ES2730216T3 - Composiciones y métodos para selección metabólica de células transfectadas - Google Patents

Abstract

Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una 3-cetoesteroide reductasa como marcador de selección metabólica, y un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo, en la que la célula hospedadora es una célula de mamífero con deficiencia de 3- cetoesteroide reductasa y es auxotrófica para el colesterol.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para selección metabólica de células transfectadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevos vectores de marcador de selección, y métodos para usar estos vectores para generar sistemas de expresión genética estables en células eucariotas.

ANTECEDENTES

El desarrollo de técnicas de cultivo de células de mamíferos ha revolucionado la investigación biológica. Los sistemas de cultivo celular se pueden usar para someter a ensayo la toxicidad o la eficacia de nuevos fármacos en una etapa temprana del desarrollo cuando los ensayos clínicos en seres humanos podrían ser de alto riesgo; para producir proteínas humanas complejas para aplicaciones terapéuticas, tales como anticuerpos monoclonales; y como plataforma para terapias basadas en células en el contexto de cultivos de células madre adultas y embrionarias. Además, la capacidad de introducir ADN recombinante heterólogo en líneas celulares cultivadas proporciona a los científicos una poderosa herramienta complementaria para manipular sistemas animales para experimentación.

Recientemente, la necesidad de abordar las preocupaciones regulatorias sobre la contaminación de las líneas celulares usadas para expresar biomoléculas y, posteriormente, para fabricar productos terapéuticos se ha vuelto más crítica. La industria biotecnológica en su conjunto se está alejando del uso de medios suplementados con FBS para el cultivo celular comercial con el fin de garantizar que los patógenos animales potenciales o las proteínas animales causantes de enfermedades no se introduzcan en la población humana a través de futuros productos biológicos. Los medios sin suero se están convirtiendo en el protocolo convencional para el cultivo de células de mamífero, especialmente los usados para la expresión de genes y la purificación de proteínas en los canales de productos biológicos.

La línea de células de mieloma de ratón NS-0 se usa comúnmente en sistemas de expresión de proteínas, tales como el Sistema de Expresión Genética GS de Lonza (Lonza Group, Basilea, Suiza). El Sistema de Expresión Genética GS aprovecha la incapacidad de las células NS-0 para producir suficiente glutamina para sobrevivir sin añadir glutamina exógena al medio de crecimiento, mediante el uso de la enzima glutamina sintetasa (GS) como marcador para la transfección celular con un vector plásmido.

Las células NS-0 también son auxótrofas para el colesterol, lo que da como resultado una situación en la que los medios usados para apoyar el crecimiento de la línea celular se deben complementar tanto con colesterol como con glutamina. La adición de colesterol exógeno a los medios acuosos es un proceso complejo y lento porque el lípido se debe acoplar a restos de azúcar, tales como ciclodextrinas, para aumentar la solubilidad acuosa. Además, el proceso de acoplamiento es inherentemente inestable, lo que da como resultado medios de crecimiento suplementados con colesterol con una vida útil muy corta. Además, cuando se usa medio sin suero, químicamente definido (CD-SFM) en lugar de medio suplementado con suero bovino fetal (FBS) para cultivar líneas celulares auxotróficas para el colesterol, la precipitación de colesterol se produce con frecuencia. Por último, el colesterol no se puede filtrar fácilmente a través de membranas esterilizantes de poros pequeños, tales como PES, debido a su afinidad inherente a dichos polímeros, lo que reduce de forma significativa la cantidad de colesterol en el medio filtrado final. Este problema contribuye aún más a incoherencias en las preparaciones de lote a lote de medios suplementados con colesterol. La adición de colesterol exógeno directamente al medio sin pasar a través de un filtro también aumenta la posibilidad de introducir contaminantes, tales como agentes accidentales y/o endotoxinas. El mecanismo molecular que subyace a la auxotrofia para el colesterol de las células NS-0 se ha identificado y caracterizado recientemente (Colección Europea de Cultivos Celulares-ECACC, N.° 85110503, Depositado por el Dr. J Jarvis, Laboratorio de Biología Molecular MRC, Cambridge, 73B (3) Methods in Enzymology (1981). La línea celular no expresa el gen que codifica una enzima que cataliza una etapa en la biosíntesis endógena del colesterol. Una enzima llamada 3-cetoesteroide reductasa (3-KSR), un miembro de una gran familia de beta-hidroxiesteroide deshidrogenasas, está codificada por el gen específico. La proteína 3-KSR cataliza la conversión de zimosterona en zimosterol, un precursor del colesterol. Marijanovic et al., 17 (9) MOL. ENDOCRINOL. 1715-25 (2003).

Se han propuesto una serie de técnicas diferentes para abordar la auxotrofia para el colesterol de las células NS-0 con el objetivo de hacer que el protocolo de cultivo sea más eficaz y menos dependiente de la solubilidad del colesterol satisfactoria en medios acuosos. Un enfoque ha sido usar lípidos obtenidos a partir de plantas o sintéticos en lugar de colesterol obtenido a partir de animales para suplementar los medios de CD. Gorfien et al., 16 (5) BIOTECHNOL. PROG. 682-7 (2000). Otro enfoque ha sido modificar mediante ingeniería células NS-0 para sobreexpresar 3-KSR, revirtiendo de ese modo la deficiencia enzimática y permitiendo el cultivo de la línea celular sin la adición de colesterol exógeno. Seth et al., 121 (2) J. BIOTE^c HⁿOL. 241-52 (2006). Por último, los investigadores están investigando las bases moleculares para la inactividad del gen 3-KSR en las células NS-0 e intentan restaurar la expresión del gen mediante la desmetilación de una región reguladora cadena arriba crítica, que podría aliviar la represión transcripcional del gen 3-KSR. Seth et al., 93 (4) BIOTECHNOL. BIOENG. 820-27 (2006). Sin embargo, en la industria biotecnológica sigue existiendo una gran necesidad de generar líneas celulares estables mediante transfección con vectores de expresión en medios químicamente definidos/sin suero, que son capaces de expresar moléculas heterólogas. Además, es altamente deseable que los medios químicamente definidos/sin suero se puedan usar de forma inmediata sin la necesidad de una adición problemática de colesterol exógeno. La presente invención proporciona un vector de expresión que contiene un gen o polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol o colesterol de una célula eucariota que imparte la capacidad de la célula para sobrevivir y ser cultivada en medios químicamente definidos y/o sin suero. Cuando este vector de expresión también comprende un gen o polinucleótido que codifica una proteína, polipéptido o péptido heterólogos, este vector es útil como un marcador de selección metabólica para seleccionar las células transfectadas que contienen el gen que codifica la proteína heteróloga que se puede producir en medios químicamente definidos y/o sin suero.

SUMARIO

La presente invención se refiere a nuevos vectores de marcador de selección metabólica, y métodos para usar estos vectores para generar sistemas de expresión genética estable en células de mamífero.

La presente invención incluye una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de una célula de mamífero, un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo y un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo.

La presente invención también incluye un kit que comprende: un vector que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de una célula de mamífero, un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo; y opcionalmente uno o más de: una pluralidad de células hospedadoras que son auxotróficas para el colesterol; medio sin suero, químicamente definido; suplementos de crecimiento que soportan el crecimiento de la pluralidad de células hospedadoras a bajas densidades de siembra y clonales; y al menos un protocolo o instrucciones escritas para usar el kit.

La presente invención incluye además un método para seleccionar células que pueden sobrevivir en medio sin colesterol que comprende: transfectar células de mamífero que son auxotróficas para el colesterol con un vector que comprende un polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de una célula de mamífero, un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo y opcionalmente al menos un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga; y seleccionar células que tienen la capacidad de sobrevivir en medio que carece de colesterol.

La presente invención comprende además un método para obtener células que tienen la capacidad de sobrevivir en un medio que carece de colesterol y para producir una proteína heteróloga que comprende: transfectar células de mamífero que son auxotróficas para el colesterol con un vector como se describe en el presente documento que contiene una enzima, tal como una 3-KSR, y al menos un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga; y seleccionar las células que tienen la capacidad de sobrevivir en medio que carece de colesterol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las Figuras 1A-1J muestran la ruta bioquímica para la biosíntesis de esterol de eucariotas y, específicamente, de mamífero que está mediada parcialmente por el producto del gen de 3-KSR.

La Figura 2 representa el mapa plasmídico del vector de expresión p3-KSR.

La Figura 3 representa el mapa plasmídico del vector de expresión p3-KSR: mAbVL:mAbVH que porta genes de cadena ligera y pesada de anticuerpo humano completos clonados en tándem.

La Figura 4 representa el mapa plasmídico de p3-KRS:rec_gen, un ejemplo de una construcción genética recombinante (rec_gen) clonada en p3-KSR.

La Figura 5 representa pBFKSR.1HUMAB que proporciona un ejemplo de 6 orientaciones posibles de expresión de casete genético de anticuerpo en la región de clonación múltiple del vector de expresión p3-KSR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se entiende que la presente invención no se limita a los métodos y componentes particulares, etc., que se describen en el presente documento, ya que estos pueden variar. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento se usa con el fin de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Se debe indicar que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un polinucleótido" es una referencia a uno o más polinucleótidos e incluye equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia y así sucesivamente. El término "vector" es una referencia a una molécula de ADN autorreplicante, a la que en el presente documento también se hace referencia como "plásmido" o "vector de clonación de plásmido", que es un plásmido usado en experimentos de ADN recombinante como un aceptor de ADN extraño o heterólogo. Se pretende que la proteína, polipéptido o péptido heterólogos incluyan cualquier proteína que sea útil para tratar afecciones o enfermedades o como reactivos.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que normalmente entiende alguien con una experiencia habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Se describen métodos, dispositivos y materiales específicos, aunque en la práctica o ensayo de la presente invención se puede usar cualquier método y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento.

La presente invención proporciona composiciones y métodos útiles para la selección metabólica de células transfectadas usando una enzima de la ruta de biosíntesis de esterol de mamífero como un gen de selección metabólica en células de mamífero que presentan deficiencia de la enzima. Las células eucariotas con estas propiedades son útiles para la producción de una molécula heteróloga, tal como un péptido, un polipéptido, una proteína u otra molécula que normalmente no es producida por la célula. De forma específica, la presente invención usa 3-cetoesteroide reductasa (3-KSR) como un gen de selección metabólica en la generación de líneas celulares de mamífero que presentan deficiencia de 3-KSR para la producción de una molécula heteróloga tal como un péptido, un polipéptido o una proteína en medio que carece de colesterol exógeno o cualquier precursor de colesterol cadena abajo de 3-KSR en la ruta de biosíntesis de colesterol eucariota. Véase la Figura 1, que presenta la ruta bioquímica para la biosíntesis de esterol de mamífero que está parcialmente mediada por 3-KSR.

De forma más específica, la presente invención proporciona polinucleótidos y polipéptidos que codifican una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de mamífero como se proporciona en la Figura 1, en la que una enzima de ese tipo, por ejemplo es 3-KSR, vectores para expresar la enzima, tal como 3-KSR, líneas celulares que presentan deficiencia de la enzima, tal como 3-KSR, medios de cultivo celular y suplementos de crecimiento para su uso en el proceso de transfección, y kits para el aprovechamiento comercial de la presente invención.

La presente invención incluye una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de una célula de mamífero. En este vector la enzima comprende más específicamente una 3-cetoesteroide reductasa (3-KSR), y más específicamente una 3-KSR murina. Los polinucleótidos representativos específicos que codifican una 3-KSR comprenden la SEQ ID NO: 1 que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 3 y comprenden la SEQ ID NO: 2 que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4.

Como se ha descrito anteriormente el vector es preferentemente un vector de expresión de ADN recombinante, que opcionalmente comprende además al menos una primera unidad de transcripción para un producto génico, unidad de transcripción que está bajo el control del promotor del citomegalovirus humano. Los detalles de otras unidades y elementos en el vector de expresión se describen de forma detallada en el presente documento.

La célula hospedadora es una célula de mamífero. La célula hospedadora es auxotrófica para el colesterol. Las células hospedadoras específicas que son útiles en la presente invención son células NS-0, NS-1, y CHO-215, y más específicamente una célula de mieloma de ratón NS-0.

La presente invención también incluye un kit que comprende: un vector que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de una célula de mamífero, un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo; y opcionalmente uno o más de: una pluralidad de células hospedadoras que son auxotróficas para el colesterol; medio sin suero, químicamente definido; suplementos de crecimiento que soportan el crecimiento de la pluralidad de células hospedadoras a bajas densidades de siembra y clonales; y al menos un protocolo o instrucciones escritas para usar el kit. Como se ha indicado anteriormente, la enzima es preferentemente una 3-KSR, y más preferentemente una 3-KSR murina con el vector conteniendo por ejemplo, polinucleótidos útiles que codifican la enzima que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. Estos polinucleótidos codifican la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. El vector en el kit es preferentemente un vector de expresión de ADN recombinante, que opcionalmente comprende además al menos una primera unidad de transcripción para un producto génico, unidad de transcripción que está bajo el control del promotor del citomegalovirus humano.

Las células hospedadoras en el kit son preferentemente células NS-0, NS-1, y CHO-215 y más preferentemente una célula de mieloma de ratón NS-0 que son adecuadas para crecer en medio químicamente definido, sin suero y/o en medio químicamente definido.

Además el kit puede contener opcionalmente suplementos de crecimiento que comprenden al menos uno de BSA sin ácido graso, interleuquina-t humana recombinante (rhlL-6), insulina humana recombinante, selenito sódico, piruvato sódico, y etanolamina. Más preferentemente los suplementos de crecimiento comprenden concentraciones finales en medio de selección de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 % de BSA sin ácido graso, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 9 ng/ml de rhIL-6, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/l de insulina humana recombinante, de aproximadamente 5 |jg/l a aproximadamente 8 |jg/l de selenito sódico, de aproximadamente 0,01 g/l a aproximadamente 0,3 g/l de piruvato sódico, y de aproximadamente 0,5 mg/l a aproximadamente 3,5 mg/l de etanolamina. Más preferentemente, los suplementos de crecimiento comprenden concentraciones finales en medio de selección de aproximadamente un 1 % de BSA sin ácido graso, aproximadamente 5 ng/ml de rhlL-6, aproximadamente 10 mg/l de insulina humana recombinante, aproximadamente 6,7 pg/l de selenito sódico, aproximadamente 0,11 g/l de piruvato sódico, y aproximadamente 2,0 mg/l de etanolamina.

La invención además incluye una composición de suplementos de cultivo celular que comprende concentraciones finales en medio de selección de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 % de BSA sin ácido graso, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 9 ng/ml de rhlL-6, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/l de insulina humana recombinante, de aproximadamente 5 jg /l a aproximadamente 8 jg/l de selenito sódico, de aproximadamente 0,01 g/l a aproximadamente 0,3 g/l de piruvato sódico, y de aproximadamente 0,5 mg/l a aproximadamente 3,5 mg/l de etanolamina. Además, la invención también incluye una composición de suplementos de cultivo celular que comprende concentraciones finales en medio de selección de aproximadamente un 1 % de BSA sin ácido graso, aproximadamente 5 ng/ml de rhlL-6, aproximadamente 10 mg/l de insulina humana recombinante, aproximadamente 6,7 jg/l de selenito sódico, aproximadamente 0,11 g/l de piruvato sódico, y aproximadamente 2,0 mg/l de etanolamina.

La presente invención además incluye un método para seleccionar células que pueden sobrevivir en medio sin colesterol que comprende: transfectar células de mamífero que son auxotróficas para el colesterol con un vector que comprende un polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de una célula eucariota, un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo y opcionalmente al menos un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga; y seleccionar células que tienen la capacidad de sobrevivir en medio que carece de colesterol. Las células hospedadoras preferentes son NS-0, NS-1, y CHO-215, y preferentemente las células son células de mieloma de ratón NS-0 y el medio está químicamente definido y sin suero 0 químicamente definido. La enzima útil en este método comprende una 3-KSR.

La presente invención comprende además un método para obtener células que tienen la capacidad de sobrevivir en un medio que carece de colesterol y para producir una proteína heteróloga que comprende: transfectar células eucariotas que son auxotróficas para el colesterol con un vector como se describe en el presente documento que contiene una enzima, tal como una 3-KSR, y al menos un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga; y seleccionar las células que tienen la capacidad de sobrevivir en medio que carece de colesterol. Como se ha descrito anteriormente, las células son auxotróficas para el colesterol, y preferentemente son NS-0, NS-1, y CHO-215, y más preferentemente son células de mieloma de ratón NS-0, que se pueden cultivar en un medio está químicamente definido y sin suero o químicamente definido.

La presente invención además incluye un método para producir una proteína heteróloga en el sistema de cultivos celulares que se describen en el presente documento que comprende: transfectar células de mamífero que son auxotróficas para el colesterol con un vector que comprende un polinucleótido que codifica una enzima en la ruta de biosíntesis de esterol de una célula eucariota, un fragmento biológicamente activo del mismo o una variante biológicamente activa del mismo; y al menos un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga; y cultivar las células en condiciones para producir la proteína heteróloga. El método además comprende la obtención de la proteína heteróloga a partir del cultivo celular mediante técnicas de aislamiento, separación o purificación conocidas por las personas con experiencia en la materia. Las células son auxotróficas para el colesterol, y preferentemente son NS-0, NS-1, y CHO-215, y más preferentemente son células de mieloma de ratón NS-0 que se pueden cultivar en un medio que está químicamente definido y sin suero o químicamente definido.

La presente invención además incluye más específicamente un método para expresar una proteína heteróloga que comprende cultivar una célula transfectada con un vector que comprende una secuencia que codifica 3-cetoesteroide reductasa y al menos una proteína heteróloga en ausencia de colesterol en condiciones para producir la proteína heteróloga en el que las células y el medio preferentes se han descrito anteriormente.

13-Cetoesteroide Reductasas

La presente invención usa cualquier 3-KSR eucariota como un gen de selección metabólica para la producción de proteínas heterólogas. En una realización, se puede usar una 3-KSR murina, de forma específica, 3phidroxiesteroide:NADP+3-oxirreductasa, también conocida como HSD3rp5 (N.° L41519 de Registro de Nucleótidos en NCBI) con una secuencia de nucleótidos como sigue a continuación:(SEQ ID NO: 1):

ATGCCTGGAT g g a g c t g c c t g g t g a c a g g a g c a g g a g g g t t t c t t g g c c a

GAGGATTGTC CGAATGTTGG TGCAGGAGGA AGAGTTGCAG GAGATCAGAG

CCCTGTTCAG g a c c t t c g g t c g a a a a c a t g a a g a g g a a t t g t c c a a g c t g

CAGACAAAGG CCAAGGTGAG AGTACTGAAG GGAGACATTC TGGATGCCCA

ATGCCTGAAG a g a g c c t g c c a g g g c a t g t c t g c t g t c a t c c a c a c c g c t g

CTGCTATTGA CCCCCGTGGT GCCGCTTCCA GACAGACCAT CCTAGATGTC

AATCTGAAAG GTACTCAGCT CCTACTGGAT GCTTGTGTGG AAGCCAGTGT

GCCAACATTC ATCTACAGCA GCTCAGTGCT TGTGGCTGGA CCAAATTCCT

ACAAGGAGAT CATCCTGAAT GCCCATGAGG AAGAGCATCA TGAAAGCACA

TGGCCTAACC CATACCCATA CAGCAAAAGG ATGGCTGAGA AGGCAGTGCT

GGCAACAAAT GGGAGACTCC TGAAAAATGG TGGCACTTTG CATACTTGTG

CCTTAAGACT CCCTTTCATC TATGGGGAAG AATGCCAAGT CACTTCAACC

ACTGTGAAAA CAGCACTGAA GAACAACAGC ATAATTAAGA AAAATGCCAC

ATTCTCCATC GCCAACCCAG TGTATGTGGG CAA1GCAGCC TGGGCTCACA

TTCTGGCTGC CAGGAGCCTA CAGGACCCCA AGAAGTCCCC AAGCATCCAA

GGACAGTTCT ATTACATCTC TGATAACACC CCTCACCAAA GCTATGATGA

TTTAAATTAC ACCCTGAGCA AGGAGTGGGG CCTCTGCCTT GATXCTGGCT

GGAGGCTTCC TCTGTCCCTG CTTTACTGGC TXGCCTTCCT GCTGGAAACT

GTGAGCTTCC TGCTACGTCC AGTTTACAAC TATAGGCCAC CCTTTACCCG

CCTCTTGATC ACAGTGCTAA ATAGCGTGTT TACCATTTCC TATAAGAAAG

CTCAGCGCGA TCTAGGCTAT CAGCCACTTG TCAGCTGGGA GGAAGCCAAG

CAAAAAACCT CAGAGTGGAT TGGAACACTA GTGAAGCAGC ACAGGGAGAC

ACTACACAAA AAGTCACAGX GA

La SEQ ID NO: 1 codifica una 3-KSR específica que tiene la secuencia de aminoácidos que sigue a continuación:

Secuencia de aminoácidos de HSD3b5 murina (SEQ ID NO: 3):

MPGVÍSCLVTGAGGFLGQRXVHMLVQE EE LQEIRAAFRTFGRKHE E E G SKXjQTKAKVKVLKGD X JLDAQCLr RACQ GMSAVrHTAAAIDPRGAASRQTILDVHLKGTQLLLDACVEASVPTFrYSSSVLVAGPlíSYKEIILNAHEEEHHE STWPNPYP YSKRMA2 KAVLATNGRLLKNGGTLHTCALRLPFIYGEE CQVT S T T V K IA LK N N S IIK K N A TF8IA N PVyVGNAAWAHIIAARSLQDPKKSPSIOGQFYyiSDNTPHQSYDDLNYTLSKEWGLCLDSGWRLPLSLLYWLAF LLETVSFLL.RPVYNYRPPFTRALITVLNSVr'I'ISYKKAQRDLGYQPLVSW EBAKQKTSEW ISTLVKgHRETLHK KSQ*

Además, otras enzimas funcionales están codificadas con genes que incluyen, pero no se limitan a, 17phidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 7 (Hsdl7b7), 3p-hidroxi-delta(5)-esteroide deshidrogenasa (Hsd3b5), 3/3-Hsd III de rata, 33-Hsd IV de ratón, 33-Hsd V de ratón y 3/3-Hsd III de hámster, que se sabe que funcionan exclusivamente como 3-cetoesteroide reductasas. Específicamente, un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 2, también conocido como hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 7 (N.° de Acceso de Nucleótido en NCBI: BC011464) que contiene la siguiente secuencia de nucleótidos HSD17b7 murina que es como sigue a continuación:

ATGCGGAAGG TGGTTTTGAT CACCGGGGCG AGCAGTGGCA TTGGGCTAGC

CCTTTGCGGT CGACTGCTGG CAGAAGACGA TGACCTCCAC CTGTGTTTGG

CGTGTAGGAA CCTGAGCAAA GCAAGAGCTG TTCGAGATAC CCIGCTGGCC

TCTCACCCCT CCGCCGAAGT CAGCATCGTG CAGATGGATG TCAGCAGCCT

GCAGTCGGTG GTCCGGGGTG CAGAGGAAGT CAAGCAAAAG TTTCAAAGAT

TAGACTACTT ATATCTGAAT GCTGGAATCC TGCCTAATCC ACAATTCAAC

CTCAAGGCAT TTTTCTGCGG C A TC TTTTC A AGAAATGTGA TTC A TA TG TT

CACCACAGCG GAAGGAATTT TGACCCAGAA TGACTCGGTC ACTGCCGACG

GGTTGCAGGA GGTGTTTGAA ACCAATCTCT TTGGCCACTT TA TTC TG A TT

CGGGAACTGG AACCACTTCT CTGCCATGCG GACAACCCCT CTCAGCTCAT

CTGGACGTCC TCTCGCAATG CAAAGAAGGC TAACTTCAGC CTGGAGGACA

TCCAGCACTC CAAAGGCCCG GAACCCTACA GCTCTTCCAA ATATGCTACC

GACCTCCTGA ATGTGGCTTT GAACAGGAAT T TCAAC CAGA AGGGTCTGTA

TTCCAGTGTG ATGTGCCCAG GCGTCGTGAT GACCAATATG ACGTATGGAA

TTTTG CCTCC CTTTATCTGG ACGTTGCTCC TACCCATAAT GTGGCTCCTT

C G C TTTTTTG TAAATGCGCT CACTGTGACA CCGTACAACG GAGCAGAGGC

CCTGGTGTGG CTCTTCCACC a a a a a c c g g a GTCTCTTAAT CCTCTGACCA

AATACGCGAG CGCCACCTCG GGATTTGGGA CTAATTACGT CACGGGCCAA

AAGAT GGACA TAGATGAAGA CACTGCTGAA AAATTCTATG AGGTCTTACT

GGAGCTGGAA AAGCGTGTCA GGACCACCGT TCAGAAATCG GATCACCCGA

GCTGA

La SEQ ID NO: 2 codifica una 3-KSR específica que tiene la secuencia de aminoácidos que sigue a continuación: Secuencia HSD17b7 a.a. murina (SEQ ID NO: 4):

M EtKVVlilTGASSGIGIALCGRliAEDDDLHLCLACÍlHLSKARAVRDTIJjASHPSAEVSlV^lDVSSLQSVVRGAE EVKQKFQRLDYLYIJNP.G ILPNPQ 8m KAFFCG IFSRNVIHM FTIAfiG ILrQ NDSVTADG LQ EVFE'm LFG HFILI RELEPtLCfíAD^pSQI.IWTSSRNAKKAHFSLSDIQHSKGPEPYSSSKYATDLLNVALNRNFNQKGLYSSVKCPGV

VJtfTNMTYGILPPFIWM^LPIMWLLRFiVNAIirVTPXNGAEALVWLB’HQKPESLNPLríCfASATSGFGTNYVXGQ KMDXDEDTAEKFYEVLLELEKRVRTIVQKSDHPS*

En otra realización, se puede usar cualquier enzima, por ejemplo, tal como una 3-KSR que facilite la conversión enzimática de los siguientes precursores en el primer y segundo ciclos de biosíntesis de esterol de mamífero como se representa en la Fig. 1:

4-metil-5a-colesta-3,8,24-trien-3p-ol ^ 3-KSR ^ 3-oxo-4a-metil-5a-colesta-8,24-dieno ^ 3-KSR ^ 3p-hidroxi-4a-metil-5a-colesta-8,24-dieno (1er ciclo)

5a-colesta-3,8,24-trien-3p-ol ^ 3-KSR ^ -oxo-5a-colesta-8,24-dieno ^ 3-KSR ^ delta-8,24-colestadien-3pol(3p-hidroxi-5a-colesta-8,24-dieno; zimosterol) (2° ciclo)

Otros ejemplos específicos de las 3-KSR que se pueden usar en la presente invención incluyen otras 3-KSR murina (N.os de Acceso NM_00295, NM 010476, y BC_0l2715), bovino (N.° de Acceso XM_591611), ser humano (N.° de Acceso NM_016371).

A. Polinucleótidos de 3-KSR, Fragmentos y Variantes de los Mismos

La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican cualquier 3-KSR. El alcance de la invención con respecto a los polinucleótidos que codifican 3-KSR incluye, pero no se limita a, polinucleótidos que tienen una secuencia establecida en una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos y que se proporcionan en el presente documento; polinucleótidos obtenidos a partir de los materiales biológicos y que se describen en el presente documento u otras fuentes biológicas (por ejemplo, fuentes murinas o humanas) mediante hibridación en condiciones rigurosas (en particular condiciones de alta rigurosidad); genes que corresponden a los polinucleótidos proporcionados; variantes de los polinucleótidos proporcionados y sus genes correspondientes, en particular aquellas variantes que conservan una actividad biológica del producto génico codificado (por ejemplo, una actividad biológica atribuida a un producto génico que corresponde a los polinucleótidos proporcionados como resultado de la asignación del producto génico a una familia de proteínas y/o familias de proteínas y/o identificación de un dominio funcional presente en el producto génico). Otras composiciones de polinucleótidos de 3-KSR contempladas por y dentro del alcance de la presente invención serán rápidamente evidentes para una persona con experiencia en la materia cuando se proporcione con la presente descripción. Tal como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" no pretenden ser limitantes en cuanto a la longitud o estructura del polinucleótido a menos que se indique de forma específica.

Los polinucleótidos de 3-KSR pueden comprender una secuencia establecida en una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se proporcionan en el presente documento. Los polinucleótidos de 3-KSR de la presente invención también incluyen polinucleótidos que tienen similitud de secuencia o identidad de secuencia con el ADN de 3-KSR nativo. Esto incluye las secuencias asociadas no traducidas, promotoras y potenciadoras en las posiciones 5' y 3'. Los polinucleótidos de 3-KSR que tienen similitud de secuencia se pueden detectar por hibridación en condiciones de baja rigurosidad, por ejemplo, a 50 °C y 10X SSC (solución salina 0,9 M/citrato sódico 0,09 M) y permanecen unidos cuando se someten a lavado a 55 °C en 1X SSC. La identidad de la secuencia se puede determinar por hibridación en condiciones rigurosas, por ejemplo, a 50 °C o más elevada y 0,1X SSC (solución salina 9 mM/citrato sódico 0,9 mM). Por supuesto, los métodos y condiciones de hibridación se conocen bien en la técnica y todos los métodos y condiciones alternativos se pueden usar para identificar polinucleótidos de 3-KSR adicionales.

Los polinucleótidos de 3-KSR de la presente invención también incluyen variantes de origen natural de las secuencias de nucleótidos de 3-KSR (por ejemplo, variantes degeneradas, variantes alélicas, etc.). Las variantes de los polinucleótidos de 3-KSR de la presente invención se identifican por hibridación de variantes supuestas con secuencias de nucleótidos que se desvelan en el presente documento, preferentemente por hibridación en condiciones rigurosas. Por ejemplo, al usar condiciones de lavado apropiadas, las variantes de los polinucleótidos de 3-KSR que se describen en el presente documento se pueden identificar cuando la variante alélica presenta como máximo una falta de coincidencias de aproximadamente un 25-30 % de pares de bases (pb) con respecto a la sonda polinucleotídica seleccionada. En general, las variantes alélicas contienen aproximadamente una falta de coincidencias de un 15-25 % de pb, y pueden contener tan pocas faltas de coincidencias como incluso un 5-15 %, o un 2-5 %, o un 1-2 % de pb, así como una sola falta de coincidencias de pb.

La presente invención también incluye homólogos que corresponden a las secuencias de polinucleótidos de 3-KSR proporcionadas en el presente documento, en los que la fuente de genes homólogos puede ser cualquier especie de mamífero, por ejemplo, especies de primates, en particular ser humano; roedores, tales como ratas; caninos, felinos, bovinos, ovinos, equinos, levaduras, nematodos, etc. Entre especies de mamíferos, por ejemplo, ser humano y ratón, los homólogos generalmente tienen una similitud de secuencia básica con el gen o parte del mismo, por ejemplo, al menos un 75 % de identidad de secuencia, normalmente al menos un 90 %, más habitualmente al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % entre secuencias de nucleótidos. La similitud de secuencia se puede calcular basándose en una secuencia de referencia, que puede ser un subconjunto de una secuencia de 3-KSR más grande, por ejemplo, tal como un motivo conservado, parte de una región codificante, región de flanqueo, etc. Una secuencia de referencia normalmente tendrá una longitud de al menos aproximadamente 18 nt contiguos, más habitualmente una longitud de al menos aproximadamente 30 nt, y se puede extender a la secuencia completa de 3-KSR que se está comparando. En la técnica se conocen algoritmos para el análisis de secuencias, tales como BLAST con huecos, descrito en Altschul, et al., 25 NUCLEIC ACID RES. 3389-3402 (1997).

En general, las variantes de los polinucleótidos de 3-KSR que se describen en el presente documento tienen una identidad de secuencia mayor que al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 85 %, y puede ser mayor que al menos aproximadamente un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 98 %, un 99 % o más tal como se determina usando métodos convencionales tales como el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman tal como se implementa en el programa MPSRCH (Accelrys, Inc., San Diego, CA). Por ejemplo, la identidad de la secuencia de ADN global puede ser superior a un 65 % tal como se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con los siguientes parámetros de búsqueda: penalización por apertura de hueco, 12; y penalización por extensión de hueco, 1.

Los polinucleótidos de 3-KSR de la presente invención pueden ser ADNc o ADN genómicos, así como versiones truncadas o fragmentos de los mismos, en particular fragmentos que codifican un producto génico de 3-KSR biológicamente activo o rescatable que es funcional en las células eucariotas en las que se transfecta para permitir que las células crezcan en medios sin colesterol. Los ADNc incluyen todos los ácidos nucleicos que comparten la disposición de elementos de secuencia que se encuentran en las especies de ARNm maduro nativo, en los que los elementos de secuencia son exones y regiones no codificantes en las posiciones 3' y 5'. Las especies de ARNm tienen exones contiguos, con los intrones que intervienen, cuando están presentes, siendo eliminados mediante corte y empalme de ARN nuclear, para crear un marco de lectura abierto continuo que codifica un polipéptido. Las especies de ARNm también pueden existir tanto con exones como con intrones, en las que los intrones se pueden eliminar mediante un corte y empalme alternativo.

Una secuencia genómica de 3-KSR puede comprender el ácido nucleico presente entre el codón de inició y el codón de parada, como se define en las secuencias enumeradas, incluyendo todos los intrones que normalmente están presentes en un cromosoma nativo. Además, puede incluir las regiones no traducidas en las posiciones 5' y 3' encontradas en el ARNm maduro. La secuencia genómica puede incluir además secuencias reguladoras de transcripción y traducción específicas, tales como promotores, potenciadores, etc., que incluyen aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, del ADN genómico de flanqueo en el extremo en las posiciones 5' y 3' de la región transcrita.

B. Polipéptidos de 3-KSR, Fragmentos y Variantes de los Mismos

Los polipéptidos de 3-KSR de la presente invención incluyen aquellos codificados por los polinucleótidos de 3-KSR desvelados, fragmentos y variantes de los mismos que incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticos en secuencia a los polinucleótidos de 3-KSR desvelados.

Un polipéptido de 3-KSR se refiere tanto al polipéptido de longitud completa codificado por el polinucleótido mencionado, el polipéptido codificado por el gen representado por el polinucleótido mencionado, como a partes o fragmentos del mismo. Los polipéptidos de 3-KSR también incluyen variantes de las proteínas de origen natural, en los que dichas variantes son homólogas o básicamente similares a las proteínas de 3-KSR de origen natural, y pueden ser de un origen de la misma o diferente especie que las proteínas de 3-KSR de origen natural (por ejemplo, ser humano, murina o alguna otra especie que exprese naturalmente el polipéptido mencionado, generalmente una especie de mamífero). En general, los polipéptidos de 3-KSR variantes tienen una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 %, normalmente al menos aproximadamente un 90 %, y más habitualmente al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia o superior, es decir, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido con un polipéptido de 3-KSR que se describe en el presente documento, tal como se mide, por ejemplo, mediante BLAST 2.0 usando los parámetros que se han descrito anteriormente. Los polipéptidos de 3-KSR variantes se pueden modificar después de la traducción de forma natural o no natural, es decir, el polipéptido tiene un patrón de modificación posterior a la traducción que se diferencia de cualquier modificación después de la traducción predicha o caracterizada experimentalmente de la proteína de 3-KSR de origen natural.

La presente invención también incluye homólogos de polipéptidos de 3-KSR (o fragmentos de los mismos) en los que los homólogos se aíslan de cualquier especie, normalmente de mamíferos, por ejemplo, roedores, tales como ratones, ratas; animales domésticos, por ejemplo, caballo, vaca, perro, gato; y seres humanos. Los homólogos pueden tener al menos aproximadamente un 35 %, normalmente al menos aproximadamente un 40 % y más habitualmente al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína de 3-KSR particular que se describe en el presente documento, en la que la identidad de secuencia se determina usando el algoritmo BLAST 2.0, por ejemplo, con los parámetros que se han descrito anteriormente.

Dentro del alcance de la presente invención también encuentran variantes de polipéptidos que incluyen mutantes, fragmentos y fusiones. Los mutantes pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, tal como para alterar un sitio de glicosilación, un sitio de fosforilación o un sitio de acetilación, o para minimizar el plegamiento incorrecto mediante la sustitución o eliminación de uno o más restos de cisteína que no son necesarios para funcionar. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas que conservan la carga general, hidrofobia/hidrofilia y/o el volumen estérico del aminoácido sustituido. Las variantes se pueden diseñar para que retengan o tengan una actividad biológica mejorada de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional y/o, cuando el polipéptido es un miembro de una familia de proteínas, una región asociada con una secuencia consenso). La selección de las alteraciones de aminoácidos para la producción de variantes de 3-KSR se puede basar en la accesibilidad (interior frente a exterior) del aminoácido (véase, por ejemplo, Go et al., 15 INT. J. ^p E^pTIDE PROTEIN RES. 211 (1980)), la termoestabilidad del polipéptido variante (véase, por ejemplo, Querol et al., 9 PROT. ENG. 265 (1996)), sitios de glicosilación deseados (véase, por ejemplo, Olsen y Thomsen, 137 J. GEN. MICROBIOL. 579 (1991)), puentes disulfuro deseados (véase, por ejemplo, Clarke et al., 32 BIOCHEM. 4322 (1993); y Wakarchuk et al., 7 PROTEIN ENG. 1379 (1994)), sitios de unión a metal deseados (véase, por ejemplo, Toma et al., 30 BIOCHEM. 97 (1991), y Haezerbrouck et al., 6 PROTEIN ENG. 643 (1993)), y las sustituciones deseadas dentro de los bucles de prolina (véase, por ejemplo, Masui et al., 60 APPL. ENV. MICROIBIOL. 3579 (1994)). Las muteínas con agotamiento de cisteína se pueden producir como se desvela en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.959.314.

Las variantes de 3-KSR también incluyen fragmentos de los polipéptidos que se desvelan en el presente documento, en particular fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos que corresponden a dominios funcionales. Los fragmentos de interés generalmente tendrán una longitud de al menos aproximadamente 10 aminoácidos (aa) a al menos aproximadamente 15 aa, generalmente una longitud de al menos aproximadamente 50 aa, y pueden tener una longitud de hasta 300 aa o más larga, pero normalmente no superará una longitud de aproximadamente 531 aa, en los que el fragmento tendrá un tramo de aminoácidos que es idéntico a un polipéptido de 3-KSR codificado por un polinucleótido que tiene una secuencia de una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se proporcionan en el presente documento, o un homólogo del mismo. El código genético se puede usar para seleccionar los codones apropiados para construir las variantes correspondientes. En particular, los fragmentos incluirán aquellos que contengan los dominios o epítopos específicos de la proteína 3-KSR.

Las variantes de secuencia de aminoácidos de 3-KSR se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico, o mediante síntesis de péptidos. Las modificaciones de ese tipo incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos de 3-KSR. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción formal de 3-KSR, con la condición de que la construcción final tenga las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos posteriores a la traducción de 3-KSR, tales como cambio del número o posición de los sitios de glicosilación u otras modificaciones posteriores a la traducción, incluyendo acetilación y fosforilación.

Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones de 3-KSR que son ubicaciones preferentes para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" como lo describen Cunningham y Wells, 244 SCIENCE 1081-85 (1989). Aquí, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o con carga negativa (más preferentemente alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con antígeno. Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones a continuación se refinan mediante la introducción de otras variantes en los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos se determina previamente, no es necesario determinar previamente la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza un barrido de ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes de 3-KSR expresadas se identifican sistemáticamente para la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían en longitud desde un resto hasta polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen una 3-KSR con un resto de metionilo N-terminal.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto de aminoácido en la proteína 3-KSR reemplazado por un resto diferente.

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la proteína 3-KSR se consiguen seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (i) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (ii) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (iii) la mayor parte de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gin, his, lys, arg;

(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones conservativas implican el intercambio de aminoácidos dentro de la misma clase.

II Vectores que Codifican 3-KSR

La presente invención proporciona además vectores para expresar cualquier enzima en la ruta bioquímica para la biosíntesis de esteroles de mamífero, como la enzima 3-KSR en células auxotróficas para el colesterol. En general, cualquier vector de clonación procariota se puede usar para la construcción del vector. El vector puede comprender un origen bacteriano de replicación, que es útil para la propagación del vector en una cepa hospedadora de E. coli a partir de la cual se aislará el ADN del vector antes de la transfección de células de mamífero. Los ejemplos de orígenes de replicación bacterianos incluyen, entre otros, Col El, pUC, pBR322 u otros obtenidos a partir de cepas no patógenas de E. coli. El vector puede comprender además un marcador de selección para la expansión de un alto número de copias del plásmido en E. coli. Los marcadores de selección a modo de ejemplo incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos tales como ampicilina, carbenicilina, tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina, gentamicina, sulfaetoazol, trimetoprim y otros. Los marcadores de selección adicionales que se pueden usar en los vectores de la presente invención incluyen genes que confieren una selección basada en choque térmico, desintoxicación de metales y otros procesos metabólicos.

El vector puede comprender además un promotor eucariota para dirigir la expresión del gen de 3-KSR. Este puede ser un promotor mínimo, tal como el promotor del gen de la timidina quinasa (TK) de mamífero, o un casete de transcripción más fuerte, tal como el origen de replicación del Virus del Simio 40 (SV40) y la región del promotor temprano. También se pueden usar promotores muy fuertes, tales como la región del promotor Temprano Inmediato Mayor (MIE) del citomegalovirus (CMV), con o sin las secuencias del intrón A y/o B, o el Factor 1 Alfa de Elongación humano (EFa), también se puede usar para dirigir la expresión del gen de 3-KSR. También puede estar presente una secuencia de terminación de la transcripción eucariota, o un sitio de poliadenilación para detener la transcripción y señalizar la poliadenilación del gen de 3-KSR. El sitio de poliadenilación se puede obtener teóricamente a partir de cualquier gen eucariota, pero las secuencias de poliadenilación fuertes usadas comúnmente incluyen la poli-A tardía de SV40 y la poli-A de Hormona de Crecimiento Bovina (BGH).

Como se representa en la Figura 2, una realización de un vector (en este caso, denominado p3-KSR), puede comprender un origen de replicación bacteriano obtenido a partir de pUC (ori) y un gen de beta-lactamasa (bla) que confiere resistencia a ampicilina o carbenicilina en cepas de E. coli sensibles a estos antibióticos. El vector también puede contener el promotor y el potenciador Temprano Inmediato Mayor (MIE) del Citomegalovirus (CMV) para dirigir la expresión de secuencias recombinantes heterólogas clonadas en la región del policonector. La secuencia de poliadenilación (SV40 pA) del Virus del Simio 40 (SV40) se puede ubicar cadena abajo tanto de las secuencias recombinantes heterólogas como del gen de 3-KSR para poliadenilar de manera eficaz los ARNm nacientes de cada gen. El promotor de SV40 y el origen de replicación (SV40 on) se pueden ubicar inmediatamente cadena arriba del gen de 3-KSR para dirigir la expresión de este marcador de selección.

En una realización específica, el gen de 3-KSR se puede insertar en un vector mediante clonación directa del ADNc de 3-KSR murina amplificado a partir de una biblioteca de ADNc de riñón de ratón. Los cebadores modificados mediante ingeniería para amplificar 3-KSR a partir de una biblioteca de ADNc de riñón de ratón pueden contener, por ejemplo, extremos Pmli, que son compatibles con un sitio PmlI presente en el vector obtenido a partir de pUC, p3-KSR, y qué sitio está presente en la región entre el ori de SV40 y la poli-A de SV40. Por lo tanto, un ADNc de 3-KSR restringido con PmlI se puede usar para clonar este gen en el sitio PmlI de la estructura principal de p3-KSR. La orientación del gen en el vector se puede determinar mediante análisis de endonucleasa de restricción (REN) y secuenciación del ADN con terminación didesoxi.

Un polinucleótido o gen o un casete que codifica al menos un polipéptido heterólogo de interés a continuación se inserta en el vector que comprende el gen de 3-KSR en una región o sitio de clonación múltiple como se muestra, por ejemplo, en las Figuras 3, 4 o 5. Los polinucleótidos o casetes insertados están bajo el control de, o están unidos de forma operativa a un promotor que permitirá la expresión en una célula hospedadora eucariota o, preferentemente, de mamífero.

III Transfección de Células con Vectores que Codifican 3-KSR

La introducción de vectores polinucleotídicos que codifican proteínas heterólogas de interés (y 3-KSR como marcador de selección) en células hospedadoras se puede conseguir usando técnicas bien conocidas en la técnica, que incluyen, entre otras, electroproporación, lipofección, precipitación con fosfato cálcico, precipitación con polietilenglicol, tratamiento con ultrasonidos, transfección, transducción, transformación e infección viral. Véase SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (3a ed. 2001).

Para transfección se puede usar cualquier célula eucariota, preferentemente de mamífero, cuya auxotrofia para el colesterol se pueda atribuir a la actividad enzimática, tal como actividad de 3-KSR. Las líneas celulares a modo de ejemplo pueden incluir, pero no se limitan a, NS-0 (ECACC N.° 85110503), NS-1 (ECACC N.° 85011427), y CHO-215 (Plemenitas et al., 265 (28) T. Biol. Chem. 17012-17 (1990)).

La presente invención también incluye células de mamífero, que inicialmente no son auxotróficas para el colesterol, pero se hacen mediante el uso de radiación, agentes mutagénicos o técnicas de desactivación genética recombinantes para inactivar genes endógenos que codifican actividades de 3-KSR que incluyen, pero no se limitan a, 17p-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 7 (Hsd17b7) y 3p-hidroxi-delta(5)-esteroide deshidrogenasa (Hsd3b5). Además en otra realización, el gen con desactivación genética dirigido puede incluir, pero no se limita a, 3p-Hsd III de rata, 3p-Hsd IV de ratón, 3p-Hsd V de ratón y 3p-Hsd III de hámster, que se sabe que funcionan exclusivamente como 3-cetoesteroide reductasas.

NS-0, NS-1, CHO-215, y otras líneas celulares auxotróficas para el colesterol que se transfectan con un vector de expresión que contiene el marcador de selección 3-KSR (y un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga de interés) se debería cultivar en medio que carece de colesterol. En ciertas otras realizaciones, las células hospedadoras se pueden cultivar en cualquier medio sin suero y sin colesterol que contenga el siguiente listado exhaustivo de precursores de esterol: 4-metil-5a-colesta-3,8,24-trien-3p-ol, 3-oxo-4a-metil-5a-colesta-8,24-dieno, 5acolesta-3,8,24-trien-3p-ol, y/o 3-oxo-5a-colesta-8,24-dieno. Estos precursores actúan cadena arriba de 3-KSR en la ruta bioquímica del colesterol.

Para abordar las preocupaciones reglamentarias, las células hospedadoras (antes o después de la transfección) se pueden cultivar en cualquier medio adecuado incluye, pero no se limita a, medio sin suero, medio sin proteínas, medio químicamente definido, o cualquier combinación de los mismos, incluyendo medio químicamente definido/sin suero. Este aspecto particular de la presente invención aborda las preocupaciones de que las proteínas obtenidas a partir de animales y/o proteínas de origen desconocido pueden hacer que los productos de proteínas recombinantes no sean adecuados para uso terapéutico o diagnóstico en seres humanos. Una realización específica de un medio de crecimiento adecuado es el Medio de Hibridoma CD (Invitrogen® Corp., Carlsbad, CA), a químicamente definido, sin suero que no contiene proteínas de origen animal, vegetal o sintético y se ha confirmado que está libre de lisados o hidrolizados indefinidos.

Las células hospedadoras de la presente invención se pueden proporcionar ya adaptadas a un medio de crecimiento apropiado, tal como CD-SFM. A menudo, las células se adaptan a los medios de ese tipo antes de la transfección. En ese caso, las células se pueden adaptar a HyQ® CDM4NS-0 (Hyclone®, Logan, UT), que es otro medio químicamente definido, sin suero que está desprovisto de componentes obtenidos a partir de animales. El último medio disponible en el mercado incluye cantidades suficientes de colesterol para soportar el crecimiento de líneas celulares auxotróficas para el colesterol. Después de la transfección, las células se cultivan en un medio de selección adecuado sin colesterol. Alternativamente, los transfectantes se cultivan en medio sin colesterol usando medios clásicos suplementados con suero que se han sometido a amplia deslipidación usando técnicas conocidas y se encontró que no son compatibles con el crecimiento de células precursoras.

Después de la transfección, las células generalmente se siembran a densidades bajas para seleccionar los transformantes estables. En este sentido, se puede usar cualquier medio de selección apropiado. En una realización, el medio de selección puede comprender Hibridoma CD suplementado con L-Glutamina 2 mM o Glutamax y IX NEAA (aminoácidos no esenciales) (Invitrogen® Corp., Carlsbad, CA).

En ciertas realizaciones, se puede añadir al medio de selección un cóctel de suplementos de crecimiento para optimizar las condiciones de crecimiento después de la transfección. Los suplementos de crecimiento se pueden añadir después de la transfección a cualquier línea celular apropiada que incluye, pero no se limita a, células NS-0, NS-1, CHO-215. En una realización específica, el cóctel de suplementos de crecimiento se puede usar para optimizar las condiciones de crecimiento después de la transfección para células NS-0. En una realización, los suplementos de crecimiento pueden comprender, pero no se limitan a, albúmina de suero, interleuquina-6, insulina, selenito sódico, piruvato sódico, y etanolamina,

Se puede usar cualquier versión apropiada de albúmina de suero, disponible en el mercado que incluye, pero no se limita a, albúmina de suero bovino (BSA), fracción v de albúmina de suero bovino, y albúmina de suero humano completo. En ciertas realizaciones, la albúmina de suero puede ser sin ácido graso, en lugar de sin modificar, con el fin de eliminar los posibles complejos de colesterol-albúmina de suero que pueden suministrar el lípido a células en crecimiento. La BSA sin ácido graso está disponible en numerosas compañías que incluyen, por ejemplo, Research Organics, Inc., Cleveland, OH. La concentración final de este componente puede incluir, pero no se limita a, un intervalo de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 % en medio de selección, más específicamente, aproximadamente un 0,2%, aproximadamente un 0,5%, aproximadamente un 1,0%, aproximadamente un 1,5%, aproximadamente un 2,0 % o más hasta aproximadamente un 5,0 %. En una realización específica, la concentración final de albúmina de suero puede ser aproximadamente 1 % en medio de selección.

Otro suplemento de crecimiento que se puede usar para optimizar las condiciones de crecimiento incluye interleuquina-6. En una realización, se puede usar IL-6 humana recombinante (Promega Corp., Madison, WI). La concentración final de IL-6 puede incluir, pero no se limita a, un intervalo de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 9 ng/ml en medio de selección, más específicamente, aproximadamente 2 ng/ml, aproximadamente 3 ng/ml, aproximadamente 4 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 6 ng/ml o más, hasta aproximadamente 9 ng/ml. En una realización específica, la concentración final de IL-6 puede ser aproximadamente 5 ng/ml en medio de selección. Las concentraciones de IL-6, tal como rhIL-6, se pueden ajustar de lote a lote, si fuera necesario, para tener como diana la CE⁵⁰ informada por el fabricante para la citoquina.

El cóctel de suplementos de crecimiento puede incluir adicionalmente insulina, específicamente, insulina humana recombinante (RayBiotech, Inc., Norcross, GA). La concentración final de este componente puede incluir, pero no se limita a, un intervalo de aproximadamente 5 mg/l a aproximadamente 15mg/l en medio de selección, más específicamente, aproximadamente 6 mg/l, aproximadamente 7 mg/l, aproximadamente 8 mg/l, aproximadamente 9 mg/l, aproximadamente 10 mg/l, aproximadamente 11 mg/l o más, hasta aproximadamente 15 mg/l. En una realización específica, la concentración final de insulina puede ser aproximadamente 10 mg/l en medio de selección. El selenito sódico también se puede usar para optimizar las condiciones de crecimiento (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). La concentración final de este suplemento puede incluir, pero no se limita a, un intervalo de aproximadamente 5.0 |jg/l a aproximadamente 8,0 jg/l en medio de selección, más específicamente aproximadamente 5,5 jg/l, aproximadamente 6,0 jg/l, aproximadamente 6,5 jg/l, aproximadamente 7,0 jg/l o más, hasta aproximadamente 8.0 jg/l. En una realización específica, la concentración final de selenito sódico puede ser aproximadamente 6,7 jg/l en medio de selección.

En otras realizaciones, el piruvato sódico se puede usar como un suplemento de crecimiento (SAFC Biosciences, Inc., Lenexa, KA). La concentración final de piruvato sódico puede incluir, pero no se limita a, un intervalo de aproximadamente 0,01 g/l a aproximadamente 0,3 g/l en medio de selección, más específicamente, aproximadamente 0,05 g/l, aproximadamente 0,1 g/l, aproximadamente 0,15 g/l o más, hasta aproximadamente 0,3 g/l. En una realización específica, la concentración final de piruvato sódico puede ser aproximadamente 0,11 g/l en medio de selección.

El cóctel de suplementos de crecimiento puede incluir además etanolamina (Sigma-Aldrich® Co., St. Louis, MO). La concentración final de este suplemento puede incluir, pero no se limita a, un intervalo de aproximadamente 0,5 mg/l a aproximadamente 3,5 mg/l, más específicamente, aproximadamente 1,0 mg/l, aproximadamente 1,5 mg/l, aproximadamente 2,0 mg/l, aproximadamente 2,5 mg/l o más, hasta aproximadamente 3,5 mg/l. En una realización específica, la concentración final de etanolamina puede ser aproximadamente 2,0 mg/l en medio de selección. En una realización específica, el cóctel de suplementos de crecimiento puede comprender BSA sin ácido graso (0,1 %-5 %), rhlL-6 (1 ng/ml-9 ng/ml), insulina humana recombinante (5 mg/l-15 mg/l), selenito sódico (5 pg/l-8 pg/l), piruvato sódico (0,01 g/l-0,3 g/l), y etanolamina (0,5 mg/l-3,5 mg/l) (concentraciones finales en medio de selección). En otra realización específica, el cóctel de suplementos de crecimiento puede comprender BSA sin ácido graso (1 %-5 %), rhlL-6 (0,5 pg/ml), insulina humana recombinante (10 mg/l), selenito sódico (6,7 pg/l), piruvato sódico (0,11 g/l), y etanolamina (2 mg/l) (concentraciones finales en medio de selección). Además en otra realización, el cóctel de suplementos de crecimiento puede comprender BSA sin ácido graso (1 %), rhlL-6 (0,5 ng/ml), insulina humana recombinante (10 mg/l), selenito sódico (6,7 pg/l), piruvato sódico (0,11 g/l), y etanolamina (2 mg/l) (concentraciones finales en medio de selección).

En otra realización, los suplementos de crecimiento pueden comprender BSA sin ácido graso, rhlL-6, insulina humana recombinante, selenito sódico, piruvato sódico, etanolamina, y ningún otro suplemento de crecimiento. Además en una realización, los suplementos de crecimiento pueden comprender BSA sin ácido graso, rhlL-6, insulina humana recombinante, selenito sódico, piruvato sódico, etanolamina, y ninguna otra sustancia implicada causada generalmente en el crecimiento de células cultivadas. En una realización alternativa, los suplementos de crecimiento pueden comprender BSA sin ácido graso, rhIL-6, insulina humana recombinante, selenito sódico, piruvato sódico, etanolamina, y ninguna otra sustancia encontrará generalmente en el suero. Además en otra realización, los suplementos de crecimiento pueden comprender BSA sin ácido graso, rhlL-6, insulina humana recombinante, selenito sódico, piruvato sódico, etanolamina, cualquier sustancia usada generalmente para reconstituir cualquiera de los suplementos de crecimiento que se han mencionado anteriormente incluyendo agua, y ninguna otra sustancia en absoluto.

IV Kits para Producir Proteínas Heterólogas

La presente invención proporciona además kits para venta comercial. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender un vector, una pluralidad de células y suplementos de crecimiento. El vector puede comprender una secuencia que codifica una enzima en la ruta bioquímica para la biosíntesis de esterol de mamífero, tal como por ejemplo, 3-KSR, útil para la selección de células transfectadas con el vector. Los usuarios del kit pueden clonar un gen diana en el vector usando una enzima(s) de restricción apropiada(s). En ciertas realizaciones, las células son auxotróficas para el colesterol. En una realización, las células que se proporcionan en el kit ya pueden estar adaptadas para crecer en medios químicamente definidos. En otra realización, las células que se proporcionan en el kit ya pueden estar adaptadas para crecer en medio sin suero, químicamente definido. Como respuesta a los requisitos regulatorios, las células se pueden obtener a partir de un banco de células de trabajo que se podría determinar como libre de agentes inesperados.

En otra realización, el kit puede comprender suplementos de crecimiento, como se describe en el presente documento, que apoyan el crecimiento de células, que incluyen, pero no se limitan a, células NS-0, NS-1 y CHO-215. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender suplementos de crecimiento que soportan el crecimiento de células en medios sin suero, medios sin proteínas, medios químicamente definidos, o cualquier combinación de los mismos, incluyendo medios químicamente definidos/sin suero. En una realización específica, el kit puede comprender suplementos de crecimiento, como se describe en el presente documento, que apoyan el crecimiento de células CD-SFM NS-0 a bajas densidades de siembra, por ejemplo, durante la fase de post-transfección y clonación celular de dilución limitante (LDCC).

Además, los kits de la presente invención se pueden usar para expresar cualquier proteína heteróloga de interés. De hecho, la naturaleza y la fuente de la proteína heteróloga expresada en las células, líneas celulares y cultivos celulares de la presente invención no están limitadas. Por ejemplo, el plásmido p3-KSR se puede modificar mediante ingeniería para la expresión de uno o al menos dos genes. Lo primero se puede aplicar para expresión de proteínas independientes, tal como una hormona de cadena única, y lo último se refiere a la expresión de una molécula de cadena doble, tal como un anticuerpo.

En una realización específica de la presente invención, una molécula de anticuerpo recombinante se puede expresar usando el vector que contiene los genes necesarios. Véase, por ejemplo, la Figura 3. Los anticuerpos son proteínas complejas formadas por múltiples componentes, específicamente dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En una realización, el vector p3-KSR se puede modificar por ingeniería para incluir genes completos de cadenas pesadas y ligeras para Inmunoglobulina G (IgG) humana clonada en tándem. La expresión de proteínas de esta construcción recombinante da como resultado la secreción de un anticuerpo monoclonal que posteriormente se puede aislar a partir del cultivo celular y se puede purificar para uso comercial. Los anticuerpos monoclonales humanos son muy adecuados para su aplicación como agentes terapéuticos en seres humanos porque son específicos de un solo antígeno y se pueden usar para que se dirijan a patógenos, órganos o tumores específicos. Sin elaboración adicional, se cree que alguien con experiencia en la materia, usando la descripción anterior, puede usar la presente invención en toda su extensión. Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos, y no limitan el resto de la divulgación en modo alguno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Demostración de Selección de Colesterol de la Línea Celular de Mieloma Murino NS-0 en Medio Sin Suero Químicamente Definido

La línea celular de mieloma murino NS-0 se adaptó a dos formulaciones independientes de medio sin suero químicamente definido (CD-SFM) para someter a ensayo la idoneidad de 3-KSR como marcador de selección en este fondo celular y en las condiciones de SFM desde el inicio. Las células NS-0 se adaptaron a CD-Hibridoma (Invitrogen®) y CDM-4-NS-0 (HyClone®). Para cada una de las líneas celulares NS-0 adaptadas a CD-SFM se generaron bancos de células de acceso (ACB). Se estableció un ensayo para determinar la dependencia de las líneas celulares CD-SFM-NS-0 con respecto al suplemento con colesterol en el medio de crecimiento. Estos ensayos mostraron que 72 horas después de cultivar células CD-SFM-NS-0 en un medio sin colesterol, menos de un 10 % de las células permanecen vivas. En tan solo 5 días después del cultivo en CD-SFM, no se pudieron detectar células vivas mediante el análisis de exclusión con Azul de Tripano. Además, no se observó una fase de crecimiento intermitente de estas células en ausencia de colesterol, lo que revela la sensibilidad a la falta de este lípido en el medio de cultivo.

Ejemplo 2: Amplificación por PCR de una 3-Cetosteroide Reductasa Murina (3-KSR) y Clonación de una 3-KSR en un Vector de Expresión

Un gen de 3-cetoesteroide reductasa murina (3-KSR) que codifica 3p-hidroxi-delta(5)-esteroide deshidrogenasa (Hsd3b5) de Mus musculus se amplificó a partir de los ADNc generados a partir de riñones de ratón BALB/c macho adulto. Después de la amplificación por PCR usando oligonucleótidos específicos para la secuencia publicada del Hsd3b5 de 3-KSR murina, una banda distinta de aproximadamente 1,1 kb se detectó mediante electroforesis en gel de agarosa. Esta banda se aisló y se clonó en el vector pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen®), y posteriormente se volvió a clonar en el fondo pBFdhfr.1, en lugar de dhfr. La nueva construcción se denomina pBFksr.1.

La región codificante de 1,1 kb de 3-ksr en pBFksr.1 se confirmó mediante secuenciación de ADN, y su marco de lectura abierto (orf) se comparó con la secuencia publicada. La secuencia determinada coincidió en un 100 % con la 3-cetoesteroide reductasa murina publicada en el NCBI con el número de acceso A49573.

Ejemplo 3: Transfección y Selección de Células NS-0 en Medio de Selección Suplementado Sin Ácido Graso Químicamente Definido

Una construcción pBFksr.1 que contiene un orf de 3-KSR correcto se transfecta en células NS-0 y se selecciona en medio de selección suplementado sin ácido graso químicamente definido. El medio consiste en lo siguiente: CD-Hibridoma (Invitrogen®), Glutamax (2 mM, Invitrogen®), NEAA (aminoácidos no esenciales) (lx, Invitrogen®), BSA sin ácidos grasos (1 %, Calbiochem), IL-6 humana recombinante (5 ng/ml, Promega), Suplemento de Medio Líquido ITS (lx, Sigma-Aldrich). La transfección inicial y la selección se realizan "en masa", en matraces T-75 como sigue a continuación. El día de la transfección, se hace el recuento del cultivo precursor de NS-0 usando el método de exclusión con azul de Tripano para diferenciar entre células vivas y muertas. El cultivo debería ser viable en al menos un 90%. Para cada transfección, se requieren aproximadamente 1 x 107 células. Además de las transfecciones de plásmidos, se debería realizar una transfección "simulada" (sin ADN) para establecer un control negativo. Las células se centrifugan y se lavan resuspendiendo el sedimento celular en 20 ml de medio de transfección sin suero y centrifugando una vez más. Para cada transfección, 1 x 107 células se resuspenden en 700 |jl, de medio de transfección sin suero. La solución de ADN se prepara resuspendiendo 40 j l del ADN de plásmido linealizado purificado en 100 j l de agua estéril destilada. La linealización del ADN se consigue con cualquier endonucleasa de restricción de ADN, comúnmente pero sin limitarse a PvuI (endonucleasa I de restricción de Proteus vulgaris), que restringe pBFksr.1 una vez, en el marco de lectura abierto (orf) de beta-lactamasa. Esta solución de ADN completa se añade a una cubeta de electroporación. Los 700 j l de suspensión celular se añaden a la solución de ADN en la cubeta y se mezclan suavemente mediante pipeteo, evitando la creación de burbujas. La tapa se coloca en la cubeta y la cubeta se coloca en el aparato de electroporación (Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, ^cA) o equivalente). Un solo impulso de 250 voltios, 400 jFd se administra a la cubeta (intensidad de campo de 625 V/cm). Las condiciones óptimas deberían proporcionar un valor constante de tiempo no superior a 8 milisegundos. Las células se añaden a 12 ml de medio de selección suplementado sin ácido graso químicamente definido en un matraz de cultivo celular T-75 y se dejan incubar a 37 °C, CO2 al 5 %, humedad relativa de un 90 % durante la noche.

El cultivo transfectado con pBFksr.1 y seleccionado en medio de selección suplementado sin ácido graso

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una 3-cetoesteroide reductasa como marcador de selección metabólica, y un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo, en la que la célula hospedadora es una célula de mamífero con deficiencia de 3-cetoesteroide reductasa y es auxotrófica para el colesterol.

2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la que dicha 3-cetoesteroide reductasa es una 3-cetoesteroide reductasa murina.

3. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la que dicho polinucleótido que codifica dicha reductasa comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, o codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

4. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la que dicho vector es un vector de expresión de ADN recombinante.

5. La célula hospedadora de la reivindicación 4, en la que el vector de expresión de ADN recombinante comprende además al menos una primera unidad de transcripción para el polinucleótido que codifica el polipéptido heterólogo, y en el que dicha unidad de transcripción está bajo el control del promotor del citomegalovirus humano.

6. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la que dicha célula hospedadora es una célula de mieloma de ratón NS-0.

7. Un kit que comprende:

- un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una 3-cetoesteroide reductasa como marcador de selección metabólica;

- una pluralidad de células hospedadoras de mamífero con deficiencia de 3-cetoesteroide reductasa que son auxotróficas para el colesterol;

- medio sin suero, químicamente definido;

- suplementos de crecimiento que soportan el crecimiento de dicha pluralidad de células hospedadoras a bajas densidades de siembra y clonales; y

- al menos un protocolo para usar dicho kit.

8. El kit de la reivindicación 7, en el que dicha 3-cetoesteroide reductasa es una 3-cetoesteroide reductasa murina.

9. El kit de la reivindicación 7, en el que dicho polinucleótido que codifica dicha reductasa comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, o codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

10. El kit de la reivindicación 7, en el que dicho vector es un vector de expresión de ADN recombinante.

11. El kit de la reivindicación 10, en el que el vector de expresión de ADN recombinante comprende además al menos una primera unidad de transcripción para un producto génico, en el que dicha unidad de transcripción está bajo el control del promotor del citomegalovirus humano.

12. El kit de la reivindicación 7, en el que dicha célula hospedadora es una célula de mieloma de ratón NS-0.

13. El kit de la reivindicación 7, en el que dichos suplementos de crecimiento comprenden al menos uno de BSA sin ácido graso, rhlL-6, insulina humana recombinante, selenito sódico, piruvato sódico, y etanolamina.

14. El kit de la reivindicación 7, en el que dichos suplementos de crecimiento comprenden concentraciones finales en el medio sin suero, químicamente definido de un 0,1 % a un 5 % de BSA sin ácido graso, de 1 ng/ml a 9 ng/ml de rhIL-6, de 5 mg/ml a 15 mg/l de insulina humana recombinante, de 5 p.g/l a 8 p.g/l de selenito sódico, de 0,01 g/l a 0,3 g/l de piruvato sódico, y de 0,5 mg/l a 3,5 mg/l de etanolamina.

15. El kit de la reivindicación 7, en el que dichos suplementos de crecimiento comprenden concentraciones finales en el medio sin suero, químicamente definido de un 1 % de BSA sin ácido graso, 5 ng/ml de rhIL-6, 10 mg/l de insulina humana recombinante, 6,7 pg/l de selenito sódico, 0,11 g/l de piruvato sódico, y 2,0 mg/l de etanolamina.

16. Un método para seleccionar células de mamífero que tienen la capacidad de sobrevivir en un medio que carece de colesterol y tienen la capacidad de expresar una proteína heteróloga que comprende:

- transfectar células de mamífero con deficiencia de 3-cetoesteroide reductasa que son auxotróficas para el colesterol con un vector de expresión, comprendiendo dicho vector de expresión:

- un polinucleótido que codifica una 3-cetoesteroide reductasa como marcador de selección metabólica, y - al menos un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga; y

- seleccionar las células que tienen la capacidad de sobrevivir en el medio que carece de colesterol.

17. El método de la reivindicación 16, en el que dichas células son células de mieloma de ratón NS-0.

18. El método de la reivindicación 17, en el que dicho medio está químicamente definido y sin suero o químicamente definido.

19. Un método para expresar una proteína heteróloga que comprende:

- transfectar una célula de mamífero con deficiencia de 3-cetoesteroide reductasa que es auxotrófica para el colesterol con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una 3-cetoesteroide reductasa como marcador de selección metabólica, en el que el vector de expresión comprende además un polinucleótido que codifica la proteína heteróloga;

y

- cultivar la célula transfectada en un medio sin colesterol en condiciones para proporcionar la expresión de dicha proteína heteróloga.

20. El método de la reivindicación 19, en el que dichas células son células de mieloma de ratón NS-0.

21. El método de la reivindicación 19, en el que dicho medio está químicamente definido y sin suero o químicamente definido.