CN101193918B

CN101193918B - 用于转染细胞代谢性选择的组合物和方法

Info

Publication number: CN101193918B
Application number: CN200680017290.4A
Authority: CN
Inventors: 路易斯·布兰科; 达里尔·B·桑佩
Original assignee: Biofactura Inc
Current assignee: Biofactura Inc
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2006-05-18
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2026-05-18
Also published as: WO2006125126A3; AU2006247143B2; EP1910421A4; CN101193918A; US8076102B2; DK1910421T3; ES2730216T3; EP1910421B1; IL187403A0; US20100028940A1; KR20080003447A; WO2006125126A2; JP2008539792A; CA2608913A1; SG195394A1; BRPI0609808A2; KR101451117B1; EP1910421A2; AU2006247143A1

Abstract

本发明涉及新的标记选择载体以及使用这些载体在真核细胞内稳定表达基因产物的方法。更具体地说，本发明提供了组合物和利用任意酶在真核甾醇/胆固醇生物合成途径中有用的方法，例如3‑甾酮还原酶作为一种选择转染细胞的代谢选择标记。在一个实施方案中，该方法包括转染细胞，其为具有载体编码3‑甾酮还原酶和至少一种异源蛋白的胆固醇缺陷型细胞，并选择缺乏胆固醇培养液中能够存活的选择细胞和/或在化学确定成分和/或无血清培养液中这些细胞内产生异源蛋白。

Description

用于转染细胞代谢性选择的组合物和方法

相关申请的交叉引用

该申请在基于美国专利法35.U.S.C.§119(e)上要求对2005年5月18日申请的美国临时申请系列号60/681,969的优先权，在此全部收录作为参考。

技术领域

本发明涉及新的标记选择载体以及使用这些载体在真核细胞内稳定表达基因产物的方法。

背景技术

哺乳细胞体外培养技术的发展对生物研究有着革命性的意义。细胞培养技术可以用来评价处于发展前期的药物的毒性或者效应，药物发展前期使用人体临床试验具有很高的风险。细胞培养技术也可用来产生治疗用途的复杂人体蛋白例如单抗，也可用做细胞基础上治疗的平台。这些细胞培养技术包括成人和胚胎干细胞的体外培养。另外，在体外细胞培养系内引入杂和性重组DNA是科学家探索动物系统试验的有力辅助工具。

最近，对于用来表达生物分子进而产生治疗用药物的细胞系可能存在的污染问题的调控需求更加重要。整个生物技术业不再使用含有胎牛血清的培养液，从而达到避免由未来生物手段引起的潜在动物病原体或者可能治病的动物蛋白被引入人体的可能性。无血清培养液日益成为体外培养哺乳细胞的标准程序，特别是对那些用于基因表达和蛋白质纯化的制备体系。

NS-0小鼠骨髓瘤细胞系是一个常用的蛋白质表达系统，例如Lonza′s GS基因表达系统(Lonza Group，Basel，Switzerland)。这个系统利用了在细胞液中不添加谷氨酸的情况下NS-0细胞本身不能产生存活所必需的谷氨酸这一特性，使用谷氨酸合成酶作为质粒载体细胞转染的选择标记。

NS-0细胞也能产生胆固醇营养缺陷，从而导致细胞培养液中必须同时加入胆固醇和谷氨酸以支持本细胞系的生长。在细胞培养液内加入胆固醇是一个复杂的耗时巨大的过程，这是因为脂质必须与糖分子(例如环糊精)相互偶联以增加其在水溶液中的溶解度。另外，偶联过程本质上不稳定，因此会导致添加胆固醇的生长液的半衰期十分短暂。另外，当使用化学成分确定的无血清的细胞培养液而非含有胎牛血清的培养液培养胆固醇营养缺乏型细胞系时，胆固醇沉淀的情况更易发生。最终，胆固醇因为其内在的多聚体亲和性而不易滤过小孔无菌滤膜例如PES，从而导致在最终滤过的培养中胆固醇含量显著下降。这一现象导致添加胆固醇细胞培养液制备批次间的不一致性。当在细胞培养液内直接加入胆固醇而不经过过滤会产生引入污染的可能性例如异源物质或/及内毒素。

NS-0细胞产生胆固醇营养缺乏的分子机制最近已经被确证(EuropeanCollection of Cell Cultures-ECACC，No.85110503，Deposited by Dr J Jarvis，MRCLaboratory of Molecular Biology，Cambridge，73B(3)Methods in Enzymology(1981)。此细胞系不能表达胆固醇体内生物合成通路中一个关键的蛋白酶。这个称作3-酮固醇还原酶(3-KSR)的蛋白酶属于beta-羟基固醇脱氢酶家族的一个成员，是由一个特定基因所编码的。3-KSR能够催化酵母甾酮转变为酵母甾醇的化学反应，酵母甾醇是胆固醇的前体Marijanovic等人，17(9)MOL.ENDOCRINOL.1715-25(2003)。

就NS-0细胞的胆固醇营养缺乏问题，一系列不同的技术手段被提议，以改善制备细胞培养程序的效率以及减弱胆固醇在水性培养液中低溶解能力的局限性。其中的一个方法是使用植物来源或者合成的脂质代替动物来源的脂质加入细胞培养液Gorfien等人，16(5)BIOTECHNOL.PROG.682-7(2000)。另外的一个方法是改造NS-0细胞使之能够过量表达3-KSR从而逆转其在细胞内的不足从而使得细胞在未加入胆固醇的细胞培养液中正常生长Seth等人，121(2)J.BIOTECHNOL.241-52(2006)。最后，研究人员研究了NS-0细胞内3-KSR活性缺乏的分子机制，试图通过对关键上游调控区域去甲基化，消除其对3-KSR基因的转录抑制能力从而使3-KSR的水平恢复正常Seth等人，93(4)BIOTECHNOL.BIOENG.820-27(2006)。

但是，化学成分确定的无血清培养液中在生物技术公司使用表达载体制备能够表达杂和性分子的稳定细胞系中仍然十分必要。另外，能够直接使用而无须加入外源性胆固醇的化学成分确定的无血清培养液是非常理想的细胞培养液。本发明提供了一个含有基因或者核苷酸序列的表达载体，这个基因或者多核苷酸序列能够编码真核细胞固醇或者胆固醇体内合成通路的一个蛋白酶，从而使得细胞能够在化学成分确定或/及无血清细胞培养液内生长和体外培养。如果本表达载体也包含一个编码杂和性蛋白，多肽或者单肽的基因或者多核苷酸序列，本载体可被用做代谢选择标记从而筛选出含有编码杂和性蛋白基因的被转染细胞，从而在化学成分确定或/及无血清细胞培养液产生杂和性蛋白。

发明内容

本发明包括一种载体，其包含编码真核细胞甾醇生物合成途径酶的多核苷酸，其生物学活性片段或其生物学上活性变体和编码异源多肽的多核苷酸。本发明进一步包括使用该载体转化的宿主细胞。

本发明还包括一种试剂盒(kit)，其包含：一种载体，其包含含有编码真核细胞类固醇生物合成途径酶的多核苷酸，其生物学活性片段或其生物活性变体和编码异源多肽的多核苷酸的载体；任意一种或多种：胆固醇缺陷型的大量宿主细胞；化学限定且无血清的培养液；帮助在低播种和克隆密度的大量宿主细胞的生长；和至少一种应用试剂盒的协议(protocol)。

本发明另外包括可以使选择细胞在无胆固醇培养液中存活的方法，包括转染真核细胞，即包含在多核苷酸的胆固醇缺陷型载体编码真核细胞类固醇生物合成途径酶，其生物学活性片段或其生物学上活性变体，以及任意至少一种编码异源蛋白的多核苷酸；在缺乏胆固醇培养液中存活的选择细胞。

本发明进一步包含一种获得在缺乏胆固醇培养液中存活并生产异源蛋白细胞的方法：转染真核细胞，即如这里描述的胆固醇缺陷型载体包含一种酶，例如3-KSR，以及任意至少一种编码异源蛋白的多核苷酸；在缺乏胆固醇培养液中存活的选择细胞。

附图简述

图1A-1J显示了真核和特异性的生物合成途径，通过3-KSR基因的产物部分调节哺乳动物类固醇的生物合成。

图2描述了p3-KSR表达载体的质粒图谱。

图3 p3-KSR:mAbVL:mAbVH表达载体先后进行完整人抗体轻和重链基因克隆的质粒图谱。

图4描述了p3-KRS:rec_gene的质粒图谱，其是重组细胞基因构件(rec_gene)克隆为p3-KSR的例子。

图5描述了pBFKSR.1HUMAB，其提供了在p3-KSR表达载体的多个克隆区域中6个可能的抗体基因盒表达方向。

详细描述

容易理解本发明不局限于这里描述的可能改变的具体方法和组分。同时容易理解这里使用术语仅仅用于描述的具体实施方案的目的，将不限定于本发明的范围。必须注意到除非上下文清楚定义之外，如这里使用和在附加权利要求中单数的形式“a”、“an”和“the”包括两个以上的含义。因此，例如“一个多核苷酸”的含义是本领域技术人员等公知的一种或多种多核苷酸和包括其同等物的含义。术语“载体”是DNA分子自我复制和含义，同时这里涉及作为一种“质粒”或“质粒克隆载体”，其是一种用于重组DNA实验的质粒，如一种外来的或异源的DNA的受体。异源蛋白、多肽或肽意指包括用于治疗症状或疾病或作为试剂的任意蛋白质。

除非另有定义，这里使用的所有技术性和科学性术语与本领域普通技术人员对本发明内容的一般理解具有相同的意思。尽管与这里那些描述的任意方法和原料相似或相同，所描述的具体的方法、装置和原料可用于本发明的实验或测试。

本发明提供了用于转染细胞代谢性选择的组合物和方法，即通过利用一种哺乳动物类固醇生物合成途径的酶作为酶中缺乏真核细胞的一种代谢性选择基因。具有这些特性的真核细胞用于产生异源分子如肽、多肽、蛋白或细胞不正常产生的其它分子。具体地，本发明利用3-甾酮还原酶(3-KSR)作为一种代谢性选择基因用于缺乏3-KSR真核细胞系的产生，其用于在缺乏外原性的胆固醇或真核胆固醇生物合成途径中3-KSR下游的任意胆固醇前体的培养液中产生异源的分子如肽、多肽或蛋白。参见图1，其提供了通过3-KSR部分调节的哺乳动物类固醇生物合成的生物化学途径。

更具体地说，本发明提供了如图1提供的编码在哺乳动物类固醇生物合成途径酶的多核苷酸和多肽，例如这里该酶是3-KSR，表达该酶的载体如3-KSR，缺乏该酶的细胞系如3-KSR，用于转染步骤的细胞培养液和生长因子，以及用于本发明商业性开发的试剂盒。

本发明包括一种载体，其包含编码真核细胞类固醇生物合成途径酶的多核苷酸，其生物学活性片段或其生物学上活性变体，以及一种编码异源蛋白的多核苷酸。更具体地说在该载体中的酶包含3-甾酮还原酶(3-KSR)，更具体地说是小鼠的3-KSR。编码3-KSR的具体有代表性的多核苷酸包含SEQ ID NO：1--其编码由SEQ ID NO：3代表的氨基酸顺序；并且包含SEQ ID NO：2--其编码由SEQ ID NO：4代表的氨基酸顺序。

如上所述的载体优选重组DNA表达载体，其进一步任意包含至少用于产物基因的第一转录单元，其转录单元由人细胞巨化病毒启动子控制。表达载体中其它单元与元件的具体情况在这里详细描写。

本发明进一步包括用如上所述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞是本领域技术人员公知的一种真核细胞，其包括原生生物、真菌、动物和植物。因此，真菌、植物和哺乳动物细胞指的是本发明包括的如适当的宿主细胞。宿主细胞优选胆固醇缺陷型细胞。本发明使用的具体宿主细胞是NS-0、NS-1和CHO-215细胞等，更具体地是NS-0小鼠骨髓瘤细胞。

本发明同时包括一种试剂盒，其包含：一种载体，其包含含有编码真核细胞类固醇生物合成途径酶的多核苷酸，其生物学活性片段或其生物学上活性变体和编码异源多肽的多核苷酸的载体；任意一种或多种：胆固醇缺陷型的大量宿主细胞；化学成分确定的无血清培养液；帮助在低播种和克隆密度的大量宿主细胞的生长；和至少一种应用试剂盒的协议。如上所述，酶优选为3-KSR，更优选具有包含载体的小鼠3-KSR，例如，编码酶的有用的多核苷酸包含SEQ ID NO：1和SEQID NO：2。编码酶氨基酸序列的多核苷酸分别包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。试剂盒中的载体优选重组DNA表达载体，其进一步任意包含至少用于产物基因的第一转录单元，其转录单元由人细胞巨化病毒启动子控制。

试剂盒中的宿主细胞优选NS-0、NS-1和CHO-215细胞等，更优选NS-0小鼠骨髓瘤细胞，它们适合于在化学上定义的无血清培养液和/或化学上定义的培养液中培养。

试剂盒进一步可任意包含生长因子，其包含无脂肪酸的牛血清白蛋白、重组细胞人白细胞间介素-t(rhIL-6)、重组细胞人胰岛素、亚硒酸钠、丙酮酸钠和乙醇胺中的至少一种。生长因子更优选包含最终浓度为约0.1％到约5％的无脂肪酸牛血清白蛋白、约1ng/mL到约9ng/mL的rhIL-6、约5mg/mL到约15mg/L重组细胞人胰岛素、约5μ/L到约8μ/L亚硒酸钠、约0.01g/L到约0.3g/L丙酮酸钠和约0.5mg/L到约3.5mg/L乙醇胺的选择培养液。生长因子更优选包含最终浓度为约1％的无脂肪酸牛血清白蛋白、约5ng/mL的rhIL-6、约10mg/L重组细胞人胰岛素、约6.7μ/L亚硒酸钠、约0.11g/L丙酮酸钠和约约2.0mg/L乙醇胺的选择培养液。

本发明进一步包括细胞培养因子的组合物，包含最终浓度为约0.1％到约5％的无脂肪酸牛血清白蛋白、约1ng/mL到约9ng/mL的rhIL-6、约5mg/mL到约15mg/L重组细胞人胰岛素、约5μ/L到约8μ/L亚硒酸钠、约0.01g/L到约0.3g/L丙酮酸钠和约0.5mg/L到约3.5mg/L乙醇胺的选择培养液。另外，本发明也包括细胞培养因子组合物，包含最终浓度为约1％的无脂肪酸牛血清白蛋白、约5ng/mL的rhIL-6、约10mg/L重组细胞人胰岛素、约6.7μ/L亚硒酸钠、约0.11g/L丙酮酸钠和约约2.0mg/L乙醇胺的选择培养液。

此外，本发明选择细胞在无胆固醇培养液中存活的方法，包括：转染真核细胞，即包含在多核苷酸的胆固醇缺陷型载体编码真核细胞甾醇生物合成途径酶，其生物学活性片段或其生物学上活性变体，以及任意至少一种编码异源蛋白的多核苷酸；在缺乏胆固醇培养液中存活的选择细胞。更优选的宿主细胞为NS-0、NS-1和CHO-215细胞等，优选的细胞为NS-0小鼠骨髓瘤细胞，培养液和无血清培养液是化学确定成分的。在该方法中有用的酶包含3-KSR。

本发明进一步包括为了获得能够在无胆固醇培养液中存活并产生异源蛋白的细胞的方法，包括转染真核细胞，即包含在多核苷酸的胆固醇缺陷型载体编码真核细胞甾醇生物合成途径酶，和至少一种编码异源蛋白的多核苷酸；以及在缺乏胆固醇培养液中存活的选择细胞。如以上所述，该细胞为胆固醇缺陷型细胞，优选为NS-0、NS-1和CHO-215细胞，更优选为NS-0小鼠骨髓瘤细胞，它们可以在化学上定义的无血清培养液和/或化学上定义的培养液中培养。

本发明进一步包括一种本文描述的细胞培养系统中生产异源蛋白细胞的方法，包含：转染真核细胞，即包含在多核苷酸的胆固醇缺陷型载体编码真核细胞甾醇生物合成途径酶，其生物学活性片段或其生物学上活性变体，以及任意至少一种编码异源蛋白的多核苷酸；在产生异源蛋白的条件下培养细胞。该方法进一步包含使用本领域技术人员公知的离析、分离或纯化技术来获得异源蛋白。该细胞为胆固醇缺陷型细胞，优选NS-0、NS-1和CHO-215细胞，更优选为NS-0小鼠骨髓瘤细胞，它们可以在化学上定义的无血清培养液和/或化学上定义的培养液中培养。

本发明进一步包括，更具体地说一种表达异源蛋白的方法，其包含培养一种具有包含编码3-甾酮还原酶和至少一种异源蛋白载体的转染细胞，其在缺乏胆固醇条件下产生异源蛋白，其中优选上述的细胞和培养液。

I.3-甾酮还原酶

本发明利用任意真核生物的3-KSR作为代谢性选择基因用于产生异源蛋白。在一个实施方案中，可以使用小鼠的3-KSR，具体地是3β-胆固醇：NADP+3-氧化还原酶，也称作HSD3β5(NCBI核苷酸登记号L41519)，其具有的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO：1)：

ATGCCTGGAT GGAGCTGCCT GGTGACAGGA GCAGGAGGGT TTCTTGGCCA

GAGGATTGTC CGAATGTTGG TGCAGGAGGA AGAGTTGCAG GAGATCAGAG

CCCTGTTCAG GACCTTCGGT CGAAAACATG AAGAGGAATT GTCCAAGCTG

CAGACAAAGG CCAAGGTGAG AGTACTGAAG GGAGACATTC TGGATGCCCA

ATGCCTGAAG AGAGCCTGCC AGGGCATGTC TGCTGTCATC CACACCGCTG

CTGCTATTGA CCCCCGTGGT GCCGCTTCCA GACAGACCAT CCTAGATGTC

AATCTGAAAG GTACTCAGCT CCTACTGGAT GCTTGTGTGG AAGCCAGTGT

GCCAACATTC ATCTACAGCA GCTCAGTGCT TGTGGCTGGA CCAAATTCCT

ACAAGGAGAT CATCCTGAAT GCCCATGAGG AAGAGCATCA TGAAAGCACA

TGGCCTAACC CATACCCATA CAGCAAAAGG ATGGCTGAGA AGGCAGTGCT

GGCAACAAAT GGGAGACTCC TGAAAAATGG TGGCACTTTG CATACTTGTG

CCTTAAGACT CCCTTTCATC TATGGGGAAG AATGCCAAGT CACTTCAACC

ACTGTGAAAA CAGCACTGAA GAACAACAGC ATAATTAAGA AAAATGCCAC

ATTCTCCATC GCCAACCCAG TGTATGTGGG CAATGCAGCC TGGGCTCACA

TTCTGGCTGC CAGGAGCCTA CAGGACCCCA AGAAGTCCCC AAGCATCCAA

GGACAGTTCT ATTACATCTC TGATAACACC CCTCACCAAA GCTATGATGA

TTTAAATTAC ACCCTGAGCA AGGAGTGGGG CCTCTGCCTT GATTCTGGCT

GGAGGCTTCC TCTGTCCCTG CTTTACTGGC TTGCCTTCCT GCTGGAAACT

GTGAGCTTCC TGCTACGTCC AGTTTACAAC TATAGGCCAC CCTTTACCCG

CCTCTTGATC ACAGTGCTAA ATAGCGTGTT TACCATTTCC TATAAGAAAG

CTCAGCGCGA TCTAGGCTAT CAGCCACTTG TCAGCTGGGA GGAAGCCAAG

CAAAAAACCT CAGAGTGGAT TGGAACACTA GTGAAGCAGC ACAGGGAGAC

ACTACACAAA AAGTCACAGT GA

SEQ ID NO：1编码一种具有如下氨基酸序列的特异3-KSR：

小鼠HSD3b5氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：

MPGWSCLVTGAGGFLGQRIVRMLVQEEELQEIRALFRTFGRKHEEELSKLQTKAKVRVLK

GDILDA-QCLKRACQGMSAVIHTAAAIDPRGAASRQTIIiDVNLKGTQLLLDACVEASVP

TFIYSSSVLVAGPNSYKEIILNAHEEEHHESTWPNPYPYSKRMAEKAVIiATNGRLLKNG

GTLHTCALRLPFIYGEECQPVYVGNAAWAHIIJ-ARSLQDPKKSPSIQGQFYYISDNTPH

QSYDDLNYTLSKEWGLCLDSGVMLPLSLLYWLAFLLETVSFLLRPVYNYRPPFTRLLITV

LNSVFTISYKKAQRDLGYQPLVSWEEAKQKTSEWIGTLVKQHRETLHK

KSQ*

另外，使用基因编码其它功能的酶包括但不限于17β-羟甾醇脱氢酶类型7(Hsd17b7)、3β-羟基-delta(5)-类固醇脱氢酶(Hsd3b5)、大鼠3β-HsdIJI、小鼠3β-HsαIV、小鼠3βHsdV和仓鼠3β-Hsd111，其公知的功能是唯一作为3-酮类固醇还原酶。具体地，一种多核苷酸包含SEQ ID NO：2，也称为胆固醇(17β)脱氢酶7(核苷酸登记号NCBI：BCO11464)，包含以下小鼠HSD17b7核苷酸序列，其如下：

ATGCGGAAGG TGGTTTTGAT CACCGGGGCG AGCAGTGGCA TTGGGCTAGC

CCTTTGCGGT CGACTGCTGG CAGAAGACGA TGACCTCCAC CTGTGTTTGG

CGTGTAGGAA CCTGAGCAAA GCAAGAGCTG TTCGAGATAC CCTGCTGGCC

TCTCACCCCT CCGCCGAAGT CAGCATCGTG CAGATGGATG TCAGCAGCCT

GCAGTCGGTG GTCCGGGGTG CAGAGGAAGT CAAGCAAAAG TTTCAAAGAT

TAGACTACTT ATATCTGAAT GCTGGAATCC TGCCTAATCC ACAATTCAAC

CTCAAGGCAT TTTTCTGCGG CATCTTTTCA AGAAATGTGA TTCATATGTT

CACCACAGCG GAAGGAATTT TGACCCAGAA TGACTCGGTC ACTGCCGACG

GGTTGCAGGA GGTGTTTGAA ACCAATCTCT TTGGCCACTT TATTCTGATT

CGGGAACTGG AACCACTTCT CTGCCATGCG GACAACCCCT CTCAGCTCAT

CTGGACGTCC TCTCGCAATG CAAAGAAGGC TAACTTCAGC CTGGAGGACA

TCCAGCACTC CAAAGGCCCG GAACCCTACA GCTCTTCCAA ATATGCTACC

GACCTCCTGA ATGTGGCTTT GAACAGGAAT TTCAACCAGA AGGGTCTGTA

TTCCAGTGTG ATGTGCCCAG GCGTCGTGAT GACCAATATG ACGTATGGAA

TTTTGCCTCC CTTTATCTGG ACGTTGCTCC TACCCATAAT GTGGCTCCTT

CGCTTTTTTG TAAATGCGCT CACTGTGACA CCGTACAACG GAGCAGAGGC

CCTGGTGTGG CTCTTCCACC AAAAACCGGA GTCTCTTAAT CCTCTGACCA

AATACGCGAG CGCCACCTCG GGATTTGGGA CTAATTACGT CACGGGCCAA

AAGATGGACA TAGATGAAGA CACTGCTGAA AAATTCTATG AGGTCTTACT

GGAGCTGGAA AAGCGTGTCA GGACCACCGT TCAGAAATCG GATCACCCGA

GCTGA

SEQ ID NO：2编码具有如下氨基酸序列的特异3-KSR：小鼠

HSD17b7 a.a.序列(SEQ ID NO：4)：

MRKVVLITGASSGIGI1ALCGRLI1AEDDDLHLCLACRNLSKARAVRDTLLASHPSAEVS

IVQMDVSSLQSWRGAEEVKQKFQRLDYLYLNAGILPNPQFNLKAFFCGIFSRNVIHMFTT

AEGILTQNDSVTADGLQEVFETNLFGHFILIRELEPLLCHADNPSQLIWTSSRNAKKANF

SLEDIQHSKGPEPYSSSKYATDLLNVALNRNFNQKGLYSSVMCPGVVMTNMTYGILPPFI

WTLLLPI1^WLLRFFVNALWTProGAEALVWLFHQKPESLNPLTKYASATSGFGTNYVTG

QKMDIDEDTAEKFYEVLLELEKRVRTTVQKSDHPS*

在另一个实施方案中，任意酶，例如可以使用如3-KSR促进图1描述的在温血动物甾醇生物合成的第一和第二周期中下列前体酶转化：

4-甲基-5α-胆甾-3，8，24-三烯-3β-醇-＞3-KSR-＞3-氧-4α-甲基-5α-胆甾-8，24-二烯-＞3-KSR-＞3β-羟基-4α-甲基-5α-胆甾-8，24-二烯(1st周期)

5α-胆甾-3，8，24-三烯-3β-醇-＞3-KSR-＞3-氧-5α-胆甾-8，24-二烯-＞3-KSR-＞delta-8，24-胆甾二烯-3β-醇(3β-羟基-5α-胆甾-8，24-二烯；酵母甾醇)(2nd周期)

其它可以用于本发明的3-KSRs具体实施例包括其它小鼠(登记号NM_00295、NM010476和BC_012715)、牛(感记号XM_591611)、人(登记号NMJH6371)3-KSRs。

A.3-KSR多核苷酸、其片段和变体

本发明涉及编码任意3-KSR的多核苷酸。本发明关于编码3-KSR多核苷酸的范围包括但不局限于这里提供的任意一个多核苷酸序列中公布的序列；通过在严格条件(高度严格的特别条件)杂交获得从这里描述的生物材料或其它生物来源(例如，小鼠或人来源)的多核苷酸；与提供的多核苷酸相对应的基因；多核苷酸和它们对应基因提供的可变体，特别是保持编码基因产物生物活性的可变体(例如，归于基因产物的生物活性相当于提供的多核苷酸，作为结果基因产物分配到一种蛋白家族和/或蛋白家族群和/或存在于基因产物的识别功能域)。当本发明提供其它预期的3-KSR多核苷酸组合物时，在本发明范围附近和范围内对于本领域普通技术人员来说的显而易见的。如这里使用的，除非明确地说明，术语“多核苷酸”和“核酸”将不限定多核苷酸的长度或结构。

3-KSR多核苷酸可以包含这里提供的任意一个多核苷酸序列中公布的序列。本发明的3-KSR多核苷酸同时包括与天然3-KSR DNA相比序列相似或序列同一的多核苷酸。这包括相关联的5′和3′未转译的序列、启动子和增强子的序列。在低严格条件如在50℃和10XSSC(0.9M盐水/0.09M柠檬酸钠)和在55℃、1XSSC下洗涤，可通过杂交测定具有序列相似性的3-KSR多核苷酸。在严格条件下通过杂交可以测定序列同源性，例如在50℃或更高的温度和0.1XSSC(0.9M盐水/0.09M柠檬酸钠)的条件下。当然，杂交方法和条件为本领域所熟知，所有可选择的方法和条件可用来识别附加的3-KSR多核苷酸。

本发明的3-KSR多核苷酸也包括天然存在的变体3-KSR核苷酸序列(例如，退化变体、等位变体等)。通过这里公开的核苷酸序列杂交公认的变体识别本发明的3-KSR多核苷酸变体，优选在严格条件下的杂交。例如通过使用适当的洗涤条件，可以识别这里描述的3-KSR多核苷酸变体，这里等位变体显示至多约25-30％碱基对(bp)错配，可以包含同样少甚至5-15％或2-5％或1-2％bp错配，以及单个bp错配。

本发明同时包括相当于这里提供的3-KSR多核苷酸序列的同源染色体，这里同源基因的来源可以是任意哺乳动物种属，例如灵长类动物种属，特别是人；啮齿类，例如鼠类；犬类、猫类、牛类、羊类、马类、酵母、线虫等。在哺乳动物种属之间，例如人和小鼠，同源染色体通常对基因或其部分来说具有相当大的序列相似性，例如至少75％序列，通常至少90％，更通常至少95％、96％、97％、98％或99％在核苷酸序列之间同源。根据参比序列可以计算序列相似性，其可以是大的3-KSR序列的亚群，例如，作为一种保守基序、部分编码区、旁侧区等。参比序列通常至少为约18(邻接)nt长度，更通常至少为约30nt长度，可提供完整3-KSR序列用于对照。序列分析的算法为本领域已知，例如Altschul等人在25 NUCLEIC ACIDSRES.3389-3402(1997)中描述的gapped BLAST。

通常，使用常用方法如Smith-Waterman同源性检索算法作为在MPSRCH程序(Accelrys公司，San Diego，CA)的工具，这里描述的3-KSR多核苷酸变体具有大于至少约65％、至少约75％、至少约85％和可以大于至少约90％、95％、96％、98％、99％或更多的序列同源。例如，全球DNA序列同源性大概大于65％是由the Smith-Waterman同源性检索算法使用仿射的空位检索(affine gap search)测定，使用以下检索参数：空位打开罚分，12；以及空位扩充罚分，1。

本发明的3-KSR可以是cDNA或基因组DNA，以及其截断的形式(versions)或片段，特别是编码生物学上活性的或可救援在真核细胞中具有功能性的3-KSR基因产物的片段，其中片段被转染，允许细胞在无胆固醇培养液中生长。cDNA包括所有的核酸，其共用在自然成熟mRNA种属的序列因子的排列，这里序列因子是外显子和3′和5′非编码区域。通常，mRNA种属具有插入内含子的邻接外显子，当通过核内RNA拼接的可移动的，产生了连续的可译框架编码多肽。mRNA种属还可以以外显子和内含子存在，这里通过选择性拼接可除去内含子。

3-KSR基因组序列可以包含在起始密码子和终止密码子之间出现的核酸，如列出序列所定义，包括通常存在于天然染色体中的所有内含子。它可以进一步包含在成熟mRNA中发现的5′和3′非转译区。基因组序列可以进一步包含特异的转录和翻译调节序列，例如启动子、增强子等，包括约1kb，但可能更多DNA在或者5′和3′转录区域末端的侧面基因组。

B.3-KSR多肽、片段和其变体

本发明包括那些通过公开的3-KSR多核苷酸、片段和其变体编码的3-KSR多肽，例如，由于遗传密码的蜕化，核酸与公开的3-KSR多核苷酸序列是不相同的。

3-KSR多肽意指通过所述多核苷酸编码的全长的多肽和通过所述多核苷酸表示的基因以及其部分或片段编码的多肽。3-KSR多肽也包含自然存在于蛋白质的变体，这里这些变体与天然存在的3-KSR蛋白质同源或大体上类似，可以是天然存在的3-KSR蛋白质(例如，人、鼠或其它种属自然表达的所述多肽，通常是哺乳动物种属)中相同或不同种属的起源。通常，3-KSR多肽变体具有至少约80％，通常至少约90％等，通常至少为约95％序列同源性或更高的序列，例如这里描述的3-KSR多肽，具有96％、97％、98％或99％序列同源性，例如通过BLAST 2.0使用如上所述参数。3-KSR多肽变体可以自然或非自然地进行翻译后修饰，例如多肽具有翻译后修饰图案，与翻译后修饰任意预知或实验表征的自然存在3-KSR蛋白不同。

本发明同时包括3-KSR多肽(或其片段)的同源染色体，这里同源染色体与任意种属通常从哺乳动物种属如啮齿类如小鼠、老鼠；家畜如马、奶牛、狗、猫；和人分离。同源染色体可具有至少约35％，通常至少40％等，通常至少约60％的氨基酸序列与这里描述的特异3-KSR蛋白同源，例如这里通过BLAST 2.0算法使用如上所述参数测定序列同源性。

本发明范围内的多肽变体也包含突变体、片段和融合体。突变体可以包含氨基酸取代、加入或删除。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或取代以消除不需要的氨基酸，这样改变了糖基化位点、磷酸化位点或乙酰化位点，或通过取代或删除没有所需功能的一种或多种半胱氨酸残基使错折叠最小化。保守的氨基酸取代是那些保存了一般充电、疏水性/亲水性、和/或氨基酸取代的立体。可以设计变体使得保持或具有提高蛋白的具体区域的生物活性(例如，功能区域和/或与交感序列有关的区域，这里多肽是蛋白家族的一个成员)。为了生产3-KSR变体，可基于可达性(内部对比外部)的氨基酸(参见，例如Go等人，15INT.J.PEPTIDE PROTEIN RES.211(1980))、变体多肽的热稳定性(参见，例如，Querol等人，9 PROT.ENG.265(1996))、想得到的糖基化位点(参见，例如Olsen和Thomsen，137J.GEN.MICROBIOL.579(1991))、想得到的二硫键(参见，例如Clarke等人，32 BIOCHEM.4322(1993)和Wakarchuk等人，7 PROTEIN ENG.1379(1994))、想得到的金属结合基点(参见例如Toma等人，30 BIOCHEM.97(1991)和Haezerbrouck等人，6 PROTEIN ENG.643(1993))和脯氨酸环内想得到的取代(参见例如Masui等人，60 APPL.ENV.MICROBIOL.3579(1994))选择改变氢基酸。美国专利号4,959,314公开了可以生产半胱氨酸衰竭突变蛋白。

3-KSR变体同时包含这里公开的多肽片段，特别是生物学上活性片段和/或相当于功能性区域片段。感兴趣的片段一般为最小约10氨基酸(aa)到至少约15aa长度，通常至少为约50aa长度，可以只要300aa长度或更长的但通常不超过约531aa长度，其中片段具有一个氨基酸碱基，即与通过多核苷酸编码的3-KSR多肽相同，多核苷酸具有这里提供了多核苷酸序列任意一种序列或其同源染色体。遗传密码可用于选择适当的密码子构建对应的变体。特别地，片段包括那些包含3-KSR蛋白的特异性领域或抗原决定基。

通过将适当的核苷酸序列插入核酸或通过肽合成制备3-KSR的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如从3-KSR的氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。假如最终的构造具有想得到的特征，任意缺失、插入和取代的结合可用于达到外形的3-KSR构造。氨基酸变化同时可改变3-KSR的翻译后步骤，例如改变糖基化位点的数目或位置或改变其它翻译后修饰包括乙酰化和磷酸化。

一种有用的方法用于识别3-KSR的某些残基或区域，优选用于诱变定位的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells描述，244 SCIENCE 1081-85(1989)。这里，通过中性的或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚氨基丙酸)识别和替代一个残基或目标残基组(例如，带电残基例如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，使用抗原影响氨基酸的相互作用。那些氢基酸定位显示了对取代功能性的灵敏度，然后通过进一步引入或其它变体在或为取代的位点提纯。因此，当用于引入氨基酸序列变异的位点预先决定时，自然突变本身不必预先决定。例如，为了研究在已给定位点的一个突变的特性，在目标密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，筛查想得到活性的表达3-KSR变体。

氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端熔融范围长度从一个残基到多肽包含一百个或更多残基，以及氨基酸残基单一或多倍的序列内插入。末端插入的例子包括用N-末端蛋氨酰残基插入3-KSR。

另外的变体类型是氨基酸取代变体。这些变体具有在3-KSR蛋白内至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。

在3-KSR蛋白的生物学特性中实际的修饰伴随有选择取代，其在它们的影响维持(i)取代区域内多肽支架的构造，例如作为一种片状或螺旋构造，(ii)在目标位点分子的电荷或疏水性，或(iii)大部分侧链。基于常见的侧-链特性将自然存在的残基分成组：

(1)疏水的：正亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；

(2)中性疏水的：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；

(3)酸性的：天冬氨酸、谷氨酸；

(4)碱性的：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；

(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和

(6)芳香性的：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。

非保守取代将需要将这些种类的一种交换为另一种种类。保守取代包括在相同的种类中交换氨基酸。

II.编码3-KSR的载体

本发明进一步提供了在用于哺乳动物甾醇生物的合成生物化学途径中表达任意酶的载体，例如胆固醇缺陷细胞中的酶、3-KSR。通常，任意原核的克隆载体可用于载体的构建。载体可包含一个细菌复制起点，其用于载体大肠杆菌的宿主细胞株中载体的繁殖，载体DNA在哺乳动物细胞转染之前将从宿主细胞株中分离。细菌复制起点的例子包括但不局限于，Co1 E1、pUC、pBR322或从大肠杆菌的非病原细胞株得到的其它来源。载体可以进一步包含用于大肠杆菌中质粒的高复制数扩展的一个选择标记。作为举例的选择标记包括使抗生素如氨苄青霉素、羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、sulphaethoazole、甲氧苄氨嘧啶等具有耐药性的基因。可用于本发明载体的其它选择标记包括提供基于热休克、金属解毒和其它代谢过程选择的基因。

载体可进一步包含真核启动子，其驱动3-KSR基因的表达。其可以是一个极小的启动子，例如哺乳动物的胸苷激酶(TK)基因启动子，或更强的转录盒，例如猿猴病毒40(SV40)复制起点和早期启动子区域。很强的启动子，例如巨细胞病毒(CMV)主要即刻早期(MIE)启动子区域，有或者没有内含子A和/或B序列，或人延伸因子-α(EFa)，也可以用于驱动3-KSR基因的表达。真核转录终止序列或聚腺苷酰作用位点同时可以出现在中止3-KSR基因转录和信号腺苷酰作用上。理论上聚腺苷酰作用位点可以源自于任意真核类基因，但是一般使用强的聚腺苷酰作用序列，包括SV40 late poly-A和牛生长素(BGH)poly-A。

如图2描述，载体(在这种情况下称为p3-KSR)的一个实施方案可包含pUC衍生细菌复制起点(ori)和β-内酰胺酶基因(bla)，其在对这些抗生素敏感的大肠杆菌细胞株给予氨苄青霉素或羧苄青霉素耐药性。载体可以同时包含巨细胞病毒(CMV)主要即刻早期(MIE)启动子和增强子以用于驱动异源重组序列克隆为多种限制酶切点的表达。猿猴病毒40(SV40)聚腺苷酰作用序列(SV40 pA)可以定位于异源重组序列和3-KSR基因的下游区以有效地聚腺苷酰化各个基因的新生mRNA。SV40启动子和复制起点(SV40 ori)可以立即定位于3-KSR基因的上游区以驱动选择标记的表达。

在一个具体的实施方案中，通过从小鼠肾cDNA库中克隆增强的小鼠3-KSR cDNA可将3-KSR基因插入载体，小鼠肾cDNA库可以包含如Pm1I末端，其与存在于pUC-衍生载体、p3-KSR的Pm1I位点一致，其位点存在于在SV40 ori和SV40 poly-A之间区域。因此，用Pm1I限制的3-KSR cDNA可用来克隆该基因进入p3-KSR主链的Pm1I位点。在载体基因的取向可以用限制性核酸内切酶分析(REN)和双脱氧-终止DNA序列测定。

编码至少感兴趣异源多肽的一种多核苷酸或基因或基因盒然后在例如图3、4或5所示的多克隆位点或位点插入到包含3-KSR基因的载体中。插入的多核苷酸或基因盒在控制中或可操控的连接启动子，这将允许在真核的或优选温血动物宿主细胞中表达。

III.具有载体编码的3-KSR细胞的转染

将感兴趣的多核苷酸载体编码异源蛋白(和3-KSR作为一种选择标记)引入宿主细胞，可以使用本领域公知的技术包括但不限于电穿孔法、脂质转染法、磷酸钙沉淀法、聚乙二醇沉淀法、超声处理、转染、转导、转化和病毒感染来完成。参见SAMBROOK等人，《分子克隆：实验室操作指南》(第三版，2001)。

优选温血动物可以用于转染的任意真核细胞，其胆固醇缺陷型可归因于酶活性如3-KSR活性，例举的细胞系可包括但不局限于NS-0(ECACC号85110503)、NS-1(ECACC号85011427)和CHO-215(Plemenitas等人，265(28)J.Biol.Chem.17012-17(1990))。

本发明同时包括真核细胞和特定的哺乳动物细胞，其不是初始胆固醇缺陷型细胞，但通过使用放射剂、诱变剂或重组修复基因敲除技术制备得到失去活性的内源性基因，编码3-KSR活性包括但不限于17β-羟甾醇脱氢酶类型7(Hsd17b7)和3B-羟基-delta(5)-类固醇脱氢酶(Hsd3b5)。在又一个实施方案中，靶敲除基因可以包括但不局限于大鼠3β-HsdIII、小鼠3β-HsdIV、小鼠3β-HsdV和仓鼠3β-HsdIII，其公知的功能仅仅作为3-甾酮还原酶。

使用包含3-KSR选择标记(和多核苷酸编码感兴趣的异源蛋白)表达载体转染的NS-0、NS-I、CHO-215和其它胆固醇缺陷型细胞系应该在缺乏胆固醇培养液中生长。在某些其它实施方案中，宿主细胞可以在任意无血清和无胆固醇培养液中生长，其包含以下非详尽的清单甾醇前体：4-甲基-5α-胆甾-3，8，24-三烯-3β-醇、3-氧-4α-甲基-5α-胆甾-8，24-二烯、5α-胆甾-3，8，24-三烯-3β-醇和/或3-氧-5α-胆甾-8，24-二烯。这些前体在胆固醇的生物化学途径中的3-KSR上游区作用。

就调节所关心的问题，宿主细胞(转染之前或以后)可以在任意合适培养液包括但不限于无血清培养液、无蛋白培养液、化学确定成分培养液或其任意结合包括化学上确定成分/无血清培养液中生长。本发明的特定的方面所关心的动物衍生蛋白质和/或未明起源的蛋白质可以给予不合适人治疗的或诊断利用的重组蛋白质产物。合适生长培养液的一个具体的实施方案是CD杂交瘤培养液(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)、化学确定成分、无血清培养液，其不包含动物、植物或合成来源的蛋白质和已证实没有未定义的溶菌产物或水解产物。

本发明的宿主细胞可以作为已经适应于合适的生长培养液如CD-SFM提供。在转染之前，细胞常常适合于这样的培养液。在那种情况下，细胞可以适合于HyQCDM4NS-0(Hyclone，Logan，UT)，其为另一个缺乏动物衍生组分的化学确定成分、无血清培养液。后者市售培养液包括足够数量的胆固醇支持胆固醇缺陷型细胞系的生长。转染后，细胞在没有胆固醇的合适选择培养液中生长。另外地，在无胆固醇培养液中培养的转染子使用标准的补充有血清的培养液已脱脂，广泛使用已知技术并发现不支持双亲细胞的生长。

在转染后，细胞一般低密度播种以选作稳定的转化株。在这方面，可以使用任意合适的选择介质。在一个实施方案中，选择培养液可以包含补充有2mM L-谷氨酰胺或Glutamax和IX NEAA(不需要氨基酸)(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的CD杂交瘤。

在某些实施方案中，转染后可以将一种鸡尾酒生长因子加到选择培养液中以最佳化生长条件。转染后可将生长因子加入任意合适的细胞系包括但不限于NS-0、NS-1、CHO-215细胞。在一个具体的实施方案中，鸡尾酒生长因子可用来最优化NS-0细胞转染后生长条件。在一个实施方案中，生长因子可以包括但不限于血清清蛋白、白细胞间介素-6、胰岛素、亚硒酸钠、丙酮酸钠和乙醇胺。

任意合适的市售型血清清蛋白可以使用包括但不限于牛血清清蛋白(BSA)、牛血清清蛋白(fraction v)和全部人血清白蛋白。在某些实施方案中，可以是代替未改变的无脂肪酸血清清蛋白，为了除去可能的胆固醇-血清清蛋白络合物可以提供脂类到生长细胞。无脂肪酸BSA从众多包括如Research Organics公司、Cleveland，OH购得。在选择培养液中的组分最后浓度可以包括但不局限于从约0.1％至约5％的范围，更具体地说，约0.2％、约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％或更多达到约5.0％。在一种具体的实施方案中，在选择培养液中血清清蛋白的最后浓度可以为约1％。

可用来最优化生长条件的另一种生长因子包括白细胞间介素-6。在一个实施方案中，可以使用重组人IL-6(Promega公司，Madison，WI)。IL-6的最后浓度可以包括但不局限于，在选择培养液中为从约1ng/mL至约9ng/mL的范围，更具体地说为约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL或更多，达到约9ng/mL。在一个具体的实施方案中，在选择培养液中IL-6的最后浓度可以为约5ng/mL。IL-6如rhIL-6的浓度，根据需要可以成批调整至目标厂商报告的细胞活素的EC50。

鸡尾酒生长因子可以进一步包括胰岛素，具体地是重组人胰岛素(RayBiotech公司，Norcross，GA)。该组分在选择培养液中的最后浓度可以包括但不局限于从约5mg/L至约15mg/L的范围，更具体地说为约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L、约10mg/L、约11mg/L或更多，达到约15mg/L。在一个具体的实施方案中，在选择培养液中胰岛素的最后浓度可以为约10mg/L。

亚硒酸钠同时可以用来最优化生长条件(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。该添加剂的最后浓度可以包括但不局限于，在选择培养液中为从约5.0μg/L至约8.0μg/L的范围，更具体地说为约5.5μg/L、约6.0μg/L、约6.5μg/L、约7.0μg/L或更多，达到约8.0μg/L。在一个具体的实施方案中，在选择培养液中亚硒酸钠最后浓度可以为约6.7μg/L。

在其它实施方案中，丙酮酸钠可以用作生长因子(SAFCBiosciences，公司，Lenexa，KA)。丙酮酸钠在选择培养液中的最后浓度可以包括但不局限于从约0.01g/L到约0.3g/L的范围，更具体地说为约0.05g/L、约0.1g/L、约0.15g/L或更多，达到约0.3g/L。在一个具体的实施方案中，在选择培养液中丙酮酸钠最后浓度可以为约0.11g/L。

鸡尾酒生长因子可以进一步包括乙醇胺(Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO)。该添加剂在选择培养液中的最后浓度可以包括但不局限于从约0.5mg/L至约3.5mg/L的范围，更具体地说为约1.0mg/L、约1.5mg/L、约2.0mg/L、约2.5mg/L或更多，达到约3.5mg/L。在一个具体的实施方案中，在选择培养液中乙醇胺最后浓度可以为约2.0mg/L。

在一个具体的实施方案中，鸡尾酒生长因子可以包含无脂肪酸BSA(0.1％-5％)、rhIL-6(1ng/mL-9ng/mL)、重组人胰岛素(5mg/L-15mg/L)、亚硒酸钠(5μg/L-8μg/L)、丙酮酸钠(0.01g/L-0.3g/L)和乙醇胺(0.5mg/L-3.5mg/L)(在选择培养液中的最后浓度)。在另一个具体的实施方案中，鸡尾酒生长因子可以包含无脂肪酸BSA(1％-5％)、rhIL-6(0.5μg/mL)、重组人胰岛素(10mg/L)、亚硒酸钠(6.7μg/L)、丙酮酸钠(0.11g/L)和乙醇胺(2mg/L)(在选择培养液中的最后浓度)。在又一个实施方案中，鸡尾酒生长因子可以包含无脂肪酸BSA(1％)、rhIL-6(0.5μg/mL)、重组人胰岛素(10mg/L)、亚硒酸钠(6.7μg/L)、丙酮酸钠(0.11g/L)和乙醇胺(2mg/L)(在选择培养液中的最后浓度)。

在另一个实施方案中，生长因子可以包含无脂肪酸BSA、rhIL-6、重组人胰岛素、亚硒酸钠、丙酮酸钠、乙醇胺和没有其它生长因子。在进一步的实施方案中，生长因子可以包含无脂肪酸BSA、rhIL-6、重组人胰岛素、亚硒酸钠、丙酮酸钠、乙醇胺和没有一般包括或用于培养细胞生长中的其它物质。在一个选择性的实施方案中，生长因子可以包含无脂肪酸BSA、rhIL-6、重组人胰岛素、亚硒酸钠、丙酮酸钠、乙醇胺和没有在血清一般发现的其它物质。在又一个实施方案中，生长因子可以包含无脂肪酸BSA、rhIL-6、重组人胰岛素、亚硒酸钠、丙酮酸钠、乙醇胺、通常用于重新组成任意所述生长因子包括水的任意物质和没有其它任意物质。

IV.用于产生异源蛋白的试剂盒

本发明进一步提供了工业上销售的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可以包含载体、多个细胞和生长因子。载体可以包含用于哺乳动物甾醇生物合成的生物化学途径中编码一种酶的序列，例如3-KSR，可用于使用载体进行转染细胞的选择。试剂盒的用户可以使用合适的限切酶克隆一个靶基因为载体。在某些实施方案中，细胞为胆固醇缺陷型细胞。在一个实施方案中，试剂盒提供的细胞已可以适合于化学确定成分培养液中生长。在另一个实施方案中，试剂盒提供的细胞已可以适合于化学确定成分、无血清的培养液中生长。根据调整的要求，这些细胞来自工作细胞库，其将无需外源因子就可以决定。

在另一个实施方案中，试剂盒可以包含这里描述的生长因子，其支持细胞包括但不限于NS-0、NS-1和CHO 215的生长和细胞。在某些实施方案中，试剂盒可以包含生长因子，其支持细胞在无血清培养液、无蛋白培养液、化学确定成分培养液或其任意结合包括化学上确定成分/无血清培养液中生长。在一个具体的实施方案中，试剂盒可以包含这里描述的生长因子，其支持CD-SFM NS-0细胞在低播种密度下生长，例如在转染后和有限稀释细胞克隆(LDCC)阶段期间。

此外，本发明的试剂盒可用来表达任意感兴趣的异源蛋白。当然，不限定在本发明的细胞、细胞系和细胞培养中表达异源蛋白的本质和来源。例如，可以改造质粒p3-KSR用于表达单个或至少两个基因。前者适用于独立蛋白如单个链激素，后者意指双重链状分子链状分子如一种抗体的表达。

在本发明一个具体的实施方案中，可以使用包含必要基因的载体表达重组抗体分子。参见实施例，图3。抗体由多重组分构成蛋白质，特别地为两个重链和两个轻链。在一个实施方案中，可以改造p3-KSR载体，包括完全的重和轻链的基因，用于人免疫球蛋白G(IgG)先后克隆。从重组构造表达的蛋白导致单克隆抗体的分泌，随后可以从细胞培养在分离和纯化用于工业应用。因为它们为具体的到单个抗原，可用于目标具体的病原体、脏器或肿瘤，所以人单克隆抗体可很好适于人体治疗。

没有进一步详细说明，本领域技术人员可以相信使用优先的描述，可以以最充分的程度利用了本发明。下面的实施例仅仅是说明性的，而不限定以任何方式公开的剩余部分。

实施例

实施例1：阐述小鼠骨髓瘤细胞系NS-0在化学成分确定或/及无血清细胞培养液中的胆固醇筛选

小鼠骨髓瘤细胞系NS-0在两种化学成分确定无血清细胞培养液中进行适应培养以测试3-KSR在此细胞背景下或者SFM条件下作为选择标记的适宜性。使用CD-杂交瘤(Invitrogen)和CDM-4-NS-0(HyClone)对NS-0细胞进行适应培养。从每个在CD-SFM适应培养的NS-0细胞系被用来建立Acession细胞库。建立一个方法可以用于测定CD-SFM-NS-0细胞系对细胞培养液胆固醇的依赖性。这些试验结果表明CD-SFM-NS-0细胞在无胆固醇培养液中培养72小时后，少于10％的细胞可以存活。在CD-SFM内继续培养5天后，使用台盼蓝染色法没有检测到活细胞。另外，在无胆固醇的条件下，没有检测到细胞的间歇生长期，表明细胞对培养液中的脂质缺乏灵敏度。

实施例2：小鼠3-酮固醇还原酶(3-KSR)的PCR反应和构建3-KSR表达载体

使用从成年雄性BALB/c小鼠肾脏分离的cDNA进行3-酮固醇还原酶(3-KSR)基因的PCR扩增反应，本基因编码小鼠muscuhis 3B-羟基-delta(5)-类固醇脱氢酶(Hsd3b5)。使参考文献报道中的小鼠3-KSRHsd3b5序列，使用其特异寡核苷酸序列进行PCR扩增反应，在琼脂糖凝胶电泳中可以检测到一条1.1kb大小的带。分离此带并将其克隆至pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen中，然后重新克隆至pBVdhfr.1质粒背景下，新的构件载体称作pBFksr.1。

在pBFksr.1中编码3-ksr的1.1kb区域通过DNA测序得以确认，其开放阅读框(orf)与发表的序列进行比较，测序的结果与已报道的小鼠3-酮固醇还原酶(NCBI登记号A49573)完全一致。

实施例3：NS-0细胞在化学成分确定的无脂肪酸选择培养液中的转染和选择

一个含有正确3-KSR开放阅读框的pBF/csr.1被转染进入NS-0细胞并于化学成分确定的无脂肪酸选择培养液中进行选择。细胞选择培养液包括下列成分：CD-杂交瘤(Invitrogen)、Glutamax(2mM，Invitrogen)、NEAA(非必需氨基酸)(Ix，Invitrogen)、无脂肪酸的BSA(1％，Calbiochem)、重组人IL-6(5ng/ml，Promega)，ITS液体培养液添加物(Ix，Sigma-Aldrich)。最初的转染和选择可以在T-75细胞培养瓶内进行。在转染当天，使用台盼蓝染色法对NS-0细胞进行记数以区分活细胞或者死细胞。至少90％的细胞存活。每次转染需要大约1×10⁷。除了质粒转染外，还需要进行一个阴性对照转染(不含有DNA)。离心细胞，将其混悬于20ml的无血清转染液中进行洗涤并再次离心。对于每次转染，将1×10⁷个细胞混悬于700μL的无血清转染液。制备DNA溶液，制备途径如下：将40μg纯化的线性质粒DNA置于100μL的无菌蒸馏水中。线性DNA可以通过使用DNA限制性内切酶进行制备，通常不局限于Pvul(Proteus vulgaris restriction endonucleaseI)，其能够在beta-内酰胺酶开放阅读框内对pBF/csr.1进行一次限制性内切。将整个DNA溶液加入电转染杯内，将700μL的细胞混悬液加入含有DNA溶液的电转染杯内，小心吹打混合均匀，同时避免气泡的产生。将电转染杯加盖，置于电转染仪器内进行转染(Gene Pulser II(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA)或等同物)。转染条件为250v的单一脉冲，400μFd加之于电转染杯上(电场强度为625V/cm)。适宜的转染条件下的时间常数值应该不大于8微秒。电转染后将细胞加至含有12mL的化学成分确定的无脂肪酸的选择培养液的T-75细胞培养瓶内，于37℃下孵育过夜，孵育条件为5％CO₂、90％的相对湿度。

在体外培养三个星期后，被pBF/csr.1转染和筛选后的细胞在化学成分确定的无脂肪酸的选择培养液的存活率比对照组显著提高。在体外培养三个星期后，被阴性对照转染和筛选后的细胞在同样条件下的存活率与对照组相比没有显著提高。

实施例4：在化学成分确定的无脂肪酸的选择培养液NS-0细胞的转染，筛选以及单抗的表达

构建哺乳动物表达载体pBFdhfr.1，其可以作为哺乳动物基因克隆的骨架，这些基因包括人抗体重链和轻链编码区域，这个载体也可以在二氢叶酸脱氢酶(dhfr)突变的parental母系细胞系(CHO-DG44)内进行表达。在使用这个载体时，人IgGI的重链恒定区可以被克隆在多克隆位点内(mcs)，作为人抗体重链可变区的受方。这个载体被命名为pBFdhfr.1：H。

首先将相应的轻链可变区序列克隆至含有人轻链恒定区基因片断的杆状病毒表达载体pIEI-light内。然后将整个轻链编码序列克隆至pBFdhfr.1。为了构建双重表达载体，与pCMV-MIE5’端和在互补链上的BGH-pA相匹配的引物可以被用来扩增含有pCMV-MIE-轻链-BGHpA的轻链序列，此序列在两端都含有BgIII限制性酶切位点。然后将本片段克隆至每个相应的pdhfr：Heavy_Chain载体的单一Bg1II限制性酶切位点上。由此构建的载体pBVdhfr.1：humAb含有完整的人抗体重链和轻链基因。

分离小鼠3-酮类固醇还原酶基因，将其克隆至pCR-BluntII-TOPO zaiti(Invitrogen)内，然后再次克隆至于pBVdhfr.1：humAb载体内。这个含有正确3-KSR开放阅读框的新载体pBFksr.1：HUMAB可以被转染至NS-0细胞内并使用化学成分确定的无脂肪酸的选择培养液进行筛选。最初的转染和筛选可以在T-75细胞培养瓶内进行。在转染后，细胞可直接培养于筛选培养液内。在体外培养三个星期后，被pBFksr.1：HUMAB转染和筛选后的细胞在化学成分确定的无脂肪酸的选择培养液的存活率比对照组显著提高。在体外培养三个星期后，被阴性对照转染和筛选后的细胞在同样条件下的存活率与对照组相比没有显著提高。

被转染细胞进行筛选和体外培养，可以使用酶联免疫法测定细胞上清液内的重组mAb。简而言之，收集被转染pBFksr.1：HUMAB细胞的上清液，离心以去除任何细胞或碎片。使用羊抗人Fab lambda特异性抗体溶液(Sigma-AldrichCo.，St.Louis，MO)对96孔板进行包被，抗体溶液制备如下：将9μL抗体加至6.3mL的磷酸缓冲液(PBS)中。将96孔板于4℃孵育至少24小时，至多两个星期。在测定当天，使用PBS/tween(0.1％tween)缓冲液漂洗96孔板，漂洗次数为三次。将人IgG1单抗标准品(Sigma)以PBS/tween稀释至5μg/mL，然后再以1∶2的比率依次稀释，从而得到标准浓度梯度。将每个标准溶液加至96孔板中，每孔100μL。未知抗体浓度的样品以1∶2000的比率进行稀释，加至96孔板中，每孔100μL。将96孔板于室温下孵育1小时。孵育后使用PBS/tween缓冲液漂洗96孔板，漂洗次数为三次。将过氧化物酶标记的羊抗人IgG Fc抗体(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)以1∶2000的比率进行稀释，加至96孔板中，每孔100μL。将96孔板于室温下孵育1小时。孵育后使用PBS/tween缓冲液漂洗96孔板，漂洗次数为三次。将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma)加至96孔板中，每孔100μL。一分钟后，加入100μL的0.5M硫酸溶液(Acros Organics，Geel，Belgium)以停止反应的进行。在450nm波长下进行读色，使用仪器为ThermoMax96孔板读数器或者类似仪器。ELISA试验结果可以测定重组单抗产物的存在。

Claims

1.一种用于产生异源多肽的哺乳动物表达载体，其包含：

编码作为代谢选择标记的3-甾酮还原酶的多核苷酸，

编码所述异源多肽的多核苷酸，

用于驱动作为代谢性选择标记的3-甾酮还原酶的表达的SV40启动子和复制起点，和

用于驱动所述异源多肽的表达的巨细胞病毒主要即刻早期启动子和增强子。

2.如权利要求1所述的载体，其中所述3-甾酮还原酶是鼠3-甾酮还原酶。

3.如权利要求1所述的载体，其中编码所述酶的所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1，或者编码包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的载体，其中所述载体是重组DNA表达载体。

5.一种以如权利要求4所述的载体转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，并且是胆固醇营养缺陷型细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由NS-O和NS-1组成的组。

7.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是NS-O小鼠骨髓瘤细胞。

8.一种获得具有在缺乏胆固醇的培养基中存活的能力并具有表达异源蛋白的能力的细胞的方法，包括：

用权利要求1所述的载体来转染胆固醇营养缺陷型真核细胞；以及

选择能够在缺乏胆固醇的培养基中存活的细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞选自由NS-0和NS-1组成的组。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞是NS-0小鼠骨髓瘤细胞。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述培养基是化学成分确定的。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述培养基是化学成分确定且无血清的。

13.一种表达异源蛋白的方法，包含：

用权利要求1所述的载体转染胆固醇营养缺陷型的细胞，其中所述载体还包含编码所述异源蛋白的多核苷酸；以及

在表达所述异源蛋白的条件下，在无胆固醇的培养基中培养所述转染细胞。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞选自由NS-0和NS-1组成的组。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述细胞是NS-0小鼠骨髓瘤细胞。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述培养基是化学成分确定的。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述培养基是化学成分确定且无血清的。