EA012566B1 - Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка - Google Patents

Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка Download PDF

Info

Publication number
EA012566B1
EA012566B1 EA200501756A EA200501756A EA012566B1 EA 012566 B1 EA012566 B1 EA 012566B1 EA 200501756 A EA200501756 A EA 200501756A EA 200501756 A EA200501756 A EA 200501756A EA 012566 B1 EA012566 B1 EA 012566B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
chimeric protein
biologically active
immunoglobulin
active molecule
molecule
Prior art date
Application number
EA200501756A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501756A1 (ru
Inventor
Роберт Т. Петерс
Адам Р. Мезо
Дэниел С. Ривера
Алан Дж. Битонти
Джеймс М. Статтел
Сьюзан С. Лоу
Original Assignee
Синтоникс Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33458764&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA012566(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Синтоникс Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Синтоникс Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA200501756A1 publication Critical patent/EA200501756A1/ru
Publication of EA012566B1 publication Critical patent/EA012566B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Изобретение относится к химерному гибридному белку мономер-димер, при этом указанный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, где указанная первая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и биологически активную молекулу и указанная вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без биологически активной молекулы, имеющейся в первой цепи. Изобретение также относится к способам применения и способам получения химерного гибридного белка мономер-димер согласно изобретению.

Description

Данная заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США № 60/469600, поданной 6 мая 2003 года, предварительной заявке на выдачу патента США № 60/487964, поданной 17 июля 2003 года, и предварительной заявке на выдачу патента США № 60/539207, поданной 26 января 2004 года, все указанные заявки включены в виде ссылки в полном объеме. Непредварительная заявка на выдачу патента США, озаглавленная «Ме!кобк йог Скет1са11у Ξνηΐΐιοδίζίπβ 1ттипод1оЬикп СЫтепс Рго!еш8», поданная 6 мая 2004 года, включена в виде ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение в общем относится к терапевтическим химерным белкам, состоящим из двух полипептидных цепей, в которых первая цепь состоит из терапевтической биологически активной молекулы, а вторая цепь не состоит из терапевтической биологически активной молекулы первой цепи. Более конкретно изобретение относится к химерным белкам, состоящим из двух полипептидных цепей, в которых обе цепи состоят по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, где первая цепь модифицирована так, чтобы она, кроме того, содержала биологически активную молекулу, а вторая цепь не модифицирована таким образом. Следовательно, изобретение относится к химерному белку, который является гибридом мономер-димер, т.е. химерному белку, имеющему димерный аспект и мономерный аспект, при этом димерный аспект относится к тому факту, что он состоит из двух полипептидных цепей, каждая из которых состоит из части константной области иммуноглобулина, а мономерный аспект относится к тому факту, что только одна из двух цепей состоит из терапевтической биологически активной молекулы. Фиг. 1 иллюстрирует один пример гибрида мономер-димер, в котором биологически активной молекулой является эритропоэтин (ЕРО), а часть константной области иммуноглобулина представляет собой Бс-область 1дС.
Уровень техники
Иммуноглобулины состоят из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых цепей и двух легких цепей, которые связаны посредством дисульфидных связей с образованием тетрамеров. Каждая цепь, кроме того, состоит из одной вариабельной области одной константной области. Вариабельные области опосредуют узнавание и связывание антигена, тогда как константные области, в частности константные области тяжелых цепей, опосредуют множество эффекторных функций, например связывание комплемента и связывание Бс-рецептора (смотрите, например, патенты США №№ 6086875, 5624821, 5116964).
Константная область, кроме того, состоит из доменов, называемых СН-доменами (константная тяжелая) (СН1, СН2 и т.д.). В зависимости от изотипа (например, 1дС. 1дМ, 1дА, Ι§Ό, 1дЕ) константная область может состоять из трех или четырех СН-доменов. Константные области некоторых изотипов (например, 1дС) также содержат шарнирную область, 1апе^ау е! а1. 2001, 1ттипоЬю1о§у, Саг1апб РиЬНкЫпд, N. Υ., N. Υ.
Создание химерных белков, состоящих из константных областей иммуноглобулина, связанных с представляющей интерес частью или ее фрагментом, описано (смотрите, например, патенты США № 5480981 и 5808029; Саксофпе е! а1. 1987, Ргос. №!1. Асаб. 8сй И8А 84:2936; Сароп е! а1. 1989, №Шге 337:525; Тгаипескег е! а1. 1989, №1иге 339:68; 2ейтек§1 е! а1. 1990, ΌΝΑ Се11 Вю1. И8А 9:347; Вугп е! а1. 1990, №!ите. 344:667; Аа!коп е! а1. 1990, 1. Се11. Вю1. 110:2221; Аа!коп е! а1. 1991, №1иге 349:164; Агиййо е! а1. 1990, Се11 61:1303; ЬтДеу е! а1. 1991, 1. Ехр. Меб. 173:721; ЬтДеу е! а1. 1991, 1. Ехр. Меб. 174:561; 8(атепкоу1с е! а1., 1991, Се11 66:1133; АкккешЩ е! а1. 1991, Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 88:10535; Ье881аиег е! а1. 1991, Еиг. 1. 1ттипо1. 27:2883; Рерре1 е! а1. 1991, 1. Ехр. Меб. 174:1483; Веппей е! а1. 1991, 1. Вю1. Скет. 266:23060; Кигкскпег е! а1. 1992, 1. Вю1. Скет. 267:9354; Ска1ирпу е! а1. 1992, Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 89:10360; Кйбд^ау апб Согтап, 1991, 1. Се11. Вю1. 115, АЬк!гас! №. 1448; 2кепд е! а1. 1995, 1. 1ттип. 154:5590). Указанные молекулы обычно обладают как биологической активностью, ассоциированной со связанной представляющей интерес молекулой, так и эффекторной функцией или некоторыми другими требуемыми характеристиками, связанными с константной областью иммуноглобулина (например, биологической стабильностью, клеточной секрецией).
Бс-часть константной области иммуноглобулина в зависимости от изотипа иммуноглобулина, может включать в себя домены СН2, СН3 и СН4, а также шарнирную область. Химерные белки, содержащие Бс-часть иммуноглобулина, приобретают несколько требуемых свойств химерного белка, включая повышенную стабильность, увеличенное время полужизни в сыворотке (смотрите Сароп е! а1. 1989, №!иге 337: 525), а также связывание с Бс-рецепторами, такими как неонатальный Бс-рецептор (БсЯп) (патенты США №№ 6086875, 6485726, 6030613; АО 03/077834; И82003-0235536А1).
БсРп является активным в эпителиальной ткани взрослых особей и экспрессируется в просвете кишечника, легочных дыхательных путях, назальных поверхностях, вагинальных поверхностях и ректальных поверхностях (патент США № 6485726). Химерные белки, состоящие из БсЯп-связывающих партнеров (например, 1дС, Бс-фрагментов), могут быть эффективно перемещены через эпителиальные барьеры посредством БсЯп, таким образом обеспечивая неинвазивные способы системного введения требуемой терапевтической молекулы. Кроме того, химерные белки, содержащие БсЯп-связывающий партнер, подвергаются эндоцитозу клетками, экспрессирующими БсКп. Но вместо того, чтобы стать мишенью для разрушения, указанные химерные белки снова возвращаются в циркуляцию, таким образом увеличивая время полужизни указанных белков ш у1уо.
- 1 012566
Части константных областей иммуноглобулина, например, РсКп-связывающие партнеры, обычно связаны посредством дисульфидных связей и других неспецифичных взаимодействий друг с другом, образуя димеры и мультимеры более высокого порядка. Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что трансцитоз химерных белков, состоящих из РсВи-связывающих партнеров, по-видимому, ограничен молекулярной массой химерного белка, при этом формы с более высокой молекулярной массой транспортируются менее эффективно.
Химерные белки, состоящие из биологически активных молекул, после введения обычно будут взаимодействовать с молекулой-мишенью или клеткой. Настоящее изобретение, кроме того, частично основано на неожиданном открытии того, что гибриды мономер-димер с одной биологически активной молекулой, но с двумя частями константной области иммуноглобулина, например двумя РсКпсвязывающими партнерами, функционируют и могут транспортироваться более эффективно, чем гомодимеры, также называемые в данном описании просто «димеры», или мультимеры более высокого порядка с двумя или более копиями биологически активной молекулы.
Отчасти это является следствием того факта, что химерные белки, состоящие из двух или более биологически активных молекул, которые существуют в виде димеров и мультимеров более высокого порядка, могут иметь стерические препятствия для взаимодействия с молекулой-мишенью или клеткой вследствие присутствия двух или более биологически активных молекул в тесном соседстве друг с другом, и что биологическая молекула может обладать высокой аффинностью к себе самой.
Соответственно, один аспект изобретения относится к химерным белкам, состоящим из биологически активной молекулы, которая транспортируется через эпителиальный барьер. Дополнительный аспект изобретения относится к химерным белкам, состоящим по меньшей мере из одной биологически активной молекулы, которая способна взаимодействовать со своей молекулой-мишенью или клеткой с небольшим стерическим препятствием или самоагрегацией или в отсутствие таковых.
Аспекты изобретения относятся к химерным белкам, содержащим первую и вторую полипептидные цепи, при этом первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, где часть константной области иммуноглобулина была модифицирована так, чтобы она включала в себя биологически активную молекулу, а вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, где часть константной области иммуноглобулина не была модифицирована таким образом, чтобы она содержала биологически активную молекулу первой цепи.
Сущность изобретения
Изобретение относится к химерному белку, содержащему одну биологически активную молекулу и две молекулы по меньшей мере части константной области иммуноглобулина. Химерный белок способен взаимодействовать с молекулой-мишенью или клеткой с меньшим стерическим препятствием по сравнению с химерным белком, состоящим по меньшей мере из двух биологически активных молекул и по меньшей мере части двух константных областей иммуноглобулина. Изобретение также относится к химерному белку, содержащему по меньшей мере одну биологически активную молекулу и две молекулы по меньшей мере части константной области иммуноглобулина, который транспортируется через эпителиальный барьер более эффективно, чем соответствующий гомодимер, т.е. в котором обе цепи связаны с одной и той же биологически активной молекулой. Таким образом изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, связанные вместе, где указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, а указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, но не содержит вариабельной области иммуноглобулина и не содержит какой-либо связанной биологически активной молекулы.
Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без вариабельной области иммуноглобулина или какой-либо биологически активной молекулы и где указанная вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 1, 2, 5, 10 или 20 кДа. В одном варианте вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 0-2 кДа. В одном варианте вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 510 кДа. В одном варианте вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 15-20 кДа.
Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, нековалентно связанную с любой другой молекулой, за исключением части иммуноглобулина указанной первой полипептидной цепи.
Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и указанная вторая цепь состоит по мень
- 2 012566 шей мере из части константной области иммуноглобулина и необязательно аффинной метки.
Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и указанная вторая цепь, по существу, состоит по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина и необязательно аффинной метки.
Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без вариабельной области иммуноглобулина или какой-либо биологически активной молекулы и необязательно молекулу с молекулярной массой менее 10, 5, 2 или 1 кДа. В одном варианте вторая цепь содержит молекулу менее 15-20 кДа. В одном варианте вторая цепь содержит молекулу менее 5-10 кДа. В одном варианте вторая цепь содержит молекулу менее 1-2 кДа.
Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере первый домен, при этом указанный первый домен имеет по меньшей мере один специфичный связывающий партнер, и в котором указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере второй домен, где указанный второй домен является специфичным партнером при связывании с указанным первым доменом, без какой-либо вариабельной области иммуноглобулина или биологически активной молекулы.
Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь неодинаковы, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую первую полипептидную цепь, содержащую биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и необязательно линкер, и второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую вторую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина и необязательно линкер, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая первой конструкцией ДНК, и экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая второй конструкцией ДНК, и выделение гибридов мономер-димер, состоящих из полипептидной цепи, кодируемой первой конструкцией ДНК, и полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК.
Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь неодинаковы и в котором указанная первая полипептидная цепь содержит биологически активную молекулу, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере первый домен, при этом указанный первый домен имеет по меньшей мере один специфичный связывающий партнер, и в котором указанная вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и второй домен, где указанный второй домен является специфичным партнером при связывании с указанным первым доменом, без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую указанную первую полипептидную цепь, и второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую указанную вторую полипептидную цепь, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая первой конструкцией ДНК, и экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая второй конструкцией ДНК, и выделение гибридов мономер-димер, состоящих из полипептидной цепи, кодируемой первой конструкцией ДНК, и полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК.
Изобретение относится к способу получения химерного белка согласно изобретению, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую первую полипептидную цепь, содержащую биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и необязательно линкер, культивирование клетки в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая первой конструкцией ДНК, выделение полипептидной цепи кодируемой первой конструкцией ДНК, и трансфекцию клетки второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую вторую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина, культивирование клетки в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая второй конструкцией ДНК, выделение полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК, объединение полипептидной цепи, кодируемой первой конструкцией ДНК, и полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК, в таких условиях, при которых образуются гибриды мономер-димер, содержащие поли
- 3 012566 пептидную цепь, кодируемую первой конструкцией ДНК, полипептидную цепь, кодируемую второй конструкцией ДНК, и выделение указанных гибридов мономер-димер.
Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь не являются одинаковыми, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая конструкцией ДНК, с Ν-концевым цистеином, так что образуются димеры полипептидной цепи, выделение димеров, состоящих из двух копий полипептидной цепи, кодируемой конструкцией ДНК, и химическое взаимодействие выделенных димеров с биологически активной молекулой, при этом указанная биологически активная молекула имеет сложный тиоэфир на Сконце, в таких условиях, при которых биологически активная молекула взаимодействует преимущественно только с одной полипептидной цепью димера, тем самым образуя гибрид мономер-димер.
Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь не являются одинаковыми, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая конструкцией ДНК, с Ν-концевым цистеином, так что образуются димеры полипептидных цепей, и выделение димеров, содержащих две копии полипептидной цепи, кодируемой конструкцией ДНК, и химическое взаимодействие выделенных димеров с биологически активной молекулой, при этом указанная биологически активная молекула имеет сложный тиоэфир на Сконце, так что биологически активная молекула связывается с каждой цепью димера, денатурацию димера, состоящего из части иммуноглобулина, связанного с биологически активной молекулой с образованием мономерных цепей, объединение мономерных цепей с полипептидной цепью, содержащей по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, не имеющей связанной с ней биологически активной молекулы, с образованием гибридов мономер-димер и выделение гибридов мономер-димер.
Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь не являются одинаковыми, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая конструкцией ДНК, в виде смеси двух полипептидных цепей, где смесь содержит полипептид с Ν-концевым цистеином и полипептид с цистеином вблизи Ν-конца, выделение димеров, состоящих из смеси полипептидных цепей, кодируемых конструкцией ДНК, и химическое взаимодействие выделенных димеров с биологически активной молекулой, при этом указанная биологически активная молекула имеет активный сложный тиоэфир, так что образуются, по меньшей мере, несколько гибридов мономер-димер, и выделение гибрида мономер-димер из указанной смеси.
Изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, включающему в себя введение химерного белка согласно изобретению, благодаря чему лечат заболевание или состояние.
Дополнительные объекты и преимущества изобретения будут указаны частично в описании, которое следует далее, и частично будут очевидными, исходя из описания, или могут быть исследованы при практическом осуществлении изобретения. Объекты и преимущества изобретения будут понятны и достигнуты с помощью элементов и комбинаций, подробно указанных в прилагаемой формуле изобретения.
Следует понимать, что и приведенное выше общее описание и следующее далее подробное описание являются только примерными и пояснительными и не ограничивают изобретение, которое заявлено.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 является схематичной диаграммой, сравнивающей структуру гомодимера ЕРО-Ес или димера и структуру гибрида мономер-димер Еро-Ес.
На фиг. 2а показана аминокислотная последовательность химерного белка фактор УП-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой, и пропептид (жирным шрифтом), который узнается витамин К-зависимой γ-карбоксилазой, которая модифицирует фактор У11 с достижением полной активности. Последовательность впоследствии расщепляется РАСЕ с получением фактор УП-Ес.
На фиг. 2Ь показана аминокислотная последовательность химерного белка фактор ΙΧ-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой, и пропептид (жирным шрифтом), который узнается витамин К-зависимой γ-карбоксилазой, которая модифицирует фактор ΙΧ, с достижением полной активности. Последовательность впоследствии расщепляется РАСЕ с получением фактор ΙΧ-Ес.
На фиг. 2с показана аминокислотная последовательность химерного белка ΓΡΝα-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в
- 4 012566 результате зрелого ΙΕΝα-Ес.
На фиг. 26 показана аминокислотная последовательность химерного белка ΙΡΝα-Ес-А-линкер. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого ΙΕΝα-Гс-А- линкер.
На фиг. 2е показана аминокислотная последовательность химерного белка Е1ад-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого Е1ад-Ес.
На фиг. 2ί показана аминокислотная последовательность химерного белка Еро-ССА-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого Еро-ССА-Ес. Также жирным шрифтом показан кислый двухспиральный домен.
На фиг. 2д показана аминокислотная последовательность химерного белка ССВ-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого ССВ-Ес. Также жирным шрифтом показан основной двухспиральный домен.
На фиг. 211 показана аминокислотная последовательность химерного белка Сук-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого Сук-Ес. Когда данная последовательность образуется в клетках СНО, некоторый процент молекул неправильно расщепляется сигнальной пептидазой, так что слева от Ν-конца имеются две дополнительные аминокислоты, тем самым препятствуя связыванию биологически активной молекулы с С-концевым тиоэфиром (например, посредством простого лигирования). Когда указанные неправильно расщепленные формы димеризуются с правильно расщепленным Сук-Ес и затем подвергаются взаимодействию с биологически активными молекулами с С-концевыми тиоэфирами, образуются гибриды мономер-димер гибриды мономер-димер.
На фиг. 21 показана аминокислотная последовательность химерного белка ΙΕΝα-0815-Γο. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого 1Е№/.-С815-Ес.
На фиг. 2_) показана аминокислотная последовательность химерного белка Еро-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате Еро-Ес. Также жирным шрифтом показан 8-аминокислотный линкер.
На фиг. 3а показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка фактор νΐΙ-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут) и пропептид (жирным шрифтом), который узнается витамин К-зависимой γ-карбоксилазой, которая модифицирует фактор VII с достижением полной активности. Транслируемая последовательность затем расщепляется РАСЕ с получением зрелого фактор νΐΙ-Ес.
На фиг. 3Ь показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка фактор ΙΧ-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут) и пропептид (жирным шрифтом), который узнается витамин К-зависимой γ-карбоксилазой, которая модифицирует фактор ΙΧ с достижением полной активности. Транслируемая последовательность затем расщепляется РАСЕ с получением зрелого фактор ΙΧ-Ес.
На фиг. 3с показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка ΙΡΝα-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляцией с образованием в результате зрелого ΙΡΝα-Ес.
На фиг. 36 показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка ΙΡΝα-Ес-А-линкер. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого ΙΡΝα-Ес А-линкер.
На фиг. 3е показана аминокислотная последовательность химерного белка Е1ад-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Е1ад-Ес.
На фиг. 3ί показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка Еро-ССА-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Еро-ССА-Ес. Также жирным шрифтом показан кислый двухспиральный домен.
На фиг. 3д показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка ССВ-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого ССВ-Ес. Также жирным шрифтом показан основной двухспиральный домен.
На фиг. 31 показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка Сук-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Сук-Ес.
На фиг. 31 показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка ШЫа-С815-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого ШЫа-6815-Ес.
- 5 012566
На фиг. 3| показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка Еро-Ес. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Еро-Ес. Также жирным шрифтом показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 8-аминокислотный линкер.
Фиг. 4 показывает пути образования гибридов мономер-димер посредством обычного лигирования.
На фиг. 5а показана аминокислотная последовательность Ес ΜΕ8ΝΆ (ЗЕО ΙΌ N0:4).
На фиг. 5Ь показана последовательность ДНК Ес ΜΕ8ΝΆ (ЗЕО ΙΌ N0:5).
На фиг. 6 приведено сравнение противовирусной активности гомодимера ΙΕΝα (т.е. состоящего из 2 молекул ΙΕΝα) с активностью гибрида мономер ΙΕΝα-димер (т.е. состоящего из 1 молекулы ΙΕΝα).
На фиг. 7 приведено сравнение свертывающей активности химерного гибрида мономер-димер фактор УНа-Ес (одна молекула фактора УН) и химерного гомодимера фактор УНа-Ес (две молекулы фактора УН).
На фиг. 8 приведено сравнение перорального дозирования у новорожденных крыс химерного гибрида мономер-димер фактор УЛа-Ес (одна молекула фактора УН) и химерного гомодимера фактор УПаЕс (две молекулы фактора УН).
На фиг. 9 приведено сравнение перорального дозирования у новорожденных крыс химерного гибрида мономер-димер фактор ΙΧ-Ес (одна молекула фактора ΙΧ) и химерного гомодимера.
На фиг. 10 показано временное исследование, сравнивающее химерный гибрид мономер-димер фактор ΙΧ-Ес (одна молекула фактора ΙΧ), вводимого перорально новорожденным крысам, с вводимым перорально химерным гомодимером.
Фиг. 11 показывает фармакокинетику димера Еро-Ес по сравнению с гибридом мономер-димер Еро-Ес у макак-крабоедов после однократной легочной дозы.
На фиг. 12 приведено сравнение сывороточной концентрации у обезьян подкожно введенного гибрида мономер-димер Еро-Ес и подкожно введенного Агапекр® (дарбепоэтин альфа).
На фиг. 13 приведено сравнение сывороточной концентрации у обезьян внутривенно введенного гибрида мономер-димер Еро-Ес и внутривенно введенного Агапекр® (дарбепоэтин альфа) и Еродеп® (эпоэтин альфа).
На фиг. 14 показана кривая для колонки МипеОс Кеб 2™ (РтоМеНс ЬИеЗаепсек, Ιπο., \¥аупе. ΝΕ) и ЗОЗ-ПААГ-фракций с колонки, содержащих гибрид мономер-димер ЕроЕс, димер ЕроЕс и Ес. Гидрид мономер-димер ЕроЕс обнаружен во фракциях 11, 12, 13 и 14. Димер ЕроЕс обнаружен во фракции 18. Ес обнаружен во фракциях 1/2.
На фиг. 15 показана фармакокинетика ГЕ^Ес с 8-аминокислотным линкером у макак-крабоедов после однократной легочной дозы.
На фиг. 16 показан стимуляция неоптерина в ответ на гомодимер ΙΓΝβ-Ес и гибрид мономер-димер ΙΓΝβ-Ес Ν297Α у макак-крабоедов.
На фиг. 17а показан нуклеотидная последовательность интерферон β-Ес.
На фиг. 17Ь показана аминокислотная последовательность интерферон β-Ес.
На фиг. 18 показана аминокислотная последовательность Т20(а); Т21(Ь) и Т1249(с).
Описание вариантов
А. Определения
Аффинная метка в используемом в данном описании смысле означает молекулу, связанную со второй представляющей интерес молекулой, способную взаимодействовать со связывающим партнером в целях выделения или идентификации указанной второй представляющей интерес молекулы.
Аналоги химерных белков согласно изобретению или белки или пептиды, по существу, идентичные химерным белкам согласно изобретению, в используемом в данном описании смысле означают, что соответствующая аминокислотная последовательность белка или пептида по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична данной последовательности. В качестве примера такие последовательности могут быть вариантами, полученными из разных видов, или они могут быть получены из данной последовательности посредством укорочения, делеции, замены или добавления аминокислот. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием стандартных алгоритмов выравнивания, например посредством Баас Ьоса1 АНдптеп! Тоо1 (ВЬАЗТ), описанного в А1!ксйи1 е! а1. 1990, 1. Мо1. Вю1., 215: 403-410, алгоритма №еб1ешап е! а1. 1970, 1. Мо1. Вю1., 48: 444-453; алгоритма Меуегк е! а1. 1988, Сотри!. Арр1. Вюксг, 4: 11-17; или ТаШкоса е! а1. 1999, ЕЕМ8 МютоЬю1. Ьей., 174: 247-250, и т.д. Такие алгоритмы включены в программы ВБ-АЗТИ ВЬАЗТР и «ВЬАЗТ 2 Зесщепсек» (см. \\л\л\'.псЫп11п.ш11.до\7ВЕАЗТ). При использовании таких программ можно использовать параметры по умолчанию. Например, для нуклеотидных последовательностей можно использовать следующие установки в случае «ВЬАЗТ 2 Зесщепсек»: программа ВЬАЗТН награда за совпадение 2, штраф за несовпадение -2, штрафы за открытие пробела и удлинение пробела 5 и 2, соответственно, дар х_бгороГГ 50, ожидание 10, размер слова 11, фильтр 0Ν. Для аминокислотных последовательностей можно использовать следующие установки в случае «ВЬАЗТ 2 Зесщепсек»: программа ВЬАЗТР, матрица ВЕ0ЗИМ62, штрафы за открытие пробела и удлинение пробела 11 и 1, соответствен
- 6 012566 но, дар х_6гороГГ 50, ожидание 10, размер слова 3, фильтр ΟΝ.
Биодоступность в используемом в данном описании смысле означает степень и скорость, с которой вещество поглощается в живой системе или становится доступным в месте физиологической активности.
Биологически активная молекула в используемом в данном описании смысле означает неиммуноглобулиновую молекулу или ее фрагмент, обеспечивающую лечение заболевания или состояния или локализацию или направление молекулы к месту заболевания или состояния в организме посредством осуществления функции, или действия, или стимулирования, или ответа на функцию, действие или реакцию в биологическом контексте (например, в организме, клетке или ее модели ίη νίΐΓο). Биологически активные молекулы могут включать в себя по меньшей мере оно из следующих веществ: полипептиды, нуклеиновые кислоты, малые молекулы, такие как малые органические или неорганические молекулы.
Химерный белок в используемом в данном описании смысле относится к любому белку, состоящему из первой аминокислотной последовательности, полученной из первого источника, связанной ковалентно или нековалентно со второй аминокислотной последовательностью, полученной из второго источника, где первый и второй источники не являются одинаковыми. Первый источник и второй источник, которые не являются одинаковыми, могут включать два разных биологических объекта или два разных белка из одного и того же биологического объекта или биологический объект и небиологический объект. Химерный белок может включать, например, белок, полученный по меньшей мере из 2 разных биологических источников. Биологический источник может включать любую несинтетически полученную последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность (например, последовательность геномной или кДНК, плазмидный или вирусный вектор, нативный вирион или мутант или аналог, которые описаны далее в данном описании, любого из указанных выше). Синтетический источник может включать последовательность белка или нуклеиновой кислоты, полученную химически, а не в биологической системе (например, твердофазный синтез аминокислотных последовательностей). Химерный белок также может включать белок, полученный по меньшей мере из 2 разных синтетических источников, или белок, полученный по меньшей мере из одного биологического источника и по меньшей мере из одного синтетического источника. Химерный белок также может содержать первую аминокислотную последовательность, полученную из первого источника, ковалентно или нековалентно связанную с нуклеиновой кислотой, полученной из любого источника, или малой органической или неорганической молекулой, полученной из любого источника. Химерный белок может содержать молекулу линкера между первой и второй аминокислотными последовательностями, или между первой аминокислотной последовательностью и нуклеиновой кислотой, или между первой аминокислотной последовательностью и малой органической или неорганической молекулой.
Фактор свертывания в используемом в данном описании смысле означает любую молекулу или ее аналог природного происхождения или полученную рекомбинантно, которая предотвращает или снижает продолжительность эпизода кровотечения у субъекта с гемостатическим нарушением. Другими словами фактор свертывания означает любую молекулу, обладающую свертывающей активностью.
Свертывающая активность в используемом в данном описании смысле означает способность принимать участие в каскаде биохимических реакций, который завершается образованием сгустка фибрина, и/или уменьшать тяжесть, продолжительность или частоту геморрагии или эпизода кровотечения.
Димер в используемом в данном описании смысле относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, в котором и первая, и вторая цепи содержат биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. Гомодимер относится к димеру, в котором обе биологически активные молекулы являются одной и той же молекулой.
Димерно связанный гибрид мономер-димер относится к химерному белку, состоящему по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, например фрагмента Рс иммуноглобулина, биологически активной молекулы и линкера, который связывает их вместе, так что одна биологически активная молекула связана с 2 полипептидными цепями, каждая из которых содержит часть константной области иммуноглобулина. На фиг. 4 показан пример димерно связанного гибрида мономер-димер.
Конструкция ДНК в используемом в данном описании смысле означает молекулу ДНК или клон такой молекулы либо однонитевой, либо двунитевой, которая была модифицирована в результате вмешательства человека так, что она содержит участки ДНК, объединенные таким образом, чтобы они как целое не могли бы существовать в природе в ином случае. Конструкции ДНК содержат информацию, необходимую для управления экспрессией представляющих интерес полипептидов. Конструкции ДНК могут содержать промоторы, энхансеры и терминаторы транскрипции. Конструкции ДНК, содержащие информацию, необходимую для управления секрецией полипептида, также буду содержать по меньшей мере одну сигнальную последовательность секреции.
Домен в используемом в данном описании смысле означает область полипептида (включая белки, в том виде, как данный термин определен), имеющую некоторое отличительное физическое свойство или роль, включая, например, структуру с независимой укладкой, состоящую из участка полипептидной цепи. Домен может содержать последовательность с отличительным физическим признаком полипептида или может содержать фрагмент с физическим признаком, который сохраняет свои связывающие свойства (т.е. он может связываться со вторым доменом). Домен может быть связан с другим доменом. Други
- 7 012566 ми словами, первый домен может в естественных условиях связываться со вторым доменом.
Фрагмент в используемом в данном описании смысле относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по меньшей мере из 2 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 5 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 следующих друг за другом аминокислотных остатков или по меньшей мере 200 следующих друг за другом аминокислотных остатков или любую делецию или укорочение белка, пептида или полипептида.
Гемостаз в используемом в данном описании смысле означает остановку кровотечения или геморрагии или остановку потока крови через кровеносный сосуд или часть тела.
Гемостатическое расстройство в используемом в данном описании смысле означает генетически наследуемое или приобретенное состояние, характеризуемое тенденцией к геморрагии, либо спонтанно либо в результате травмы, или неспособностью образовывать сгусток фибрина.
Связанная в используемом в данном описании смысле относится к первой последовательности нуклеиновой кислоты, ковалентно связанной со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Первая последовательность нуклеиновой кислоты может быть непосредственно связана или помещена рядом со второй последовательностью нуклеиновой кислоты или, альтернативно, промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую последовательность со второй последовательностью. Связанная в используемом в данном описании смысле также может относиться к первой аминокислотной последовательности, ковалентно или нековалентно связанной со второй аминокислотной последовательностью. Первая аминокислотная последовательность может быть непосредственно связана или помещена рядом со второй аминокислотной последовательностью или, альтернативно, промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую аминокислотную последовательность со второй аминокислотной последовательностью.
Оперативно связанная в используемом в данном описании смысле означает, что первая последовательность нуклеиновой кислоты связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты так, что обе последовательности способны экспрессироваться в виде биологически активного белка или пептида.
Полипептид в используемом в данном описании смысле относится к полимеру аминокислот и не имеет отношения к конкретной длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин не исключает постэкспрессионные модификации полипептида, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, пэгилирование, добавление липидного остатка или добавление любой органической или неорганической молекулы. В определение включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты), и полипептиды с замещенными связями, а также другими модификациями, известными в данной области, как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе.
Высокая жесткость в используемом в данном описании смысле включает условия, легко определяемые специалистом в данной области на основании, например, длины ДНК. В общем такие условия определены в 8атЬгоок с1 а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2 еб. Уо1. 1, рр. 1.101-104, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге55 (1989), и включают применение раствора для предварительно промывки нитроцеллюлозных фильтров 5х88С. 0,5% 8Ό8, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), условия гибридизации в 50% формамиде, 6х88С при 42°С (или другом сходном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, в 50% формамиде при 42°С), и с промывкой примерно при 68°С, 0,2х88С, 0,1% 8Ό8. Специалисту в данной области будет известно, что температуру и концентрацию соли в растворе для промывки можно корректировать так, как это необходимо в соответствии с такими факторами, как длина зонда.
Умеренная жесткость в используемом в данном описании смысле включает условия, которые могут быть легко определены специалистом в данной области на основании, например длины ДНК. Основные условия приведены в 8атЬгоок е1 а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 26 еб. Уо1. 1, рр. 1.101-104, Со16 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге§8 (1989) и включают применение раствора для предварительной промывки нитроцеллюлозных фильтров 5х88С. 0,5% 8Ό8, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), условия гибридизации в 50% формамиде, 6х88С при 42°С (или другом сходном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, в 50% формамиде при 42°С) и условия промывки при 60°С, в 0,5х 88С, 0,1% 8Ό8.
Малая неорганическая молекула в используемом в данном описании смысле означает молекулу, не содержащую атомов углерода и имеющую размер не больше 50 кДа.
Малая органическая молекула в используемом в данном описании смысле означает молекулу, содержащую по меньшей мере один атом углерода и имеющую размер не больше 50 кДа.
Лечить, лечение, осуществление лечения в используемом в данном описании смысле означает любое из следующего: уменьшение тяжести заболевания или состояния; уменьшение продолжительности
- 8 012566 течения заболевания; ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или состоянием; оказание благотворного действия на субъект с заболеванием или состоянием без обязательного исцеления заболевания или состояния, профилактику одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или состоянием.
B. Усовершенствования, предлагаемые некоторыми вариантами осуществления изобретения
В изобретении предлагаются химерные белки (гибриды мономер-димер), содержащие первую и вторую полипептидные цепи, в которых указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина. На фиг. 1 сопоставлены традиционные слитые белковые димеры с одним примером гибрида мономер-димер согласно изобретению. В данном варианте биологически активной молекулой является ЕРО и часть иммуноглобулина представляет собой Есобласть 1дС.
Подобно другим химерным белкам, состоящим по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, изобретение относится к химерным белкам, которые обеспечивают повышенную стабильность и повышенную биодоступность химерного белка по сравнению с отдельной биологически активной молекулой. Однако, кроме того, поскольку только одна из двух цепей содержит биологически активную молекулу, химерный белок имеет меньшую молекулярную массу, чем химерный белок, в котором все цепи содержат биологически активную молекулу, и не желая при этом быть привязанными к какой-либо теории, это может приводить к химерному белку, более легко подвергаемому трансцитозу через эпителиальный барьер, например, посредством связывания с рецептором ЕеВи, таким образом повышая время полужизни химерного белка. Таким образом, в одном варианте изобретение относится к улучшенному неинвазивному способу (например, через любую поверхность слизистой оболочки, а именно пероральным, буккальным, подъязычным, назальным, ректальным, вагинальным или легочным или глазным путями) введения терапевтического химерного белка согласно изобретению. Таким образом, изобретение относится к способам достижения терапевтических уровней химерных белков согласно изобретению с использованием менее частых и более низких доз по сравнению с ранее описанными химерными белками (например, химерными белками, состоящими по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина и биологически активной молекулы, в которых все цепи химерного белка содержат биологически активную молекулу).
В другом варианте изобретение относится к инвазивному способу, например, подкожного, внутривенного введения терапевтического химерного белка согласно изобретению. Инвазивное введение терапевтического химерного белка согласно изобретению обеспечивает повышенное время полужизни терапевтического химерного белка, что в результате приводит к применению менее частых и более низких доз по сравнению с ранее описанными химерными белками (например, химерными белками, состоящими по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина и биологически активной молекулы, в которых все цепи химерного белка содержат биологически активную молекулу).
Еще одним преимуществом химерного белка, в котором только одна из цепей содержит биологически активную молекулу, является повышенная доступность биологически активной молекулы для ее клетки-мишени или молекулы-мишени, возникающая в результате уменьшенных стерических помех, уменьшенных гидрофобных взаимодействий, уменьшенных ионных взаимодействий или пониженной молекулярной массы по сравнению с химерным белком, в котором все цепи содержат биологически активную молекулу.
C. Химерные белки
Изобретение относится к химерным белкам, содержащим одну биологически активную молекулу, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и необязательно по меньшей мере один линкер. Часть иммуноглобулина будет иметь Ν- или аминоконец и С- или карбоксильный конец. Химерный белок может иметь биологически активную молекулу, связанную с Ν-концом части иммуноглобулина. Альтернативно, биологически активная молекула может быть связана с С-концом части иммуноглобулина. В одном варианте связь является ковалентной связью. В другом варианте связь является нековалентной связью.
Химерный белок необязательно может содержать по меньшей мере один линкер; таким образом, биологически активная молекула не должна быть непосредственно связана с частью константной области иммуноглобулина. Линкер может располагаться между биологически активной молекулой и частью константной области иммуноглобулина. Линкер может быть связан с Ν-концом части константной области иммуноглобулина или С-концом части константной области иммуноглобулина. Если биологически активная молекула состоит по меньшей мере из одной аминокислоты, то биологически активная молекула будет иметь Ν-конец и С-конец и линкер может быть связан с Ν-концом биологически активной молекулы или С-концом биологически активной молекулы.
Изобретение относится к химерному белку формулы Х-Еа-Е:Е или Е:Е-Ьа-Х, где X означает биологически активную молекулу, Ь означает необязательный линкер, Е означает по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и а является любым целым числом или нулем. Изобретение также
- 9 012566 относится к химерному белку формулы Та-Х-Ьа-Е:Е или Та-Е:Е-Ьа-Х, где X означает биологически активную молекулу, Ь означает необязательный линкер, Е означает по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, а является любым целым числом или нулем, Т означает второй линкер или, альтернативно, метку, которая может быть использована для облегчения очистки химерного белка, например, ЕЬАС-метка, гистидиновая метка, С8Т-метка, метка в виде связывающего мальтозу белка и (:) означает химическую ассоциацию, например по меньшей мере одну непептидную связь. В некоторых вариантах химическая ассоциация, т.е. (:) является ковалентной связью. В других вариантах химическая ассоциация, т. е. (:) является нековалентным взаимодействием, например ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, взаимодействием Ван-дер-Ваальса, водородной связью. Специалисту в данной области будет понятно, что когда а равно нулю, X будет непосредственно связан с Р. Таким образом, например, а может равняться 0, 1, 2, 3, 4, 5 или быть больше 5.
В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2а (8ЕО ΙΌ N0:6). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2Ь (8Е0 Ш N0:8). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2с (8Е0 ΙΌ N0:10). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 26 (8Е0 ΙΌ N0:12). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2е (8Е0 Ш N0:14). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2£ (8Е0 ΙΌ N0:16). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2д (8Е0 ΙΌ N0:18). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 211 (8Е0 ΙΌ N0:20). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 21 (8Е0 ΙΌ N0:22). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2_) (8Е0 ΙΌ N0:24). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 17Ь (8Е0 Ш N0:27).
1. Варианты химерных белков
Рассматриваются производные химерных белков согласно изобретению, антитела против химерных белков согласно изобретению и антитела против связывающих партнеров химерных белков согласно изобретению, и они могут быть получены изменением их аминокислотных последовательностей посредством замен, присоединений и/или делеций/укорочение или посредством введения химической модификации, которая приводит к функционально эквивалентным молекулам. Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые аминокислоты в последовательности любого белка могут быть заменены другими аминокислотами без неблагоприятного влияния на активность белка.
Следовательно, могут быть осуществлены различные изменения в аминокислотных последовательностях химерных белков согласно изобретению или в кодирующих последовательностях ДНК без существенной потери их биологической активности, функции или применимости. Производные, аналоги или мутанты, возникающие в результате таких изменений, и применение таких производных входит в объем настоящего изобретения. В конкретном варианте производное является функционально активным, т.е. способным проявлять одну или несколько активностей, связанных с химерными белками согласно изобретению, например связывание ЕеКп. ингибирование вирусов, гемостаз, продукция красных кровяных клеток. Многие анализы, позволяющие тестировать активность химерного белка, содержащего биологически активную молекулу, известны в данной области. В том случае, когда биологически активная молекула является ингибитором ВИЧ, активность можно тестировать измерением активности обратной транскриптазы, используя известные способы (см., например, Вагге-8тои881 е! а1. 1983, 8с1епсе 220: 868; Са11о е! а1. 1984, 8с1епсе 224: 500). Альтернативно, активность можно измерить посредством измерения фузогенной активности (см., например, №.188Ьаит е! а1. 1994, 1. У1го1. 68 (9): 5411). В том случае, когда биологической активностью является гемостаз, может быть осуществлен анализ 81аСЬо1 ЕУНа-гТЕ, чтобы оценить активность производных фактора У11а (1ойаппе88еп е! а1. 2000, В1оо6 Соащ.11а!юп ап6 Е1Ьппо1у818 11: 8159).
Заменители аминокислот в последовательности могут быть выбраны из других представителей класса, к которому относится аминокислота (смотрите табл. 1). Кроме того, различные аминокислоты обычно заменяют нейтральными аминокислотами, например аланином, лейцином, изолейцином, валином, пролином, фенилаланином, триптофаном и метионином (см., например, МасЬепиап е! а1. 1998, Ас!а РЬ.у8ю1. 8сап6. 8ирр1. 643: 55-67; 8азак1 е! а1. 1998, Α6ν. Вюрйуз. 35: 1-24).
- 10 012566
Таблица 1
Исходный остаток Примерные замены Типичные замены
А1а (А) Уа1, Ьеи, 11е Ьеи
Агд (К) Ьуз, С1п, Азп Ьуз
Азп (Ν) С1п 61п
Авр (□) 61и Б1и
Суз (С) Зег, А1а Зег
61п (О) Азп Азп
С1у (С) Рго, АЬа А1а
Н15 (Н) Азп, О1п, Ьуз, Агд Агд
11е (I) Ьеи, Уа1, Ме£, А1а, РЬе, норлейцин Ьеи
Ьеи (Ь) норлейцин, Не, 57а1, МеЪ, А1а, РЬе 11е
Ьуз (К) Агд, 1,4-диаминомасляная кислота, С1п, Азп Агд
Ме£ (М) Ьеи, РЬе, Не Ьеи
РЬе (К) Ьеи, УаЬ, Не, АЬа, Туг Ьеи
Рго (Р) АЬа ОЬу
Зег (3) ТЬг, А1а, Суз ТЬг
ТЬг (Т) Зег Зег
Тгр (И) Туг, РЬе Туг
Туг (Υ) Тгр, РЬе, ТЬг, Зег РЬе
Уа1 (V) Не, МеЬ, Ьеи, РЬе, АЬа, норлейцин Ьеи
2. Биологически активные молекулы
Изобретение предполагает применение любой биологически активной молекулы в качестве терапевтической молекулы согласно изобретению. Биологически активной молекулой может быть полипептид. Биологически активной молекулой может быть одна аминокислота. Биологически активная молекула может включать в себя модифицированный полипептид.
Биологически активная молекула может включать в себя липидную молекулу (например, стероид или холестерин, жирную кислоту, триацилглицерин, глицерофосфолипид или сфинголипид). Биологически активная молекула может включать в себя молекулу сахара (например, глюкозу, сахарозу, маннозу). Биологически активная молекула может включать в себя молекулу нуклеиновой кислоты (например, ДНК, РНК). Биологически активная молекула может включать в себя малую органическую молекулу или малую неорганическую молекулу.
a) Цитокины и факторы роста
В одном варианте биологически активной молекулой является фактор роста, гормон или цитокин или их аналог или фрагмент. Биологически активной молекулой может быть любой агент, способный индуцировать рост и пролиферацию клеток. В конкретном варианте биологически активной молекулой является любой агент, который может индуцировать пролиферацию эритроцитов. Таким образом, один из примеров биологически активной молекулы, предлагаемой в изобретении, является ЕРО. Биологически активная молекула также может включать, без ограничения, ΚΑΝΤΕ8, ΜΙΡ1α, ΜΙΡΙβ, 1Ь-2, 1Ь-3, СМ-С8Е, гормон роста, фактор некроза опухолей (например, ΤΝΡα или β).
Биологически активная молекула может включать интерферон α, полученный либо синтетически, либо рекомбинантно, включая, без ограничения, любой из примерно двадцати пяти структурно родственных подтипов, как, например, интерферон-а2а, новый коммерчески доступный для клинического применения (ВоГегоп®, Воейе), и интерферон-а2Ь, также одобренный для клинического применения (Ιηΐτοη®, 8сйеттд), а также генетически сконструированные варианты различных подтипов, включая, но не ограничивая указанным, коммерчески доступный консенсусный интерферон α (1пГегдеп®, 1п1еттипе, разработанный Атдеп) и консенсусный интерферон лейкоцитов человека, см., например, патенты США № 4695623, 4897471, интерферон β, эпидермальный фактор роста, гонадотропин-рилизинг гормон (СпВН), лейпролид, фолликулостимулирующий гормон, прогестерон, эстроген или тестостерон.
Список цитокинов и факторов роста, которые могут быть использованы в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США № 6086875, 6485726, 6030613; \УО 03/077834; И82003-0235536А1).
b) Противовирусные агенты
В одном варианте биологически активной молекулой является противовирусный агент, включая его фрагменты и аналоги. Противовирусный агент может включать любую молекулу, которая ингибирует или предотвращает репликацию вирусов, или ингибирует или предотвращает внедрение вируса в клетку, или ингибирует или предотвращает выход вируса из клетки. В одном варианте противовирусным агентом является ингибитор слияния. В одном варианте противовирусным агентом является цитокин, кото
- 11 012566 рый ингибирует репликацию вирусов. В другом варианте противовирусным агентом является интерферон а.
Ингибитором слияния вирусов для применения в химерном белке может быть любая молекула, которая снижает или предотвращает проникновение вируса через клеточную мембрану клетки-мишени. Ингибитором слияния вирусов может быть любая молекула, которая уменьшает или предотвращает образование синцитиев по меньшей мере между двумя чувствительными клетками. Ингибитором слияния вирусов может быть любая молекула, которая снижает или предотвращает связывание липидной бислойной мембраны эукариотической клетки и липидного бислоя вируса, имеющего оболочку. Примеры вируса, покрытого оболочкой, включают, но не ограничивают указанным, ВИЧ-1, ВИЧ-2, 81У, вирус гриппа, парагриппа, вирус Эпштейн-Барра, СМУ, вирус простого герпеса 1, вирус простого герпеса 2 и респираторно-синцитиальный вирус.
Ингибитором слияния вирусов может быть любая молекула, которая уменьшает или предотвращает слияние вирусов, включая, без ограничения, полипептид, малую органическую молекулу или малую неорганическую молекулу. В одном варианте ингибитором слияния является полипептид. В одном варианте ингибитором слияния вирусов является полипептид длиной 3-36 аминокислот. В другом варианте ингибитором слияния вирусов является полипептид длиной 3-50 аминокислот, 10-65 аминокислот, 10-75 аминокислот. Полипептид может состоять из встречающейся в природе аминокислотной последовательности (например, фрагмент др41), включая ее аналоги и мутанты, или полипептид может состоять из аминокислотной последовательности, не встречающейся в природе, при условии, что полипептид проявляет активность ингибитора слияния вирусов.
В одном варианте ингибитором слияния вирусов является полипептид, идентифицированный как ингибитор слияния вирусов с использованием по меньшей мере одного компьютерного алгоритма, например, ЛЬЬМОТ15, 107x178x4 и ΡΕΖΙΡ (см., например, патенты США № 6013263, 6015881, 6017536, 6020459, 6060065, 6068973, 6093799 и 6228983).
В одном варианте ингибитором слияния вирусов является ингибитор слияния ВИЧ. В одном варианте ВИЧ представляет собой ВИЧ-1. В другом варианте ВИЧ представляет собой ВИЧ-2. В одном варианте ингибитором слияния ВИЧ является полипептид, состоящий из фрагмента белка оболочки др41 ВИЧ-1. Ингибитор слияния ВИЧ может содержать, например, Т20 (8ЕЦ ΙΌ N0:1) или его аналог, Т21 (8ЕЦ ΙΌ N0:2) или его аналог, Т1249 (8ЕЦ ГО N0:3) или его аналог, НзСОдр41 (Ьоищ ек а1. 2001, 1. ΒίοΙ. Сйеш. 276: (31) 29485) или его аналог или 5-йейх (Воок ек а1. 2001, 8с1еисе 291: 884) или его аналог.
Анализы, известные в данной области, можно использовать для того, чтобы тестировать ингибирующую слияние вирусов активность полипептида, малой органической молекулы или малой неорганической молекулы. Такие анализы включают анализ обратной транскриптазы, анализ р24 или анализ образования синцитиев (см., например, патент США № 5464933).
Список противовирусных агентов, которые можно использовать в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США № 6086875, 6485726, 6030613; XVО 03/077834; И82003-0235536А1).
с. Гемостатические агенты
В одном варианте биологически активной молекулой является фактор свертывания или другой агент, который стимулирует гемостаз, включая его фрагменты и аналоги. Фактор свертывания крови может включать любую молекулу, которая обладает свертывающей активностью или активирует молекулу, обладающую свертывающей активностью. Фактор свертывания крови может состоять из полипептида. Фактором свертывания крови может быть, например, без ограничения, фактор VIII, фактор IX, фактор XI, фактор XII, фибриноген, протромбин, фактор V, фактор VII, фактор X, фактор XIII или фактор фон Виллебранда. В одном варианте фактором свертывания крови является фактор VII или фактор УПа. Фактором свертывания крови может быть фактор, который принимает участие во внешнем пути свертывания крови. Фактором свертывания крови может быть фактор, который принимает участие во внутреннем пути свертывания крови. Альтернативно, фактором свертывания крови может быть фактор, который принимает участие как во внешнем, так и во внутреннем пути.
Фактором свертывания крови может быть фактор свертывания крови человека или фактор свертывания крови животного, отличного от человека, например полученный от примата, отличного от человека, свиньи или любого млекопитающего. Фактором свертывания крови может быть химерный фактор свертывания крови, например, фактор свертывания крови может содержать часть фактора свертывания крови человека и часть фактора свертывания крови свиньи или часть первого фактора свертывания крови животного, отличного от человека, и часть второго фактора свертывания крови животного, отличного от человека.
Фактором свертывания крови может быть активированный фактор свертывания крови. Альтернативно, фактором свертывания крови может быть неактивная форма фактора свертывания крови, например зимоген. Неактивный фактор свертывания крови может подвергаться активации после связывания по меньшей мере с частью константной области иммуноглобулина. Неактивный фактор свертывания крови может быть активирован после введения субъекту. Альтернативно, неактивный фактор свертывания кро
- 12 012566 ви может быть активирован перед введением.
В некоторых вариантах может быть использована эндопептидаза, например фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты (РАСЕ), или любой представитель семейства РАСЕ, такой как РС8К1-9, включая его укороченные варианты, или его дрожжевой эквивалент Кех2 из 8. сетеу181ае и укороченные варианты Кех2 (Кех2 1-675) (см., например, патенты США № 5077204, 5162220, 5234830, 5885821, 6329176), чтобы отщепить пропептид с образованием зрелого химерного белка согласно изобретению (например, фактора VII, фактора IX).
б) Другие белковые биологически активные молекулы
В одном варианте биологически активной молекулой является рецептор или его фрагмент или аналог. Рецептор может быть экспрессирован на поверхности клетки или, альтернативно, рецептор может быть экспрессирован внутри клетки. Рецептор может быть вирусным рецептором, например СЭ4. ССВ5, СХСВ4, СЭ21, СЭ46. Биологически активной молекулой может быть бактериальный рецептор. Биологически активной молекулой может быть белок внеклеточного матрикса или его фрагмент или аналог, важный для колонизации бактерий и инфекции (см., например, патенты США № 5648240, 5189015, 5175096), или белок поверхности бактерий, важный для адгезии и инфекции (см., например, патент США № 5648240). Биологически активной молекулой может быть рецептор фактора роста, гормона или цитокина или его фрагмент или аналог, например рецептор ΤΝΕα, рецептор эритропоэтина, СО25, СО122 или СЭ132.
Список других белковых молекул, которые можно использовать в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США № 6086875, 6485726, 6030613, XVО 03/077834; И82003-0235536Л1).
е) Нуклеиновые кислоты
В одном варианте биологически активной молекулой является нуклеиновая кислота, например, ДНК, РНК. В одном конкретном варианте биологически активной молекулой является нуклеиновая кислота, которая может использована в интерференции РНК (ΚΝΆί). Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой в качестве примера, но не ограничивая указанным, антисмысловую молекулу, или рибозим, или аптамер.
Молекулы антисмысловой РНК и ДНК действуют, прямо блокируя трансляцию мРНК посредством гибридизации с мРНК-мишенью и предотвращая трансляцию белка. Способы на основе антисмысловых последовательностей заключаются в конструировании олигонуклеотидов, которые комплементарны мРНК гена-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды будут связываться с комплементарными мРНКтранскриптами гена-мишени и предотвращать трансляцию. Абсолютная комплементарность не требуется.
Последовательность «комплементарная» части РНК, в используемом в данном описании смысле означает последовательность, обладающую достаточной комплементарностью, чтобы быть способной гибридизоваться с РНК, образуя стабильный дуплекс; таким образом в случае двунитевых антисмысловых нуклеиновых кислот может быть тестирована одна нить ДНК-дуплекса или может быть исследовано образование триплекса. Способность гибридизоваться будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. В общем, чем длиннее гибридизующаяся нуклеиновая кислота, тем больше ошибочно спариваемых оснований с РНК она может содержать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс, в зависимости от обстоятельств). Специалист в данной области может выяснить приемлемую степень ошибочного спаривания, используя стандартные способы определения точки плавления гибридизованного комплекса.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты должны иметь по меньшей мере шесть нуклеотидов в длину и предпочтительно являются олигонуклеотидами длиной в пределах от 6 до примерно 50 нуклеотидов. В конкретных аспектах олигонуклеотид имеет по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 17 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов или по меньшей мере 50 нуклеотидов.
Олигонуклеотиды могут быть ДНК или РНК, или их химерными смесями, или производными, или модифицированными вариантами, однонитевыми или двунитевыми. Олигонуклеотид может быть модифицирован по остатку основания, остатку сахара или фосфатному остову, например, чтобы повысить стабильность молекулы, гибридизацию и т.д. Олигонуклеотид может включать в себя другие боковые группы, такие как полипептиды (например, для нацеливания на рецепторы клеток-хозяев ίη νίνο), или агенты, способствующие транспорту через клеточную мембрану (см., например, ЬеШпдет е! а1. 1989, Ргос. Νίώ. Асаб. 8с1. И8Л 86: 6553; Ьетайте е! а1. 1987, Ргос. Асаб. 8с1. И8Л 84: 648; νθ 88/09810,) или гематоэнцефалический барьер (см., например, νθ 89/10134), агенты для запускаемого гибридизацией расщепления (см., например, Кго1 е! а1. 1988, ВюТесйшдиек 6: 958) или интеркалирующие агенты (см., например, Ζοη 1988, Рйатт. Век. 5: 539). С этой целью олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, например полипептидом, агентом для запускаемого гибридизацией перекрестного сшивания, транспортирующим агентом или агентом запускаемого гибридизацией расщепления.
Молекулы рибозимов, сконструированные для каталитического расщепления транскриптов мРНК гена-мишени, также можно использовать для того, чтобы предотвратить трансляцию мРНК гена-мишени и, следовательно, экспрессию продукта гена-мишени (см., например, νθ 90/11364; 8аг«ег е! а1. 1990, 8с1епсе 247, 1222-1225).
- 13 012566
Рибозимы являются молекулами ферментной РНК, способными катализировать специфичное расщепление РНК (см. Ко881 1994, СиггеШ Βίοίομν 4: 469). Механизм действия рибозимов заключается в специфичной для последовательности гибридизации молекулы рибозима с комплементарной РНКмишенью с последующим событием эндонуклеолитического расщепления. В состав молекул рибозимов могут входить одна или несколько последовательностей, комплементарных мРНК гена-мишени, и должна входить хорошо известная каталитическая последовательность, ответственная за расщепление мРНК. В отношении указанной последовательности см., например, патент США № 5093246.
В одном варианте рибозимы, которые расщепляют мРНК в сайт-специфично узнаваемых последовательностях, можно использовать для разрушения мРНК генов-мишеней. В другом варианте предполагается применение рибозимов типа «головки молота». Рибозимы типа «головки молота» расщепляют мРНК в положениях, продиктованных фланкирующими областями, которые образуют комплементарные пары оснований с мРНК-мишенью. Единственным требованием является, чтобы мРНК-мишень имела следующую последовательность из двух оснований: 5'-ИО-3'. Конструирование и получение рибозимов типа «головки молота» хорошо известно в данной области и описано более полно в Муегз 1995, Мо1еси1аг В1о1оду аий В1о1есЬио1оду: А СошргеНепЦуе Эе^к Векегепсе, УСН РиЬЕзкегв, Ыеи Уогк, и в Назе1окк аий Сег1асН 1988, Ыа1иге, 334: 585.
к) Малые молекулы
Изобретение также предполагает применение любой терапевтической малой молекулы или лекарственного средства в качестве биологически активной молекулы в химерном белке согласно изобретению. Список малых молекула и лекарственных средств, которые можно использовать в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США №№ 6086875, 6485726, 6030613, АО 03/077834, И82003-0235536А1).
2. Иммуноглобулины
Химерные белки согласно изобретению содержат по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. Иммуноглобулины состоят из четырех белковых цепей, которые связаны ковалентно: двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Каждая цепь, кроме того, состоит из одной вариабельной области и одной константной области. В зависимости от изотипа иммуноглобулина константная область тяжелой цепи состоит 3 или 4 доменов константной области (например, СН1, СН2, СН3, СН4). Некоторые изотипы, кроме того, содержат шарнирную область.
Часть константной области иммуноглобулина может быть получена от любого млекопитающего. Часть константной области иммуноглобулина может включать в часть константной области иммуноглобулина человека, константной области иммуноглобулина примата, отличного от человека, константной области бычьего иммуноглобулина, константной области иммуноглобулина свиньи, константной области иммуноглобулина мыши, константной области иммуноглобулина овцы или константной области иммуноглобулина крысы.
Часть константной области иммуноглобулина может быть получена рекомбинантно или путем синтеза. Иммуноглобулин может быть выделен из библиотеки кДНК. Часть константной области иммуноглобулина может быть выделена из фаговой библиотеки (см., например, МсСаккеПу е1 а1. 1990, №11иге 348: 552, Капд е1 а1. 1991, Ргос. №111. Асай. 8сг И8А 88: 4363; ЕР 0589877 В1). Часть константной области иммуноглобулина может быть получена перетасовкой генов с известными последовательностями (Магк е! а1. 1992, В|о1Тес1то1. 10: 779). Часть константной области иммуноглобулина может быть выделена посредством рекомбинации ίη у1уо (Аа1егкои8е е! а1. 1993, Ыис1. Ас1й Вее. 21: 2265). Иммуноглобулин может быть гуманизированным иммуноглобулином (патент США № 5585089, 1опез е! а1. 1986, №11иге 332: 323).
Часть константной области иммуноглобулина может включать в себя часть 1дО, 1дА, 1дМ, 1дЭ или 1дЕ. В одном варианте иммуноглобулин является 1дО. В другом варианте иммуноглобулин является 1дО1. В другом варианте иммуноглобулин является 1дС2.
Часть константной области иммуноглобулина может включать в себя полную константную область тяжелой цепи или ее фрагмент или аналог. В одном варианте константная область тяжелой цепи может содержать домен СН1, домен СН2, домен СН3 и/или шарнирную область. В другом варианте константная область тяжелой цепи может содержать домен СН1, домен СН2, домен СН3 и/или домен СН4.
Часть константной области иммуноглобулина может содержать фрагмент Ес. Фрагмент Ес может состоять из доменов СН2 и СН3 иммуноглобулина и шарнирной области иммуноглобулина. Фрагмент Ес может представлять собой фрагмент Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. В одном конкретном варианте часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Ес 1дС1. В другом варианте часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Ес 1дС2.
В другом варианте часть константной области иммуноглобулина представляет связывающий партнер неонатального рецептора Ес (ЕсВп). ЕсВп-связывающим партнером является любая молекула, которая может быть специфично связана рецептором ЕсВп с последующим активным транспортом рецептором ЕсВп ЕсВп-связывающего партнера. Специфично связанный относится к двум молекулам, образующим комплекс, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфичное связывание характеризуется высокой аффинностью и емкостью от низкой до умеренной, что отличаются
- 14 012566 от неспецифичного связывания, которое обычно имеет низкую аффинность при емкости от умеренной до высокой. Обычно связывание считают специфичным, когда константа аффинности КА выше 106 М-1 или более предпочтительно выше 108 М-1. При необходимости неспецифичное связывание может быть уменьшено без существенного влияния на специфичное связывание варьированием условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, разрешенное для связывания, концентрация блокирующего агента (например, сывороточного альбумина, казеина молока) и т.д., могут быть оптимизированы специалистом в данной области с использованием обычных способов.
Рецептор РсКп был выделен из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Последовательности РсКп человека, РсКп обезьян, РсКп крыс и РсКп мышей известны (81огу с1 а1. 1994, Т Ехр. Мей. 180: 2377). Рецептор РсКп связывает 1дС (но не другие классы иммуноглобулинов, такие как 1дА, 1дМ, Ι§Ό и 1дЕ) при относительно низком рН, активно транспортирует 1дС трансклеточным путем в просвет в направлении серозной оболочки и затем высвобождает 1дО при относительно более высоком рН, обнаруженном в интерстициальных жидкостях. Он экспрессируется в эпителиальной ткани взрослого организма (патенты США №№ 6485726, 6030613, 6086875, \\'О 03/077834; И82003-0235536А1), включая эпителий легких и кишечника (1§гае1 е1 а1. 1997, 1ттипо1оду 92: 69), эпителий проксимальных почечных канальцев (КоЬауакЫ е1 а1. 2002, Ат. Т Р11У5ю1. Кепа1 Р11У5ю1. 282: Р358), а также эпителий носа, вагинальные поверхности и поверхности желчного дерева.
РсКп-связывающие партнеры согласно настоящему изобретению охватывают любую молекулу, которая может быть специфично связана рецептором РсКп, включая целый 1дО, Рс-фрагмент 1дО и другие фрагменты, которые содержат полную область связывания рецептора РсКп. Область Рс-части 1дО, которая связывается с рецептором РсКп, была описана рентгеновской кристаллографией (ВигшеКЮг е1 а1. 1994, №1иге 372: 379). Основная область контакта Рс с РсКп расположена вблизи соединения доменов СН2 и СН3. Все контакты Рс-РсКп находятся в одной тяжелой цепи 1д. РсКп-связывающие партнеры включают полный 1дО, Рс-фрагмент 1дО и другие фрагменты 1дО, которые содержат полную область связывания РсКп. Основные места контакта включают в себя аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СН3. Все ссылки, сделанные на нумерацию аминокислот иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов или областей, основаны на КаЬа! е1 а1. 1991, 8ес.|иепсе5 оГ РгоЮнъ оГ 1ттипо1одюа1 1п(егек1, и. 8. Эераг1теп1 оГ РнЬКс Неайй, ВеШекйа, ΜΌ.
Рс-область 1дО может быть модифицирована в соответствии с хорошо известными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и тому подобные, чтобы получить модифицированный 1дО или его Рс-фрагменты или части, которые будут связываться рецептором РсКп. Такие модификации включают модификации, удаленные от сайтов контакта РсКп, а также модификации в сайтах контакта, которые сохраняют или даже усиливают связывание с РсКп. Например, следующие одиночные остатки аминокислот в Рс(Рсу1) 1дС1 человека могут быть заменены без существенной потери аффинности связывания Рс в отношении РсКп: Р238А, 8239А, К246А, К248А, Ό249Α, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, Ό265Α, 8267А, Н268А, Е269А, Ό270Α, Е272А, Ь274А, Ν276Α, Υ278Α, Ό280Α, У282А, Е283А, Н285А, Ν286Α,
Т289А, К290А, К292А, Е293А, Е294А, Р295А, Υ296Р, Ν297Α, 8298А, Υ300Р, К301А, У303А, У305А,
Т307А, Ь309А, О311А, Ό312Α, Ν315Α, К317А, Е318А, К320А, К322А, 8324А, К326А, А327Р, Р329А,
А330Р, Р331А, Е333А, К334А, Т335А, 8337А, К338А, К340А, Р342А, К344А, Е345А, Р347А, К355А,
Е356А, М358А, Т359А, К360А, Ν361Α, Р362А, Υ373Α, 8375А, Ό376Α, А378Р, Е380А, Е382А, 8383А, Ν384Α, Р386А, Е388А, Ν389Α, Ν390Α, Υ391Ε, К392А, Ь398А, 8400А, Ό401Α, Ό413Α, К414А, К416А, Р418А, Р419А, Ν421Α, У422А, 8424А, Е430А, Ν434Α, Т437А, Р438А, К439А, 8440А, 8444А и К447А, где, например, Р238А означает пролин дикого типа, заменяемый аланином в положении номер 238. В качестве примера один конкретный вариант включает мутацию Ν2 97А, удаляющую высоко консервативный сайт Ν-гликозилирования. Кроме аланина, другие аминокислоты могут быть использованы для замены аминокислот дикого типа в указанных выше положениях. Мутации могут быть по отдельности введены в Рс с образованием более ста РсКп-связывающих партнеров, отличных от нативного Рс, кроме того, комбинации из двух, трех или более указанных отдельных мутаций могут быть введены вместе, приводя к образованию еще сотен РсКп-связывающих партнеров. Кроме того, один из РсКпсвязывающих партнеров в гибриде мономер-димер может быть мутирован, а другой РсКп-связывающий партнер вообще не мутирован, или они могут быть мутированы оба, но разными мутациями. Любую из приведенных в данном описании мутаций, включая Ν297Α, можно использовать для модификации Рс, независимо от биологически активной молекулы (например, ЕРО, ΙΡΝ, фактор IX, Т20).
Некоторые из указанных выше мутаций могут придавать новые функциональности РсКпсвязывающему партнеру. Например, один вариант включает Ν297Α, удаляющую высоко консервативный сайт Ν-гликозилирования. Влияние мутации заключается в уменьшении иммуногенности и при этом увеличении времени полужизни в циркуляции РсКп-связывающего партнера, и в придании РсКпсвязывающему партнеру неспособности связываться с РсуК1, РсуКПА, РсуКПВ и РсуКША, не подвергая риску аффинность в отношении РсКп (Коийейде е1 а1. 1995, Тгап8р1ап1айоп 60: 847; Рпепй е1 а1. 1999,
- 15 012566
Тгап8р1ап1абоп 68: 1632; 81пе1б5 е! а1. 1995, Ι.ΒίοΙ. Сйет. 276: 6591). В качестве следующего примера новой функциональности, возникающей в результате мутаций, описанных выше, может быть увеличена аффинность в отношении ЕсКп, в некоторых случаях выше чем аффинность дикого типа. Указанная повышенная аффинность может отражать повышенную скорость образования комплекса, пониженную скорость распада комплекса или/и повышенную скорость образования комплекса и пониженную скорость распада комплекса вместе. Мутации, которые предположительно придают повышенную аффинность в отношении ЕсКп, включают Т256А, Т307А, Е380А и Ν434Α (81ие1б5 е! а1. 2001, 1. Βίο1. Сйет. 276: 6591).
Кроме того, по меньшей мере три рецептора Ес гамма человека, по-видимому, узнают сайт связывания на Ιβ6 в области ниже шарнира, обычно аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новой функциональности и возможной пониженной иммуногенности может возникать в результате мутаций данной области, например при замене аминокислот 233-236 Ι§61 человека «ЕЬЬС» на соответствующую последовательность из Ι§62 «РУА» (с делецией одной аминокислоты). Показано, что ЕсуШ, ЕсуКП и ЕсуКШ, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с Ι§61, когда введены такие мутации. \Уагб и 6йебе 1995, Тйетареибс 1ттипо1оду 2: 77 и Агтоиг е! а1. 1999, Еиг. 1. 1ттипо1. 29: 2613.
В одном варианте ЕсКп-связывающим партнером является полипептид, содержащий последовательность ΡΚΝ88ΜΙ8ΝΤΡ (8ЕО ΙΌ N0:26) и необязательно, кроме того, содержащий последовательность, выбранную из 1Ю8Е6ТО (8ЕО ΙΌ N0:27), НОХЕ8Э6К (8 НО ΙΌ N0:28), НОМ8Э6К (8 НО ΙΌ N0:29) или УКЗНЬСр (8ЕО ΙΌ N0:30) (патент США № 5739277).
Два рецептора ЕсКп могут связывать одну молекулу Ес. Кристаллографические данные свидетельствуют, что каждая молекула ЕсКп связывает один полипептид гомодимера Ес. В одном варианте связывание ЕсКп-связывающего партнера, например Ес-фрагмента Ιβ6, с биологически активной молекулой обеспечивает средства доставки биологически активной молекулы пероральным, буккальным, подъязычным, ректальным, вагинальным путем, в виде аэрозоля, вводимого назально, или через легочный путь, или глазным путем. В другом варианте химерный белок может быть введен инвазивно, например подкожно, внутривенно.
Специалисту в данной области будет понятно, что части константной области иммуноглобулина для применения в химерном белке согласно изобретению могут включать его мутанты или аналоги, или могут включать химически модифицированные константные области иммуноглобулина (например, пэгилированные), или ее фрагменты (смотрите, например, Ак1ат апб Эеп1 1998, Вюсонщдабоп: Рто!ет Соирбпд Тесйтсщек Еог 1йе Вютебюа1 ЗОепсек Мастбап КеЕегепсе, Ьопбоп). В одном случае мутант может обеспечивать повышенное связывание ЕсКп-связывающего партнера по отношению к ЕсКп. Также для применения в химерном белке согласно изобретению предлагаются пептидомиметики по меньшей мере части константной области иммуноглобулина, например пептидомиметик Ес-фрагмента или пептидомиметик ЕсКп-связывающего партнера. В одном варианте пептидомиметик идентифицируют, используя фаговый дисплей или посредством скрининга химической библиотеки (см., например, МсСайебу е! а1. 1990, №1Ц1ге 348: 552, Капд е! а1. 1991, Ргос. №б. Асаб. 8сЕ И8А 88: 4363; ЕР0 589 877В1).
3. Необязательные линкеры
Химерный белок согласно изобретению необязательно может содержать по меньшей мере одну линкерную молекулу. Линкер может состоять из любой органической молекулы. В одном варианте линкером является полиэтиленгликоль (ПЭГ). В другом варианте линкер состоит из аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот. В одном варианте линкер является восьмиаминокислотным линкером ЕЕА6АААУ (8Е0 ΙΌ N0:31). Любой из линкеров, приведенных в данном описании, может быть использован в химерном белке согласно изобретению, например гибрид мономер-димер, содержащий ЕЕАОАААУ, независимо от биологически активной молекулы (например, ЕР0, фактор ΙΧ).
Линкер может содержать последовательность Оп. Линкер может содержать последовательность (ОА)п (8Е0 ΙΌ N0:32). Линкер может содержать последовательность (668)п(8Е0 ΙΌ N0:33). Линкер может содержат последовательность (ОО8)||(СООО8)||(8Е0 ΙΌ N0:34). В указанных случаях п может быть целым числом от 1 до 10, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Примеры линкеров включают, но не ограничены указанным, ООО (8 НО ГО N0:35), 8608008 (8 НО ГО N0:36), 668668668668666 (8 НО ГО N0:37), 6686686666866668 (8ЕО ГО N0:38), 668668668668668668 (8ЕО ГО N0:39). Линкер не исключает или не уменьшает биологическую активность химерного белка. Необязательно линкер усиливает биологическую активность химерного белка, например, дополнительного уменьшая влияние стерических помех и делая биологически активную молекулу более доступной для связывающего ее сайта мишени.
В одном конкретном варианте линкер для интерферона α имеет длину 15-25 аминокислот. В другом конкретном варианте линкер для интерферона α имеет длину 15-20 аминокислот. В другом конкретном варианте линкер для интерферона α имеет длину 10-25 аминокислот. В другом конкретном варианте линкер для интерферона α имеет длину 15 аминокислот. В одном варианте линкером для интерферона α
- 16 012566 является (СССС8)п (8Е0 ΙΌ ΝΟ:40), где С означает глицин, 8 означает серии и η является целым числом от 1 до 10. В конкретном варианте η равно 3.
Линкер также может включать в себя остаток, способный расщепляться либо химически (например, гидролиз эфирной связи), ферментативно (например, включение последовательности расщепления протеазой) или фотолитически (например, хромофор, такой как 3-амино-3-(2-нитрофенил)пропионовая кислота (ΑΝΡ)), для того, чтобы высвобождать биологически активную молекулу из Ес-белка.
4. Димеризация химерных белков с использованием специфичных связывающих партнеров
В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит первую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере первый домен, при этом указанный первый домен имеет по меньшей мере один специфичный связывающий партнер, и вторую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере второй домен, где указанный второй домен является специфичным связывающим партнером указанного первого домена. Таким образом, химерный белок содержит полипептид, способный димеризоваться с другим полипептидом в результате взаимодействия первого домена и второго домена. Способы димеризации антител с использованием гетерологичных доменов известны в данной области (патенты США № 5807706 и 5910573; Ко81е1пу е1 а1. 1992, 1. 1ттипо1. 148 (5): 1547).
Димеризация может происходить в результате образования ковалентной связи или, альтернативно, нековалентной связи, например гидрофобного взаимодействия, сил Ван-дер-Ваальса, взаимного расположения амфифильных пептидов, такого как, без ограничения, альфа-спирали, взаимодействия зарядов аминокислот, несущих противоположные заряды, таких как, без ограничения, лизин и аспарагиновая кислота, аргинин и глутаминовая кислота. В одном варианте домен представляет собой спиральный мотив, содержащий спираль, поворот и другую спираль. В другом варианте домен является лейциновым зиппером, содержащим пептид, имеющий несколько повторяющихся аминокислот, в котором каждая седьмая аминокислота является остатком лейцина. В одном варианте специфичным связывающим партнером является ГоУщп (смотрите Вгапбеп е1 а1. 1991, И'ИгобисНоп То Рго1еш 81гис1иге. Саг1апб РиЬйкЫпд, Νονν Уогк).
В другом варианте связывание опосредовано химическим связыванием (см., например, Вгеппап е1 а1. 1985, 8с1епсе 229: 81). В данном варианте интактные иммуноглобулины или химерные белки, состоящие по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, расщепляют, чтобы создать фрагменты тяжелой цепи. Указанные фрагменты восстанавливают в присутствии агента для образования комплексов дитиолов арсенита натрия, чтобы стабилизировать соседние дитиолы и предотвратить образование межмолекулярных дисульфидов. Созданные фрагменты затем превращают в производные тионитробензоата (ΤΝΒ). Одно из производных ΤΝΒ затем снова превращают в тиол фрагмента тяжелой цепи восстановлением меркаптоэтиламином и затем смешивают с эквимолярным количеством другого производного ΤΝΒ с образованием химерного димера.
Ό. Нуклеиновые кислоты
Изобретение относится к первой конструкции нуклеиновой кислоты и второй конструкции нуклеиновой кислоты, каждая из которых содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере часть химерного белка согласно изобретению. В одном варианте первая конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть константной области иммуноглобулина, оперативно связанную со второй последовательностью ДНК, кодирующей биологически активную молекулу, и указанная вторая конструкция ДНК содержит последовательность ДНК, кодирующую константную область иммуноглобулина, без второй последовательности ДНК, кодирующей биологически активную молекулу.
Биологически активная молекула может, например, включать, но не в качестве ограничения, ингибитор слияния вирусов, фактор свертывания крови, фактор роста, или гормон, или рецептор, или аналог, или фрагмент любого из указанных выше.
Последовательности нуклеиновых кислот также могут включать в себя дополнительные последовательности или элементы, известные в данной области (например, промоторы, энхансеры, поли Апоследовательности, аффинные метки). В одном варианте последовательность нуклеиновой кислоты второй конструкции необязательно может включать в себя последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую линкер, помещенный между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей биологически активную молекулу и часть константной области иммуноглобулина. Последовательность нуклеиновой кислоты второй конструкции ДНК необязательно может включать в себя линкерную последовательность, помещенную перед или после последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей биологически активную молекулу и/или часть константной области иммуноглобулина.
В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты состоит из ДНК. В другом варианте конструкция нуклеиновой кислоты состоит из РНК. Конструкция нуклеиновой кислоты может представлять собой вектор, например вирусный вектор или плазмиду. Примеры вирусных векторов включают, но не ограничены указанным, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса или вектор на основе вируса лейкоза мышей. Примеры плазмид включают, но не ограничены указанным, риС, рСЕМ и рСЕХ.
В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой
- 17 012566 кислоты, показанную на фиг. 3а (8ЕС ΙΌ N0:7). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3Ь (8ЕС ΙΌ N0:9). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3с (8ЕС ΙΌ N0:11). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 36 (8ЕС ΙΌ N0:13). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3е (8ЕС ΙΌ N0:15). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3Г (8ЕС ΙΌ N0:17). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3д (8ЕС ΙΌ N0:19). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 311 (8ЕС Ш N0:21). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3ί (8ЕС ΙΌ N0:23). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3_) (8ЕС ΙΌ N0:25). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 17а (8ЕС ΙΌ N0:27).
Вследствие известной вырожденности генетического кода, в котором более чем один кодон может кодировать одну и ту же аминокислоту, последовательность ДНК может изменяться по сравнению с последовательностями, показанными в 8ЕС ΙΌ N0:7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 или 27, но все еще кодировать полипептид, имеющий соответствующую аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 или 26, соответственно. Такие варианты последовательности ДНК могут возникать в результате молчащих мутаций (например, происходящих во время ПЦР-амплификации) или могут быть продуктом преднамеренного мутагенеза нативной последовательности. Таким образом изобретение относится к изолированным последовательностям ДНК, кодирующим полипептиды согласно изобретению, выбранным из: (а) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕС ΙΌ N0:7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 или 27; (Ь) ДНК, кодирующей полипептиды 81 Τ) ΙΌ N0:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 или 26; (с) ДНК, способной гибридизоваться с ДНК по (а) или (Ь) в условиях умеренной жесткости, и которая кодирует полипептиды согласно изобретению; (6) ДНК, способная гибридизоваться с ДНК по (а) или (Ь) в условиях высокой жесткости и которая кодирует полипептиды согласно изобретению, и (е) ДНК, которая является вырожденной в результате генетического кода по сравнению с ДНК, определенной в (а), (Ь), (с) или (6), и которая кодирует полипептиды согласно изобретению. Конечно, полипептиды, кодируемые такими последовательностями ДНК, входят в объем изобретения.
В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность, кодирующую химерный белок согласно изобретению, также могут содержать нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны нативной последовательности. Также предполагаются варианты, в которых молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность, кодирующую химерный белок согласно изобретению, содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 98% идентична, по меньшей мере на 99% идентична или по меньшей мере на 99,9% идентична нативной последовательности. Нативная последовательность может включать любую последовательность ДНК, не измененную искусственно человеком. Процент идентичности можно определить визуальным просмотром и математическим расчетом. Альтернативно, процент идентичности двух последовательностей нуклеиновой кислоты можно определить сравнением информации о последовательности с использованием компьютерной программы САР, версия 6.0, описанной Оехсгсих е! а1. 1984, №с1. Ас16к Век. 12: 387 и доступной из υηίνβΓκίίγ оГ ХУЕсопкю Сепебск Сотри!ег Сгоир (и^ССС). Предпочтительные параметры, используемые по умолчанию, в случае программы САР включают: (1) матрицу унарного сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для неидентичности) нуклеотидов и матрицу взвешивающего сравнения СпЬкко\' ап6 Вигдекк 1986, №с1. Ас16к Век. 14: 6745, которые описаны 8скчаг!х ап6 ЭауНоГГ. е6к. 1979, Абак оГ Рго(ет 8ециепсе ап6 8(гис(иге, №1!юпа1 Вюте6юа1 ВекеагсЕ Роип6а(юп, рр. 353-358; (2) штраф 3,0 за каждый пробел и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пробеле и (3) отсутствие штрафа за концевые пробелы. Также можно использовать другие программы, используемые специалистом в области сравнения последовательностей.
Е. Синтез химерных белков
Химерные белки, содержащие по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и биологически активную молекулу, могут быть синтезированы с использованием способов, известных в данной области. Например, химерные белки согласно изобретению могут быть синтезированы рекомбинантно в клетках (см., например, 8атЬгоок е! а1. 1989, Мо1еси1аг С1ошпд А ЕаЬога(огу Мапиа1, Со16 8рппд НагЬог ЕаЬога(огу, N. Υ. и АикиЬе1 е! а1. 1989, Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬНкЫпд Аккос1а(ек ап6 \УПеу 1п(егкс1епсе, N. Υ.). Альтернативно, химерные белки согласно изобретению могут быть синтезированы с использованием известных способов синтеза, таких как твердофазный синтез. Способы синтеза хорошо известны в данной области (см., например, МеггШе16, 1973, СЕет1са1 Ро1урер66ек, (Ка(коуапшк ап6 Рапауобк е6к.) рр. 335-61; МеггШе16 1963, I. Ат. СЕет. 8ос. 85:2149; Эа^зк е! а1. 1985, ВюсЕет. 1п(1. 10:394; Ртп е! а1. 1976, ТЕе Рго(ешк (36 е6.) 2:105; Епккоп е! а1. 1976, ТЕе Рго(ешк (36
- 18 012566 еб.) 2:257; патент США № 3941763). Альтернативно, химерные белки согласно изобретению могут быть синтезированы с использованием комбинации способов на основе рекомбинации и способов синтеза. В некоторых применениях может быть полезным применение либо способа на основе рекомбинации, либо комбинации способа на основе рекомбинации и способа синтеза.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие биологически активную молекулу, могут быть легко синтезированы с использованием способов рекомбинации, хорошо известных в данной области. Альтернативно, пептиды как таковые могут быть синтезированы химическим путем. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть синтезированы стандартными способами, известными в данной области, например, посредством применения автоматизированного синтезатора ДНК (такого как коммерчески доступные из Вюкеагсй, Лррбеб Вюкук1етк, и т.д.). В качестве примеров фосфоротиоатные олигонуклеотиды могут быть синтезированы способом 81ет е1 а1. 1988, №с1. Ас1бк Век. 16: 3209, метилфосфонатные олигонуклеотиды могут быть получены в результате применения подложек из полимерного стекла с контролируемым размером пор, как описано в 8апп е1 а1. 1988, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 85: 7448. Дополнительные способы синтеза нуклеиновых кислот известны в данной области (см., например, патенты США № 6015881, 6281331, 6469136).
Последовательности ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина или его фрагменты, могут быть клонированы из различных библиотек геномной или кДНК, известных в данной области. Способы выделения таких последовательностей ДНК с использованием основанных на зондах способов являются обычными методиками и хорошо известны специалистам в данной области. Зонды для выделения таких последовательностей ДНК могут быть основаны на опубликованных последовательностях ДНК (см., например, Ше1ег е1 а1. 1980, Се11 22: 197-207). Можно использовать способ полимеразной цепной реакции (ПЦР), описанный МиШк е1 а1. (патент США № 4683195) и МиШк (патент США № 4683202). Выбор библиотеки и подбор зондов для выделения таких последовательностей ДНК осуществляется специалистом в данной области. Альтернативно, последовательности ДНК, кодирующие иммуноглобулины или их фрагменты, можно получить из векторов, которые, как известно в данной области, содержат иммуноглобулины или их фрагменты.
Для рекомбинантного получения первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую часть химерного белка согласно изобретению (например, часть константной области иммуноглобулина) и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую часть химерного белка согласно изобретению (например, часть константной области иммуноглобулина и биологически активную молекулу), встраивают в соответствующие носители для экспрессии, например, векторы, которые содержат необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности, или в случае вектора на основе РНК-вируса необходимые элементы для репликации и трансляции. Нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный белок, встраивают в вектор в правильной рамке считывания.
Экспрессирующими носителями затем трансфицируют или котрансфицируют подходящую клеткумишень, которая будет экспрессировать полипептиды. Способы трансфекции, известные в данной области, включают, но не ограничены указанным, осаждение фосфатом кальция (\Мщ1ег е1 а1. 1978, Се11 14: 725) и электропорацию (№итапп е1 а1. 1982, ЕМВО, I. 1: 841) и реагенты на основе липосом. Может быть использовано множество систем хозяин-экспрессирующий вектор, чтобы экспрессировать химерные белки, указанные в данном описании, включая как прокариотические, так и эукариотические клетки. Системы включают, но не ограничены указанным, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. со11), трансформированные экспрессирующими векторами на основе рекомбинантной ДНК бактериофага или плазмидной ДНК, содержащими соответствующую кодирующую последовательность; дрожжи или нитчатые грибы, трансформированные рекомбинантными экспрессирующими векторами дрожжей или грибов, содержащими соответствующую кодирующую последовательность; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, на основе вируса мозаики цветной капусты или вируса мозаики табака) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Τί-плазмидой), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; или системы клеток животных, включая клетки млекопитающих (например, клетки СНО, Сок, НеЬа).
В том случае, когда химерный белок согласно изобретению синтезируют рекомбинантно в прокариотической клетке, может быть желательной укладка химерного белка. Химерный белок, полученный таким способом, может быть подвергнут рефолдингу до биологически активной конформации с использованием условий, известных в данной области, например денатурацией в восстанавливающих условиях и затем медленным диализом в РВ8.
В зависимости от используемой системы экспрессии экспрессируемый химерный белок затем выделяют способами, хорошо разработанными в данной области (например, аффинной хроматографией, эксклюзионной хроматографией по размеру, ионообменной хроматографией).
Экспрессирующие векторы могут кодировать метки, которые дают возможность легко очищать рекомбинантно полученный химерный белок. Примеры включают, но не ограничены указанным, вектор
- 19 012566 рИК278 (КиШег с1 а1. 1983, ЕМВО к 2: 1791), в котором последовательности, кодирующие химерный белок, указанный в данном описании, могут быть лигированы в вектор в рамке с областью, кодирующей 1ас ζ, так что получается гибридный белок; векторы рСЕХ могут быть использованы для экспрессии химерных белков согласно изобретению с меткой в виде глутатион-8-трансферазы (С8Т). Указанные белки обычно растворимы и могут быть легко очищены из клеток посредством адсорбции на глутатионагарозных шариках с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы содержат сайты расщепления (тромбин, или протеаза фактора Ха, или протеаза Рге8с1ккюп™ (Рйагтааа, Реараск, Ν. I.)) для простого удаления метки после очистки.
Чтобы повысить эффективность получения, могут быть сконструированы полинуклеотиды, кодирующие множественные единицы химерного белка согласно изобретению, разделенные сайтами расщепления ферментами. Полученный в результате полипептид может быть расщеплен (например, обработкой соответствующим ферментом), чтобы получить полипептидные единицы. Это может повысить выход полипептидов, управляемый одним промотором. При использовании в соответствующих вирусных системах экспрессии управление трансляцией каждого полипептида, кодируемого мРНК, осуществляется внутри транскрипта, например, посредством внутреннего сайта присоединения рибосомы, ΙΚΞδ. Таким образом полицистронная конструкция направляет транскрипцию одной большой полицистронной мРНК, которая в свою очередь направляет трансляцию множества отдельных полипептидов. Такой подход исключает продуцирование и ферментативный процессинг полибелков и может значительно увеличить выход полипептида под управлением одного промотора.
Векторы, используемые для трансформации, обычно будут содержать селектируемый маркер, используемый для того, чтобы идентифицировать трансформанты. В бактериальных системах он может включать ген резистентности к антибиотику, такому как ампициллин или канамицин. Селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают резистентность к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Одним из амплифицируемых селектируемых маркеров является ген ЭНЕК. Другим амплифицируемым маркером является кДНК ЭНЕК (81топкеп ап6 Ьеуткоп 1983, Ргос. Аса6. 8сг И8А 80: 2495). Обзор селектируемых маркеров приведен ТПШу (МаттаПап Се11 Тесйпо1оду, ВиЦег\\'ог111 РиЬйкйегк, 8Гопейат, МА) и выбор селектируемых маркеров может осуществить специалист в данной области.
Селектируемые маркеры могут быть введены в клетку в отдельной плазмиде в одно и то же время с представляющим интерес геном или они могут быть введены в одной и той же плазмиде. При введении в одной и той же плазмиде селектируемый маркер и представляющий интерес ген могут быть под контролем разных промоторов или одного и того же промотора, в случае последнего расположения продуцируется дицистронный мессенджер. Конструкции такого типа известны в данной области (например, патент США № 4713339).
Элементы экспрессии экспрессирующих систем варьируют по своей длине и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин/вектор в экспрессирующем векторе можно использовать любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцируемые промоторы, такие как рЬ бактериофага λ, р1ас, рГгр, р1ас (гибридный промотор р1гр-1ас) и тому подобные; при клонировании в системах клеток насекомых можно использовать такие промоторы, как промотор полиэдрина бакуловируса; при клонировании в системах клеток растений можно использовать промоторы, полученные из генома растительных клеток (например, промоторы теплового шока; промотор для малой субъединицы КИВКСО; промотор для белка, связывающего хлорофилл а/Ь) или из вирусов растений (например, промотор 358 РНК СаМV; промотор белка оболочки ΤΜν); при клонировании в системах клеток млекопитающих можно использовать промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7,5 К вируса вакцинии); при создании линий клеток, которые содержат множественные копии продукта экспрессии, можно использовать векторы, основанные на 8ν40, ВРV и ЕВV с соответствующим селектируемым маркером.
В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы растений, экспрессия последовательностей, кодирующих линейные или нециклические формы химерных белков согласно изобретению, может управляться любым из ряда промоторов. Например, можно использовать вирусные промоторы, такие как промоторы 358 РНК и 198 РНК СаΜV (Впккоп еГ а1. 1984, №11иге 310: 511-514) или промотор белка оболочки ΤΜν (ТакатаГки е1 а1. 1987, ЕМВО к 6: 307-311); альтернативно, можно использовать промоторы растений, такие как промотор малой субъединицы КИВКСО (Соп.^1 е1 а1. 1984, ЕМВО к 3: 1671-1680; Вгодйе е1 а1. 1984, 8с1епсе 224: 838-843) или промотор теплового шока, например 1кр17.5-Е или 1кр17.3-В сои (Сиг1еу е1 а1. 1986, Мо1. Се11. Вю1. 6: 559-565). Указанные конструкции могут быть введены в клетки растений с использованием Т1-плазмид, К1-плазмид, векторов на основе вирусов растений, прямой трансформацией ДНК, микроинъекцией, электропорацией и т. д. Обзор таких способов смотрите, например, в \Уе1ккЬас11 ап6 \Уе1ккЬасН 1988, МеГйобк Гог Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду, Асабетю Ргекк, ΝΥ,
- 20 012566
8еск1оп¥Ш, рр. 421-463; и Спеюоп апб Согеу 1988, Р1апк Мо1еси1аг Βίοίοβν. 26 Еб., В1аск1е, Ьопбоп, СИ. 79.
В одной системе экспрессии насекомых, которую можно использовать для получения химерных белков согласно изобретению, используют вирус ядерного полиэдроза Аикодгарйа саНГогшса (Лс№¥) в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках 8роборкега Ггид1регба. Кодирующая последовательность может быть клонирована в несущественных областях (например, в гене полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора Лс№¥ (например, промотор полиэдрина). Успешное встраивание кодирующей последовательности приведет к инактивации гена полиэдрина и продукции «невкрапленного» рекомбинантного вируса (т.е. вируса, у которого отсутствует белковая оболочка, кодируемая геном полиэдрина). Затем указанные рекомбинантные вирусы используют для инфекции клеток 8роборкега Ггид1регба, в которых встроенный ген экспрессируется (см., например, 8шйй ек а1. 1983, 1. ¥^^ο1. 46: 584; патент США № 4215051). Дополнительные примеры такой системы экспрессии можно найти в Ли5иЬе1 ек а1., еб§. 1989, Сштепк Ргокосок ш Мо1еси1аг В1о1оду, ¥ο1. 2, Сгеепе РиЫ18Й. Л55ос. апб \νίΕ\· Шкегаскепсе.
Другой системой, которую можно использовать для экспрессии химерных белков согласно изобретению, является система экспрессии гена глутаминсинтетазы, также называемая «системой экспрессии С8» (Бопха В1о1оц1с8 РЬС, ВегккЫге иК). Указанная система экспрессии подробно описана в патенте США № 5981216.
В клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать ряд основанных на вирусах систем экспрессии. В тех случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована с комплексом регуляции транскрипции/трансляции аденовируса, например поздним промотором и состоящей из трех частей лидерной последовательностью. Затем указанный химерный ген может быть встроен в аденовирусный геном посредством рекомбинации 1п νίΙΐΌ или 1п у1уо. Инсерция в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) в результате приведет к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид у инфицированных хозяев (см., например, Бодан апб 811епк 1984, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 81: 3655). Альтернативно, можно использовать промотор 7.5К вакцинии (см., например, Маскей ек а1. 1982, Ргос. №ак1. Асаб. 8ск И8А 79:7415; Маскей ек а1. 1984, 1. ¥^^ο1. 49:857; РашсаП ек а1. 1982, Ргос. №ак1. Асаб. 8οΐ. И8А 79:4927).
В тех случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована с комплексом регуляции транскрипции/трансляции аденовируса, например поздним промотором и состоящей из трех частей лидерной последовательностью. Затем указанный химерный ген может быть встроен в аденовирусный геном посредством рекомбинации ш уйго или ίπ у1уо. Инсерция в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) в результате приведет к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид у инфицированных хозяев (см., например, Ьодап апб 811епк 1984, Ргос. №ак1. Асаб. 8ск И8А 81: 3655). Альтернативно, можно использовать промотор 7.5 К вакцинии (см., например, Маскекк ек а1. 1982, Ргос. №ак1. Асаб. 8ск И8А 79:7415; Маскей ек а1. 1984, 1. ¥^^ο1. 49:857; Рашсай ек а1. 1982, Ргос. №ак1. Асаб. 8οΐ. И8А 79:4927).
Клетки-хозяева, содержащие конструкции ДНК химерного белка, выращивают в подходящей среде для роста. В используемом в данном описании смысле термин «подходящая среда для роста» означает среду, содержащую питательные вещества, требуемые для роста клеток. Питательные вещества, требуемые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и факторы роста. Необязательно среды могут содержать сыворотку теленка или фетальную сыворотку теленка. В одном варианте среда, по существу, не содержит ЦС. Среда для роста, как правило, будет выбираться для клеток, содержащих конструкцию ДНК, например, посредством лекарственной селекции или с использованием дефицита незаменимого питательного вещества, которые комплементируются селектируемым маркером в конструкции ДНК или котрансфицируемым вместе с конструкцией ДНК. Культивируемые клетки млекопитающих обычно выращивают в коммерчески доступной содержащей сыворотку или бессывороточной среде (например, МЕМ, ЭМЕМ). Выбор среды, подходящей для конкретной используемой линии клеток, может осуществить специалист в данной области.
Рекомбинантно полученный химерный белок согласно изобретению может быть выделен из культуральной среды. Культуральную среду от соответствующим образом выращенных трансформированных или трансфицированных клеток-хозяев отделяют от клеточного материала и показывают присутствие химерных белков. Одним из способов выявления химерных белков, например, является связывание химерных белков или частей химерных белков со специфичным антителом, узнающим химерный белок согласно изобретению. Антитело против химерного белка может быть моноклональным или поликлональным антителом, вырабатываемым против рассматриваемого химерного белка. Например, химерный белок содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. Антитела, узнающие константную область многих иммуноглобулинов, известны в данной области и являются коммерчески доступными. Антитело может быть использовано для осуществления ЕБ18А или для вестерн-блота, что
- 21 012566 бы выявить наличие химерного белка согласно изобретению.
Химерный белок согласно изобретению может быть синтезирован в трансгенном животном, таком как грызун, корова, свинья, овца или коза. Термин «трансгенные животные» относится к животным, отличным от человека, в геном которых был введен чужеродный ген. Так как данный ген присутствует в зародышевых тканях, он передается от родителей потомству. Экзогенные гены вводят в одноклеточные эмбрионы (Вгтйег е! а1. 1985, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 82: 4438). Способы получения трансгенных животных известны в данной области, включая трансгенные организмы, которые продуцируют молекулы иммуноглобулина (^адпег е! а1. 1981, Ргос. №11. Асаб. δα. И8А 78:6376; МсКшдб! е! а1. 1983, Се11 34:335; Вппйег е! а1. 1983, №!иге 306:332; ВйсЫе е! а1. 1984, №!иге 312:517; Ва1ба88агге е! а1. 2003, Тбег1одепо1оду 59:831; НоЬ1 е! а1. 2003, Тбеподепо1оду 59:107; Ма1а88адпе е! а1. 2003, Хепо!гап8р1ап!а!юп 10(3):267).
Химерный белок согласно изобретению также может быть получен при комбинировании способов химического синтеза и способов рекомбинации. Например, часть константной области иммуноглобулина может быть экспрессирована рекомбинантно, как описано выше. Биологически активная молекула может быть получена с использованием известных способов химического синтеза (например, твердофазным синтезом).
Часть константной области иммуноглобулина может быть лигирована с биологически активной молекулой с использованием химического лигирования и затем объединена с частью константной области иммуноглобулина, которая не была лигирована с биологически активной молекулой, с образованием химерного белка согласно изобретению. В одном варианте часть константной области иммуноглобулина представляет собой Бс-фрагмент. Бс-фрагмент может быть получен рекомбинантно, чтобы образовать Сук-Бс, и подвергнут взаимодействию с биологически активной молекулой, имеющей тиоэфир, чтобы получить гибрид мономер-димер. В другом варианте получают Бс-тиоэфир и подвергают взаимодействию с биологически активной молекулой, имеющей Ν-концевой цистеин (фиг. 4).
В одном варианте часть константной области иммуноглобулина, лигированная с биологически активной молекулой, будет образовывать гомодимеры. Гомодимеры могут быть разрушены при воздействии на гомодимеры денатурирующих и восстанавливающих условий (например, бета-меркаптоэтанол и 8М мочевина) и затем объединены с частью константной области иммуноглобулина, не связанного с биологически активной молекулой, с образованием гибридов мономер-димер. Затем гибриды мономердимер подвергают ренатурации и рефолдингу посредством диализа в РВ8 и выделяют, например, эксклюзионной хроматографией по размеру или аффинной хроматографией.
В другом варианте часть константной области иммуноглобулина будет образовывать гомодимеры перед связыванием с биологически активной молекулой. В данном варианте условия реакции для связывания биологически активной молекулы с гомодимером, можно корректировать так, чтобы связывание биологически активной молекулы происходило предпочтительно с одной цепью гомодимера (например, корректируя молярные эквиваленты каждого реагирующего вещества).
Биологически активная молекула может быть химически синтезирована с Ν-концевым цистеином. Последовательность, кодирующая часть константной области иммуноглобулина, может быть субклонирована в векторе, кодирующем интеин, связанный с хитин-связывающим доменом (№\ν Епд1аиб Вю1аЬ§, Веуег1у, МА). Интеин может быть связан с С-концом части константной области иммуноглобулина. В одном варианте часть иммуноглобулина с интеином, связанным с ее С-концом, может быть экспрессирована в прокариотической клетке. В другом варианте часть иммуноглобулина с интеином, связанным с ее С-концом, может быть экспрессирована в эукариотической клетке. Часть константной области иммуноглобулина, связанная с интеином, может быть подвергнута взаимодействию с МЕ8NА. В одном варианте часть константной области иммуноглобулина, связанную с интеином, связывают с колонкой, например, колонкой с хитином, и затем элюируют, используя МЕ8NА. Биологически активная молекула и часть иммуноглобулина могут быть подвергнуты взаимодействию друг с другом так, чтобы происходила нуклеофильная перегруппировка и биологически активная молекула ковалентно связывалась с частью иммуноглобулина посредством амидной связи (Оа\\ъеп е! а1. 2000, Аппи. Неу. Вюсбет. 69: 923). Синтезированный таким образом химерный белок необязательно может содержать линкерный пептид между частью иммуноглобулина и биологически активной молекулой. Линкер можно, например, синтезировать на Ν-конце биологически активной молекулы. Линкеры могут включать пептиды и/или органические молекулы (например, полиэтиленгликоль и/или короткие аминокислотные последовательности). Указанный комбинированный рекомбинантный и химический синтез позволяет проводить быстрый скрининг биологически активных молекул и линкеров, чтобы оптимизировать требуемые свойства химерного белка согласно изобретению, например ингибирование вирусов, гемостаз, продукция красных кровяных клеток, биологическое время полужизни, стабильность, связывание с белками сыворотки или некоторые другие свойства химерного белка. Способ также позволяет вводить не встречающиеся в природе аминокислоты в химерный белок согласно изобретению, которые могут быть применимы для оптимизации требуемого химерного белка согласно изобретению. При желании химерный белок, полученный таким способом, может быть подвергнут рефолдингу до биологически активной конформации с использованием условий, известных в данной области, например восстанавливающих условий, и затем медленно диа
- 22 012566 лизован в РВ8.
Альтернативно, Ν-концевой цистеин может быть на части константной области иммуноглобулина, например, Рс-фрагменте. Рс-фрагмент может быть создан с Ν-концевым цистеином, принимая во внимание тот факт, что нативный Рс имеет цистеин в положении 226 (смотрите КаЬа! е! а1. 1991, 8ециепсек οί Рго!ешк οί 1ттипо1од1са1 1п!егек!, и. 8. Эерайтеп! οί РиЬНс НеаИй, ВеШекба, ΜΌ).
Чтобы экспрессировать концевой цистеин, Рс-фрагмент может быть экспрессирован рекомбинантно. В одном варианте Рс-фрагмент экспрессируют в прокариотической клетке, например Е. со11. Последовательность, кодирующую Рс-часть, начиная с Сук 226 (нумерация ЕЙ), можно поместить сразу после последовательности, кодирующей сигнальный пептид, например ОтрА, РйоА, 8ΤΙΙ. Прокариотическую клетку можно подвергнуть осмотическому шоку, чтобы высвободить рекомбинантный Рс-фрагмент. В другом варианте Рс-фрагмент продуцируют в эукариотической клетке, например клетке СНО, клетке ВНК. Последовательность, кодирующую фрагмент Рс-части, можно поместить прямо после последовательности, кодирующей сигнальный пептид, например сигнальной последовательности легкой цепи 1дк мыши или сигнальной последовательности КЬ МНС класса I так, чтобы когда рекомбинантный химерный белок синтезировался эукариотической клеткой, сигнальная последовательность отщеплялась, оставляя при этом Ν-концевой цистеин, затем белок может быть выделен и подвергнут химическому взаимодействию с молекулой, несущей тиоэфир (например, С-концевой тиоэфир, если молекула состоит из аминокислот).
Ν-концевой цистеин на Рс-фрагменте также может быть создан с использованием фермента, который расщепляет свой субстрат у его Ν-конца, например фактор Ха, энтерокиназы, и продукт может быть выделен и подвергнут взаимодействию с молекулой, имеющий тиоэфирную группу.
Рекомбинантно экспрессированный Рс-фрагмент может быть использован для получения гомодимеров или гибридов мономер-димер.
В конкретном варианте Рс-фрагмент экспрессируют с сигнальным пептидом интерферона человека, расположенным рядом с Сук в положении 226. Когда конструкцию, кодирующую данный полипептид, экспрессируют в клетках СНО, клетки СНО отщепляют сигнальный пептид в двух разных положениях (у Сук 226 и у Уа1 в сигнальном пептиде на 2 аминокислоты выше в направлении Ν-конца). Это приводит к образованию смеси двух видов Рс-фрагментов (один с Ν-концевым Уа1 и один с Ν-концевым Сук). Это в свою очередь приводит к смеси димерных видов (гомодимеры с концевым Уа1, гомодимеры с концевым Сук и гетеродимеры, в которых одна цепь имеет концевой Сук, а другая цепь имеет концевой Уа1). Рсфрагменты могут быть подвергнуты взаимодействию с биологически активной молекулой, имеющей Сконцевой тиоэфир и полученный в результате гибрид мономер-димер может быть выделен из смеси (например, эксклюзионной хроматографией по размеру). Предполагается, что при использовании других последовательностей сигнального пептида для экспрессии Рс-фрагментов в клетках СНО будет образовываться смесь видов Рс-фрагментов по меньшей мере с двумя разными Ν-концами.
В другом варианте рекомбинантно полученный Сук-Рс может образовывать гомодимер. Гомодимер может быть подвергнут взаимодействию с пептидом, который имеет разветвленный линкер на С-конце, при этом разветвленный линкер имеет два С-концевых тиоэфира, которые могут быть подвергнуты взаимодействию с Сук-Рс. В другом варианте биологически активная молекула имеет один неконцевой тиоэфир, который может быть подвергнут взаимодействию с Сук-Рс. Альтернативно, разветвленный линкер может иметь два С-концевых цистеина, которые могут взаимодействовать с тиоэфиром Рс. В другом варианте разветвленный линкер имеет две функциональные группы, которые могут быть подвергнуты взаимодействию с тиоэфиром Рс, например 2-меркаптоамин. Биологически активная молекула может состоять из аминокислот. Биологически активная молекула может включать малую органическую молекулу или малую неорганическую молекулу.
Р. Способы применения химерных белков
Химерные белки согласно изобретению имеют много применений, которые будут известны специалисту в данной области, включая, но не ограничивая указанным, способы лечения субъекта при заболевании или патологическом состоянии. Заболевание или состояние может включать, без ограничения, вирусную инфекцию, гемостатическое расстройство, анемию, злокачественную опухоль, лейкоз, воспалительное состояние или аутоиммунное заболевание (например, артрит, псориаз, системная красная волчанка, множественный склероз) или бактериальную инфекцию (см., например, патенты США № 6086875, 6030613, 6485726; νθ 03/077834; И82003-0235536А1).
1. Способы лечения субъекта с недостаточностью красных кровяных клеток
Изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего недостаточность красных кровяных клеток, например анемию, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере один агент, способный индуцировать пролиферацию красных кровяных клеток, например ЕРО, и вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина без агента, способного индуцировать пролиферацию красных кровяных клеток, имеющегося в первой цепи.
2. Способы лечения субъекта с вирусной инфекцией
- 23 012566
Изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию или подвергнутого воздействию вируса, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере один противовирусный агент, например ингибитор слияния или интерферон α, и вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина без противовирусного агента, имеющегося в первой цепи. В одном варианте субъект инфицирован вирусом, который можно лечить IЕNα, например, вирусом гепатита С. В одном варианте субъект инфицирован ВИЧ, таким как ВИЧ-1 или ВИЧ-2.
В одном варианте химерный белок согласно изобретению ингибирует репликацию вирусов. В одном варианте химерный белок согласно изобретению предотвращает или ингибирует проникновение вируса в клетки-мишени, тем самым останавливая, предотвращая или ограничивая распространение вирусной инфекции у субъекта и уменьшая вирусную нагрузку инфицированного субъекта. Благодаря связыванию части иммуноглобулина с ингибитором слияния вирусов изобретение обеспечивает химерный белок с активностью, ингибирующей слияние вирусов, с более высокой стабильностью и более высокой биодоступностью по сравнению с ингибиторами слияния, используемыми отдельно, например Т20, Т21, Т1249. Таким образом в одном варианте ингибитор слияния вирусов уменьшает или предотвращает ВИЧ-инфекцию клетки-мишени, например инфекции ВИЧ-1.
а) Состояния, которые можно лечить
Химерный белок согласно изобретению можно использовать для ингибирования или предотвращения инфекции клетки-мишени вирусом гепатита, например вирусом гепатита С. Химерный белок может содержать противовирусный агент, который ингибирует репликацию вирусов.
В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит ингибитор слияния. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для ингибирования или предотвращения инфекции любой клетки-мишени любым вирусом (см., например, патенты США № 6086875, 6030613, 6485726; \У0 03/077834; И82003-0235536А1). В одном варианте вирус является вирусом, покрытым оболочкой, таким как, без ограничения, ВИЧ, 81У, вирус кори, гриппа, вирус Эпштейн-Барра, респираторносинцитиальный вирус или вирус парагриппа. В другом варианте вирус является вирусом, не покрытым оболочкой, таким как риновирус или вирус полиомиелита.
Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта, уже инфицированного вирусом. Субъект может быть иметь острую вирусную инфекцию. Альтернативно, субъект может быть хронически инфицирован вирусом. Химерный белок согласно изобретению также можно использовать для профилактического лечения субъекта, для которого существует риск заражения вирусной инфекцией, например субъекта, который, как известно или предположительно, близко контактирует с вирусом, или субъекта, который предположительно инфицирован или несет вирус. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта, который подвергался воздействию вируса, но который еще не имеет позитивного диагноза.
В одном варианте изобретение относится к способу лечения субъекта, инфицированного НСУ, включающему в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества химерного белка, при этом химерный белок содержит Ес-фрагмент 1дС и цитокин, например ШЫа.
В одном варианте изобретение относится к способу лечения субъекта, инфицированного ВИЧ, включающему в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества химерного белка, при этом химерный белок содержит Ес-фрагмент 1дС и ингибитор слияния вируса содержит Т20.
3. Способы лечения субъекта, имеющего гемостатическое расстройство
Изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего гемостатическое расстройство, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере один фактор свертывания крови и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина.
Химерный белок согласно изобретению лечит или предотвращает гемостатическое расстройство, стимулируя образование сгустка фибрина. Химерный белок согласно изобретению может активировать любой член каскада коагуляции. Фактор свертывания крови может быть участником внешнего пути, внутреннего пути или обоих путей. В одном варианте фактором свертывания крови является фактор УН или фактор УНа. Фактор УНа может активировать фактор X, который взаимодействует с фактором Уа, расщепляя протромбин до тромбина, который в свою очередь расщепляет фибриноген до фибрина. В другом варианте фактором свертывания крови является фактор IX или фактор 1Ха. В еще одном варианте фактором свертывания крови является фактор УШ или фактор УШа. В еще одном варианте фактором свертывания крови является фактор фон Виллебрандта, фактор XI, фактор XII, фактор У, фактор X или фактор XIII.
а) Состояния, которые можно лечить
Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения любого гемостатического
- 24 012566 расстройства. Гемостатические расстройства, которые можно лечить введением химерного белка согласно изобретению, включают, но не ограничены указанным, гемофилию А, гемофилию В, болезнь фон Виллебрандта, недостаточность фактора ΧΙ (недостаточность РТА), недостаточность фактора ΧΙΙ, а также недостаточности или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора У, фактора УН, фактора Χ или фактора ΧΙΙΙ.
В одном варианте гемостатическое расстройство является наследственным расстройством. В одном варианте субъект имеет гемофилию А и химерный белок содержит фактор УШ или фактор УШа. В другом варианте субъект имеет гемофилию А и химерный белок содержит фактор УН или фактор УНа. В другом варианте субъект имеет гемофилию В и химерный белок содержит фактор ΙΧ или фактор ΙΧ;·ι. В другом варианте субъект имеет гемофилию В и химерный белок содержит фактор УН или фактор УНа. В другом варианте субъект имеет ингибирующие антитела к фактору УШ или фактору УШа и химерный белок содержит фактор УН или фактор УНа. В еще одном варианте субъект имеет ингибирующие антитела против фактора ΙΧ или фактора ΙΧη и химерный белок содержит фактор УН или фактор УНа.
Химерный белок согласно изобретению можно использовать для профилактического лечения субъекта с гемостатическим расстройством. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения острого эпизода кровотечения у субъекта с гемостатическим расстройством.
В одном варианте гемостатическое расстройство является результатом недостаточности фактора свертывания крови, например фактора ΙΧ, фактора УШ. В другом варианте гемостатическое расстройство может быть результатом дефектного фактора свертывания крови, например фактора фон Виллебрандта.
В другом варианте гемостатическое расстройство может представлять собой приобретенное расстройство. Приобретенное расстройство может быть результатом лежащего в основе вторичного заболевания или состояния. Неродственным состоянием может быть, например, без ограничения, злокачественная опухоль, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное расстройство может быть результатом пожилого возраста или медикаментозного лечения, лежащего в основе вторичного расстройства (например, химиотерапии злокачественной опухоли).
4. Способы лечения субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте
Изобретение также относится к способам лечения субъекта, который не имеет гемостатического расстройства или вторичного заболевания или состояния, приводящего к приобретению гемостатического расстройства. Таким образом, изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, где первая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере один фактор свертывания крови и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без фактора свертывания крови, имеющегося в первой полипептидной цепи.
а) Состояния, которые можно лечить
В одном варианте субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте, подвергают или собираются подвергнуть хирургической операции. Химерный белок согласно изобретению можно вводить перед или после операции в качестве профилактического средства. Химерный белок согласно изобретению можно вводить во время или после операции, чтобы контролировать острый эпизод кровотечения. Хирургическая операция может включать, но не ограничена указанным, трансплантацию печени, резекцию печени или трансплантацию стволовых клеток.
Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта, имеющего острый эпизод кровотечения, который не имеет гемостатического расстройства. Острый эпизод кровотечения может быть результатом тяжелой травмы, например хирургической операции, автомобильной аварии, ранения, огнестрельного ранения или любого другого травмирующего события, приводящего к неконтролируемому кровотечению.
5. Средства лечения
Химерный белок согласно изобретению можно вводить внутривенно, подкожно, внутримышечно или через любую поверхность слизистой оболочки, например, пероральным, подъязычным, буккальным, подъязычным, назальным, ректальным, вагинальным способом или через легочный путь. Химерный белок может быть имплантирован в твердую подложку на основе биополимера или связан с подложкой, которая обеспечивает возможность медленного высвобождения химерного белка в требуемом месте.
Доза химерного белка согласно изобретению будет варьироваться в зависимости от субъекта и конкретного используемого пути введения. Дозы могут быть в диапазоне от 0,1 до 100000 мкг/кг массы тела. В одном варианте пределы доз составляют 0,1-1000 мкг/кг. Белок может вводиться непрерывно или с конкретными временными интервалами. Можно использовать анализы ш уйго, чтобы определить оптимальные пределы доз и/или схемы введения. В данной области известно много анализов ш уйго, в которых измеряют инфекционность вируса. Например, можно использовать анализ обратной транскриптазы или ОТ-ПЦР-анализ или анализ разветвленной ДНК, чтобы измерить концентрации ВИЧ. Можно использовать анализ З!аС1о!, чтобы измерить свертывающую активность. Кроме того, эффективные дозы
- 25 012566 можно экстраполировать на основе кривых доза-ответ, полученных в моделях на животных.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей ингибитор слияния вируса, по меньшей мере часть иммуноглобулина и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Кеттд!оп'к Ркагтасеи!1са1 8с1епсек, Е. А. Магйп. Примеры эксципиентов могут включать крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция также может содержать реагенты для рН-буферов и увлажнители или эмульгаторы.
Для перорального введения фармацевтическая композиция может иметь форму таблеток или капсул, полученных обычными способами. Композиция также может быть получена в виде жидкости, например сиропа или суспензии. Жидкость может содержать суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры), эмульгаторы (лецитин или акациевую камедь), неводные наполнители (например, миндальное масло, маслянистые сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-пара-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты также могут содержать корригенты, красители и подсластители. Альтернативно, композиция может быть получена в виде сухого продукта для приготовления с водой или другим подходящим наполнителем.
Для буккального и подъязычного введения композиции можно придавать форму таблеток, лепешек или быстро растворяющихся пленок согласно обычным протоколам.
В случае введения путем ингаляции соединения для применения согласно настоящему изобретению обычно доставляют в форме аэрозольного спрея из упаковки под давлением или распылителя (например, в РВ8) с подходящим газом-вытеснителем, например дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторметаном, углекислым газом или другим подходящим газом. В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определять, снабжая клапаном для доставки измеряемого количества. Могут быть приготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошкообразную смесь соединения и подходящую порошкообразную основу, такую как лактоза или крахмал.
Фармацевтическая композиция может быть приготовлена для парентерального введения (например, внутривенного или внутримышечного) посредством инъекции болюса. Препараты для инъекции могут быть представлены в дозированной лекарственной форме, например в ампулах или контейнерах, содержащих несколько доз с добавлением консерванта. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии или эмульсии в масляных или водных наполнителях, и содержать агенты для приготовления лекарственного средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для перерастворения с использованием подходящего наполнителя, например апирогенной воды.
Фармацевтическая композиция также может быть приготовлена для ректального введения в виде суппозитория или удерживающей клизмы, например, содержащих обычные для суппозиториев основы, такие как масло какао или другие глицериды.
6. Комбинированная терапия
Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта с заболеванием или состоянием в комбинации по меньшей мере с одним другим известным средством для лечения указанного заболевания или состояния.
В одном варианте изобретение относится к способу лечения субъекта, инфицированного ВИЧ, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, содержащего первую и вторую цепи, в котором первая цепь содержит ингибитор слияния ВИЧ и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и вторая цепь содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина без ингибитора слияния ВИЧ, имеющегося в первой цепи, в комбинации по меньшей мере с одним другим агентом против ВИЧ. Указанным другими агентом против ВИЧ может быть любое терапевтическое средство, для которого показана анти-ВИЧ-активность. Указанный другой агент против ВИЧ в качестве примера может включать, но не ограничен указанным, ингибитор протеазы (например, Атргепауп®; Спх1уап®, К1!ошу1г®), нуклеозидный аналог обратной транскриптазы (например, А2Т, ΌΌΙ, Ό4Τ, 3ТС, 21адеп®), ненуклеозидный аналог-ингибитор обратной транскриптазы (например, 8ик!1уа®), другие ингибиторы слияния ВИЧ, нейтрализующее антитело, специфичное по отношению к ВИЧ, антитело, специфичное по отношению к СЭ4, миметик СЭ4, например слитый белок СО4-1дС2 (заявка на выдачу патента США 09/912824) или антитело, специфичное по отношению к ССК5 или СХСК4, или специфичный связывающий партнер ССК5 или СХСК4.
В другом варианте изобретение относится к способу лечения субъекта с гемостатическим расстройством, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, содержащего первую и вторую цепи, в котором первая цепь содержит по меньшей мере один фактор свертывания крови и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без фактора свертыва
- 26 012566 ния крови, имеющегося в первой цепи, в комбинации по меньшей мере с одним другим фактором свертывания крови или агентом, который стимулирует гемостаз. Указанным другим фактором свертывания крови или агентом, который стимулирует гемостаз, может быть любое терапевтическое средство с показанной свертывающей активностью. В качестве неограничивающего примера фактор свертывания крови или гемостатический агент может включать фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин или фибриноген или активированные формы любого из указанных выше. Фактор свертывания крови или гемостатический агент также может включать антифибринолитические лекарственные средства, например эпсилон-аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту.
7. Способы ингибирования слияния вирусов с клеткой-мишенью
Изобретение также относится к способу ίη νίίτο ингибирования слияния ВИЧ с клеткой млекопитающего, включающему в себя комбинирование клетки млекопитающего по меньшей мере с одним химерным белком, при этом химерный белок содержит первую и вторую цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и ингибитор ВИЧ и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без ингибитора ВИЧ, имеющегося в первой цепи.
Клетка млекопитающего может включать любую клетку или линию клеток, чувствительную к инфекции ВИЧ, включая, без ограничения, первичные Т-клетки СЭ4' человека или макрофаги, клетки МОЬТ-4, клетки СЕМ, клетки АА5 или клетки НеЬа, которые экспрессируют СЭ4 на клеточной поверхности.
С. Способы выделения химерных белков
Обычно, когда получают химерные белки согласно изобретению, они находятся в смеси других молекул, таких как другие белки или фрагменты белков. Таким образом, изобретение относится к способам выделения любого из химерных белков, описанных выше, из смеси, содержащей химерные белки. Определено, что химерные белки согласно изобретению связываются с лигандами-красителями в подходящих условиях и что изменение указанных условий после связывания может разрывать связь между лигандомкрасителем и химерным белком, тем самым обеспечивая способ выделения химерного белка. В некоторых вариантах смесь может содержать гибрид мономер-димер, димер и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, например Ес. Таким образом, в одном варианте изобретение относится к способу выделения гибрида мономер-димер. В другом варианте изобретение относится к способу выделения димера.
Соответственно в одном варианте изобретение относится к способу выделения гибрида мономердимер из смеси, когда смесь содержит
a) гибрид мономер-димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и в котором вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина;
b) димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая и вторая цепи обе содержат биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина; и
c) часть константной области иммуноглобулина;
при этом указанный способ включает в себя:
1) осуществление контакта смеси с лигандом-красителем, связанным с твердой подложкой в подходящих условиях, так что и гибрид мономер-димер и димер связываются с лигандом-красителем;
2) удаление несвязанной части константной области иммуноглобулина;
3) изменение подходящих условий 1) так, что связь между гибридом мономер-димер и лигандомкрасителем, связанным с твердым подложкой, разрывается;
4) выделение гибрида мономер-димер.
В некоторых вариантах перед осуществлением контакта смеси с лигандом-красителем смесь может быть подвергнута контакту с веществом для хроматографии, таким как белок А-сефароза или тому подобным. Смесь элюируют с вещества для хроматографии, используя подходящий элюирующий буфер (например, буфер с низким значением рН) и элюат, содержащий смесь, затем подвергают контакту с лигандом-красителем.
Подходящие условия для контактирования смеси с лигандом-красителем могут включать буфер для поддержания смеси при соответствующем рН. Соответствующее значение рН может составлять 3-10, 49, 5-8. В одном варианте соответствующее значение рН равно 8,0. Можно использовать любой буферный агент, известный в данной области, при условии, что он поддерживает рН в соответствующем диапазоне, например Трис, ΗΕΡΕ8, ΡΓΡΕ8, ΜΟΡ8. Подходящие условия также могут включать буфер для промывки, чтобы элюировать несвязанные формы с лиганда-красителя. Буфером для промывки может быть любой буфер, который не разрушает связывание связанной формы. Например, буфером для промывки может быть такой же буфер, который используют на стадии контактирования.
После того как химерный белок связывают с лигандом-красителем, химерный белок выделяют, из
- 27 012566 меняя подходящие условия. Изменение подходящих условий может включать добавление соли к буферу. Можно использовать любую соль, например ИаС1, КС1. Соль следует добавлять в концентрации, которая является достаточно высокой, чтобы разрушить связывание между лигандом-красителем и требуемой формой, например, гибридом мономер-димер.
В некоторых вариантах, когда смесь состоит из Ре, гибрида мономер-димер и димера, обнаружено, что Рс не связывается с лигандом-красителем и следовательно элюируется проходящим потоком. Димер связывается более прочно с лигандом-красителем, чем гибрид мономер-димер. Таким образом, требуется более высокая концентрация соли, чтобы разрушить связь (например, элюировать) между димером и лигандом-красителем, по сравнению с концентрацией соли, необходимой для разрушения связи между лигандом-красителем и гибридом мономер-димер.
В некоторых вариантах можно использовать №1С1. чтобы выделить гибрид мономер-димер из смеси. В некоторых вариантах соответствующая концентрация соли, которая разрушает связь между лигандом-красителем и гибридом мономер-димер, составляет 200-700, 300-600, 400-500 мМ. В одном варианте концентрация ИаС1, требуемая для разрушения связывания между лигандом-красителем и гибридом мономер-димер, составляет 400 мМ.
№1С1 также можно использовать для выделения димера из смеси. Обычно гибрид мономер-димер выделяют из смеси до выделения димера. Димер выделяют добавлением соответствующей концентрации соли к буферу, таким образом разрушая связывание между лигандом-красителем и димером. В некоторых вариантах соответствующая концентрация соли, которая разрушает связь между лигандомкрасителем и димером составляет от 800 мМ до 2 М, от 900 мМ до 1,5 М, от 950 мМ до 1,2 М. В одном конкретном варианте используют 1 М ИаС1, чтобы разрушить связывание между лигандом-красителем и димером.
Лигандом-красителем может быть биомиметик. Биомиметик представляет собой искусственно полученное вещество, устройство или систему, которая имитирует природную. Таким образом, в некоторых вариантах лиганд-краситель имитирует молекулы лигандов, встречающихся в природе. Лигандкраситель может быть выбран из М1ше11с ВеЕ 1™, МипеОс ВеЕ 2™, М1ше11с Огапде 1™, М1ше11с Огапде 2™, МипеЕс Огапде 3™, МипеОс Уе11о\у 1™, М1ше11с Уе11о\у 2™, М1ше11с Стееп 1™, МипеОс В1ие 1™ и М1ше11с В1ие 2™ (Ртотейс Вюзаепсез (ИЗА) 1пс., ^аупе, N1). В одном конкретном варианте лигандомкрасителем является М1ше11с ВеЕ 2™ (Ртошейс Вюзаепсез (ИЗА) 1пс., ^аупе, N1). В некоторых вариантах лиганд-краситель связывают с твердой подложкой, например, из МипеОс ВеЕ 1 А6ХЬ™, М1теНс ВеЕ 2 А6ХЬ™, М1ше11с Огапде 1 А6ХЬ™, М1ше11с Огапде 2 А6ХЬ™, М1теНс Огапде 3 А6ХЬ™, М1теНс Уе11ο\ν 1 А6ХЬ™, М1ше11с Уе11о\у 2 А6ХЬ™, М1ше11с Стееп 1 А6ХЬ™, М1ше11с В1ие 1 А6ХЬ™ и М1ше11с В1ие 2 А6ХЬ™ (Ртошейс Вюзаепсез (ИЗА) 1пс., ^аупе, N1).
Лиганд-краситель может быть связан с твердой подложкой. Твердой подложкой может быть любая твердая подложка, известная в данной области (см., например, \\л\лу.зерега1юпзХО\У.сот). Примеры твердых подложек могут включать шарик, гель, мембрану, наночастицу или микросферу. Твердая подложка может содержать любой материал, который может быть связан с лигандом-красителем (например, агарозу, полистирол, сефарозу, сефадекс). Твердые подложки могут содержать любой синтетический органический полимер, такой как полиакриловый, виниловый полимеры, акрилат, полиметакрилат и полиакриламид. Твердые подложки также могут содержать углеводный полимер, например агарозу, целлюлозу или декстран. Твердые подложки могут содержать неорганические оксиды, такие как диоксид кремния, диоксид циркония, диоксид титана, оксид церия, оксид алюминия, магнезию (т.е. оксид магния) или оксид кальция. Твердые подложки также могут содержать комбинации некоторых из указанных выше подложек, включая, без ограничения, декстран-акриламид.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Молекулярная масса влияет на трасцитоз, опосредованный РсВп.
Химерные белки, состоящие из различных представляющих интерес белков и 1дС Рс, получали рекомбинантно (ЗатЬтоок е( а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1оту Мапиа1, 2 еЕ., Со1Е Зрппд НатЬот ЬаЬота1оту Ргезз, (1989)) или в случае контактин-Рс, МАВ-в-да1 (комплекс моноклонального антитела, связанного с в-да1) (ВюЕез1дп 1п1егпа1юпа1, Засо, МЕ) и МАВ-СН (комплекс моноклонального антитела и гормона роста) (ВезеатсН БхадпозНсз, 1пс. Р1апЕегз, N1) приобретали из коммерческих источников. Коротко, гены, кодирующие представляющий интерес белок, клонировали посредством ПЦР и затем субклонировали в плазмиде, экспрессирующей слияние Рс. Плазмидами трансфицировали клетки БС44 СНО и отбирали стабильные трансфектанты и размножали с метотрексатом. Гомодимеры химерного белка очищали на колонке с белком А. Тестируемые белки включали интерферон α, гормон роста, эритропоэтин, фолликулостимулирующий гормон, фактор 1Х, бета-галактозидазу, контактин и фактор VIII. Связывание белков с частями иммуноглобулина, включая партнер, связывающий рецептор РсВп, или использование коммерчески доступных комплексов полное антитело (включая РсВп-связывающую область)-антиген позволило исследовать трансгеноз как функцию молекулярной массы (см. патент США № 6030613). Химерные белки вводили крысам перорально и измеряли уровни в сыворотке через 2-4 ч после введения, используя ЕЫЗА для рекомбинантно полученных химерных белков и используя вестерн-блот и ЕЫЗА для коммер
- 28 012566 чески полученных комплексов антител и химерных белков. Кроме того, все коммерчески полученные белки или комплексы, а также контроли фактор УШ-Ес, фактор ΙΧ-Ес и Еро-Ес йодировали, используя шарики ΙΟΌΟ (Р1егсе, РШкЬигдЬ, РА). Результаты показали, что уровни в сыворотке Ес и химерных белков моноклональных антител, введенных крысам перорально, непосредственно связаны с размером белка. Вероятная точка отсечения для перорально вводимых химерных белков Ес находится между 200 и 285 кДа (табл. 2).
Таблица 2
Белок Размер (кДа) Трансцитоз
ΙΕΝα-Ес 92 ++++
СН-Ес 96 +++
Еро-Ес 120 +++
ЕЗН-Ес 170 +++
МАЕ:СН 172-194 +++
Е1Х-ЕС 200 +
МАВ:₽Са1 285-420 -
Контактин-Ес 300 -
ЕУШй-Ес 380 -
Пример 2. Клонирование рсДНК 3.1-Е1ад-Ес.
Последовательность для пептида ЕЬАС (Азр-Туг-Ьуз-Азр-Азр-Азр-Азр-Ьуз), обычной аффинной метки, используемой для идентификации или очистки белков, клонировали в плазмиде рсДНК 3.1-Ес, которая содержит сигнальную последовательность 1дк мыши, за которой следует Ес-фрагмент 1дС1 человека (аминокислоты 221-447, нумерация ЕЙ). Конструкцию создавали ПЦР с перекрыванием, используя следующие праймеры:
Р!адРоР1: 5’-ССТСССТАСССАССАТССА -3’(8ЕО ГО N0:41)
Р1адРс-К1: 5’- СПбТСАТССТССТССТТСТАСТССТСА ССАСТССААССТССААС -3’ (ЗЕ<2 ГО N0:42)
Р!адРс-Р2: 5’- 6АСТАСАА66 АС6АССАТСА СААЕ6АСААА АСТСАСАСАТ 6СССАСССТ6 СССАССТСС6 СААСТСС -3’ (8ЕО Ю N0:43)
Р1адРс-К2: 5’- ТА6Т6САТССТСАТТТАССС6 -3’ (8Е0 ГО N0:44)
Затем добавляли матрицу рсДНК 3.1-Ес к двум отдельным реакционным смесям для ПЦР, содержащим 50 пмоль каждой из пар праймеров Е1адЕс-Е1/В1 или Е1адЕс-Е2/В2 в 50 мкл реакционной смеси, используя ДНК-полимеразу РГи ИЙга (81га1адепе, СА) согласно стандартному протоколу производителя, в термоциклере М1, используя следующие циклы: 95°С 2 мин; 30 циклов (95°С 30 с, 52°С 30 с, 72°С 45 с), затем 72°С в течение 10 минт. Затем продукты указанных двух реакций смешивали в другой реакции ПЦР (2 мкл каждый) с 50 пмоль праймеров Е1адЕс-Е1 и Е1адЕс-В2 в 50 мкл реакционной смеси, используя ДНК-полимеразу РГи ИЙга (81га1адепе, СА) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере М1, используя следующие циклы: 95°С 2 мин; 30 циклов (95°С 30 с, 52°С 30 с, 72°С 45 с) затем 72°С в течение 10 мин. Полученный в результате фрагмент очищали из геля, расщепляли и встраивали в плазмиду рсДНК 3.1-Ес в сайт Ы11е1-ВатН1. Полученная в результате плазмида содержит сигнальную последовательность 1дк мыши, продуцируя белок Е1адЕс.
Пример 3. Клонирование конструкции фактор УТ1-Ес.
Кодирующую последовательность фактора VII получали в ОТ-ПЦР из РНК фетальной печени человека (С1оп1есй, Ра1о А11о, СА). Клонированная область содержала последовательность кДНК от 36 п.н. до 1430 п.н., заканчивающуюся непосредственно перед стоп-кодоном. В Ν-конец вводили сайт 8ЬП. Сайт В§рЕ1 вводили в С-конец. Конструкцию клонировали посредством ПЦР, используя праймеры
Антисмысловой:
5’6СТАССТбСА6СССАССАТеСТСТСССАСССССТСА6С
3’(8Е<2 ГО N0:45)
Смысловой:
5'САСТТССС<ЗАССТ66ССАС66С6СССАСОТ<ЗТСАСТТТ ТеТСОСбАААТ ВС 3’ (8ЕО ГО N0:46) и следующие условия: 95°С в течение 5 мин, затем 30 циклов (95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин и 45 с) и конечный цикл удлинения 12°С в течение 10 мин.
Фрагмент расщепляли 8ЬП-В5рЕ1 и встраивали в рЕО.йС-Ес, плазмиду, кодирующую Ес-фрагмент 1дС1.
Пример 4. Клонирование конструкции фактор ΙΧ-Ес.
Кодирующую последовательность фактора IX, включая последовательность препропептида, получали амплификацией в ОТ-ПЦР из РНК печени взрослого человека, используя следующие праймеры:
- 29 012566 па1Р1Х-Е: 5'-ТТАСТ<ЗСА<ЗААО6ТТАТ<ЗСАОС<ЗС(ЗТ(ЗААСАТС- 3’(8ЕО ГО
N0:47)
Е9-К: 5'-ТТГТТС6ААТТСА6ТОАОСТТТ6ТТТТТТССТТААТСС- 3'(5ЕО Ю
N0:48) нг РНК печени взрослого человека (С1оп1еск Ра1о А1!о, СА) и 25 пмоль каждого праймера добавляли к реакционной смеси для ОТ-ПЦР, используя одностадийную ОТ-ПЦР 8ирег8спр1™ с системой Тад РЬАТГЫиМ® (1пуйгодеп, СагкЬай, СА) согласно протоколу производителя. Реакцию осуществляли в термоциклере М1, используя следующие циклы: 50°С 30 мин; 94°С 2 мин; 35 циклов (94°С 30 с, 58°С 30 с, 72°С 1 мин), и конечный 72°С 10 мин. Фрагмент очищали из геля, используя набор для экстракции из геля 01а§еп (Р1адеп, Уа1епс1а, СА), и расщепляли РкП-ЕсоК!, очищали из геля и клонировали в соответствующим образом расщепленной плазмиде рЕЭ.йС.ХЕс.
Пример 5. Клонирование конструкции РАСЕ.
Кодирующую последовательность эндопротеазы РАСЕ человека (фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты) получали посредством ОТ-ПЦР. Использовали следующие праймеры:
РАСЕ-Р1: 5'- С0ТААССТТСССАТ36АССТСА66СССТ06ТТ6С -3’(8ЕО Ю N0:49)
РАСЕ-К1: 5’- ВТТТТСААТСТСТАССАСССАСТСОСС -3’(5ЕО 10 N0:50)
РАСЕ-Р2: 5’-СССАС6ССАСАТСАСТАСТСС6С -3'(8ЕО ГО N0:51)
РАСЕ-К2: 5’- ббТСААТТСТСАСТСАОССАСбТСТСАбООСАСС -3’(8ЕО Ю N0:52)
Праймер РАСЕ-Е1 добавляет сайт НшйШ к 5'-концу последовательности РАСЕ, начиная с 3 нуклеотида перед стартовым кодоном, тогда как праймер РАСЕ-К2 добавляет стоп-кодон после аминокислоты 715, которая имеет место на конце внеклеточного домена РАСЕ, а также добавляет сайт ЕсоШ к 3'концу стоп-кодона. Праймеры РАСЕ-К1 и -Е2 отжигаются с 3'- и 5'-стороны от внутреннего сайта ВатН1, соответственно. Затем готовили две реакционные смеси для ОТ-ПЦР, используя 25 пмоль каждой из пар праймеров РАСЕ-Е1/К1 или РАСЕ-Е2/К2 с 20 нг РНК печени взрослого человека (С1оп1есй; Ра1о А11о, СА) в 50 мкл реакционной смеси для ОТ-ПЦР, используя одностадийную ОТ-ПЦР 8ирегксг1р1™ с системой Тад РЬАТЕЫиМ® (1пуйгодеп, Саг1кЬай, СА) согласно протоколу производителя. Реакцию осуществляли в термоциклере М1, используя следующие циклы: 50°С 30 мин; 94°С 2 мин; 30 циклов (94°С 30 с, 58°С 30 с, 72°С 2 мин), затем 72°С 10 мин. Каждый из таких фрагментов лигировали в вектор рСЕМ Т-Еаку (Рготеда, Майкоп, XVI) и полностью секвенировали. Затем фрагмент Е2-К2 субклонировали в рсДНКб У5/Н18 (1пуйгодеп, Саг1кЬай, СА), используя сайты ВатН1/ЕсоШ, и затем фрагмент Е1-К1 клонировали в данной конструкции, используя сайты НтЛП/ВатНЕ Конечная плазмида рсДНКбРАСЕ продуцировала растворимую форму РАСЕ (аминокислоты 1-715), так как трансмембранная область была делетирована. Последовательность РАСЕ в рсДНКб-РАСЕ по существу такая, как описано в Наткоп е! а1. 1998, 8еттагк т Нета1о1о§у 35: 4.
Пример 6. Клонирование конструкции ΙΕΝα-Ес-восьмиаминокислотный линкер.
Кодирующую последовательность интерферона α 2Ь человека (ΗΙΕΝα), включая сигнальную последовательность, получали посредством ПЦР из геномной ДНК человека, используя следующие праймеры:
1РНа-8|д-Е-. 5’-ССТАСТвСАСССАССАТС0ССТТвАССТТТ6СТТТАС3’(8ЕО Ю N0:53)
ΙΕΝθ-ΕοοΚ-Κ: б'-ССТТОААТТСТТССТТАСТТСТГАААСТТТСТТОС3'(8ЕО Ю N0:54)
Геномную ДНК получали из линии клеток астроцитомы человека 373МС согласно стандартным способам (8атЬгоок е! а1. 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 2й ей., Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк). Коротко, примерно 2х105 клеток осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера, рН 7,4, затем смешивали с равным объемом лизирующего буфера (100 мМ Трис рН 8,0/200 мМ №С1/2% 8Ό8/5 мМ ЭДТА). Добавляли протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и образец расщепляли при 37°С в течение 4 ч, время от времени осторожно перемешивая. Затем образец дважды экстрагировали смесью фенол: хлороформ, ДНК преципитировали добавлением ацетата натрия рН 7,0 до 100 мМ и равного объема изопропанола, и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадок удаляли и осадок один раз промывали холодным 70% этанолом и давали возможность высохнуть на воздухе перед ресуспендированием в ТЕ (10 мМ Трис рН 8,0/1 мМ ЭДТА).
Затем 100 нг полученной геномной ДНК использовали в реакции ПЦР в объеме 25 мкл с 25 пмоль каждого праймера, используя систему высокоточной Ехрапй (Воейппдег Маппйет, 1пй1апаро118, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя, в термоциклере М1, используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 30 циклов (94°С 30 с, 50°С 30 с, 72°С 45 с), и наконец 72°С 10 мин. Полосу ожидаемого размера (~550 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, Уа1епс1а, СА), расщепляли РкИ/ЕсоК!, снова очищали в геле и клонировали в сайте РкИ/ЕсоК! рЕЭ.йС.ХЕс, которая содержит 8аминокислотный линкер (ЕЕАСАААУ), за которым следует область Ес 1дС1 человека.
- 30 012566
Пример 7. Клонирование конструкции ШЫаЕс-линкер А.
мкг очищенной ДНК рЕО.бС.-нативный ШЫаЕс человека из примера 6 затем использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР в объеме 25 мкл с 25 пмоль каждого праймера ΙΕΝη-δίβ-Ε и следующего праймера:
САССТСТСАеТТТТбТСТТССТТАСТТСТТАААСТТТТТССААСТТТб- 3’(8ЕО ГО
N0:55)
Реакцию ПЦР осуществляли, используя высокоточную систему Ехрапб (Воейппдег Маппйеш, Гпб1апаройк, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере Вар1бСус1ег (Гбайо Тесйпо1оду, 8аЙ Ьаке Сйу, ИТ), денатурируя при 94°С в течение 2 мин с последующими 18 циклами (95°С в течение 15 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 1 мин), с наклоном 6, с последующим удлинением при 72°С в течение 10 мин. ПЦР-продукт правильного размера (~525 п.н.) очищали в геле, используя набор для экстракции из геля (Ц1адеп; Уа1епс1а, СА), расщепляли ферментами рестрикции РкП и ВкрЕГ, очищали в геле и субклонировали в соответствующих сайтах модифицированной рЕО.бС.ХЕс, где аминокислоты 231-233 Ес-области были изменены с использованием вырожденности генетического кода так, чтобы включить сайт ВкрЕГ, сохраняя при этом аминокислотную последовательность дикого типа.
Пример 8. Клонирование конструкции ШЫаЕс-линкер 6815.
Создавали вектор с новым остовом, используя Ес, имеющуюся в конструкции с линкером А (содержащей сайты ВкрЕГ и ВкгГГ в 5'-концевой области, используя вырожденность генетического кода, чтобы сохранить аминокислотную последовательность), используя указанную ДНК в качестве матрицы для реакции ПЦР со следующими праймерами:
5' В2х6СС63: 5' д1садда(ссддсдд1ддадддадсдасаааас(сасасд1дссс 3’(8Е0 ГО N0:56)
3’ ССС68: 5’ 1дасдсддссдс1саН1асссддадасаддд 3'(8ЕО ГО N0:57)
Реакцию ПЦР осуществляли с 25 пмоль каждого праймера, используя фермент РГи ТитЬо (8Ча1адепе, Ьа 1о11а, СА) согласно стандартному протоколу производителя, в термоциклере МТ используя следующий способ: 95°С 2 мин; 30 циклов (95°С 30 с, 54°С 30 с, 72°С 2 мин), 72°С 10 мин. Полосу ожидаемого размера (~730 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Ц1адеп, Уа1епс1а СА), расщепляли ВатНГ/ЫоП; снова очищали в геле и клонировали в расщепленном ВатНГ^оП векторе рсДНК6 ГО, варианте рсДНК6 с последовательностью ГВЕ8 и геном бНГг, встроенным в сайт №П/ХЬаГ.
Затем 500 нг очищенной ДНК рЕО.бС.-нативный ΙΡΝαΡο человека использовали в качестве матрицы в ПЦР в объеме 25 мкл со следующими праймерами:
5' ΙΕΝθ Гог 66008: 5’ ссдс1адсс1дсаддссасса(ддссйдаос 3’(8ЕО ГО
N0:58)
3’ 1Р№ Гог 00003: 5' ссдда(ссдссдссассИссНас1асд1ааас 3’(8ЕС! ГО
N0:59)
Реакцию ПЦР осуществляли с 25 пмоль каждого праймера, используя высокоточную систему Ехрапб (Воейппдег Маппйеш, Гпб1апаройк, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя, в термоциклере Мф используя следующие циклы: 95°С 2 мин; 14 циклов (94°С 30 с, 48°С 30 с, 72°С 1 мин), 72°С 10 мин. Полосу ожидаемого размера (~600 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Ц1адеп, Уа1епаа СА), расщепляли №е1/ВатНГ, снова очищали в геле и клонировали в сайте №е1/ВатНГ вектора рсДНК6 Ш/Ес, указанном выше, чтобы создать слияние Ес ΙΕΝα с 10-аминокислотным линкером 61у/8ег (2x66668), рсДНК6 1О/1Е\а-6810-Ес.
Затем осуществляли реакцию ПЦР, используя 500 нг указанной рсДНК6 ΙΩ/ΙΒΝα-6810-Вс со следующими праймерами:
5’ ВЗХ66С68:5’(8Е0 ГО N0:60) д1садда(ссдд1ддаддсддд1ссддсдд1ддадддадсдасаааас1сасасд(дссс 3’(8Е<2 Ю N0:61) ίοοΙν-Κ: 5‘ а1адаадссй(дассаддс 3'(8Е0 ГО N0:62)
Реакцию ПЦР осуществляли с 25 пмоль каждого праймера, используя высокоточную систему Ехрапб (Воейппдег Маппйеш, Гпб1апаройк, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя, в термоциклере Мф используя следующие циклы: 95°С 2 мин; 14 циклов (94°С 30 с, 48°С 30 с, 72°С 1 мин), 72°С 10 мин. Полосу ожидаемого размера (504 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Ц1адеп, Уа1епаа СА), расщепляли ВатНГ/ВкрЕГ, полосу 68 п.н. очищали из геля и клонировали в сайте ВатНГ/ВкрЕГ вектора рсДНК6 ГО/ГЕ№-6810-Ес, указанном выше, чтобы создать слияние Ес ΙΒΝα с 15аминокислотным линкером 61у/8ег (3x66668), рсДНК61О/1Ж(/.-6815-Вс.
Пример 9. Клонирование конструкции основного пептида.
Шарнирную область Ес-фрагмента Гд61 человека из аминокислот 221-229 (нумерация ЕЙ) заменяли основным пептидом (ССВ).
Использовали четыре перекрывающихся олигонуклеотида (ГОТ, СогаМ11е, ГА):
- 31 012566
1. ССВ-Рс Смысловой 1:
5’ ССС ССС САА ТТС ССТ ССТ САС ТАС САС ССС СТС ААС ААС ААС СТС ССС САС СТС ААС ОСС ААС ААС САС ССС СТС ААС ААС ААС 3’(8ЕО ГО N0:63)
2. ССВ-Рс Смысловой 2:
5’ СТС ССС САС СТС ААС САС ААС ССС ССС ССС ССС ССС ССА САС СТС СТС ССС ОСА ССС А 3'(8ЕО ГО N0:64)
3. ССВ-Рс Антисмысловой 1:
5’ ССС ТСС ССС САС САС СТС ТСС ССС ССС ССС ССС ССС СТТ СТС СТТ САС СТС ССС САС СТТ СТТ СТТ САС ССС СТС СТТ СТТ 6 3’(8ЕО ГО N0:65)
4. ССВ-Рс Антисмысловой 2:
5' ССС ТТС АСС ТСС ССС АСС ТТС ТТС ТТС АСС ССС ТСС ТАС ТСА ССА ССС ААТ ТСС ССС ССА 3'(8ЕО ГО N0:66)
Олигонуклеотиды перерастворяли до концентрации 50 мкМ в дН2О. 5 мкл каждого олигонуклеотида отжигали друг с другом, объединяя в тонкостенной пробирке для ПЦР с 2,2 мкл буфера для реакции № 2 (т.е. конечная концентрация 10 мМ Трис-НС1 рН 7,9, 10 мМ МдС12, 50 мМ №С1, 1 мМ дитиотреитол) (Νο\ν Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МА) и нагревая до 95°С в течение 30 с, и затем давали возможность отжигаться, медленно охлаждая в течение 2 ч до 25°С. 5 пмоль подвергнутых отжигу олигонуклеотидов лигировали в вектор рСЕМ Т-Еаку согласно инструкции, прилагаемой к набору (Рготеда, Майкоп \¥Ι). Смесь для лигирования добавляли к 50 мкл ОН5а-компетентных клеток Е. со11 Цпуйгодеп, Саг1кЬаб, СА) на льду в течение 2 мин, инкубировали при 37°С в течение 5 мин, инкубировали на льду в течение 2 мин и затем высевали на чашки с агаром, содержащим ЬВ+100 мкг/л ампициллина, и помещали в 37°С на 14 ч. Собирали отдельные бактериальные колонии и помещали в 5 мл ЬВ+100 мкг/л ампициллина и давали возможность расти в течение 14 ч. Пробирки центрифугировали при 2000 д, 4°С в течение 15 мин и векторную ДНК выделяли, используя набор 01адеп т1пргер (О|адеп, Уа1епаа, СА), как указано в руководстве, прилагаемом к набору. 2 мкг ДНК расщепляли ^оМ IУ-Кк^-II. Фрагмент очищали в геле способом р1адшск, как указано в руководстве, прилагаемом к набору (О|адеп, Уа1епаа, СА), и лигировали с рЕО.бсЕроЕс, расщепленной ^оМ ТУ/Ккг ΙΙ. Продуктом лигирования трансформировали ΌΗ5αкомпетентные клетки Е. со11 и получали ДНК, как описано для вектора рСЕМ Т-Еаку.
Пример 10. Клонирование конструкции эритропоэтин-кислый пептид-Ес.
Шарнирную область Ес-фрагмента ЦС1 человека в ЕР0-Ес из аминокислот 221-229 (нумерация ЕЙ) заменяли кислым пептидом (ССА).
Использовали четыре перекрывающихся олигонуклеотида (ШТ, Сога1у111е, ^):
1. Еро-ССА-Рс Смысловой 1:
5’ ССС СТ© АСА ССС ААТ ТСС СТС ОТ© АОТ АСС АСС ССС ТСС АСА АО© АС© Т©© ССС А©С ТО© А© 3'(5Е0 Ю N0:67)
2. Еро-ССА-Рс Смысловой 2:
5’ ССС ©А© ААС СА© ©СС СТО ©А© ААС ©А© ©Т© ©СС СА© СТ© ©А© САС САС ОСТ ССТ СОТ ССС ©СТ ССА ©А© СТС СТ© С6С ©©А СА 3’(5ЕО Ю N0:68)
3. Еро-ССА-Рс Антисмысловой 1:
5' ©ТС СОС ССА ССА ©СТ СТ© САС С©0 САС САС САС ССТ ССТ ССТ ССА ССТ се© ССА С 3’(5ЕО 10 N0:69)
4. Еро-ССА-Рс Антисмысловой 2:
5’ СТС СТТ СТС САС ©©С СТ© ©ТТ СТС ©СС СТС САС СТ© ©СС САС СТС СТТ СТС СА© ©ОС СТ© СТА СТС АСС АСС ©АА ТТС ССТ ©ТС АСС ©СА 3'{ЗЕО Ю N0:70)
Олигонуклеотиды перерастворяли до концентрации 50 мкМ в дН2О. 5 мкл каждого олигонуклеотида отжигали друг с другом, объединяя в тонкостенной пробирке для ПЦР с 2,2 мкл буфера для реакции № 2 (№\ν Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МА) и нагревая до 95°С в течение 30 с, и затем давали возможность отжигаться, медленно охлаждая в течение 2 ч до 25°С. 5 пмоль подвергнутых отжигу олигонуклеотидов лигировали в вектор рСЕМ Т-Еаку согласно инструкции, прилагаемой к набору (Рготеда, Майкоп \¥Ι). Смесь для лигирования добавляли к 50 мкл ^Η5α-компетентных клеток Е. со11 Цпуйгодеп, Саг1кЬаб, СА) на льду в течение 2 мин, инкубировали при 37°С в течение 5 мин, инкубировали на льду в течение 2 мин и затем высевали на чашки с агаром, содержащим ЬВ+100 мкг/л ампициллина, и помещали в 37°С на 14 ч. Собирали отдельные бактериальные колонии и помещали в 5 мл ЬВ+100 мкг/л ампициллина и давали возможность расти в течение 14 ч. Пробирки центрифугировали при 2000 д, 4°С в течение 15 мин и векторную ДНК выделяли, используя набор 01адеп т1пргер (О|адеп, Уа1епаа, СА), как указано в руководстве, прилагаемом к набору. 2 мкг ДНК расщепляли Аде Ι-Ккг-П. Фрагмент очищали в геле способом
- 32 012566
Р1ачшск, как указано в руководстве, прилагаемом к набору ^адеп, Уа1епс1а, СА), и лигировали с рЕЭ.Еро Ес.1, расщепленной Аде [-Нзг II. Продуктом лигирования трансформировали ΌΗ5αкомпетентные клетки Е. сой и получали ДНК, как описано выше.
Пример 11. Клонирование конструкции Сук-Ес.
Используя ПЦР и стандартные способы молекулярной биологии (8атЬгоок е! а1. 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2п6 е6., Со16 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк), создавали экспрессирующую конструкцию млекопитающих так, чтобы кодирующая последовательность сигнального пептида ШЫа человека непосредственно упиралась в кодирующую последовательность Ес, начинающуюся с первого остатка цистеина (Сук 226, нумерация ЕЙ). Таким образом, после расщепления сигнальной пептидазой и секреции из клеток млекопитающих создавали белок Ес с ^концевым остатком цистеина. Коротко, праймеры
ΙΡ№-8ΐ9-Ρ (1Р№-81д-Р: 5’-ССТАСТССА6ССАССАТССССТТ6АССТТ
Т<ЗСТТТАС-3’)(8ЕО Ю N0:71) и Суз-Рс-Р (5’-САеТТССв6А6СТСвбСАССОССОА
СА6СССАСА0А0САССТТ6-3') (8Е0 Ю N0:72) использовали в реакции ПЦР, чтобы создать фрагмент, связывающий сигнальную последовательность ШЫа с ^концом Ес, начинающимся с Сук 226. 500 нг рЕЭ.6С.нативный ЬШЫа-линкер Δ добавляли к 25 пмоль каждого праймера в реакции ПЦР с использованием высокоточной системы Ехрап6 (Воейгшдег МаппЕет, ^хагароШ, ЕЙ) согласно стандартному протоколу производителя. Реакцию осуществляли в термоциклере М1, используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 30 циклов (94°С 30 с, 50°С 30 с, 72°С 45 с) и наконец 72°С 10 мин. Полосу ожидаемого размера (~112 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, Уа1епс1а, СА), расщепляли РкН и ВкрЕЕ очищали в геле и субклонировали в соответствующих сайтах рЕЭ.6С.нативный ЫЕМ/.-линкер Δ, чтобы создать рЕЭ.6С.Сук-Ес (фиг. 5).
Пример 12. Экспрессии белка и получение Ес-МЕ8NΑ.
Кодирующую последовательность Ес (константная область ^С1 человека) получали посредством ПЦР-амплификации из Ес-содержащей плазмиды, используя стандартные условия и реагенты, следуя способу, рекомендованному производителем, чтобы субклонировать Ес-кодирующую последовательность ^е^арЕ Коротко, праймеры
5’- 6ТОСТСАТА
ТОСбСАТТСААбОСАСАСОССССОСТСССеТСО - 3’(8ЕО Ю N0:73) и 5’ еетооттес τοττοοθοαααααοοοθοαοαοαοθοαοαοαοτοττοτθοθ - з (ВЕС ГО N0:74) использовали, чтобы амплифицировать последовательность Ес из 500 нг плазмиды рЕ0.6С.ЕР0-Ес, используя высокоточную систему Ехрап6 (Воейгшдег Маппйет, Ваке1 8\\'Цхег1ап6) в термоциклере Вар16 Су1с1ег (Шайо Тес11по1оду 8а1! Ьаке СИу, И1ай), денатурируя при 95°С в течение 2 мин с последующими 18 циклами при 95°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 12°С в течение 1 мин, с наклоном 4, с последующим удлинением при 72°С в течение 10 мин. Продукт ПЦР субклонировали в промежуточном клонирующем векторе и полностью секвенировали и затем субклонировали, используя сайты N6еI и 8арI в векторе рТVIN1, следуя стандартным способам, 8атЬгоок, 1., Егйкск Е. Е. и МашаПк, Т. 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2п6 е6.; Со16 8ргтд НагЬог, №\ν Уогк: Со16 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк. Затем указанной плазмидой трансформировали клетки ВЕ21(ПЕ3)рЬук8, используя стандартные способы (там же). 1 л культуры клеток выращивали до регистрации оптической плотности 0,8 ед. ОП при 37°С, индуцировали 1 мМ изопропил-бета-О-1-тиогалактопиранозидом и выращивали в течение ночи при 25°С. Клетки осаждали центрифугированием, лизировали в 20 мМ Трис 8,8/1% №40/0,1 мМ фенилметансульфонилфторида/1 мкг/мл бензоназы (Nоνадеи Ма61коп, XVI) и связывали с хитиновыми шариками (№\ν Епд1ап6 Вю1аЬк; Веνе^1у, МА) в течение ночи при 4°С. Затем шарики промывали несколькими объемами колонки 20 мМ Трис 8,5/500 мМ N110.4/1 мМ ЭДТА и затем хранили при -80°С. Очищенный ЕсМЕ8NΑ получали элюированием белка с шариков в 20 мМ Трис 8,5/500 мМ №С1/1 мМ ЭДТА/500 мМ 2меркаптоэтансульфоновой кислоте (МЕ8NΑ) и элюат использовали в реакции связывания, описанной ниже.
Пример 13. Экспрессия и очистка гибрида мономер-димер фактор УП-Ес.
Создавали клетки СНО ΌΟ-44, экспрессирующие фактор УП-Ес. Клетки СНО ΌΟ-44 выращивали при 37°С, 5% СО2, в МЕМ-альфа плюс нуклеозид и рибонуклеозиды и с добавлением 5% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки до трансфекции.
Клетки ΌΟ44 высевали в чашки Петри для культуры ткани диаметром 100 мм и выращивали до слияния в монослой на 50%-60%. Всего 10 мкг ДНК использовали для трансфекции клеток на одной чашке диаметром 100 мм: 7,5 мкг рЕО.6С.ЕУП-Ес+Е5 мкг рсДНК3/Е1ад-Ес + 1 мкг рсДНК6-РАСЕ. Клетки трансфицировали как описано в руководстве к реагенту для трансфекции 8ирегГес! ^адеп, Уа1епс1а,
- 33 012566
СА). Среду удаляли из смеси для трансфекции через 48 ч и заменяли ΜΕΜ-альфа без нуклеозидов плюс 5% диализованной фетальной бычьей сыворотки и 10 мкг/мл бластицидина Ц^йгодеп, СагНЬаб, СА) и 0,2 мг/мл генетицина (^йгодеп, СаббЬаб, СА). Через 10 дней клетки снимали с чашки 0,25% трипсином и переносили во флаконы для культуры ткани Т25 и селекцию продолжали в течение 10-14 дней до тех пор, пока клетки не начинали хорошо расти, так как были созданы стабильные линии клеток. Затем экспрессию белка увеличивали посредством добавления 25 нМ метотрексата.
Примерно 2х107 клеток использовали для инокуляции в 300 мл среды для роста во вращающихся флаконах объемом 1700 см2 (Согшпд, Согшпд, ΝΥ) с добавлением 5 мкг/мл витамина К3 (бисульфит менадиона натрия) (81дта, 8ί Ьошз, МО). Вращающиеся флаконы инкубировали в 5% СО2 при 37°С в течение 72 ч. Затем среду для роста заменяли 300 мл бессывороточной среды для продуцирования (ΌΜΕΜ/Ε12 с 5 мкг/мл бычьего инсулина и 10 мкг/мл гентамицина) с добавлением 5 мкг/л витамина К3 Среду для продуцирования (кондиционированную среду) собирали каждый день в течение 10 дней и хранили при 4°С. После каждого сбора во вращающиеся флаконы добавляли свежую среду для продуцирования и флаконы возвращали в инкубатор. Объединенную среду сначала осветляли, используя фильтр из стекловолокна 8айос1еап (3,0 мкм + 0,2 мкм) (8абобоиб Согр. Сойшдеп, Сегтапу), затем фильтр Асгораск 500 (0,8 мкм + 0,2 мкм) ^а11 Согр., ΕηδΙ НШб, ΝΥ). Затем осветленную среду концентрировали примерно в 20 раз, используя кассеты для фильтрации в тангенциальном потоке Ρе11^сοη (предел отсечения по молекулярной массе 10 кДа) ^ИНроге Согр., ВШебса, ΜА).
Затем Ес-химеры улавливали из концентрированной среды пропусканием через колонку с белок Асефарозой 4 ЕаЛ Е1о\г (АР Вю1ес1г Ρ^8саίа^ау, N1). На колонку 5x5 см (100 мл) нагружали <5 мг белка Ес на мл объема колонки при линейной скорости потока 100 см/ч, чтобы добиться времени удерживания >3 мин. Затем колонку промывали >5 объемами колонки 1χΌΡΒ8, чтобы удалить неспецифично связанные белки. Связанные белки элюировали 100 мМ глицином рН 3,0. Элюированные фракции, содержащие пик белка, затем нейтрализовали добавлением 1 части 1 М Трис-НС1, рН 8 на 10 частей элюированной фракции.
Чтобы удалить гомодимеры ЕЬАС-Ес (то есть химерные димеры Ес с пептидом ЕЬАС, экспрессированным в виде слияний с обеими молекулами Ес) из препарата объединенные фракции из быстрого потока через белок А-сефарозу 4 попускали через катионообменную колонку Ипокрйеге 8 (ВюВаб Согр., Кгсйтопб, СА). При рабочих условиях для колонки гибрид мономер-димер ЕЬАС-Ес становится незаряженным (теоретическая рI ЕЬАС-Ес = 6,19) и проходит через колонку, тогда как конструкции йЕVII-Ес являются положительно заряженными и, следовательно, связываются с колонкой и элюируются при более высокой ионной силе. Объединенные фракции из быстрого потока через белок А-сефарозу 4 сначала диализовали в 20 мМ ΜΕ8, 20 мМ №С1, рН 6,1, затем диализованный материал наносили на колонку 1,1x11 см (9,9 мл) со скоростью 150 см/ч. Во время промывки и элюирования скорость потока увеличивали до 500 см/ч. Колонку последовательно промывали 8 объемами колонки 20 мМ ΜΕ8, 20 мМ №С1, рН 6,1 и 8 объемами колонки 20 мМ ΜΕ8, 40 мМ №С1, рН 6,1. Связанный белок элюировали 20 мМ ΜΕ8, 750 мМ №С1, рН 6,1. Элюированные фракции, содержащие пик белка, объединяли и стерильно фильтровали через фильтровальный диск 0,2 мкм перед хранением при -80°С.
Аффинную колонку с мАт против ЕЬАС использовали для отделения химерных димеров Ес с №νΠ, слитым с обеими молекулами Ес, от химерных димеров с одним пептидом ЕЬАС и одним слияниям №νπ. Объединенные элюированные фракции с Ипокрйеге 8 разбавляли 1:1 20 мМ Трис, 50 мМ №С1, 5 мМ СаС12, рН 8, и наносили на колонку 1,6x5 см, содержащую анти-ЕЬАС-сефарозу М2 (81дта Согр., 8ί. Ьои18, МО) с линейной скоростью потока 60 см/ч. Цель заключалась в нанесении <2,5 мг гибрида мономер-димер/мл объема колонки. После нанесения колонку промывали 5 объемами колонки 20 мМ Трис, 50 мМ №С1, 5 мМ СаС12, рН 8,0, затем гибриды мономер-димер элюировали 100 мМ глицина, рН 3,0. Затем элюированные фракции, содержащие пик белка, нейтрализовали добавлением 1 части 1 М ТрисНС1, рН 8, к 10 частям элюированной фракции. Объединенные фракции хранили при -80°С.
Пример 14. Экспрессия и очистка гомодимера фактор Ш-Ес и гибрида мономер-димер.
Создавали клетки СНО ЭС-44, экспрессирующие фактор К-Ес. Клетки СНО ЭС-44 высевали в чашки Петри для культуры ткани диаметром 100 мм и выращивали до слияния в монослой на 50-60%. Всего 10 мкг ДНК использовали для трансфекции клеток на одной чашке диаметром 100 мм: для трансфекции гомодимером использовали 8 мкг рЬЭ.бС.фактор ЕК-Ес+2 мкг рсДНК6-РАСЕ; для трансфекции гибридом мономер-димер использовали 8 мкг рΕ^.άС.фактор К-Ес + 1 мкг рсДНК3-Е1адЕс + 1 мкг рсДНК6-РАСЕ. Клетки трансфицировали как описано в руководстве к реагенту для трансфекции 8ирегГес1 (О1адеп, Vа1еηс^а, СА). Среду удаляли из смеси для трансфекции через 48 ч и заменяли ΜΕΜ-альфа без нуклеозидов плюс 5% диализованной фетальной бычьей сыворотки и 10 мкг/мл бластицидина (^1йодеп, СагкЬаб, СА) в случае обеих трансфекции, тогда как в случае трансфекции гибридом мономердимер также добавляли 0,2 мг/мл генетицина Д^йгодеп, СагкЬаб, СА). Через 3 дня клетки снимали с чашки 0,25% трипсином и переносили во флаконы для культуры ткани Т25 и селекцию продолжали в течение 10-14 дней до тех пор, пока клетки не начинали хорошо расти, так как были созданы стабильные линии клеток. Затем экспрессию белка увеличивали посредством добавления 10 нМ или 100 нМ метот
- 34 012566 рексата в случае гомодимера или гибрида мономер-димер, соответственно.
В случае обеих клеточных линий примерно 2х107 клеток использовали для инокуляции в 300 мл среды для роста во вращающийся флакон объемом 1700 см2 (Согшпд, Согшпд, ΝΥ) с добавлением 5 мкг/л витамина К3 (бисульфит менадиона натрия) (81дта, 8ΐ Ьошк, МО). Вращающиеся флаконы инкубировали в 5% СО2 при 37°С в течение 72 ч. Затем среду для роста заменяли 300 мл бессывороточной среды для продуцирования (ЭМЕМ/Р12 с 5 мкг/мл бычьего инсулина и 10 мкг/мл гентамицина) с добавлением 5 мкг/л витамина К3. Среду для продуцирования (кондиционированную среду) собирали каждый день в течение 10 дней и хранили при 4°С. После каждого сбора во вращающиеся флаконы добавляли свежую среду для продуцирования и флаконы возвращали в инкубатор. Перед хроматографией среду осветляли, используя фильтр 8ирогСар-100 (0,8/0,2 мкм) (Ра11 Се1тап 8с1епсек, Апп АгЬог, МЦ Все следующие стадии проводили при 4°С. Осветленную среду наносили на белок А-сефарозу, промывали 5 объемами колонки 1х РВ8 (10 мМ фосфат, рН 7,4, 2,7 мМ КС1 и 137 мМ №С1), элюировали 0,1 М глицином, рН 2,7, и затем нейтрализовали 1/10 объема 1 М Трис-НС1, рН 9,0. Затем белок диализовали в РВ8.
Образец белка для трансфекции гибридом мономер-димер подвергали дальнейшей очистке, так как он содержал смесь гомодимера РБХ-РсЯХ-Рс, гибрида мономер-димер РЬХ-РсЯад-Рс и гомодимера Р1ад-Рс:Р1ад-Рс. Материал концентрировали и наносили на колонку 2,6х60 см (318 мл) 8ирегбех 200 Ргер Огабе со скоростью потока 4 мл/мин (36 см/ч) и затем элюировали 3 объемами колонки 1х РВ8. Фракции, соответствующие двум пикам на УФ-детекторе, собирали и анализировали в 8Э8-ПААГ. Фракции первого пика содержали либо гомодимер РБХ-РсЯХ-Рс, либо гибрид мономер-димер РБХ-РсЯадРс, тогда как второй пик содержал гомодимер Р1адРс:Р1адРс. Все фракции, содержащие гибрид мономердимер, но не содержащие гомодимер Р1адРс, объединяли и наносили непосредственно на колонку 1,6х5 см с анти-РЬАб-сефарозой М2 (81дта Согр., 8ΐ. Ьошк, МО) с линейной скоростью потока 60 см/ч. После нанесения колонку промывали 5 объемами колонки РВ8. Затем гибриды мономер-димер элюировали 100 мМ глицином, рН 3,0. Элюированные фракции, содержащие пик белка, затем нейтрализовали добавлением 1/10 объема 1 М Трис-НС1 и анализировали в восстанавливающем и невосстанавливающем 8Ό8ПААГ. Фракции диализовали в РВ8, концентрировали до 1-5 мг/мл и хранили при -80°С.
Пример 15. Экспрессия и очистка гомодимера ΓΕΝα и гибрида мономер-димер.
Создавали клетки СНО Эб-44, экспрессирующие ΗΣΕΝα. Клетки Эб-44 высевали в чашки Петри для культуры ткани диаметром 100 мм и выращивали до слияния в монослой на 50-60%. Всего 10 мкг ДНК использовали для трансфекции клеток на одной чашке диаметром 100 мм: для трансфекции гомодимером 10 мкг конструкций ЪШЫаРс; для трансфекции гибридом мономер-димер 8 мкг конструкций НШЫаЕс + 2 мкг рсДНК3-Р1адРс. Клетки трансфицировали как описано в руководстве к реагенту для трансфекции 8ирегГес1 (Р1адеп, Уа1епаа, СА). Среду удаляли из смеси для трансфекции через 48 ч, и заменяли МЕМ-альфа без нуклеозидов плюс 5% диализованной фетальной бычьей сыворотки, в случае трансфекции гибридом мономер-димер также добавляли 0,2 мг/мл генетицина ([^йгодеп, Саг1кЬаб, СА). Через 3 дня клетки снимали с чашки 0,25% трипсином и переносили во флаконы для культуры ткани Т25 и селекцию продолжали в течение 10-14 дней до тех пор, пока клетки не начинали хорошо расти, так как были созданы стабильные линии клеток. Затем экспрессию белка увеличивали посредством добавления метотрексата: в диапазоне от 10 до 50 нМ.
В случае всех клеточных линий примерно 2х107 клеток использовали для инокуляции в 300 мл среды для роста во вращающийся флакон объемом 1700 см2 (Согшпд, Согшпд, ΝΥ). Вращающиеся флаконы инкубировали в 5% СО2 при 37°С в течение примерно 72 ч. Затем среду для роста заменяли 300 мл бессывороточной среды для продуцирования (ЭМЕМ/Р12 с 5 мкг/мл бычьего инсулина и 10 мкг/мл гентамицина). Среду для продуцирования (кондиционированную среду) собирали каждый день в течение 10 дней и хранили при 4°С. После каждого сбора во вращающиеся флаконы добавляли свежую среду для продуцирования и флаконы возвращали в инкубатор. Перед хроматографией среду осветляли, используя фильтр 8ирогСар-100 (0,8/0,2 мкм) из Ра11 бе1тап 8с1епсек (Апп АгЬог, МЦ Все следующие стадии проводили при 4°С. Осветленную среду наносили на белок А-сефарозу, промывали 5 объемами колонки 1хРВ8 (10 мМ фосфат, рН 7,4, 2,7 мМ КС1 и 137 мМ №С1), элюировали 0,1 М глицином, рН 2,7, и затем нейтрализовали 1/10 объема 1 М Трис-НС1, рН 9,0. Затем белок диализовали в РВ8.
Образец белка для трансфекции гибридом мономер-димер подвергали дальнейшей очистке, так как он содержал смесь гомодимера ШЫаРс:ШНаРс, гибрида мономер-димер ШЫаРс:Р1адРс и гомодимера Р1адРс:Р1адРс (или линкер Δ, или линкер 6815). Материал концентрировали и наносили на колонку 2,6х60 см (318 мл) 8ирегбех 200 Ргер бгабе со скоростью потока 4 мл/минуту (36 см/ч) и затем элюировали 3 объемами колонки 1х РВ8. Фракции, соответствующие двум пикам на УФ-детекторе, собирали и анализировали в 8Э8-ПААГ. Фракции первого пика содержали либо гомодимер Ш^РаШНаРс, либо гибрид мономер-димер ШЫаРс:Р1адРс, тогда как второй пик содержал гомодимер Р1адРс:Р1адРс. Все фракции, содержащие гибрид мономер-димер, но не содержащие гомодимер Р1адРс, объединяли и наносили непосредственно на колонку 1,6х5 см с анти-РЬАб-сефарозой М2 (81дта Согр., 8ΐ. Ьошк, МО) с линейной скоростью потока 60 см/ч. После нанесения колонку промывали 5 объемами колонки РВ8, за
- 35 012566 тем гибриды мономер-димер элюировали 100 мМ глицином, рН 3,0. Элюированные фракции, содержащие пик белка, затем нейтрализовали добавлением 1/10 объема 1 М Трис-НС1 и анализировали в восстанавливающем и невосстанавливающем 8Э8-ПАЛГ. Фракции диализовали в РВ8, концентрировали до 15 мг/мл и хранили при -80°С.
Пример 16. Экспрессия и очистка двуспирального белка.
Плазмидами рЕЭ.йС Еро-ССА-Рс и рЕЭ.йС ССВ-Рс либо по отдельности, либо вместе в соотношении 1:1 будут трансфицированы клетки СНО ЭС4 4. Клетки будут трансфицированы как описано в руководстве, прилагаемом к реагенту для трансфекции 8ирегГес1 (01адеп. Уа1епаа, СА). Среда будет удалена через 48 ч и заменена МЕМ-альфа без нуклеозидов плюс 5% диализованной фетальной бычьей сыворотки. Очистка будет осуществлена аффинной хроматографией на колонке с белком А согласно способам, известным в данной области. Альтернативно, очистка может быть осуществлена с использованием эксклюзионной хроматографии по размеру.
Пример 17. Экспрессии и очистка Сук-Рс.
Создавали клетки СНО ΌΟ-44, экспрессирующие Сук-Рс. Экспрессирующей плазмидой рЕЭ.йС.Сук-Рс, которая содержит ген дигидрофолатредуктазы (йНГг) мыши, трансфицировали клетки СНО Ό644 (дефицитные по йЫг), используя реагент 8нрегГес1 (01адеп; Уа1епаа, СА) согласно протоколу производителя с последующей селекцией стабильных трансфектантов в среде для культуры ткани аМЕМ (без нуклеозидов) с добавлением 5% диализованной РВ8 и антибиотиков пенициллин/стрептомицин (ЧпуЦгодеп; Саг1кЬай, СА) в течение 10 дней. Полученный в результате пул стабильно трансфицированных клеток увеличивали с помощью 50 нМ метотрексата, чтобы повысить экспрессию. Примерно 2х 107 клеток использовали для инокуляции в 300 мл среды для роста во вращающийся флакон объемом 1700 см2 (Согшпд, Согшпд, ΝΥ). Вращающиеся флаконы инкубировали в 5% СО2 при 37°С в течение примерно 72 ч. Затем среду для роста заменяли 300 мл бессывороточной среды для продуцирования (ЭМЕМ/Р12 с 5 мкг/мл бычьего инсулина и 10 мкг/мл гентамицина). Среду для продуцирования (кондиционированную среду) собирали каждый день в течение 10 дней и хранили при 4°С. После каждого сбора во вращающиеся флаконы добавляли свежую среду для продуцирования и флаконы возвращали в инкубатор. Перед хроматографией среду осветляли, используя фильтр 8ирогСар-100 (0,8/0,2 мкм) из Ра11 Се1тап 8с1епсек (Апп АгЬог, М1). Все следующие стадии проводили при 4°С. Осветленную среду наносили на белок А-сефарозу, промывали 5 объемами колонки 1хРВ8 (10 мМ фосфат, рН 7,4, 2,7 мМ КС1 и 137 мМ №С1), элюировали 0,1 М глицином, рН 2,7, и затем нейтрализовали 1/10 объема 1 М ТрисНС1, рН 9,0. Затем белок диализовали в РВ8 и непосредственно использовали в реакциях конъюгации.
Пример 18. Связывание Т20-тиоэфиров с Сук-Рс Сук-Рс (4 мг, конечная концентрация 3,2 мг/мл) и либо Т20-тиоэфир, либо Т20-ПЭГ-тиоэфир (2 мг, примерно 5 молярных эквивалентов) инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре в 0,1 М Трис 8/10 мМ ΜЕ8NА. Анализ в 8^8-ПЛЛГ (Трис-61угель) с использованием восстанавливающего буфера для образцов показал наличие новой полосы примерно на 5 кДа длиннее, чем Рс-контроль (>40-50% превращение в конъюгат). Предварительное Νконцевое секвенирование Сук-Рс и непрореагировавшего Сук-Рс показало, что сигнальный пептид неправильно процессирован по части молекул, давая смесь (Сук)-Рс, который будет взаимодействовать посредством нативного лигирования с пептид-тиоэфирами, и (Уа1)-(С1у)-(Сук)-Рс, которые не будут взаимодействовать. Так как условия реакции недостаточны для нарушения димеризации молекул Сук-Рс, указанная реакция давала смесь гомодимеров Т20-Сук-Рс:Т20-Сук-Рс, гибридов мономер-димер Т20-СукРс:Рс и Рс-димеров Сук-Рс:Сук-Рс. Данный белок очищали, используя эксклюзионную хроматографию по размеру, как указано выше, чтобы разделить три вида. Результат подтверждали анализом в 8Ό8ПААГ в невосстанавливающих условиях.
Пример 19. Анализ противовирусной активности ΙΕΝα.
Противовирусную активность (Ιυ/мл) слитых белков ΙΡΝη определяли, используя анализ ЦПД (цитопатическое действие). Клетки А549 высевали в 96-луночный планшет для культуры ткани в среду для роста (КРМ1 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (РВ8) и 2 мМ Ь-глутамина) на 2 ч при 37°С, 5% СО2. Стандарты ШЫа и слитые белки ΙΡΝη разбавляли в среде для роста и добавляли к клеткам в трех повторах на 20 ч при 37°С, 5% СО2. После инкубации всю среду удаляли из лунок, разбавляли вирус энфцефаломиокардита (ЕМС) в среде для роста и добавляли (3000 БОЕ/лунку) в каждую лунку за исключением контрольных лунок. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 28 ч. Живые клетки фиксировали охлажденной 10% трихлоруксусной кислотой (ТСА) и затем красили сульфородамином В (8КВ) согласно опубликованным протоколам (КиЬтйет е1 а1. 1990, 1 №111. Сапсег 1пк1. 82, 1113). Краситель 8КВ солюбилизировали в 10 мМ Трис рН 10,5 и считывали на спектрофотометре при 490 нм. Образцы анализировали посредством сравнения активностей с известной стандартной кривой для международного стандарта ШЫа 2Ь Всемирной организации здравоохранения в диапазоне от 5 до 0,011 Ιυ/мл. Результаты представлены ниже в табл. 3 и на фиг. 6 и показывают повышенную противовирусную активность гибридов мономер-димер.
- 36 012566
Таблица 3. Анализ противовирусной активности интерферона. Гомодимер по сравнению с гибридом мономер-димер
Белок Противовирусная активность (ΐυ/нмоль) Стандартное отклонение
Гомодимер 1ГКсгГс- 8-аминокислотный линкер 0,45x10= 0,29*10=
Гибрид мономер-димер ΙΓΝαΓο-8-аминокислотный линкер:Р1адЕс 4,5x10= 1,2*10=
Гомодимер IΕΝαЕс-Δлинкер 0,22*10= 0,07*10=
Гибрид мономер-димер ΙΕΝαΓο-Δ дельта линкер:Е1адЕс 2,4*10= 0,0005х105
Гомодимер IΕΝα Ес-СЗ15линкер 2, 3*10= 1, 0*10=
Гибрид мономер-димер 1ЕЫаЕс-С515-линкер 5, 3«10= 0,15x10=
Пример 20. Анализ свертывающей активности ЕУПа.
Набор для анализа 81аС1о1ЕУПа-гТЕ приобретали из О1адпо8бса 8!адо (Рагщррапу, N1) и модифицировали как описано в 1о11аппе55еп е! а1. 2000, В1ооб Соади1а!юп апб Е1Ьппо1у818 11: 8159. Предварительно получали стандартную кривую со стандартом ЕУПа Всемирной организации здравоохранения 89/688. Анализ использовали для сравнения свертывающей активности гибридов мономер-димер по сравнению с гомодимерами. Результаты показали, что гибрид мономер-димер обладал свертывающей активностью в четыре раза более высокой по сравнению с гомодимером (фиг. 7).
Пример 21. Пероральное дозирование ЕУЛа-Ес у 10-дневных крыс.
Крыс 8ргадие Эал1еу массой 25 грамм на 9 день после рождения приобретали из Сйабек К1уег (^11щщд!оп, МА) и давали возможность акклиматизироваться в течение 24 ч. Крысам перорально вводили дозы гомодимера ЕУЛаЕс, гибрида мономер-димер или их смеси 50:50. Вводили объем 200 мкл раствора ЕУЛаЕс для получения дозы 1 мг/кг. Раствор содержал буфер Трис-НС1 рН 7,4 с 5 мг/мл ингибитора трипсина сои. Крыс подвергали эвтаназии с использованием СО2 в нескольких временных точках и брали 200 мкл крови пункцией сердца. Плазму получали добавлением 3,8% раствора цитрата натрия и центрифугированием при комнатной температуре со скоростью 1268д. Образцы плазмы либо исследовали в свежем виде, либо замораживали при -20°С. При пероральном дозировании гибрид мономер-димер приводил к значительно более высоким максимальным концентрациям в сыворотке (Стах) по сравнению с гомодимерным фактором УЛ (фиг. 8).
Пример 22. Пероральное дозирование фактор ΙΧ-Ес у неонатальных крыс.
Неонатальным крысам 8ргадие-ОаМеу десятидневного возраста п/о вводили 200 мкл гомодимера ΡΙΧ-Ес или гибрида мономер-димер ЕЕХ-Ес:Е1адЕс в соответствующих эквимолярных дозах 10 нмоль/кг в 0,1 М буфере на основе фосфата натрия, рН 6,5, содержащем 5 мг/мл ингибитора трипсина сои и 0,9% №С1. Через 1, 2, 4, 8, 24, 48 и 72 ч после инъекции животных подвергали эвтаназии с использованием СО2, брали кровь пункцией сердца и получали плазму добавлением 3,8% раствора цитрата натрия и центрифугированием при комнатной температуре со скоростью 1268 д. Затем образцы осаждали центрифугированием, собирали сыворотку и замораживали при -20°С вплоть до анализа слитых белков в ЕЫ8А.
Пример 23. ЕЫ8А фактора ΙΧ-Ес.
96-луночный планшет для ЕЫ8А Iтти1οη 4НВХ (Тйегто ЬаЬ8у5!ет5, Уап!аа, Е1п1апб) покрывали 100 мкл/лунку козьего Ц6 против фактора ΙΧ (АГПпНу Вю1одюа18, Апсайег, Сапаба) в разведении 1:100 в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты инкубировали при температуре окружающей среды в течение 2 ч или в течение ночи при 4°С, герметично закрытыми полимерной пленкой. Лунки промывали 4 раза РВ8Т по 300 мкл/лунку, используя устройство для промывки планшетов ТЕСАК Лунки блокировали РВ8Т + 6% БСА, 200 мкл/лунку, и инкубировали 90 мин при температуре окружающей среды. Лунки промывали 4 раза РВ8Т, 300 мкл/лунку, используя устройство для промывки планшетов ТЕСАК В лунки добавляли стандарты и образцы крови от крыс, описанные в примере 18 (100 мкл/лунку), и инкубировали 90 мин при температуре окружающей среды. Образцы и стандарты разбавляли в буфере НВЕТ (НВЕТ: 5,95 г НЕРЕ8, 1,46 г №С1, 0,93 г №2 ЭДТА, 2,5 г бычьего сывороточного альбумина, 0,25 мл Твин-20, доведенный до 250 мл дН2О, доведение рН до 7,2). Диапазон стандартной кривой составлял от 200 нг/мл до 0,78 нг/мл с 2-кратными разведениями между ними. Лунки промывали 4 раза РВ8Т, 300 мкл/лунку, используя устройство для промывки планшетов ТЕСАК В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунку конъюгированного козьего антитела анти-[д6-Ес человека-НАКР (Р1егсе, КоскГогб, ГЬ), разведенного в НВЕТ 1:25000. Планшеты инкубировали 90 мин при температуре окружающей среды. Лунки промывали 4 раза РВ8Т, 300 мкл/лунку, используя устройство для промывки планшетов ТЕСАК Планшеты проявляли, добавляя 100 мкл/лунку субстрата пероксидазы тетраметилбензидина (ТМВ) (Р1егсе, КоскГогб, ΙΕ), согласно инструкциям производителя. Планшеты инкубировали 5 мин при температуре
- 37 012566 окружающей среды в темноте или вплоть до развития окраски. Реакцию останавливали, добавляя 100 мкл/лунку 2 М серной кислоты. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм на считывающем устройстве 8рес!гаМах р1икр1а!е (Мо1еси1аг Оеуюек, 8иппууа1е, СА). Анализ крови, взятой в точке, соответствующей 4 ч, показал более чем 10-кратное различие в концентрации в сыворотке между гибридом мономер-димер фактор ΙΧ-Бс и гомодимерами фактор ΙΧ-Бс (фиг. 9). Результаты показали, что уровни гибрида мономер-димер фактор ΙΧ-Бс были существенно выше, чем гомодимеров фактор ΙΧ-Бс (фиг. 10).
Пример 24. Клонирование Еро-Бс.
Кодирующую область зрелого Еро получали ПЦР-амплификацией из плазмиды, кодирующей кодирующую последовательность зрелого эритропоэтина, исходно полученную в ОТ-ПЦР из мРНК Нер С2, и используя праймеры керохЬа-Б и кероесо-К, показанные ниже. Праймер керохЬа-Б содержит сайт ХЬаЕ тогда как праймер кероесо-К содержит сайт ЕсоКЕ ПЦР осуществляли в термоциклере Кар1бСус1ег Шайо Тескпо1оду, используя полимеразу Уеп!, денатурируя при 95°С в течение 15 с с последующими 28 циклами с наклоном 6,0 при 95°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 1 мин 20 с с последующим 3-минутным удлинением при 12°С. Продукт длиной примерно 514 п.н. очищали в геле, расщепляли ХЬай и ЕсоШ, снова очищали в геле и непосредственно субклонировали в ХЬай/ЕсоКЬрасщепленном, очищенном в геле векторе рЕО.бС.ХБс, указанном выше. Данную конструкцию назвали рЕЭ.бС.ЕроБс.
Последовательность Еро, содержащую как эндогенный сигнальный пептид, так и зрелую последовательность, получали ПЦР-амплификацией, используя препарат кДНК ОШСК-Оопе почки взрослого организма в качестве матрицы и праймеры Еро+Рер-8Ьй-Б и Еро+Рер-8Ьй-К, описанные ниже. Праймер Еро+Рер-8Ьй-Б содержит сайт 8ЬП выше стартового кодона, тогда как праймер Еро+Рер-8Ьй-К отжигается ниже эндогенного сайта 8ЬП в последовательности Еро. Реакцию ПЦР проводили в термоциклере РТС-200 М1, используя полимеразу Ехрапб, денатурируя при 94°С в течение 2 мин с последующими 32 циклами (при 94°С в течение 30 с, при 57°С в течение 30 с и при 72°С в течение 45 с) с последующим 10минутным удлинением при 72°С. Продукт длиной примерно 603 п.н. выделяли из геля и субклонировали в векторе рСЕМ-Т Еаку. Правильную кодирующую последовательность вырезали расщеплением 8ЬП, очищали в геле и клонировали в Ркй-расщепленной, обработанной щелочной фосфатазой креветки (8АР), очищенной в геле плазмиде рЕЭ.бС.ЕроЕс. Плазмиду со вставкой в правильной ориентации сначала определяли расщеплением КриЕ Расщепление Хпий и РуцП указанной конструкции сравнивали с рЕЭ.бС.ЕроБс и подтвердили, что она имеет правильную ориентацию. Определяли последовательность и конструкцию назвали рЕП.бС.па(ЕроБс. Праймеры ПЦР:
ЬерохЬа-Е (ЕРО-Е): 5'-ААТСТА6АСССССАССАС6ССТСАТСТСТ6АС-3'(ЗЕа
ГО N0:75)
Ьероесо-К (ЕРО-Е) 5'-ТТ6ААТТСТСТСТССССТ6ТССТ6СА<ЗеСС-3'(8Еа ГО
N0:76) Еро+Рер-ЗЫ-Е: 5'-6ТАССТ6САбеСС6АСАТСССе<ЗТвСА-3'(ЗЕ0 ГО
N0:77)
Еро+Рер-ЗЫ-К: 5’-ССТС6ТСАТСТ0ТССССТ6ТСС-3’(8Еа Ю N0:78)
Пример 25. Клонирование Еро-Бс.
В данном описании приведен альтернативный способ клонирования ЕРО-Бс. Сначала конструировали праймеры, чтобы амплифицировать кодирующую последовательность Еро полной длины, включая нативную сигнальную последовательность, следующим образом:
Еро-Е: 5-6ТССААССТ6 САОСААОСТТб СС6ССАССАТ 666А6Т6САС СААТСТССТС ССТ66- 3'(ЗЕО Ю N0:79)
Еро-Е: 5’-еССвААТТСА 6ТПТ6ТС6А ССССА6С66 СОСССОССАА СТСТСТ6ТСС ССТ6ТТСТ6С А66ССТСС- 3’(5ЕО Ю N0:80)
Прямой праймер включает сайт 8Ьй и НтбШ выше последовательности Козака, тогда как обратный праймер удаляет внутренний сайт 8ЬП и добавляет 8-аминокислотный линкер к 3'-концу кодирующей последовательности (ЕБАСАААУ) (8Е0 ΙΌ N0:81), а также сайты рестрикции 8аП и ЕсоКЕ Затем кодирующую последовательность Еро амплифицировали из библиотеки кДНК почки (ВО В1окс1епсек С1оп!еск, Ра1о А1!о, СА), используя 25 пмоль указанных праймеров в 25 мкл реакционной смеси для ПЦР, используя высокоточную систему Ехрапб (Воекппдег Маппке1т, Шбхапаройк, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере Мф используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 30 циклов (94°С 30 с, 58°С 30 с, 72°С 45 с), затем 72°С в течение 10 мин. Полосу ожидаемого размера (641 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, Уа1епс1а, СА), и лигировали в промежуточный клонирующий вектор рСЕМ Т-Еаку (Рготеда, Мабкоп, ΑΙ). ДНК трансформировали клетки ЭН5а (Ιιινί!годеп, СагкЬаб, СА) и приготовленные миникультуры выращивали и очищали, используя набор для плазмид М1п1ргер (Р1адеп, Уа1епс1а, СА) согласно стандартным протоколам производителя. После подтверждения последовательности указанную вставку выщепляли ферментами рестрикции 8ЬП/ЕсоЕЕ очищали в геле и клонировали в сайтах РкП/ЕсоШ экспрессирующего вектора млекопитающих рЕЭ.бС сходным образом.
Конструировали праймеры для амплификации кодирующей последовательности константной области !дС1 человека (Бс-область, нумерация ЕЙ 221-447) следующим образом:
- 38 012566
Рс-Р: 5’-еСТСС©еТСС АСААААСТСА САСАТ6СССА СССТОСССАО СТСС66ААСТ ССТбСбССвАССеТСАбТС- 3'(8ЕО Ю N0:82) Рс-К 5-АТТеСААТТС ТСАТТТАССС ССАСАСАОСЗ А6А6СС- 3'(ЗЁО 10 N0:83)
Прямой праймер включает сайт 8аП в соединение линкер-Ес, а также вводит сайты ВкрЕI и КкгП в Ес-область, не влияя на кодирующую последовательность, тогда как обратный праймер добавляет сайт ЕсоШ после стоп-кодона. Затем кодирующую последовательность Ес амплифицировали из библиотеки кДНК лейкоцитов (ВО Вюкаепсек С1оп1ес11. Ра1о А11о, СА), используя 25 пмоль указанных праймеров в 25 мкл реакционной смеси для ПЦР, используя высокоточную систему Ехрапб (Воейппдег Маппйет, ШбГапароНк, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере М1, используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 30 циклов (94°С 30 с, 58°С 30 с, 72°С 45 с), затем 72°С в течение 10 мин. Полосу ожидаемого размера (696 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (01адеп, Vа1епс^а, СА), и лигировали в промежуточный клонирующий вектор рСЕМ Т-Еаку (Рготеда, Ма61коп, \νΙ). ДНК трансформировали клетки ΌΗ5α Цпуйгодеп, Саг1кЬа6, СА) и приготовленные миникультуры выращивали и очищали, используя набор для плазмид М1шргер (01адеп, Vа1епс^а, СА) согласно стандартным протоколам производителя. После подтверждения последовательности указанную вставку выщепляли ферментами рестрикции 8а1/ЕсоШ, очищали в геле и клонировали в сайтах 8а1I/ЕсоКI плазмиды рЕО.бС.Еро (указанной выше) сходным образом, чтобы создать экспрессирующую плазмиду млекопитающих рЕО.бС.ЕроЕс. В другом эксперименте указанную плазмиду также расщепляли Кк^II/XтаI и в ней клонировали соответствующий фрагмент из р8ΥN-Ес-002, который содержит мутацию Акп 297 А1а (нумерация ЕЙ), чтобы создать рЕО.6С.ЕРО-Ес Ν297Λ (р8ΥN-ЕРО-004). Экспрессию в клетках млекопитающих осуществляли, как описано в примере 26. Аминокислотная последовательность ЕроЕс с восьмиаминокислотным линкером представлена на фиг. 2_). Во время осуществления указанного альтернативного способа клонирования, хотя и была сохранена точная аминокислотная последовательность ЕроЕс (фиг. 2_)), был сделан ряд некодирующих изменений на уровне нуклеотидов (фиг. 3|). Указанные изменения представляют собой С6А (С в положении нуклеотида 6 изменен на А) (исключает возможную вторичную структуру в праймере), С567А (удаляет эндогенный сайт 8ЬП из Еро), А582С (удаляет сайт ЕсоШ из линкера), А636Т и Т639С (добавляют уникальный сайт ВкрЕI к Ес) и С651С (добавляет уникальный сайт КкгП к Ес). Нуклеотидная последовательность на фиг. 3_) получена на основе конструкции, полученной в примере 25, которая включает указанные отличия от последовательности конструкции из примера 24.
Пример 26. Экспрессия и очистка гомодимера ЕРО-Ес и гибрида мономер-димер.
Клетки ОС-44 высевали в чашки Петри для культуры ткани диаметром 100 мм и выращивали до слияния в монослой на 50%-60%. Всего 10 мкг ДНК использовали для трансфекции клеток на одной чашке диаметром 100 мм: для трансфекции гомодимером 10 мкг рЕО.6С.ЕРО-Ес; для трансфекции гибридом мономер-димер 8 мкг рЕО.6С.ЕРО-Ес+2 мкг рсДНК3-Е1адЕс. Используемые конструкции клонировали, как описано в примере 24. Способ клонирования, описанный в примере 25, также можно использовать для получения конструкций для применения в данном примере. Клетки трансфицировали, как описано в руководстве к реагенту для трансфекции 8ирегГес1 (01адеп, Vа1епс^а, СА). Альтернативно, рЕО.6С.ЕРО-Ес котрансфицировали с р8ΥN-Ес-016, чтобы получить немеченый мономер. Среду удаляли из смеси для трансфекции через 48 ч и заменяли МЕМ-альфа без нуклеозидов плюс 5% диализованной фетальной бычьей сыворотки в обоих случаях трансфекции, тогда как при трансфекции гибридом мономер-димер также добавляли 0,2 мкг/мл генетицина Цпуйгодеп, Саг1кЬа6, СА). Через 3 дня клетки снимали с чашки 0,25% трипсином и переносили во флаконы для культуры ткани Т25 и селекцию продолжали в течение 10-14 дней до тех пор, пока клетки не начинали хорошо расти, так как были созданы стабильные линии клеток. Затем экспрессию белка увеличивали посредством добавления метотрексата.
В случае обеих клеточных линий примерно 2х107 клеток использовали для инокуляции в 300 мл среды для роста во вращающийся флакон объемом 1700 см2 (Согшпд, Согшпд, ΝΥ). Вращающиеся флаконы инкубировали в 5% СО2 при 37°С в течение 72 ч. Затем среду для роста заменяли 300 мл бессывороточной среды для продуцирования (ОМЕМ/Е12 с 5 мкг/мл бычьего инсулина и 10 мкг/мл гентамицина). Среду для продуцирования (кондиционированную среду) собирали каждый день в течение 10 дней и хранили при 4°С. После каждого сбора во вращающиеся флаконы добавляли свежую среду для продуцирования и флаконы возвращали в инкубатор. Перед хроматографией среду осветляли, используя фильтр 8ирогСар-100 (0,8/0,2 мкм) Ра11 Се1тап 8с1епсек (Апп АгЬог, МГ). Все следующие стадии проводили при 4°С. Осветленную среду наносили на белок А-сефарозу, промывали 5 объемами колонки 1х РВ8 (10 мМ фосфат, рН 7,4, 2,7 мМ КС1 и 137 мМ №С1), элюировали 0,1 М глицином, рН 2,7, и затем нейтрализовали 1/10 объема 1 М Трис-НС1, рН 9,0. Затем белок диализовали в РВ8.
Образец белка для трансфекции гибридом мономер-димер подвергали дальнейшей очистке, так как он содержал смесь гомодимера ЕРО-Ес:ЕРО-Ес, гибрида мономер-димер ЕРО-Ес:Е1ад-Ес и гомодимера Е1ад-Ес:Е1ад-Ес. Материал концентрировали и наносили на колонку 2,6х60 см (318 мл) 8ирег6ех 200 Ргер Сгабе со скоростью потока 4 мл/минуту (36 см/ч) и затем элюировали 3 объемами колонки 1х РВ8. Фракции, соответствующие двум пикам на УФ-детекторе, собирали и анализировали в 808-ПААГ. Фракции
- 39 012566 первого пика содержали либо гомодимер ЕРО-Бс:ЕРО-Бс, либо гибрид мономер-димер ЕРО-Бс:Б1адБс, тогда как второй пик содержал гомодимер Б1адБс:Б1адБс. Все фракции, содержащие гибрид мономердимер, но не содержащие гомодимер Б1адБс, объединяли и наносили непосредственно на колонку 1,6х5 см с анти-БЬАС-сефарозой М2 (§1дта Согр., §!. Ьошк, МО) с линейной скоростью потока 60 см/ч. После нанесения колонку промывали 5 объемами колонки РВ8. Затем гибриды мономер-димер элюировали 100 мМ глицином, рН 3,0. Элюированные фракции, содержащие пик белка, затем нейтрализовали добавлением 1/10 объема 1 М Трис-НС1 и анализировали в восстанавливающем и невосстанавливающем 8Ό8ПААГ. Фракции диализовали в РВ8, концентрировали до 1-5 мг/мл и хранили при -80°С.
Альтернативно, фракции первого пика с Зирегбех 200 анализировали в δΌδ-ПААГ и объединяли только фракции, содержащие большую часть гибрида мономер-димер ЕроБс с небольшим количеством гомодимера ЕроБс. Полученный пул, обогащенный гибридом мономер-димер, затем наносили на колонку §ирегбех 200 и затем объединяли фракции, содержащие только гибрид мономер-димер ЕроБс, диализовали и хранили в виде очищенного белка. Следует отметить, что указанный альтернативный способ очистки можно использовать для того, чтобы также очистить немеченые гибриды мономер-димер.
Пример 27. Введение димера ЕроБс и гибрида мономер-димер с восьмиаминокислотным линкером макакам-крабоедам.
Для легочного введения создавали аэрозоли либо с димерным белком ЕроБс, либо с гибридным белком мономер-димер ЕроБс (оба с 8-аминокислотным линкером) в РВ8, рН 7,4, используя распылитель АегопеЬ Рго™ (АегоСеп, Моип!ат У|е\у. СА) наряду с респиратором В1гб Магк 7А, и вводили анестезированным нативным макакам-крабоедам через эндотрахеальные трубки (приближенно к нормальным вдохам и выдохам). Оба белка также вводили нативным макакам-крабоедам посредством внутривенной инъекции. Образцы брали в разных временных точках и определяли количество Еро-содержащего белка в полученной плазме, используя иммуноанализ Еро человека ^иаи!^к^ηе 1УЭ (Н апб Ό §у8!ет8, Мтпеаро118, МХ). Фармакокинетические параметры рассчитывали, используя компьютерную программу \Ут№пЫп. В табл. 4 представлены результаты биодоступности для макак-крабоедов, обработанных гибридом мономер-димер ЕроБс или димером ЕроБс.
Таблица 4. Введение гибрида мономер-димер ЕроБс и димера ЕроБс обезьянам
Белок № обезьяны Путь Примерная осаджаемая доза1 (мкг/кг) Стпзх (НГ/МЛ) с *— спал (фмоль/ мл) и (час) Среднее Ън (час)
Гибрид мономердимер ЕроГс СО6181 Легочный 20 72,3 1014 23, 6 25,2
СО6214 Легочный 20 50, 1 703 23, 5
СО7300 Легочный 20 120 1684 36, 2
СО7332 Легочный 20 100 1403 17, 5
СО7285 В/в 25 749 10508 21, 3 22, 6
СО7288 В/в 25 566 7941 23
СО7343 В/в 25 551 1014 23, 5
Димер ЕроГс 0602 6 Легочный 15 10,7 120 11,5 22, 1
ϋϋ062 Легочный 15 21,8 244 27,3
ϋΟ04 6 Легочный 15 6,4 72 21,8
ϋϋ015 Легочный 15 12, 8 143 20, 9
ϋϋ038 Легочный 35 27 302 29
Γ4921 В/в 150 3701 41454 15,1 14,6
96Ξ002 В/в 150 3680 41219 15,3
12 61СО В/в 150 2726 30533 23,6
127-107 В/в 150 4230 47379 15, 0
118-22 В/в 150 4500 50403 8, 7
126-60 В/в 150 3531 39550 9, 8
1 на основании 15% осаждаемой части распыляемой дозы, которую определяли гамма-сцинтиографией
Процент биодоступности (Б) рассчитывали для легочных доз, используя следующее уравнение: Б = (АИС легочное/доза легочная)/(АИС в/в/доза в/в)х 100
- 40 012566
Таблица 5. Расчет биодоступности в процентах для гибрида мономер-димер ЕроЕс по сравнению с димером после легочного введения нативным макакам-крабоедам
Белок № обезьяны Примерная осаджаемая! доза1 (мкг/кг) дис (нг·час/мл) Био доступность2 ί Г) Средняя биодоступность
Гибрид мономердимер ЕроГС СО6181 20 мг/кг 3810 25,2% 34,9%
СО6214 20 мг/кг 3072 20,3%
СО7300 20 мг/кг 9525 63,0%
СО7332 20 мг/кг 4708 31,1%
Димер ЕроЕс ϋϋ026 15 мг/кг 361 5,1% 10, 0%
ϋϋΟ62 15 мг/кг 1392 19, 6%
ББ046 15 мг/кг 267 3,8%
ББ015 15 мг/кг 647 9,1%
ОБО 38 35 мг/кг 2062 12,4%
1 на основании 15% осаждаемой части распыляемой дозы, которую определяли гамма-сцинтиографией;
2 Средняя ЛИС для гибрида мономер-димер ЕроЕс = 18,913 нг-ч/мл (п=3 обезьяны) в/в в дозе 25 мкг/кг. Средняя АИС для димера ЕроЕс=7 0,967 нг-ч/мл (п=6 обезьян) в/в в дозе 150 мкг/кг
Фармакокинетика ЕроЕс с 8-аминокислотным линкером, вводимого макакам-крабоедам, представлена на фиг. 11. На чертеже приведено сравнение димера ЕроЕс с гибридом мономер-димер ЕроЕс у макак после введения однократной легочной дозы. На основании молярного сравнения получали значительно более высокие уровни в сыворотке у макак, обработанных гибридом мономер-димер, по сравне нию с димером.
Пример 28. Подкожное введение гибрида мономер-димер ЕроЕс.
Чтобы сравнить концентрации в сыворотке известных эритропоэтиновых агентов с гибридом мономер-димер ЕроЕс, и гибрид мономер-димер ЕроЕс и Агапекр® (дарбепоэтин альфа), который не является химерным слитым белком, вводили подкожно разным обезьянам и измеряли концентрацию в сыворотке обоих препаратов с течением времени.
Макакам-крабоедам (п=3 на группу) подкожно инъецировали 0,025 мг/кг гибрида мономер-димер ЕроЕс. Образцы крови собирали перед введением дозы и во временных точках вплоть до 144 ч после введения дозы. Из крови получали сыворотку и хранили в замороженном виде вплоть до анализа ЕЫ8А (иммуноанализ Еро человека БиапИкте) (В апб Ό Зуккетк, М1ппеаройк, М№). Фармакокинетические параметры определяли, используя компьютерную программу V^πNοπ^^π® (Рйагк1дйк, Моип1ашу1ете, СА).
Результаты показали, что концентрации в сыворотке как гибрида мономер-димер ЕроЕс, так и Агапекр® (дарбепоэтин альфа) были равны с течением времени, даже несмотря на то, что вводимая молярная доза Агапекр® (дарбепоэтина альфа) была немного выше (табл. 6) (фиг. 12).
Таблица 6
Путь Доза (мг/кг) Доза (нмоль / кг) Сшах (нг/мл) АИС (нг'час' мл'1) и (час) Био доступность (Г), %
Гибрид мономердимер ЕроЕс Под кожный 25 0,3 133+34 10,745± 3, 144 26±5 57±17
Агапезр® Под кожный 20 0, 54 83±11 5390± 747 22+2 53 + 8
Пример 29. Внутривенное введение гибрида мономер-димер ЕроЕс.
Чтобы сравнить концентрации в сыворотке известных эритропоэтиновых агентов с гибридом мономер-димер ЕроЕс, гибрид мономер-димер ЕроЕс, Агапекр® (дарбепоэтин альфа) и Еродеп® (эпоэтин альфа), ни один из которых не является химерным слитым белком, вводили внутривенно разным обезья нам и измеряли концентрации в сыворотке указанных агентов с течением времени.
Макакам-крабоедам (п=3 на группу) внутривенно инъецировали 0,025 мг/кг гибрида мономердимер ЕроЕс. Собрали образцы крови перед введением дозы и во временных точках вплоть до 144 ч после введения дозы. Из крови получали сыворотку и хранили в замороженном виде вплоть до анализа ЕЫЗА (иммуноанализ Еро человека Оиапйкте) (В апб Ό Зуккетк, М1ппеаройк, М№). Фармакокинетические параметры определяли, используя компьютерную программу V^πNοπ^^π (Рйагк1дйк, Моип1ашу1ете, СА). Результаты показали, что концентрация в сыворотке против времени (АИС) гибрида мономердимер ЕроЕс была выше, чем концентрации Еродеп® (эпоэтин альфа) или Агапекр® (дарбепоэтин альфа), даже если обезьяны получали большие молярные дозы Еродеп® (эпоэтина альфа) и Агапекр® (дар- 41 012566 бепоэтина альфа) (табл. 7) (фиг. 13).
Таблица 7
Путь Доза (мг/кг) Доза (нмоль/кг) г '-шах (нг/мл) лис (нг*час· мл1) (час)
Гибрид мономердимер ЕроГс Внутривенный 25 0,3 622+110 18,913± 3,022 23+1
Агапезр® Внутривенный 20 0,54 521 + 8 10,219± 298 20±1
Еродеп Внутривенный 20 0, 66 514+172 3936±636 6,3+0,6
Пример 30. Альтернативная очистка гибрида мономер-димер ЕроРс.
В данном примере описан еще один альтернативный способ очистки ЕР0-Рс. Смесь, содержащую Рс, гибрид мономер-димер ЕроРс и димер ЕроРс, наносили на колонку с белок А-сефарозой (АтегкЕат, иррка1а, 8\\'е6еп). Смесь элюировали согласно инструкциям производителя. В элюате с белок Асефарозы, содержащем смесь, буфер заменяли на 50 мМ Трис-С1 (рН 8,0). Смесь белков наносили на колонку Мипейс Ве6 2 ХЬ объемом 8 мл (РгоМеЕс ЫГе 8с1епсек, 1пс., ^аупе, N1), которая была уравновешена 50 мМ Трис-С1 (рН 8,0). Затем колонку промывали 50 мМ Трис-С1 (рН 8,0); 50 мМ №С1. Данная стадия удаляла большую часть Рс. Гибрид мономер-димер ЕроРс специфично элюировали с колонки, используя 50 мМ Трис-С1 (рН 8,0); 400 мМ №С1. Димер ЕроРс может быть элюирован и колонки регенерирована 5 объемами колонки 1 М №ЮН. Элюированные с колонки фракции анализировали в 8Ό8ПААГ (фиг. 14).
Пример 31. Клонирование конструкции 1дк-сигнальная последовательность-Рс для получения отдельно не содержащего метки Рс.
Кодирующую последовательность константной области 1дС1 (Еи № 221-447; Рс-область) получали ПЦР-амплификацией из библиотеки кДНК лейкоцитов (С1оп(есЕ, СА), используя следующие праймеры: гсРс-Р 5'- еСТеСвбТССАСАЛААСТСАСАСАТССССАССОТеСССАбСТСС
6бААСТССТСббСО6АССОТСА6ТС -3' (ЗЕО Ю ΝΟ: 84) гсРс-Р 5’- АТТССААТТСТСАТТТАСССебАбАСАбСвАСАСеС -3' (8ЕО Ю
ΝΟ: 85)
Прямой праймер добавляет три аминокислоты (ААУ) и сайт клонирования 8аИ перед началом Рсобласти, а также вводит сайт рестрикции ВкрЕ1 в положениях аминокислот 231-233 и сайт рестрикции Вкг11 в положениях аминокислот 236-238, используя вырожденность генетического кода, чтобы сохранить правильную аминокислотную последовательность (нумерация Еи). Обратный праймер добавляет сайт клонирования ЕсоВ1 после стоп-кодона для Рс. Реакцию ПЦР в объеме 25 мкл осуществляли с 25 пмоль каждого праймера с использованием высокоточной системы Ехрап6 (ВоеЕппдег МаппЕеш, 1п61апароЕк, 1Ц) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере МЕ используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 30 циклов (94°С 30 с, 58°С 30 с, 72°С 45 с), 72°С 10 мин. Полосу ожидаемого размера (-696 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (О1адеп, Уа1епс1а СА), и клонировали в рСЕМ Т-Еаку (Рготеда, Ма61коп, ^Ι), чтобы получить промежуточную плазмиду р8ΥN-Рс-001 (рСЕМ Т-Еаку/Рс).
Сигнальную последовательность Ι§κ мыши добавляли к кодирующей последовательности Рс, используя следующие праймеры:
гс-1дк З!д εβς-Ρ: 5'-ТТТААССТТССС6ССАССАТ0СА6АСА6АСАСАСТСС
ТвСТАТбССТАСТССТбСТСТСееТТССАОСТТССАСТООТСАСААААСТ
САСАСАТбСССАССО -3’ (6ЕО Ю ΝΟ: 86)
Рс-поХта-СЗ-Р: 5’- 6СТСАОСТСАТСОССООАТСОС -3’ (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 87)
Рс-поХта-бЗ-Р: 5'- СССАТССССССАТСАССТСАСС -3’ (ЗЕО Ю ΝΟ: 88)
Праймер гсЛдк-сигнальная последовательность-Р добавляет сайт рестрикции Нт6Ш к 5'-концу молекулы с последующей последовательностью Козака (ССССССАСС) (8Е0 ΙΌ N0:89), за которой следует сигнальная последовательность легкой цепи Ι§κ мыши, непосредственно примыкающая к началу последовательности Рс (Еи № 221). Праймеры Рс-поХта-С8-Р и -В удаляют внутренний сайт XтаI из кодирующей последовательности Рс, используя вырожденность генетического кода, чтобы сохранить правильную аминокислотную последовательность. Проводили две реакции ПЦР объемом 25 мкл с 25 пмоль либо гсЛдк-сигнальная последовательность-Р и Рс-поХта-С8-В, либо Рс-поХта-С8-Р и гсРс-В, используя высокоточную систему Ехрап6 (ВоеЕппдег МаппЕеш, Iη6^аηарο1^к. Ш) согласно стандартному прото
- 42 012566 колу производителя в термоциклере МБ Первую реакцию осуществляли с 500 нг библиотеки кДНК лейкоцитов (ВБ Вюзаепсез С1оп1есН, Ра1о А11о, СА) в качестве матрицы, используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 30 циклов (94°С 30 с, 55°С 30 с, 72°С 45 с), 72°С 10 мин. Вторую реакцию осуществляли с 500 нг рЗУИ-Рс-001 в качестве матрицы (выше), используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 16 циклов (94°С 30 с, 58°С 30 с, 72°С 45 с), 72°С 10 мин. Полосы ожидаемого размера (~495 и 299 п.н., соответственно) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, Vа1епс^а СА), затем объединяли в реакционной смеси для ПЦР с 25 пмоль праймеров гс-1дк-сигнальная последовательность-Р и гсРс-В и реакцию осуществляли, как описано выше, отжигая при 58°С и продолжая в течение 16 циклов. Полосу ожидаемого размера (~772 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, Vа1епаа СА), и клонировали в рСЕМ Т-Еазу (Рготеда, МаЕ1зоп, ^1), чтобы получить промежуточную плазмиду рЗ'УИ-Рс-007 (рСЕМ Т-Еазу/1дк з1д зед-Ес). Затем полную кассету 1дк-сигнальная последовательность-Рс субклонировали, используя сайты НшЕШ и ЕсоВ1, в экспрессирующий вектор млекопитающих либо рЕЕ6.4 (Бопха, З1оидН, ИК), либо в рсДНК3.1 (Гпуйгодеп, Саг1зЬаЕ, СА), в зависимости от используемой системы, чтобы создать рЗУН-Рс-009 (рЕЕ6.4/1дк з1д зед-Ес) и рЗУИ-Рс-015 (рсДНК3/1дк з1д зес.|Рс).
Пример 32. Клонирование конструкции 1дк-сигнальная последовательность-Рс №97А для получения не содержащего метки Рс №97А отдельно.
Чтобы мутировать Азп 297 (нумерация ЕЙ) в Рс до остатка А1а использовали следующие праймеры:
Ν297Α-Ρ 5'- СА0СА6ТАСССТАССАССТАСС6 -3’ (8ЕО Ю ΝΟ: 90)
N297А-К 5'- 6СТАССТССТА6С6ТАСТССТСС -3’ (8ЕО Ю ΝΟ: 91)
Осуществляли две реакции ПЦР с 25 пмоль либо гс-1дк-сигнальная последовательность-Р и №97АВ, либо №97А-Р и гсРс-В, используя высокоточную систему ЕхрапЕ (Воейппдег МаппНет, 1пЕ1апаройз, ГНГ) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере МБ Обе реакции осуществляли, используя 500 нг рЗУН-Рс-007 в качестве матрицы и используя следующие циклы: 94°С 2 мин; 16 циклов (94°С 30 с, 48°С 30 с, 72°С 45 с), 72°С 10 мин. Полосы ожидаемого размера (~319 и 475 п.н., соответственно) очищали из геля. Используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, νη^αη СА), затем объединяли в реакционной смеси для ПЦР с 25 пмоль праймеров гс-1дк-сигнальная последовательность-Р и гсРс-В и реакцию осуществляли, как описано выше, отжигая при 58°С и продолжая в течение 16 циклов. Полосу ожидаемого размера (~772 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, νΗ^αΗ СА), и клонировали в рСЕМ Т-Еазу (Рготеда, МаЕ1зоп, ^1), чтобы получить промежуточную плазмиду рЗУН-Рс-008 (рСЕМ Т-Еазу/1дк з1д зед-Ес №97А). Затем полную кассету 1дксигнальная последовательность-Рс отдельно субклонировали, используя сайты НтЕШ и ЕсоВ1, в экспрессирующем векторе млекопитающих либо рЕЕ6.4 (Бопха, З1оидН, ИК), либо в рсДНК3.1 (Гпуйгодеп, Саг1зЬаЕ, СА), в зависимости от используемой системы, чтобы создать рЗУН-Рс-010 (рЕЕ6.4/1дк з1д зес.|Рс №97А) и рЗУХ-Р с-016 (рсДНК3/1дк з1д зед-Ес №97А).
Те же самые указанные №97А-праймеры также использовали с праймерами гсРс-Р и гсРс-В и рЗУИ-Рс-001 в качестве матрицы в реакции ПЦР с последующим субклонированием, как указано выше, чтобы создать рЗУН-Рс-002 (рСЕМ Т Еазу/Рс №97А).
Пример 33. Клонирование ЕроРс и Рс в одной плазмиде для создания двухгенных векторов для получения гибридов мономер-димер ЕроРс дикого типа или №97А и экспрессия.
Альтернативой трансфекции конструкциями ЕроРс и Рс на отдельных плазмидах является их клонирование в одной плазмиде, также называемой двухгенным вектором, таким как используется в системе Бопха Вю1одюз (З1оидН, ИК). Фрагмент Взг11/ЕсоВ1 из рЗУН-Рс-002 субклонировали в соответствующих сайтах в рЕЕ12.4 (Бопха Вю1одюз, З1оидН, ИК) согласно стандартным способам, чтобы создать рЗУИ-Рс006 (рЕЕ12.4/Рс №97А-фрагмент). Плазмиду рЗ'УИ-ЕРО-004 использовали в качестве матрицы для реакции ПЦР, используя праймер Еро-Р из примера 25 и следующий праймер:
ЕроВег-Р: 5’- СТСАСССТССССССАСОАСТТССО
САССТОСеСАСббТССССАТС ТСТ6АСТТТТСТССАСС6САСС6<3 -3' (3ΕΩ
ΙΟ ΝΟ: 91)
Реакцию ПЦР осуществляли, используя высокоточную систему ЕхрапЕ (Воейппдег МаппНеш, 1пЕ1апаройз, ГИ) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере М1, как указано выше, в течение 16 циклов с температурой отжига 55°С. Полосу ожидаемого размера (~689 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, Vа1епс^а СА), и клонировали в рЗУИ-Рс-006, используя сайты рестрикции НтЕШ/ВзгП, чтобы создать рЗ'УИ-ЕРО-005 (рЕЕ12.4/ЕроРс №97А). Затем конструировали двухгенный вектор для гибрида мономер-димер ЕроРс №97А клонированием Хо11/ВатН1фрагмента из рЗУИ-Рс-010 в соответствующих сайтах в рЗ'УН-ЕРО-005, чтобы создать рЗ'УИ-ЕРО-008 (рЕЕ12.4-6.4/ЕроРс №97А/Ес №97А).
Также получали конструкцию дикого типа субклонированием последовательности Рс дикого типа из рЗУН-Рс-001 в рЗ'УН-ЕРО-005, используя сайты ВзгП и ЕсоВГ, чтобы создать рЗ'УИ-ЕРО-006
- 43 012566 (рЕЕ12.4/ЕроЕс). Затем конструировали двухгенный вектор для гибрида мономер-димер ЕроЕс клонированием ШП/ВашНЕфрагмента из рЗУ№Ес-009 в соответствующих сайтах в рЗУ№ЕР0-006, чтобы создать рЗУ№ЕР0-007 (рЕЕ12.4-6.4/ЕроЕс/Ес).
Каждой плазмидой трансфицировали клетки СН0К1ЗУ и идентифицировали позитивные клоны и адаптировали к бессывороточной суспензии, как указано в йопха Вю1од1ск Мапиа1 Гог З!апбагб 0рега!шд ргосебигек (Ъопха Вю1од1ск, З1оидй, ИК), и очищали, как указано для других конструкций мономердимер.
Пример 34. Клонирование конструкций Ш^Ес человека, Ш^-Ес №97А с восьмиаминокислотными линкерами и Iдκ-Εс-6Η^к.
нг библиотеки геномной ДНК человека из С1оп1ес11 (ВО Вюкаепсек С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА) использовали в качестве матрицы для того, чтобы выделить ΙΕΝβ человека с его нативной сигнальной последовательностью, используя следующие праймеры:
ΐΡΝβ-Ρ Η3/3ΜΙ:
5’- СТАСССТ6САССАА6СТТ6СССССАССАТ0АССА АСАА6ТСТСТССТС -3' (ЗЕО ГО N0:92)
ΙΡΝβ-Β (ΕΡΑΘ) 8а1: 5ТпетсбАссссАесб©сесссесбААстсбтттссе АССТААССТСТАА6 -3’ (ЗЕО ГО N0: 93)
Также использовали обратный праймер, чтобы создать восьмиаминокислотную линкер последовательность (ЕЕАСАААУ) (ЗЕЦ ΙΌ Ν0:94) на 3'-конце последовательности ΙΡΝβ человека. Реакцию ПЦР осуществляли с использованием высокоточной системы Ехрапб (Воейппдег Маппйе1т, ШФапаройк, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере КарИ Сус1ег (Шайо Тесйпо1оду, За1! Ьаке Сйу, ИТ). Продукт ПЦР правильного размера (~607 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля Ю1адеп; Уа1епс1а, СА), клонировали в ТА-клонирующем векторе (Рготеда, Майкоп, \¥Ι) и секвенировали. Данная конструкция названа рЗУ№Ш^-002. рЗУ№Ш^-002 расщепляли ЗЬП и ЗаН и клонировали в рЗР72 (Рготеда) в сайты РкН и ЗаН, получая рЗУ№Ш^-005.
Очищенную рЗУ^Ес-001 (0,6 мкг) расщепляли ЗаН и ЕсоК! и клонировали в соответствующих сайтах рЗУ№Ш^-005, чтобы создать плазмиду рЗΥN-IΕNβ-006, которая содержит ΙΓΝβ человека, связанный с Ес человека через восьмиаминокислотную линкерную последовательность. Затем рЗ'ТО-Ш^006 расщепляли ЗЬП и ЕсоК! и полноразмерную последовательность ΙΓΝβ-Ес клонировали в сайтах РкН и ЕсоК! рЕОбС.к1д, чтобы создать плазмиду рЗУ№Ш^-008.
рЗУ№Ес-002, содержащую ДНК Ес человека с одной аминокислотной заменой аспарагина на аланин в положении 297 (№97А; нумерация ЕЙ), расщепляли ВкрΕI и Xта1, чтобы выделить фрагмент ДНК длиной ~365 п.н., содержащий мутацию №97А. Полученный фрагмент ДНК клонировали в соответствующих сайтах в рЗУ№Ш^-008, чтобы создать плазмиду рЗУ№Ш^-009, которая содержит последовательность ΙΡ'Νβ-Ес с восьмиаминокислотным линкером и мутацию №97А в Ес в экспрессирующем векторе, рЕО.йС.
Клонирование Ιμκ-сигнальная последовательность - Ес №97А-6Н1к.
Использовали следующие праймеры, чтобы добавить метку 6хН1к к С-концу кодирующей последовательности Ес №97А:
Рс Θ8-Ρ: 5- СОСААОСТТОССОССАССАТОбАСАСАОАСАСАСТСС -3’ (ЗЕО Ю
N0: 95)
Рс.6Н|в-К: 5’- ТСА6Т63ТСАТССТСАТСАТ6ТТТАСССС50АСАСАСССАС -3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 96)
Рс.6Н!8-Р: 5'- ОСТАААСАТСАТСАССАТСАССАСТСАбААТТСС
ААТАТСАСТАСТСААТТСС -3’ (ЗЕО ГО ΝΟ: 97)
Зрб+Т-Я: б- 0СТАТТТА0СТСАСАСТАТА6ААТАСТСАА6С -3’ (ЗЕО Ю N0:98)
Проводили две реакции ПЦР с 50 пмоль либо Ес СЗ-Е и Ес.6Н1к-К, либо Ес.6Н1к-Е и Зр6+Т-К, используя высокоточную систему Ехрапб (Воейппдег Маппйе1т, ШФапаройк, ΙΝ) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере М1. Обе реакции осуществляли с использованием 500 нг рЗУ№Ес-008 в качестве матрицы в 50 мкл реакционной смеси, используя стандартные условия циклов. Полосы ожидаемого размера (~780 и 138 п.н., соответственно) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля Ю1адеп, Уа1епс1а СА), затем объединяли в 50 мкл реакционной смеси для ПЦР с 50 пмоль праймеров Ес СЗ-Е и Зр6+Т-К и реакцию осуществляли, как описано ранее, используя стандартные условиях циклов. Полосу ожидаемого размера (~891 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Р1адеп, Уа1епс1а СА) и клонировали в рсДНК6У5-Н1к В, используя сайт НтбШ и ЕсоК! чтобы создать рЗУ№Ес-014 (рсДНК6Лдк ктд кед-Ес №97А-6Н1к).
- 44 012566
Пример 35. Экспрессия и очистка 1ЕЫвЕс, гомодимера ΙΕΝβ-Ес Ν297Λ и гибрида мономер-димер 1ЕЫ|3-Ес Ы297А.
Клетки СНО ЭС-44 высевали в чашки Петри для культуры ткани диаметром 100 мм и выращивали до слияния в монослой на 50-60%. Всего 10 мкг ДНК использовали для трансфекции клеток на одной чашке диаметром 100 мм. Для трансфекции гомодимером использовали 10 мкг конструкции μδΥΝ-ΙΕΝβ008 или рδΥN-IЕNβ-009; для трансфекции гибридом мономер-димер использовали 8 мкг конструкции рδΥN-IЕNβ-009+2 мкг р8ΥN-Ес-014. Клетки трансфицировали, используя реагенты для трансфекции 8ирегГес1 (ф1адеп, Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям производителя. Через 48-72 ч после трансфекции среду для роста удаляли и клетки снимали с чашек 0,25% трипсином и переносили во флаконы для культуры ткани Т75 в среду для селекции (МЕМ-альфа без нуклеозидов плюс 5% диализованной фетальной бычьей сыворотки). В среду для селекции в случае трансфекции гибридом мономер-димер добавляли 5 мкг/мл бластицидина Цпуйгодеп, СагНЬай, СА). Селекцию продолжали в течение 10-14 дней до тех пор, пока клетки не начинали хорошо расти, так как были созданы стабильные линии клеток. Затем экспрессию белка увеличивали посредством добавления метотрексата: в диапазоне от 10 до 50 нМ.
В случае всех клеточных линий примерно 2х107 клеток использовали для инокуляции в 300 мл среды для роста во вращающийся флакон объемом 1700 см2 (Согшпд, Согшпд, ΝΥ). Вращающиеся флаконы инкубировали в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С в течение 72 ч. Затем среду для роста заменяли 300 мл бессывороточной среды для продуцирования (ЭМЕМ/Р12 с 5 мкг/мл бычьего инсулина). Среду для продуцирования (кондиционированную среду) собирали каждый день в течение 10 дней и хранили при 4°С. После каждого сбора во вращающиеся флаконы добавляли свежую среду для продуцирования и флаконы возвращали в инкубатор. Перед хроматографией среду осветляли, используя фильтр 8ирогСар-100 (0,8/0,2 мкм) из Ра11 Се1тап Заепсек (Апп АгЬог, М1). Все следующие стадии проводили при 4°С. Осветленную среду наносили на белок А-сефарозу, промывали 5 объемами колонки 1хРВ8 (10 мМ фосфат, рН 7,4, 2,7 мМ КС1 и 137 мМ ЫаС1), элюировали 0,1 М глицином, рН 2,7, и затем нейтрализовали 1/10 объема 1 М Трис-НС1, рН 8,0, 5 М ЫаС1. Гомодимерные дополнительно очищали при пропускании через колонку Зирегйех 200 Ргер Сгайе, разделяющую по размеру, и элюировали в 50 мМ фосфата натрия, рН 7,5, 500 мМ ЫаС1, 10% глицерин.
Гибридный белок мономер-димер подвергали дополнительной очистке, так как он содержал смесь гомодимера ΙΕΝβΠ Ы297А:1ЕЫвЕс Ы297А, гибрида мономер-димер 1ЕЫвЕс Ы297А:Ес Ы297А-Н18 и гомодимера Ес Ы297А-Н18:Ес Ы297А-Н18. Материал наносили на никель-хелатирующую колонку в 50 мМ фосфате натрия рН 7,5, 500 мМ ЫаС1. После нанесения колонку промывали 50 мМ имидазолом в 50 мМ фосфате натрия рН 7,5, 500 мМ ЫаС1 и белок элюировали градиентом 50-500 мМ имидазола в 50 мМ фосфате натрия рН 7,5, 500 мМ ЫаС1. Фракции, соответствующие пикам элюирования на УФ-детекторе, собирали и анализировали в δΌδ-ПААГ. Фракции первого пика содержали гибрид мономер-димер ΙΕΝβΠ Ы297А:Ес Ы297А-Н18, тогда как второй пик содержал гомодимер Ес Ы297А-Н18:Ес Ы297А-Н18. Все фракции, содержащие гибрид мономер-димер, но не содержащие гомодимер Ес, объединяли и наносили непосредственно на колонку Зирегйех 200 Ргер Сгайе, разделяющую по размеру, пропускали и элюировали в 50 мМ фосфата натрия, рН 7,5, 500 мМ ЫаС1, 10% глицерин. Фракции, содержащие гибриды мономер-димер ΙΕΝβ-Ес Ы297А:Ес Ы297А-Н18, объединяли и хранили при -80°С.
Пример 36. Анализ противовирусной активности ΙΕΝβ.
Противовирусную активность (Ιυ/мл) слитых белков ΙΕΝβ определяли, используя анализ ЦПД (цитопатическое действие). Клетки А549 высевали в 96-луночный планшет для культуры ткани в среду для роста (ВРМI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ЕВ8) и 2 мМ Ь-глутамина) на 2 ч при 37°С, 5% СО2.
Стандарты ΙΕΝβ и слитые белки ΙΕΝβ разбавляли в среде для роста и добавляли к клеткам в трех повторах на 20 ч при 37°С, 5% СО2. После инкубации всю среду удаляли из лунок, разбавляли вирус энцефаломиокардита (ЕМС) в среде для роста и добавляли (3000 БОЕ/лунку) в каждую лунку за исключением контрольных лунок. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 28 ч. Живые клетки фиксировали охлажденной 10% трихлоруксусной кислотой (ТСА) и затем красили сульфородамином В (8ВВ) согласно опубликованным протоколам (ВиЬтйет е! а1. 1990, 1 №111. Сапсег Ι1151. 82, 1113). Краситель 8ВВ солюбилизировали в 10 мМ Трис рН 10,5 и считывали на спектрофотометре при 490 нм. Образцы анализировали посредством сравнения активностей с известной стандартной кривой в диапазоне от 10 до 0,199 Ιυ/мл. Результаты представлены ниже в табл. 8 и показывают повышенную противовирусную активность гибридов мономер-димер.
- 45 012566
Таблица 8. Анализ противовирусной активности интерферона бета. Гомодимер по сравнению с гибридом мономер-димер
Белок Противовирусная активность (Ш/моль) Стандартное отклонение
Гомодимер ΙΓΝβΞο- 8-амнокислотный линкер 4,5х105 0,72*105
Гомодимер ΙΕΝβΕο Ν297Α8-амнокислотный линкер 3,21χ105 0,48*105
Гибрид мономер-димер ΙΓΝβΓσ N2 97А-8-амнокислотный линкер:Ес-Ндз 12,2*10ь 2χ105
Пример 37. Введение гомодимера и гибрида мономер-димер ГЕ^Ес с восьмиаминокислотным линкером макакам-крабоедам.
Для легочного введения создавали аэрозоли либо с гомодимерным белком ΣΡΝβΓο, либо с гибридным белком мономер-димер Ш^Ес Ν297Λ (оба с 8-аминокислотным линкером) в ΡΒ8, рН 7,4, 0,25% НА8, используя распылитель АегопеЬ Ριό™ (АегоСеп, Μοиηίа^η ^ете, СА) наряду с респиратором В1гб Μητί; 7А, и вводили анестезированным нативным макакам-крабоедам через эндотрахеальные трубки (приближенно к нормальным вдохам и выдохам). Образцы крови брали в разных временных точках и определяли количество [ΓΝβ-содержащего белка в полученной сыворотке, используя иммуноанализ [ΓΝβ человека (Вюкоигсе Иетабопаф СатагШо, СА). Фармакокинетические параметры рассчитывали, используя компьютерную программу \Ут№пЬт. В табл. 9 представлены результаты для макаккрабоедов, обработанных гибридом мономер-димер Ш^Ес №97А или гомодимером ΣΡΝβΓο.
Таблица 9. Введение гибрида мономер-димер Ш^Ес и гомодимера
ΣΡΝβΓο обезьянам
Белок № обезьяны Путь Примерная осаджаемая доза1 (мкг/кг) с ^тпах (нт/ МЛ) АОС (часнг/ мл) Ьн (час) Среднее Ьч (час)
Гибрид мономердимер ΙΓΝβΓο Ν297Α СО7308 Легочный 20 23, 3 987,9 27, 6 27, 1
СО7336 Легочный 20 22, 4 970, 6 25, 6
СО7312 Легочный 20 21, 2 1002,7 28, 0
Гомодимер ΙΕΝβΓο СО7326 Легочный 20 2,6 94,6 11, 1 11, 4
СО7338 Легочный 20 5,0 150, 6 11, 7
1 на основании 15% осаждаемой части распыляемой дозы, которую определяли гаммасцинтиографией
Фармакокинетика Ш^Ес с 8-аминокислотным линкером, вводимого макакам-крабоедам, представлена на фиг. 15, где приведено сравнение гомодимера Ш^Ес с гибридом мономер-димер Ш^Ес №97А у макак после введения однократной легочной дозы. Получали значительно более высокие уровни в сыворотке у макак, обработанных гибридом мономер-димер, по сравнению с гомодимером.
Образцы сыворотки также анализировали в отношении уровней неоптерина (биомаркера активности ^Νβ), используя иммуноанализ неоптерина (МР Вютебюак, ОгапдеЬигд, ΝΥ). Результаты данного анализа показаны на фиг. 16, где приведено сравнение стимуляции неоптерина в ответ на гомодимер ΣΓΝβ-Ес и гибрид мономер-димер Ш^-Ес №97А. Можно видеть, что выявляли значительно более высокие уровни неоптерина у обезьян, обработанных гибридом мономер-димер Ш^-Ес №97А, по сравнению с гомодимером ΣΡΝβ-Γο.
Все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «примерно». Соответственно, если не оговорено иное, числовые параметры, указанные в описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными, так что они могут варьировать в зависимости от требуемых свойств, которые пытаются получить посредством настоящего изобретения. Как минимум, и не в качестве попытки ограничить заявленный принцип эквивалентов в объеме формулы изобретения, каждый числовой параметр следует рассматривать в свете ряда значащих цифр и обычных способов округления.
Все ссылки, цитированные в данном описании, включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме и фактически в такой же степени, как в случае, когда каждая отдельная публикация или патент или заявка на выдачу патента специально и отдельно указаны как включенные в виде ссылки фактически в полном объеме. Что касается степени, в которой публикации и патенты или заявки на выдачу патентов, включенные в виде ссылки, противоречат раскрытию, приведенному в описании, описание предназначено для того, чтобы заменить собой и/или иметь преимущественное право перед любым таким противоречащим материалом.
- 46 012566
Как будет понятно специалистам в данной области, могут быть осуществлены многие модификации и изменения данного изобретения, не отходя от сути и не выходя за рамки его объема. Конкретные варианты, приведенные в данном описании, предлагаются только в качестве примера и никоим образом не предназначены для ограничения. Подразумевается, что описание и примеры должны считаться только примерными, при этом подлинный объем и сущность изобретения указаны в следующей формуле изобретения.

Claims (108)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Химерный белок, содержащий первую и вторую полипептидную цепь, (a) где указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и РсКп-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина и (b) где указанная вторая цепь содержит РсКп-связывающий сайт иммуноглобулина, но не содержит биологически активной молекулы или вариабельного домена иммуноглобулина, где химерный белок обладает повышенной способностью к трансцитозу.
  2. 2. Химерный белок по п.1, где указанная вторая цепь также содержит аффинную метку.
  3. 3. Химерный белок по п.2, где аффинная метка представляет собой метку РЬАС.
  4. 4. Химерный белок по п.1, где часть иммуноглобулина представляет собой Рс-фрагмент.
  5. 5. Химерный белок по п.1, где РсКп-связывающий сайт представляет собой пептидный миметик РсКп-связывающего сайта.
  6. 6. Химерный белок по п.1, где иммуноглобулин представляет собой 1дС.
  7. 7. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой полипептид.
  8. 8. Химерный белок по п.6, где 1дС представляет собой 1дС1 или 1дС2.
  9. 9. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой ингибитор слияния вируса.
  10. 10. Химерный белок по п.9, где ингибитор слияния вируса представляет собой ингибитор слияния ВИЧ.
  11. 11. Химерный белок по п.10, где ингибитор слияния ВИЧ представляет собой Т20 (8Е0 ΙΌ ΝΟ:1), Т21 (81 У) ΙΌ ΝΟ:2) или Т1249 (81 У) ΙΌ ΝΟ:3).
  12. 12. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой фактор свертывания крови.
  13. 13. Химерный белок по п.12, где фактор свертывания крови представляет собой фактор УН или УПа.
  14. 14. Химерный белок по п.12, где фактор свертывания крови представляет собой фактор ΙΧ.
  15. 15. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой малую молекулу.
  16. 16. Химерный белок по п.15, где биологически активная молекула представляет собой лейпролид.
  17. 17. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой интерферон.
  18. 18. Химерный белок по п.17, где интерферон представляет собой интерферон а и имеет линкер из 15-25 аминокислот.
  19. 19. Химерный белок по п.18, где интерферон а имеет линкер из 15-20 аминокислот.
  20. 20. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой нуклеиновую кислоту.
  21. 21. Химерный белок по п.20, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК.
  22. 22. Химерный белок по п.20, где нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловую молекулу.
  23. 23. Химерный белок по п.20, где нуклеиновая кислота представляет собой рибозим.
  24. 24. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой фактор роста.
  25. 25. Химерный белок по п.24, где фактор роста представляет собой эритропоэтин.
  26. 26. Химерный белок по п.15, где низкомолекулярная молекула представляет собой антагонист УЬА4.
  27. 27. Химерный белок по п.1, где указанная вторая цепь состоит из РсКп-связывающего сайта константного домена иммуноглобулина и, необязательно, аффинной метки.
  28. 28. Химерный белок по п.27, где аффинная метка представляет собой метку РЬАС.
  29. 29. Химерный белок по п.1, где указанная вторая цепь состоит, по существу, из РсКп-связывающего сайта константного домена иммуноглобулина и, необязательно, аффинной метки.
  30. 30. Химерный белок по п.29, где аффинная метка представляет собой метку РЬАС.
  31. 31. Химерный белок по п.1, где:
    a) первая цепь содержит биологически активную молекулу, РсКп-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина и первый домен, имеющий по меньшей мере один специфичный связывающий партнер; и
    b) вторая цепь содержит РсКп-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина, но не со
    - 47 012566 держит биологически активную молекулу или вариабельный домен иммуноглобулина и дополнительно содержит специфичный связывающий партнер первого домена.
  32. 32. Химерный белок по п.31, где указанная вторая цепь также содержит аффинную метку.
  33. 33. Химерный белок по п.32, где аффинная метка представляет собой таг ЕЬА6.
  34. 34. Химерный белок по п.31, где первый домен связывается со вторым доменом нековалентно.
  35. 35. Химерный белок по п.31, где первый домен представляет собой половину двойной спирали лейцинового зиппера и указанный второй домен представляет собой комплементарный связывающий партнер указанной двойной спирали лейцинового зиппера.
  36. 36. Фармацевтическая композиция, содержащая химерный белок по п.1 или 31 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
  37. 37. Способ получения биологически активного химерного белка по п.1, включающий:
    a) трансфекцию первой клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептид, содержащий биологически активную молекулу, оперативно связанную со второй молекулой ДНК, кодирующей по крайней мере часть константного домена иммуноглобулина, содержащего ЕсВп-связывающий сайт;
    b) трансфекцию второй клетки второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептид, содержащий по крайней мере часть константного домена иммуноглобулина без ЕсВпсвязывающего сайта и не содержащий биологически активную молекулу или вариабельный домен иммуноглобулина;
    c) культивирование клетки стадии а) и Ь) в условиях, при которых экспрессируется полипептид, кодируемый указанной первой конструкцией ДНК и указанной второй конструкцией ДНК; и
    б) выделение димеров стадии а) и Ь) из указанной трансфецированной клетки.
  38. 38. Способ лечения индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, включающий введение химерного белка по п.1 индивидууму, причем указанное заболевание или состояние излечивается.
  39. 39. Способ по п.38, где указанный химерный белок вводят внутривенно, подкожно, перорально, защечно, подъязычно, назально, парентерально, ректально, вагинально или через дыхательные пути.
  40. 40. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой вирусную инфекцию.
  41. 41. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой гемостатическое заболевание.
  42. 42. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой гемофилию А.
  43. 43. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой гемофилию В.
  44. 44. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой анемию.
  45. 45. Химерный белок формулы где X представляет собой биологически активную молекулу, Ь представляет собой линкер, Е представляет собой ЕсВп-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина, и а представляет собой любое целое число или ноль, где химерный белок обладает повышенной способностью к трансцитозу.
  46. 46. Химерный белок по п.45, где ЕсВп-связывающий сайт представляет собой пептидный миметик ЕсВп-связывающего сайта.
  47. 47. Химерный белок по п.45, где каждый Е химически ассоциирован с другим Е.
  48. 48. Химерный белок по п.47, где химическая ассоциация представляет собой нековалентное взаимодействие.
  49. 49. Химерный белок по п.47, где химическая связь представляет собой ковалентную связь.
  50. 50. Химерный белок по п.47, где химерная связь представляет собой дисульфидную связь.
  51. 51. Химерный белок по п.45, где Е присоединен к Е посредством связи, отличной от дисульфидной связи.
  52. 52. Химерный белок по п.45, где Е представляет собой константный домен иммуноглобулина Гд6.
  53. 53. Химерный белок по п.45, где Е представляет собой Гд61.
  54. 54. Химерный белок по п.45, где Е представляет собой Ес-фрагмент.
  55. 55. Химерный белок по п.45, где X представляет собой полипептид.
  56. 56. Химерный белок по п.45, где X представляет собой лейпролид.
  57. 57. Химерный белок по п.45, где X представляет собой низкомолекулярную молекулу.
  58. 58. Химерный белок по п.57, где малая молекула представляет собой антагонист УЬА4.
  59. 59. Химерный белок по п.45, где X представляет собой ингибитор слияния вируса.
  60. 60. Химерный белок по п.59, где ингибитор слияния вируса представляет собой ингибитор слияния ВИЧ.
  61. 61. Химерный белок по п.60, где ингибитор слияния ВИЧ представляет собой Т20 (8ЕЦ ГО ΝΟ:1) или Т21 (81 У) ГО ΝΟ:2) или Т1249 (81 У) ГО ΝΟ:3).
  62. 62. Химерный белок по п.45, где X представляет собой фактор свертывания крови.
  63. 63. Химерный белок по п.62, где фактор свертывания крови представляет собой фактор УГГ или УГГа.
    - 48 012566
  64. 64. Химерный белок по п.62, где фактор свертывания крови представляет собой фактор IX.
  65. 65. Химерный белок по п.45, где X представляет собой нуклеиновую кислоту.
  66. 66. Химерный белок по п.65, где нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК или РНК.
  67. 67. Химерный белок по п.45, где X представляет собой фактор роста.
  68. 68. Химерный белок по п.67, где фактор роста представляет собой эритропоэтин.
  69. 69. Способ лечения заболевания или состояния у индивидуума, включающий введение химерного белка по п.45 указанному индивидууму.
  70. 70. Способ по п.69, где заболевание или состояние представляет собой вирусную инфекцию.
  71. 71. Способ по п.70, где вирусная инфекция представляет собой ВИЧ.
  72. 72. Способ по п.69, где заболевание или состояние представляет собой нарушение свертываемости крови.
  73. 73. Способ по п.72, где нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию А.
  74. 74. Способ по п.72, где нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию В.
  75. 75. Способ по п.69, где заболевание или состояние представляет собой анемию.
  76. 76. Способ по п.69, где химерный белок вводят внутривенно, подкожно, перорально, защечно, подъязычно, назально, парентерально, ректально, вагинально или через дыхательные пути.
  77. 77. Способ по п.76, где химерный белок вводят через дыхательные пути.
  78. 78. Способ по п.76, где химерный белок вводят перорально.
  79. 79. Способ по п.69, где иммуноглобулин представляет собой ЦС.
  80. 80. Способ по п.69, где часть иммуноглобулина представляет собой Рс фрагмент.
  81. 81. Химерный белок по п.1, где вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой с молекулярной массой более 2 кДа.
  82. 82. Способ получения первой полипептидной цепи белка по п.1, включающий:
    a) трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую Рс-фрагмент иммуноглобулина, и вторую последовательность ДНК, кодирующую интеин;
    b) культивирование указанной клетки в условиях, при которых экспрессируется Рс-фрагмент и интеин;
    c) выделение указанного Рс-фрагмента и интеина из указанный клетки;
    б) химический синтез биологически активной молекулы с Ν-концевым Сук;
    е) взаимодействие выделенного интеина Рс стадии с) с ΜЕ8NА с получением С-концевого тиоэфира;
    ί) взаимодействие биологически активной молекулы стадии б) с Рс стадии е) с получением химерного белка, содержащего Рс, связанного с биологически активной молекулой.
  83. 83. Способ получения первой полипептидной цепи белка по п.1, включающий:
    a) трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую Рс-фрагмент иммуноглобулина, и вторую последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, где указанный сигнальный пептид расположен рядом с цистеином Рс-фрагмента;
    b) культивирование указанной клетки в условиях, при которых экспрессируется Рс-фрагмент и сигнальный пептид и Рс-фрагмент секретируется из клетки без сигнального пептида, но с Ν-концевым цистеином;
    c) выделение димеров указанного Рс-фрагмента с Ν-концевым цистеином из указанной клетки;
    б) химический синтез биологически активной молекулы, имеющей тиоэфир;
    е) взаимодействие биологически активной молекулы стадии б) с Рс стадии с) в условиях, при которых биологически активная молекула может связываться с одной цепью димера стадии с) с получением химерного белка, содержащего Рс, связанного с биологически активной молекулой.
  84. 84. Способ по п.83, где тиоэфир представляет собой С-концевой тиоэфир.
  85. 85. Способ получения первой полипептидной цепи белка по п.1, включающий:
    a) трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую Рс-фрагмент иммуноглобулина, и вторую последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, где указанный сигнальный пептид расположен рядом с цистеином Рс-фрагмента;
    b) культивирование указанной клетки в таких условиях, при которых экспрессируется Рс-фрагмент и сигнальный пептид, связанные вместе, и указанный сигнальный пептид отщепляется от Рс-фрагмента в клетке в первом положении, расположенном рядом с цистеином, или во втором положении, расположенном рядом с валином;
    c) выделение димеров указанных Рс-фрагментов с двумя Ν-концевыми цистеинами или двумя Νконцевыми валинами или Ν-концевым цистеином и Ν-концевым валином из указанной клетки;
    б) химический синтез биологически активной молекулы с тиоэфиром;
    е) взаимодействие биологически активной молекулы стадии б) с димерами стадии с) с получением химерного белка, содержащего первую цепь, включающую в себя Рс, связанный с биологически активной молекулой, и вторую цепь, включающую в себя Рс, не связанный ни с какой биологически активной молекулой или вариабельной областью иммуноглобулина.
  86. 86. Способ по п.85, где тиоэфир представляет собой С-концевой тиоэфир.
    - 49 012566
  87. 87. Химерный белок по п.19, где линкер представляет собой (СССС8)3.
  88. 88. Способ выделения химерного белка по п.1 из смеси, где смесь содержит:
    a) гибрид мономер-димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, где первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина;
    b) димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, где первая и вторая цепи содержат биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина; и
    c) часть константной области иммуноглобулина; где указанный способ предусматривает:
    ί) приведение в контакт смеси с лигандом-красителем, связанным с твердой подложкой в подходящих условиях, при которых гибрид мономер-димер и димер связываются с лигандом-красителем;
    ίί) удаление несвязанной части константной области иммуноглобулина;
    ϊϊΐ) изменение подходящих условий 1) для того, чтобы связь между гибридом мономер-димер и лигандом-красителем, связанным с твердой подложкой, разрывалась;
    ίν) выделение гибрида мономер-димер.
  89. 89. Способ по п.88, где лигандом-красителем является молекула биомиметика.
  90. 90. Способ по п.88, где лиганд-краситель выбран из М1тебс Неб 1™, М1тебс Неб 2™, М1тебс Огапде 1™, М1тейс Огапде 2™, М1тебс Огапде 3™, МипеЦс Уе11оп 1™, М1тебс Уе11оп 2™, М1тебс Сгееп 1™, М1тебс В1ие 1™ и М1тебс В1ие 2™.
  91. 91. Способ по п.90, где лигандом-красителем является М1тебс Неб 2™.
  92. 92. Способ по п.90, где лигандом-красителем является М1тебс Сгееп 1™.
  93. 93. Способ по п.88, где подходящие условия включают буфер с рН в области от 4-9 включительно.
  94. 94. Способ по п.93, где изменение подходящих условий заключается в добавлении по меньшей мере одной соли к буферу в концентрации, достаточной для разрушения связи гибрида мономер-димер с лигандом-красителем с выделением, таким образом, гибрида мономер-димер.
  95. 95. Способ по п.94, где по крайней мере одна соль представляет собой №С1.
  96. 96. Способ по п.93, где рН буфера составляет 8.
  97. 97. Способ по п.96, где концентрация соли составляет 400 мМ, а химерный белок содержит Еро.
  98. 98. Способ по п.94, также включающий добавление высококонцентрированной соли, сравнимой с концентрацией соли, которая разрушает связь гибрида мономер-димер с лигандом-красителем, так что более высокая концентрация соли разрушает связь димера с лигандом-красителем с выделением, таким образом, димера.
  99. 99. Химерный белок по п.17, где биологически активная молекула представляет собой интерферон α.
  100. 100. Химерный белок по п.17, где биологически активная молекула представляет собой интерферон β.
  101. 101. Химерный белок по п.45, где X представляет собой ЕРО, Ь представляет собой линкер из восьми аминокислот с аминокислотной последовательностью ЕБАСАААУ и Б представляет собой БсНпсвязывающий сайт с заменой аспарагина на аланин в положении 297.
  102. 102. Химерный белок по п.101, также содержащий аффинную метку.
  103. 103. Химерный белок по п.45, где 8Х представляет собой ΙΡΝβ, Ь представляет собой линкер из восьми аминокислот с аминокислотной последовательностью ЕБАСАААУ и Б представляет собой БсНпсвязывающий сайт с заменой аспарагина на аланин в положении 297.
  104. 104. Химерный белок по п.103, также содержащий аффинную метку.
  105. 105. Химерный белок по п.45, где X представляет собой фактор IX, Ь представляет собой линкер из восьми аминокислот с аминокислотной последовательностью ЕБАСАААУ и Б представляет собой БсНпсвязывающий сайт с заменой аспарагина на аланин в положении 297.
  106. 106. Химерный белок по п.105, также содержащий аффинную метку.
  107. 107. Химерный белок по п.12, где фактор свертываемости крови представляет собой фактор УШ, УШа или их биологически активный фрагмент.
  108. 108. Химерный белок по п.62, где фактор свертываемости крови представляет собой фактор УШ, УШа или их биологически активный фрагмент.
EA200501756A 2003-05-06 2004-05-06 Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка EA012566B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46960003P 2003-05-06 2003-05-06
US48796403P 2003-07-17 2003-07-17
US53920704P 2004-01-26 2004-01-26
PCT/US2004/014064 WO2005001025A2 (en) 2003-05-06 2004-05-06 Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501756A1 EA200501756A1 (ru) 2006-08-25
EA012566B1 true EA012566B1 (ru) 2009-10-30

Family

ID=33458764

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501756A EA012566B1 (ru) 2003-05-06 2004-05-06 Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка

Country Status (28)

Country Link
US (13) US7404956B2 (ru)
EP (7) EP2174946B1 (ru)
JP (6) JP5091480B2 (ru)
CN (3) CN104448003B (ru)
AT (1) ATE446307T1 (ru)
AU (1) AU2004252422B2 (ru)
BE (1) BE2016C015I2 (ru)
BR (2) BRPI0410345A8 (ru)
CA (1) CA2522590C (ru)
CY (4) CY1114639T1 (ru)
DE (1) DE602004023724D1 (ru)
DK (4) DK2361932T3 (ru)
EA (1) EA012566B1 (ru)
ES (3) ES2582947T3 (ru)
FR (1) FR16C0011I2 (ru)
HK (2) HK1161604A1 (ru)
HU (4) HUE030293T2 (ru)
IL (2) IL171779A (ru)
LT (2) LTC1625209I2 (ru)
LU (1) LU92991I2 (ru)
NL (1) NL300799I2 (ru)
NO (5) NO339539B1 (ru)
PL (3) PL2361932T3 (ru)
PT (3) PT1625209E (ru)
SI (4) SI1625209T1 (ru)
TW (1) TWI353991B (ru)
UA (1) UA95436C2 (ru)
WO (2) WO2005001025A2 (ru)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2647769C2 (ru) * 2015-12-30 2018-03-19 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Химерный улучшенный рекомбинантный фактор VIII
RU2650868C2 (ru) * 2012-07-13 2018-04-17 Займворкс Инк. Биспецифические асимметричные гетеродимеры, содержащие анти-cd3 конструкции
RU2711485C2 (ru) * 2014-04-11 2020-01-17 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Конъюгированные соединения, содержащие сконструированные с цистеином антитела
EA037095B1 (ru) * 2010-07-09 2021-02-05 Биовератив Терапьютикс Инк. Способ лечения гемофилии в и эпизодов кровотечения
EA038618B1 (ru) * 2009-12-06 2021-09-23 Биовератив Терапьютикс Инк. Химерные и гибридные полипептиды фактора viii-fc и способы их применения

Families Citing this family (371)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7737260B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
SG155777A1 (en) 2003-04-09 2009-10-29 Neose Technologies Inc Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2004101740A2 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2004100882A2 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
DK2325207T3 (en) 2004-11-12 2017-06-06 Xencor Inc Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
CN101184771A (zh) * 2005-05-26 2008-05-21 先灵公司 干扰素－IgG融合体
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20080219952A1 (en) 2005-08-26 2008-09-11 Ares Trading S.A. Process For the Preparation of Glycosylated Interferon Beta
CA2624189A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
JP4860703B2 (ja) 2005-10-06 2012-01-25 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化された抗ｃｄ３０抗体
US8153598B2 (en) * 2005-10-19 2012-04-10 Intrexon Corporation PKD ligands and polynucleotides encoding PKD ligands
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
ES2618785T3 (es) * 2005-10-31 2017-06-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Composiciones y métodos para tratar el cáncer basados en receptores FZD humanos
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
US8604175B2 (en) 2005-12-09 2013-12-10 Ares Trading S.A. Method for purifying FSH or a FSH mutant
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
WO2007112005A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Pc5 as a factor ix propeptide processing enzyme
KR101492422B1 (ko) * 2006-04-11 2015-02-12 체에스엘 베링 게엠베하 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법
EP2029738A2 (en) 2006-05-24 2009-03-04 Novo Nordisk Health Care AG Factor ix analogues having prolonged in vivo half life
AU2013202566C1 (en) * 2006-06-14 2018-07-12 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
EP3896090B1 (en) 2006-06-14 2022-01-12 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
EP1867660A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
WO2008036449A2 (en) * 2006-06-29 2008-03-27 The Regents Of The University Of California Chemical antibodies for immunotherapy and imaging
US20080274958A1 (en) 2006-07-21 2008-11-06 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
ES2457072T3 (es) 2006-08-14 2014-04-24 Xencor, Inc. Anticuerpos optimizados que seleccionan como diana CD19
TW200817438A (en) 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
MX2009001204A (es) * 2006-08-17 2009-02-11 Hoffmann La Roche Conjugado de un anticuerpo cointra ccr5 y un peptido antifusogenico.
WO2008051326A2 (en) * 2006-08-21 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Identification of contactins and l1- cams as ligands for the amyloid precursor protein
WO2008025747A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
UA99262C2 (ru) * 2006-08-28 2012-08-10 Арес Трейдінг С.А. СПОСОБ УМЕНЬШЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СВОБОДНЫХ FC-частиц В ЖИДКОСТИ, КОТОРАЯ СОДЕРЖИТ Fc-содержащий БЕЛОК
CA2660795C (en) 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
US7803769B2 (en) * 2006-10-25 2010-09-28 Amgen Inc. OSK1 peptide analogs and pharmaceutical compositions
US20080254512A1 (en) * 2006-11-02 2008-10-16 Capon Daniel J Hybrid immunoglobulins with moving parts
US8754194B2 (en) 2006-12-22 2014-06-17 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
DK2109457T3 (en) 2007-02-12 2016-04-11 Csl Behring Gmbh THERAPEUTIC USE OF KAZAL TYPE SERINE PROTEASE INHIBITORS
NZ580030A (en) 2007-04-03 2012-06-29 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
WO2008153745A2 (en) * 2007-05-22 2008-12-18 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
TWI554520B (zh) * 2007-07-20 2016-10-21 諾華健控股公司 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ）-ｆｃ融合蛋白
CL2008002092A1 (es) * 2007-07-20 2009-05-29 Hoffmann La Roche Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas.
BRPI0814465B1 (pt) 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica
JP2010535788A (ja) 2007-08-09 2010-11-25 シントニックス・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 免疫調節性ペプチド
AU2008304111B2 (en) 2007-09-27 2014-04-24 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
WO2009045894A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-09 Centocor, Inc. Methods and structural conformations of antibody preparations with increased resistance to proteases
WO2009053358A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying fc-fusion proteins
CA2701221A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an fc-containing protein
EP2203180B1 (en) * 2007-10-22 2012-11-21 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
ES2558155T3 (es) 2007-10-30 2016-02-02 Indiana University Research And Technology Corporation Compuestos que muestran actividad antagonista de glucacón y agonista de GLP-1
ES2962777T3 (es) 2007-11-15 2024-03-21 Amgen Inc Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP4098661A1 (en) 2007-12-26 2022-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
KR101863136B1 (ko) * 2008-01-24 2018-05-31 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 용해 도메인 융합 구성물 및 이를 제조하고 사용하는 방법
JP5701064B2 (ja) 2008-01-25 2015-04-15 アムジエン・インコーポレーテツド フェロポーチン抗体およびその使用方法
KR101582841B1 (ko) 2008-02-27 2016-01-11 노보 노르디스크 에이/에스 콘쥬게이트된 인자 ｖｉｉｉ 분자
US9315577B2 (en) 2008-05-01 2016-04-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
EA020326B9 (ru) 2008-06-17 2015-03-31 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Агонисты смешанного действия на основе глюкозозависимого инсулинотропного пептида для лечения нарушений обмена веществ и ожирения
TWI541023B (zh) 2008-06-17 2016-07-11 印第安納大學科技研究公司 在生理ｐｈ緩衝液中呈現增強之溶解度及穩定性之升糖激素類似物
CL2009001424A1 (es) 2008-06-17 2010-04-30 Univ Indiana Res & Tech Corp Peptido tipo glucagon; dimero que comprende dos de dichos peptidos; composicion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar diabetes o inducir perdida de peso.
KR101507718B1 (ko) 2008-06-24 2015-04-10 체에스엘 베링 게엠베하 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체
US20100048488A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
PT2331136T (pt) 2008-09-26 2018-03-27 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligação a frizzled e utilizações dos mesmos
US20120021484A1 (en) * 2008-10-22 2012-01-26 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant FcRn and Variants Thereof for Purification of Fc-Containing Fusion Proteins
CA2742871C (en) 2008-11-13 2018-10-23 Herb Lin Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6
CA2742817A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Arginine inactivation of viruses
JP5755566B2 (ja) 2008-12-19 2015-07-29 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ アミド系インスリンプロドラッグ
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010111414A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Bayer Healthcare Llc Factor viii variants and methods of use
WO2010111617A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
AU2010230563A1 (en) 2009-04-02 2011-09-22 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain Fab fragments
US20100256340A1 (en) * 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
CN102405230A (zh) * 2009-04-22 2012-04-04 默克专利有限公司 具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白
MX2011013625A (es) 2009-06-16 2012-01-20 Univ Indiana Res & Tech Corp Compuestos glucagon activo de receptor de gip.
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CA2772051C (en) 2009-08-24 2020-08-18 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
NZ701769A (en) 2009-09-16 2016-06-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
NZ600278A (en) 2009-11-13 2014-04-30 Grifols Therapeutics Inc Von willebrand factor (vwf)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto
US8703701B2 (en) 2009-12-18 2014-04-22 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
RU2012136450A (ru) 2010-01-27 2014-03-10 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Конъюгаты антагонист глюкагона - агонист gip и композиции для лечения метаболических расстройств и ожирения
EP2547359B1 (en) 2010-03-15 2016-03-09 The Board of Trustees of the University of Illionis Inhibitors of beta integrin-g protein alpha subunit binding interactions
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
EP2371857A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease
KR20130043102A (ko) 2010-04-01 2013-04-29 온코메드 파마슈티칼스, 인크. 프리즐드-결합 작용제 및 그의 용도
US9127088B2 (en) 2010-05-13 2015-09-08 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
US9061097B2 (en) 2010-06-07 2015-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device
US8940860B2 (en) 2010-06-16 2015-01-27 Indiana University Research And Technology Corporation Single-chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
JP5912112B2 (ja) 2010-06-24 2016-04-27 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ アミド系インスリンプロドラッグ
RU2580317C2 (ru) 2010-06-24 2016-04-10 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Пептидные пролекарства, принадлежащие к суперсемейству амид-содержащих глюкагонов
AU2011274423B2 (en) 2010-07-09 2016-02-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
US9611310B2 (en) 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012087943A2 (en) 2010-12-20 2012-06-28 The Regents Of The University Of Michigan Inhibitors of the epidermal growth factor receptor-heat shock protein 90 binding interaction
SG191194A1 (en) 2010-12-22 2013-07-31 Univ Indiana Res & Tech Corp Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CN103415621A (zh) 2011-01-14 2013-11-27 雷德伍德生物科技股份有限公司 醛标记免疫球蛋白多肽及其使用方法
LT3489255T (lt) * 2011-02-10 2021-08-25 Roche Glycart Ag Mutantiniai interleukino-2 polipeptidai
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
CA2825081A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Birgit Bossenmaier Antigen binding proteins
EP2497489A1 (en) 2011-03-09 2012-09-12 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of silent brain ischemia and ischemia of other organs
CN103415301A (zh) 2011-03-09 2013-11-27 德国杰特贝林生物制品有限公司 用于与包括与人造表面接触的医疗操作一起施用的fxii抑制剂
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
CA2833748C (en) 2011-04-20 2019-07-16 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
EP2704739B1 (en) 2011-05-06 2017-07-12 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Recombinant immunotoxin targeting mesothelin
CA2838833A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
JP6179864B2 (ja) 2011-06-22 2017-08-16 インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション グルカゴン／ｇｌｐ−１レセプタコ−アゴニスト
EP3513804B1 (en) 2011-07-08 2022-03-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
IL230564B2 (en) 2011-07-22 2023-09-01 Csl Ltd Anticoagulant monoclonal antibodies anti–factor xii/fxiia, a method for their preparation, a pharmaceutical compound containing them and medical uses.
EA028914B1 (ru) 2011-07-25 2018-01-31 Байоджен Хемофилия Инк. Исследования для мониторинга нарушений свертываемости крови
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
MY168754A (en) 2011-10-06 2018-11-30 Hanmi Science Co Ltd Blood coagulation factor vii and viia derivatives, conjugates and complexes comprising the same, and use thereof
ES2729993T3 (es) 2011-10-14 2019-11-07 Amgen Inc Inyector y procedimiento de ensamblaje
EP2784080B1 (en) * 2011-10-31 2019-12-18 Shimadzu Corporation Peptide-hinge-free flexible antibody-like molecule
BR112014007124A2 (pt) 2011-11-17 2017-06-13 Univ Indiana Res & Tech Corp superfamília de peptídeos gluxagon que exibem atividade no receptor glicocorticóide
RS63244B1 (sr) 2011-12-16 2022-06-30 Modernatx Inc Kompozicije modifikovane mrna
JP6392123B2 (ja) 2011-12-20 2018-09-19 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 糖尿病治療のためのｃｔｐ系インスリンアナローグ
HUE046396T2 (hu) 2012-01-12 2020-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Kiméra faktor VIII polipeptidek és ezek alkalmazása
CN108465106B (zh) 2012-01-12 2022-05-27 普吉特海湾血液中心 降低经受因子viii疗法的个体中针对因子viii的免疫原性的方法
EP2623110A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders
MX2014009565A (es) 2012-02-10 2014-11-10 Genentech Inc Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros.
PL2814502T3 (pl) 2012-02-15 2018-02-28 Csl Behring Gmbh Warianty czynnika von Willebranda mające ulepszone powinowactwo do wiązania czynnika VIII
KR102008190B1 (ko) 2012-02-15 2019-08-07 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 재조합 인자 viii 단백질
ES2935489T3 (es) 2012-02-15 2023-03-07 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
EP2833892A4 (en) 2012-04-02 2016-07-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013256229A1 (en) * 2012-05-03 2014-10-30 Medimmune, Llc Method for analyzing sample components
CN104427995A (zh) 2012-06-08 2015-03-18 比奥根艾迪克Ma公司 嵌合凝血因子
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
MX2014015558A (es) 2012-06-21 2015-03-05 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que exhiben actividad del receptor gip.
BR112014031671A2 (pt) 2012-06-21 2018-08-07 Hoffmann La Roche análogos de glucagon exibindo atividade de receptor gip
US20140051834A1 (en) 2012-06-21 2014-02-20 Hoffmann-La Roche, Inc. Incretin Receptor Ligand Polypeptide Fc-Region Fusion Polypeptides And Conjugates With Altered Fc-Effector Function
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
KR20150023889A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
JP6603128B2 (ja) 2012-07-11 2019-11-06 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド ＸＴＥＮおよびｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子タンパク質を有する第ＶＩＩＩ因子の複合体、および、その使用
WO2014018777A2 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Biogen Idec Ma Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
DK2880170T3 (en) 2012-08-02 2016-10-24 Hoffmann La Roche PROCEDURE FOR PREPARING SOLUBLE FcR AS Fc FUSION WITH INERT IMMUNOGLOBULIN Fc REGION AND APPLICATIONS THEREOF
TW201427685A (zh) 2012-09-25 2014-07-16 Biogen Idec Inc Ｆｉｘ多肽的應用
AU2013331000B2 (en) 2012-10-18 2018-04-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
AU2013334790A1 (en) 2012-10-23 2015-04-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using Wnt pathway-binding agents
EP3943102A1 (en) 2012-10-30 2022-01-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
EP2922590B1 (en) 2012-11-21 2020-02-05 Amgen Inc. Drug delivery device
ES2921623T3 (es) 2012-11-26 2022-08-30 Modernatx Inc ARN modificado terminalmente
US10717965B2 (en) 2013-01-10 2020-07-21 Gloriana Therapeutics, Inc. Mammalian cell culture-produced neublastin antibodies
JP2016510411A (ja) 2013-02-04 2016-04-07 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｗｎｔ経路インヒビターによる処置の方法およびモニタリング
EP4223772A3 (en) 2013-02-15 2023-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii gene
ES2844189T3 (es) 2013-03-08 2021-07-21 Csl Behring Gmbh Tratamiento y prevención de lesiones remotas por isquemia-reperfusión
US20160017017A1 (en) 2013-03-11 2016-01-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Growth Hormone Compounds
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
WO2014144911A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Capon Daniel J Hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
SG11201505926VA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
CN105263514B (zh) 2013-03-15 2019-04-26 本质生命科学有限公司 抗铁调素抗体及其用途
EP3593839A1 (en) 2013-03-15 2020-01-15 Amgen Inc. Drug cassette
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
TWI580451B (zh) 2013-03-15 2017-05-01 安美基公司 用於注射器之匣盒及使用具有自動注射器及匣盒之自動注射器設備之方法
ES2776195T3 (es) 2013-03-15 2020-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
LT2976117T (lt) 2013-03-22 2021-02-25 Amgen Inc. Purkštuvas ir surinkimo būdas
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
PL3013366T3 (pl) 2013-06-28 2022-01-17 Csl Behring Gmbh Terapia skojarzona z zastosowaniem inhibitora czynnika xii i inhibitora c1
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
EP3875106A1 (en) 2013-08-08 2021-09-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
CN103599527A (zh) * 2013-08-16 2014-02-26 安源生物科技(上海)有限公司 包含改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白的药物组合物
CN103397009B (zh) * 2013-08-16 2015-06-03 安源生物科技(上海)有限公司 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
US9322037B2 (en) * 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
EP3903599A1 (en) 2013-09-25 2021-11-03 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
AU2014329452B2 (en) 2013-10-03 2019-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
AU2014340171B2 (en) 2013-10-24 2019-05-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015061389A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
US9975942B2 (en) 2013-11-11 2018-05-22 Wake Forest University Health Services EPHA3 And multi-valent targeting of tumors
CA2931356A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
WO2015085276A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Biogen Idec Ma Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
JP2017500017A (ja) 2013-12-20 2017-01-05 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 生物薬剤フェドバッチ生産能力及び生産物品質を改善するための灌流シード培養の使用
JP2017504598A (ja) 2013-12-20 2017-02-09 インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション 脂質化インクレチン受容体リガンドヒト免疫グロブリンｆｃ−領域融合ポリペプチド
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
EP3102589A1 (en) 2014-02-04 2016-12-14 Biogen MA Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
LT3701971T (lt) * 2014-03-14 2023-01-10 Biomolecular Holdings Llc Junginiai, naudingi hibridinio imunoglobulino, turinčio nepeptidilo ryšį, gamyboje
CA3193070A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
JP6817074B2 (ja) 2014-06-03 2021-01-20 アムジエン・インコーポレーテツド 制御可能な薬物送達システム及び使用方法
CN106456778A (zh) 2014-06-18 2017-02-22 德国杰特贝林生物制品有限公司 在神经创伤性病患中使用因子xii抑制剂进行治疗
US11008561B2 (en) 2014-06-30 2021-05-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor IX gene
CA2953593C (en) 2014-07-02 2023-09-26 Csl Limited Modified von willebrand factor
NZ730186A (en) 2014-09-22 2020-04-24 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
SG11201701803XA (en) 2014-09-26 2017-04-27 Bayer Pharma AG Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof
ES2753391T3 (es) 2014-10-14 2020-04-08 Halozyme Inc Composiciones de adenosina desaminasa 2 (ADA2), variantes de la misma y métodos de uso de las mismas
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
CN106999602B (zh) * 2014-11-27 2022-02-01 诺和诺德股份有限公司 Glp-1衍生物及其用途
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3233163B1 (en) 2014-12-19 2021-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
EP3250609A4 (en) 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
CN107835820B (zh) 2015-01-26 2021-10-15 芝加哥大学 识别癌症特异性IL13Rα2的CAR T细胞
CN114773469A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3981450A1 (en) 2015-02-27 2022-04-13 Amgen, Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2016154601A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
EP3298036B1 (en) 2015-05-22 2022-04-06 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von willebrand factor
EP3297656B1 (en) 2015-05-22 2020-01-08 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
ES2784603T3 (es) 2015-06-02 2020-09-29 Novo Nordisk As Insulinas con extensiones recombinantes polares
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CA2993423C (en) 2015-09-18 2024-03-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Il-8-binding antibodies and uses thereof
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
WO2017070167A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
CN105384828B (zh) * 2015-12-18 2019-06-21 中国科学技术大学 长效干扰素-α及其改造方法
EP3184149A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
SG11201805497QA (en) 2016-01-07 2018-07-30 Csl Behring Recombinant Facility Ag Mutated truncated von willebrand factor
WO2017117630A1 (en) 2016-01-07 2017-07-13 Csl Limited Mutated von willebrand factor
CA3009661A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Inhibrx, Inc. Multivalent and multispecific 41bb-binding fusion proteins
BR112018015659A2 (pt) 2016-02-01 2018-12-26 Bioverativ Therapeutics Inc genes otimizados do fator viii
CN106397598B (zh) * 2016-02-23 2020-07-14 上海交通大学 多价多特异性抗体及免疫杂合蛋白的表达和制备方法
CN106397599B (zh) * 2016-02-23 2020-08-07 上海交通大学 二价双特异性抗体杂交蛋白的表达和制备方法
EP3721922B1 (en) 2016-03-15 2022-05-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US11174321B2 (en) 2016-04-06 2021-11-16 Csl Limited Method of treating atherosclerosis
EP3442554A4 (en) * 2016-04-14 2019-12-04 Iconic Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DISEASES RELATED TO NEOVASCULARIZATION
CN109071634A (zh) 2016-04-26 2018-12-21 R.P.谢勒技术有限责任公司 抗体偶联物及其制备和使用方法
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017191817A1 (ja) 2016-05-02 2017-11-09 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
CA3018426A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
SG11201809642TA (en) 2016-05-16 2018-11-29 Baxalta Inc Anti-factor ix padua antibodies
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018064098A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Cohbar, Inc. Therapeutic mots-c related peptides
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
US11249082B2 (en) 2016-10-29 2022-02-15 University Of Miami Zika virus assay systems
WO2018087271A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Csl Behring Recombinant Facility Ag Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
SG11201903950UA (en) 2016-11-11 2019-05-30 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
MX2019006446A (es) 2016-12-02 2019-12-11 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos para inducir tolerancia inmunológica a factores de coagulación.
MA46967A (fr) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc Méthodes de traitement de l'arthropathie hémophilique à l'aide de facteurs de coagulation chimériques
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
TW201836646A (zh) * 2017-01-25 2018-10-16 美商艾康尼醫療股份有限公司 治療與血管生成及血管新生相關病症的方法
WO2018148224A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
EP3582829A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
WO2018156892A1 (en) 2017-02-23 2018-08-30 Adrx, Inc. Peptide inhibitors of transcription factor aggregation
US11850262B2 (en) 2017-02-28 2023-12-26 Purdue Research Foundation Compositions and methods for CAR T cell therapy
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
CA3052482A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
IL303449B1 (en) 2017-03-09 2024-04-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
WO2018170134A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to a tissue factor-targeting igg3 immunoconjugates
JP2020511499A (ja) 2017-03-20 2020-04-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 赤血球生成刺激タンパク質のインビトロでの糖鎖改変のための方法
CN114588404A (zh) 2017-03-28 2022-06-07 美国安进公司 柱塞杆和注射器组件系统以及方法
CN110505885A (zh) 2017-04-05 2019-11-26 诺和诺德股份有限公司 寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物
PE20200150A1 (es) * 2017-04-21 2020-01-17 Genentech Inc Uso de antagonistas de klk5 para el tratamiento de una enfermedad
WO2018207023A2 (en) * 2017-05-10 2018-11-15 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual hiv antiviral and immunomodulatory activity
US20230137562A1 (en) 2017-06-07 2023-05-04 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
WO2018234518A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 CSL Behring Lengnau AG MODULATION OF IMMUNOGENICITY OF FVIII BY VWF TRONQUÉ
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MX2019015479A (es) 2017-06-23 2020-02-20 Amgen Inc Dispositivo electronico de administracion de farmacos con tapa accionada por un conjunto de conmutador.
WO2019014014A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Amgen Inc. NEEDLE INSERTION-RETRACTING SYSTEM HAVING DOUBLE TORSION SPRING SYSTEM
JP2020527376A (ja) 2017-07-21 2020-09-10 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
EP3658203B1 (en) 2017-07-25 2022-08-31 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
JP7374883B2 (ja) 2017-08-09 2023-11-07 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 核酸分子およびその使用
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
CA3073062A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US11759565B2 (en) 2017-10-04 2023-09-19 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
WO2019090086A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
MA50553A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec détection de positionnement et de débit
MA50569A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Ensembles de remplissage-finition et procédés associés
JP7247174B2 (ja) 2017-11-10 2023-03-28 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスのプランジャ
MA50903A (fr) 2017-11-16 2021-05-12 Amgen Inc Auto-injecteur avec détection de décrochage et de point d'extrémité
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
JP7002927B2 (ja) 2017-11-22 2022-01-20 本田技研工業株式会社 駆動軸配置構造
CN112055595A (zh) 2018-01-22 2020-12-08 恩多塞特公司 Car t细胞的使用方法
CN111918674A (zh) 2018-02-01 2020-11-10 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 表达因子viii的慢病毒载体的用途
EA202092316A1 (ru) 2018-03-28 2021-05-25 Бристол-Маерс Сквибб Компани Слитые белки интерлейкина-2/альфа-рецептора интерлейкина-2 и способы применения
CU24554B1 (es) 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
BR112020022164A2 (pt) 2018-05-18 2021-02-02 Bioverativ Therapeutics Inc. métodos de tratamento de hemofilia a
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US11830582B2 (en) 2018-06-14 2023-11-28 University Of Miami Methods of designing novel antibody mimetics for use in detecting antigens and as therapeutic agents
BR112020026512A2 (pt) 2018-07-03 2021-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Formulações de fgf-21
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US20210228815A1 (en) 2018-07-24 2021-07-29 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
JP2021533753A (ja) 2018-08-09 2021-12-09 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 核酸分子及び非ウイルス遺伝子治療のためのそれらの使用
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
WO2020068476A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AR116679A1 (es) 2018-10-02 2021-06-02 Amgen Inc Sistemas de inyección para la administración de fármacos con transmisión de fuerza interna
US20210338936A1 (en) 2018-10-05 2021-11-04 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
CN109439679A (zh) * 2018-10-09 2019-03-08 上海市儿童医院 一种高活性重组人凝血因子ix融合蛋白及其制备方法
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
EP3866890A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
WO2020086408A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A high-yield perfusion-based transient gene expression bioprocess
EP3873567A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
WO2020091981A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
EP3917944A1 (en) 2019-01-28 2021-12-08 Cohbar Inc. Therapeutic peptides
AU2020242945A1 (en) 2019-03-19 2021-10-14 CSL Innovation Pty Ltd Factor IX variants and uses thereof in therapy
KR20220009389A (ko) 2019-04-17 2022-01-24 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 엑소좀 및 aav 의 조성물
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
KR20220009984A (ko) 2019-05-17 2022-01-25 유니베르시태트 취리히 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응을 치료하는데 사용하기 위한 합토글로빈
EP3986918A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
WO2021001522A1 (en) 2019-07-04 2021-01-07 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vwf) for increasing the in vitro stability of coagulation factor viii
US20220273887A1 (en) 2019-08-23 2022-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
EP4038182A1 (en) 2019-09-30 2022-08-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
US20220348637A1 (en) 2019-11-11 2022-11-03 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
EP4058465A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Cohbar Inc. Cxcr4 antagonist peptides
CN115023444A (zh) 2019-12-20 2022-09-06 再生元制药公司 新型il2激动剂及其使用方法
PE20230036A1 (es) 2019-12-23 2023-01-10 Denali Therapeutics Inc Variantes de progranulina
US20230087600A1 (en) 2020-02-06 2023-03-23 Bristol-Myers Squibb Company Il-10 and uses thereof
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
KR20230110563A (ko) 2020-11-20 2023-07-24 체에스엘 베링 게엠베하 항체 매개 거부 반응의 치료 방법
WO2022162218A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Csl Behring Ag Method of treating or preventing an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
AU2022269297A1 (en) 2021-05-07 2023-12-07 Csl Behring Ag Expression system for producing a recombinant haptoglobin (hp) beta chain
CA3217207A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2024047219A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Csl Behring Ag Haptoglobin for use in treating or preventing exaggerated erectile response or erectile dysfunction

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605689A (en) * 1991-05-31 1997-02-25 Genentech, Inc. Treatment of HIV-associated immune thrombocytopenic purpura
WO2000006605A2 (en) * 1998-07-28 2000-02-10 Micromet Ag Heterominibodies

Family Cites Families (310)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US660843A (en) * 1900-05-16 1900-10-30 Rebecca Coyle Nursing-gown.
US786376A (en) 1902-05-15 1905-04-04 Fischer Motor Vehicle Company Electrogasolene-vehicle.
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4456591A (en) 1981-06-25 1984-06-26 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Therapeutic method for activating factor VII
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US4889919A (en) 1986-08-13 1989-12-26 Zymogenetics, Inc. Biologically active PDGF derived A-chain homodimers
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DK525384D0 (da) * 1984-11-05 1984-11-05 Nordisk Insulinlab Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4868112A (en) 1985-04-12 1989-09-19 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4745055A (en) 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
US5180583A (en) 1985-11-26 1993-01-19 Hedner Ulla K E Method for the treatment of bleeding disorders
JP2525022B2 (ja) 1986-01-03 1996-08-14 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド ▲ＶＩＩＩ▼：ｃ因子型タンパク質の改良生産方法
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL78444A (en) 1986-04-08 1992-05-25 Yeda Res & Dev Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
CA1340456C (en) 1986-07-07 1999-03-23 Hubert J.P. Schoemaker Chimeric rodent/human immunoglobulins specific for tumor-associated antigens
NO873164L (no) 1986-07-30 1988-02-01 Teijin Ltd Muse-humane kimaere antistoffer.
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
CA1339445C (en) 1986-11-12 1997-09-09 The General Hospital Corporation Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and method of use
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
ZA89430B (en) * 1988-01-22 1989-10-25 Gen Hospital Corp Cloned genes encoding ig-cd4 fusion proteins and the use thereof
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2641468A1 (fr) * 1989-01-11 1990-07-13 Merieux Inst Anticorps chimeriques anti-recepteur de l'interleukine-2 humaine, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
WO1990014425A1 (en) 1989-05-22 1990-11-29 Zymogenetics, Inc. PDGF α-RECEPTOR
US5061786A (en) 1989-05-25 1991-10-29 Genentech, Inc. Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
DE69005740T2 (de) 1989-08-21 1994-06-01 Ngk Insulators Ltd Aufzeichnungskopf, bestehend aus einem eine Elektrode tragenden Substrat mit einem dünnwandigen Kontaktendteil, und Schicht zur Verstärkung des Substrats.
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
ATE194384T1 (de) 1989-09-12 2000-07-15 Hoffmann La Roche Tnf-bindende proteine
US5935815A (en) 1989-10-25 1999-08-10 Katholieke Universiteit Leuven Process for micro biological production of proteins
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5648273A (en) 1989-12-27 1997-07-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Hepatic growth factor receptor is the MET proto-oncogene
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
GB9009106D0 (en) 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
CA2040099A1 (en) 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
US20030064480A1 (en) 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
EP0464533B1 (de) 1990-06-28 1998-07-29 Hoechst Aktiengesellschaft Fusionsproteine mit immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
JP4236698B2 (ja) 1990-11-26 2009-03-11 ジェネティックス インスティチュート，リミテッド ライアビリティ カンパニー 宿主細胞でのｐａｃｅの発現およびその使用法
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
CA2097060A1 (en) * 1990-12-04 1992-06-05 Peter J. Curtis Bifunctional antibodies and method of preparing same
US5374617A (en) 1992-05-13 1994-12-20 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with FVIIa
US5541063A (en) 1991-04-19 1996-07-30 Schering Corporation Human interleukin-3 receptor α subunit
US5227158A (en) 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5346991A (en) 1991-06-13 1994-09-13 Genentech, Inc. Tissue factor mutants useful for the treatment of myocardial infarction and coagulopathic disorders
US5348856A (en) 1991-07-08 1994-09-20 E. R. Squibb & Sons, Inc. DNA encoding TRKC protein
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5116753A (en) * 1991-07-30 1992-05-26 The Salk Institute For Biological Studies Maintenance of pancreatic islets
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5454933A (en) * 1991-12-16 1995-10-03 Exxon Research And Engineering Company Deep desulfurization of distillate fuels
WO1993015210A1 (en) * 1992-01-23 1993-08-05 Merck Patent Gmbh Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
EP0615451B1 (en) 1992-05-26 2005-12-07 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994005328A1 (en) 1992-08-28 1994-03-17 The Scripps Research Institute Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
GB2270845B (en) 1992-09-24 1996-07-10 Smiths Ind Med Syst Inc Suction catheter assemblies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE669986T1 (de) 1992-11-13 1996-10-10 Idec Pharma Corp Völlig unfunktionelle konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung.
US5648446A (en) * 1993-02-24 1997-07-15 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Diguanamines and preparation process, derivatives and use thereof
WO1994028017A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 The Scripps Research Institute Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6479055B1 (en) * 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
KR950003279A (ko) 1993-07-29 1995-02-16 고사이 아끼오 플루오로알칸 카르복사미드 유도체의 제조방법
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6740734B1 (en) 1994-01-14 2004-05-25 Biovitrum Ab Bacterial receptor structures
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
HU220347B (hu) 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
US6027726A (en) * 1994-09-30 2000-02-22 Inex Phamaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
US5596080A (en) * 1994-10-03 1997-01-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Crosslinking processes/agents for zein
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6485726B1 (en) * 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
ATE238668T1 (de) * 1995-01-17 2003-05-15 Brigham & Womens Hospital Rezeptorspezifischer transepithelialer transport von immunogenen
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5731168A (en) * 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5591573A (en) * 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
NZ311319A (en) 1995-06-07 2000-01-28 Trimeris Inc The treatment of HIV and other viral infections using the peptide DP-178 or DP-107 in combination therapy
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US5840529A (en) 1995-08-02 1998-11-24 Clinical Research Institute Of Montreal Mammalian pro-hormone convertase
AU710696C (en) 1995-09-08 2002-10-24 Genentech Inc. VEGF-related protein
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US20030026779A1 (en) 1999-10-15 2003-02-06 Liming Yu Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
CA2198968C (en) 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
JP2000515735A (ja) 1996-07-03 2000-11-28 ジェネンテック インコーポレーテッド 肝細胞成長因子レセプターアゴニスト
CA2203745A1 (en) 1996-07-26 1998-01-26 Robert Day Pro-protein converting enzyme
EP0918872B1 (en) 1996-08-02 2008-02-20 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6159462A (en) 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
JP4138013B2 (ja) 1996-12-23 2008-08-20 イミュネックス・コーポレーション Ｔｎｆスーパーファミリーのメンバーであるｎｆ−ｋａｐｐａ ｂの受容体アクティベーターに対するリガンド
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
PT988056E (pt) 1997-01-22 2003-09-30 Univ Texas Metodos e composicoes de factor tecidual para o tratamento da coagulacao e de tumores
TW502011B (en) * 1997-02-05 2002-09-11 Ajinomoto Kk Process for producing n-long-chain acyl acidic amino acids or salts thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
PT981637E (pt) 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
ATE386802T1 (de) 1997-06-12 2008-03-15 Novartis Int Pharm Ltd Künstliche antikörperpolypeptide
ES2235336T3 (es) 1997-06-13 2005-07-01 Gryphon Therapeutics, Inc. Ligacion quimica nativa en fase solida de peptidos desprotegidos o protegidos en la cisteina n-terminal en solucion acuosa.
DE59809378D1 (de) * 1997-06-21 2003-10-02 Tesa Ag Klebfolienstreifen-Verbund und seine Verwendung
US6310183B1 (en) 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
NZ505880A (en) 1998-01-23 2003-06-30 Immunex Corp IL-18 receptor polypeptides
PL199659B1 (pl) 1998-02-25 2008-10-31 Merck Patent Gmbh Białko fuzyjne przeciwciała hu-KS IL2, cząsteczka DNA kodująca białko fuzyjne przeciwciała hu-KS IL2 i sposób wytwarzania białka fuzyjnego przeciwciała hu-KS IL2
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3871099A (en) 1998-05-06 1999-11-23 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Reversal of proinflammatory response by ligating the macrophage fcgammari receptor
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
WO1999059643A2 (en) * 1998-05-20 1999-11-25 Sdg, Inc. Liposomal delivery complex
US6355782B1 (en) 1998-07-09 2002-03-12 Baylor College Of Medicine Hypohidrotic ectodermal dyplasia genes and proteins
US6596847B2 (en) 1998-07-15 2003-07-22 Genentech, Inc. Tissue factor protein variants
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
DE69931382T2 (de) 1998-09-30 2007-05-03 New England Biolabs, Inc., Ipswich Intein vermittelte peptidligation
US7488590B2 (en) * 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
KR100719202B1 (ko) 1998-10-23 2007-05-16 키린-암젠 인코포레이티드 ＭＰｌ 수용체에 결합하는 화합물 및 이를 함유하는 제약학적 조성물
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000028065A1 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Novo Nordisk A/S Method for the production of fvii
US6280994B1 (en) 1998-11-25 2001-08-28 Zymogenetics, Inc. Zace 1: a human metalloenzyme
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
IL143834A0 (en) 1999-01-06 2002-04-21 Genentech Inc Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants
IL143866A0 (en) 1999-01-06 2002-04-21 Genentech Inc Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
US6602977B1 (en) 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
CA2270600A1 (en) * 1999-05-03 2000-11-03 Infectio Recherche Inc. Method and formulations for the treatment of diseases, particularly those caused by human immunodeficiency virus and leishmania
EP1187852B1 (en) * 1999-05-19 2007-08-08 EMD Lexigen Research Center Corp. EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS
EP1198479B1 (en) 1999-07-01 2008-06-18 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
IL147270A0 (en) 1999-07-02 2002-08-14 Genentech Inc Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
IL147269A0 (en) * 1999-07-02 2002-08-14 Genentech Inc FVIIa ANTAGONISTS
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
JP4944324B2 (ja) * 1999-07-13 2012-05-30 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 免疫グロブリン融合タンパク質
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
ATE316982T1 (de) * 1999-08-09 2006-02-15 Lexigen Pharm Corp Mehrere zytokin-antikörper komplexen
CN1407900A (zh) * 1999-10-14 2003-04-02 人类基因组科学公司 使用人骨髓祖细胞抑制因子－1(mpif－1)来治疗或预防细胞、组织、和器官损伤的方法
US7479539B1 (en) 1999-11-05 2009-01-20 Curis, Inc. Hedgehog fusion proteins
EP1228214A2 (en) 1999-11-12 2002-08-07 MERCK PATENT GmbH Erythropoietin forms with improved properties
US6808902B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
AU1920301A (en) * 1999-11-17 2001-05-30 Immunex Corporation Receptor activator of nf-kappa b
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
WO2001058935A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Maxygen Aps FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES
DE60122286T2 (de) 2000-02-11 2007-08-02 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
US20040102388A1 (en) 2000-03-22 2004-05-27 High Katherine A. Modified blood clotting factors and methods of use
DK1290013T3 (da) * 2000-04-21 2006-06-26 Amgen Inc Apo-A1/All-peptidderivater
DE10020332A1 (de) 2000-04-26 2001-11-15 Henkel Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
EP1278778A2 (en) 2000-05-03 2003-01-29 Amgen Inc., Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
US20020090646A1 (en) * 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
BR0111182A (pt) 2000-05-26 2004-02-25 Ortho Mcneil Pharm Inc Peptìdeos neuroprotetores
EP1294904A1 (en) 2000-06-30 2003-03-26 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Heterodimeric fusion proteins
JP2004507557A (ja) 2000-09-01 2004-03-11 グリフォン　セラピューティクス，インコーポレーテッド 求核物質に対して安定なチオエステル生成化合物、製造および使用の方法
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
US7208151B2 (en) 2001-09-12 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Tweak receptor agonists as anti-angiogenic agents
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
AU2002245204A1 (en) 2000-10-25 2002-07-24 Genzyme Corporation Methods for treating blood coagulation disorders
WO2002046208A2 (en) * 2000-11-01 2002-06-13 Elusys Therapeutics, Inc. Method of producing biospecific molecules by protein trans-splicing
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
IL157142A0 (en) 2001-01-29 2004-02-08 Idec Pharma Corp Modified antibodies and methods of use
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
MXPA03007323A (es) * 2001-02-19 2003-12-12 Merck Patent Gmbh Proteinas artificiales con inmunogenicidad reducida.
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
JP4369662B2 (ja) 2001-04-26 2009-11-25 アビディア インコーポレイテッド 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
AU2002310922A1 (en) 2001-05-04 2002-11-18 Institute Of Molecular And Cell Biology Interferons in the treatment of ischemia
US7419949B2 (en) 2001-07-16 2008-09-02 Novo Noridsk Healthcare A/G Single-dose administration of factor VIIa
US7144380B2 (en) * 2001-07-23 2006-12-05 Gilliam Larry A Traction method and device
DK1288433T3 (da) 2001-08-31 2006-05-01 Lille Zeger De Borerigindretning
EP1300419B1 (en) 2001-10-05 2007-06-13 Affimed Therapeutics AG Antibody of human origin for inhibiting thrombocyte aggregation
FR2831170B1 (fr) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
US20030078180A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Benchmark Research & Technology, Inc. Contaminant-tolerant foaming additive
US7737260B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
ES2425738T3 (es) 2001-12-21 2013-10-17 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de la albúmina
US20040102440A1 (en) 2002-07-01 2004-05-27 Wong Erik Ho Fong Method of promoting smoking cessation
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
EP1478394B1 (en) 2002-02-27 2008-07-30 Immunex Corporation Stabilized TNFR-Fc composition comprising arginine
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
WO2003077834A2 (en) 2002-03-15 2003-09-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
JP2006507228A (ja) 2002-07-01 2006-03-02 ザ ケネス エス．ウォーレン インスティテュート，インコーポレーテッド 応答性の細胞、組織および器官を保護、回復ならびに増強するための組換え型組織保護サイトカインおよびそれをコードする核酸
JP2006513139A (ja) 2002-07-03 2006-04-20 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療薬の全身性送達のための中央部気道投与
US20040110929A1 (en) 2002-07-12 2004-06-10 Bjorn Soren E. TF binding compound
EP1523504A2 (en) 2002-07-12 2005-04-20 Novo Nordisk A/S A tissue factor binding immunoconjugate comprising factor viia
EP2371389A3 (en) 2002-08-14 2012-04-18 MacroGenics, Inc. FcgammaRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
BRPI0314814C1 (pt) 2002-09-27 2021-07-27 Xencor Inc anticorpo compreendendo uma variante de fc
CA2502904C (en) 2002-10-15 2013-05-28 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
WO2004100882A2 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
US20050281829A1 (en) 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2004101740A2 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
DK1641483T3 (da) 2003-06-12 2008-06-02 Lilly Co Eli Fusionsproteiner
AU2003264100A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
CA2546580A1 (en) 2003-11-18 2005-06-09 Iconic Therapeutics, Inc. Homogeneous preparations of chimeric proteins
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
BRPI0506771A (pt) 2004-01-12 2007-05-22 Applied Molecular Evolution anticorpo, e, composição farmacêutica
AU2005227326B2 (en) 2004-03-24 2009-12-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DK1773872T3 (en) 2004-05-21 2017-05-08 Uab Res Found VARIABLE Lymphocyte Receptors, Associated Polypeptides and Nucleic Acids, and Uses thereof
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
BRPI0510674A (pt) 2004-07-15 2007-12-26 Xencor Inc variantes fc otimizadas
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
JP2008520207A (ja) 2004-11-16 2008-06-19 アヴィディア リサーチ インスティテュート タンパク質骨格およびその使用
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
US9296816B2 (en) 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7427787B2 (en) 2005-07-08 2008-09-23 Texas Instruments Incorporated Guardringed SCR ESD protection
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP1820508A1 (en) 2006-02-21 2007-08-22 CSL Behring GmbH Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
WO2007112005A2 (en) * 2006-03-24 2007-10-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Pc5 as a factor ix propeptide processing enzyme
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
EP3896090B1 (en) 2006-06-14 2022-01-12 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
EP1952822A1 (en) 2007-01-26 2008-08-06 Novo Nordisk A/S Factor VII polypeptides with increased affinity to platelets
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
EP2203180B1 (en) 2007-10-22 2012-11-21 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
TWI465247B (zh) 2008-04-11 2014-12-21 Catalyst Biosciences Inc 經修飾的因子ｖｉｉ多肽和其用途
KR101841870B1 (ko) 2008-05-16 2018-03-23 바이엘 헬스케어 엘엘씨 표적화 응고 인자 및 그의 사용 방법
CN102482340B (zh) 2009-04-06 2015-05-13 诺沃—诺迪斯克有限公司 因子viii蛋白向血小板的靶向递送
RU2563231C2 (ru) 2009-06-25 2015-09-20 Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Химерные молекулы фактора vii
WO2011023785A1 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novo Nordisk A/S Targeting tissue factor to activated platelets
HUE036233T2 (hu) 2009-12-06 2018-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc VIII-FC Faktor kimérás és hibrid polipeptidek, és ezek használati módszerei
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9611310B2 (en) * 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
AU2011274423B2 (en) 2010-07-09 2016-02-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
UA126265C2 (uk) 2010-07-09 2022-09-14 Байовератів Терапьютікс Інк. Поліпептид фактора іх і спосіб його застосування
CN103429256B (zh) 2011-03-02 2022-09-13 诺和诺德保健股份有限公司 凝血因子向活化的血小板上的tlt-1的靶向

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605689A (en) * 1991-05-31 1997-02-25 Genentech, Inc. Treatment of HIV-associated immune thrombocytopenic purpura
WO2000006605A2 (en) * 1998-07-28 2000-02-10 Micromet Ag Heterominibodies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LANDOLFI NF. "A chimeric IL-2/lg molecule possesses the functional activity of both proteins". J. Immunol, 1991, 146(3), referat *
LI YX et al.: "Expression of TPO mimetic peptide chimeric proteins with human IgGl Fc fragments and their biological characters". Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2002, 18(4), referat *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA038618B1 (ru) * 2009-12-06 2021-09-23 Биовератив Терапьютикс Инк. Химерные и гибридные полипептиды фактора viii-fc и способы их применения
EA037095B1 (ru) * 2010-07-09 2021-02-05 Биовератив Терапьютикс Инк. Способ лечения гемофилии в и эпизодов кровотечения
RU2650868C2 (ru) * 2012-07-13 2018-04-17 Займворкс Инк. Биспецифические асимметричные гетеродимеры, содержащие анти-cd3 конструкции
RU2711485C2 (ru) * 2014-04-11 2020-01-17 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Конъюгированные соединения, содержащие сконструированные с цистеином антитела
RU2647769C2 (ru) * 2015-12-30 2018-03-19 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Химерный улучшенный рекомбинантный фактор VIII

Also Published As

Publication number Publication date
ATE446307T1 (de) 2009-11-15
US20110182919A1 (en) 2011-07-28
EP1654378B1 (en) 2009-10-21
JP2018126153A (ja) 2018-08-16
US20200071385A1 (en) 2020-03-05
EP1625209B1 (en) 2013-07-17
JP2012067142A (ja) 2012-04-05
US7404956B2 (en) 2008-07-29
HUS1600011I1 (hu) 2016-04-28
US9636416B2 (en) 2017-05-02
CY2016007I1 (el) 2016-08-31
EP3978508A1 (en) 2022-04-06
IL205802A (en) 2013-12-31
EP2361932B1 (en) 2016-05-04
JP5091480B2 (ja) 2012-12-05
CN102234334B (zh) 2014-10-29
SI2361932T1 (sl) 2016-08-31
US20050027109A1 (en) 2005-02-03
AU2004252422A1 (en) 2005-01-06
CN1852736A (zh) 2006-10-25
EP1654378A4 (en) 2006-09-13
EA200501756A1 (ru) 2006-08-25
UA95436C2 (ru) 2011-08-10
FR16C0011I1 (ru) 2016-04-22
DK2174946T3 (en) 2016-10-24
IL171779A (en) 2010-11-30
US20230023927A1 (en) 2023-01-26
DK1625209T3 (da) 2013-10-28
SI1625209T1 (sl) 2013-12-31
NO342384B1 (no) 2018-05-14
US20220010000A1 (en) 2022-01-13
EP2174946A1 (en) 2010-04-14
NO339539B1 (no) 2016-12-27
EP2357196B1 (en) 2016-05-04
US20170226189A1 (en) 2017-08-10
EP1625209A4 (en) 2007-01-03
HK1159649A1 (zh) 2012-08-03
JP2014139244A (ja) 2014-07-31
EP2357196B9 (en) 2016-10-05
US20080249288A1 (en) 2008-10-09
JP6441432B2 (ja) 2018-12-19
EP2357196A2 (en) 2011-08-17
PL2361932T3 (pl) 2016-11-30
CY1117764T1 (el) 2017-05-17
EP1625209A2 (en) 2006-02-15
BE2016C015I2 (ru) 2023-08-09
TWI353991B (en) 2011-12-11
PL1625209T3 (pl) 2013-12-31
US7381408B2 (en) 2008-06-03
EP2361932A1 (en) 2011-08-31
LTPA2016028I1 (lt) 2016-11-10
WO2005001025A3 (en) 2006-06-01
LU92991I2 (fr) 2016-05-09
US9725496B1 (en) 2017-08-08
CA2522590C (en) 2016-08-09
CY2016007I2 (el) 2016-08-31
DE602004023724D1 (de) 2009-12-03
EP3103809A1 (en) 2016-12-14
US20110159540A1 (en) 2011-06-30
CN104448003B (zh) 2019-03-26
NO2017027I2 (no) 2017-06-23
US8329182B2 (en) 2012-12-11
PT2357196T (pt) 2016-07-15
BRPI0410345A8 (pt) 2017-10-10
NO2017028I1 (no) 2017-06-23
US20070172928A1 (en) 2007-07-26
NL300799I2 (ru) 2016-09-01
LTPA2016007I1 (lt) 2021-07-12
US20130171138A1 (en) 2013-07-04
NO20055773D0 (no) 2005-12-06
NO2017028I2 (no) 2017-06-23
PT2361932T (pt) 2016-08-02
PT1625209E (pt) 2013-10-24
JP2007500744A (ja) 2007-01-18
US20170266309A1 (en) 2017-09-21
PL2357196T3 (pl) 2016-11-30
CY1117756T1 (el) 2017-05-17
US11401322B2 (en) 2022-08-02
HUE030293T2 (en) 2017-04-28
EP2357196A3 (en) 2011-11-30
CN1852736B (zh) 2011-06-08
US7862820B2 (en) 2011-01-04
BR122019011535B1 (pt) 2021-08-31
AU2004252422B2 (en) 2011-10-27
SI2357196T1 (sl) 2016-08-31
ES2582947T3 (es) 2016-09-16
CN102234334A (zh) 2011-11-09
EP2174946B1 (en) 2016-07-06
CY1114639T1 (el) 2016-08-31
US11168125B2 (en) 2021-11-09
US7820162B2 (en) 2010-10-26
US20150139947A1 (en) 2015-05-21
NO20055773L (no) 2006-01-04
WO2005001025A2 (en) 2005-01-06
CA2522590A1 (en) 2005-01-06
TW200510457A (en) 2005-03-16
ES2431116T3 (es) 2013-11-25
EP2361932B2 (en) 2022-06-22
WO2004101739A3 (en) 2005-04-14
EP1654378A2 (en) 2006-05-10
NO20160483A1 (no) 2006-01-04
HUE031663T2 (en) 2017-07-28
FR16C0011I2 (fr) 2017-04-14
BRPI0410345A (pt) 2006-05-30
DK2357196T3 (en) 2016-08-15
ES2579938T3 (es) 2016-08-17
US20050032174A1 (en) 2005-02-10
JP2016034977A (ja) 2016-03-17
US8932830B2 (en) 2015-01-13
HK1161604A1 (zh) 2012-07-27
NO2020016I1 (no) 2020-06-12
EP3103809B1 (en) 2021-08-18
WO2004101739A2 (en) 2004-11-25
JP2018002737A (ja) 2018-01-11
DK2361932T3 (en) 2016-08-15
JP6526281B2 (ja) 2019-06-05
SI2174946T1 (sl) 2017-01-31
NO2017027I1 (no) 2017-06-23
CN104448003A (zh) 2015-03-25
LTC1625209I2 (lt) 2021-07-26
HUE030065T2 (en) 2017-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012566B1 (ru) Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка
US20210348150A1 (en) Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
US20050260194A1 (en) Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
NO20210848A1 (no) Immunoglobulin kimeriske monomere-dimere hybrider
AU2016244273A1 (en) Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
AU2012203896A1 (en) Clotting Factor-Fc Chimeric Proteins to Treat Hemophilia

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ KG TJ TM

TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent