KR100267720B1

KR100267720B1 - 사람 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이를 이용하여 동물세포에서 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100267720B1
Application number: KR1019970076923A
Authority: KR
Inventors: 홍효정; 박흥록; 박성섭
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-12-29
Filing date: 1997-12-29
Publication date: 2001-03-02
Also published as: KR19990056899A

Abstract

본 발명은 사람 글루타민 합성효소 (glutamine synthase, GS) 유전자를 이용하여 동물세포에서 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 메티오닌 설폭시민 (methionine sulfoximine, MSX)에 의하여 증폭되는 글루타민 합성효소 유전자를 이용하여 외래 유전자를 대량으로 발현할 수 있는 발현 벡터, 이를 이용하여 얻은 재조합 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 세포주 및 그의 제조 방법 그리고 이로부터 에리트로포이에틴을 얻는 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 발현 벡터를 이용하면 다양한 재조합 단백질을 생산하는 세포주를 단일 단계의 증폭 과정을 거쳐 용이하게 선발할 수 있어 활성이 우수한 재조합 단백질을 CHO 세포 등에서 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

사람 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 이를 이용하여 동물세포에서 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 방법{An expression vector containing human glutamine synthase gene and a producing method of erythropoietin from animal cell using the same}

본 발명은 사람 글루타민 합성효소 (glutamine synthase, GS) 유전자를 이용하여 동물세포에서 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 메티오닌 설폭시민 (methionine sulfoximine, MSX)에 의하여 증폭되는 글루타민 합성효소 유전자를 이용하여 외래 유전자를 대량으로 발현할 수 있는 발현 벡터, 이를 이용하여 얻은 재조합 에리트로포이에틴 (Erythropoietin, 이하 " EPO " 라고 약칭함)을 고수율로 생산하는 세포주 및 그의 제조 방법 그리고 이로부터 EPO 를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 발현 벡터를 이용하면 다양한 재조합 단백질을 생산하는 세포주를 단일 단계의 증폭 과정을 거쳐 용이하게 선발할 수 있어 활성이 우수한 재조합 단백질을 CHO 세포 등에서 효과적으로 생산할 수 있다.

에리트로포이에틴 (EPO)은 골수 내에서 생성된 적아구를 적혈구로 분화시키는 166개의 아미노산으로 구성된 적혈구 형성 자극인자라고도 하는 산성 당단백질 호르몬이다. EPO 는 건강한 사람의 경우 보통 혈액 내에 10-20 mU/ml 가 존재하며, 사고 등으로 다량 출혈이 유발되어 인체 내 산소 농도가 감소하는 경우에는 EPO 의 생산이 자극되어 그 생산성이 최소한 1천배까지 증가한다. 또한 신장에 이상이 있는 경우에는 EPO 의 생산이 감소하여 극심한 빈혈을 초래하기도 한다 (Jacobson, et al.,Nature,179, 633, 1957).

따라서 EPO 는 겸상 적혈구성 빈혈, 적혈구 용해증, 혈우병, 생리적 빈혈, 수술전후의 과다출혈 및 만성 신부전증으로 신장이 손상되어 EPO 를 생산하지 못하는 빈혈증을 치료하는데 사용될 수 있다. 이와 같이 빈혈 치료제로 유용한 EPO 는 1989년에 혈우병, 생리적 빈혈 및 만성 신부전증 등에 사용할 수 있는 악성 빈혈치료제로 승인되었고, 1991년에는 아자사이티딘 (AZT)을 사용하는 후천성 면역결핍증 환자에 사용할 수 있는 악성 빈혈 치료제로서 허가되었다. 이외에도 EPO 는 약물 치료를 받고 있는 류마티스성 관절염 환자 또는 암 환자에서 빈혈증을 치료하고, 수술전후에 수혈을 대체하는 등에 이용되고 있으며, 그 적용 범위는 점점 확대되고 있는 추세이다.

지금까지 임상적으로 사용된 EPO 는 주로 양의 혈장 (미국 특허 제 3,033,753호), 사람의 오줌 (미국 특허 제 3,865,801호) 및 재생불량성 빈혈 환자의 오줌 (Miyake, et al.,J. Biol. Chem.,252, 5558, 1977) 등에서 추출된 것으로서, 이를 치료에 사용하기에는 양이 충분하지 않아 널리 이용되지 못하였다. 따라서 EPO 를 유전공학적 방법으로 생산하기 위하여 많은 시도들이 이루어 졌는데, 구체적으로 사람 EPO 유전자의 cDNA 가 클로닝되어 그의 DNA 염기 서열이 밝혀지고 (미국 특허 제 4,703,008호), 이 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포유동물 세포인 CHO 세포주 유래의 디하이드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase, dhfr) 변이 세포주 (ATCC CRL 9096) 등에 형질전환시켜 순수한 EPO 를 생산하는 방법 등이 시도되었다 (Jacobs et al.,Nature,313, 806, 1985; Lin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 7580, 1985).

상기에서 형질전환된 CHO 세포주는 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX)를 첨가한 배지에 단계적으로 적응시켜 EPO 유전자를 증폭시킴으로써 EPO 의 생산량을 효율적으로 증가시킬 수 있다 (Malik, et al.,DNA and Cell Biol.,11, 453, 1992). 구체적으로 기린-암젠사의 특허 (국제 특허공개 제 85-2610호)는 1μM MTX 농도에서 적응한 세포주로부터 21μg/ 10⁶세포/ 48시간 농도로 EPO 를 생산하였다. 그러나 1μM MTX 농도까지 단계별로 세포를 적응시키기 위해서는 6개월 이상의 오랜 배양 기간이 필요하고, 세포의 성장이 저하되는 부작용이 있으며 EPO 를 대량 생산하는데 비용도 많이 든다.

한편 본 발명자들은 낮은 MTX 농도의 배양액을 사용하여 CHO 세포주로부터 외래 유전자를 대량으로 발현시키기 위하여, SV40 프로모터의 128-270 부위를 제거하여 dhfr 유전자를 연결한 발현 벡터를 제조하고 이를 상기 세포주에 형질전환시켜 20mM MTX 농도에서 생존하면서 유용한 외래 단백질을 고수율로 생산할 수 있는 세포주를 개발하였다. 구체적으로 플라스미드 벡터 pRc/CMV 에 dhfr 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pCMV-dhfr (수탁번호 : KCTC 8671 P)를 얻은 다음 상기 발현 벡터에 EPO 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pEpoG-dhfr (수탁번호 : KCTC 0181 P) 또는 pEpoC-dhfr (수탁번호 : KCTC 0180 P)를 제작하였다. 이들 발현 벡터를 dhfr 변이 CHO 세포주에 형질전환시켜 각각 낮은 MTX 농도에서도 외래 유전자를 증폭할 수 있는 g2 (수탁번호 : KCTC 0183 P) 및 EC1 (수탁번호 : KCTC 0182 P) 세포주를 개발한 바 있었고 (한국 특허출원 제 95-22441호), 이들 세포주는 EPO 의 생산성이 탁월하게 높은 것으로 확인되었다.

또한, 상기에서 얻은 EC1-20 세포주를 낮은 MTX 농도의 세포 배지를 이용하여 세포 배양, 세포 서브클로닝, 세포 클론 팽창의 과정을 반복하는 장기 계대배양을 통하여 EPO 를 효율적으로 생산하는 세포주 EC1-71-1C8 (수탁번호 : KCTC 0296 BP)를 선발함으로 고역가의 EPO 를 대량 생산한 바 있었다 (한국 특허출원 제 97-22957호).

그러나 상기 방법에 사용하는 세포주는 반드시 dhfr 변이 세포주를 사용해야만 하는 조건이 매우 까다로운 문제점이 있었다.

글루타민 합성효소 (GS)는 모든 세포에 발현되는 효소 (universal housekeeping enzyme)로서, 이 효소 유전자를 포함하는 벡터는 GS 효소를 발현하는 보통의 세포에서는 선택 마커 (dominant selectable marker)로 사용될 수 있고 이 효소의 억제제인 메티오닌 설폭시민 (MSX)을 처리하면 높은 복사본 수 (copy number)로 유전자를 증폭시킬 수 있다. 이러한 특성이 있는 GS 유전자를 단백질의 발현에 이용하려는 많은 연구들이 이루어져 왔고, 구체적으로 동물세포인 CHO-K1 세포에서 햄스터 GS 유전자를 SV40 프로모터에 연결시킨 벡터를 이용함으로 외래 유전자, TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase) 유전자를 발현시킨 결과가 보고되었다 (Cockette, et al.,Bio/Technology,8: 662-667, 1990). 이는 증폭되는 과정을 통하여 TIMP 단백질의 양이 500μM MSX 농도에서 최고 110μg/10⁶세포/일임을 밝혔다.

이에 본 발명자들은 배양 방법이 간단하고 동물세포에서 고수율로 재조합 단백질을 생산하는 방법을 개발하기 위하여, MSX 에 의해 증폭될 수 있는 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작한 다음 이 발현 벡터에 EPO 유전자를 삽입하여 CHO 세포를 형질전환시키고 MSX 을 배지에 처리하여 EPO 를 대량 생산하는 세포주를 선발하고 이로부터 재조합 EPO 를 고수율로 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 사람 글루타민 합성효소 (GS) 유전자를 이용하여 동물세포에서 외래 유전자를 간편하게 증폭시켜 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1 은 본 발명의 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 의 제작 과정을 도시화하여 나타낸 것이고,

도 2 는 본 발명의 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 의 유전자 지도를 도시화하여 나타낸 것이고,

도 3 은 본 발명의 발현 벡터 pcDNA-gs 의 유전자 지도를 도시화하여 나타낸 것이고,

도 4 는 본 발명의 방법으로 생산된 에리트로포이에틴 (EPO)의 활성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람 글루타민 합성효소 유전자를 이용하여 외래 유전자를 동물세포에서 대량 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 다양한 외래 유전자를 삽입할 수 있는 발현 벡터 pcDNA-gs 및 그의 형질전환체 그리고 에리트로포이에틴 (EPO)을 고수율로 생산할 수 있는 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 및 그의 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 동물세포를 형질전환시키고 형질전환된 세포를 메티오닌 설폭시민 (MSX)의 농도를 증가시킨 배지에 배양하여 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 세포주를 선발하고 이로부터 재조합 단백질을 대량 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 MSX 포함하는 배지에 배양하여 선발한 EPO 를 고수율로 생산하는 세포주 및 그의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 메티오닌 설폭시민 (MSX)에 의하여 증폭되는 사람 글루타민 합성효소 (glutamine synthase, GS) 유전자를 이용하여 재조합 단백질을 동물세포에서 고수율로 생산한다.

우선, 본 발명은 MSX 에 의해 증폭되는 사람 GS 유전자를 이용하여 동물세포 발현 벡터를 제작한다.

본 발명의 발현 벡터는 SV40 프로모터의 염기 번호 128-270 부위가 제거된 프로모터에 상기 GS 유전자를 연결하는데, 구체적으로는 SV40 프로모터의 염기 번호 128-270 부위가 제거된 프로모터 부위는 기존의 플라스미드 벡터 pEpoC-dhfr (수탁번호 : KCTC 0180 P)를 주형으로 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하여 얻고, 사람 글루타민 합성효소 유전자는 사람 간 cDNA 라이브러리를 주형으로 PCR 을 수행하여 얻는다 (Gibbs, et al.,NAR.,15, 6293, 1987) (도 1 참조).

본 발명은 재조합 단백질로서 EPO 를 고수율로 생산할 수 있는 발현 벡터를 얻기 위하여, 상기 발현 벡터에 EPO 유전자를 삽입한 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 를 제작한다.

상기 발현 벡터는 기존의 발현 벡터 pEpoC-dhfr (수탁번호 : KCTC 0180 BP; 대한민국 특허출원 제 95-22441호)의 dhfr 유전자 부위가 GS 유전자로 대체된 형태이며, SV40 프로모터의 염기 번호 128-270 부위가 제거된 프로모터에 글루타민 합성효소 유전자를 연결한 다음 EPO 를 생산하는 발현 벡터 pcDNA-EPO-PA 와 연결함으로 제작될 수 있다 (도 1 및 도 2 참조).

또한, 본 발명은 다양한 외래 유전자를 삽입하여 재조합 단백질을 대량 생산하는데 사용될 수 있는 발현 카세트 (cassette)를 포함하는 발현 벡터 pcDNA-gs 를 제작한다 (도 3 참조).

상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 얻고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 12월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8860 P).

또한, 본 발명은 MSX 에 의해 증폭되는 사람 GS 유전자를 포함하는 발현 벡터로 동물세포를 형질전환시키고 세포를 MSX 농도를 증가시킨 배지에 배양하여 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 세포주를 선발한다.

구체적으로 EPO 를 대량 생산하는 세포를 얻기 위하여, CHO-K1 세포를 투석된 10% 송아지 혈청을 함유하는 GDMEM 배지 등에 배양하고 적당한 농도로접시에 접종한 다음 상기 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 및 리포펙틴 등을 혼합하여 상기 세포에 가한다. 다음 배지를 바꾸어 주면서 세포를 배양하여 분주하고 MSX 을 여러 농도로 각각 높여 첨가함으로써 EPO 를 고수율로 생산하는 세포주를 얻는다.

또한, 본 발명은 사람 GS 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 동물세포를 MSX 의 농도를 증가시킨 배지에 배양하여 얻은 세포주를 이용하면 EPO 를 포함한 유용한 재조합 단백질을 고수율로 생산할 수 있다.

상기 방법은 단일 단계의 증폭 과정만으로도 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 세포주를 용이하게 선발할 수 있고, 이로부터 활성이 우수한 재조합 단백질을 효과적으로 생산할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하기로 한다.

단 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 발현 벡터 pcDNA-EPO 의 제작

본 발명은 메티오닌 설폭시민 (MSX)에 의해 증폭될 수 있는 사람 글루타민 합성효소 (GS) 유전자를 이용하여 재조합 단백질로서 EPO 를 대량 생산하는 유용한 발현 벡터를 얻기 위하여, 우선 상기 EPO 유전자를 기존의 발현 벡터 pcDNA3 (Invitrogen사 제품)에 삽입한 발현 벡터 pcDNA-EPO 를 제작하였다.

구체적으로 기존의 발현 벡터 pEpoC-dhfr (수탁번호 : KCTC 0180 BP; 한국 특허출원 제 95-22441호)를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Apa I 으로 절단하고 이로부터 450 bp 크기의 EPO 유전자를 분리한 다음 발현 벡터 pcDNA3 에 연결시켰다.

〈실시예 2〉 발현 벡터 pBS-dE1-gs 의 제작

본 발명은 SV40 프로모터의 염기 번호 128-270 부위가 제거된 프로모터의 하류에 GS 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pBS-dE1-gs 를 제작하였다.

우선 SV40 프로모터의 염기 번호 128-270 부위가 제거된 프로모터 부위를 얻기 위하여, 기존의 플라스미드 벡터 pEpoC-dhfr 을 주형으로 제한효소 Bam HI 및 Hind Ⅲ 절단부위를 포함하도록 설계한 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하고 200 bp 크기의 DNA 절편을 분리한 다음 이를 제한효소 Bam HI 및 Hind Ⅲ 로 절단하여 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+)에 삽입함으로 플라스미드 벡터 pBS-dE1 를 얻었다.

또한, 사람 GS 유전자를 상기 SV40 프로모터의 하류에 삽입하기 위하여, GS 유전자는 인간 간 cDNA 라이브러리 (Stratagene사 제품)를 주형으로 올리고 뉴클레오타이드 시발체를 이용한 PCR 을 수행하여 얻었다. 그 결과, 1150 bp 크기의 GS 유전자의 DNA 절편을 분리하였고 이를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xho I 으로 절단한 다음 상기 플라스미드 벡터 pBS-dE1 의 제한효소 Hind Ⅲ 및 Xho I 부위에 삽입하여 플라스미드 벡터 pBS-dE1-gs 를 제작하였다.

〈실시예 3〉 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 의 제작

본 발명은 GS 유전자를 이용하여 EPO 를 대량 생산할 수 있는 발현 벡터를 얻기 위하여, 상기 플라스미드 벡터 pBS-dE1-gs 를 제한효소 Bam HI 및 Bgl Ⅱ 로 처리하고 이로부터 염기 번호 128-270 부위가 제거된 SV40 프로모터의 하류에 GS 유전자를 포함하는 1350 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였다. 또한, 상기 플라스미드 벡터 pcDNA-EPO 의 제한효소 Bgl Ⅱ 부위에 미리 SV40 의 폴리 A (poly A) 부위를 삽입하여 플라스미드 벡터 pcDNA-EPO-PA 를 제작한 다음 다시 제한효소 Bgl Ⅱ 로 절단하여 그 개환한 부위에 상기 GS 유전자를 삽입하여 본 발명의 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 를 제작하였다.

〈실시예 4〉 발현 벡터 pcDNA-gs 의 제작

본 발명은 GS 유전자를 이용하여 다양한 재조합 단백질을 발현할 수 있는 카세트 (cassette)를 포함하는 발현 벡터를 얻기 위하여, 상기 발현 벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs 를 제한효소 Pvu I 및 Nde I 으로 처리하고 이로부터 GS 유전자를 포함하는 3250 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였다. 또한, 상기 다양한 제한효소 부위를 가지고 있는 발현 벡터 pcDNA (Invitrogen사 제품)를 상기와 동일한 제한효소 Pvu I 및 Nde I 로 절단하여neo유전자와 다클로닝 부위를 가지는 DNA 절편과 상기의 3250 bp DNA 절편을 재조합시킴으로써 유용한 외래 단백질을 다양하게 생산할 수 있는 7660 bp 크기의 본 발명의 발현 벡터 pcDNA-gs 를 제작하였다.

〈실시예 5〉 세포 형질전환 및 배양

본 발명은 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 세포를 얻기 위하여, 상기 발현 벡터로 CHO-K1 세포를 다음의 과정으로 형질전환시켰다.

구체적으로, CHO-K1 세포를 투석된 10% 송아지 혈청을 함유하는 GDMEM 배지 [DMEM 배지 (Gibco사 제품)에 4.5 g/l 포도당, 15 mg/l 페놀 레드, 1 mM 피루브산 나트륨, 2.75 g/l 소듐 바이카보네이트, 500 μM 글루탐산, 500 μM 아스파라진, 30 μM 아데노신, 30 μM 구아노신, 30 μM 사이티딘, 30 μM 우리딘, 30 μM 티미딘 및 불필수 아미노산 (Gibco사 제품)을 첨가한 배지]를 이용하고 탄산가스 5% 가 유지되도록 하여 37℃에서 배양한 다음 접시당 5×10⁵세포 가 되도록 맞추어 지름 6cm 의 접시에 접종하였다.

다음 상기 발현 벡터 (pcDNA-EPO-dE1-gs) DNA 5 μg 을 OPTI-MEMI (Gibco사 제품) 0.3 ml 에 희석하고 동량으로 희석한 리포펙틴 (lipopectin, Gibco사 제품) 15 μl 와 혼합하여 15분 동안 방치하였다. 다음 이를 OPTI-MEMI 로 3번 씻은 상기에서 준비한 CHO-K1 세포 위에 부어 주었다. 이 세포를 탄산가스 5% 가 유지되도록 하여 37℃에서 6시간 동안 배양한 다음 투석된 10% 송아지 혈청을 함유하는 GDMEM 배지로 바꾸어 주고 48시간 더 배양하였다. 이에 0.25% 트립신 (Gibco사 제품)을 처리하여 원심분리한 다음 세포를 웰당 2×10³세포가 되도록 하여 96-웰 플레이트에 분주하였다.

〈실시예 6〉 EPO 유전자의 증폭 및 EPO 의 생산성 조사

상기 실시예 4 에서 얻은 세포를 48시간 동안 배양한 다음 세포를 투석된 10% 송아지 혈청을 포함하는 GDMEM 배지에 메티오닌 설폭시민 (MSX) 25μM 을 첨가하여 4일 간격으로 배지를 갈아주면서 2주 동안 배양하였다. 이들 세포의 EPO 생산 능력을 조사하기 위하여, 생쥐 항-인간 EPO 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 (ATCC CRL 8164)로부터 분리한 항체 및 과산화수소와 결합된 염소 항-생쥐 IgG 항체 (시그마사 제품)를 이용한 간접 엘라이자 (ELISA) 방법을 수행하여 EPO 를 고수율로 생산하는 세포주를 선발하였다.

이들 과정에서 선발한 EPO 를 생산하는 세포주에서 생산된 EPO 양 등의 결과를 표 1 에 나타내었다. 구체적으로 상기 각 세포 클론을 투석된 10% 송아지 혈청을 포함하는 GDMEM 배지에 MSX 를 각각 100, 200, 350, 500, 750, 1000μM 첨가하여 배양하고 이로부터 최종적으로 적응하여 생존하는 각 세포 클론의 EPO 생산 정도를 측정하였다. 그 결과 2개의 세포주 (8D, 1H)에서 EPO 생산 능력이 증가된 것으로 나타났다.

EPO 의 양은 베링거만하임사의 EPO-엘라이자 키트를 사용하여 정량하였다. EPO 에 대한 항체를 코팅한 플레이트에 세포 배양액을 몇 개의 농도로 첨가하고 퍼옥시다제가 결합된 EPO 모노클로날 항체를 첨가하였다. 다음 ABTS 로 발색시키고 405 nm 에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이 때 배양액에 존재하는 EPO 의 양은 키트에서 제공하는 정제된 EPO의 표준량을 배양액의 시료들과 같이 정량하고 이들로부터 표준곡선을 구하여 시료의 EPO 가 나타내는 엘라이자 값에 해당하는 EPO 의 양을 결정하였다.

본 발명에서 선발한 세포주의 EPO 생산성 (μg/10⁶세포/일)

세포주	25μM MSX 농도에서의 EPO 생산량	MSX 농도를 증가시킨 경우의 EPO 생산량 (괄호 안은 MSX 농도)
8D	274	319 (750)
1E	224	102 (350)
2G	180	93 (200)
1H	194	262 (200)
5B	120	-

〈실시예 7〉 EPO 의 생물학적 특성 검증

본 발명은 상기 과정으로 제조한 EPO 의 생물학적 특성을 검증하기 위하여, EPO 에 대해 민감하게 반응하여 증식하는 세포주로서 EP-FDC-P₂세포 (Dr. Ryuzo Sasaki, 일본 교토대학 식품공학과 교수로부터 받음)를 이용하여 MTT 방법 (Tasuda, et al.,Acta Haematol. JPN,53: 1045, 1990)에 의한 EPO 의 생체외 세포 활성을 조사하였다 (도 4 참조). 96-웰 플레이트에 4×10⁴세포/웰 농도로 세포를 현탁시키고 각 웰에 EPO 표준품 (베링거만하임사)과 본 발명의 8D 세포 배양액과 1H 세포 배양액을 첨가하였다. 이를 37℃, CO₂배양기에서 20시간 동안 배양한 다음 MTT 용액 (5 mg/ml)을 각 웰에 10μl씩 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하였다. 플레이트를 1,500 rpm 에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 0.04 N 염산을 녹인 이소프로판올 용액을 0.1 ml 씩 넣은 후 20분이 경과한 다음 3% SDS 용액을 다시 첨가하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 본 발명을 통하여 얻은 EPO 가 EPO 표준품과 거의 동일한 생물학적 활성을 가짐을 확인하였다.

상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 발현 벡터는 메티오닌 설폭시민 (MSX)에 의하여 증폭되는 사람 글루타민 합성효소 (GS) 유전자를 이용하므로 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포에서 외래 유전자를 단일 단계로 간편하고 효과적으로 증폭시킬 수 있고 이로부터 활성이 우수한 형태의 재조합 단백질, 특히 재조합 에리트로포이에틴 (EPO)을 고수율로 생산할 수 있다.

구체적으로 상기 결과는 기존의 코케트 (Cockette) 등이 보고한 TIMP 생산성과 비교하여 3배 이상 효율적인 것으로 나타나 사람 GS 유전자와 인핸서 부위를 제거한 SV40 프로모터를 포함하는 상기 발현 벡터는 CHO 세포에서 유전자를 증폭시키는데 매우 유용함을 알 수 있다. 특히 상기 결과는 기존에 많이 사용하여 온 dhfr 유전자를 이용한 경우 (대한민국 특허출원 제 97-22957호) 보다도 더욱 효율적인 것이다.

Claims

SV40 프로모터의 염기번호 128-270 번째의 부위가 제거된 프로모터 하류에 연결된 사람 글루타민 합성효소(glutamine synthase)유전자를 발현벡터 pcDNA에 삽입하여 외래 유전자를 동물세포에서 대량 발현할 수 있는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 도 3에 기재된 개열지도를 가지며, 다양한 외래 유전자를 삽입할 수 있는 발현 카세트를 포함하는 pcDNA-gs 발현 벡터.
제2항의 발현 벡터로 형질전환시킨 대장균 형질전화체 E. coli / pcDNA-gs (수탁번호 : KCTC 8860 P).
제1항에 있어서, 에리트로포이에틴 (EPO)을 고수율로 생산할 수 있는 pcDNA-EPO-dE1-gs 발현 벡터.
제4항의 발현 벡터로 형질전화시킨 대장균 형질전환체 E. coli / pcDNA-EPO-dE1-gs.
제1항의 발현 벡터로 동물세포를 형질전환시키고 형질전환된 세포를 메티오닌 설폭시민(methionine sulfoximine)의 농도를 증가시킨 배지에 배양하여 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 세포주를 선발하고 이로부터 재조합 단백질을 대량 제조하는 방법.
제4항의 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 메티오닌 설폭시민을 포함하는 배지에 배양하여 선발한 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 세포주.