BR112020022612A2

BR112020022612A2 - métodos e composições de terapia genética usando células reguláveis auxotróficas

Info

Publication number: BR112020022612A2
Application number: BR112020022612-2A
Authority: BR
Inventors: James Patterson; Matthew Porteus; Volker WIEBKING
Original assignee: Auxolytic Ltd; The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-02-09
Also published as: AU2019265916A1; US20210052741A1; SG11202010837XA; JP2021522865A; KR20210030902A; CA3098874A1; CN112513271A; WO2019217803A1; EP3790974A1; MX2020011757A

Abstract

''MÉTODOS E COMPOSIÇÕES DE TERAPIA GENÉTICA USANDO CÉLULAS REGULÁVEIS AUXOTRÓFICAS''. A presente invenção refere-se a composições e métodos para produzir e usar células hospedeiras auxotróficas modificadas para terapia genética aprimorada envolvendo a administração de um fator auxotrófico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS E COMPOSIÇÕES DE TERAPIA GENÉTICA USANDO CÉLU- LAS REGULÁVEIS AUXOTRÓFICAS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido internacional reivindica prioridade em relação ao pedido provisório U.S. 62/669.848 depositado em 10 de maio de 2018, que está incorporado aqui por referência em sua totali- dade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido está sendo arquivado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. O arquivo de Lis- tagem de Sequência, intitulado 2158 1001PCT SL.txt, foi criado em de maio de 2019 e tem 1.970 bytes de tamanho. A informação em formato eletrônico da Listagem de Sequência é incorporada neste do- cumento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA DESCRIÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se a métodos, composições e kits de terapia genética com eficácia e segurança melhoradas.

ANTECEDENTES

[0004] As terapias de célula mostraram fornecer tratamentos pro- missores. No entanto, a reintrodução de células modificadas em um hospedeiro humano acarreta riscos, incluindo reações imunológicas, transformação maligna ou superprodução ou falta de controle de transgenes.

[0005] Várias abordagens de engenharia genética permitem o con- trole sobre as funções das células humanas, como sinalização, prolife- ração ou apoptose celular (Veja, Bonifant, e outro Mol. Ther. - Onco- Iytics 3, 16011 (2016); Sockolosky e outro, ( 2018). Science (80-.). 359, 1037-1042 Tey, (2014) Clin. Transl. Immunol. 3, e17; cada um dos quais está aqui incorporado por referência em sua totalidade) e tornou possível controlar até mesmo os graves efeitos colaterais das terapias de célula (Bonifant e outro, 2016). Apesar destes avanços, outras apli- cações foram impedidas de ganhar uma aplicação generalizada, por exemplo o uso de células pluripotentes projetadas para medicina re- generativa (Veja, Ben-David e Benvenisty, 2011, Nat. Rev. Cancer 11, 268-277.; Lee e outro, 2013, Nat. Med. 19, 998-1004; Porteus, M. (2011) Mol. Ther. 19, 439-441; cada um dos quais está aqui incorpora- do por referência em sua totalidade), devido ao fato de que os siste- mas de controle que dependem da introdução de um mecanismo de controle geneticamente codificado na célula têm múltiplas limitações (Tey, 2014).

[0006] Dois dos principais problemas que podem surgir são "va- zamento”", ou seja, atividade de baixo nível do mecanismo na ausência de seu gatilho (veja Ando e outro (2015) Stem Cell Reports 5, 597-608, que está aqui incorporado por referência em sua totalidade), e a falta de remoção de toda a população de células após a ativação do meca- nismo (veja Garin e outro (2001) Blood 97, 122-129; Di Stasi e outro (2011) N Engl J Med 365, 1673-1683; Wu e outro (2014) N Engl J Med 365, 1673-1683; Yagyu e outro (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485; cada um dos quais está aqui incorporado por referência em sua totalidade), devido a vários mecanismos de escape do controle externo. Por exemplo, o transgene que é introduzido por transdução viral pode ser silenciado da expressão pela célula (veja Sutkowski e outro (2018) Switch. Int. J. Mol. Sci. 19, 197, que está aqui incorporado por referên- cia em sua totalidade) ou a célula pode desenvolver resistência em relação ao mecanismo efetor (Veja, Yagyu e outro (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485, que estão incorporados aqui por referência em sua to- talidade). Outra preocupação é a mutação do transgene em tipos de células com instabilidade genética, por exemplo linhagens celulares que são cultivadas por períodos prolongados de tempo ou linhagens de célula de tumor (Merkle e outro (2017) Nature 545, 229—233; D'An- tonio e outro (2018) Cell Rep. 24, 883-894; cada um dos quais está aqui incorporado por referência em sua totalidade). Além disso, as po- pulações de células primárias muitas vezes retêm sua funcionalidade apenas por um tempo limitado em cultura ex vivo e muitos tipos não podem ser purificados por isolamento clonal.

[0007] Os modos existentes de chaves de segurança da mesma forma têm uma série de riscos, tais como (1) inserção do transgene em um supressor de tumor levando à transformação oncogênica da linhagem celular e (2) inserção do transgene em uma região epigeneti- camente silenciada levando à falta de expressão e, portanto, eficácia, ou subsequente silenciamento epigenético do transgene após a inser- ção. A instabilidade do genoma é um fenótipo comum na transforma- ção oncogênica de uma célula. Além disso, uma mutação pontual ou perda genética de uma chave suicida exógeno seria rapidamente sele- cionada e amplificada. Uma chave de segurança baseada no alveja- mento de uma trilha de sinalização da célula depende da fisiologia da célula. Por exemplo, uma célula que está no modo "pró-sobrevivência" pode expressar inibidores de caspase, evitando a morte celular após a indução de chave suicida.

[0008] Uma aplicação especialmente atraente de terapia genética envolve o tratamento de distúrbios que são causados por uma insufici- ência de um produto de gene ou que são tratáveis por expressão au- mentada de um produto de gene, por exemplo, uma proteína terapêu- tica, anticorpo ou RNA.

[0009] Avanços recentes permitem a modificação precisa do ge- noma das células humanas. Essa engenharia genética permite uma ampla faixa de aplicações, porém da mesma forma requer novos mé- todos para controlar o comportamento das células. Um sistema de controle alternativo para células é auxotrofia que pode ser criado por alvejamento de um gene no metabolismo. Este conceito foi explorado para microrganismos (veja Steidler e outro (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade) e tem sido amplamente utilizado como uma ferramenta de pesquisa quase universal por geneticistas de levedura. Seria particularmente poderoso em células de mamíferos se fosse criado por nocaute de um gene em vez de pela introdução de um mecanismo de controle com- plexo, e se a auxotrofia fosse para um composto não tóxico que faz parte do metabolismo endógeno da célula. Isso pode ser alcançado pela interrupção de um gene essencial em uma trilha metabólica, per- mitindo que a célula funcione apenas se o produto dessa trilha for ex- ternamente fornecido e absorvido pela célula em seu ambiente. Além disso, se o respectivo gene estiver da mesma forma envolvido na ati- vação de um agente citotóxico, o nocaute do gene (KO) tornaria as células resistentes a esse fármaco, desse modo permitindo a depleção de células não modificadas e purificação das células modificadas em uma população de célula. Vários erros inatos monogênicos do metabo- lismo podem ser tratados pelo fornecimento de um metabólito e, por- tanto, podem ser vistos como modelos de auxotrofia humana.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[0010] Descritos aqui, em algumas modalidades, são modelos de doadores que compreendem (a) uma ou mais sequências de nucleotí- deos homólogas em um fragmento de um local de indução de auxotro- fia ou homólogo ao complemento do referido local de indução de auxo- trofia, e (b) um transgene que codifica um fator terapêutico, opcional- mente ligado a uma sequência de controle de expressão. Em alguns casos, o modelo de doador é de filamento único. Em alguns casos, o modelo de doador é de filamento duplo. Em alguns casos, o modelo de doador é um plasmídeo ou fragmento de DNA ou vetor. Em alguns ca- sos, o modelo de doador é um plasmídeo que compreende elementos necessários para a replicação, opcionalmente compreendendo um promotor e um 3' UTR.

Descritos aqui, em algumas modalidades, são vetores que compreendem (a) uma ou mais sequências de nucleotí- deos homólogas a um fragmento do local de indução de auxotrofia, ou homóloga ao complemento do referido local de indução de auxotrofia, e (b) um transgene que codifica um fator terapêutico.

Em alguns ca- sos, o vetor é um vetor viral.

Em alguns casos, o vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em vetores retrovirais, lentivirais, adenovi- rais, virais adenoassociados e virais do herpes simples.

Em alguns ca- sos, o vetor compreende ainda genes necessários para a replicação do vetor viral.

Em alguns casos, o transgene flanqueado em ambos os lados por sequências de nucleotídeos homólogas a um fragmento do local de indução de auxotrofia ou o complemento do mesmo.

Em al- guns casos, o local de indução de auxotrofia é um gene que codifica uma proteína que está envolvida na síntese, reciclagem ou resgate de um fator auxotrófico.

Em alguns casos, o local de indução de auxotro- fia está dentro de um gene na Tabela 1 ou dentro de uma região que controla a expressão de um gene na Tabela 1. Em alguns casos, o lo- cal de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase.

Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a holocarboxilase sin- tetase.

Em alguns casos, a sequência de nucleotídeo homóloga a um fragmento do local de indução de auxotrofia é 98% idêntica a pelo me- nos 200 nucleotídeos consecutivos do local de indução de auxotrofia.

Em alguns casos, a sequência de nucleotídeo homóloga a um frag- mento do local de indução de auxotrofia é 98% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de uridina monofosfato sintetase hu- mana ou holocarboxilase sintetase ou qualquer um dos genes na Ta- bela 1. Em alguns casos, o modelo de doador ou vetor compreende ainda uma sequência de controle de expressão operacionalmente |i-

gada ao referido transgene. Em alguns casos, a sequência de controle de expressão é uma sequência de controle de expressão específica de tecido. Em alguns casos, a sequência de controle de expressão é um promotor ou intensificador. Em alguns casos, a sequência de controle de expressão é um promotor induzível. Em alguns casos, a sequência de controle de expressão é um promotor constitutivo. Em alguns ca- Sos, a sequência de controle de expressão é uma sequência regulado- ra pós-transcricional. Em alguns casos, a sequência de controle de expressão é um microRNA. Em alguns casos, o modelo de doador ou vetor compreende ainda um gene marcador. Em alguns casos, o gene marcador compreende pelo menos um fragmento de NGFR ou EGFR, pelo menos um fragmento de CD20 ou CD19, Myc, HA, FLAG, GFP, um gene de resistência a antibióticos. Em alguns casos, o transgene é selecionado a partir do grupo que consiste em hormônios, citocinas, quimiocinas, interferons, interleucinas, proteínas de ligação à interleu- cina, enzimas, anticorpos, proteínas de fusão Fc, fatores de cresci- mento, fatores de transcrição, fatores sanguíneos, vacinas, proteínas estruturais, proteínas ligantes, receptores, antígenos de superfície ce- lular, antagonistas de receptor e fatores coestimulantes, proteínas es- truturais, antígenos de superfície celular, canais iônicos, um modifica- dor epigenético ou uma proteína de edição de RNA. Em alguns casos, o transgene codifica um receptor de antígeno de células T. Em alguns casos, o transgene codifica um RNA, opcionalmente, um microRNA regulador.

[0011] Descritos aqui, em algumas modalidades, sistemas de nu- clease para direcionar a integração de um transgene a um local de in- dução de auxotrofia compreendendo uma proteína cas9 e um RNA guia específico para um local de indução de auxotrofia. Descrito aqui, em algumas modalidades, é o sistema de nuclease para direcionar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia com-

preendendo uma meganuclease específica para o referido local de in- dução de auxotrofia. Em alguns casos, a meganuclease é uma ZFN ou TALEN. Em alguns casos, o sistema de nuclease compreende ainda um modelo de doador ou vetor descrito neste documento.

[0012] Descritas aqui, em algumas modalidades, são células hos- pedeiras modificadas ex vivo, compreendendo um transgene que codi- fica um fator terapêutico integrado em um local de indução de auxotro- fia, em que a referida célula hospedeira modificada é auxotrófica para um fator auxotrófico e capaz de expressar o fator terapêutico. Em al- guns casos, a célula hospedeira modificada é uma célula de mamífero. Em alguns casos, a célula hospedeira modificada é uma célula huma- na. Em alguns casos, a célula hospedeira modificada é uma célula- tronco embrionária, uma célula-tronco, uma célula progenitora, uma célula-tronco pluripotente, uma célula-tronco pluripotente induzida (IPS), uma célula-tronco somática, uma célula diferenciada, uma célu- la-tronco mesenquimal, uma célula-tronco neural, uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula progenitora hematopoiética, uma célula- tronco adiposa, um queratinócito, uma célula-tronco esquelética, uma célula-tronco muscular, um fibroblasto, uma célula NK, uma célula B, uma célula T ou um célula mononuclear de sangue periférico (PBMC). Em alguns casos, a célula hospedeira modificada é derivada de célu- las de um indivíduo a ser tratado com as células hospedeiras modifi- cadas.

[0013] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos de produção de uma célula hospedeira de mamífero modificada compre- endendo (a) a introdução na referida célula hospedeira de mamífero um ou mais sistemas de nuclease que têm como alvo e cliva o DNA no local de indução de auxotrofia, ou um ácido nucleico codificando um ou mais componentes dos referidos um ou mais sistemas de nuclease e (b) um modelo de doador ou vetor descrito aqui. Em alguns casos,

os métodos compreendem ainda a introdução de uma segunda nu- clease ou segundo RNA guia para alvejar e clivar DNA em um segun- do local genômico, ou um ácido nucleico que codifica a referida se- gunda nuclease ou segundo RNA guia e, opcionalmente (b) um se- gundo modelo de doador ou vetor.

[0014] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos pa- ra alvejar a integração de um transgene a um local de indução de au- xotrofia em uma célula de mamífero ex vivo, compreendendo contatar a referida célula de mamífero com um modelo de doador ou vetor des- crito aqui e uma nuclease. Em alguns casos, a nuclease é uma ZFN. Em alguns casos, a nuclease é um TALEN.

[0015] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos de produção de uma célula hospedeira de mamífero modificada compre- endendo a introdução na referida célula hospedeira de mamífero com: (a) um polipeptídeo Cas9 ou um ácido nucleico que codifica o referido polipeptídeo Cas9, (b) um RNA guia específico para um local de indu- ção de auxotrofia, ou um ácido nucleico que codifica o referido RNA guia, e (c) um modelo de doador ou vetor descrito aqui. Os métodos compreendem ainda a introdução na referida célula hospedeira de mamífero com (a) um segundo RNA guia específico para um segundo local de indução de auxotrofia, ou um ácido nucleico que codifica o re- ferido RNA guia, e opcionalmente (b) um segundo modelo ou vetor doador.

[0016] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos pa- ra direcionar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia em uma célula de mamífero ex vivo, compreendendo conta- tar a referida célula de mamífero com um modelo de doador ou vetor descrito aqui, um polipeptídeo cas9 e um RNA guia. Em alguns casos, o RNA guia é um RNA quimérico. Em alguns casos, o RNA guia com- preende dois RNAs hibridizados. Em alguns casos, os métodos produ-

zem uma ou mais quebras de filamento único dentro do local de indu- ção de auxotrofia. Em alguns casos, os métodos produzem uma que- bra de filamento duplo dentro do local de indução de auxotrofia. Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia é modificado por re- combinação homóloga usando o referido modelo de doador ou vetor. Em alguns casos, as etapas (a) e (b) são realizadas antes ou depois de expandir as referidas células e, opcionalmente, cultivar as referidas células. Em alguns casos, os métodos compreendem ainda (c) a sele- ção de células que contêm o transgene integrado no local de indução de auxotrofia. Em alguns casos, a seleção compreende (i) selecionar células que requerem o fator auxotrófico para sobreviver e, opcional- mente (ii) selecionar células que compreendem o transgene integrado no local de indução de auxotrofia. Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia é um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase e as células são selecionadas pelo contato com 5-FOA.

[0017] Descrita aqui, em algumas modalidades, é composição es- téril contendo o referido modelo de doador ou vetor, ou o referido sis- tema de nuclease, e água estéril ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. Descrita aqui, em algumas modalidades, é composição esté- ril que compreende a célula hospedeira de mamífero modificada e água estéril ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. Descritos aqui, em algumas modalidades, é um kit contendo o referido modelo de doador ou vetor ou sistema de nuclease ou célula hospedeira modi- ficada, ou uma combinação dos mesmos, de qualquer uma das reivin- dicações anteriores, opcionalmente com um recipiente ou frasco.

[0018] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos de expressão de um fator terapêutico em um indivíduo compreendendo (a) administrar as células hospedeiras modificadas, (b) opcionalmente administrar um regime de condicionamento para permitir que as célu- las modificadas se enxertem e (c) administrar o fator auxotrófico. Em alguns casos, as células hospedeiras modificadas e o fator auxotrófico são administrados simultaneamente. Em alguns casos, as células hospedeiras modificadas e o fator auxotrófico são administrados se- quencialmente. Em alguns casos, a administração do referido fator au- xotrófico é continuada regularmente por um período de tempo suficien- te para promover a expressão do fator terapêutico. Em alguns casos, a administração do referido fator auxotrófico é diminuída para diminuir a expressão do fator terapêutico. Em alguns casos, a administração do referido fator auxotrófico é aumentada para aumentar a expressão do fator terapêutico. Em alguns casos, a administração do referido fator auxotrófico é interrompida para criar condições que resultam na inibi- ção do crescimento ou morte das células hospedeiras modificadas. Em alguns casos, a administração do referido fator auxotrófico é tempora- riamente interrompida para criar condições que resultam na inibição do crescimento das células hospedeiras modificadas. Em alguns casos, a administração do referido fator auxotrófico é continuada por um perío- do de tempo suficiente para exercer um efeito terapêutico em um indi- víduo. Em alguns casos, a célula hospedeira modificada é regenerati- va. Em alguns casos, a administração da célula hospedeira modificada compreende a liberação localizada. Em alguns casos, a administração do fator auxotrófico compreende a administração sistêmica. Em alguns casos, a célula hospedeira antes da modificação é derivada do indiví- duo a ser tratado.

[0019] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos de tratamento de um indivíduo com uma doença, um distúrbio ou uma condição compreendendo administrar ao indivíduo de (a) as referidas células hospedeiras modificadas e (b) o referido fator auxotrófico em uma quantidade suficiente para produzir a expressão de uma quanti- dade terapêutica do fator terapêutico. Em alguns casos, a doença, o distúrbio ou a condição são selecionados a partir do grupo que consis-

te em câncer, doença de Parkinson, doença do enxerto versus hospe- deiro (GvHD), condições autoimunes, distúrbio ou condição hiperproli- ferativa, transformação maligna, condições hepáticas, condições gené- ticas, incluindo defeitos genéticos hereditários, diabetes melito juvenil e condições do compartimento ocular. Em alguns casos, a doença, o distúrbio ou a condição afetam pelo menos um sistema do corpo sele- cionado a partir do grupo que consiste nos sistemas muscular, esque- lético, circulatório, nervoso, linfático, endócrino respiratório, digestivo, excretor e reprodutivo.

[0020] Descritos aqui, em algumas modalidades, são os usos de uma célula hospedeira modificada descrita aqui para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição. São descritas aqui, em algumas modalidades, as células hospedeiras modificadas descritas aqui para uso na administração a seres humanos ou para uso no tratamento de uma doença, um distúrbio ou uma condição.

[0021] Descrito aqui, em algumas modalidades, é o fator auxotrófi- co para uso na administração a um ser humano que recebeu uma cé- lula hospedeira humana modificada.

[0022] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos de alívio ou tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo: (a) uma composição compreendendo célula hospedeira modificada com- preendendo um transgene que codifica uma proteína integrada em um local de indução de auxotrofia, em que a célula hospedeira modificada é auxotrófica para um fator auxotrófico; e (b) o fator auxotrófico em uma quantidade suficiente para produzir a expressão terapêutica da proteína. Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está den- tro de um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase (UMPS). Em alguns casos, o fator auxotrófico é uridina. Em alguns casos, o lo- cal de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a holocarboxilase sintetase (HLCS). Em alguns casos, o fator auxotrófico é biotina.

Em alguns casos, a proteína é uma enzima.

Em alguns ca- sos, a proteína é um anticorpo.

Em alguns casos, a célula hospedeira modificada é uma célula-tronco embrionária, uma célula-tronco, uma célula progenitora, uma célula-tronco pluripotente, uma célula-tronco pluripotente induzida (IPS), uma célula-tronco somática, uma célula diferenciada, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco neu- ral, uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula progenitora he- matopoiética, uma célula-tronco adiposa, um queratinócito, uma célu- la-tronco esquelética, uma célula-tronco muscular, um fibroblasto, uma célula NK, uma célula B, uma célula T ou uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC). Em alguns casos, a célula hospedeira mo- dificada é uma célula de mamífero.

Em alguns casos, a célula de ma- miífero é uma célula humana.

Em alguns casos, a célula hospedeira modificada é derivada do indivíduo a ser tratado com a célula hospe- deira modificada.

Em alguns casos, a composição e o fator auxotrófico são administrados simultaneamente.

Em alguns casos, a composição e o fator auxotrófico são administrados sequencialmente.

Em alguns casos, a composição é administrada antes do fator auxotrófico.

Em alguns casos, a administração do fator auxotró- fico é continuada regularmente por um período de tempo suficiente para promover a expressão terapêutica da proteína.

Em alguns casos, a administração do fator auxotrófico é diminuída para diminuir a ex- pressão da proteína.

Em alguns casos, a administração do fator auxo- trófico é aumentada para aumentar a expressão da proteína.

Em al- guns casos, a administração descontinuada do fator auxotrófico induz a inibição do crescimento ou morte celular da célula hospedeira modi- ficada.

Em alguns casos, a administração do fator auxotrófico é conti- nuada por um período de tempo suficiente para exercer um efeito te-

rapêutico no indivíduo. Em alguns casos, a célula hospedeira modifi- cada é regenerativa. Em alguns casos, a administração da composi- ção compreende a liberação localizada. Em alguns casos, a adminis- tração do fator auxotrófico compreende a administração sistêmica. Em alguns casos, a doença é uma doença de armazenamento lisossomal (LSD). Em alguns casos, LSD é a doença de Gaucher (tipo 1/2/3), do- ença de MPS2 (de Hunter), doença de Pompe, doença de Fabry, do- ença de Krabbe, hipofosfatasia, doença de Niemann-Pick tipo A/B, MPS1, MPS3A, MPS3B, MPS3C, MPS3, MPS4, MPS6, MPS7, Fenil- cetonúria, MLD, doença de Sandhoff, doença de Tay-Sachs ou doença de Battens. Em alguns casos, a enzima é Glucocerebrosidase, Idursul- fase, Alglucosidase alfa, Agalsidase alfa/beta, Galactosilceramidase, Asfotase alfa, Ácido Esfingomielinase, Laronidase, heparan N- sulfatase, alfa-N-acetilglucosaminidase, heparan-a-glucansaminidase, heparan-a-glucansaminidase, N-acetilglucosamina 6-sulfatase, Elosul- fase alfa, Glasulfato, B-Glucoronidase, Fenilalanina hidroxilase, Arilsul- fatase A, Hexosaminidase-B, Hexosaminidase-A ou tripeptidil peptida- se 1. Em alguns casos, a doença é Friedreich, angiomas musculares ou espinal atrofia. Em alguns casos, a proteína é frataxina, inibidor de C1 esterase (que pode da mesma forma ser referido como injeção subcutânea de HAEGAARDAGO) ou SMN1.

[0023] Várias modalidades descritas aqui fornecem um método para reduzir o tamanho de um tumor ou reduzir uma taxa de cresci- mento de um tumor em um indivíduo, o método compreendendo: ad- ministrar ao indivíduo uma célula hospedeira humana modificada como aqui descrito.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[0024] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação estão aqui incorporados por refe- rência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedi-

do de patente individual fosse especificamente e individualmente indi- cado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] As características do assunto abrangido pela presente des- crição são estabelecidas com particularidade nas reivindicações ane- xas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente descrição será obtida por referência à seguinte descrição de- talhada que estabelece modalidades ilustrativas, nas quais os princí- pios do assunto abrangido pela descrição aqui são utilizados, e os de- senhos anexos dos quais:

[0026] FIG. 1A e FIG. 1B exemplifica o efeito do soro na recupera- ção pós-eletroporação ideal. FIG. 1A é um esquema exemplar de en- saio usado para determinar as condições de recuperação de eletropo- ração ideais. Após a eletroporação, as células foram fornecidas com/sem soro, ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) ou uma fonte de uracila exógena (uridina). FIG. 1B ilustra contagens de células por citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter) após 4 dias de recuperação pós-eletroporação nas condições médias indicadas. A figura mostra células administradas com soro, células editadas simuladas tratadas com/sem 5-FOA sem soro e células nocaute de uridina monofosfato sintetase (UMPS) tratadas com/sem 5-FOA sem soro.

[0027] FIG. 2A-FIG. 2F exemplifica que a manutenção e o cresci- mento de células UMPS contendo InDel requerem uma fonte de uraci- la exógena. FIG. 2A é um exemplo esquemático do procedimento usa- do para testar o crescimento de UMPS ou células T editadas simula- das após eletroporação e recuperação. FIG. 2B ilustra o rastreamento de indels por análise de decomposição (TIDE) de UMPS InDels nas condições de cultura indicadas. A análise de TIDE foi realizada no se- quencimaneto de sanger do local de UMPS com os oligonucleotídeos UMPS-O-1 e UMPS-O-2. FIG. 2C ilustra a porcentagem de alelos con-

tendo InDels frameshift analisados por TIDE realizada no dia 8. FIG. 2D ilustra números absolutos previstos de células no dia 8 contendo alelos identificados por TIDE. FIG. 2E ilustra o curso do tempo das contagens de células com/sem UMP. FIG. 2F ilustra a evolução tem- poral das contagens de células com/sem uridina.

[0028] FIG. 3A-FIG. 3C exemplifica que 5-FOA é menos tóxico em linhagens de células alvo UMPS. FIG. 3A é um esquema exemplar do procedimento de seleção de 5-FOA. FIG. 3B e FIG. 3C ilustram conta- gens de células após 4 dias de seleção de 5-FOA nas condições de cultura indicadas. Na FIG. 3B e FIG. 3C, os resultados simulados são representados pela barra esquerda para cada condição de cultura e os resultados para UMPS-7 são mostrados pela barra direita para cada condição de cultura.

[0029] FIG. 4A-FIG. 4D exemplifica que as linhagens celulares di- recionadas para UMPS selecionadas por 5-FOA exibem um cresci- mento idela apenas na presença de uma fonte de uracila exógena. FIG. 4A é um esquema exemplar de protocolo para a demonstração de auxotrofia para uracila. As culturas de células foram divididas após seleção de 4 dias em 5-FOA em meio de teste e cultivadas por mais 4 dias antes da contagem de células. FIG. 4B-FIG. 4D ilustram conta- gens de células de 5-FOA selecionadas em uracila exógena (UMP ou uridina) contendo ou meio deficiente.

[0030] FIG. 5A exemplifica a quantificação InDel realizada no local de UMPS pela análise ICE. FIG. 5B exemplifica a proliferação de célu- las T após tratamento simulado, CCR5 nocaute ou UMPS nocaute. FIG. 5C ilustra a proliferação de células T com UMPS nocaute com ou sem UMP ou uridina. FIG. 5D ilustra a frequência de InDel no dia 8 após UMPS nocaute com diferentes condições de cultura. FIG. 5E ilus- tra a frequência de InDels que se prevê levar a um frameshift.

[0031] FIG. 6A exemplifica construções de doadores de DNA para o alvejamento do local de UMPS. FIG. 6B ilustra a expressão de mar- cadores de superfície após o alvejamento de células K562. FIG. 6C exemplifica a abordagem de alvejamento para integrar a Nanolucifera- se e a proteína fluorescente verde (GFP) no local de HBB. FIG. 6D ilustra a expressão dos 3 marcadores integrados em células K562 an- tes da classificação de células. FIG. 6E ilustra o crescimento de célu- las K562 e contagens de células no dia 8 quando cultivadas na pre- sença de diferentes concentrações de uridina. FIG. 6F ilustra a sele- ção de células UMPSKO'Kº durante a cultura com 5-FOA. FIG. 6G ilus- tra a proliferação de células UMPSKO/Kº na presença de 5-FOA.

[0032] FIG. 7A exemplifica a expressão do marcador de superfície após alvejamento de UMPS de células T. FIG. 7B ilustra o crescimento auxotrófico de UMPS KO ou células T tipo silvestre (WT). FIG. 7C ilus- tra que 5-FOA seleciona células T com UMPS nocaute.

[0033] Os grupos foram comparados por testes estatísticos como indicado usando Prism 7 (GraphPad). Os asteriscos indicam níveis de significância estatística: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001 e *** = p <0,0001.

DESCRIÇÃO DETALHADA |. Introdução

[0034] Avanços recentes permitem a modificação precisa do ge- noma de células humanas. Essa engenharia genética permite uma ampla faixa de aplicações, porém da mesma forma requer novos mé- todos para controlar o comportamento das células. Um sistema de controle alternativo para células é auxotrofia, que pode ser projetada visando um gene no metabolismo. A abordagem aqui descrita de au- xotrofia de engenharia genética pela interrupção de um gene central do metabolismo é um paradigma alternativo para criar um mecanismo de controle externo sobre a função celular que não foi explorado para células humanas. Ao interromper um gene chave no metabolismo de pirimidina, um sistema de contenção passivo foi criado (Steidler e ou- tro, 2003), que é uma adição e alternativa à caixa de ferramentas já existente de sistemas para células humanas que contornam suas limi- tações mencionadas anteriormente. Permite o controle do crescimento de células humanas por meio da adição ou retirada da substância ató- xica uridina. A auxotrofia foi previamente desenvolvida em microrga- nismos, por exemplo em direção a uma substância não natural pela introdução de um circuito de gene projetado (veja, Kato, Y. (2015) An engineered bacterium auxotrophic for an unnatural amino acid: a novel biological containment system. PeerJ 3, e1247, que está aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade) ou para pirimidinas por nocaute de um gene bacteriano (veja, Steidler e outro (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789, que está aqui incorporado por referência em sua totalida- de). O último conceito é atraente, uma vez que se baseia no nocaute de um gene em vez da introdução de cassetes de expressão comple- xos, o que impede a célula de reverter a modificação genética ou o desenvolvimento de mecanismos de resistência e, portanto, aborda esse desafio de sistemas alternativos. O fato de que os nucleosídeos e nucleotídeos de pirimidina desempenham um papel essencial em uma ampla faixa de processos celulares, incluindo síntese de DNA e RNA, transferência de energia, transdução de sinal e modificação de proteí- nas (veja, van Kuilenburg, ABP e Meinsma, R. (2016). Biochem. Bi- ophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1862, 1504-1512, que está aqui incorpo- rada por referência em sua totalidade) torna a sua trilha de síntese um alvo teoricamente atraente.

[0035] As células humanas são naturalmente auxotróficas para certos compostos, como aminoácidos, que necessitam adquirir, seja de fontes externas ou de organismos simbióticos (Veja, Murray, PJ (2016). Nat. Immunol. 17, 132-139, que está aqui incorporado por refe- rência em sua totalidade). Além disso, a auxotrofia é um mecanismo natural para modular a função das células imunes, por exemplo por fornecimento ou esgotamento diferencial do metabólito para o qual as células são auxotróficas (Veja, Grohmann e outro, (2017). Citocina Growth Factor Rev. 35, 37-45, que está aqui incorporado por referên- cia em sua totalidade). A auxotrofia celular da mesma forma desem- penha um papel importante nos mecanismos de defesa contra o cres- cimento maligno, por exemplo no caso de macrófagos que inibem o crescimento do tumor por eliminação da arginina (Murray, 2016). Além disso, vários tipos de células malignas mostraram ser auxotróficos pa- ra certos metabólitos (veja, Fung, MKL e Chan, GCF (2017). J. Hema- tol. Oncol. 10, 144, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade), que é explorado pela depleção terapêutica de asparagina para o tratamento de pacientes com leucemia (Veja, Hill e outro, (1967). JAMA 202, 882).

[0036] Além das estratégias de contenção desenvolvidas anteri- ormente para microrganismos, a abordagem aqui descrita usando edi- ção de genes com base na ribonucleoproteína Cas9 (RNP)/rAAV6 permite a engenharia altamente eficiente de um tipo de célula humana primária e terapeuticamente relevante. Auxotrofia e resistência a 5- FOA são inerentes a todas as células com ruptura completa do gene UMPS, porém para mostrar a prova de conceito, a identificação das populações foi facilitada com o nocaute bialélico por integração direci- onada de marcadores de seleção. O recente desenvolvimento de mé- todos que permitem a modificação direcionada eficiente de células humanas primárias (Bak e outro (2017).

[0037] Engenharia genética multiplexada de células-tronco hema- topoéticas humanas e células progenitoras usando CRISPR/Cas9 e AAVGB. Elife 6, e27873; Bak, e outro (2018). Nat. Protoc. 13, 358—376; Porteus, M.H. e Baltimore, D. (2003). Science (80-.). 300, 763763; cada um dos quais está aqui incorporado por referência em sua totali-

dade) juntamente com o estabelecimento de auxotrofia metabólica es- tabelece a base para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas em contextos onde o uso de células humanas é necessário, por exem- plo no uso de células-tronco ou tecidos derivados de células-tronco ou outras células somáticas autólogas com funções efetoras específicas e imunogenicidade reduzida. Notavelmente, construtores e reagentes foram usados que facilitaria a tradução clínica acelerada, por exemplo marcadores de seleção tNGFR e tEGFR nos construtores de alveja- mento, que evita a imunogenicidade, e uridina fornecida no modelo in vivo usando seu pró-fármaco aprovado pela FDA.

[0038] Mecanismos projetados para controlar a função celular têm o desafio adicional de selecionar uma população totalmente pura de células que expressam as proteínas que mediam o mecanismo de controle. A possibilidade de selecionar as células projetadas, tornando- as resistentes a um agente citotóxico é particularmente atraente, uma vez que pode aumentar substancialmente a eficiência, permitindo a criação de uma população de células altamente pura que pode ser controlada usando uma substância não tóxica e a remoção de um ge- ne crucial para a função de uma trilha metabólica vital impede que as células desenvolvam mecanismos de escape. Portanto, este método oferece várias vantagens sobre os mecanismos de controle existentes em cenários onde a instabilidade genética e o risco de transformação maligna desempenham um papel e onde mesmo um pequeno número de células que escapam de sua contenção podem ter efeitos desastro- sos, por exemplo, no uso de células-tronco somáticas ou pluripotentes.

[0039] Este conceito foi explorado para microrganismos (Steidler e outro, 2003) e tem sido amplamente utilizado como uma ferramenta de pesquisa quase universal por geneticistas de leveduras. Seria particu- larmente poderoso em células de mamíferos se fosse criado por no- caute de um gene em vez de pela introdução de um mecanismo de controle complexo, e se a auxotrofia fosse em direção a um composto não tóxico que faz parte do metabolismo endógeno da célula. Isso po- de ser alcançado pela interrupção de um gene essencial em uma trilha metabólica, permitindo que a célula funcione apenas se o produto des- sa trilha for externamente fornecido e absorvido pela célula em seu ambiente. Além disso, se o respectivo gene estiver da mesma forma envolvido na ativação de um agente citotóxico, o nocaute do gene (KO) tornaria as células resistentes a esse fármaco, desse modo per- mitindo a depleção de células não modificadas e purificação das célu- las modificadas em uma população de célula. Vários erros inatos mo- nogênicos do metabolismo podem ser tratados pelo fornecimento de um metabólito e, portanto, podem ser vistos como modelos de auxotro- fia humana.

[0040] Em certas modalidades, a auxotrofia é introduzida nas célu- las humanas interrompendo UMPS na trilha de síntese de pirimidina de novo por meio da edição do genoma. Isso torna a função da célula dependente da presença da uridina exógena. Além disso, isso elimina a capacidade da célula de metabolizar o ácido 5-fluoroorótico em 5- FU, o que permite a depleção das células restantes com alelos UMPS intactos. A capacidade de usar um metabólito para influenciar a função das células humanas por auxotrofia geneticamente modificada e para esgotar outras células fornece o desenvolvimento desta abordagem para uma faixa de aplicações onde uma população pura de células controláveis é necessária.

[0041] Um exemplo é a acidúria orótica hereditária, em que muta- ções no gene UMPS levam a uma disfunção que pode ser tratada por suplementação com altas doses de uridina (Veja, Fallon e outro (1964). N. Engl. J. Med. 270, 878-881, que está incorporado aqui por referên- cia em sua totalidade). Transferindo este conceito para um tipo de cé- lula de interesse, a engenharia genética é usada para nocautear o ge-

ne UMPS em células humanas, o que torna as células auxotróficas à uridina e resistentes ao ácido 5-fluoroorótico (5-FOA). Nós mostramos que linhagens celulares UMPS -/- e células primárias sobrevivem e proliferam apenas na presença de uridina in vitro, e que a proliferação de células modificadas UMPS é inibida sem suplementação de uridina in vivo. Além disso, as células podem ser selecionadas de uma popu- lação mista por cultura na presença de 5-FOA.

[0042] Em certas modalidades, a auxotrofia é introduzida nas célu- las humanas interrompendo o UMPS na trilha de síntese de pirimidina de novo por meio da edição do genoma. Isso torna a função da célula dependente da presença de uridina exógena. Além disso, isso elimina a capacidade da célula de metabolizar o ácido 5-fluoroorótico em 5- FU, o que permite a depleção das células restantes com alelos UMPS intactos. A capacidade de usar um metabólito para influenciar a função das células humanas por auxotrofia geneticamente modificada e para esgotar outras células fornece o desenvolvimento desta abordagem para uma faixa de aplicações onde uma população pura de células controláveis é necessária.

[0043] Um exemplo de auxotrofia é a acidúria orótica hereditária, em que mutações no gene UMPS levam a uma disfunção que pode ser tratada por suplementação com altas doses de uridina (Fallon e outro, 1964). Transferindo este conceito para um tipo de célula de inte- resse, a engenharia genética foi usada para nocautear o gene UMPS em células humanas que torna as células auxotróficas à uridina e re- sistentes ao ácido 5-fluororótico (5-FOA). As linhagens celulares UMPS -/- e as células primárias são mostradas aqui para sobreviver e proliferar apenas na presença de uridina in vitro, e que a proliferação de células modificadas UMPS é inibida sem suplementação de uridina in vivo. Além disso, as células podem ser selecionadas de uma popu- lação mista por cultura na presença de 5-FOA.

Il. Composições e métodos de uso de certas modalidades

[0044] Descritas aqui são algumas modalidades de métodos e composições para uso em terapia genética. Em alguns casos, os mé- todos compreendem a liberação de um transgene, que codifica um fa- tor terapêutico, às células hospedeiras de uma maneira que torna a célula hospedeira modificada auxotrófica e que pode fornecer eficácia, potência e/ou segurança melhoradas da terapia genética através da expressão do transgene. A liberação do transgene a um local de indu- ção de auxotrofia específico cria uma célula auxotrófica, por exemplo, através da interrupção ou nocaute de um gene ou regulação negativa da atividade de um gene, que agora depende da administração contí- nua de um fator auxotrófico para crescimento e reprodução. Em alguns casos, os métodos compreendem sistemas de nuclease direcionados ao local de indução de auxotrofia, modelos de doadores ou vetores para inserir o transgene, kits e métodos de uso de tais sistemas, mo- delos ou vetores para produzir células modificadas que são auxotrófi- cas e capazes de expressar o transgene.

[0045] Da mesma forma descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos, composições e kits para uso das células hospedeiras modificadas, incluindo composições farmacêuticas, métodos terapêuti- cos e métodos de administração de fatores auxotróficos para controlar - aumentar, diminuir ou cessar - o crescimento e reprodução das célu- las modificadas e para controlar a expressão do transgene e para con- trolar os níveis do fator terapêutico.

[0046] Em alguns casos, a liberação do transgene ao local deseja- do pode ser realizada por meio de métodos, como recombinação ho- móloga. Quando aqui utilizado, "recombinação homóloga (HR)" refere- se à inserção de uma sequência de nucleotídeos durante o reparo de quebras de filamento duplo no DNA por meio de mecanismos de repa- ro direcionados por homologia. Este processo usa uma molécula "doa-

dora" ou "modelo de doador" com homologia à sequência de nucleotí- deos na região da quebra como um modelo para reparar uma quebra de filamento duplo. A presença de uma quebra de filamento duplo faci- lita a integração da sequência doadora. A sequência doadora pode ser fisicamente integrada ou usada como molde para a reparação da que- bra por meio de recombinação homóloga, resultando na introdução de toda ou parte da sequência de nucleotídeos. Este processo é usado por uma série de diferentes plataformas de edição de genes que criam a quebra de filamento duplo, como meganucleases, como nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativado- res de transcrição (TALENs) e os sistemas de edição de gene CRISPR-Cas9.

[0047] Em algumas modalidades, os genes são liberados a dois ou mais locais, por exemplo, para a expressão de múltiplos fatores tera- pêuticos, ou para a introdução de um segundo gene que atua como um regulador sintético ou que atua para influenciar as células modifi- cadas em direção uma certa linhagem (por exemplo, expressando um fator de transcrição do segundo local). Em algumas modalidades, os genes são liberados a dois ou mais locais de indução de auxotrofia. Por exemplo, um gene diferente ou uma segunda cópia do mesmo ge- ne é liberada a um segundo local de indução de auxotrofia.

[0048] Em algumas modalidades, a célula é auxotrófica porque a célula não tem mais a capacidade de produzir o fator auxotrófico. Quando aqui utilizado, uma "célula", "célula modificada" ou "célula hospedeira modificada" refere-se a uma população de células descen- dentes da mesma célula, com cada célula da população tendo uma composição genética semelhante e retendo a mesma modificação.

[0049] Em algumas modalidades, o fator auxotrófico compreende um ou dois ou mais nutrientes, enzimas, pH alterado, temperatura alte- rada, moléculas não orgânicas, aminoácidos não essenciais ou con-

centrações alteradas de uma fração (em comparação com as concen- trações fisiológicas normais), ou suas combinações. Todas as referên- cias ao fator auxotrófico aqui contemplam a administração de múltiplos fatores. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o fator au- xotrófico é um nutriente ou enzima que não é tóxico nem biodisponível no indivíduo em concentrações suficientes para sustentar a célula hospedeira modificada e deve ser entendido que qualquer referência a "fator auxotrófico" ao longo deste pedido pode incluir referência a um nutriente ou enzima.

[0050] Em alguns casos, se a célula modificada não for continua- mente fornecida com o fator auxotrófico, a célula cessa a proliferação ou morre. Em alguns casos, a célula modificada fornece um interruptor de segurança que diminui os riscos associados a outras terapias ba- seadas em células que incluem transformação oncogênica.

[0051] Os métodos e composições descritos aqui fornecem uma série de vantagens, por exemplo: resultados e condições consistentes devido à integração no mesmo local em vez de integração aleatória, como com lentivetores; expressão constante do transgene porque áreas com promotores ou potencializadores nativos ou áreas que são silenciadas são evitadas; um número consistente de cópias de integra- ção, 1 ou 2 cópias, ao invés de uma distribuição de Poisson; e chance limitada de transformação oncogênica. Em alguns casos, as células modificadas da presente descrição são menos heterogêneas do que um produto projetado por lentivetor ou outro vetor viral.

[0052] Em algumas modalidades, descritos aqui, são métodos de contra seleção para gerar uma população de células que são 100% auxotróficas, limitando a probabilidade de reversão para um estado não auxotrófico. As chaves de segurança atuais dependem da inser- ção de um transgene, e as células modificadas podem escapar por meio da mutação do transgene ou do silenciamento epigenético de sua expressão (veja, por exemplo, Wu e outro, Mol Ther Methods Clin Dev. 1: 14053 (2014), que está aqui incorporado por referência em sua totalidade). Desse modo, a combinação da inserção do transgene com a criação de um mecanismo auxotrófico é geralmente mais segura a longo prazo.

[0053] Em algumas modalidades, a redução da administração do fator auxotrófico a níveis baixos pode fazer com que as células modifi- cadas entrem em um estado quiescente em vez de serem mortas, permitindo a interrupção temporária e o reinício da terapia com células já presentes no hospedeiro. Isso seria uma vantagem em comparação a ter que reeditar as células hospedeiras e reintroduzir as células hos- pedeiras modificadas.

[0054] Em algumas modalidades, a cessação da administração do fator auxotrófico resultará na morte das células modificadas quando isso for desejado, por exemplo, se a proliferação aberrante ou trans- formação oncogênica tiver sido detectada, ou se a interrupção do tra- tamento for desejada.

[0055] Em algumas modalidades, o aumento da administração do fator auxotrófico aumenta o crescimento e a reprodução das células modificadas e resulta no aumento da expressão do transgene e, por- tanto, níveis aumentados do fator terapêutico. Em alguns casos, a ad- ministração de fator auxotrófico fornece um meio para controlar a do- sagem do produto de gene.

[0056] Um mecanismo de segurança baseado em auxotrofia con- torna muitos dos riscos para os pacientes associados às terapias de célula atuais. Ao suplementar um paciente com um fator auxotrófico definido durante o curso da terapia e remover o fator após a cessação da terapia ou alguma outra indicação baseada na segurança, o cres- cimento celular é fisicamente limitado. Em alguns casos, se o fator au- xotrófico não estiver mais disponível para a célula, a célula para de se dividir e não tem um mecanismo evidente para o desenvolvimento de resistência. Ao manipular os níveis do fator auxotrófico, a taxa de crescimento das células in vivo é controlada. Múltiplas linhas de célu- las podem ser controladas de forma independente in vivo usando au- xotrofias separadas. O crescimento específico do local pode ser con- trolado pela liberação localizada de nutrientes, como células B pan- creáticas exogenamente cultivadas administradas em um dispositivo biocompatível que libera um nutriente e evita o escape celular. Por exemplo, os métodos e composições aqui descritos podem ser usados em conjunto com a tecnologia de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR), para permitir um controle mais definido sobre a ativi- dade de células T CAR in vivo. Em alguns casos, as composições descritas aqui são usadas para inibir ou reduzir o crescimento do tu- mor. Por exemplo, a retirada do fator auxotrófico (por exemplo, uridina ou biotina) pode levar à regressão do tumor.

[0057] Um número considerável de distúrbios é causado por uma insuficiência de um produto de gene ou são tratáveis por aumento da expressão de um fator terapêutico, por exemplo, proteína, peptídeo, anticorpo ou RNA. Em algumas modalidades, descritas aqui, são com- posições que compreendem a célula hospedeira modificada compre- endendo um transgene que codifica um fator terapêutico de interesse integrado em um local de indução de auxotrofia, em que a célula hos- pedeira modificada é auxotrófica para um fator auxotrófico. Além disso, são descritos aqui, em algumas modalidades, métodos de uso das composições da descrição atual para tratar condições em um indivíduo em necessidade, fornecendo o fator auxotrófico em uma quantidade suficiente para produzir a expressão terapêutica do fator. Fatores terapêuticos exemplares

[0058] As modalidades a seguir fornecem condições a serem tra- tadas pela produção de um fator terapêutico em uma célula hospedei-

ra auxotrófica.

[0059] Os distúrbios de coagulação, por exemplo, são distúrbios genéticos bastante comuns em que os fatores da cascata de coagula- ção estão ausentes ou têm função reduzida devido a uma mutação. Estes incluem hemofilia A (deficiência de fator VIII), hemofilia B (defici- ência de fator IX) ou hemofilia C (deficiência de fator XI).

[0060] A deficiência de alfa-1antitripsina (AIAT) é uma doença au- tossômica recessiva causada pela produção defeituosa de alfai- antitripsina que leva a níveis inadequados de A1AT no sangue e nos pulmões. Pode estar associada ao desenvolvimento de doença pul- monar obstrutiva crônica (DPOC) e doenças hepáticas.

[0061] O diabetes tipo | é um distúrbio no qual a destruição imu- nomediada das células beta pancreáticas resulta em uma deficiência profunda na produção de insulina. As complicações incluem doença isquêmica do coração (angina e infarto do miocárdio), acidente vascu- lar cerebral e doença vascular periférica, retinopatia diabética, neuro- patia diabética e nefropatia diabética, que pode resultar em doença renal crônica que requer diálise.

[0062] Os anticorpos são produtos proteicos secretados usados para neutralização ou eliminação de proteínas alvo que causam doen- ças, bem como morte altamente seletiva de certos tipos de células (por exemplo, células cancerosas, certas células imunes em doenças au- toimunes, células infectadas com vírus, tal como vírus da imunodefici- ência humana (HIV), RSV, Flu, Ebola, CMV e outros). A terapia com anticorpos tem sido amplamente aplicada a muitas condições huma- nas, incluindo oncologia, reumatologia, transplante e doenças ocula- res. Em alguns casos, o fator terapêutico codificado pelas composi- ções descrita aquis é um anticorpo usado para prevenir ou tratar con- dições como câncer, doenças infecciosas e doenças autoimunes. Em certas modalidades, o câncer é tratado reduzindo a taxa de crescimen-

to de um tumor ou reduzindo o tamanho de um tumor no indivíduo.

[0063] Anticorpos monoclonais aprovados pela FDA para uso te- rapêutico incluem Adalimumabe, Bezlotoxumabe, Avelumabe, Dupilu- mabe, Durvalumabe, Ocrelizumabe, Brodalumabe, Reslizumabe, Ola- ratumabe, Daratumumabe, Elotuzumabe, Necitumumabe, Aliximabu- mabe, Alivumabumabe, Inflixzimabizolumabe, Obilepinumabe, Aljima- bizolumab e, Idarucizumabe, Evolocumabe, Dinutuximabe, bevacizu- mabe, Pembrolizumabe, Ramucirumabe, Vedolizumabe, Siltuximabe, alemtuzumabe, trastuzumabe entansina, pertuzumabe, infliximabe, Obinutuzumabe, Brentuximabe, raxibacumabe, Belimumabe, Ipilimu- mabe, Denosumabe, Denosumabe, ofatumumabe, besilesomabe, To- cilizumabe, Canacinumabe, golimumabe, ustekinumabe, certolizumabe certolizumabe, Catumaxomabe, eculizumabe, ranibizumabe, panitu- mumabe, natalizumabe, Catumaxomabe, bevacizumabe, omalizuma- be, Cetuximabe, efalizumabe, ibritumomabe tiuxetano, Fanolesomabe, Adalimumabe, Tositumomabe, alemtuzumabe, Trastuzumabe, gem- tuzumabe ozogamicina, infliximabe, palivizumabe, Necitumumabe, ba- siliximabe, Rituximabe, Votumumabe, Sulesomabe, Arcitumomabe, Imiciromabe, Capromabe, Nofetumomabe, Abciximabe, Satumomabe e Muromonab-CD3. O anticorpo biespecífico aprovado pela FDA para uso terapêutico inclui Blinatumomabe. Em algumas modalidades, o anticorpo é usado para prevenir ou tratar HIV ou outras doenças infec- ciosas. Os anticorpos para uso no tratamento de HIV incluem anticor- po monoclonal humano (mMAb) VRC-HIVMABO60-00-AB (VRCO1); mAb VRC-HIVMABO80-00-AB (VRCO1LS); mAb VRC-HIVMABO75-00-AB (VRC07-523LS); mAb F105; mAb C2F5; mAb C2G12; mAb C4E10; anticorpo UB-421 (direcionado ao receptor do HIV-1 na molécula CD4 (domínio 1) de linfócitos T e monócitos); Ccromab004 (anticorpo I9G4 monoclonal humano para Ccr5); mAb PGDM1400; mAb PGT121 (anti- corpos monoclonais IgG1 seres humanos recombinantes que têm co-

mo alvo uma região de epítopo V1IV2 (PGDM1400) e dependente de glicano V3 (PGT121) da proteína do envelope de HIV); KD-247 (um anticorpo monoclonal humanizado); PRO 140 (um anticorpo monoclio- nal CCR5); mAb 3BNC117; e PG9 (anticorpo monocional anti-HIV-1 gp120).

[0064] RNAs terapêuticos incluem antissentido, siRNAs, aptâme- ros, mímicos de microRNA/anti-miRs e mRNA sintético, e alguns des- tes podem ser expressos por transgenes.

[0065] LSDs são doenças metabólicas hereditárias que são carac- terizadas por um acúmulo anormal de vários materiais tóxicos nas cé- lulas do corpo como resultado de deficiências enzimáticas. Existem quase 50 desses distúrbios ao todo e afetam diferentes partes do cor- po, incluindo o esqueleto, o cérebro, a pele, o coração e o sistema nervoso central. Exemplos comuns incluem esfingolipidoses, doença de Farber (deficiência de ASAH1), doença de Krabbe (deficiência de galactosilceramidase ou GALC), galactosialidose, Gangliosidoses, al- fa-galactosidase, doença de Fabry (deficiência de a-galactosidase — GLA ou agalsidase alfa/beta), doença de Schindler (deficiência de alfa- NAGA), GM1 gangliosidose, GM2 gangliosidoses (deficiência de beta- hexosaminidase), doença de Sandhoff (deficiência de hexosaminida- se-B), doença de Tay-Sachs (deficiência de hexosaminidase-A), doen- ça de Gaucher Tipo 1/2/3 (deficiência de glicocerebrosidase-nome do gene: GBA), doença de Wolman (deficiência de LAL), doença de Nie- mann-Pick tipo A/B (deficiência de esfingomielina fosfodiesterase 1 - SMPD1 ou esfingomielinase ácida), Sulfatidose, leucodistrofia meta- cromática, síndrome de Hurler (deficiência de alfa-L iduronidase - IDUA), Síndrome de Hunter ou MPS2 (deficiência iduronato-2- sulfatase - idursulfase ou IDS), síndrome de Sanfilippo, Morquio, sín- drome de Maroteaux-Lamy, síndrome de Sly (deficiência de B- glucuronidase), Mucolipidose, doença de células |, Lipidose, = Lipofus-

cinoses ceroides neuronais, doença de Batten (deficiência de tripeptidil peptidase-1), Pompe (deficiência de alglucosidase alfa), hipofosfatasia (deficiência de asfotase alfa), MPS1 (deficiência de laronidase), MPS3A (deficiência de heparina N-sulfatase), MPS3B (deficiência de alfa-N-acetilglucosaminidase), MPS3C (deficiência de heparina-a-glu- cosaminida N-acetiltransferase), MPS3D (deficiência de N-acetilgluco- samina 6-sulfatase), MPS4 (deficiência de elosulfase alfa), MPS6 (de- ficiência de glassulfato), MPS7 (deficiência de B-glucoronidase), fenil- cetonúria (deficiência de fenilalanina hidroxilase) e MLD (deficiência de arilsulfatase A). Coletivamente, LSDs têm uma incidência na popula- ção de cerca de 1 em 7.000 nascimentos e têm efeitos graves, incluin- do morte precoce. Embora os ensaios clínicos estejam em andamento sobre possíveis tratamentos para algumas dessas doenças, não há atualmente nenhum tratamento aprovado para muitos LSDs. As op- ções atuais de tratamento para alguns, porém não todos os LSDs, in- cluem a terapia de reposição enzimática (TRE). ERT é um tratamento médico que substitui uma enzima deficiente ou ausente no corpo. Em alguns casos, isso é feito administrando ao paciente uma infusão in- travenosa (IV) de uma solução contendo a enzima.

[0066] Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos de tratamento de um LSD em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo fornecer à terapia de substituição de enzima individu- al usando as composições descrita aquis. Em alguns casos, o método compreende uma célula hospedeira modificada ex vivo, compreen- dendo um transgene que codifica uma enzima integrada em um local de indução de auxotrofia, em que a referida célula hospedeira modifi- cada é auxotrófica para um fator auxotrófico e capaz de expressar a enzima que é deficiente no indivíduo, desse modo tratando LSD no indivíduo. Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está den- tro de um gene na Tabela 1 ou dentro de uma região que controla a expressão de um gene na Tabela 1. Em alguns casos, o local de indu- ção de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a uridina mono- fosfato sintetase (UMPS). Em alguns casos, o fator auxotrófico é a uri- dina.

Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a holocarboxilase sintetase (HLCS). Em alguns casos, o fator auxotrófico é biotina.

Em alguns casos, o local de indu- ção de auxotrofia está dentro de um gene que codifica asparagina sin- tetase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é asparagina.

Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica aspartato transaminase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é aspartato.

Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a alanina transaminase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é alanina.

Em alguns casos, o local de indu- ção de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a cistationina beta-sintase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é cisteína.

Em al- guns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a cistationina gama-liase.

Em alguns casos, o fator auxo- trófico é cisteína.

Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a glutamina sintetase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é glutamina.

Em alguns casos, o local de in- dução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica serina hidro- ximetiltransferase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é serina ou glicina.

Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a glicina sintase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é glicina.

Em alguns casos, o local de indução de auxotro- fia está dentro de um gene que codifica a fosfoserina transaminase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é serina.

Em alguns casos, o lo- cal de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a fosfoserina fosfatase.

Em alguns casos, o fator auxotrófico é serina.

Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica fenilalanina hidroxilase. Em alguns casos, o fator auxotrófico é a tirosina. Em alguns casos, o local de indução de auxo- trofia está dentro de um gene que codifica a argininossucinato sinte- tase. Em alguns casos, o fator auxotrófico é arginina. Em alguns ca- sos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codi- fica a argininossucinato liase. Em alguns casos, o fator auxotrófico é arginina. Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está den- tro de um gene que codifica a di-hidrofolato redutase. Em alguns ca- sos, o fator auxotrófico é folato ou tetra-hidrofolato.

[0067] Também descritos aqui, em algumas modalidades, são mé- todos de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo fornecer a terapia de substituição de proteína individual usando as composições descri- tas aqui. Em alguns casos, o método compreende uma célula hospe- deira modificada ex vivo, compreendendo um transgene que codifica uma proteína integrada em um local de indução de auxotrofia, em que a referida célula hospedeira modificada é auxotrófica para um fator au- xotrófico e capaz de expressar a proteína que é deficiente no indiví- duo, desse modo tratando a doença ou distúrbio no indivíduo. Em al- guns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene na Tabela 1 ou dentro de uma região que controla a expressão de um gene na Tabela 1. Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase (UMPS). Em alguns casos, o fator auxotrófico é a uridina. Em alguns casos, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a holocarboxilase sintetase (HLCS). Em alguns casos, o fator auxotrófico é biotina. Em alguns casos, a doença é ataxia de Frie- dreich e a proteína é a frataxina. Em alguns casos, a doença é angio- edema hereditário e a proteína é um inibidor de C1 esterase (por exemplo, injeção subcutânea de HAEGAARDAOGO). Em alguns casos, a doença é a atrofia muscular espinhal e a proteína é SMN1. Ill. Composições e Métodos para Preparar Células Modificadas A. Células

[0068] Descritas aqui, em algumas modalidades, são composições compreendendo células hospedeiras modificadas, de preferência célu- las humanas, que são geneticamente modificadas para serem auxotró- ficas (por meio da inserção de um transgene que codifica um fator te- rapêutico em um local de indução de auxotrofia) e são capazes de ex- pressar o fator terapêutico. Células animais, células de mamíferos, de preferência células humanas, modificadas ex vivo, in vitro ou in vivo são contempladas. Estão da mesma forma incluídas células de outros primatas; mamíferos, incluindo mamíferos comercialmente relevantes, tais como gado, porcos, cavalos, ovelhas, gatos, cães, camundongos, ratos; pássaros, incluindo pássaros comercialmente relevantes, tais como aves, galinhas, patos, gansos e/ou perus.

[0069] Em algumas modalidades, a célula é uma célula-tronco embrionária, uma célula-tronco, uma célula progenitora, uma célula- tronco pluripotente, uma célula-tronco pluripotente induzida (iPS), uma célula-tronco somática, uma célula diferenciada, uma célula-tronco mesenquimal ou uma célula estromal mesenquimal, uma célula-tronco neural, uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula progenitora hematopoiética, uma célula-tronco adiposa, um queratinócito, uma cé- lula-tronco esquelética, uma célula-tronco muscular, um fibroblasto, uma célula NK, uma célula B, uma célula T ou uma célula mononucle- ar de sangue periférico (PBMC). Por exemplo, a célula pode ser proje- tada para expressar um CAR, desse modo criando uma célula T CAR. Em algumas modalidades, as linhagens celulares são células T que são geneticamente modificadas para serem auxotróficas. As células T auxotróficas projetadas podem ser administradas a um paciente com câncer junto com um fator auxotrófico. Após a destruição do câncer, o nutriente auxotrófico pode ser removido, o que resulta na eliminação das células T auxotróficas manipuladas. Em algumas modalidades, as linhagens celulares são células-tronco pluripotentes que são geneti- camente modificadas para serem auxotróficas. As células-tronco pluri- potentes auxotróficas projetadas podem ser administradas a um paci- ente junto com um fator auxotrófico. Após a conversão de uma célula- tronco pluripotente auxotrófica projetada em uma célula cancerosa, o fator auxotrófico pode ser removido, o que resulta na eliminação da célula cancerosa e da células-tronco pluripotente auxotrófica projeta- da.

[0070] Para evitar a rejeição imunológica das células modificadas quando administradas a um indivíduo, as células a serem modificadas são preferencialmente derivadas das próprias células do indivíduo. Desse modo, de preferência, as células de mamífero são do indivíduo a ser tratado com as células modificadas. Em alguns casos, as células de mamíferos são modificadas para serem células autólogas. Em al- guns casos, as células de mamíferos são ainda modificadas para se- rem células alogênicas. Em alguns casos, as células T modificadas podem ser ainda modificadas para serem alogênicas, por exemplo, pela inativação do local receptor de células T. Em alguns casos, as células modificadas podem ainda ser modificadas para serem alogêni- cas, por exemplo, excluindo B2M para remover MHC classe | na su- perfície da célula, ou excluindo B2M e, em seguida, adicionando de volta uma fusão HLA-G-B2M à superfície para evitar a rejeição de cé- lulas NK de células que não têm MHC Classe | em sua superfície.

[0071] As linhagens celulares podem incluir células-tronco que fo- ram mantidas e diferenciadas usando as técnicas abaixo, como mos- trado em U.S. 8.945.862, que está aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a célula-tronco não é uma célula-tronco embrionária humana. Além disso, as linhagens de células podem incluir células-tronco feitas pelas técnicas descritas em WO 2003/046141 ou Chung e outro (Cell Stem Cell, fevereiro de 2008, Vol. 2, páginas 113-117); cada um dos quais está aqui incorporado por re- ferência em sua totalidade.

[0072] Por exemplo, as células podem ser células-tronco isoladas do indivíduo para uso em um tratamento médico regenerativo em qualquer epitélio, cartilagem, osso, músculo liso, músculo estriado, epi- télio neural, epitélio escamoso estratificado e gânglios. Doenças que resultam da morte ou disfunção de um ou alguns tipos de células, co- mo doença de Parkinson e diabetes juvenil, são da mesma forma co- mumente tratadas usando células-tronco (Veja, Thomson e outro, Sci- ence, 282: 1145-1147, 1998, que está aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[0073] Em algumas modalidades, as células são colhidas do indi- víduo e modificadas de acordo com os métodos aqui descritos, que podem incluir selecionar certos tipos de células, opcionalmente expan- dir as células e opcionalmente cultivar as células, e que podem incluir adicionalmente a seleção de células que contêm o transgene integrado no local de indução de auxotrofia. B. Modelos de doador ou vetores para inserir o transgene

[0074] Em algumas modalidades, as composições descritas aqui compreendem modelos de doador ou vetores para inserir o transgene no local de indução de auxotrofia.

[0075] Em algumas modalidades, o modelo de doador compreen- de (a) uma ou mais sequências de nucleotídeos homólogas a um fra- gmento do local de indução de auxotrofia, ou homólogo ao comple- mento do referido local de indução de auxotrofia, e (b) um transgene que codifica um fator terapêutico, opcionalmente ligado a uma se- quência de controle de expressão. Por exemplo, após um sistema de nuclease ser usado para clivar o DNA, a introdução de um modelo de doador pode tirar vantagem dos mecanismos de reparo direcionados por homologia para inserir a sequência do transgene durante o reparo da quebra no DNA. Em alguns casos, o modelo de doador compreen- de uma região que é homóloga à sequência de nucleotídeos na região da quebra, de modo que o modelo de doador hibridiza com a região adjacente à quebra e é usado como um modelo para reparar a quebra.

[0076] Em algumas modalidades, o transgene é flanqueado em ambos os lados por sequências de nucleotídeos homólogas a um fra- gmento do local de indução de auxotrofia ou seu complemento.

[0077] Em alguns casos, o modelo de doador é de filamento único, filamento duplo, um plasmídeo ou um fragmento de DNA.

[0078] Em alguns casos, os plasmídeos compreendem elementos necessários para a replicação, incluindo um promotor e, opcionalmen- te, um 3' UTR.

[0079] Ainda descritos aqui são vetores que compreendem (a) uma ou mais sequências de nucleotídeos homólogas a um fragmento do local de indução de auxotrofia, ou homólogo ao complemento do referido local de indução de auxotrofia, e (b) um transgene que codifica um fator terapêutico.

[0080] O vetor pode ser um vetor viral, tal como um vetor retroviral, lentiviral (ambos os vetores lentivirais de integração competentes e defeituosos de integração), adenoviral, vírus adeno-associado ou her- pes simples. Os vetores virais podem compreender ainda genes ne- cessários para a replicação do vetor viral.

[0081] Em algumas modalidades, o construtor de alvejamento compreende: (1) uma estrutura de vetor viral, por exemplo, uma cadeia principal de AAV, para gerar vírus; (2) braços de homologia com o lo- cal alvo de pelo menos 200 bp, porém idealmente 400 bp em cada la- do para garantir altos níveis de alvejamento reproduzível para o local (veja Porteus, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol.

56: 163- 190 (2016); que está incorporado aqui por referência em sua totalidade); (3) um transgene que codifica um fator terapêutico e é ca- paz de expressar o fator terapêutico; (4) uma sequência de controle de expressão operacionalmente ligada ao transgene; e opcionalmente (5) um gene marcador adicional para permitir o enriquecimento e/ou moni- toramento do células hospedeiras modificadas.

[0082] Genes marcadores adequados são conhecidos na técnica e incluem Myc, HA, FLAG, GFP, NGFR truncado, EGFR truncado, CD20 truncado, CD19 truncado, bem como genes de resistência a antibióti- Cos.

[0083] Qualquer AAV conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, o sorotipo AAV primário é AAV6.

[0084] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o modelo de doador ou vetor compreende uma sequência de nucleotídeo homóloga a um fragmento do local de indução de auxotrofia, opcionalmente qualquer um dos genes na Tabela 1 abaixo, em que a sequência de nucleotídeos é de pelo menos 85, 88 , 90, 92, 95, 98 ou 99% idêntica a pelo menos 200, 250, 300, 350 ou 400 nucleotídeos consecutivos do local de indução de auxotrofia; até 400 nucleotídeos geralmente são suficientes para garantir uma recombinação precisa. Qualquer combi- nação dos parâmetros anteriores é considerada, por exemplo pelo menos 85% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 88% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos consecuti- vos, ou pelo menos 90% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos con- secutivos, ou pelo menos 92% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos , ou pelo menos 95% idêntica a pelo menos 200 nucleo- tídeos consecutivos, ou pelo menos 98% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 99% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 85% idêntica a pelo menos 250 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 88% idêntica a pelo menos 250 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 90% idên- tica a pelo menos 250 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 92% idêntica a pelo menos 250 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 95% idêntica a pelo menos 250 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 98% idêntica a pelo menos 250 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 99% idêntica a pelo menos 250 nucleotídeos consecuti- vos, ou pelo menos 85% idêntica a pelo menos 300 nucleotídeos con- secutivos , ou pelo menos 88% idêntica a pelo menos 300 nucleotí- deos consecutivos, ou pelo menos 90% idêntica a pelo menos 300 nu- cleotídeos consecutivos, ou pelo menos 92% idêntica a pelo menos 300 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 95% idêntica a pelo menos 300 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 98% idêntica a pelo menos 300 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 99% idên- tica a pelo menos 300 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 85% idêntica a pelo menos 350 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 88% idêntica a pelo menos 350 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 90% idênticas a pelo menos 350 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 92% idênticas a pelo menos 350 nucleotídeos consecuti- vos, ou pelo menos 95% idênticas a pelo menos 350 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 98% idênticas a pelo menos 350 nucleo- tídeos consecutivos, ou pelo menos 99% idêntica a pelo menos 350 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 85% idêntica a pelo menos 400 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 88% idêntica a pelo menos 400 nucleotídeos consecutivos tides, ou pelo menos 90% idên- tica a pelo menos 400 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 92% idêntica a pelo menos 400 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 95% idêntica a pelo menos 400 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 98% idêntica a pelo menos 400 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 99% idêntica a pelo menos 400 nucleotídeos consecuti- vos.

[0085] A descrição aqui da mesma forma contempla um sistema para direcionar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia compreendendo o referido modelo de doador ou vetor, uma proteína cas9 e um RNA guia.

[0086] A descrição aqui contempla ainda um sistema para direcio- nar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia compreendendo o referido modelo de doador ou vetor e uma meganu- clease específica para o referido local de indução de auxotrofia. A me- ganuclease pode ser, por exemplo, uma ZFN ou TALEN.

[0087] O construtor inserido pode da mesma forma incluir outras chaves de segurança, como um gene suicida padrão no local (por exemplo, iCasp9) em circunstâncias em que a remoção rápida de célu- las pode ser necessária devido à toxicidade aguda. A presente descri- ção fornece um interruptor de segurança robusto de modo que qual- quer célula projetada transplantada para um corpo possa ser eliminada pela remoção de um fator auxotrófico. Isso é especialmente importante se a célula modificada se transformou em uma célula cancerosa.

[0088] Em alguns casos, o polinucleotídeo doador ou vetor opcio- nalmente compreende ainda uma sequência de controle de expressão operacionalmente ligada ao referido transgene. Em algumas modali- dades, a sequência de controle de expressão é um promotor ou inten- sificador, um promotor induzível, um promotor constitutivo, um promo- tor específico de tecido ou sequência de controle de expressão, uma sequência reguladora pós-transcricional ou um microRNA. C. Sistemas de nuclease

[0089] Em algumas modalidades, as composições descritas aqui compreendem sistemas de nuclease direcionados ao local de indução de auxotrofia. Por exemplo, a presente descrição contempla (a) uma meganuclease que visa e cliva o DNA no referido local de indução de auxotrofia, ou (b) um polinucleotídeo que codifica a referida meganu-

clease, incluindo um sistema de vetor para expressar a referida me- ganuclease. Por exemplo, a meganuclease é um TALEN que é uma proteína de fusão compreendendo (i) um domínio de ligação de DNA Efetor semelhante a ativador de transcrição (TALE) que se liga ao lo- cal de indução de auxotrofia, em que a proteína de ligação de DNA TALE compreende uma pluralidade de unidades de repetição de TA- LE, cada unidade de repetição de TALE compreendendo uma sequên- cia de aminoácidos que se liga a um nucleotídeo em uma sequência alvo no local de indução de auxotrofia, e (ii) um domínio de clivagem de DNA.

[0090] Da mesma forma descritos aqui são sistemas de CRISPR/ Cas ou CRISPR/Cpf1 que tem como alvo e cliva DNA no referido local de indução de auxotrofia que compreende (a) um Cas (por exemplo, Cas9) ou polipeptídeo Cpf1 ou um ácido nucleico que codifica o referi- do polipeptídeo, e (b) um RNA guia que hibridiza especificamente com o referido local de indução de auxotrofia, ou um ácido nucleico que co- difica o referido RNA guia. Na natureza, o sistema Cas9 é composto por um polipeptídeo cas9, um crRNA e um crRNA transativador (tracrRNA). Quando aqui utilizado, "polipeptídeo cas9" refere-se a um polipeptídeo cas9 de ocorrência natural ou um polipeptídeo cas9 modi- ficado que retém a capacidade de clivar pelo menos um filamento de DNA. O polipeptídeo cas9 modificado pode, por exemplo, ser pelo me- nos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a um polipeptídeo Cas9 de ocorrência natural. Polipeptídeos Cas9 de diferentes espécies bacteri- anas podem ser usados; S. piogenes é comumente vendido comerci- almente. O polipeptídeo cas9 normalmente cria quebras de filamento duplo, porém pode ser convertido em uma nicase que cliva apenas um filamento único de DNA (ou seja, produz uma "quebra de filamento único") pela introdução de uma mutação de inativação no domínio HNH ou RuvC. Da mesma forma, o tracrRNA e crRNA de ocorrência natural podem ser modificados, desde que continuem a hibridizar e reter a capacidade de direcionar o DNA desejado e a capacidade de se ligar ao cas9. O RNA guia pode ser um RNA quimérico, no qual os dois RNAs são fundidos, por exemplo com uma alça artificial, ou o RNA guia pode compreender dois RNAs hibridizados. O sistema de meganuclease ou CRISPR/Cas ou CRISPR/Cpf1i pode produzir uma quebra de filamento duplo ou uma ou mais quebras de filamento único dentro do local de indução de auxotrofia, por exemplo, para produzir uma extremidade clivada que inclui uma saliência.

[0091] Em alguns casos, os sistemas de nuclease descritos aqui compreendem ainda um modelo de doador como descrito aqui.

[0092] Vários métodos são conhecidos na técnica para editar áci- do nucleico, por exemplo, para causar um nocaute de gene ou a ex- pressão de um gene a ser regulada negativamente. Por exemplo, vá- rios sistemas de nuclease, tais como nucleases de dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALEN), meganucleases ou combinações dos mesmos são conheci- das na técnica para serem usadas para editar ácido nucleico e podem ser usadas na presente descrição. As meganucleases são versões modificadas de enzimas de restrição de ocorrência natural que nor- malmente possuem sequências de reconhecimento de DNA estendi- das ou fundidas.

[0093] O sistema de CRISPR/Cas é detalhado, por exemplo, em WO 2013/176772, WO 2014/093635 e WO 2014/089290; cada um dos quais está incorporado aqui por referência em sua totalidade. A sua utilização em células T é sugerida no WO 2014/191518, que está in- corporada aqui por referência em sua totalidade. A engenharia CRISPR de células T é discutida em EP 3004349, que está incorpora- do aqui por referência em sua totalidade.

[0094] O fator de limitação de tempo para a geração de linhagens celulares mutantes (knock-out, knock-in ou gene substituído) foi a tria- gem e seleção de clones antes do desenvolvimento da plataforma CRISPR/Cas9. O termo "sistema de nuclease CRISPR/Cas9", quando aqui utilizado, refere-se a uma ferramenta de engenharia genética que inclui uma sequência de RNA guia (gRNA) com um sítio de ligação pa- ra Cas9 e uma sequência de alvejamento específica para a área a ser modificada. O Cas9 se liga ao gRNA para formar uma ribonucleoprote- na que se liga e cliva a área alvo. CRISPR/Cas9 permite a multiplexa- ção fácil de edições de múltiplos genes. Em algumas modalidades, o gRNA compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.

[0095] Além da plataforma CRISPR/Cas 9 (que é um sistema de CRISPR/Cas do tipo Il), existem sistemas alternativos, incluindo siste- mas de CRISPR/Cas do tipo |, sistemas de CRISPR/Cas do tipo Ill e sistemas de CRISPR/Cas do tipo V. Vários sistemas CRISPR/Cas9 foram descritos, incluindo Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9) e Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), para citar alguns. Alternativas ao sistema de Cas incluem Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1), Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1), e sistemas Lachnospi- raceae bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1). Qualquer um dos sistemas de CRISPR acima pode ser usado em métodos para gerar as linha- gens celulares descritas aqui. Por exemplo, o sistema de CRISPR usado pode ser o sistema de CRISPR/Cas9, tal como o sistema S. pyogenes CRISPR/Cas9. IV. Métodos de criação de células hospedeiras modificadas

[0096] Em algumas modalidades, o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene alvo selecionado daqueles descritos na Tabe- la 1, ou a região que controla a expressão desse gene. Em algumas modalidades, o gene alvo é selecionado de UMPS (criando uma linha- gem celular auxotrófica para uracila) e holocarboxilase sintetase (cri-

ando uma linhagem celular auxotrófica para biotina). Em algumas mo- dalidades, o fator auxotrófico é selecionado dentre biotina, alanina, as- partato, asparagina, glutamato, serina, uracila e colesterol.

[0097] Ainda descritos aqui são métodos de uso dos referidos sis- temas de nuclease para produzir as células hospedeiras modificadas aqui descritas, compreendendo a introdução na célula (a) os compo- nentes de um ou mais sistemas de nuclease que têm como alvo e cli- vam o DNA em um local de indução de auxotrofia, por exemplo me- ganuclease, como ZFN ou TALEN, ou nuclease CRISPR/Cas, como CRISPR/Cas9, e (b) um modelo de doador ou vetor como aqui des- crito. Cada componente pode ser introduzido na célula diretamente ou pode ser expresso na célula pela introdução de um ácido nucleico que codifica os componentes de um ou mais sistemas de nuclease. Os mé- todos podem da mesma forma compreender a introdução de um se- gundo sistema de nuclease, por exemplo uma segunda meganuclease ou segunda nuclease CRISPR/Cas que tem como alvo e cliva o DNA em um segundo local, ou um segundo RNA guia que tem como alvo o DNA em um segundo local, ou um ácido nucleico que codifica qual- quer um dos anteriores, e (b) um segundo doador modelo ou vetor. O segundo moldelo de doador ou vetor pode conter um transgene dife- rente, ou uma segunda cópia do mesmo transgene, que será então integrado no segundo local de acordo com tais métodos.

[0098] Tais métodos terão como alvo a integração do transgene que codifica o fator terapêutico para um local de indução de auxotrofia em uma célula hospedeira ex vivo.

[0099] Tais métodos podem compreender ainda (a) a introdução de um modelo de doador ou vetor na célula, opcionalmente após ex- pandir as referidas células, ou opcionalmente antes de expandir as re- feridas células, e (b) opcionalmente, a cultura da célula.

[00100] Em algumas modalidades, a descrição aqui contempla um método de produção de uma célula hospedeira de mamífero modifica- da compreendendo a introdução em uma célula de mamífero: (a) um polipeptídeo Cas9, ou um ácido nucleico que codifica o referido poli- peptídeo Cas9, (b) um RNA guia específico a um local de indução de auxotrofia, ou um ácido nucleico que codifica o referido RNA guia, e (c) um modelo de doador ou vetor como aqui descrito. Os métodos podem da mesma forma compreender a introdução de (a) um segundo RNA guia específico para um segundo local de indução de auxotrofia e (b) um segundo modelo de doador ou vetor. Em tais métodos, o RNA guia pode ser um RNA quimérico ou dois RNAs hibridizados.

[00101] Em qualquer um desses métodos, a nuclease pode produzir uma ou mais quebras de filamento único dentro do local de indução de auxotrofia, ou uma quebra de filamento duplo dentro do local de indu- ção de auxotrofia. Nestes métodos, o local de indução de auxotrofia é modificado por recombinação homóloga com o referido modelo de do- ador ou vetor para resultar na inserção do transgene no local.

[00102] Os métodos podem compreender ainda (c) selecionar célu- las que contêm o transgene integrado no local de indução de auxotro- fia. As etapas de seleção podem incluir (i) selecionar células que re- querem o fator auxotrófico para sobreviver e, opcionalmente, (ii) sele- cionar células que compreendem o transgene integrado no local de indução de auxotrofia.

[00103] Em algumas modalidades, o local de indução de auxotrofia é um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase e as células são selecionadas por contato com 5-FOA. O gene UMPS é necessário para metabolizar 5-FOA em 5-FUMP, que é tóxico para as células de- vido à sua incorporação em RNA/DNA. Desse modo, as células que têm uma interrupção no gene UMPS sobreviverão ao tratamento com 5-FOA. As células resultantes serão todas auxotróficas, embora nem todas as células possam conter o transgene. A seleção positiva sub-

sequente para o transgene irá isolar apenas células hospedeiras modi- ficadas que são auxotróficas e que também são capazes de expressar o transgene.

[00104] Em algumas modalidades, a descrição aqui fornece um mé- todo de criação de uma célula hospedeira humana modificada que compreende as etapas de: (a) obter uma mistura de células, (b) usar uma nuclease para introduzir um transgene no local de indução de au- xotrofia, por exemplo, eliminando ou regulando negativamente a ex- pressão de um gene, e (c) rastreio de auxotrofia, e (d) rastreio para a presença do transgene.

[00105] A etapa de avaliação pode ser realizada por cultura das cé- lulas com ou sem um dos fatores auxotróficos descritos na Tabela 1.

[00106] Técnicas para inserção de transgenes, incluindo grandes transgenes, capazes de expressar fatores funcionais, anticorpos e re- ceptores de superfície celular são conhecidas na técnica (Veja, por exemplo, Bak e Porteus, Cell Rep. 2017 Jul 18; 20 (3): 750 —756 (inte- gração de EGFR); Kanojia e outro, Stem Cells. 2015 Out; 33 (10): 2985-94 (expressão de anticorpo anti-Her2); Eyquem e outro, Nature. 2017 Mar 2; 543 (7643 ): 113-117 (integração específica do local de um CAR); O'Connell e outro, 2010 PLoS ONE 5 (8): e12009 (expres- são de IL-7 humana); Tuszynski e outro, Nat Med. 2005 maio; 11 (5): 551-5 (expressão de NGF em fibroblastos); Sessa e outro, Lancet. 30 de julho de 2016; 388 (10043): 476-87 (expressão de arilsulfatase À em terapia genética ex vivo para tratar MLD) ; Rocca e outro, Science Translational Medicine 25 Outubro de 2017: Vol. 9, Issue 413, eaaj2347 (expressão de frataxina); Bak e Porteus, Cell Reports, Vol. 20, Edição 3, 18 de julho de 2017, Páginas 750-756 (integrando gran- des cassetes de transgene em um local único), Dever e outro, Nature 17 de novembro de 2016: 539, 384-389 (adicionando tNGFR em célu- las-tronco hematopoiéticas (HSC) e HSPCs para selecionar e enrique-

cer para células modificadas); cada uma das quais está incorporada aqui por referência em sua totalidade. A. Local de indução de auxotrofia e fator auxotrófico

[00107] Em algumas modalidades, a interrupção de um único gene causa a auxotrofia desejada. Em modalidades alternativas, a interrup- ção de múltiplos genes produz a auxotrofia desejada.

[00108] Em algumas modalidades, o local de indução de auxotrofia é um gene que codifica uma proteína que produz um fator auxotrófico, que inclui proteínas a montante na trilha para a produção do fator au- xotrófico.

[00109] Em algumas modalidades aqui descritas, o local de indução de auxotrofia é o gene que codifica a uridina monofosfato sintetase (UMPS) (e o fator auxotrófico correspondente é uracila), ou o gene que codifica a holocarboxilase sintetase (e o fator auxotrófico correspon- dente é biotina). Em algumas modalidades, os locais de indução de auxotrofia são selecionados dos seguintes genes na Tabela 1. Os ge- nes da Tabela 1 foram agrupados selecionando genes de S. cerevisiae com um fenótipo anotado como "Auxotrofia" baixado com dados "Quí- micos" do banco de dados de ontologia de fenótipo de levedura no banco de dados do genoma de Saccharomyces (SGD) (Veja, Cherry e outro 2012, Nucleic Acids Res. 40: D700-D705, que está aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade). Esses genes foram convertidos em homólogos seres humanos usando o banco de dados YeastMine& ou, em modalidades alternativas, o banco de dados do genoma Sac- charocyces (SGD). Os genes são identificados por seu símbolo de ge- ne ENSEMBL e identificador de ENSG, que se encontram no banco de dados de ENSEMBL (www.ensembl.org). Os primeiros cinco zeros dos identificadores ENSG (por exemplo, ENSGO0000) foram removidos.

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[00110] CCBL1 pode da mesma forma ser referido como KYAT1. CCBL2 pode da mesma forma ser referido como KYAT3. DHFRL1 po- de da mesma forma ser referido como DHFR2. PYCRL pode da mes- ma forma ser referido como PYCR3. HRSP12 pode da mesma forma ser referido como RIDA.

[00111] O fator auxotrófico pode ser um ou dois ou mais nutrientes, enzimas, pH alterado, temperatura alterada, moléculas não orgânicas, aminoácidos não essenciais ou concentrações alteradas de uma fra- ção (em comparação com as concentrações fisiológicas normais) ou combinações dos mesmos. Todas as referências ao fator auxotrófico aqui contemplam a administração de múltiplos fatores. Qualquer fator é adequado, desde que não seja tóxico ao indivíduo e não esteja bio- disponível ou presente em uma concentração suficiente em um indiví- duo não tratado para sustentar o crescimento e a reprodução da célula hospedeira modificada.

[00112] Por exemplo, o fator auxotrófico pode ser um nutriente que é uma substância necessária para a proliferação ou que funciona co- mo um cofator no metabolismo da célula hospedeira modificada. Vá- rios fatores auxotróficos são descritos na Tabela 1. Em certas modali- dades, o fator auxotrófico é selecionado de biotina, alanina, aspartato, asparagina, glutamato, serina, uracila, valina e colesterol. A biotina, da mesma forma conhecida como vitamina B7, é necessária para o cresci- mento celular. Em alguns casos, a valina é necessária para a prolifera- ção e manutenção das células-tronco hematopoéticas. Em alguns casos, as composições descritas aqui são usadas para expressar as enzimas em HSCs que aliviam a necessidade de suplementação de valina e, des- se modo, dão a essas células uma vantagem seletiva quando a valina é removida da dieta em comparação com as células não modificadas. B. Transgene

[00113] As entidades terapêuticas codificadas pelo genoma da célu-

la hospedeira modificada podem causar efeitos terapêuticos, como o tráfego de moléculas, a indução da morte celular, o recrutamento de células adicionais ou o crescimento celular. Em algumas modalidades, o efeito terapêutico é a expressão de uma proteína terapêutica. Em algumas modalidades, o efeito terapêutico é a morte celular induzida, incluindo a morte celular de uma célula tumoral. C. Controle da expressão do transgene

[00114] Em alguns casos, o transgene está opcionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle de expressão, incluindo o promotor endógeno do gene ou promotores heterólogos constitutivos ou induzí- veis, intensificadores, promotores específicos de tecido ou sequências regulatórias pós-transcricionais. Por exemplo, pode-se usar promoto- res específicos de tecido (alvejamento transcricional) para conduzir a expressão do transgene ou pode-se incluir sequências regulatórias (sítios alvo de microRNA (miRNA)) no RNA para evitar a expressão em certos tecidos (alvejamento pós-transcricional). Em alguns casos, a sequência de controle de expressão funciona para expressar o trans- gene terapêutico seguindo o mesmo padrão de expressão que em in- divíduos normais (expressão fisiológica) (veja Toscano e outro, Gene Therapy (2011) 18, 117-127 (2011), aqui incorporado por referência em sua totalidade para suas referências a promotores e sequências regulatórias).

[00115] Os promotores constitutivos de mamíferos incluem, porém não são limitados aos promotores para os seguintes genes: hipoxanti- na fosforibosil transferase (HPTR), adenosina desaminase, piruvato quinase, promotor a-actina e outros promotores constitutivos. Promoto- res virais exemplares que funcionam constitutivamente em células eu- carióticas incluem, por exemplo, promotores do vírus símio, papiloma vírus, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovírus, as repetições terminais longas

(LTR) do vírus da leucemia de Moloney e outros retrovírus e o promo- tor da timidina quinase do vírus do herpes simples. Promotores comu- mente usados, incluindo o promotor/intensificador de CMV (citomegaloví- rus), EF1a (fator de alongamento 1a), SV40 (vírus símio 40), B-actina de galinha e CAG (CMV, B-actina de galinha, B-globina de coelho), Ubiquitina C e PGK, que fornecem expressão de gene de alto nível constitutivamente ativa na maioria dos tipos de células. Outros promo- tores constitutivos são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00116] Os promotores induzíveis são ativados na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor da metalotioneína é ativado para aumentar a transcrição e tradução na presença de certos íons de metal. Outros promotores indutíveis incluem promotores regulados por álcool, regulados por tetraciclina, regulados por esteroides, regulados por metais, regulados por nutrientes e promotores regulados por tem- peratura.

[00117] Para alvejamento específico do fígado: promotores e esti- muladores naturais e quiméricos foram incorporados em vetores virais e não virais para direcionar a expressão do fator Vlla, fator VIII ou fator IX para hepatócitos. Regiões promotoras de genes específicos do fi- gado, como albumina e antitripsina a1 humana (hAAT), são bons exemplos de promotores naturais. Alternativamente, promotores qui- méricos foram desenvolvidos para aumentar a especificidade e/ou a eficiência dos vetores. Bons exemplos são promotor/potenciador qui- mérico (ApoE) 4/hAAT, contendo quatro cópias de uma combinação de intensificador/promotor ApoE/hAAT específico do fígado e o promo- tor quimérico DC172, consistindo em uma cópia do promotor hAAT e duas cópias do realçador a(1)-microglobulina.

[00118] Parao alvejamento específico do músculo: promotores na- turais (promotor da creatina quinase-MCK, desmina) e promotores sin- téticos (promotor da cadeia pesada a-miosina/realçador-promotor MCK

(MHCK7)) foram incluídos em vetores virais e não virais para alcançar uma expressão muscular eficiente e específica.

[00119] Parao alvejamento específico do endotélio, os promotores naturais (vWF, FLT-1 e ICAM-2) e sintéticos têm sido usados para conduzir a expressão específica do endotélio.

[00120] Parao alvejamento de células mieloides, um promotor qui- mérico sintético que contém locais de ligação para proteínas da família de ligação de potenciadores de caixa CAAT de fatores de transcrição mieloide (C/EBPs) e PU.1, que são altamente expressos durante a di- ferenciação granulocítica, foi relatado dirigir expressão do transgene principalmente em células mieloides (Veja, Santilli e outro, Mol Ther. 2011 Jan; 19 (1): 122-32, que está aqui incorporado por referência em sua totalidade. CD68 pode da mesma forma ser usado para alveja- mento mieloide.

[00121] Exemplos de vetores específicos de tecido para terapia ge- nética de doenças genéticas são mostrados na Tabela 2.

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[00123] A expressão específica do tecido e/ou fisiologicamente re- gulada pode da mesma forma ser buscada pela modificação da estabi- lidade do mMRNA e/ou da eficiência da tradução (alvejamento pós- transcricional) dos transgenes. Alternativamente, a incorporação de sítios de reconhecimento de miRNA alvo (miRTs) no mMRNA expresso foi usada para recrutar o hospedeiro endógeno. Todo o mecanismo para bloquear a expressão do transgene (desalvejamento) em tecidos ou tipos de células específicos. miRNAs são RNAs não codificantes, aproximadamente 22 nucleotídeos, que são total ou parcialmente complementares à região 3' UTR de um mMRNA específico, referido como miRTs. A ligação de um miRNA a seus miRTs específicos pro- move a atenuação/inativação e/ou degradação translacional. A regula- ção da expressão através de miRNAs é descrita em Geisler e Fechner, World J Exp Med. 20 de maio de 2016, 6 (2): 37-54; Brown e Naldini, Nat Rev Genet. 10 de agosto de 2009 (8): 578-85; Gentner e Naldini, Tissue Antigens. Novembro de 2012, 80 (5): 393-403; cada um dos quais é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. À engenharia do vetor miRTs reconhecido por um tipo de célula de miR- NA específico mostrou ser uma forma eficaz para derrubar a expres- são de um gene terapêutico em tipos de células indesejáveis (Veja, Toscano e outro, Supra., Que está aqui incorporado por referência em sua totalidade). D. Composições farmacêuticas

[00124] —Descritos aqui, em algumas modalidades, são métodos, composições e kits para uso das células modificadas, incluindo com- posições farmacêuticas, métodos terapêuticos e métodos de adminis- tração de fatores auxotróficos para controlar - aumentar, diminuir ou cessar - o crescimento e a reprodução das células modificadas e para controlar a expressão do fator terapêutico pelo transgene.

[00125] A célula hospedeira de mamífero modificada pode ser ad-

ministrada ao indivíduo separadamente do fator auxotrófico ou em combinação com o fator auxotrófico. Embora as descrições das com- posições farmacêuticas fornecidas aqui sejam principalmente direcio- nadas a composições farmacêuticas que são adequadas para adminis- tração a seres humanos, será entendido pelo especialista na técnica que tais composições são geralmente adequadas para administração a quaisquer animais.

[00126] Os indivíduos para os quais a administração das composi- ções farmacêuticas está contemplada incluem, porém não estão limi- tadas a seres humanos e/ou outros primatas; mamíferos, incluindo mamíferos comercialmente relevantes, tais como gado, porcos, cavalos, ovelhas, gatos, cães, camundongos, ratos, pássaros, incluindo pássaros comercialmente relevantes, tais como aves, galinhas, patos, gansos e/ou perus. Em algumas modalidades, as composições são adminis- tradas a seres humanos, pacientes seres humanos ou sujeitos.

[00127] Em alguns casos, as composições farmacêuticas aqui des- critas são usadas em um método de tratamento de uma doença, um distúrbio ou uma condição em um indivíduo, o método incluindo: (i) ge- rar uma linhagem celular que é auxotrófica para um nutriente, uma en- zima, um pH alterado, uma temperatura alterada, uma concentração alterada de uma fração e/ou um ambiente de nicho, de modo que o nutriente, enzima, pH alterado, temperatura alterada e ambiente de nicho não estejam presentes no indivíduo; (ii) contatar o indivíduo com a linhagem celular auxotrófica resultante da etapa (i); (iii) contatar o indivíduo de (ii) com o fator auxotrófico que é selecionado a partir do nutriente, enzima, fração que altera o pH e/ou temperatura e um ambi- ente de nicho celular no indivíduo, de modo que o fator auxotrófico ati- ve o sistema auxotrófico ou elemento que resulta no crescimento da linhagem celular e/ou na expressão de uma ou mais entidades tera- pêuticas ao indivíduo.

[00128] As composições farmacêuticas da descrição aqui podem da mesma forma ser utilizadas em um método de tratamento de uma do- ença, um distúrbio ou uma condição em um indivíduo, compreendendo (a) administrar ao indivíduo uma célula hospedeira modificada de acordo com a descrição aqui, e (b) administrar o fator auxotrófico ao indivíduo em uma quantidade suficiente para promover o crescimento da célula hospedeira modificada.

[00129] As composições compreendendo um fator auxotrófico de nutriente podem da mesma forma ser usadas para administração a um humano compreendendo uma célula hospedeira modificada da descri- ção aqui. V. Formulações A. Formulações de Engenharia Celular

[00130] A célula hospedeira modificada é geneticamente modificada para inserir o transgene que codifica o fator terapêutico no local de in- dução de auxotrofia. A liberação de complexos de proteína Cas9/ribo- nucleoproteína gRNA (Cas9 RNPs) direcionados ao locus desejado pode ser realizada por transfecção mediada por lipossoma, eletropora- ção ou localização nuclear. Em algumas modalidades, a célula hospe- deira modificada está em contato com um meio contendo soro após eletroporação. Em algumas modalidades, a célula hospedeira modifi- cada está em contato com um meio contendo soro reduzido ou não contendo soro após eletroporação. B. Formulações Terapêuticas

[00131] A célula hospedeira modificada ou fator auxotrófico da des- crição aqui pode ser formulado usando um ou mais excipientes para: (1) aumentar a estabilidade; (2) alterar a biodistribuição (por exemplo, direcionar a linhagem celular para tecidos ou tipos de células especiífi- cos); (3) alterar o perfil de liberação de um fator terapêutico codificado; e/ou (4) melhorar a absorção do fator auxotrófico.

[00132] As formulações da presente descrição podem incluir, sem limitação, solução salina, lipossomas, nanopartículas lipídicas, políme- ros, peptídeos, proteínas, e suas combinações.

[00133] As formulações das composições farmacêuticas aqui des- critas podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou a se- guir desenvolvido na técnica da farmacologia. Quando aqui utilizado, o termo "composição farmacêutica" refere-se a composições incluindo pelo menos um ingrediente ativo e, opcionalmente, um ou mais excipi- entes farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas da presente descrição podem ser estéreis.

[00134] Em geral, tais métodos preparatórios incluem a etapa de associar o ingrediente ativo a um excipiente e/ou um ou mais outros ingredientes acessórios. Quando aqui utilizado, a frase "ingrediente ativo" geralmente se refere a (a) uma célula hospedeira modificada ou modelo de doador incluindo um transgene capaz de expressar um fa- tor terapêutico inserido em um local de indução de auxotrofia, ou (b) o fator auxotrófico correspondente, ou (c) o sistema de nuclease para direcionar a clivagem dentro do local de indução de auxotrofia.

[00135] As formulações da célula hospedeira modificada ou o fator auxotrófico e composições farmacêuticas aqui descritas podem ser preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica.

[00136] Uma composição farmacêutica de acordo com a presente descrição pode ser preparada, embalada e/ou vendida a granel, como uma dose unitária única e/ou como uma pluralidade de doses unitárias únicas. Quando aqui utilizado, uma "dose unitária" refere-se a uma quantidade discreta da composição farmacêutica, incluindo uma quan- tidade predeterminada do ingrediente ativo.

[00137] As quantidades relativas do ingrediente ativo (por exemplo, a célula hospedeira modificada ou fator auxotrófico), um excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica de acordo com a presente descri- ção podem variar, dependendo da identidade, tamanho, e/ou condição do indivíduo a ser tratado e ainda dependendo da trilha pela qual a composição deve ser administrada. Por exemplo, a composição pode incluir entre 0,1% e 99% (p/p) do ingrediente ativo. A título de exemplo, a composição pode incluir entre 0,1% e 100%, por exemplo, entre 0,5 e 50%, entre 1-30%, entre 5-80%, ou pelo menos 80% (p/p) de ingre- diente ativo. C. Excipientes e diluentes

[00138] Em algumas modalidades, um excipiente farmaceuticamen- te aceitável pode ser pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% puro. Em algumas modalidades, um excipiente é aprovado para uso em seres humanos e para uso veterinário. Em algumas modalidades, um excipiente pode ser aprovado pela United States Food and Drug Administration. Em algumas modalidades, um excipiente pode ser de grau farmacêutico. Em algumas modalidades, um excipiente pode atender aos padrões da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), da Farmacopeia Europeia (EP), da Farmacopeia Britânica e/ou da Farmacopeia Internacional.

[00139] Excipientes, quando aqui utilizados, incluem, porém não são limitados a qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, diluentes ou outros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou sus- pensão, agentes tensoativos, agentes isotônicos, espessantes ou emulsificantes, conservantes e similar, como adequado para a forma de dosagem particular desejada. Vários excipientes para formular composições farmacêuticas e técnicas para preparar a composição são conhecidos na técnica (veja Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21º Edição, AR Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; incorporado aqui por referência em sua totalida- de). O uso de um meio de excipiente convencional pode ser contem-

plado dentro do escopo da presente descrição, exceto na medida em que qualquer meio de excipiente convencional possa ser incompatível com uma substância ou seus derivados, como para produzir qualquer efeito biológico indesejável ou de outra forma interagir de maneira deletéria com qualquer outro componente (s) da composição farmacêutica.

[00140] Exemplos de diluentes incluem, porém não são limitados a carbonato de cálcio, carbonato de sódio, fosfato de cálcio, fosfato di- cálcico, sulfato de cálcio, hidrogenofosfato de cálcio, fosfato de sódio, lactose, sacarose, celulose, celulose microcristalina, caulino, manitol, sorbitol, inositol, cloreto de sódio, amido seco, amido de milho, açúcar em pó, etc., e/ou combinações dos mesmos. D. Ingredientes inativos

[00141] Em algumas modalidades, as formulações podem incluir pelo menos um ingrediente inativo. Quando aqui utilizado, o termo "in- grediente inativo" refere-se a um ou mais agentes que não contribuem para a atividade do ingrediente ativo da composição farmacêutica in- cluída nas formulações. Em algumas modalidades, todos, nenhum ou alguns dos ingredientes inativos que podem ser usados nas formula- ções da presente descrição podem ser aprovados pela U.S. Food and Drug Administration (FDA). E. Sais farmaceuticamente aceitáveis

[00142] O fator auxotrófico pode ser administrado como um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo. Quando aqui utilizado, "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a derivados dos compostos descritos, de modo que o composto parental é modificado pela con- versão de um ácido ou fração de base existente em sua forma de sal (por exemplo, pela reação do grupo de base livre com um ácido orgâà- nico adequado). Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não são limitados a sais de ácidos minerais ou orgâni- cos de resíduos básicos, tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos, tais como ácidos carboxílicos; e similar. Sais de adição de ácido representativos incluem acetato, ácido acético, adipa- to, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, ácido benzeno sulfônico, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforossul- fonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecil sulfato, etanossulfonato, fumarato , glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexa- noato, bromidrato, cloridrato, iodidrato, 2-hidroxi-etanossulfonato, lac- tobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxa- lato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfa- to, picrato, pivalato, propionato, estearato, sucinato, sulfato, tartarato, tiocianato, toluenossulfonato, undecanoato, sais de valerato e similar. Sais representativos de metais alcalinos ou alcalino terrosos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similar, bem como amônio não tóxico, amônio quaternário e cátions de amina, incluindo, porém, não limitado a amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamina, dime- tilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina e similar. Os sais farma- ceuticamente aceitáveis da presente descrição incluem os sais não tóxicos convencionais do composto original formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos.

VI. Dosagem e Administração

[00143] As células hospedeiras modificadas ou fatores auxotróficos da presente descrição incluídos nas composições farmacêuticas des- critas acima podem ser administradas por qualquer trilha de liberação, liberação sistêmica ou liberação local, o que resulta em um resultado terapeuticamente eficaz. Estas incluem, porém não são limitadas a en- teral (no intestino), gastroenteral, epidural (na dura-máter), oral (pela boca), transdérmico, intracerebral (no cérebro), intracerebroventricular (nos ventrículos cerebrais)), epicutânea (aplicação na pele), intradér- mica (na própria pele), subcutânea (sob a pele), administração nasal

(através do nariz), intravenosa (em uma veia), bolo intravenoso, gote- jamento intravenoso, intra-arterial ( em uma artéria), intramuscular (em um músculo), intracardíaca (no coração), infusão intraóssea (na medu- la óssea), intratecal (no canal espinhal), intraparenquimatosa (no teci- do cerebral), intraperitoneal (infusão ou injeção no peritônio), infusão intravesical, intravítrea, (através do olho), injeção intracavernosa (em uma cavidade patológica), intracavitária (na base do pênis), adminis- tração intravaginal, intrauterina, administração extra-amniótica, trans- dérmica (difusão através da pele intacta para distribuição sistêmica), transmucosal (difusão através de uma membrana mucosa), transvagi- nal, insuflação (cheirar), sublingual, sublabial, enema, colírio (na con- juntiva), ou em colírios, auricular (na ou por meio da orelha), bucal (di- recionada para a bochecha), conjuntival, cutânea, dentária (para um dente ou dentes), eletro-osmose, endocervical, endossinusial, endo- traqueal, extracorpórea, hemodiálise, infiltração, intersticial, intra-abdo- minal, intra-amniótica, intra-articular, intrabiliar, intrabrônquica, intra- bursal, intracartilaginosa (dentro de uma cartilagem), intracaudal (den- tro da cauda equina), intracisternal (dentro da cisterna magna cerebe- lomedular), intracorneal (dentro da córnea), dentária intracornal, intra- coronária(dentro das artérias coronárias), intracorpórep cavernoso (dentro dos espaços dilatáveis do corpo cavernoso do pênis), intradis- cal (dentro de um disco), intraductal (dentro de um ducto de uma glân- dula), intraduodenal (dentro do duodeno), intra dural (dentro ou abaixo da dura), intraepidérmica (para a epiderme), intraesofágica (para o esôfago), intragástrica (dentro do estômago), intragengival (dentro da gengiva), intraileal (dentro da porção distal do intestino delgado), intra- lesional (dentro ou introduzido diretamente em uma lesão localizada), intraluminal (dentro de um lúmen de um tubo), intralinfático (dentro da linfa), intramedular (dentro da cavidade medular de um osso), intrame- níngea (dentro das meninges), intramiocárdica (dentro da miocárdio),

intraocular (dentro do olho), intra-ovário (dentro do ovário), intraperi- cárdica (dentro do pericárdio), intrapleural (dentro da pleura), intrapros- tática (dentro da próstata), intrapulmonar (dentro dos pulmões ou brônquios), intrasinal (dentro dos seios nasais ou periorbital), intraes- pinhal (dentro da coluna vertebral), intrassinovial (dentro da cavidade sinovial de uma articulação), intratendínea (dentro de um tendão), in- tratesticular (dentro do testículo), intratecal (dentro do líquido cefalor- raquidiano em qualquer nível do eixo cerebroespinhal), intratorácico (dentro do tórax), intratubular (dentro dos túbulos de um órgão), intra- tumoral (dentro de um tumor), intratimpânico (dentro do áuro médio ), intravascular (dentro de um vaso ou vasos), intraventricular (dentro de um ventrículo), iontoforese (por meio de corrente elétrica onde íons de sais solúveis migram para os tecidos do corpo), irrigação (para banhar ou limpar feridas abertas ou cavidades corporais ), laríngea (direta- mente sobre a laringe), nasogástrica (através do nariz e no estômago), técnica de curativo oclusivo (administração por trilha tópica que é em seguida revestida por um curativo que oclui a área), oftálmica (para o olho externo), orofaríngea (diretamente para a boca e faringe), paren- teral, percutânea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, retal, respiratório (dentro do trato respiratório por inalação oral ou nasal para efeito local ou sistêmico), retrobulbar (atrás da ponte ou atrás do globo ocular), tecido mole, subaracnoide, subconjuntival, submucosa, tópica, transplacentária (através ou através da placenta), transtraqueal (atra- vés da parede da traquéia), transtimpânica (através ou através da ca- vidade timpânica) , ureteral (para o ureter), uretral (para a uretra), va- ginal, bloqueio caudal, diagnóstico, bloqueio de nervo, perfusão biliar, perfusão cardíaca, fotoférese e espinhal.

A. Administração parenteral e injetável

[00144] Em algumas modalidades, as células hospedeiras modifi- cadas podem ser administradas por trilha parenteral.

[00145] As preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquo- sas ou oleaginosas injetáveis estéreis podem ser formuladas de acor- do com a técnica conhecida usando agentes dispersantes, agentes umectantes e/ou agentes de suspensão adequados. As preparações injetáveis estéreis podem ser soluções, suspensões e/ou emulsões injetáveis estéreis em diluentes e/ou solventes não tóxicos parenteri- camente aceitáveis, por exemplo, como uma solução em 1,3- butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotôni- ca de cloreto de sódio. Óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este pro- pósito, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos, como o ácido oleico, po- dem ser usados na preparação de injetáveis.

[00146] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção bacteriana e/ou pela incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água es- téril ou outro meio injetável estéril antes usar.

[00147] Afim de prolongar o efeito dos ingredientes ativos, muitas vezes é desejável retardar a absorção dos ingredientes ativos de inje- ções subcutâneas ou intramusculares. Isso pode ser realizado pelo uso de suspensões líquidas de material cristalino ou amorfo com baixa solubilidade em água. A taxa de absorção dos ingredientes ativos de- pende da taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do ta- manho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção atrasada de uma forma de fármaco parenteralmente administrada é realizada pela dissolução ou suspensão do fármaco em um veículo oleoso. As formas de depósito injetáveis são feitas formando-se matri- zes microencapsuladas do fármaco em polímeros biodegradáveis, tais como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da proporção de fárma- co para polímero e da natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação do fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli (ortoésteres) e poli (anidridos). As formulações injetáveis de depósito são preparadas capturando-se o fármaco em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos corporais. B. Administração de depósito

[00148] “Quando aqui descrito, em algumas modalidades, as com- posições farmacêuticas incluindo a célula hospedeira modificada da presente descrição são formuladas em depósitos para liberação pro- longada. Geralmente, órgãos ou tecidos específicos ("tecidos alvo") são direcionados para administração. Em algumas modalidades, a li- beração localizada é afetada por meio da utilização de um dispositivo biocompatível. Por exemplo, o dispositivo biocompatível pode restringir a difusão da linhagem celular no indivíduo.

[00149] Em alguns aspectos da descrição aqui, as composições farmacêuticas, incluindo a célula hospedeira modificada da presente descrição, são retidas espacialmente dentro ou proximal aos tecidos alvo. São fornecidos métodos de fornecimento de composições farma- cêuticas, incluindo a célula hospedeira modificada ou o fator auxotrófi- co, para tecidos alvo de mamíferos por contato de tecidos alvo (que incluem uma ou mais células alvo) com composições farmacêuticas incluindo a célula hospedeira modificada ou o fator auxotrófico, sob condições tais que são substancialmente retidos nos tecidos alvo, o que significa que pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ou mais do que 99,99% da composição é retida nos tecidos alvo. Por exemplo, pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 290%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99% ou mais do que 99,99% das composições farma-

cêuticas, incluindo a célula hospedeira modificada ou o fator auxotrófi- co administrado a indivíduos, estão presentes em um período de tem- po após a administração.

[00150] Certos aspectos da presente descrição são direcionados a métodos de fornecimento de composições farmacêuticas incluindo a célula hospedeira modificada ou o fator auxotrófico da presente des- crição para tecidos alvo de mamíferos, por contato de tecidos alvo com composições farmacêuticas incluindo a célula hospedeira modificada sob condições tais que são substancialmente retidos em tais tecidos alvo. As composições farmacêuticas incluindo a célula hospedeira mo- dificada incluem ingrediente ativo suficiente para que o efeito de inte- resse seja produzido em pelo menos uma célula alvo. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas que incluem a célula hospedeira modificada geralmente incluem um ou mais agentes de penetração celular, embora formulações "nuas" (tais como sem agen- tes de penetração celular ou outros agentes) da mesma forma sejam contempladas, com ou sem excipientes farmaceuticamente aceitáveis. C. Métodos terapêuticos

[00151] A presente descrição adicionalmente fornece um método de liberação a um indivíduo, incluindo um indivíduo mamífero, qualquer uma das células hospedeiras modificadas descritas acima ou fatores auxotróficos, incluindo como parte de uma composição ou formulação farmacêutica. D. Dose e regime

[00152] A presente descrição fornece métodos de administração de células hospedeiras modificadas ou fatores auxotróficos de acordo com a descrição a um indivíduo em necessidade. As composições farmacêuticas, incluindo a célula hospedeira modificada ou o fator au- xotrófico, e as composições da presente descrição podem ser adminis- tradas a um indivíduo usando qualquer quantidade e qualquer trilha de administração eficaz para prevenir, tratar, administrar ou diagnosticar doenças, distúrbios e/ou condições. A quantidade exata necessária irá variar de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade e condição geral do indivíduo, a gravidade da doença, a composição particular, seu modo de administração, seu modo de atividade e simi- lar. O indivíduo pode ser um humano, um mamífero ou um animal. O nível de dose de diagnóstico específico terapeuticamente eficaz, profi- laticamente eficaz ou apropriado para qualquer indivíduo particular de- penderá de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio a ser trata- do e a gravidade do distúrbio; a atividade da carga útil específica em- pregada; a composição específica empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, a trilha de administração e a taxa de excreção do fator auxotrófico; a du- ração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coinciden- tes com a célula hospedeira modificada específica ou fator auxotrófico empregado; e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[00153] Em certas modalidades, a célula hospedeira modificada ou as composições farmacêuticas de fator auxotrófico de acordo com a presente descrição podem ser administradas em níveis de dosagem suficientes para liberação de cerca de 0,0001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 0,005 mg/Kg, de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,5 mg/kg, de cer- ca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, ou de cerca de 1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, do peso corporal do indivíduo por dia, uma ou mais vezes ao dia, para obter o efeito te- rapêutico, diagnóstico ou profilático desejado.

[00154] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas de células hospedeiras modificadas ou de fator auxotrófico de acordo com a presente descrição podem ser administradas em cerca de 10 a cerca de 600 ul/sítio, 50 a cerca de 500 ul/sítio, 100 a cerca de 400 ul/sítio, 120 a cerca de 300 ul/sítio, 140 a cerca de 200 yul/sítio, cerca de 160 ul/sítio. Como exemplos não limitantes, a célula hospedeira modificada ou fator auxotrófico pode ser administrado a 50 ul/sítio e/ou 150 ul/sítio.

[00155] A dosagem desejada da célula hospedeira modificada ou fator auxotrófico da presente descrição pode ser liberada apenas uma vez, três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas ou a cada quatro semanas. Em certas modalidades, a dosagem desejada pode ser liberada usando múltiplas administrações (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, on- ze, doze, treze, quatorze ou mais administrações).

[00156] A dosagem desejada das células hospedeiras modificadas da presente descrição pode ser administrada uma vez ou várias vezes. O fator auxotrófico é administrado regularmente com uma frequência definida durante um período de tempo, ou continuamente normalmente como um "fluxo contínuo". Uma dose diária total, uma quantidade dada ou prescrita em um período de 24 horas, pode ser administrada por qualquer um desses métodos ou como uma combinação desses mé- todos.

[00157] Em algumas modalidades, a liberação da célula hospedeira modificada ou fator auxotrófico da presente descrição a um indivíduo fornece um efeito terapêutico por pelo menos 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais de 10 anos.

[00158] As células hospedeiras modificadas podem ser usadas em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, profiláticos, de pesquisa ou de diagnóstico, ou procedimentos médicos, sequencial ou simultaneamente. Em geral, cada agente será administrado em uma dose e/ou em um cronograma determinado para esse agente. Em algumas modalidades, a presente descrição abrange a liberação de composições farmacêuticas, profiláticas, de pesquisa ou de diagnósti- co em combinação com agentes que podem melhorar sua biodisponi- bilidade, reduzir e/ou modificar seu metabolismo, inibir sua excreção e/ou modificar sua distribuição dentro do corpo.

[00159] Por exemplo, a célula hospedeira modificada ou fator auxo- trófico é administrado como um dispositivo biocompatível que restringe a difusão no indivíduo para aumentar a biodisponibilidade na área alvo para o tratamento. A célula hospedeira modificada ou fator auxotrófico pode da mesma forma ser administrado por distribuição local.

[00160] A descrição aqui contempla métodos de expressão de um fator terapêutico em um indivíduo que compreende (a) administrar as referidas células modificadas, (b) opcionalmente administrar um regi- me de condicionamento para permitir o enxerto de células modificadas e (c) administrar o referido fator auxotrófico.

[00161] O termo "regime de condicionamento" refere-se a um curso de terapia que um paciente é submetido antes do transplante de célu- las-tronco. Por exemplo, antes do transplante de células-tronco hema- topoéticas, um paciente pode ser submetido a terapia mieloablativa, terapia não mieloablativa ou condicionamento de intensidade reduzida para evitar a rejeição do transplante de células-tronco, mesmo se a célula-tronco for originada do mesmo paciente. O regime de condicio- namento pode envolver a administração de agentes citotóxicos. O re- gime de condicionamento pode da mesma forma incluir imunossupres-

são, anticorpos e irradiação.

Outros possíveis regimentos de condicio- namento incluem condicionamento mediado por anticorpos (veja, por exemplo, Czechowicz e outro, 318 (5854) Science 1296-9 (2007); Pal- chaudari e outro, 34 (7) Nature Biotechnology 738-745 (2016); Chha- bra e outro ., 10: 8 (351) Science Translational Medicine 351ra105 (2016)) e condicionamento mediado por CAR-T (veja, por exemplo, Arai e outro, 26 (5) Molecular Therapy 1181-1197 (2018); cada um dos quais está incorporado aqui por referência em sua totalidade). O con- dicionamento necessita ser usado para criar espaço no cérebro para a microglia derivada de HSCs projetadas para migrar para liberação a proteína de interesse (testes recentes de terapia genética para ALD e MLD). O regime de condicionamento é da mesma forma projetado pa- ra criar um "espaço" de nicho para permitir que as células transplanta- das tenham um lugar no corpo para enxertar e proliferar.

No transplan- te de células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, o regime de condi- cionamento cria um espaço de nicho na medula óssea para o enxerto das células-tronco hematopoiéticas transplantadas.

Sem um regime de condicionamento, as células-tronco hematopoéticas transplantadas não podem ser enxertadas.

Em algumas modalidades, as linhagens celulares são células T que são geneticamente modificadas para se- rem auxotróficas.

As células T auxotróficas manipuladas podem ser usadas como células T CAR para atuar como um fármaco vivo e ad- ministradas a um paciente junto com um fator auxotrófico para condi- cionar o paciente a um transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Antes da liberação das células-tronco hematopoéticas do doador, o fator auxotrófico pode ser removido, o que resulta na eliminação das células T auxotróficas manipuladas.

Em algumas modalidades, as |i- nhagens celulares são células T alogênicas que são geneticamente modificadas para serem auxotróficas.

Células T alogênicas auxotrófi- cas projetadas podem ser administradas a um paciente junto com um fator auxotrófico para fornecer um efeito terapêutico. Após o paciente desenvolver doença do enxerto versus hospedeiro (GvHD), o fator au- xotrófico pode ser removido, o que resulta na eliminação das células T alogênicas auxotróficas projetadas que se tornaram alorreativas.

[00162] Em algumas modalidades, a administração do referido fator auxotrófico é continuada regularmente por um período de tempo sufi- ciente para expressar o fator terapêutico e, de preferência, por um pe- ríodo de tempo suficiente para que o fator terapêutico exerça um efeito terapêutico. Em algumas modalidades, a administração do referido fa- tor auxotrófico é diminuída para diminuir a expressão do fator terapêu- tico. Em algumas modalidades, a administração do referido fator auxo- trófico é aumentada para aumentar a expressão do agente terapêutico fator. Em algumas modalidades, a administração do referido fator au- xotrófico é descontinuada para criar condições que resultam na inibi- ção do crescimento ou morte das células modificadas. Em algumas modalidades, a administração do referido fator auxotrófico é tempora- riamente interrompida para criar condições que resultam na inibição do crescimento das células modificadas.

[00163] A descrição aqui da mesma forma contempla um método de tratamento de um indivíduo com uma doença, um distúrbio ou uma condição compreendendo administrar ao indivíduo de (a) as referidas células hospedeiras de mamífero modificadas e (b) o referido fator au- xotrófico em uma quantidade suficiente para produzir expressão de uma quantidade terapêutica do fator terapêutico.

[00164] O uso de uma célula hospedeira de mamífero modificada de acordo com a presente descrição para o tratamento de uma doen- ça, distúrbio ou condição está da mesma forma abrangido pela descri- ção.

[00165] Certas modalidades fornecem a doença, o distúrbio ou a condição selecionada a partir do grupo que consiste em câncer, doen-

ça de Parkinson, doença do enxerto versus hospedeiro (GvHD), condi- ções autoimunes, distúrbio ou condição hiperproliferativa, transforma- ção maligna, doenças hepáticas, condições genéticas incluindo defei- tos genéticos hereditários, diabetes melito juvenil e condições do com- partimento ocular.

[00166] Em certas modalidades, a doença, o distúrbio ou a condi- ção afeta pelo menos um sistema do corpo selecionado a partir do grupo que consiste nos sistemas muscular, esquelético, circulatório, nervoso, linfático, respiratório endócrino, digestivo, excretor e reprodu- tivo. Condições que afetam mais de um tipo de célula no indivíduo po- dem ser tratadas com mais de uma célula hospedeira modificada com cada linhagem celular ativada por um fator auxotrófico diferente. Em alguns casos, um indivíduo pode receber mais de um fator auxotrófico.

[00167] Certas modalidades fornecem a linhagem celular como re- generativa. Em um aspecto da presente descrição, o indivíduo pode ser contatado com mais de uma célula hospedeira modificada e/ou com um ou mais fatores auxotróficos. Certas modalidades fornecem liberação localizada do fator auxotrófico, por exemplo nutriente ou a enzima. Modalidades alternativas fornecem liberação sistêmica. Por exemplo, a liberação localizada é afetada através da utilização de um dispositivo biocompatível. Em um aspecto da presente descrição, o dispositivo biocompatível pode restringir a difusão da linhagem celular no indivíduo. Certas modalidades do método fornecem a remoção do fator auxotrófico para esgotar os efeitos terapêuticos da célula hospe- deira modificada no indivíduo ou para induzir a morte celular na célula hospedeira modificada. Certas modalidades do método fornecem os efeitos terapêuticos como incluindo pelo menos um selecionado a par- tir do grupo que consiste em: tráfico de moléculas, indução da morte celular, morte celular e recrutamento de células adicionais. Certas mo- dalidades do método prevêem que as células hospedeiras não modifi-

cadas são derivadas do mesmo indivíduo antes do tratamento do indi- víduo com as células hospedeiras modificadas.

[00168] A presente descrição contempla kits que compreendem tais composições ou componentes de tais composições, opcionalmente com um recipiente ou frasconete. VII. Definições

[00169] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x signi- fica, por exemplo, x + 10%.

[00170] O termo "ingrediente ativo" geralmente se refere ao ingredi- ente em uma composição que está envolvida no exercício de um efeito terapêutico. Quando aqui utilizado, geralmente se refere a (a) a célula hospedeira modificada ou modelo de doador incluindo um transgene como aqui descrito, (b) o fator auxotrófico correspondente como aqui descrito, ou (c) o sistema de nuclease para direcionar a clivagem den- tro da auxotrofia local de indução.

[00171] O termo "concentração alterada", quando aqui utilizado, re- fere-se a um aumento na concentração de um fator auxotrófico em comparação com a concentração do fator auxotrófico no indivíduo an- tes da administração das composições farmacêuticas aqui descritas.

[00172] O termo "pH alterado", quando aqui utilizado, refere-se a uma mudança no pH induzida em um indivíduo em comparação com o pH no indivíduo antes da administração da composição farmacêutica aqui descrita.

[00173] Otermo "temperatura alterada", quando aqui utilizado, refe- re-se a uma mudança na temperatura induzida em um indivíduo em comparação com a temperatura no indivíduo antes da administração da composição farmacêutica como aqui descrito.

[00174] O termo "auxotrofia" ou "auxotrófico", quando aqui utilizado, refere-se a uma condição de uma célula que requer a administração exógena de um fator auxotrófico para sustentar o crescimento e a re-

produção da célula.

[00175] O termo "local de indução de auxotrofia", quando aqui utili- zado, refere-se a uma região de um cromossomo em uma célula que, quando interrompida, faz com que a célula seja auxotrófica. Por exem- plo, uma célula pode ser tornada auxotrófica pela interrupção de um gene que codifica uma enzima envolvida na síntese, reciclagem ou salvamento de um fator auxotrófico (diretamente ou a montante atra- vés da síntese de intermediários usados para fazer o fator auxotrófico), ou interrompendo um controle de expressão sequência que regula a expressão do gene.

[00176] O termo "biodisponibilidade", quando aqui utilizado, refere- se à disponibilidade sistêmica de uma determinada quantidade da cé- lula hospedeira modificada ou fator auxotrófico administrado a um indi- víduo.

[00177] Otermo"Cas9", quando aqui utilizado, refere-se à proteína 9 associada a CRISPR, que é uma endonuclease para uso na edição do genoma.

[00178] O termo "compreendendo" significa "incluindo", bem como "consistindo", por exemplo uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[00179] O termo "regime de condicionamento" refere-se a um curso de terapia que um paciente é submetido antes do transplante de célu- las-tronco.

[00180] O termo "fluxo contínuo", quando aqui utilizado, refere-se a uma dose de terapêutica administrada continuamente por um período de tempo em uma única rotina/ponto único de contato, ou seja, evento de administração contínua.

[00181] O termo "CRISPR", quando aqui utilizado, refere-se a repe- tições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas de DNA que implantam uma enzima que corta os nucleotídeos de RNA de uma célula invasora.

[00182] O termo "sistema de nuclease CRISPR/Cas9", quando aqui utilizado, refere-se a uma ferramenta de engenharia genética que in- clui uma sequência de RNA guia (gRNA) com um local de ligação para Cas9 e uma sequência de alvejamento específica para o local a ser clivado no DNA alvo. O Cas9 se liga ao gRNA para formar um comple- xo de ribonucleoproteína que se liga e cliva o local alvo.

[00183] O termo "expansão", quando usado no contexto de células, refere-se a aumentar o número de células por meio da geração de progênie.

[00184] O termo "sequência de controle de expressão" refere-se a uma sequência de nucleotídeos capaz de regular ou controlar a ex- pressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse. Os exemplos incluem um promotor, potenciador, sítio de ligação do fator de transcri- ção, sítio de ligação miRNA.

[00185] O termo "recombinação homóloga" (HR) refere-se à inser- ção de uma sequência de nucleotídeos durante o reparo de quebras no DNA por meio de mecanismos de reparo direcionados por homolo- gia. Este processo usa uma molécula "doadora" ou "modelo de doa- dor" com homologia à sequência de nucleotídeos na região da quebra como um modelo para reparar a quebra. A sequência de nucleotídeos inserida pode ser uma mudança de base única no genoma ou a inser- ção de uma ampla sequência de DNA.

[00186] O termo "homólogo" ou "homologia", quando usado no con- texto de duas ou mais sequências de nucleotídeos, refere-se a um grau de emparelhamento de base ou hibridização que é suficiente para ligar especificamente as duas sequências de nucleotídeos juntas em uma célula sob condições fisiológicas. A homologia pode da mesma forma ser descrita calculando a porcentagem de nucleótidos que sofre-

ria emparelhamento de bases Watson-Crick com a sequência com- plementar, por exemplo pelo menos 70% de identidade, de preferência pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade superior sobre um determinado número de bases. No que diz respeito aos modelos de doadores, por exemplo, a homologia pode ser superior a 200-400 bases. No que diz respeito às sequências guia, por exemplo, a homologia pode ser superior a 15- bases.

[00187] O termo "operativamente ligado" refere-se à ligação funcio- nal entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, intensificador, sequência de sinal ou matriz de sítios de ligação de fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que o controle de expressão sequência afeta a transcrição e/ou tradução da segunda sequência de ácido nucleico.

[00188] O termo "composição farmacêutica", quando aqui utilizado, refere-se a uma composição incluindo pelo menos um ingrediente ati- vo e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente acei- táveis.

[00189] O termo "sal farmaceuticamente aceitável", quando aqui utilizado, refere-se a derivados dos compostos descritos, de modo que o composto parental seja modificado pela conversão de um ácido exis- tente ou fração de base em sua forma de sal (por exemplo, pela rea- ção do grupo de base livre com um ácido orgânico adequado). Todas as referências aqui a compostos ou componentes incluem o seu sal farmaceuticamente aceitável.

[00190] O termo "regenerativo", quando aqui utilizado, refere-se à renovação ou restauração de um órgão ou sistema do indivíduo.

[00191] O termo "fator terapêutico" se refere a um produto codifica- do pelo transgene inserido que trata e/ou alivia os sintomas da doen- ça, distúrbio ou condição do indivíduo.

[00192] O termo "quantidade terapêutica" refere-se a uma quanti- dade de fator terapêutico suficiente para exercer um "efeito terapêuti- co", o que significa um alívio ou melhoria dos sintomas da doença, dis- túrbio ou condição.

[00193] O termo "dose unitária", quando aqui utilizado, refere-se a uma quantidade discreta da composição farmacêutica, incluindo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo.

EXEMPLOS Exemplo 1. Métodos de cultura de células T gerais

[00194] Células K562 (adquiridas da ATCC) e células Nalm6 (gen- tilmente fornecidas por C. Mackall) foram cultivadas em RPMI 1640 (HyClone) suplementadas com 10% de soro de crescimento bovino, 2mM de L-glutamina e 100 U/ml de Penicilina e 100 U/ml de Estrepto- micina. As células T foram usadas frescas após o isolamento das ca- madas leucocitárias obtidas de doadores saudáveis. As células T fo- ram isoladas através de uma centrifugação em gradiente de densidade Ficoll seguida por enriquecimento magnético usando Pan T Cell Isola- tion Kit (Miltenyi Biotec).

[00195] As células foram criopreservadas em meio de BAMBAN- KER Tv, Após o descongelamento, as células foram cultivadas a 37ºC, 5% de CO>2 em X-Vivo 15 (Lonza) suplementadas com ou sem 5% de soro humano (Sigma-Aldrich) e 100 IL-2 recombinante humano (Pe- protech) e 10 ng/ml de IL-7 humano recombinante (BD Biosciences). UMP ou uridina foi adicionado a 250 pg/ml. 5-FOA foi adicionado a 100 pg/ml a 1 mg/ml. Durante a cultura, o meio foi atualizado a cada 2 dias.

[00196] As células T foram ativadas usando anti-CD3 imobilizado (clone OKT3, Tonbo Biosciences) e anti-CD28 solúvel (clone CD28.2, Tonbo Biosciences) por três dias antes da eletroporação.

[00197] 1,4 milhões de células T ativadas foram ressuspensas em solução de eletroporação, misturadas com o RNP pré-complexado e eletroporadas usando um sistema 4D-NUCLEOFECTOR'" (Lonza) usando o programa EO-115. O RNP consistia em proteína Cas9 (sis- tema AIt-RO& CRISPR/Cas9 baseado em S. pyogenes, IDT) a 300 pg/ml e saRNA usando uma relação molar saRNA: Cas9 de 2,5.

[00198] O DNA genômico foi coletado usando QUICKEXTRACTTY DNA Extraction Kit (Epicentro). As células foram contadas em um con- tador de células automatizado usando coloração com azul Tripano ou em um citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter) com leitora de placa automático usando esferas COUNTBRIGHT'Y (ThermoFisher) como referência para normalizar os valores. Alternativamente, as célu- las foram analisadas após o manchamento com anticorpos rotulados com fluorocromo (Biolegend) em um citômetro de fluxo ACCURITY C6 (BD Biosciences), que da mesma forma mede volumes, ou um classifi- cador de células FACS ARIA'Y Il SORP (BD Biosciences). Os dados foram analisados nos softwares Excel (Microsoft) e FlowJo (Tree Star).

[00199] O sequenciamento de Sanger do local de UMPS foi realiza- do usando UMPS-O-1 e UMPS-O-2, com a região amplificada usando PHUSIONTY Hot Start Flex 2x Master Mix (New England Biolabs, Inc.). Traços de sequenciamento Sanger foram analisados por análise de TIDE (veja Brinkman e outro, 2014, Nucleic Acids Res. 42 (22): e168), que está incorporado aqui por referência em sua totalidade) para iden- tificar inserções e deleções (InDels) após a edição. A quantificação InDel foi realizada nas sequências usando a ferramenta online TIDE (www.deskgen.com/landing/tide.html) (Veja, M. Sadelain, N. Engl. J. Med. 365, 1735-7 (2011), que está aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[00200] Sequências de gRNA (incluindo motifs adjacentes de proto- espaçador, da mesma forma referido como PAMs): UMPS-7

GCC CCG CAG AUC GAU GUA GAG UUU UAG AGC UAG AAA UAG

CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U (SEQ ID NO: 1)

[00201] —Oligonucleotídeos de sequenciamento para análise de TIDE do local de UMPS: UMPS-O-1: COCGGGGAAACCCACGGGTGC (SEQ ID NO: 2) UMPS-O-2: AGGGTCGGTCTGCCTGCTTGGCT (SEQ ID NO: 3)

[00202] Após a triagem inicial, saRNA "UMPS-7", que mostrou a maior frequência de InDels foi escolhido para análise posterior, Exemplo 2. Edição de UMPS por eletroporação de Cas9-sgRNA em células T humanas

[00203] As células T foram descongeladas e cultivadas, seguido por ativação e eletroporação subsequente com Cas9-UMPS-7 sagRNA RNP como descrito acima. Após a eletroporação, as células foram permitidas a se recuperar em meio com ou sem soro, 5-FOA ou uma fonte de uracila exógena (FIG. 1A). A sobrevivência celular após a ele- troporação foi acentuadamente aumentada quando o soro foi incluído no meio (FIG. 1B) e, portanto, um período de recuperação de quatro dias no meio com soro, uridina e UMP foi realizado em todas as expe- riências subsequentes. As contagens de células pós-eletroporação são mostradas na Tabela 4.

Tabela 4. Contagens de células veta esuesinediss (absaivto) — Exemplo 3. Crescimento de uma população editada por UMPS mista e manutenção de mutações de UMPS

[00204] As células T foram eletroporadas e editadas como no

Exemplo 2 e permitidas se recuperar por um período de 4 dias em meio com soro, uridina e UMP. No dia 4, as células foram transferidas para UMP, uridina ou meio de origem de uracila. Esta experiência não apresentou uma etapa de seleção e, portanto, a população de células resultante era uma mistura heterogênea de células do tipo silvestre (WT), mutantes heterozigotos e mutantes homozigotos. O crescimento de células mutantes UMPS homozigóticas foi observado ser depen- dente de uma fonte de uracila exógena - uma vez que deve ser auxo- trófica (FIG. 2A). Quando UMPS é direcionado, observou-se que InDels foi gerado em cerca de 50% das células (como testado pela análise de TIDE (Veja, Brinkman e outro, 2014, Nucleic Acids Res. 42 (22): e168), que está aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[00205] Quando a fonte de uracila exógena foi removida, a frequên- cia de InDel na população foi reduzida após três dias de crescimento (Dia 7 = quatro dias de recuperação e três dias em meio de teste). Isto foi consistente com o modelo que mostra que quaisquer células homo- zigóticas mutantes UMPS auxotróficas seriam superadas na popula- ção por mutantes heterozigóticos não auxotróficos e células WT ainda apresentam após edição - resultando em uma frequência de InDel aparente reduzida (veja, FIG. 2B). As porcentagens de alelos com In- Dels são mostradas na Tabela 5. Tabela 5. Alelos com InDels

[00206] O crescimento ideal da população editada por UMPS hete- rogênea foi observado ser dependente da presença de uma fonte exó- gena de uracila (FIG. 2C-FIG. 2F). A percentagem de alelos com um frameshift InDel é mostrada na FIG. 2C, e os valores são mostrados na Tabela 6. Tabela 6. Alelos com frameshift InDels [| | Porcentagem de alelos (sem 5-FOA)

[00207] FIG.2D compara os números absolutos previstos de célu- las no dia 8 contendo alelos identificados por TIDE. Os valores são mostrados na Tabela 7.

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Exemplo 4. O tratamento com 5-FOA seleciona para células dire- cionadas a UMPS

[00212] 5-FOA seleciona para células auxotróficas de uracila em outros organismos (por exemplo, Boeke e outro 1984, Mol. Gen. Ge- net. 197 (2): 345-6), que está aqui incorporado por referência em sua totalidade). Para investigar a utilidade potencial de 5-FOA para a sele- ção de auxotróficos de uracila entre células humanas, o gene UMPS foi direcionado em células T humanas por eletroporação de complexo Cas9-gRNA seguido por recuperação (como mostrado no Exemplo 2) seguido por um ensaio de resistência ao tratamento com 5-FOA (FIG. 3A). As células foram cultivadas em 5-FOA e uma variedade de com- binações de fontes de soro e uracila por 4 dias antes da contagem de células ser realizada.

[00213] A Tabela 10 compara as contagens de células para popula- ções de células cultivadas com ou sem soro. Tabela 10. Contagens de células Número médio de células por unidade de volume [Condição de cultura TSubstratos — [simulado — [UMPST |

[00214] O soro, embora seja importante para a recuperação de cé- lulas pós eletroporação, não teve efeito sobre a viabilidade das células em 5-FOA (FIG. 3B). As contagens de células para amostras adicionais cultivadas em 5-FOA sem soro são mostradas na FIG. 3C e Tabela 11. Tabela 11. Contagens de células [Lo Média de células por unidade de volume | substratos | Simulado | uUeso 2477090 56200,26 Sem UMP/Uridina 12279,07 52156,98 5305249 ITS? Sem UMP/Uridina 16467,39 67438,73

[00215] Uridina e UMP melhoraram a sobrevivência de células tra- tadas com simulação e direcionadas para UMPS em 5-FOA em com- paração com o controle. Isso é provavelmente através de um meca- nismo baseado em competição (a uridina pode reverter a toxicidade do 5-fluorouracila em seres humanos (veja, van Groeningen e outro 1992, Semin. Oncol. 19 (2 Suplemento 3): 148-54, que está aqui incorporado por referência em sua totalidade)) (FIG. 3B e FIG. 3C). Em todos os casos, as células alvo UMPS exibiram sobrevivência aumentada em comparação com células alvo simuladas. Esses dados indicam que 5- FOA pode ser usado para a seleção de células auxotróficas para uraci- la em cultura de células humanas. Exemplo 5. Células alvo UMPS selecionadas com 5-FOA exibem auxotrofia para uracila

[00216] Para avaliar se as células selecionadas para o tratamento com 5-FOA eram ou não auxotróficos de uracila, células T direciona- das a simulação ou UMPS foram expostas a 5-FOA como mostrado no Exemplo 4. Após 4 dias de seleção de 5-FOA, a população de células foi dividida em um meio contendo uracila (UMP, uridina ou ambos) e um meio deficiente em uracila. Um ensaio de crescimento foi subse- quentemente realizado por contagem de célula após 4 dias de incuba- ção em meio de teste (Dia 8) (FIG. 4A). Em todos os casos, o cresci- mento celular nas culturas de células alvo simuladas foi desprezível e independente da suplementação da fonte de uracila - indicando morte bem-sucedida de células alvo não UMPS durante a etapa de seleção 5-FOA (FIG. 4B-FIG. 4D). Na população alvo de UMPS, em todas as condições o crescimento celular foi estimulado pela adição de uracila e um crescimento celular pobre foi observado na sua ausência (FIG. 4B- FIG. 4D).

[00217] FIG.4B compara as contagens de células em cultura no

Dia 8 para amostras sem soro. Os valores são mostrados na Tabela

12. Tabela 12. Contagens de células no dia 8 a | EFA | mr [Repreação =| 1 [2 [a [a 1 |] 2 (3 | a)

[00218] FIG.4C compara as contagens de células em culturas su- plementadas com UMP e sem soro. Os valores são mostrados na Ta- bela 13. Tabela 13. Contagens de células no dia 8 [Sem eU o Renee [ataãos [Raçãos [Resçãos

[00219] FIG.4D compara as contagens de células em culturas su- plementadas com uridina e sem soro. Os valores são mostrados na Tabela 14. Tabela 14. Contagens de células no dia 8 [Sem Bridi Jetema CO sor Ros raiar rasos

[00220] Empregados em conjunto, os resultados dos Exemplos 1-5 indicam que a edição do local de UMPS por Cas9 em células T huma- nas gera células que são dependentes de uma fonte de uracila exóge- na para o crescimento celular ideal. Estes resultados demonstram que a auxotrofia humana projetada pode ser usada como um mecanismo para controlar a proliferação de células T ou alguma outra terapia celu- lar. Além disso, a seleção de 5-FOA de células editadas UMPS forne- ce um mecanismo útil para a seleção de uma verdadeira população auxotrófica de células T.

Exemplo 6. Cultivo de células-tronco

[00221] Afim de avaliar outro tipo de célula com potencial relevân- cia terapêutica, UMPS foi projetado em células pluripotentes humanas. As células hospedeiras modificadas que são o assunto da descrição aqui podem incluir células-tronco que foram mantidas e diferenciadas usando as técnicas abaixo, como mostrado na U.S. 8.945.862, que está aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[00222] HESCs indiferenciados (linha H9 de WICELLO, passagens a 45) foram cultivados em uma camada alimentadora de fibroblasto embrionário de camundongo inativado (MEF) (Stem Cells, 2007. 25 (2): p. 392-401, que está aqui incorporado por referência em sua tota- lidade). Resumidamente, a célula foi mantida em um estágio indiferen- ciado em camadas alimentadoras de MEF de passagem baixa irradia- das em placas revestidas com gelatina a 0,1%. O meio foi mudado dia- riamente. O meio consiste em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)/F-12, 20% de substituição de soro nocaute, 0,1 mM de ami- noácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de B- mercaptoetanol e 4 ng/ml de rhnFGF-2 (R&D Systems Inc., Minneapo- lis). As hESCs indiferenciadas foram tratadas com 1 mg/ml de colage- nase tipo IV em DMEM/F12 e raspadas mecanicamente no dia da passagem. Antes da diferenciação, hESCs foram semeados na mistu- ra de proteína MATRIGELO (Corning, Inc.) - placas revestidas em meio condicionado (CM) preparado a partir de MEF como segue (Nat Biotechnol, 2001. 19 (10): p. 971-4, que está aqui incorporado por refe- rência em sua totalidade). As células de MEF foram colhidas e irradia- das com 50 Gy e foram cultivadas com meio de hES sem fator de crescimento de fibroblastos básico (DFGF). CM foi coletado diariamen- te e suplementado com um adicional de 4 ng/ml de bFGF antes de alimentar as células CTeh.

Exemplo 7. Diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias humanas (ESC)-células endoteliais (ECs)

[00223] Para induzir a diferenciação de hESC, hESCs indiferencia- dos foram cultivados em meio de diferenciação contendo meio de Dul- becco modificado de Iscove (IMDM) e 15% de soro fetal bovino defini- do (FBS) (Hyclone, Logan, Utah), 0,1 mM de aminoácidos não essen- ciais, 2 MM de L-glutamina, 450 uM de monotioglicerol (Sigma, St. Louis, Mo.), 50 U/ml de penicilina e 50 ug/ml de estreptomicina, em placas de fixação ultrabaixa para a formação de corpos embrioides suspensos (EBs), como prevoamente descrito (veja Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99 (7): p. 4391-6 e Stem Cells, 2007. 25 (2): p. 392-401; cada um dos quais está aqui incorporado por referência em sua totali- dade). Resumidamente, hESCs cultivados em placa de mistura de pro- teína MATRIGELO (Corning, Inc.) revestida com meio condicionado foram tratados por 2 mg/ml de dispase (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) por minutos em 37ºC para soltar as colônias. As colônias foram em se- guida raspadas e transferidas para placas de fixação ultrabaixa (Cor- ning Incorporated, Corning, N.Y.) para a formação do corpo embrioide. Exemplo 8. Seleção de células hospedeiras auxotróficas modifi- cadas

[00224] O localde UMPS foi interrompido nos hESCs por eletropo- ração de Cas9 RNP e seleção de um clone com InDels no exon 1, co- mo avaliado por amplificação e sequenciamento de Sanger do local genômico. Para edição de genes, hESCs foram tratados com inibidor de ROCK de 10 um (Y-27632) por 24 horas antes da eletroporação. As células em 70-80% de confluência foram colhidas com solução de ACCUTASEPO (Life Technologies). 500,000 células foram usadas por reação com uma concentração de SpCas9 de 150 ug/mL (Integrated DNA Technologies) e uma relação molar de Cas9:sgRNA de 1:3 e ele- troporação realizada em solução de célula primária P3 (Lonza) em ti-

ras de NUCLEOCUVETTE'Y em 16 cavidades no sistema NUCLEO- FECTOR 4D (Lonza). Imediatamente após a eletroporação, as células foram transferidas para uma cavidade de uma mistura de proteína MATRIGELO (Corning, Inc.) - placa de 24 cavidades revestida conten- do 500 ul de meio de mTeSR'"Y (STEMCELL Technologies) com 10 UM de Y-27632. O meio foi trocado 24 horas após a edição e Y-27632 foi removido 48 horas após.

[00225] O sequenciamento de Sanger comparado a população de hESC antes da edição, a população em massa após a eletroporação de RNP e o genótipo do clone selecionado. Os resultados mostraram uma deleção de 10 bp em torno da região alvo do sgRNA. A falta de um traço de sequência nesta região indicava que ambos os alelos fo- ram modificados.

[00226] Um ensaio de auxotrofia foi realizado ao longo de quatro dias com diferentes concentrações de uridina. Fotos microscópicas de cavidades foram tiradas no dia 4 após a semeadura de hESCs UMPS- KOIKO em densidades similares e cultura na presença de diferentes concentrações de uridina. As fotos mostraram que as células prolifera- ram na presença de 2,5-250 pg/ml, porém não mostraram proliferação sem adição de uridina. A quantificação de células viáveis no dia 4 após a semeadura para avaliar o efeito de diferentes concentrações de uri- dina é mostrada na Tabela 15. Tabela 15. Contagens de células viáveis usem — Repleaçõo 1 Replicação? | Reprcçãos | er a e lg

[00227] Curvas de eliminação com diferentes concentrações de su- plemento versus controle foram geradas para demonstrar que uma versão fornecida exogenamente do produto do gene eliminado resgata o fenótipo auxotrófico da linhagem celular.

[00228] Para avaliar a resistência a 5-FOA, os hESCs UMPS-KO foram geneticamente modificados para expressar GFP a partir de um cassete de expressão integrado em um local seguro para facilitar a identificação em co-cultura com células UMPS-WT.

[00229] Um clone que mostrou expressão brilhante e estável de GFP foi selecionado. Estes UMPSKO'Kº hESCs foram misturados com células UMPSWTWT que não expressavam GFP e seguidos por análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) na pre- sença de diferentes concentrações de 5-FOA. A Tabela 16 fornece contagens de células GFP+ e GFP- viáveis após a cultura com diferen- tes concentrações de 5-FOA. Tabela 16. Contagens de células viáveis o dem

[00230] Similar aos tipos de células anteriores, o enriquecimento para células GFP+ ao longo do tempo foi observado. 54,8% das célu- las eram GFP+ no grupo sem 5-FOA e 95,0% das células eram GFP+ nos grupos com 5-FOA. Neste tipo de célula, as células UMPS-WT foram sensíveis a todas as concentrações testadas de 5-FOA, e as células UMPS-KO toleraram bem a concentração de 0,25 ug/ml, en- quanto exibiam proliferação prejudicada em concentrações mais altas, como mostrado na Tabela 16.

[00231] Em conclusão, estes resultados confirmam que uma trilha principal do metabolismo pode ser projetada de forma eficiente para criar auxotrofia em uma variedade de células humanas de linhagens celulares de leucemia a linhagens celulares pluripotentes e células imunes primárias. O alvejamento de genes de ambos os alelos de UMPS pode ser usado para criar e purificar uma população de células com homozigoto nocaute ou enriquecer essas células usando 5-FOA. Linhagens celulares com nocautes e mutações múltiplas podem da mesma forma ser geradas para fornecer engenharia e seleção de ge- noma multiplexado rápido (por exemplo, 5 mutações auxotróficas e 5 antibióticos). Exemplo 9. Análise in vivo

[00232] As linhagens de células nocaute auxotróficas validadas in vitro podem da mesma forma ser analisadas in vivo. Estas linhagens celulares são restringidas pela toxicidade e biodisponibilidade do fator auxotrófico em seres humanos. As linhagens de células de gene no- caute são projetadas a partir de células T humanas ou de qualquer ou- tro linfócito. O crescimento condicional in vitro pela linhagem celular é demonstrado na presença do fator auxotrófico, e não na ausência do fator auxotrófico. As células hospedeiras de mamífero modificadas confirmadas como auxotróficas para o fator e capazes de expressar o transgene podem ser administradas em um modelo de camundongo. Apenas os camundongos que consomem o suplemento de fator auxo- trófico sustentam o crescimento de linfócitos seres humanos. Além disso, o crescimento celular para in vivo após a remoção do nutriente da fonte alimentar do camundongo. Exemplo 10. Criação de auxotrofia em células humanas por meio de engenharia genética

[00233] Ferramentas de bioinformática (crispor.tefor.net) foram usadas para identificar possíveis sítios alvo de saRNA no exon 1 do gene UMPS para spCas9. Os efeitos putativos fora do alvo (OT) foram previstos usando COSMID (crispr.bme.gatech.edu/) (Veja, Majzner e outro Cancer Cell. 31, 476-485 (2017), que está incorporado aqui por referência em sua totalidade). Potenciais sítios fora do alvo no genoma humano (hg38) foram identificados usando o programa de bioinformá- tica baseado na web COSMID (crispr.bme.gatech.edu) com até 3 in- compatibilidades ou exclusão/inserção de 1 bp com 1 incompatibilida- de permitida nas bases proximais PAM 19. Os sgRNAs foram classifi- cados pelo número de sítios fora do alvo altamente similar (pontuação COSMID <1) e, em seguida, classificados pelo número de sítios OT com pontuações mais altas. Os iniciadores para amplificar todos os sites foram da mesma forma desenvolvidos pelo programa COSMID. Todos os sítios foram amplificados por PCR específico de local, com código de barras por meio de uma segunda rodada de PCR, agrupa- dos em quantidades equimolares e sequenciados usando um lllumina MiSeq usando 250pb de leituras de extremidades emparelhadas como descrito anteriormente em Porteus, M. Mol. Ther. 19, 439-441 (2011), que está incorporado aqui por referência em sua totalidade. Os dados resultantes foram analisados usando o texto personalizado indelQuan- tificationFromFastaPaired-1.0.1.pl (10) (https://github.com/piyuranjan/ NucleaselndelActivityScript/blob/master/indelQuantificationFromFastq Paired-1.0.1.pl).

[00234] Os 3 sgRNAs com o menor número de sítios OT foram identificados e usados para uma triagem in vitro de atividade. Esses SARNAs são mostrados na Tabela 17.

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Tabela 18. Iniciadores Mer em a

[00236] A quantificação InDel foi realizada nas sequências usando a interferência de edições de CRISPR (ICE) e ferramentas online ICE- D (ice.synthego.com) (FIG. 5A). Os resultados são mostrados na Ta- bela 19. Tabela 19. Quantificação InDel [1 emma esaraAA

[00237] —sgRNA "UMPS-7" foi escolhido para outras experiências. Este sgaRNA levou à criação de uma alta proporção de deleções gran- des (maiores que 30 bp) que foram detectáveis por inferência de edi- ções CRISPR - discordância (ICE-D), porém não por análise conven- cional de ICE ou TIDE (www.deskgen.com/landing /tide.html).

[00238] Para avaliar se o UMPS nocaute leva à proliferação celular diferencial se cultivado sem a adição de uridina ou monofosfato de uri- dina (UMP), as contagens de células em cultura foram seguidas ao longo do tempo por contagem automática de células com manchamen- to azul de tripano. O UMPS nocaute levou a contagens de células mais baixas a partir do dia 2 após a eletroporação, em comparação com as células que foram simuladas eletroporadas ou eletroporadas usando Cas9 tendo como alvo um local genômico diferente (isto é, CCR5) (FIG. 5B). As contagens de células são mostradas na Tabela 20.

Tabela 20. Quantificação InDel CCR5 nocaute, sem | UMPS nocaute, sem Simulado, sem metabólitos metabólitos metabólitos jo 500000 500000 500000 967000 835000 808000 2350000 2290000 1590000 3440000 3420000 2510000 i6 4150000 3900000 2210000 EN 3710000 3910000 2550000

[00239] Em contraste, a proliferação celular não foi prejudicada após UMPS nocaute se UMP ou Uridina foram suplementados em al- tas concentrações (250 pg/ml cada) (FIG. 5C). O número de células viáveis por ml é mostrado na Tabela 21. Tabela 21. Número de células viáveis por ml UMPS nocaute, com | UMPS — nocaute, UMPS nocaute, sem metabólitos | UMP com Uridina jo | 500000 500000 500000 808000 874000 769000 1590000 1860000 1590000 2510000 3470000 3430000 6 | 2210000 3880000 3790000 i8 | 2550000 3630000 3170000

[00240] Para confirmar os resultados no nível genômico, o DNA ge- nômico foi colhido no final do experimento e os InDels foram quantifi- cados (FIG. 5D-FIG. 5E). FIG. 5D compara a frequência de InDels em diferentes condições de cultura para células não expostas a 5-FOA. As porcentagens são mostradas na Tabela 22. Tabela 22. Porcentagens da frequência de InDel total Condição de cultura Percentual (%)

[00241] FIG.5E compara a frequência de frameshift InDels em dife- rentes condições de cultura para células não expostas a 5-FOA. As porcentagens são mostradas na Tabela 23. Tabela 23. Porcentagens de frequência frameshift InDel

[00242] A frequência geral de InDel foi ligeiramente reduzida após cultura sem uridina ou UMP, porém ao quantificar InDels que levaria a um frameshift (não múltiplos de + 3/-3), houve uma redução de InDels na população de células sem a adição de metabólito. Isso confirma que as células com UMPS nocaute devido a um frameshift InDel no exon 1 têm uma desvantagem na sobrevivência e proliferação em comparação com células UMPS tipo silvestre ou células com InDel no exon 1 que preservou o quadro de leitura.

[00243] Em seguida, os construtores de alvejamento de gene foram gerados que permitem a integração de 2 marcadores diferentes no lo- cal de UMPS, desse modo interrompendo a expressão do gene e per- mitindo a identificação das células com nocaute do gene bi-alélico através da co-expressão de tEGFR e tNGFR (FIG. 6A), usando a abor- dagem descrita em Bak e outro, Elife 28:6 (2017), que está aqui incor- porada por referência em sua totalidade. Os construtores foram clona- dos por montagem de Gibson usando métodos de biologia molecular padrão com um esqueleto de plasmídeo que é flanqueado pelas repe- tições terminais invertidas de AAV2 (ITRs).

[00244] Para o alvejamento de células-tronco e células humanas primárias, os construtores foram empacotados em vírus adeno- associado recombinante tipo 6 (rAAV6) para liberar o DNA após a cri- ação da quebra de filamento duplo, desse modo estimulando a recom-

binação homóloga para integrar os transgenes. Os plasmídeos de transferência para a produção de rAAV6 foram criados clonando o transgene e os braços circundantes homólogos à região genômica di- recionada na estrutura do plasmídeo pAAV-MCS (Agilent Technologi- es) adjacente às repetições terminais invertidas flanqueadoras (ITR) por montagem Gibson (NEBUILDERGO HiFi DNA Assembly Master Mix, New England Biolabs Inc.). Os braços de homologia foram amplifica- dos por PCR a partir de DNA genômico de doador saudável. Para a expressão dos marcadores de superfície, usamos o tNnNGFR e o teéEGFR (veja Teixeira e outro Curr. Opin. Biotechnol. 55, 87-94 (2019); Chen e outro Sci. Transl. Med. 3 (2011); cada um dos quais está aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade). Para a terminação da transcri- ção, foi usada a sequência de poliadenilação do hormônio de cresci- mento bovino (bGH).

[00245] A produção de AAV foi realizada em células HEK293T por cotransfecção do plasmídeo de transferência com o plasmídeo de em- pacotamento de pdgm6 e purificado por centrifugação em gradiente de iodixanol. As células HEK293 foram co-transfectadas com polietilenoi- mina com o plasmídeo auxiliar pPDGM6 e o respectivo plasmídeo de transferência transportando o transgene entre os braços de homologia flanqueados pelos ITRs de AAV2. Após 48 horas, as células foram destacadas, separadas do sobrenadante e lisadas. A suspensão foi tratada com Benzonase (Sigma Aldrich) e os resíduos sedimentados. O extrato de AAV bruto foi purificado em um gradiente de densidade de iodixanol e depois submetido a 2 ciclos de diálise contra PBS e um ciclo contra PBS com 5% de sorbitol em 1 x 10º de peso molecular de corte (MWCO) SLIDE-A-LYZER'TY G2 Dialysis Cassettes (Thermo Fis- her Scientific). O título AAV foi determinado por extração de DNA ge- nômico pelo QUICKEXTRACT 'T“ DNA Extraction Kit (Epicentro) e me- dição da concentração absoluta de números de cópias de ITR por

PCR digital de gotículas (Bio-rad) de acordo com o protocolo do fabri- cante usando conjuntos de iniciador e sonda relatados anteriormente ( Veja, Jaén e outro, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 6, 1-7 (2017, que está aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[00246] O alvejamento com essas construções de doadores usados como plasmídeos foi testado pela primeira vez na linhagem celular de leucemia mieloide K562 (ATCCO CCL-243TY). As células foram eletro- poradas com 2 ug de cada plasmídeo em um sistema SF Cell Line 4D NUCLEOFECTOR 'Y (Lonza) seguindo o protocolo do fabricante. Ao alvejar os 2 marcadores para o local de UMPS, foi identificada uma população de células pequena, porém estável, que mostrou co- expressão de ambos os marcadores (FIG. 6B).

[00247] O enriquecimento magnético de esferas foi usado para en- riquecer sequencialmente para as células que expressam os marcado- res de superfície EGFR e NGFR. Para a separação magnética, as cé- lulas que expressam tNGFR e tEGFR foram enriquecidas por classifi- cação sequencial de esferas magnéticas usando anticorpos contra NGFR e EGFR com PE e APC como fluorocromos (Biolegend), Anti- Ficoeritrina (kit PE MultiSort (Miltenyi) e MicroContas anti-APC ( Mil- tenyi) em colunas LS ou MS (Miltenyi). A classificação FACS foi reali- zada em um classificador de células FACS ARIA'Y Il SORP (BD Bios- ciences).

[00248] Para tornar a identificação mais fácil, uma segunda etapa de edição foi realizada em que um cassete de expressão com lucifera- se de vaga lume e TurboGFP foi alvejado para um local seguro (HBB) (FIG. 6C). As células K562 foram suspensas em 20 ug de solução de linha de células SF com 6 ug de proteína Cas9 (IDT) e 3,2 ug de sgR- NA (Trilink) e eletroporadas. Após ressuspensão em meio de células K562 (RPMI com 10% de BGS e suplementadas com GLUTAMAXTY e Penicilina/Estreptomicina), as células foram transduzidas com rAAV carregando o cassete de expressão. Isso resultou em uma população de células que expressa todos os 3 marcadores (tNGFR, tEGFR e GFP) que foram classificados por citometria de fluxo. Os resultados da citometria de fluxo são mostrados na FIG. 6D. A porcentagem de célu- las GFP+ em cada grupo é mostrada na FIG. 6F.

[00249] A população de células UMPSKXº/GFP* classificada foi submetida a ensaios que avaliam sua auxotrofia e sua resistência a 5- FOA. As células foram divididas em amostras de igual número e culti- vadas na presença de diferentes concentrações de uridina ou sem. Com a suplementação de altas concentrações de Uridina (250 ug/ml), as células se expandiram rapidamente. O crescimento celular foi inibi- do em uma concentração mais baixa (25 ug/ml), enquanto o número de células diminuiu com uma concentração mais baixa ou sem uridina (FIG. 6E). O número de células por ml é mostrado na Tabela 24.

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[00253] FIG.6G mostra a curva de crescimento para células GFP+ em diferentes quantidades de 5-FOA. Os valores são mostrados na Tabela 27. Tabela 27. Número de células GFP+ por ul [— [9a SF0R T TUssiISFOR [iNugiSFOR [NoSFOR | [Da6 [mato => sotanAa = ssoranat — 2eas2oes |

[00254] Em todas as concentrações que foram utilizadas, a fração de células UMPSK9'Kº aumentou ao longo do tempo. As células com UMP nocaute proliferaram bem nas concentrações de 10 e 100 ug/ml de 5-FOA, enquanto a concentração mais alta desacelerou seu cres- cimento celular. Exemplo 11. A edição de UMPS cria auxotrofia em células T e permite a seleção com 5-FOA

[00255] Células T foram isoladas de leucócitos que foram adquiri- dos do Stanford Blood Center (Palo Alto, CA) usando gradientes de densidade Ficoll e seleção negativa MACS (Kit de enriquecimento de células T Miltenyi). As células T foram cultivadas em meio X-VIVO15 suplementadas com 5% de soro humano (Sigma) e 100 Ul/ml de IL-2.

[00256] Antes da eletroporação, as células T foram ativadas por 3 dias com esferas Anti-CD3/-CD28 (STEMCELL Technologies), da mesma forma referidas como Dynabeads na técnica, e IL-2 (100 Ul/ml). As contas de ativação foram removidas por imobilização mag- nética antes da eletroporação. As células K562 e as células Nalm6 fo- ram mantidas na fase de crescimento logarítmico antes da eletropora- ção. saRNAs foram adquiridos da Synthego com modificações de 2'-O- metil-3'-fosforotioato nos três nucleotídeos terminais de ambas as ex- tremidades (Veja, Bonifant, e outro Mol. Ther. - Oncolytics. 3, 16011 (2016), que está aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[00257] Os dois marcadores de seleção, teEGFR e tNGFR, foram direcionados para o local de UMPS em células T humanas primárias após o isolamento de células T CD3+ de doadores saudáveis e ativa- ção das células.

[00258] Os sgRNAs em grande escala foram adquiridos por croma- tografia líquida de alto desempenho (HPLC)-purificada. A proteína Cas9 de alta fidelidade (HiFi) foi adquirida de IDT. Os saRNAs foram complexados com a proteína HiFi spCas9 (IDT) em uma relação molar de 2,5:1 (sgRNA proteína) e eletroporados nas linhagens celulares ou células T ativadas usando um Sistema 4D-NUCLEOFECTOR 7“ (Lon- za) em tiras de 16 cuvetes.

[00259] Parao alvejamento de transgenes em locais específicos do genoma, as células foram editadas como descrito, ressuspensas dire- tamente após eletroporação em 80 ul de meio e, em seguida, incuba- das com rAAV6 para transdução em multiplicidades de infecção (MOI) de 5000 vg/célula. Após 8-12 horas, a suspensão foi diluída com o meio para atingir uma concentração de células de 0,5-1E6 células por ml. Para o alvejamento do local de HBB, um sgRNA previamente ca- racterizado com a sequência alvo CTTGCCCCACAGGGCAGTAA (SEQ ID NO: 7) foi usado (veja Teixeira e outro, Curr. Opin. Bio- technol. 55, 87-94 (2019), que está aqui incorporado por referência em sua totalidade). Cas9 e saRNA foram complexados em um RNP e mis- turados com as células T ressuspensas em tampão de P3 e eletropo- radas no sistema NUCLEOFECTOR'Y 4D (Lonza) usando o programa EO-115. As células T humanas são conhecidas na técnica por permiti- rem altas frequências de edição com baixa toxicidade, como descrito em Bak e outro, 2018, para criar uma população de células com um UMPS nocaute bi-alélico usando métodos de alvejamento de gene RNP/rAAV6. As células que expressam ambos os marcadores foram expressas simultaneamente. As seguintes contagens de células por eletroporação, soluções de eletroporação e programas foram usados: células 2E5 K562 em solução de linhagem de células SF usando o pro- grama FF-120, células 2E5 Nalm6 em solução de linhagem de células SF e programa CV-104 e células T ativadas 1E6 em solução P3. Para controles editados no local CCR5, a sequência alvo genômica do saRNA foi GCAGCATAGTGAGCCCAGAA (SEQ ID NO: 8). Após a eletropora- ção, as células foram ressuspensas em meio e rAAV adicionado.

[00260] Três dias após o alvejamento, uma população de células EGFR +/NGFR+ foi identificada e expandida por co-cultura com esferas magnéticas Anti-CD3/-CD28 na presença de altas concentrações de uri- dina. A população de células EGFR+/NGFR+ foi diferenciada das células que receberam AAV sozinho devido à expressão mais brilhante indican- do integração estável em oposição à expressão epissomal de AAV.

[00261] Após a expansão, a população EGFR+/NGFRr+ foi classifica- da usando citometria de fluxo para obter uma população de células T com UMPS nocaute bi-alélico. Os resultados são mostrados na FIG. 7A.

[00262] Essas células T foram da mesma forma submetidas a um ensaio de auxotrofia e a possibilidade de selecionar essas células com 5-FOA foi testada. Ao cultivar as células na presença de esferas Anti- CD3/-CD28 e diferentes concentrações de Uridina, as células prolifera- ram apenas na presença de Uridina, o que confirmou seu crescimento celular auxotrófico. Concentrações mais altas de uridina levaram a taxas de proliferação mais altas. O crescimento auxotrófico de UMPS KO ou células T do tipo silvestre (WT) é mostrado na FIG. 7B e Tabela 28. Tabela 28. Células viáveis por ml o PMS

[00263] A Tabela 29 mostra a viabilidade relativa da população de células no Dia 4. Tabela 29. Células viáveis por ml

LL

[00264] Para avaliar a possibilidade de selecionar células UMPS- KOIKO com 5-FOA, as células classificadas foram misturadas com célu- las tipo silvestre, que foram marcadas com diferentes tinturas de ras- treamento e cultivadas na presença ou ausência de 5-FOA. Em parte das amostras, o 5-FOA foi adicionado apenas no primeiro dia (Dia O), enquanto em outro grupo foi suplementado diariamente. Tabela 30 e FIG. 7C mostram a porcentagem (%) das células T UMPS-KO (rotula- das com eFluor670) ao longo do tempo durante a cultura com ou sem 5- FOA.

oa oO A E E EG Ss Ni o eo S ST Ss = RES SEO FT o 2 35% e e 8 o E Oo - o 6 E = S c 9 o çÇkÇ E o a 36 SE 28 >

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[00267] Na verdade, a análise FACS de uma cultura de uma popu- lação mista de células UMPS nocaute e células T tipo silvestre com 5- FOA. As células T UMPS-KO foram rotuladas com eFluor670, e as cé- lulas do tipo silvestre foram rotuladas com éster sucinimidílico de car- boxifluoresceína (CFSE). Os resultados mostraram que no Dia O no grupo tratado com 5-FOA apenas no primeiro dia (Dia 0), 43,7% das células eram células T UMPS-KO, enquanto 56,0% foram observadas nas células do tipo silvestre. No Dia O, no grupo de controle não trata- do com 5-FOA, 47,7% das células eram células T UMPS-KO e 52,1% eram células do tipo silvestre. No Dia 3, no grupo com 5-FOA suple- mentado diariamente, 74,0% das células eram células T UMPS-KO, enquanto 25,8% eram células do tipo silvestre. No Dia 3, no grupo de controle não tratado com 5-FOA, 43,1% das células eram células T UMPS-KO e 56,4% eram células do tipo silvestre. Exemplo 12. Terapia celular

[00268] As células-tronco pluripotentes são geneticamente modifi- cadas para torná-las dependentes de fatores fornecidos externamente. Essas células são injetadas em camundongos NSG imunodeficientes como ensaios de formação de teratoma para avaliar o sistema de se- gurança, que evita a formação de teratoma por meio da retirada do composto fornecido externamente. As linhagens celulares utilizadas são iPSCs: iLiF3, iSB7-M3 (fonte: Nakauchi Lab na Universidade de Stanford) e hES: H9. Exemplo 13. Ensaio de formação de teratoma no músculo gastro- cnêmio

[00269] Para determinar se o interruptor de segurança pode erradi- car teratomas que se originam de células pluripotentes, iPSCs ou célu- las ES que foram geneticamente modificadas (ou células de controle) foram transplantadas em camundongos. As células expressaram luci- ferase para detecção in vivo. 1x106º hESCs criados por UMPS foram ressuspensos em 100 ul de mistura de proteína MATRIGELO (Cor- ning, Inc.) e mistura de PBS e injetados no músculo gastrocnêmio da pata traseira direita de camundongos NSG anestesiados. Os camun- dongos foram acompanhados para a formação do tumor por medição do tamanho do tumor e por imagem de bioluminescência. Após o es- tabelecimento dos tumores, foi testado se a retirada do triacetato de uridina (UTA) levou à regressão do tumor. No ponto final (tamanhos de tumor acima de 1,7 cm ou diminuição da atividade do camundongo, de outra maneira, 24 semanas) o tumor foi explantado e fixado para aná- lise histológica. Exemplo 14. Modelo de xenoenxerto K562

[00270] Parao ensaio de xenoenxerto K562, camundongos machos NOD SCID gama (NSG) de 6 a 12 semanas de idade foram transplan- tados com 1x106 células K562 ressuspensas em mistura de proteína MATRIGELO (Corning, Inc.) 1:1 diluída com PBS sob anestesia. Todos os animais foram mantidos e manuseados de acordo com as diretrizes institucionais e o protocolo experimental foi aprovado pelo Stanford University's Administrative Panel on Laboratory Animal Care.

[00271] O crescimento de células modificadas UMPSHKO'Kº foi anali- sado in vivo após o transplante em um organismo modelo, fornecendo ao animal altas doses de uridina. A uridina tem sido usada em seres hu- manos para o tratamento de acidúria orótica hereditária e para toxicidade de overdoses de fluoropirimidina (veja, van Groeningen, e outro Ann. On- col. 4, 317-320 (1993); Becroft, e outro J. Pediatr. 75, 885-91 (1969); ca- da um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade), porém é pouco absorvido no trato gastrointestinal e dividido no fígado (Veja, Gasser, e outro Science. 213, 777 —8 (1981); cada um dos quais está incorporado aqui por referência em sua totalidade). Sua biodisponi- bilidade pode ser aumentada pela administração como o pró-fármaco triacetato de uridina (UTA, PN401), que tem a aprovação da FDA para as indicações acima mencionadas (veja Weinberg e outro, PLoS One. 6, e14709 (2011); Ison e outro, Clin. Cancer Res. 22, 4545-9 (2016); cada um dos quais está incorporado aqui por referência em sua totalidade). Em seres humanos e modelos de camundongos, isso pode aumentar efetivamente os níveis de soro de uridina em mais de 10 vezes (Veja, Garcia e outro, Brain Res. 1066, 164—171 (2005); FDA, "XURIDEN - Highlights of prescribing information". (2015), (disponível em https:// WwWww.accessdata.fda.gov/ drugsatfída docs/label/2015/208169s000IbI. pdf); cada um dos quais está incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00272] A linhagem de célula UMPSK9'Kº K562 previamente criada que expressa a luciferase de vaga lume (FLuc) foi usada em um mo- delo de xenoenxerto em camundongos NSG. As células K562 de con- trole com UMPS tipo silvestre foram criadas visando um cassete de expressão com FLuc e GFP em um local seguro, a fim de estabelecer modelos de xenoenxerto comparáveis para ambos os genótipos UMPS em que os tumores podem ser monitorados por imagem de biolumi- nescência. Cas9 RNP é direcionado ao exon 1 do local de HBB com um RNA guia e um modelo de DNA doador transduzido por rAAV6 que transporta um cassete FLuc-2A-GFP-polyA sob controle do promotor SFFV. A análise FACS foi realizada quatro dias após o alvejamento das células K562 para avaliar a expressão de GFP antes da classifica- ção da população GFP+. Em um grupo de controle administrado ape- nas com AAV, 1,61% das células eram GFP+ e 13,4% das células.

[00273] Os camundongos foram alimentados com alimento de ca- mundongo regular ou com um alimento personalizado que foi enrique- cido com 8% (p/p) de UTA, uma quantidade que havia anteriormente demonstrado aumentar os níveis de soro em camundongos, embora fosse bem tolerada (Veja, Garcia e outro, 2005). O UTA foi adquirido de Accela ChemBio Inc. e adicionado para preparar os 8% (p/p) ao alimento de camundongo Teklad (Envigo) e o alimento irradiado antes do uso. O alimento de controle foi o alimento padrão para ratos Teklad 2018 (irradiado).

[00274] —Alternativamente, o alimento foi suplementado com mono- fosfato de uridina. Essas células podem ser implantadas em camun- dongos imunocomprometidos em um local (pata traseira) ou sistemi- camente por meio de uma injeção intravenosa (iv).

[00275] Células UMPSKOKº K562 ou células de controle foram transplantadas subcutaneamente e observadas semanalmente com imagens de bioluminescência. A imagem de luminescência de células K562 foi realizada 5 minutos após a injeção intraperitoneal (ip) de 125 mg/kg de D-Luciferina (PerkinElmer) em um sistema de imagem IVIS Spectrum (PerkinElmer). O crescimento localizado que foi descrito pa- ra células K562 após xeno-transplante subcutâneo foi observado (Veja, Sontakke, e outro Stem Cells Int. 2016, 1625015 (2016), que está incor- porado aqui por referência em sua totalidade). Os camundongos foram sacrificados quando estavam moribundos ou se o maior diâmetro do tu- mor ultrapassasse 1,75 cm. Exceto para um camundongo com falha de enxerto, foi observado um aumento na carga tumoral em células UMPS tipo silvestre com alimentos normais ou suplementados com UTA. Em contraste, observou-se que a luminescência de tumores derivados de UMPSKOKº K562 aumentou apenas nos camundongos alimentados com 8% de UTA, enquanto as cargas de tumor permaneceram está- veis na maioria dos camundongos que receberam comida sem UTA.

[00276] A proliferação de células auxotróficas das células hES pro- jetadas por UMPSHKO'KO jn vivo também foi da mesma forma analisada. Exceto por um camundongo com falha em formar um teratoma, mas- sas foram observadas em todos os camundongos alimentados com UTA suplementado, após a injeção das células pluripotentes nas patas traseiras de camundongos NSG. Ao sacrificar os camundongos 7 se-

manas após a injeção de células, grandes teratomas que se formaram na região da injeção em camundongos alimentados com UTA foram extraídos, enquanto em camundongos com comida normal os terato- mas eram visíveis, porém significativamente menores e pesavam me- nos, como mostrado na Tabela 31. A medula óssea é analisada no momento em que o animal morre ou é sacrificado (mais tardar 16 se- manas após a injeção). A Tabela 31 mostra os resultados de quantifi- cação de pesos de teratoma (p <0,05 por teste t não pareado compa- rando todos os camundongos entre os grupos, p <0,01 ao censurar o camundongo sem enxerto). Os grupos foram comparados por testes estatísticos como indicado usando Prism 7 (GraphPad). Tabela 31. Peso do Teratoma [emundongono | 1 | 2 3 a Ts) Lo AE

[00277] Os resultados in vivo foram consistentes com os resultados in vitro anteriores, que mostraram proliferação reduzida, porém não completamente anulada, de células UMPSKO'Xº na concentração de uridina de 2,5 pg/ml (= 10 nmol/ml). Esta concentração corresponde aos níveis de uridina de soro de camundongos, que são relatados na literatura como variando de 8 a 11,8 nmol/ml (Veja, Karle, e outro Anal. Biochem. 109, 41-46 (1980), que está aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[00278] Em geral, esses resultados são evidências de que uma auxo- trofia metabólica pode ser projetada para adicionar um mecanismo de controle sobre a proliferação celular de células humanas in vitro e in vivo. Exemplo 15. Modelo GvHD

[00279] Seosistema de segurança pode prevenir os efeitos colate- rais do xeno-GvHD é determinado em um modelo de mouse. Células T humanas geneticamente modificadas ou células T de controle são trans-

plantadas para camundongos imunocomprometidos irradiados e camun- dongos são suplementados com UTA ou não. Os camundongos são ava- liados quanto à perda de peso ou outros sinais de GvHD e sacrificados após o estabelecimento da doença (últimas 16 semanas). As células são seguidas por imagens de bioluminescência e coleta de sangue. Exemplo 16. Terapia de substituição enzimática na doença de ar- mazenamento lisossomal (LSD)

[00280] As células-tronco pluripotentes são geneticamente modifi- cadas para codificar uma enzima de interesse integrada no local de UMPS para torná-las dependentes de uridina fornecida externamente. Os indivíduos que necessitam de terapia de reposição enzimática para a enzima específica para tratar um LSD são administradas composi- ções compreendendo essas células juntamente com a uridina, para promover a expressão da enzima deficiente no indivíduo. A dosagem e o tempo de administração da uridina são ajustados com base na ex- pressão desejada da enzima.

[00281] Em alguns casos, as células são geneticamente modifica- das para codificar uma enzima de interesse no local de HLCs para tor- ná-las dependentes de biotina fornecida externamente.

[00282] “Embora modalidades da presente descrição tenham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio para aqueles versados na téc- nica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, mudanças e substituições ocorrerão agora para aqueles versados na técnica sem se afastar da presente descrição. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da descri- ção aqui descritas podem ser empregadas na prática do assunto da descrição. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o es- copo da descrição aqui e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos por elas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Modelo de doador, caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) uma ou mais sequências de nucleotídeos homólogas a um fragmento de um local de indução de auxotrofia, ou homólogo ao complemento do referido local de indução de auxotrofia, e (b) um transgene que codifica um fator terapêutico, opci- onalmente ligado a uma sequência de controle de expressão.

2. Modelo de doador, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que é de filamento único.

3. Modelo de doador, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que é de filamento duplo.

4. Modelo de doador, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que é um plasmídeo ou fragmento de DNA ou vetor.

5. Modelo de doador, de acordo com a reivindicação 4, ca- racterizado pelo fato de que é um plasmídeo que compreende elemen- tos necessários para a replicação, opcionalmente compreendendo um promotor e um 3' UTR.

6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma ou mais sequências de nucleotídeos homólogas a um fragmento do local de indução de auxotrofia, ou homólogo ao complemento do referido local de indução de auxotrofia, e (b) um transgene que codifica um fator terapêutico.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é um vetor viral.

8. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em vetores retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados virais e virais do herpes simples.

9. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda genes necessários para a repli- cação do vetor viral.

10. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o transgene é flanqueado em ambos os lados por sequências de nucleo- tídeos homólogas a um fragmento do local de indução de auxotrofia ou complemento do mesmo.

11. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o local de indução de auxotrofia é um gene que codifica uma proteína que está envolvida na síntese, reciclagem ou recuperação de um fator auxotrófico.

12. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene na Tabela 1 ou dentro de uma região que controla a expressão de um gene na Tabela

1.

13. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase.

14. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a sintetase de holocarboxilase.

15. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo homóloga a um fragmento do local de indu- ção de auxotrofia é 98% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos con-

secutivos do local de indução de auxotrofia.

16. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo homóloga a um fragmento do local de indu- ção de auxotrofia é 98% idêntica a pelo menos 200 nucleotídeos con- secutivos da uridina monofosfato sintetase humana ou holocarboxilase sintetase ou qualquer um dos genes na Tabela 1.

17. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de controle de expressão operacio- nalmente ligada ao referido transgene.

18. Modelo de doador ou vetor, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de controle de ex- pressão é uma sequência de controle de expressão específica de teci- do.

19. Modelo de doador ou vetor, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de controle de ex- pressão é um promotor ou realçador.

20. Modelo de doador ou vetor, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de controle de ex- pressão é um promotor induzível.

21. Modelo de doador ou vetor, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de controle de ex- pressão é um promotor constitutivo.

22. Modelo de doador ou vetor, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de controle de ex- pressão é uma sequência reguladora pós-transcricional.

23. Modelo de doador ou vetor, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de controle de ex- pressão é um microRNA.

24. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um gene marcador.

25. Modelo de doador ou vetor, de acordo com a reivindica- ção 24, caracterizado pelo fato de que o gene marcador compreende pelo menos um fragmento de NGFR ou EGFR, pelo menos um frag- mento de CD20 ou CD19, Myc, HA, FLAG, GFP ou um gene de resis- tência antibiótica.

26. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o transgene é selecionado a partir do grupo que consiste em hormônios, citocinas, quimiocinas, interferons, interleucinas, proteínas de ligação à interleucina, enzimas, anticorpos, proteínas de fusão Fc, fatores de crescimento, fatores de transcrição, fatores sanguíneos, vacinas, pro- teínas estruturais, proteínas ligantes, receptores, antígenos de superfí- cie celular, antagonistas de receptores e fatores coestimulantes, prote- ínas estruturais, antígenos de superfície celular, canais iônicos, um modificador epigenético ou uma proteína de edição de RNA.

27. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um receptor de antígeno de células T.

28. Modelo de doador ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um RNA, opcionalmente, um microRNA regulador.

29. Sistema de nuclease para direcionar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma proteína cas9, e (b) um RNA guia específico para um local de indução de auxotrofia.

30. Sistema de nuclease para direcionar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia, caracterizado pelo fato de que compreende: uma meganuclease específica para o referi- do local de indução de auxotrofia.

31. Sistema de nuclease, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a meganuclease é uma ZFN ou TA- LEN.

32. Sistema de nuclease, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um modelo de doador ou vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.

33. Célula hospedeira modificada ex vivo, caracterizada pe- lo fato de que compreende: um transgene que codifica um fator tera- pêutico integrado em um local de indução de auxotrofia, em que a re- ferida célula hospedeira modificada é auxotrófica para um fator auxo- trófico e capaz de expressar o fator terapêutico.

34. Célula hospedeira modificada, de acordo com a reivin- dicação 33, caracterizada pelo fato de que é uma célula de mamífero.

35. Célula hospedeira modificada, de acordo com a reivin- dicação 33, caracterizada pelo fato de que é uma célula humana.

36. Célula hospedeira modificada, de acordo com a reivin- dicação 33, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira modifi- cada é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma célula- tronco embrionária, uma célula-tronco, uma célula progenitora, uma célula-tronco pluripotente, uma célula-tronco pluripotente induzida (IPS), uma célula-tronco somática, uma célula diferenciada, uma célu- la-tronco mesenquimal, uma célula-tronco neural, uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula progenitora hematopoiética, uma célula- tronco adiposa, um queratinócito, uma célula-tronco esquelética, uma célula-tronco muscular, um fibroblasto, uma célula NK, uma célula B,

uma célula T e uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

37. Célula hospedeira modificada, de acordo com a reivin- dicação 33, caracterizada pelo fato de que é derivada de células de um indivíduo a ser tratado com as células hospedeiras modificadas.

38. Método de produção de uma célula hospedeira de ma- mífero modificada, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) in- troduzir na referida célula hospedeira de mamífero um ou mais siste- mas de nuclease que têm como alvo e cliva o DNA no local de indução de auxotrofia, ou um ácido nucleico que codifica um ou mais compo- nentes do referido um ou mais sistemas de nuclease, e (b) um modelo de doador ou vetor como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a introdução de uma segunda nuclease ou segundo RNA guia para direcionar e clivar o DNA em um segundo local genômico ou um ácido nucleico que codifica a referida segunda nuclease ou segundo RNA guia e, opcionalmente (b) um se- gundo modelo de doador ou vetor.

40. Método para direcionar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia em uma célula de mamífero ex vivo, caracterizado pelo fato de que compreende: contatando a referida cé- lula de mamífero com um modelo de doador ou vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, e uma nuclease.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 38 a 40, caracterizado pelo fato de que a nuclease é uma ZFN.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 38 a 40, caracterizado pelo fato de que a nuclease é um TALEN.

43. Método de produção de uma célula hospedeira de ma- mífero modificada, caracterizado pelo fato de que compreende: intro- duzir na referida célula hospedeira de mamífero o seguinte: (a) um po-

lipeptídeo Cas9, ou um ácido nucleico que codifica o referido polipep- tídeo Cas9, (b) um RNA guia específico para um local de indução de auxotrofia, ou um ácido nucleico que codifica o referido RNA guia, e (c) um modelo de doador ou vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a introdução na referida célula hospedeira de mamífero o seguinte: (a) um segundo RNA guia especí- fico para um segundo local de indução de auxotrofia, ou um ácido nu- cleico que codifica o referido RNA guia, e opcionalmente (b) a segundo modelo de doador ou vetor.

45. Método para direcionar a integração de um transgene a um local de indução de auxotrofia em uma célula de mamífero ex vivo, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar a referida célula de mamífero com um modelo de doador ou vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, um polipeptídeo cas9 e um RNA guia.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 45, caracterizado pelo fato de que o RNA guia é um RNA quimérico.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 45, caracterizado pelo fato de que o RNA guia compreende dois RNAs hibridizados.

48 Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 38 a 45, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a pro- dução de uma ou mais quebras de filamento único dentro do local de indução de auxotrofia.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 38 a 45, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a pro- dução de uma quebra de filamento duplo dentro do local de indução de auxotrofia.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 38 a 49, caracterizado pelo fato de que o local de indução de au- xotrofia é modificado por recombinação homóloga usando o referido modelo de doador ou vetor.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 38 a 49, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadas antes ou depois da expansão das referidas células e, opci- onalmente, da cultura das referidas células.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda (c) selecionar células que con- têm o transgene integrado no local de indução de auxotrofia.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que a seleção compreende: (i) selecionar células que requerem o fator auxotrófico para sobreviver; e opcionalmente (ii) se- lecionar células que compreendem o transgene integrado no local de indução de auxotrofia.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o local de indução de auxotrofia é um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase e as células são selecionadas por contato com 5-FOA.

55. Composição estéril, caracterizada pelo fato de que con- tém o referido modelo de doador ou vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, ou o referido sistema de nuclease, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 32, e água esté- ril ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

56. Composição estéril, caracterizada pelo fato de que compreende: a célula hospedeira de mamífero modificada, como defi- nida em qualquer uma das reivindicações 33 a 37, e água estéril ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

57. Kit, caracterizado pelo fato de que contém o referido modelo de doador ou vetor ou sistema de nuclease ou célula hospe- deira modificada, ou uma combinação dos mesmos, como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes, opcionalmente com um recipiente ou frasconete.

58. Método para expressar um fator terapêutico em um in- divíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar as células hospedeiras modificadas como definidas em qualquer uma das reivindicações 33 a 37; (b) opcionalmente administrar um regime de condiciona- mento para permitir o enxerto de células modificadas; e (c) administração do fator auxotrófico.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que a administração das células hospedeiras modifica- das e do fator auxotrófico é realizada simultaneamente.

60. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que a administração das células hospedeiras modifica- das e do fator auxotrófico é realizada sequencialmente.

61. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a administração contínua do referido fator auxotrófico regularmente por um período de tempo sufi- ciente para promover a expressão do fator terapêutico.

62. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda diminuir a taxa de administra- ção do referido fator auxotrófico para diminuir a expressão do fator te- rapêutico.

63. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda aumentar a administração do referido fator auxotrófico para aumentar a expressão do fator terapêu- tico.

64. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a interrupção da administração do referido fator auxotrófico para criar condições que resultem na inibi- ção do crescimento ou morte das células hospedeiras modificadas.

65. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda interromper temporariamente a administração do referido fator auxotrófico para criar condições que resultem na inibição do crescimento das células hospedeiras modifica- das.

66. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a administração contínua do referido fator auxotrófico por um período de tempo suficiente para exercer um efeito terapêutico em um indivíduo.

67. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira modificada é regenerativa.

68. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que a administração da célula hospedeira modificada compreende a liberação localizada.

69. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza- do pelo fato de que a administração do fator auxotrófico compreende a administração sistêmica.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda derivar a célula hospedeira do indivíduo a ser tratado antes da modifi- cação.

71. Método para tratar um indivíduo com uma doença, dis- túrbio ou condição, caracterizado pelo fato de que compreende: admi- nistrar ao indivíduo (a) as referidas células hospedeiras modificadas e (b) o referido fator auxotrófico em uma quantidade suficiente para pro- duzir a expressão de uma quantidade terapêutica do fator terapêutico.

72. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do pelo fato de que a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em: câncer, doença de Parkinson, do- ença do enxerto versus hospedeiro (GvHD), condições autoimunes, distúrbio ou condição hiperproliferativa, transformação maligna, doen- ças hepáticas, doenças genéticas, incluindo defeitos genéticos heredi- tários, diabetes melito juvenil e doenças do compartimento ocular.

73. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do pelo fato de que a doença, o distúrbio ou a condição afeta pelo me- nos um sistema do corpo selecionado a partir do grupo que consiste em muscular, esquelético, circulatório, nervoso, linfático, respiratório endócrino, digestivo, excretor e sistemas reprodutivos.

74. Uso de uma célula hospedeira modificada, como defini- da em qualquer uma das reivindicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição.

75. Célula hospedeira modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, caracterizada pelo fato de que é para uso na administração a seres humanos ou para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição.

76. Fator auxotrófico, caracterizado pelo fato de que é para uso na administração a um ser humano que recebeu uma célula hos- pedeira humana modificada, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 33 a 37.

77. Método para aliviar ou tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo: (a) uma composição compreendendo célula hospedeira modificada compreendendo um transgene que codifica uma proteína integrada em um local de indução de auxotrofia, em que a célula hos- pedeira modificada é auxotrófica para um fator auxotrófico; e

(b) o fator auxotrófico em uma quantidade suficiente para produzir a expressão terapêutica da proteína.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a uridina monofosfato sintetase (UMPS).

79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracteriza- do pelo fato de que o fator auxotrófico é a uridina.

80. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que o local de indução de auxotrofia está dentro de um gene que codifica a holocarboxilase sintetase (HLCS).

81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracteriza- do pelo fato de que o fator auxotrófico é biotina.

82. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a proteína é uma enzima.

83. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a proteína é um anticorpo.

84. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira modificada é uma célula- tronco embrionária, uma célula-tronco, uma célula progenitora, uma célula-tronco pluripotente, uma célula-tronco pluripotente induzida (IPS), uma célula-tronco somática, uma célula diferenciada, uma célu- la-tronco mesenquimal, uma célula-tronco neural, uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula progenitora hematopoiética, uma célula- tronco adiposa, um queratinócito, uma célula-tronco esquelética, uma célula-tronco muscular, um fibroblasto, uma célula NK, uma célula B, uma célula T ou uma célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

85. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira modificada é uma célula de mamífero.

86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracteriza- do pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula humana.

87. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira modificada é derivada do indi- víduo a ser tratado com a célula hospedeira modificada.

88. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração da composição e do fator auxotró- fico ocorre simultaneamente.

89. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a composição e o fator auxotrófico são administra- dos sequencialmente.

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracteriza- do pelo fato de que a composição é administrada antes do fator auxo- trófico.

91. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a composição e o fator auxotrófico são administra- dos simultaneamente.

92. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração do fator auxotrófico é continuada regularmente por um período de tempo suficiente para promover a ex- pressão terapêutica da proteína.

93. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração do fator auxotrófico é diminuída para diminuir a expressão da proteína.

94. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração do fator auxotrófico é aumentada para aumentar a expressão da proteína.

95. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração descontinuada do fator auxotrófico induz a inibição do crescimento ou morte celular da célula hospedeira modificada.

96. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração do fator auxotrófico é continuada por um período de tempo suficiente para exercer um efeito terapêutico no indivíduo.

97. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira modificada é regenerativa.

98. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração da composição compreende a |i- beração localizada.

99. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a administração do fator auxotrófico compreende a administração sistêmica.

100. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado pelo fato de que a doença é uma doença de armazenamento |i- sossomal (LSD).

101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracteri- zado pelo fato de que a doença de armazenamento lisossomal (LSD) é a doença de Gaucher (tipo 1/2/3), doença de MPS2 (Hunter), doença de Pompe, doença de Fabry, doença de Krabbe, hipofosfatasia, tipo de doença de Niemann-Pick A/B, MPS1, MPS3A, MPS3B, MPS3C, MPS3, MPS4, MPS6, MPS7, Fenilcetonúria, MLD, doença de Sandhoff, doença de Tay-Sachs ou doença de Battens.

102. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracteri- zado pelo fato de que a enzima é Glucocerebrosidase, Idursulfase, Al- glucosidase alfa, Agalsidase alfa, Agalsidase beta, Galactosilcerami- dase, Asfotase alfa, Esfingomielinase Ácida, Laronidase, heparan N- sulfatase, alfa-N- acetilglucosaminidase, heparan-a-glucosaminida N- acetiltransferase, N-acetilglucosamina G6-sulfatase, Elosulfase alfa, Glasulfato, B-Glucoronidase, Fenilalanina hidroxilase, Arilsulfatase A,

Hexosaminidase-B, Hexosaminidase-A ou tripeptidil peptidase 1.

103. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado pelo fato de que a doença é ataxia de Friedreich, angioedema hereditário ou atrofia muscular espinhal.

104. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado pelo fato de que a proteína é frataxina, inibidor de C1 esterase ou SMN1.

105. Método para reduzir o tamanho de um tumor ou redu- zir a taxa de crescimento de um tumor em um indivíduo, o método ca- racterizado pelo fato de que o método compreende: administrar ao in- divíduo uma célula hospedeira modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 33 a 37.