는 CAR T 세포로 사용될 수 있고, 조혈 줄기 세포 이식을 위해 환자를 컨디셔닝하기 위해 영양요구 인자와 함께 환자에 투여될 수 있다. 공여체 조혈 줄기 세포의 전달 전에, 영양요구 인자는 제거될 수 있으며, 이는 조작된 영양요구 T 세포의 제거를 발생시킨다. 일부 구현예에서, 세포주는 영양요구성이 되도록 유전적으로 조작된 동종이형 T 세포이다. 조작된 영양요구 동종이형 T 세포는 치료 효과를 제공하기 위해 영양요구 인자와 함께 환자에 투여될 수 있다. 환자가 이식편대숙주병(GvHD) 발생시, 영양요구 인자는 제거될 수 있고, 이는 동종반응성이 된 조작된 영양요구 동종이형 T 세포의 제거를 발생시킨다.
일부 구현예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 치료 인자를 발현하기에 충분한 기간 동안, 바람직하게는 치료 인자가 치료 효과를 발휘하기에 충분한 기간 동안 정기적으로 계속된다. 일부 구현예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 치료 인자의 발현을 감소시키기 위해 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 치료 인자의 발현을 증가시키기 위해 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 변형된 세포의 성장 억제 또는 사멸을 발생시키는 조건을 생성시키기 위해 중단된다. 일부 구현예에서, 상기 영양요구 인자의 투여는 변형된 세포의 성장 억제를 발생시키는 조건을 생성시키기 위해 일시적으로 중단된다.
본원의 개시는 또한 (a) 상기 변형된 포유동물 숙주 세포 및 (b) 치료량의 치료 인자의 발현을 발생시키기에 충분한 양의 상기 영양요구 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 질병, 장애 또는 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 고려한다.
질병, 장애 또는 질환의 치료를 위한 본 발명의 개시에 따른 변형된 포유동물 숙주 세포의 용도가 또한 본 발명의 개시에 포함된다.
특정 구현예는 암, 파킨슨병, 이식편 대 숙주병(GvHD), 자가면역 질환, 과증식 장애 또는 질환, 악성 형질전환, 간 질환, 유전적 유전 결함을 포함하는 유전 질환, 소아 발병 당뇨병 및 안구 구획 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 바와 같은 질병, 장애 또는 질환을 제공한다.
특정 구현예에서, 질병, 장애 또는 질환은 근육 계통, 골격계, 순환계, 신경계, 림프계, 호흡기 내분비계, 소화계, 배설계 및 생식계로 구성된 군으로부터 선택되는 신체의 적어도 하나의 계에 영향을 미친다. 대상체에서 하나 초과의 세포 유형에 영향을 미치는 질환은 각각의 세포주가 상이한 영양요구 인자에 의해 활성화된 하나 초과의 변형된 숙주 세포로 치료될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 하나 초과의 영양요구 인자가 투여될 수 있다.
특정 구현예는 세포주를 재생성으로 제공한다. 본 발명의 개시의 양태에서, 대상체는 하나 초과의 변형된 숙주 세포 및/또는 하나 이상의 영양요구 인자와 접촉될 수 있다. 특정 구현예는 영양요구 인자, 예를 들어, 영양소 또는 효소의 국소화된 방출을 제공한다. 대안적 구현예는 전신 전달을 제공한다. 예를 들어, 국소화된 방출은 생체적합성 장치의 사용을 통해 영향을 받는다. 본 발명의 개시의 양태에서, 생체적합성 장치는 대상체에서 세포주의 확산을 제한할 수 있다. 방법의 특정 구현예는 대상체에서 변형된 숙주 세포의 치료 효과를 고갈시키거나 변형된 숙주 세포에서 세포 사멸을 유도하기 위해 영양요구 인자를 제거하는 것을 제공한다. 방법의 특정 구현예는 분자 트래피킹, 세포 사멸 유도, 세포 사멸 및 추가 세포 동원으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 치료 효과를 제공한다. 방법의 특정 구현예는 변형되지 않은 숙주 세포가 변형된 숙주 세포를 이용한 대상체의 치료 전에 동일한 대상체로부터 유래되는 것을 제공한다.
본 발명의 개시는 선택적으로 용기 또는 바이알에 상기 조성물 또는 상기 조성물의 성분을 포함하는 키트를 고려한다.
VII. 정의
숫자값 x와 관련된 용어 "약"은, 예를 들어, x±10%를 의미한다.
용어 "활성 성분"은 일반적으로 치료 효과를 발휘하는 데 관여하는 조성물의 성분을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이는 일반적으로 (a) 본원에 기재된 바와 같은 트랜스진을 포함하는 변형된 숙주 세포 또는 공여체 주형, (b) 본원에 기재된 바와 같은 상응하는 영양요구 인자, 또는 (c) 영양요구성 유도 유전자좌 내에서 절단을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "변경된 농도"는 본원에 기재된 약학적 조성물의 투여 전의 대상체에서 영양요구 인자의 농도와 비교하여 영양요구 인자의 농도 증가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "변경된 pH"는 본원에 기재된 약학적 조성물의 투여 전의 대상체의 pH와 비교하여 대상체에서 유도된 pH의 변화를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "변경된 온도"는 본원에 기재된 약학적 조성물의 투여 전의 대상체의 온도와 비교하여 대상체에서 유도된 온도의 변화를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "영양요구성" 또는 "영양요구"는 세포의 성장 및 생식을 유지하기 위해 영양요구 인자의 외인성 투여를 필요로 하는 세포의 상태를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "영양요구성 유도 유전자좌"는 파괴되는 경우 세포가 영양요구성이 되도록 하는 세포 내의 염색체의 영역을 나타낸다. 예를 들어, 세포는 영양요구 인자의 합성, 재활용 또는 구제에 관여하는 효소를 인코딩하는 유전자를 파괴하거나(직접적으로 또는 영양요구 인자를 제조하는 데 사용되는 중간체 합성을 통해 업스트림으로), 유전자의 발현을 조절하는 발현 제어 서열을 파괴함으로써 영양요구성이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생체이용률"은 대상체에 투여된 제공된 양의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자의 전신 이용 가능성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "Cas9"은 유전체 편집에 사용하기 위한 엔도뉴클레아제인 CRISPR-관련 단백질 9를 나타낸다.
용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "구성되는"을 의미하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수 있거나, 예를 들어, X + Y와 같이 추가적인 것을 포함할 수 있다.
용어 "컨디셔닝 요법"은 환자가 줄기 세포 이식 전에 받는 요법 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "연속 흐름"은 단일 경로/단일 접촉 지점에서 일정 기간 동안 연속적으로, 즉, 연속 투여 사건으로 투여되는 치료제의 용량을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR"은 침입 세포의 RNA 뉴클레오티드를 절단하는 효소를 배치하는 DNA의 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템"은 Cas9에 대한 결합 부위를 갖는 가이드 RNA(gRNA) 서열 및 표적 DNA에서 절단될 부위에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 유전 공학 도구를 나타낸다. Cas9은 gRNA에 결합하여 표적 부위에 결합하고 이를 절단하는 리보핵단백질 복합체를 형성한다.
세포와 관련하여 사용되는 경우 용어 "확장"은 자손의 생성을 통해 세포의 수를 증가시키는 것을 나타낸다.
용어 "발현 제어 서열"은 관심 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하거나 제어할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예로는 프로모터, 인핸서, 전사 인자 결합 부위, miRNA 결합 부위를 포함한다.
용어 "상동성 재조합(HR)"은 상동성 특이적 복구 메커니즘을 통해 DNA에서 파괴의 복구 동안 뉴클레오티드 서열의 삽입을 나타낸다. 이러한 과정은 파괴를 복구하기 위한 주형으로서 파괴 영역의 뉴클레오티드 서열과 상동성을 갖는 "공여체" 분자 또는 "공여체 주형"을 사용한다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 유전체의 단일 염기 변화 또는 큰 DNA 서열의 삽입일 수 있다.
2개 이상의 뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 경우 용어 "상동성의" 또는 "상동성"은 생리학적 조건하에서 세포에서 2개의 뉴클레오티드 서열이 함께 특이적으로 결합하기에 충분한 염기쌍 형성 또는 하이브리드화의 정도를 나타낸다. 상동성은 또한 상보적 서열, 예를 들어, 특정된 수의 염기에 대해 적어도 70% 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 상보적 서열과 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 겪게 될 뉴클레오티드의 백분율을 계산하여 기재될 수 있다. 예를 들어, 공여체 주형과 관련하여 상동성은 200-400개 이상의 염기일 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열과 관련하여 상동성은 15-20개 이상의 염기일 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 신호 서열, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 나타내며, 상기 발현 제어 서열은 제2 핵산 서열의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 적어도 하나의 활성 성분 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물이 기존 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환(예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴에 의함)시켜 변형되도록 하는 개시된 화합물의 유도체를 나타낸다. 본원에서 화합물 또는 성분에 대한 모든 언급은 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재생성"은 대상체의 기관 또는 시스템의 재생 또는 복원을 나타낸다.
용어 "치료 인자"는 대상체의 질병, 장애 또는 질환의 증상을 치료하고/하거나 완화시키는 삽입된 트랜스진에 의해 인코딩된 단백질을 나타낸다.
용어 "치료량"은 질병, 장애 또는 질환의 증상의 완화 또는 개선을 의미하는 "치료 효과"를 발휘하기에 충분한 치료 인자의 양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 별개의 양을 나타낸다.
실시예
실시예 1. 일반적인 T 세포 배양 방법
K562 세포(ATCC에서 획득) 및 Nalm6 세포(친절하게 C. Mackall에 의해 제공됨)를 10% 소 성장 혈청, 2mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린 및 100 U/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640(HyClone)에서 배양하였다. T 세포를 건강한 공여체로부터 획득된 백혈구 연층으로부터의 분리 후 신선하게 사용하였다. 피콜 밀도 구배 원심분리 후 Pan T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용한 자기 농축을 통해 T 세포를 분리하였다.
세포를 BAMBANKER™ 배지에서 냉동 보존하였다. 해동 후, 세포를 5% 인간 혈청(Sigma-Aldrich) 및 100 인간 재조합 IL-2(Peprotech) 및 10 ng/ml 인간 재조합 IL-7(BD Biosciences)이 보충되거나 보충되지 않은 X-Vivo 15(Lonza)에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. UMP 또는 우리딘을 250 μg/ml로 첨가하였다. 5-FOA를 100 μg/ml 내지 1 mg/ml로 첨가하였다. 배양 동안, 배지를 2일마다 새롭게 하였다.
T 세포를 전기천공 전 3일 동안 고정된 항-CD3(클론 OKT3, Tonbo Biosciences) 및 가용성 항-CD28(클론 CD28.2, Tonbo Biosciences)을 사용하여 활성화시켰다.
140만 개의 활성화된 T 세포를 전기천공 용액에 재현탁하고, 사전 복합화된 RNP와 혼합하고, 프로그램 EO-115를 사용하여 4D-NUCLEOFECTOR™ 시스템(Lonza)을 사용하여 전기천공하였다. RNP는 300 μg/ml의 Cas9 단백질(S. 피오게네스에 기반한 Alt-R® CRISPR/Cas9 시스템, IDT) 및 2.5의 sgRNA:Cas9 몰비를 사용한 sgRNA로 구성되었다.
QUICKEXTRACT™ DNA 추출 키트(Epicentre)를 사용하여 유전체 DNA를 수확하였다. 세포를 값을 표준화하기 위한 참조로서 트리판 블루 염색을 사용한 자동화된 세포 계수기에서 또는 COUNTBRIGHT™ 비드(ThermoFisher)를 사용한 자동 플레이트 판독기와 함께 CytoFLEX 흐름세포측정기(Beckman Coulter)에서 계수하였다. 대안적으로, 세포를 부피를 또한 측정하는 ACCURI™ C6 흐름세포측정기(BD Biosciences) 또는 FACS ARIA™ II SORP 세포 분류기(BD Biosciences)에서 플루오로크롬 표지된 항체(Biolegend)를 이용한 염색 후에 분석하였다. 데이터를 엑셀(Microsoft) 및 FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 사용하여 분석하였다.
UMPS 유전자좌의 생거 시퀀싱을 UMPS-O-1 및 UMPS-O-2를 사용하여 수행하였으며, 영역은 PHUSION™ Hot Start Flex 2x Master Mix(New England Biolabs, Inc.)를 사용하여 증폭되었다. 생거 시퀀싱 트레이스를 편집 후 삽입 및 결실(InDel)을 확인하기 위해 TIDE 분석(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Brinkman et al, 2014, Nucleic Acids Res. 42(22):e168)] 참조)에 의해 분석하였다. InDel 정량화를 TIDE 온라인 도구(www.deskgen.com/landing/tide.html)(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[M. Sadelain, N. Engl. J. Med. 365, 1735-7 (2011)] 참조)를 사용하여 서열에 대해 수행하였다.
gRNA 서열(PAM으로도 언급되는 프로토스페이서 인접 모티프 포함):
UMPS-7
Figure pct00008
UMPS 유전자좌 TIDE 분석을 위한 시퀀싱 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00009
Figure pct00010
초기 스크리닝 후, InDel의 가장 높은 빈도를 나타내는 sgRNA "UMPS-7"을 추가 분석을 위해 선택하였다.
실시예 2. 인간 T 세포에서 Cas9-sgRNA 전기천공에 의한 UMPS 편집
T 세포를 상기 기재된 바와 같이 해동하고, 배양한 후, 활성화하고 Cas9-UMPS-7 sgRNA RNP를 사용한 후속 전기천공을 수행하였다. 전기천공 후, 세포를 혈청, 5-FOA 또는 외인성 우라실 공급원이 있거나 없는 배지에서 회복하도록 하였다(도 1a). 전기천공 후 세포 생존은 혈청이 배지에 포함된 경우에 현저히 증가하였고(도 1b), 따라서 이후 모든 실험에서 혈청, 우리딘 및 UMP를 갖는 배지에서 4일의 회복 기간을 수행하였다. 전기천공 후 세포 수는 표 4에 제시된다.
표 4. 세포 수
Figure pct00011
실시예 3. 혼합 UMPS 편집 집단의 성장 및 UMPS 돌연변이의 유지
T 세포를 실시예 2에서와 같이 전기천공 및 편집하고, 혈청, 우리딘 및 UMP를 갖는 배지에서 4일의 기간 동안 회복시켰다. 4일에 세포를 UMP, 우리딘 또는 우라실 공급원 배지로 이동시켰다. 본 실험은 선택 단계를 특징으로 하지 않았고, 따라서 생성된 세포 집단은 야생형(WT), 이형접합성 돌연변이체 및 동종접합성 돌연변이체 세포의 이종 혼합이었다. 동형접합 UMPS 돌연변이체 세포의 성장은 외인성 우라실 공급원에 의존적인 것으로 관찰되었는데, 이는 이들이 영양요구성이어야 하기 때문이다(도 2a). UMPS가 표적화되는 경우, InDel은 세포의 약 50%에서 생성되는 것으로 관찰되었다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 TIDE 분석(문헌[Brinkman et al, 2014, Nucleic Acids Res. 42(22):e168] 참조)에 의해 검정됨).
외인성 우라실 공급원이 제거되는 경우, 집단에서의 InDel 빈도는 성장 3일 후에 감소되었다(7일 = 회복 4일 및 시험 배지에서 3일). 이는 임의의 동형접합 영양요구 UMPS 돌연변이체 세포가 집단에서 편집 후에 여전히 존재하는 비-영양요구 이형접합 돌연변이체 및 WT 세포와 경쟁하여 감소된 겉보기 InDel 빈도를 발생시킨다는 것을 제시하는 모델과 일치하였다(도 2b 참조). InDel을 갖는 대립유전자의 백분율이 표 5에 제시된다.
표 5. InDel을 갖는 대립유전자
Figure pct00012
이종성 UMPS 편집 집단의 최적 성장은 우라실의 외인성 공급원의 존재에 의존하는 것으로 관찰되었다(도 2c-도 2f). 프레임시프트 InDel을 갖는 대립유전자의 백분율은 도 2c에 제시되고, 값은 표 6에 제시된다.
표 6. 프레임시프트 InDel을 갖는 대립유전자
Figure pct00013
도 2d는 TIDE에 의해 확인된 대립유전자를 함유하는 8일에서의 예측된 세포의 절대 수를 비교한다. 값은 표 7에 제시된다.
표 7. 예측된 생존 세포 수
Figure pct00014
도 2e는 UMP가 있거나 없는 세포 수의 시간 경과(8일)를 제시한다. 값은 표 8에 제시된다.
표 8. 세포 밀도 [ml 당 세포]
Figure pct00015
도 2f는 우리딘이 있거나 없는 세포 수의 시간 경과(8일)를 제시한다. 값은 표 9에 제시된다.
표 9. 세포 밀도 [ml 당 세포]
Figure pct00016
UMP 및 우리딘은 UMPS 편집 배양물의 성장을 모의 편집 세포와 동일한 수준으로 구제하였다. 이러한 성장 구제는 UMPS 편집에 의존하고, 외인성 우라실 공급원으로 처리된 모의 세포에서 관찰되지 않으며, 이는 편집된 UMPS가 최적의 세포 성장을 위해 우라실 보충에 특별히 의존하는 인간 T 세포를 만든다는 것을 나타낸다.
UMPS 편집 집단이 영양요구성인 것으로 예상되지 않는 편집되지 않거나 이형접합성인 세포를 함유하였고, 따라서 우라실 결핍 배지에서 UMPS 편집된 세포의 성장의 완전한 부족은 예상되지 않는다는 것이 반복될 가치가 있다.
실시예 4. UMPS 표적화된 세포를 선택하는 5-FOA 처리
5-FOA는 다른 유기체에서 우라실 영양요구 세포를 선택한다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Boeke et al. 1984, Mol. Gen. Genet. 197(2):345-6]). 인간 세포 중에서 우라실 영양요구변이주의 선택을 위한 5-FOA의 잠재적 유용성을 조사하기 위해, UMPS 유전자는 Cas9-gRNA 복합체 전기천공에 이어 회복(실시예 2에 제시된 바와 같음)에 이어 5-FOA 처리에 대한 내성의 검정에 의해 인간 T 세포에서 표적화되었다(도 3a). 세포 계수를 수행하기 전에 4일 동안 5-FOA 및 다양한 조합의 혈청 및 우라실 공급원에서 세포를 성장시켰다.
표 10은 혈청과 함께 또는 혈청 없이 성장된 세포 집단에 대한 세포 수를 비교한다.
표 10. 세포 수
Figure pct00017
혈청은 전기천공 후 세포의 회복에 중요하지만 5-FOA에서 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았다(도 3b). 혈청 없이 5-FOA에서 성장한 추가 샘플에 대한 세포 수는 도 3c 및 표 11에 제시된다.
표 11. 세포 수
Figure pct00018
우리딘 및 UMP는 대조군에 비해 5-FOA에서 모의 처리된 세포 및 UMPS 표적화된 세포 둘 모두의 생존을 개선시켰다. 이는 경쟁 기반 메커니즘을 통해서일 가능성이 높다(우리딘은 인간에서 5-플루오로우라실 독성을 역전시킬 수 있다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[van Groeningen et al. 1992, Semin. Oncol. 19(2 Suppl 3):148-54] 참조))(도 3b 및 도 3c). 모든 경우에, UMPS 표적화 세포는 모의 표적화 세포에 비해 증가된 생존을 나타내었다. 이러한 데이터는 5-FOA가 인간 세포 배양에서 우라실 영양요구 세포의 선택에 사용될 수 있음을 나타내었다.
실시예 5. 우라실 영양요구성을 나타내는 5-FOA 선택된 UMPS 표적화 세포
5-FOA 처리에 의해 선택된 세포가 우라실 영양요구변이주인지 아닌지의 여부를 검정하기 위해, 모의 또는 UMPS 표적화 T 세포를 실시예 4에 제시된 바와 같이 5-FOA에 노출시켰다. 5-FOA 선택 4일 후, 세포 집단을 우라실 함유 배지(UMP, 우리딘 또는 둘 모두) 및 우라실 결핍 배지로 분할하였다. 이후, 시험 배지에서 4일 인큐베이션 후(8일) 세포 계수에 의해 성장 검정을 수행하였다(도 4a). 모든 경우에, 모의 표적화 세포 배양에서 세포 성장은 무시할 수 있었고, 우라실 공급원 보충과 독립적이었으며, 이는 5-FOA 선택 단계 동안 비-UMPS 표적화 세포의 성공적인 사멸을 나타낸다(도 4b-도 4d). UMPS 표적화 집단에서, 모든 조건에서 세포 성장은 우라실의 첨가에 의해 자극되었고, 이의 부재하에서 불량한 세포 성장이 관찰되었다(도 4b-도 4d).
도 4b는 혈청이 없는 샘플에 대해 8일에서의 배양물 중 세포 수를 비교한다. 값은 표 12에 제시된다.
표 12. 8일에서의 세포 수
Figure pct00019
도 4c는 UMP가 보충되고 혈청이 없는 배양물에서 세포 수를 비교한다. 값은 표 13에 제시된다.
표 13. 8일에서의 세포 수
Figure pct00020
도 4d는 우리딘이 보충되고 혈청이 없는 배양물에서 세포 수를 비교한다. 값은 표 14에 제시된다.
표 14. 8일에서의 세포 수
Figure pct00021
종합하면, 실시예 1-5의 결과는 인간 T 세포에서 Cas9에 의한 UMPS 유전자좌의 편집이 최적 세포 성장을 위한 외인성 우라실 공급원에 의존하는 세포를 생성하는 것을 나타낸다. 이들 결과는 조작된 인간 영양요구성이 T 세포의 증식 또는 일부 다른 세포 요법을 제어하기 위한 메커니즘으로 사용될 수 있음을 입증한다. 또한, UMPS 편집된 세포의 5-FOA 선택은 T 세포의 진정한 영양요구 집단의 선택을 위한 유용한 메커니즘을 제공한다.
실시예 6. 줄기 세포 배양
잠재적 치료 관련성을 갖는 또 다른 세포 유형을 평가하기 위해, UMPS를 인간 다능성 세포에서 조작하였다. 본원의 개시의 주제인 변형된 숙주 세포는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 U.S. 8,945,862호에 제시된 바와 같이 하기 기술을 사용하여 유지되고 분화된 줄기 세포를 포함할 수 있다.
미분화 hESC(WICELL®로부터의 H9 계통, 35 내지 45 계대)를 비활성화된 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 영양세포층에서 성장시켰다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Stem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401]). 간단히, 세포를 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트에서 방사선 조사된 저 계대 MEF 영양세포층에서 미분화 단계에서 유지시켰다. 배지를 매일 변경하였다. 배지는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)/F-12, 20% 넉아웃 혈청 대체물, 0.1 mM 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올 및 4 ng/ml rhFGF-2(R&D Systems Inc., Minneapolis)로 구성된다. 미분화 hESC를 DMEM/F12에서 1 mg/ml 콜라게나제 유형 IV으로 처리하고, 계대일에 기계적으로 긁어내었다. 분화 전, hESC를 다음과 같이 MEF에서 제조된 컨디셔닝된 배지(CM)에서 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.) 코팅 플레이트에 시딩하였다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Nat Biotechnol, 2001. 19(10): p. 971-4]). MEF 세포를 수확하고, 50 Gy로 방사선 조사하고, 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)가 없는 hES 배지로 배양하였다. CM을 매일 수집하고, hES 세포를 공급하기 전에 추가 4 ng/ml의 bFGF를 보충하였다.
실시예 7. 인간 배아 줄기 세포(ESC)-내피 세포(EC)의 시험관 내 분화
hESC 분화를 유도하기 위해, 미분화 hESC를 이전에 기재된 바와 같이 현탁 배아체(EB)의 형성을 위한 초저 부착 플레이트에서 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM) 및 15% 규명 소 태아 혈청(FBS)(Hyclone, Logan, Utah), 0.1 mM 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 450 μM 모노티오글리세롤(Sigma, St. Louis, Mo.), 50 U/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 분화 배지에서 배양하였다(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(7): p. 4391-6 및 Stem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401] 참조). 간단히, 적응용 배지를 갖는 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.) 코팅 플레이트에서 배양된 hESC를 37℃에서 15분 동안 2 mg/ml 디스파제(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)로 처리하여 콜로니를 느슨하게 하였다. 이후, 콜로니를 긁어내어, 배아체 형성을 위한 초저 부착 플레이트(Corning Incorporated, Corning, N.Y.)로 옮겼다.
실시예 8. 영양요구성 변형 숙주 세포의 선택
UMPS 유전자좌는 Cas9 RNP의 전기천공 및 유전체 유전자좌의 증폭 및 생거 시퀀싱에 의해 평가된 바와 같은 엑손 1에서 InDel을 갖는 클론의 선택에 의해 hESC에서 파괴되었다. 유전자 편집을 위해, hESC를 전기천공 전 24시간 동안 10 μm ROCK 억제제(Y-27632)로 처리하였다. 70-80% 컨플루언스(confluence)의 세포를 ACCUTASE® 용액(Life Technologies)으로 수확하였다. 150 μg/mL의 SpCas9 농도(Integrated DNA Technologies) 및 1:3의 Cas9:sgRNA 몰비로 반응 당 500,000개의 세포를 사용하였고, 전기천공을 4D NUCLEOFECTOR 시스템(Lonza)에서 16웰 NUCLEOCUVETTE™ 스트립 내의 P3 일차 세포 용액(Lonza)에서 수행하였다. 전기천공 직후, 세포를 10 μM Y-27632와 함께 500 μl의 mTeSR™ 배지(STEMCELL Technologies)를 함유하는 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.) 코팅된 24웰 플레이트의 하나의 웰로 옮겼다. 배지를 편집 24시간 후에 변경하였고, Y-27632를 48시간 후에 제거하였다.
생거 시퀀싱은 편집 전 hESC 집단, RNP 전기천공 후 벌크 집단 및 선택된 클론의 유전자형을 비교하였다. 결과는 sgRNA 표적 영역 주위에서 10bp의 결실을 나타내었다. 이러한 영역에서의 서열 트레이스의 결핍은 둘 모두의 대립유전자가 변형되었음을 나타내었다.
상이한 농도의 우리딘으로 4일에 걸쳐 영양요구 검정을 수행하였다. UMPS KO/KO hESC를 유사한 밀도로 시딩하고 상이한 우리딘 농도의 존재하에서 배양한 후 4일에 웰의 현미경 사진을 찍었다. 사진은 2.5-250 μg/ml의 존재하에서 세포가 증식한 것을 나타내었으나, 우리딘 첨가 없이 증식을 나타내지 않았다. 상이한 우리딘 농도의 효과를 평가하기 위해 시딩 후 4일에 생존 세포의 정량화가 표 15에 제시된다.
표 15. 생존 세포 수
Figure pct00022
넉아웃 유전자 생성물의 외인성으로 공급된 버전이 세포주의 영양요구 표현형을 구제한다는 것을 입증하기 위해 상이한 농도의 보충물 대 대조군을 이용한 사멸 곡선을 생성시켰다.
5-FOA에 대한 내성을 평가하기 위해, UMPS-WT 세포와의 공동 배양에서 보다 용이한 확인을 위해 세이프-하버 유전자좌(safe-harbor locus)에 통합된 발현 카세트로부터 GFP를 발현하도록 UMPS-KO hESC를 유전적으로 조작하였다.
GFP의 선명하고 안정적인 발현을 나타낸 클론을 선택하였다. 이들 UMPS KO/KO hESC를 GFP를 발현하지 않는 UMPS WT/WT 세포와 혼합한 후, 상이한 농도의 5-FOA의 존재하에서 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 수행하였다. 표 16은 상이한 5-FOA 농도로 배양한 후 생존 GFP+ 및 GFP- 세포의 수를 제공한다.
표 16. 생존 세포 수
Figure pct00023
이전 세포 유형과 유사하게, 시간 경과에 따른 GFP+ 세포의 농축이 관찰되었다. 5-FOA가 없는 그룹에서 세포의 54.8%가 GFP+였고, 5-FOA를 갖는 그룹에서 세포의 95.0%가 GFP+였다. 이러한 세포 유형에서, UMPS-WT 세포는 시험된 모든 5-FOA 농도에 민감하였고, UMPS-KO 세포는 0.25 μg/ml 웰의 농도를 잘 견딘 반면, 표 16에 제시된 바와 같이 더 높은 농도에서 손상된 증식을 나타내었다.
결론적으로, 이들 결과는 백혈병 세포주에서 다능성 세포주 및 일차 면역 세포에 이르기까지 다양한 인간 세포에서 영양요구성을 생성하기 위해 대사의 주요 경로가 효율적으로 조작될 수 있음을 확인한다. 둘 모두의 UMPS 대립유전자의 유전자 표적화는 동형접합 넉아웃을 갖는 세포 집단을 생성하고 정제하거나, 5-FOA를 사용하여 이들 세포를 농축하는 데 사용될 수 있다. 신속한 다중화 유전체 공학 및 선택을 제공하기 위해 다중 넉아웃 및 돌연변이를 갖는 세포주가 또한 생성될 수 있다(예를 들어, 5 영양요구 돌연변이 및 5 항생제).
실시예 9. 생체 내 분석
시험관 내 검증된 영양요구 넉아웃 세포주가 또한 생체 내에서 분석될 수 있다. 이들 세포주는 인간에서의 영양요구 인자의 독성 및 생체이용률에 의해 제한된다. 유전자 넉아웃 세포주는 인간 T 세포 또는 임의의 다른 림프구에서 조작된다. 세포주에 의한 조건적 시험관 내 성장은 영양요구 인자의 부재하에서가 아니라 영양요구 인자의 존재하에서 입증된다. 인자에 대해 영양요구성이고 트랜스진을 발현할 수 있는 것으로 확인된 변형된 포유동물 숙주 세포는 마우스 모델에서 투여될 수 있다. 영양요구 인자 보충제를 섭취한 마우스만 인간 림프구의 성장을 유지한다. 또한, 마우스 먹이 공급원으로부터 영양소의 제거시 생체 내에서 세포 성장이 중지된다.
실시예 10. 유전 공학을 통한 인간 세포에서 영양요구성 생성
spCas9에 대한 UMPS 유전자의 엑손 1에서 가능한 sgRNA 표적 부위를 확인하기 위해 생물정보학 도구(crispor.tefor.net)를 사용하였다. COSMID(crispr.bme.gatech.edu/)를 사용하여 추정 표적외(OT) 효과를 예측하였다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Majzner et al. Cancer Cell. 31, 476-485 (2017)] 참조). 인간 유전체(hg38)에서 잠재적 표적외 부위를 웹 기반 생물정보학 프로그램 COSMID(crispr.bme.gatech.edu)를 사용하여 확인하였으며, 최대 3개의 미스매치 또는 1개의 미스매치와 함께 1bp 결실/삽입이 19 PAM 근위 염기에서 허용되었다. sgRNA는 매우 유사한 표적외 부위의 수(COSMID 스코어 <1)로 순위를 매긴 후, 더 높은 스코어를 갖는 OT 부위의 수로 순위를 매겼다. 모든 부위를 증폭하기 위한 프라이머를 또한 COSMID 프로그램에 의해 설계하였다. 모든 부위를 유전자좌 특이적 PCR로 증폭시키고, 두 번째 라운드의 PCR을 통해 바코드화하고, 등몰량으로 푸울링하고, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Porteus, M. Mol. Ther. 19, 439-441 (2011)]에 이전에 기재된 바와 같이 250bp의 쌍을 이룬 말단 판독을 사용한 Illumina MiSeq를 사용하여 시퀀싱하였다. 결과로서 생성된 데이터를 사용자 지정 스크립트 indelQuantificationFromFastqPaired-1.0.1.pl(10)( https://github.com/piyuranjan/NucleaseIndelActivityScript/blob/master/indelQuantificationFromFastqPaired-1.0.1.pl)를 사용하여 분석하였다.
가장 적은 수의 OT 부위를 갖는 3개의 sgRNA를 확인하고, 활성의 시험관 내 스크리닝에 사용하였다. 이들 sgRNA는 표 17에 제시된다.
표 17. 가장 적은 OT 부위를 갖는 sgRNA
Figure pct00024
Synthego Corporation으로부터의 화학적 변형으로 sgRNA를 획득하였다. sgRNA를 2.5:1의 몰비(sgRNA:단백질)로 Cas9 단백질(IDT)과 복합체화하고, 4D-NUCLEOFECTOR™ 시스템(Lonza)을 사용하여 활성화된 T 세포로 전기천공하였다. 4일 후, 세포를 수확하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 QUICKEXTRACT™ DNA 추출 키트(Epicentre)를 사용하여 유전체 DNA를 추출하였다. sgRNA 표적 부위를 특정 프라이머(표 18)로 증폭시키고, 앰플리콘을 생거 시퀀싱(MCLab, South San Francisco)에 의해 시퀀싱하였다.
표 18. 프라이머
Figure pct00025
InDel 정량화를 CRISPR 편집 추론(ICE) 및 ICE-D 온라인 도구(ice.synthego.com)를 사용하여 서열에 대해 수행하였다(도 5a). 결과는 표 19에 제시된다.
표 19. InDel 정량화
Figure pct00026
sgRNA "UMPS-7"을 추가 실험을 위해 선택하였다. 이러한 sgRNA는 CRISPR 편집 추론 - 불일치(inference of CRISPR edits - discordance; ICE-D)에 의해 검출될 수 있으나 기존 ICE 또는 TIDE 분석에 의해서는 검출될 수 없는 높은 비율의 큰(30 bp 초과) 결실을 생성하였다(www.deskgen.com/landing/tide.html).
UMPS 넉아웃이 우리딘 또는 우리딘 모노포스페이트(UMP)의 첨가 없이 배양되는 경우 차별적 세포 증식을 발생시키는지의 여부를 평가하기 위해, 배양물의 세포 수를 시간이 지남에 따라 트리판 블루 염색을 사용한 자동 세포 계수로 추적하였다. UMPS 넉아웃은 모의 전기천공되거나 상이한 유전체 유전자좌(즉, CCR5)를 표적으로 하는 Cas9을 사용하여 전기천공된 세포와 비교하여 전기천공 후 2일에서부터 세포 수를 낮추었다(도 5b). 세포 수는 표 20에 제시된다.
표 20. InDel 정량화
Figure pct00027
대조적으로, UMP 또는 우리딘을 고농도(각각 250 μg/ml)로 보충한 경우 UMPS 넉아웃 후 세포 증식이 손상되지 않았다(도 5c). ml 당 생존 세포의 수는 표 21에 제시된다.
표 21. ml 당 생존 세포의 수
Figure pct00028
유전체 수준에 대한 결과를 확인하기 위해, 실험 종료시 유전체 DNA를 수확하고, InDel을 정량화하였다(도 5d-도 5e). 도 5d는 5-FOA에 노출되지 않은 세포에 대한 상이한 배양 조건에서의 InDel의 빈도를 비교한다. 백분율은 표 22에 제시된다.
표 22. 전체 InDel 빈도의 백분율
Figure pct00029
도 5e는 5-FOA에 노출되지 않은 세포에 대한 상이한 배양 조건에서의 프레임시프트 InDel의 빈도를 비교한다. 백분율은 표 23에 제시된다.
표 23. 프레임시프트 InDel 빈도의 백분율
Figure pct00030
전체 InDel 빈도는 우리딘 또는 UMP 없이 배양 후 약간 감소되었으나, 프레임시프트(+3/-3의 배수가 아님)를 발생시키는 InDel을 정량화하는 경우, 대사물 첨가 없이 세포 집단에서 InDel의 감소가 있었다. 이는 엑손 1에서 프레임시프트 InDel로 인한 UMPS 넉아웃을 갖는 세포가 UMPS 야생형 세포 또는 리딩 프레임을 보존한 엑손 1에서 InDel을 갖는 세포에 비해 생존 및 증식에 단점을 갖는 것을 확인한다.
다음으로, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bak et al., , Elife 28:6 (2017)]에 기재된 접근법을 사용하여 2개의 상이한 마커의 UMPS 유전자좌로의 통합을 가능하게 하여 유전자 발현을 붕괴시키고 tEGFR 및 tNGFR의 공동 발현을 통해 이중-대립유전자 유전자 넉아웃을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 유전자 표적화 작제물을 생성시켰다(도 6a). 작제물을 AAV2 역 말단 반복(ITR)이 측접된 플라스미드 백본과 함께 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 깁슨(Gibson) 어셈블리에 의해 클로닝하였다.
줄기 세포 및 일차 인간 세포의 표적화를 위해, 작제물을 재조합 아데노-관련 바이러스 유형 6(rAAV6)에 패키징하여 이중 가닥 파괴의 생성 후 DNA를 전달함으로써 상동성 재조합을 자극하여 트랜스진을 통합시켰다. rAAV6의 생성을 위한 전달 플라스미드를 깁슨 어셈블리(NEBUILDER® HiFi DNA Assembly Master Mix, New England Biolabs Inc.)에 의해 측접한 역 말단 반복(ITR)에 인접한 pAAV-MCS 플라스미드(Agilent Technologies)의 백본으로 표적화된 유전체 영역에 상동성인 트랜스진 및 주위 아암을 클로닝하여 생성시켰다. 상동성 아암을 건강한 공여체 유전체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 표면 마커의 발현을 위해, 본 발명자는 tNGFR 및 tEGFR을 사용하였다(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Teixeira et al. Curr. Opin. Biotechnol. 55, 87-94 (2019); Chen et al. Sci. Transl. Med. 3 (2011)] 참조). 전사 종료를 위해, 소 성장 호르몬(bGH)으로부터의 아데닐중합체형성 서열을 사용하였다.
AAV의 생성을 전달 플라스미드를 pdgm6 패키징 플라스미드와 공동 형질감염시켜 HEK293T 세포에서 수행하였고, 이오딕사놀 구배 원심분리에 의해 정제하였다. HEK293 세포를 pDGM6 헬퍼 플라스미드 및 AAV2 ITR이 측접한 상동성 아암 사이에 트랜스진을 갖는 각각의 전달 플라스미드와 함께 폴리에틸렌이민으로 공동 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 분리시키고, 상층액으로부터 분리하고, 용해시켰다. 현탁액을 벤조나제(Benzonase)(Sigma Aldrich)로 처리하고, 파편을 펠렛화하였다. 미정제 AAV 추출물을 이오딕사놀 밀도 구배에서 정제한 후, PBS에 대해 2주기의 투석 및 1 x 104 분자량 컷오프(MWCO) SLIDE-A-LYZER™ G2 투석 카세트(Thermo Fisher Scientific) 중 5% 소르비톨을 갖는 PBS에 대해 1주기의 투석에 적용시켰다. QUICKEXTRACT™ DNA 추출 키트(Epicentre)에 의한 유전체 DNA의 추출 및 이전에 보고된 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 제조업체 프로토콜에 따른 미세방울 디지털 PCR(Bio-rad)에 의해 ITR 카피수의 절대 농도를 측정하여 AAV 역가를 결정하였다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[
Figure pct00031
et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 6, 1-7 (2017)] 참조).
플라스미드로 사용되는 이들 공여체 작제물을 이용한 표적화를 골수성 백혈병 세포주 K562(ATCC® CCL-243™)에서 먼저 시험하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 SF Cell Line 4D NUCLEOFECTOR™ 시스템(Lonza)에서 2 μg의 각각의 플라스미드로 세포를 전기천공하였다. 2개의 마커를 UMPS 유전자좌로 표적화하는 경우, 둘 모두의 마커의 공동 발현을 나타낸 작지만 안정적인 세포 집단이 확인되었다(도 6b).
자기 비드 농축을 사용하여 표면 마커 EGFR 및 NGFR을 발현하는 세포를 순차적으로 농축하였다. 자기 분리를 위해, tNGFR 및 tEGFR 둘 모두를 발현하는 세포를 플루오로크롬으로서 PE 및 APC를 갖는 NGFR 및 EGFR에 대한 항체(Biolegend), 항-피코에리트린(PE MultiSort kit (Miltenyi) 및 LS 또는 MS 컬럼(Miltenyi) 상의 항-APC MicroBeads(Miltenyi)를 사용하는 순차적 자기 비드 분류에 의해 농축시켰다. FACS 분류를 FACS ARIA™ II SORP 세포 분류기(BD Biosciences)에서 수행하였다.
확인을 더 용이하게 하기 위해, 개똥벌레 루시페라제 및 TurboGFP를 갖는 발현 카세트가 세이프 하버 유전자좌(HBB)로 표적화되는 두 번째 편집 단계를 수행하였다(도 6c). K562 세포를 6 μg Cas9 단백질(IDT) 및 3.2 μg sgRNA(Trilink)를 갖는 20 ul SF 세포주 용액에 현탁시키고, 전기천공하였다. K562 세포 배지(10% BGS를 갖고, GLUTAMAX™ 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI)에 재현탁한 후, 세포를 발현 카세트를 갖는 rAAV로 형질도입하였다. 이는 흐름세포측정법에 의해 분류된 3개 모두의 마커(tNGFR, tEGFR 및 GFP)를 발현하는 세포 집단을 생성시켰다. 흐름세포측정법의 결과는 도 6d에 제시된다. 각각의 그룹에서 GFP+ 세포의 백분율은 도 6f에 제시된다.
분류된 UMPS KO/KO/GFP+ 세포 집단을 이들의 영양요구성 및 5-FOA에 대한 이들의 내성을 평가하는 검정에 적용시켰다. 세포를 동일한 수의 샘플로 분할하고, 상이한 농도의 우리딘의 존재하에서 또는 우리딘 없이 배양하였다. 고농도의 우리딘(250 μg/ml)을 보충하면 세포가 신속히 확장되었다. 세포 성장은 더 낮은 농도(25 μg/ml)에서 억제된 반면, 세포 수는 더 낮은 농도 또는 우리딘 없이 감소하였다(도 6e). ml 당 세포의 수는 표 24에 제시된다.
표 24. 1일부터 8일까지의 ml 당 세포의 수
Figure pct00032
Nalm6 세포에 대해서도 동일한 실험을 수행하였으며, 온전한 UMPS를 갖는 세포에 대해 관찰되지 않았던 배양물 내 우리딘 농도에 대한 유사한 의존성이 관찰되었다. 표 25는 상이한 우리딘 농도로 배양된 UMPS KO/KO Nalm6 세포의 성장 곡선 데이터를 제공한다. 야생형 세포에 대해서는 우리딘 보충 치료를 받은 그룹과 그렇지 않은 그룹 사이에 차이가 관찰되지 않았다.
표 25. UMPS KO/KO Nalm6 세포의 세포 수
Figure pct00033
우리딘이 보충된 그룹, 특히 25 μg/ml 및 250 μg/ml 우리딘이 보충된 그룹에서 현저하게 더 큰 성장이 관찰되었다.
5-FOA에 대한 UMPS 넉아웃 세포의 내성을 결정하기 위해, 정제된 UMPS KO/KO/GFP+ K562 세포를 UMPS WT/WT/GFP-음성 K562 세포와 동일한 비율로 혼합하였다. 세포를 우리딘 및 상이한 농도의 5-FOA의 존재하에서 배양하였다(도 6f). 표 26은 상이한 배양 조건하에서의 GFP-양성(+) 세포의 백분율을 제공한다.
표 26. GFP+ 세포의 백분율
Figure pct00034
도 6g는 상이한 양의 5-FOA에서 GFP+ 세포에 대한 성장 곡선을 제시한다. 값은 표 27에 제시된다.
표 27. μl 당 GFP+ 세포의 수
Figure pct00035
사용된 모든 농도에서, UMPS KO/KO 세포의 분획이 시간이 지남에 따라 증가하였다. UMP 넉아웃을 갖는 세포는 10 및 100 μg/ml의 5-FOA 농도에서 잘 증식한 반면, 가장 높은 농도는 이들의 세포 성장 속도를 늦추었다.
실시예 11. T 세포에서 영양요구성을 생성하고, 5-FOA를 이용한 선택을 가능하게 하는 UMPS 편집
피콜 밀도 구배 및 MACS 음성 선택(Miltenyi T cell enrichment kit)을 사용하여 Stanford Blood Center(Palo Alto, CA)에서 획극된 백혈구연층으로부터 T 세포를 분리하였다. T 세포를 5% 인간 혈청(Sigma) 및 100 IU/ml IL-2가 보충된 X-VIVO15 배지에서 배양하였다.
전기천공 전, T 세포를 당 분야에서 Dynabead로도 언급되는 항-CD3/-CD28 비드(STEMCELL Technologies) 및 IL-2(100 IU/ml)로 3일 동안 활성화하였다. 활성화 비드를 전기천공 전에 자기 고정화에 의해 제거하였다. K562 세포 및 Nalm6 세포는 전기천공 전에 대수 성장기로 유지되었다. 양 말단의 3개의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 변형을 갖는 sgRNA를 Synthego로부터 획득하였다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bonifant, et al. Mol. Ther. - Oncolytics. 3, 16011 (2016)] 참조).
2개의 선택 마커인 tEGFR 및 tNGFR은 건강한 공여체로부터의 CD3+ T 세포의 분리 및 세포의 활성화 후 1차 인간 T 세포의 UMPS 유전자좌로 표적화하였다.
대규모 sgRNA를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제로 획득하였다. 고 충실도(HiFi) Cas9 단백질을 IDT에서 구입하였다. sgRNA는 2.5:1의 몰비(sgRNA:단백질)로 HiFi spCas9 단백질(IDT)과 복합체화하고, 16-큐벳 스트립에서 4D-NUCLEOFECTOR™ 시스템(Lonza)을 사용하여 세포주 또는 활성화된 T 세포로 전기천공하였다.
유전체의 특정 유전자좌로의 트랜스진의 표적화를 위해, 세포를 기재된 바와 같이 편집하고, 80 μl의 배지에서 전기천공 직후에 재현탁한 후, 5000 vg/세포의 감염다중도(MOI)로 형질도입을 위해 rAAV6와 함께 인큐베이션하였다. 8-12시간 후, 현탁액을 배지로 희석하여 ml 당 0.5-1E6 세포의 세포 농도를 달성하였다. HBB 유전자좌의 표적화를 위해, 표적 서열 CTTGCCCCACAGGGCAGTAA(SEQ ID NO:7)을 갖는 이전에 특성규명된 sgRNA가 사용되었다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Teixeira et al., Curr. Opin. Biotechnol. 55, 87-94 (2019)] 참조). Cas9 및 sgRNA를 RNP와 복합체화하고, P3 완충액에 재현탁된 T 세포와 혼합하고, 프로그램 EO-115을 사용하는 4D NUCLEOFECTOR™ 시스템(Lonza)에서 전기천공하였다. 인간 T 세포는 문헌[Bak et al., 2018]에 기재된 바와 같이 낮은 독성에서 높은 편집 빈도를 가능하게 하여 RNP/rAAV6 유전자 표적화 방법을 사용하여 이중-대립유전자 UMPS 넉아웃을 갖는 세포의 집단을 생성시키는 것으로 당 분야에 공지되어 있다. 둘 모두의 마커를 발현하는 세포가 동시에 발현되었다. 전기천공, 전기천공 용액 및 프로그램 당 다음 세포 수를 사용하였다: 프로그램 FF-120을 사용하여 SF 세포주 용액에서 2E5 K562 세포, SF-세포주 용액 및 프로그램 CV-104에서 2E5 Nalm6 세포 및 P3 용액에서 1E6 활성화 T 세포. CCR5 유전자좌에서 편집된 대조군의 경우, sgRNA의 유전체 표적 서열은 GCAGCATAGTGAGCCCAGAA(SEQ ID NO:8)였다. 전기천공 후, 세포를 배지에 재현탁시키고, rAAV를 첨가하였다.
표적화 3일 후, 높은 우리딘 농도의 존재하에서 항-CD3/-CD28 자기 비드와 공동 배양함으로써 EGFR+/NGFR+ 세포의 집단을 확인하고 확장시켰다. EGFR+/NGFR+ 세포의 집단은 AAV로부터의 에피솜 발현과 대조적으로 안정한 통합을 나타내는 더 선명한 발현으로 인해 AAV 단독을 받은 세포와 구별되었다.
확장 후, EGFR+/NGFR+ 집단을 이중-대립유전자 UMPS 넉아웃을 갖는 T 세포의 집단을 얻기 위해 흐름세포측정법을 사용하여 분류하였다. 결과는 도 7a에 제시된다.
이들 T 세포를 또한 영양요구성 검정에 적용시키고, 5-FOA로 이들 세포를 선택할 가능성을 시험하였다. 항-CD3/-CD28 비드 및 상이한 농도의 우리딘의 존재하에서 세포를 배양하는 경우, 세포는 우리딘의 존재하에서만 증식하였고, 이는 이들의 영양요구 세포 성장을 확인하였다. 더 높은 우리딘 농도는 더 높은 증식률을 발생시켰다. UMPS KO 또는 야생형(WT) T 세포의 영양요구 성장이 도 7b 및 표 28에 제시된다.
표 28. ml 당 생존 세포
Figure pct00036
표 29는 4일에서의 세포 집단의 상대 생존력을 제시한다.
표 29. ml 당 생존 세포
Figure pct00037
5-FOA를 갖는 UMPSKO/KO 세포에 대한 선택 가능성을 평가하기 위해, 분류된 세포를 상이한 추적 염료로 표지된 야생형 세포와 혼합하고, 5-FOA의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. 샘플의 일부에서, 5-FOA는 첫째날(0일)에만 첨가한 반면, 또 다른 그룹에서는 매일 보충되었다. 표 30 및 도 7c는 5-FOA와 함께 또는 5-FOA 없이 배양하는 경우 시간 경과에 걸친 UMPS-KO T 세포(eFluor670으로 표지됨)의 백분율(%)을 제시한다.
표 30. 혼합 세포 집단에서의 UMPS KO/KO 세포의 백분율
Figure pct00038
쌍을 이루지 않은 t 검정을 사용하여 통계적으로 유의한 차이에 대해 그룹을 비교하였다. 5-FOA로 처리된 그룹 사이에는 통계적 유의성이 관찰되지 않았으며, 미처리 그룹에 비해 처리된 그룹에서 UMPS-KO T 세포의 백분율이 유의하게 증가하였다.
둘 모두의 5-FOA 처리 그룹에서, UMPS 넉아웃을 갖는 세포의 분획은 시간이 지남에 따라 증가하였고, 이는 야생형 세포에 비해 화합물에 대한 이들의 증가된 내성을 나타내며, 5-FOA를 이용한 1회 처리가 수일에 걸쳐 변형된 세포의 농축을 발생시키기에 충분하였다. 표 30의 데이터는 UMPS 넉아웃을 갖는 T 세포에 대한 5-FOA 선택을 예시한다.
사실, 5-FOA를 이용한 UMPS 넉아웃 및 야생형 T 세포의 혼합 집단의 배양물의 FACS 분석. UMPS-KO T 세포를 eFluor670으로 표지하였고, 야생형 세포를 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하였다. 결과는 0일에 첫 번째 날(0일)에만 5-FOA로 처리된 그룹에서, 세포의 43.7%가 UMPS-KO T 세포인 한편, 야생형 세포에 대해 56.0%가 관찰되었음을 나타내었다. 0일에 5-FOA로 처리되지 않은 대조군 그룹에서, 세포의 47.7%는 UMPS-KO T 세포였고, 52.1%는 야생형 세포였다. 3일에, 5-FOA가 매일 보충된 그룹에서, 세포의 74.0%는 UMPS-KO T 세포인 한편, 25.8%는 야생형 세포였다. 3일에 5-FOA로 처리되지 않은 대조군 그룹에서, 세포의 43.1%는 UMPS-KO T 세포였고, 56.4%는 야생형 세포였다.
실시예 12. 세포 요법
다능성 줄기 세포는 이들을 외부 공급 인자에 의존적이게 만들도록 유전적으로 조작된다. 이들 세포는 기형종 형성 검정으로서 면역결핍 NSG 마우스에 주사되어 외부 공급 화합물의 중지를 통해 기형종 형성을 방지하는 안전 시스템을 평가한다. 사용된 세포는 iPSCs: iLiF3, iSB7-M3(공급원: Nakauchi Lab at Stanford University) 및 hES: H9이다.
실시예 13. 비복근에서의 기형종 형성 검정
안전 스위치가 다능성 세포에서 유래한 기형종을 근절할 수 있는지 결정하기 위해, 유전적으로 변형된 iPSC 또는 ES 세포(또는 대조군 세포)를 마우스에 이식하였다. 세포는 생체 내 검출을 위해 루시페라제를 발현하였다. 1x106의 UMPS-조작된 hESC를 100 μl의 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.) 및 PBS 혼합물에 재현탁하고, 마취된 NSG 마우스의 우측 뒷다리의 비복근에 주사하였다. 마우스는 종양 크기 측정 및 생물발광 영상화에 의해 종양 형성에 대해 추적되었다. 종양의 확립 후, 우리딘 트리아세테이트(UTA)의 중지가 종양 퇴행을 유발하는지의 여부를 시험하였다. 종점(1.7cm 이상의 종양 크기 또는 마우스 활동의 손상, 그렇지 않으면 24주)에서, 종양을 조직학적 분석을 위해 체외이식하고 고정시켰다.
실시예 14. K562 이종이식 모델
K562 이종이식 검정을 위해, 6 내지 12주령 수컷 NOD SCID 감마 마우스(NSG) 마우스에 마취 하에서 PBS와 1:1 희석된 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.)에 재현탁된 1x106 K562 세포를 이식하였다. 모든 동물을 기관 지침에 따라 유지 및 취급하였으며, 실험 프로토콜은 실험 동물 관리에 관한 스탠포드 대학의 관리 패널에 의해 승인되었다.
UMPS KO/KO 조작된 세포의 성장을 동물에게 고용량의 우리딘을 공급함으로써 모델 유기체로의 이식 후 생체 내에서 분석하였다. 우리딘은 유전성 오로트산뇨증의 치료 및 플루오로피리미딘 과량투여로부터의 독성에 대해 인간에서 사용되었으나(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[van Groeningen, et al. Ann. Oncol. 4, 317-320 (1993); Becroft, et al. J. Pediatr. 75, 885-91 (1969)] 참조), 이는 위장관에서 불량하게 흡수되고, 간에서 분해된다(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Gasser, et al. Science. 213, 777-8 (1981)] 참조). 이의 생체이용률은 상기 언급된 적응증에 대한 FDA 승인을 받은 우리딘 트리아세테이트(UTA, PN401)를 프로드러그로서 투여함으로써 증가될 수 있다(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Weinberg et al., PLoS One. 6, e14709 (2011); Ison et al., Clin. Cancer Res. 22, 4545-9 (2016)] 참조). 인간 및 마우스 모델에서, 이는 우리딘 혈청 수준을 10배 초과만큼 효과적으로 증가시킬 수 있다(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Garcia et al., Brain Res. 1066, 164-171 (2005); FDA, "XURIDEN - Highlights of prescribing information." (2015)](https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2015/208169s000lbl.pdf에서 이용 가능함) 참조).
개똥벌레 루시페라제(FLuc)를 발현하는 이전에 조작된 UMPS KO/KO K562 세포주를 NSG 마우스의 이종이식 모델에 사용하였다. 야생형 UMPS를 갖는 대조군 K562 세포는 종양이 생물발광 영상화에 의해 모니터링될 수 있는 둘 모두의 UMPS 유전자형에 대한 유사한 이종이식 모델을 확립하기 위해 FLuc 및 GFP를 갖는 발현 카세트를 세이프-하버 유전자좌에 표적화함으로써 조작되었다. Cas9 RNP는 가이드 RNA 및 SFFV 프로모터의 제어하에서 FLuc-2A-GFP-polyA 카세트를 갖는 rAAV6에 의해 형질도입된 DNA 공여체 주형을 사용하여 HBB 유전자좌의 엑손 1에 표적화된다. FACS 분석을 GFP+ 집단의 분류 전에 GFP 발현을 평가하기 위해 K562 세포의 표적화 4일 후에 수행하였다. AAV만 투여된 대조군 그룹에서, 세포의 1.61%가 GFP+였고, 세포의 13.4%였다.
마우스에 정규 마우스 먹이 또는 8%(w/w) UTA가 농출된 맞춤형 먹이를 먹였는데, 이는 이전에 잘 용인되면서도 마우스의 혈청 수준을 증가시키는 것으로 나타났던 양이다(문헌[Garcia et al., 2005] 참조). UTA를 Accela ChemBio Inc.에서 획득하여, Teklad 마우스 먹이(Envigo)에 8%(w/w)가 되도록 첨가하였고, 먹이는 사용 전에 방사선 조사하였다. 대조군 먹이는 표준 마우스 먹이 Teklad 2018(방사선 조사됨)이었다.
대안적으로, 먹이에 우리딘 모노포스페이트가 보충되었다. 이들 세포는 국소(뒷다리) 또는 정맥내(iv) 주사를 통해 전신적으로 면역손상된 마우스에 이식될 수 있다.
UMPS KO/KO K562 세포 또는 대조군 세포를 피하 이식하고, 생물발광 영상화로 매주 관찰하였다. K562 세포의 발광 영상화를 IVIS 스펙트럼 영상화 시스템(PerkinElmer)에서 125 mg/kg의 D-루시페린(PerkinElmer)의 복강내(ip) 주사 5분 후에 수행하였다. 피하 이종-이식 후 K562 세포에 대해 설명된 국소화된 성장이 관찰되었다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sontakke, et al. Stem Cells Int. 2016, 1625015 (2016)] 참조). 마우스가 죽어가거나 가장 긴 종양 직경이 1.75 cm를 초과하는 경우 마우스를 안락사시켰다. 생착 실패를 갖는 한 마리의 마우스를 제외하고는, 정상 또는 UTA 보충 먹이를 이용한 UMPS 야생형 세포에서 종양 부하의 증가가 관찰되었다. 대조적으로, UMPS KO/KO K562 유래 종양의 발광은 8% UTA를 먹인 마우스에서만 증가한 것으로 관찰된 반면, 종양 부하는 UTA 없이 먹이를 먹인 대부분의 마우스에서 안정적으로 유지되는 것으로 관찰되었다.
생체 내에서 UMPS KO/KO 조작된 hES 세포의 영양요구 세포 증식을 또한 분석하였다. 기형종을 형성하는데 실패한 한 마리의 마우스를 제외하고, NSG 마우스의 뒷다리에 다능성 세포의 주입 후, 보충된 UTA를 먹인 모든 마우스에서 덩어리가 관찰되었다. 세포 주사 7주 후 마우스를 안락사시키는 경우, UTA를 먹인 마우스에서 주사 영역에서 형성된 큰 기형종을 적출한 반면, 정상 먹이를 섭취한 마우스에서 기형종이 관찰되었으나 표 31에 제시된 바와 같이 상당히 작고 중량이 덜하였다. 동물이 죽거나 희생되는 경우(주사 후 최근 16주) 골수가 분석된다. 표 31은 기형중 중량의 정량화 결과를 제시한다(그룹 사이의 모든 마우스를 비교하는 쌍을 이루지 않은 t-검정에 의해 p<0.05, 생착이 없는 마우스를 검열하는 경우 p<0.01). 그룹은 Prism 7(GraphPad)을 사용하여 표시된 바와 같은 통계 시험으로 비교되었다.
표 31. 기형종 중량
Figure pct00039
생체 내 결과는 이전의 시험관 내 결과와 일치하였으며, 2.5 μg/ml(= 10 nmol/ml)의 우리딘 농도에서 UMPS KO/KO 세포의 증식을 감소시켰으나 완전히 폐기하지는 않은 것을 나타내었다. 이러한 농도는 마우스의 혈청 우리딘 수준에 해당하며, 이는 문헌에서 8 내지 11.8 nmol/ml 범위로 보고되어 있다(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Karle, et al. Anal. Biochem. 109, 41-46 (1980)] 참조).
전반적으로, 이들 결과는 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 인간 세포의 세포 증식에 대한 제어 메커니즘을 추가하기 위해 대사 영양요구성이 조작될 수 있다는 증거이다.
실시예 15. GvHD 모델
안전성 시스템이 xeno-GvHD의 부작용을 예방할 수 있는지의 여부는 마우스 모델에서 결정된다. 유전학적으로 변형된 인간 T 세포 또는 대조군 T 세포를 방사선 조사된 면역손상 마우스에 이식하고, 마우스에 UTA를 공급하거나 공급하지 않는다. 마우스를 체중 감소 또는 GvHD의 다른 징후에 대해 평가하고, 질병 확립시 희생시킨다(최근 16주). 세포를 생물발광 영상화 및 혈액 채취에 의해 추적한다.
실시예 16. 리소좀 축적병(LSD)에서의 효소 대체 요법
다능성 줄기 세포를 UMPS 유전자좌에 통합된 관심 효소를 인코딩하도록 유전적으로 조작하여 외부 공급 우리딘에 의존적으로 만든다. LSD를 치료하기 위해 특정 효소에 대한 효소 대체 요법을 필요로 하는 개체에 개체에서 결핍된 효소의 발현을 촉진하기 위해 우리딘과 함께 이들 세포를 포함하는 조성물을 투여한다. 우리딘의 용량 및 투여 시기는 효소의 원하는 발현에 기초하여 조정한다.
일부 예에서, 세포를 HLC 유전자좌에서 관심 효소를 인코딩하도록 유전적으로 조작하여 외부 공급 비오틴에 의존적으로 만든다.
본 발명의 개시의 구현예가 본원에 제시되고 기재되었으나, 상기 구현예는 단지 예로서 제공되는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 개시를 벗어나지 않고 당업자에게 다수의 변경, 변화 및 대체가 이제 발생할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 개시의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명의 개시의 주제를 실시하는데 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기 청구항은 본원의 개시의 범위를 정의하고, 이들 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 이들의 등가물이 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> AUXOLYTIC LTD THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY <120> GENE THERAPY METHODS AND COMPOSITIONS USING AUXOTROPHIC REGULATABLE CELLS <130> 2158.1001PCT <140> PCT/US2019/XXXXXX <141> 2019-05-10 <150> 62/669,848 <151> 2018-05-10 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA" <400> 1 gccccgcaga ucgauguaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic UMPS-O-1 sequencing oligonucleotide" <400> 2 cccggggaaa cccacgggtg c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic UMPS-O-2 sequencing oligonucleotide" <400> 3 agggtcggtc tgcctgcttg gct 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ccccgcagat cgatgtagat ggg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gccccgcaga tcgatgtaga tgg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggcggtcgct cgtgcagctt tgg 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cttgccccac agggcagtaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gcagcatagt gagcccagaa 20

Claims (105)

  1. (a) 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성이거나, 상기 영양요구성 유도 유전자좌의 상보체에 상동성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및
    (b) 선택적으로 발현 제어 서열에 연결된 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진(transgene)을 포함하는,
    공여체 주형.
  2. 제1항에 있어서, 단일 가닥인 공여체 주형.
  3. 제1항에 있어서, 이중 가닥인 공여체 주형.
  4. 제1항에 있어서, 플라스미드 또는 DNA 단편 또는 벡터인 공여체 주형.
  5. 제4항에 있어서, 선택적으로 프로모터 및 3' UTR을 포함하는 복제에 필요한 요소를 포함하는 플라스미드인 공여체 주형.
  6. (a) 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성이거나, 상기 영양요구성 유도 유전자좌의 상보체에 상동성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및
    (b) 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는,
    벡터.
  7. 제6항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 바이러스 벡터의 복제에 필요한 유전자를 추가로 포함하는 바이러스 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진의 양쪽 측면에 영양요구성 유도 유전자좌의 단편 또는 이의 상보체에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 측접하는 공여체 주형 또는 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 영양요구 인자의 합성, 재활용 또는 구제에 관여하는 단백질을 인코딩하는 유전자인 공여체 주형 또는 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 표 1의 유전자 내에 또는 표 1의 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있는 공여체 주형 또는 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 우리딘 모노포스페이트 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있는 공여체 주형 또는 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 홀로카르복실라제 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있는 공여체 주형 또는 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 영양요구성 유도 유전자좌의 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 98% 동일한 공여체 주형 또는 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌의 단편에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 인간 우리딘 모노포스페이트 신세타제 또는 홀로카르복실라제 신세타제 또는 표 1의 임의의 유전자의 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 98% 동일한 공여체 주형 또는 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 추가로 포함하는 공여체 주형 또는 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 발현 제어 서열이 조직 특이적 발현 제어 서열인 공여체 주형 또는 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 발현 제어 서열이 프로모터 또는 인핸서인 공여체 주형 또는 벡터.
  20. 제17항에 있어서, 발현 제어 서열이 유도성 프로모터인 공여체 주형 또는 벡터.
  21. 제17항에 있어서, 발현 제어 서열이 항시성 프로모터인 공여체 주형 또는 벡터.
  22. 제17항에 있어서, 발현 제어 서열이 전사 후 조절 서열인 공여체 주형 또는 벡터.
  23. 제17항에 있어서, 발현 제어 서열이 마이크로RNA인 공여체 주형 또는 벡터.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 유전자를 추가로 포함하는 공여체 주형 또는 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 마커 유전자가 적어도 NGFR 또는 EGFR의 단편, 적어도 CD20 또는 CD19의 단편, Myc, HA, FLAG, GFP, 또는 항생제 내성 유전자를 포함하는 공여체 주형 또는 벡터.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, Fc 융합 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 혈액 인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질, 수용체, 세포 표면 항원, 수용체 길항제 및 공동 자극 인자, 구조 단백질, 세포 표면 항원, 이온 채널, 후성 개질제 또는 RNA 편집 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 공여체 주형 또는 벡터.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 T 세포 항원 수용체를 인코딩하는 공여체 주형 또는 벡터.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 RNA, 선택적으로 조절성 마이크로RNA를 인코딩하는 공여체 주형 또는 벡터.
  29. (a) cas9 단백질, 및
    (b) 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 가이드 RNA를 포함하는,
    영양요구성 유도 유전자좌로의 트랜스진의 통합을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템.
  30. 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 메가뉴클레아제를 포함하는 상기 영양요구성 유도 유전자좌로의 트랜스진의 통합을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템.
  31. 제27항에 있어서, 메가뉴클레아제가 ZFN 또는 TALEN인 뉴클레아제 시스템.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 공여체 주형 또는 벡터를 추가로 포함하는 뉴클레아제 시스템.
  33. 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 생체 외 변형된 숙주 세포로서, 상기 변형된 숙주 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성이고 치료 인자를 발현할 수 있는, 변형된 숙주 세포.
  34. 제33항에 있어서, 포유동물 세포인 변형된 숙주 세포.
  35. 제33항에 있어서, 인간 세포인 변형된 숙주 세포.
  36. 제33항에 있어서, 변형된 숙주 세포가 배아 줄기 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 다능성 줄기 세포, 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, 체세포 줄기 세포, 분화된 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포, 지방 줄기 세포, 각질세포, 골격 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 섬유모세포, NK 세포, B 세포, T 세포 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 숙주 세포.
  37. 제33항에 있어서, 변형된 숙주 세포로 치료될 대상체의 세포로부터 유래되는 변형된 숙주 세포.
  38. (a) 영양요구성 유도 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제 시스템 또는 상기 하나 이상의 뉴클레아제 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 핵산, 및 (b) 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 공여체 주형 또는 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 변형된 포유동물 숙주 세포를 생성시키는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 제2 유전체 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 제2 뉴클레아제 또는 제2 가이드 RNA 또는 상기 제2 뉴클레아제 또는 제2 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 (b) 제2 공여체 주형 또는 벡터를 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  40. 포유동물 세포와 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 공여체 주형 또는 벡터, 및 뉴클레아제를 접촉시키는 것을 포함하는 생체 외 포유동물 세포에서 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하는 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 ZFN인 방법.
  42. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 TALEN인 방법.
  43. (a) Cas9 폴리펩티드 또는 상기 Cas9 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, (b) 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 (c) 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 공여체 주형 또는 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 변형된 포유동물 숙주 세포를 생성시키는 방법.
  44. 제42항에 있어서, (a) 제2 영양요구성 유도 유전자좌에 특이적인 제2 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 (b) 제2 공여체 주형 또는 벡터를 상기 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  45. 포유동물 세포와 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 공여체 주형 또는 벡터, cas9 폴리펩티드, 및 가이드 RNA를 접촉시키는 것을 포함하는 생체 외 포유동물 세포에서 영양요구성 유도 유전자좌에 대한 트랜스진의 통합을 표적화하는 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 키메라 RNA인 방법.
  47. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 2개의 하이브리드화된 RNA를 포함하는 방법.
  48. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌 내에 하나 이상의 단일 가닥 파괴를 생성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌 내에 이중 가닥 파괴를 생성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 상기 공여체 주형 또는 벡터를 사용하는 상동성 재조합에 의해 변형되는 방법.
  51. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 상기 세포를 확장하기 전 또는 후에, 선택적으로 상기 세포를 배양하기 전 또는 후에 수행되는 방법.
  52. 제51항에 있어서, (c) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 트랜스진을 함유하는 세포를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 선택이 (i) 생존을 위해 영양요구 인자를 필요로 하는 세포를 선택하고, 선택적으로 (ii) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 트랜스진을 포함하는 세포를 선택하는 것을 포함하는 방법.
  54. 제52항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 우리딘 모노포스페이트 신세타제를 인코딩하는 유전자이고, 세포가 5-FOA와의 접촉에 의해 선택되는 방법.
  55. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 상기 공여체 주형 또는 벡터, 또는 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항의 상기 뉴클레아제 시스템, 및 멸균수 또는 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 멸균 조성물.
  56. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 변형된 포유동물 숙주 세포 및 멸균수 또는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 멸균 조성물.
  57. 선택적으로 용기 또는 바이알에, 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 상기 공여체 주형 또는 벡터 또는 뉴클레아제 시스템 또는 변형된 숙주 세포, 또는 이들의 조합물을 함유하는 키트.
  58. (a) 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 변형된 숙주 세포를 투여하고;
    (b) 변형된 세포가 생착될 수 있도록 컨디셔닝 요법을 선택적으로 투여하고;
    (c) 영양요구 인자를 투여하는 것을 포함하는,
    대상체에서 치료 인자를 발현시키는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 변형된 숙주 세포 및 영양요구 인자를 투여하는 것이 동시에 수행되는 방법.
  60. 제58항에 있어서, 변형된 숙주 세포 및 영양요구 인자를 투여하는 것이 순차적으로 수행되는 방법.
  61. 제58항에 있어서, 치료 인자의 발현을 촉진하기에 충분한 기간 동안 상기 영양요구 인자를 정기적으로 계속 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  62. 제58항에 있어서, 치료 인자의 발현을 감소시키기 위해 상기 영양요구 인자의 투여 속도를 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  63. 제58항에 있어서, 치료 인자의 발현을 증가시키기 위해 상기 영양요구 인자의 투여를 증가시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제58항에 있어서, 변형된 숙주 세포의 성장 억제 또는 사멸을 발생시키는 조건을 생성하기 위해 상기 영양요구 인자의 투여를 중단하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  65. 제58항에 있어서, 변형된 숙주 세포의 성장 억제를 발생시키는 조건을 생성하기 위해 상기 영양요구 인자의 투여를 일시적으로 중단하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  66. 제58항에 있어서, 대상체에서 치료 효과를 발휘하기에 충분한 기간 동안 상기 영양요구 인자를 계속 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  67. 제58항에 있어서, 변형된 숙주 세포가 재생성 숙주 세포인 방법.
  68. 제58항에 있어서, 변형된 숙주 세포의 투여가 국소화된 전달을 포함하는 방법.
  69. 제58항에 있어서, 영양요구 인자의 투여가 전신 전달을 포함하는 방법.
  70. 제38항 내지 제54항 및 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 전에 치료될 대상체로부터 숙주 세포를 유도하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  71. (a) 상기 변형된 숙주 세포 및 (b) 치료량의 치료 인자의 발현을 발생시키기에 충분한 양의 상기 영양요구 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 질병, 장애 또는 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  72. 제67항에 있어서, 질병, 장애 또는 질환이 암, 파킨슨병, 이식편 대 숙주병(GvHD), 자가면역 질환, 과증식 장애 또는 질환, 악성 형질전환, 간 질환, 유전적 유전 결함을 포함하는 유전 질환, 소아 발병 당뇨병 및 안구 구획 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  73. 제67항에 있어서, 질병, 장애 또는 질환이 근육 계통, 골격계, 순환계, 신경계, 림프계, 호흡기 내분비계, 소화계, 배설계 및 생식계로 구성된 군으로부터 선택되는 신체의 적어도 하나의 계에 영향을 미치는 방법.
  74. 질병, 장애 또는 질환의 치료를 위한 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 변형된 숙주 세포의 용도.
  75. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여하거나, 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 변형된 숙주 세포.
  76. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 변형된 인간 숙주 세포를 받은 인간에게 투여하는 데 사용하기 위한 영양요구 인자.
  77. (a) 영양요구성 유도 유전자좌에 통합된 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 변형된 숙주 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 변형된 숙주 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성인, 조성물; 및
    (b) 단백질의 치료적 발현을 생성시키기에 충분한 양의 영양요구 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 완화 또는 치료를 필요로 하는 대상체의 질병 또는 장애를 완화시키거나 치료하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자 내에 있는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 영양요구 인자가 우리딘인 방법.
  80. 제77항에 있어서, 영양요구성 유도 유전자좌가 홀로카르복실라제 신세타제(HLCS)를 인코딩하는 유전자 내에 있는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 영양요구 인자가 비오틴인 방법.
  82. 제77항에 있어서, 단백질이 효소인 방법.
  83. 제77항에 있어서, 단백질이 항체인 방법.
  84. 제77항에 있어서, 변형된 숙주 세포가 배아 줄기 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 다능성 줄기 세포, 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, 체세포 줄기 세포, 분화된 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포, 지방 줄기 세포, 각질세포, 골격 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 섬유모세포, NK 세포, B 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인 방법.
  85. 제77항에 있어서, 변형된 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인 방법.
  87. 제77항에 있어서, 변형된 숙주 세포가 변형된 숙주 세포로 치료될 대상체로부터 유래되는 방법.
  88. 제77항에 있어서, 조성물 및 영양요구 인자의 투여가 동시에 발생하는 방법.
  89. 제77항에 있어서, 조성물 및 영양요구 인자가 순차적으로 투여되는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 조성물이 영양요구 인자 전에 투여되는 방법.
  91. 제77항에 있어서, 조성물 및 영양요구 인자가 동시에 투여되는 방법.
  92. 제77항에 있어서, 영양요구 인자의 투여가 단백질의 치료적 발현을 촉진하기에 충분한 기간 동안 정기적으로 계속되는 방법.
  93. 제77항에 있어서, 영양요구 인자의 투여가 단백질의 발현을 감소시키기 위해 감소되는 방법.
  94. 제77항에 있어서, 영양요구 인자의 투여가 단백질의 발현을 증가시키기 위해 증가되는 방법.
  95. 제77항에 있어서, 영양요구 인자의 중단된 투여가 변형된 숙주 세포의 성장 억제 또는 세포 사멸을 유도하는 방법.
  96. 제77항에 있어서, 영양요구 인자의 투여가 대상체에서 치료 효과를 발휘하기에 충분한 기간 동안 계속되는 방법.
  97. 제77항에 있어서, 변형된 숙주 세포가 재생성 숙주 세포인 방법.
  98. 제77항에 있어서, 조성물의 투여가 국소화된 전달을 포함하는 방법.
  99. 제77항에 있어서, 영양요구 인자의 투여가 전신 전달을 포함하는 방법.
  100. 제77항에 있어서, 질병이 리소좀 축적병(LSD)인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 리소좀 축적병(LSD)이 고셔병(유형 1/2/3), MPS2(헌터)병, 폼페병, 파브리병, 크라베병, 저인산증, 니만-픽병 유형 A/B, MPS1, MPS3A, MPS3B, MPS3C, MPS3, MPS4, MPS6, MPS7, 페닐케톤뇨증, MLD, 잔트호프병, 테이-삭스병 또는 바텐병인 방법.
  102. 제82항에 있어서, 효소가 글루코세레브로시다제(Glucocerebrosidase), 이두르설파제(Idursulfase), 알글루코시다제 알파(Alglucosidase alfa), 아갈시다제 알파(Agalsidase alfa), 아갈시다제 베타(Agalsidase beta), 갈락토실세라미다제(Galactosylceramidase), 아스포타제 알파(Asfotase alfa), 산 스핑고미엘리나제(Acid Sphingomyelinase), 라로니다제(Laronidase), 헤파란 N-설파타제(heparan N-sulfatase), 알파-N-아세틸글루코사미니다제(alpha-N-acetylglucosaminidase), 헤파란-α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제(heparan-α-glucosaminide N-acetyltransferase), N-아세틸글루코사민 6-설파타제(N-acetylglucosamine 6-sulfatase), 엘로설파제 알파(Elosulfase alfa), 글라설페이트(Glasulfate), B-글루코로니다제(B-Glucoronidase), 페닐알라닌 하이드록실라제(Phenylalanine hydroxylase), 아릴설파타제 A(Arylsulphatase A), 헥소스아미니다제-B(Hexosaminidase-B), 헥소스아미니다제-A(Hexosaminidase-A), 또는 트리펩티딜 펩티다제 1(tripeptidyl peptidase 1)인 방법.
  103. 제77항에 있어서, 질병이 프리드리히 운동실조, 유전성 혈관부종 또는 척추 근육 위축인 방법.
  104. 제77항에 있어서, 단백질이 프라탁신, C1 에스테라제 억제제 또는 SMN1인 방법.
  105. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 변형된 인간 숙주 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나 종양의 성장 속도를 감소시키는 방법.
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