CN104059155A - 靶向性凝固因子及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了靶向性凝固因子,其包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域连接的凝固因子。所公开的靶向性凝固因子提高凝固因子的效率,并延长其作用的持续时间,并且如此是用于治疗血液学疾病诸如血友病A的改善。
Description
此案是申请日为2009年5月15日、中国申请号为200980126328.5、发明名称为“靶向性凝固因子及其使用方法”的发明申请的分案申请。
本申请要求2008年5月16日提交的美国临时申请流水号61/053,932的权益,通过提及而将其内容完整收入本文。
发明领域
本申请涉及具有升高的功效的靶向性凝固因子。本发明进一步提供了治疗凝固因子缺乏病症患者的方法,其通过将凝固因子选择性靶向至其作用的生物学位置,诸如通过将凝血因子VIII(FVIII)靶向至红细胞和血小板来进行。还提供了药物组合物,其包含依照本发明的靶向性凝固因子。
发明背景
生物学药物的效率常常受到其在患者中的作用持续时间限制,尤其在疾病需要药物的持续调控时。因此,药动学特性的增强对于治疗剂在临床上的成功通常比药物效力的优化更重要。一种保护药物免于各种清除机制以延长半衰期的办法是添加靶向域,其促进药物结合至循环中的长寿命蛋白质诸如基质蛋白或细胞(诸如血细胞或内皮细胞)表面。例如,已经显示了治疗性肽或蛋白质定位于血细胞表面通过阻止正常的清除机制来延长其循环半衰期(Chen等,Blood105(10):3902-3909,2005)。可以使用极其多种分子作为靶向域。
在另一个例子中,在连接蜱(tick)抗凝蛋白的Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI)域与阴离子磷脂、磷脂酰-L-丝氨酸(PS)结合蛋白、膜联蛋白V(ANV)时,显示了融合蛋白(ANV-KPI)比非融合对应物更具活性,而且拥有更高的体内抗凝血活性(Chen等,2005)。由于ANV对PS和磷脂酰乙醇胺(PE)具有强亲和力,假设融合蛋白ANV-KPI能特异性靶向至血栓形成(thrombogenesis)位置处存在的富含PS/PE的阴离子膜结合的凝固酶复合物。类似地,Dong等报告了融合血纤蛋白选择性吸血蝠(Desmodus rotundus)唾液PAα1(dsPAα1)与尿激酶(uPA)/抗P-选择蛋白抗体(HuSZ51)以生成完全功能性的融合蛋白,在体外测定法中具有与非融合对应物相似的抗凝血活性。此外,显示了融合蛋白HuSZ51-dsPAα1结合凝血酶激活的人和犬血小板(Dong等,Thromb.Haemost.92:956-965,2004)。
已经在靶向抗凝血剂中进行了其它努力以阻止凝块和降低与血栓性疾病有关的死亡率(参见例如WO94/09034)。Stoll等(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27:1206-1212,2007)表明了新近的开发,其中经由抗LIBS单链抗体(scFv抗LIBS)将凝血因子Xa(FXa)抑制剂,即蜱抗凝血肽(TAP)靶向至GPIIb/IIIa(即一种在血小板表面上丰富表达的糖蛋白)上的配体诱导的结合位点。显示了融合蛋白scFv抗LIBS-TAP即使在非靶向性对应物失效(fail)的低浓度也拥有有效的抗凝活性。
上述靶向性抗凝血剂是设计用于靶向特定细胞的融合蛋白。依照Stoll等,靶向性抗凝血剂应当是具有在与抗体融合时得到保留的高度有力的凝固抑制活性的小分子。不讨论抗凝血剂自其靶定位置中的融合蛋白的释放。
本发明聚焦于用于治疗血液学疾病诸如血友病的靶向性治疗性蛋白质。例如,用FVIII浓缩物或重组FVIII对血友病A患者的当前治疗受到这些因子的高成本和其相对较短的作用持续时间的限制。目前,通过在需要时静脉内施用FVIII或者作为一周数次施用的预防性疗法来治疗血友病A患者。对于预防性处理,一周三次施用FVIII。不幸地,此频率对于许多患者而言是成本昂贵的(cost prohibitive)。由于其在人中的短半衰期,必须频繁施用FVIII。尽管其在全长蛋白质上大于300kD的较大大小,FVIII具有仅约11-18(平均14)小时的人中半衰期(Gruppo等,Haemophila9:251-260,2003)。对于那些能负担得起所推荐的频繁剂量给药的人,然而频繁地静脉内注射蛋白质是非常不方便的。对于患者而言会更方便的是,若可以开发出具有较长的半衰期,因此需要频率较少的施用的FVIII产品。此外,若半衰期得到延长,则可以降低治疗成本,这是因为那样可需要较少的剂量。因此,想要具有更有效形式的FVIII,其能降低有效剂量或者具有延长的作用持续时间以显著改善血友病患者的治疗选项。
还有,靶向性FVIII的持续血浆浓度可以通过降低FVIII的谷至峰水平,如此消除需要在早期时间点时引入超生理学水平的蛋白质,从而降低不利副作用的程度。因此,想要具有如下的FVIII形式,其具有持续不变的持续时间和比目前销售的形式更长的半衰期。
目前疗法的别的缺点是约25-30%的患者形成抑制FVIII活性的抗体(Saenko等,Haemophilia8:1-11,2002)。抗体形成阻止FVIII作为代替疗法使用,迫使这组患者寻找甚至更昂贵的用高剂量重组凝血因子VIIa(FVIIa)的治疗和免疫耐受性疗法。因此,较小免疫原性的FVIII代替产品是想要的。
一种为血友病患者改善治疗的办法牵涉基因疗法。通过在血小板中指导FVIII表达来将FVIII异位靶向至血小板在治疗血友病A中可以具有治疗效果(Shi等,J.Clin.Invest.116(7):1974-1982,2006)。
本发明的目标是提供靶向性凝固因子,其与非靶向性蛋白质相比具有延长的作用持续时间、更大的功效、更少的副作用、和更小的免疫原性。
本发明的另一个目标是降低与治疗性蛋白质施用有关的副作用,其通过让蛋白质靶向至期望作用的特定位置,并且由此降低蛋白质暴露于可导致不想要副作用的其它潜在生物学活性位点来实现。
本发明的进一步的目标是获得别的优点,其通过设计靶向性治疗性凝固因子来实现,其中治疗性蛋白质在紧邻其体内作用位置处自靶向域释放。可以达到高局部浓度的非融合、激活的蛋白质。如此,增强蛋白质的治疗功效。
本发明还涉及
1.一种靶向性凝固因子,其包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域连接的凝固因子。
2.项1的靶向性凝固因子,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
3.项1的靶向性凝固因子,其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
4.项1的靶向性凝固因子,其中所述血细胞是血小板,而所述膜蛋白质是GPIIb/IIIa。
5.项4的靶向性凝固因子,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
6.项4的靶向性凝固因子,其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
7.项1的靶向性凝固因子,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽,而所述域是与所述FVIII的B域连接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
8.项7的靶向性凝固因子,其中所述血细胞是血小板,而所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
9.一种药物组合物,其包含治疗有效量的项1的靶向性凝固因子和药学可接受赋形剂或载体。
10.一种用于治疗血液学疾病的方法,包括对有所需要的患者施用有效量的项1的靶向性凝固因子。
11.一种用于将凝固因子靶向至血细胞表面的方法,包括连接所述凝固因子与至少一种结合血细胞上的膜蛋白质的域。
12.项11的方法,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX。
13.项11的方法,其中所述血细胞是血小板或红细胞。
14.项11的方法,其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
15.项11的方法,其中所述血细胞是血小板,而所述膜蛋白质是GPIIb/IIIa。
16.项15的方法,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽。
17.项15的方法,其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
18.项11的方法,其中所述凝固因子是FVIII,而所述域是与所述FVIII的B域连接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
19.项18的方法,其中所述血细胞是血小板,而所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
20.项11的方法,其中进一步从所述血细胞的表面释放所述凝固因子。
发明概述
依照本发明的靶向性凝固因子包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域连接的凝固因子。还提供了包含新公开的靶向性凝固因子的药物组合物和使用靶向性凝固因子来治疗血液学疾病的方法。本发明进一步提供了一种通过使用新公开的靶向性凝固因子来将凝固因子靶向至血细胞表面以提高用凝固因子治疗血液学疾病的效率的方法。
附图简述
图1:全长FVIII(“全长FVIII)和B域缺失型FVIII(“FVIII-BDD-TD”)(其中将靶向域(“TD”)插入B域中,并除去大部分的B域)的示意图。
图2:经由B域半胱氨酸连接FVIII的经修饰的环肽Integrilin,即“BHRF-1”(A)和“BHRF-3”(B)的结构。
图3:BHRF-1和BFRH-3对固定化GPIIa/IIIb的结合亲和力。
图4:对固定化GPIIa/IIIb的BHRF-1-FVIII结合测定法。
图5:与FVIII比较的BHRF-1-FVIII的体外凝固活性。
图6:BHRF-1-FVIII对人血小板的体外结合。
图7:BHRF-1-FVIII对小鼠血小板的体外结合。
发明详述
本发明涉及将凝固因子靶向至其作用的一个或多个位置,诸如血细胞。在一个实施方案中,提供了靶向性凝固因子,其经由连接所述因子与至少一个结合血细胞上的膜蛋白质的域来特异性靶向至血细胞。用于将凝固因子靶向至血细胞的域可以不限于对血细胞表面上的膜蛋白质具有高亲和力的抗体片段、抗体、肽、受体配体、碳水化合物、或小分子。例如,血细胞是红细胞或血小板。
如本文中所使用的,“凝固因子”指牵涉凝固级联并主要具有促凝血活性的蛋白质。凝固因子是本领域中公知的,并且包括但不限于凝固因子I、II、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、和XIII,及蛋白S。凝固因子可以从血浆浓缩或者可以重组生成。若重组生成,凝固因子可以具有与天然结构不同的氨基酸结构,只要维持足够的促凝血活性,使得变体是治疗有用的。在一个实施方案中,凝固因子是功能性FVIII多肽诸如但不限于来自血浆的FVIII浓缩物或重组生成的FVIII,或凝血因子IX(FIX)。
如本文中所使用的,“功能性FVIII多肽”意为能够在体内或在体外改正例如以血友病A表征的人FVIII缺乏的功能性多肽或多肽组合。FVIII在自然状态中具有多种降解或加工形式。这些是以蛋白水解方式自前体,即单链蛋白质衍生的。功能性FVIII多肽包括此类单链蛋白质,而且还提供了这些各种降解产物,它们具有改正人FVIII缺乏的生物学活性。可能存在等位变异。功能性FVIII多肽包括产生FVIII衍生物的所有此类等位变异、糖基化型式、修饰和片段,只要它们含有人FVIII的功能区段和本质的、特征性的人FVIII功能活性。可以容易地通过本文中所描述的直接体外测试来鉴定那些拥有必要功能活性的FVIII衍生物。此外,功能性FVIII多肽能够在存在凝血因子IXa(FIXa)、钙、和磷脂的情况中催化凝血因子X(FX)转化为FXa,以及改正自血友病A受累个体衍生的血浆中的凝固缺陷。从人FVIII氨基酸序列的公开序列和关于其功能区的公开信息看,可以经由对DNA的限制酶切割或对人FVIII蛋白的蛋白水解或其它降解衍生的片段对于本领域技术人员会是显而易见的。功能性FVIII多肽内明确包括但不限于全长人FVIII(例如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和B域缺失型凝血因子VIII(例如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4),而且具有如WO2006/053299中所披露的氨基酸序列。
FVIII的“促凝血活性”指FVIII在凝固级联中的活性。FVIII自身不引起凝固,但是在凝固级联中发挥至关重要的作用。FVIII在凝固中的作用是要被激活为FVIIIa,其是一种用于固有FX激活的催化性辅因子(Thompson,Semin.Thromb.Hemost.29:11-22,2003)。FVIII是由凝血酶或FXa以蛋白水解方式激活的,所述凝血酶或FXa将其与冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor,vWf)解离,并激活其在级联中的促凝血功能。在其活性形式中,FVIIIa在血液凝固的固有途径中发挥FX激活酶复合物的辅因子的功能,并且其在血友病A患者中是降低的或非功能性的。
“FIX”指凝固因子IX,其又称为人凝固因子IX,或血浆促凝血酶原激酶成分。
如本文中所使用的,术语“靶向性凝固因子”指与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域偶联的凝固因子。靶向性凝固因子应当有力地结合血细胞,例如以小于10nM的半最大结合。结合对于靶定的血细胞应当是特异性的,例如经由结合靶定细胞上选择性表达的膜蛋白质来实现。如本文中所使用的,“域”或“靶向域”指对靶细胞上的膜蛋白质具有高亲和力的模块。适合于本发明的域包括但不限于对血细胞表面上的膜蛋白质具有高亲和力的抗体、抗体片段诸如单链抗体(svFv)或FAB片段、抗体模拟物、和肽或小分子。在一方面,使用单链抗体片段或肽,因为其编码序列可以与FVIII编码序列连接,而且可以使用重组技术来生成融合蛋白。
可以以化学法或通过重组表达融合蛋白来将凝固因子与所述域偶联。可以通过将凝固因子上存在的化学模块与靶向域连接在一起来实现化学连接,包括使用诸如氨基、羧基、巯基、羟基基团、和碳水化合物基团等模块的化学连接。可以使用多种同和异双功能接头,它们具有活化的,或者可以活化以连接附着这些模块的基团。接头分子上的一些有用的反应基团包括马来酰亚胺、N-羟基-琥珀酰胺酯和酰肼。可以使用许多不同化学组成和长度的不同间隔物来分开这些反应基团,包括例如聚乙二醇(PEG)、脂肪族基团、亚烃基基团、环亚烷基基团、融合的或连接的芳基基团、长度为1至20个氨基酸或氨基酸类似物的肽和/或肽基模拟物。例如,可以以如下方式连接所述域与凝固因子,使得在体内功能形式的凝固因子会自其靶向域释放或者在凝固因子在身体中的生物学活性位置处或附近发生释放。
因而,在本发明的一个实施方案中,提供了靶向性凝固因子,其中可以切割或降解将凝固因子附着至用于将凝固因子靶向至血细胞的域的连接,由此自偶联物释放凝固因子。
可以通过将靶向域连接至凝固因子上在其激活过程期间除去的位点,或者通过使用以受控方式被血液中的酶降解的接头来实现凝固因子自其偶联物形式(即自靶向性凝固因子)的释放。例如,可以使用对一般的血液蛋白酶或水解酶易感的糖聚合物或肽。多种此类技术是本领域中已知的,而且已经用于制备前药。可以将接头进一步工程化改造成在最需要凝固因子的位置诸如经由外伤触发的炎症或血液凝固的位置处特异性切割。例如,接头可以对仅在想要的作用位置处所生成的特定蛋白酶,诸如通过炎症过程释放或者通过血液凝固级联生成的蛋白酶易感。治疗性蛋白质的此选择性释放可以降低副作用的潜力,并且提高蛋白质在其作用位置的效率。
依照本发明,可以靶向血细胞上的多种膜蛋白质。为了特异性且有效地将凝固因子靶向至血细胞,然而,优选的是,靶定的膜蛋白质丰富地存在于血细胞表面上。例如,发现糖蛋白GPIIb/IIIa是血小板表面上最丰富表达的分子之一。
因而,在一个实施方案中,经由特异性结合血小板膜蛋白质诸如糖蛋白GPIIb/IIIa的域将凝固因子靶向至血小板。此类将凝固因子靶向至GPIIb/IIIa的域的例子包括但不限于含有RGD的肽和模拟物(线性肽、蛇毒肽、和环肽)诸如含有RGD模拟序列(即高精氨酸、甘氨酸天冬氨酸)的Integrilin9、非肽RGD模拟物、和抗GPIIb/IIIa抗体。若使用抗体作为靶向域,则可以使用抗体的单链片段,诸如svFv或FAB片段。
靶向FVIII和FIX
将FVIII和FIX靶向至血细胞诸如血小板或红细胞的表面可以用来减缓这些凝固因子的清除。将FVIII靶向至血小板细胞的表面是特别感兴趣的。FVIII是FIX介导的FX激活中的一种重要的辅因子,所述FIX介导的FX激活主要在凝块位置处积累的激活的血小板细胞表面上发生。血小板激活触发这些凝固因子结合其表面以形成促进FXa生成的复合物。血小板具有约9天的平均循环寿命。比较而言,血浆中的FVIII(大部分结合冯维勒布兰德氏因子)展现出约14小时的半衰期。如此,FVIII对血小板的结合具有极大地延长分子的循环时间的潜力。经由依照本发明的靶向域将FVIII靶向至血小板细胞表面提高FVIII作用的效率,而且预期延长FVIII的半衰期。
在GPIIb/IIIa外,血小板上的其它蛋白质也可以充当靶向性FVIII的受体,诸如GP1a和膜联蛋白V。糖蛋白GPIIb/IIIa是优选的,因为它是血小板表面上最丰富表达的分子之一。血液中的GPIIb/IIIa浓度估计为约75nM,这基于其在血小板上的表面密度得到。这表示超过治疗性应用FVIII后达到的FVIII最大浓度(Cmax约0.7nM)100倍。因此,将FVIII靶向至血小板会占据血小板上可用GPIIb/IIIa位点的大约1%或更小。预期此低水平的占据不会改变血小板功能,这要求封闭很大分数(即大于50-60%)的GPIIb/IIIa分子。高浓度的GPIIb/IIIa还会驱动靶向性FVIII对血小板表面的平衡结合。
不以任何方式限制本发明,认为将FVIII靶向至GPIIb/IIIa还可以具有如下的益处,即一些凝固因子可以通过经由血小板的开放管内系统(openintracanicular system)胞吞和再循环GPIIb/IIIa而内在化。这种FVIII可以在alpha颗粒中停止(end up),并在血小板激活后再释放,在其为凝固所需要时提供FVIII源。可以保护靶向至血小板的结合的或内在化的FVIII免于存在于许多患者中的抑制剂(例如FVIII抗体)。如此,靶向性FVIII可以为重要的这组患者提供治疗选项。
对于促进凝固的靶向性FVIII,该分子必须能够被加工为功能形式(FVIIIa),并自其GPIIb/IIIa结合位点释放。在一个实施方案中,这通过连接GPIIb/IIIa靶向域与FVIII的B域来实现。在促凝血环境中通过凝血酶或FXa介导的蛋白酶解来除去B域,生成成熟的FVIIIa分子。如此,激活后,FVIIIa会自GPIIb/IIIa释放,而且可用于形成FX激活复合物。
可以通过使用本文中所描述的交联方法来共价结合靶向域与FVIII上的反应基团(包括氨基、巯基、羧基基团和羰基基团),从而实现FVIII与靶向域之间的连接。还可以将靶向域与主要存在于FVIII分子的B域上的碳水化合物偶联。例如,用高碘酸盐轻度氧化FVIII在碳水化合物链上生成醛,其然后能与胺或酰肼起反应,接着任选地进行还原以形成更稳定的连接。
可以经由用三(2-羧乙基)膦(TCEP)的轻度还原在重组FVIII的B域上选择性生成游离的半胱氨酸,这容许B域与靶向域的特异性连接,所述靶向域与游离的半胱氨酸起反应,诸如含有硫醇、三氟甲烷磺酸基(triflate)、三氟乙基磺酸基(tresylate)、氮丙啶(aziridine)、环氧乙烷、S-吡啶基、或马来酰亚胺模块的域。此外,可以修饰FVIII以用半胱氨酸替换氨基酸残基,从而为附着至靶向域提供特定位置。若使用B域缺失型FVIII,则可以使用多种B域缺失型FVIII半胱氨酸突变蛋白(诸如那些披露于WO2006/053299的)来经由表面半胱氨酸残基处的化学结合连接FVIII与靶向域。可以进行修饰以用半胱氨酸替换氨基酸残基的氨基酸残基的例子包括但不限于81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1911、2091、2118、和2284(氨基酸残基以其在全长FVIII序列中的位置指明)。
也可以使用重组技术将凝固因子与靶向域偶联。可以用包含FVIII和靶向域的融合蛋白的载体转染宿主细胞。在一个实施方案中,可以将靶向域插入FVIII的B域中,并删除大部分B域,其中仅在羧基和氨基端处留下B域的部分以容许对B域的生物学加工,从而将其自全长分子删除。如图1中所显示的,规定B域的剩余部分,其容许在生理学条件下生物学加工并除去B域。
宿主细胞系可以是本领域技术人员已知为可用于生成凝固因子的任何细胞,对于FVIII诸如但不限于CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、和HKB11细胞(人胚肾细胞系HEK293和人Burkitt B细胞淋巴瘤系2B8的杂合物)。
许多域可以以化学法连接至FVIII,或者与FVIII一起重组表达,从而将FVIII靶向至血小板表面上的GPIIb/IIIa。此类域的例子包括但不限于针对GPIIb/IIIa的抗体、靶向GPIIb/IIIa的RGD肽、肽模拟物、或小分子模拟物。抗体诸如靶向GPIIb/IIIa的单链抗体(svFv)或FAB片段特别可用作靶向域。
已经显示了可以在不丧失FVIII功能的情况中除去FVIII的B域。另外,还已经显示了各种B域截短形式的FVIII和B域与其它蛋白质域的融合物可以产生功能活性FVIII。在一方面,本发明牵涉可以进行工程化改造以插入、替换、或部分替换FVIII的B域而不阻断分子产生活性FVIII的正常加工的靶向域。例如,使用重组DNA技术,可以生成FVIII分子,其中将单链抗体片段融合至FVIII B域的C端。或者,也可以使用svFv片段来替换整个或部分的FVIII B域。这可以经由在B域编码序列后以符合读码框方式插入编码svFv片段的DNA序列,或者替换一些或整个B域编码序列来实现。此策略会保存FVIII的正常蛋白水解激活所要求的凝血酶切割位点。多种有效定位至血小板的针对GPIIb/IIIa的抗体是已知的(参见例如Schwarz等,Circ.Res.99(1):25-33,2006;Jacobin等,Clin.Immunol.108(3):199-210,2003;Christopoulos等,BloodCoagul.Fibrinolysis4(5):729-37,1993;及Chung等,FASEB J.18(2):361-363,2004)。
同样地,含有RGD或RGD模拟物的肽也是对于靶向FVIII有用的配体,因为许多此类肽已经描述为具有对GPIIb/IIIa的高结合亲和力。这些包括线性肽、蛇毒肽、和环肽。也可以使用非肽RGD模拟物。与抗体片段类似,可以以化学法将RGD肽与FVIII偶联。或者,可以使用重组DNA技术将RGD序列插入B域编码序列中或者用于完全或部分替换FVIII的B域编码序列并表达。
可以使用类似的方法来制备靶向性FIX。例如,可以将靶向域连接至FIX分子的激活域(氨基酸残基191-226或145-180,这取决于偏爱,即+/-信号序列),其在将FIX激活为FIXa中以蛋白水解方式除去。域可以使用与氨基酸侧链基团诸如激活域中的巯基、胺、和羧基基团反应性的交联剂来化学连接,或者经由碳水化合物链来连接,如上文针对FVIII所讨论的。也可以使用重组技术(其中将靶向域的氨基酸序列插入FIX激活肽中),或者替换激活肽序列的一部分来生成融合分子。插入的靶向域序列可以编码单链抗体,或者其它血小板结合肽序列,诸如RGD结合肽。
药物组合物和用途
本发明还涉及包含治疗有效量的本发明的靶向性凝固因子和药学可接受赋形剂或载体的药物组合物。“药学可接受赋形剂或载体”是可以添加至活性成分以帮助配制或稳定制剂,而且不对患者引起显著不利毒物学效果的物质。此类赋形剂或载体的例子是本领域技术人员公知的,包括水、糖诸如麦芽糖或蔗糖、清蛋白、盐等。其它赋形剂或载体记载于例如Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第20版,2000)。此类组合物会含有有效量的靶向性凝固因子以及合适量的赋形剂或载体以制备适合于对有所需要的患者有效施用的药学可接受组合物。
例如,可以以可随出血事件的严重性而变化的剂量对罹患血友病A的受试者胃肠内施用偶联物。静脉内施用的平均剂量范围为对于手术前适应症为每千克40个单位、对于微小出血为每千克15至20个单位、和对于维持剂量为8小时期间里施用的每千克20至40个单位。
在一个实施方案中,本发明涉及一种用于治疗血液学疾病的方法,包括对有所需要的患者施用治疗有效量的上述靶向性凝固因子。
如本文中所使用的,“治疗有效量”指在血流或靶组织中提供想要水平的靶向性因子(或自靶向性形式释放的相应的非偶联因子)所需要的靶向性凝固因子量。精确量会取决于许多因素,包括但不限于治疗性组合物的成分和物理特征、预期的患者群体、个体患者考虑因素等,而且本领域技术人员可以容易地确定。
如本文中所使用的,“患者”指接受医学护理和/或治疗的人或动物个体。
本文中所描述的多肽、材料、组合物、和方法意图是本发明的代表性例子,并且要理解的是,本发明的范围不受例子范围的限制。本领域技术人员会认可,本发明可以用所公开多肽、材料、组合物和方法的变型实施,并且认为此类变型在本发明的范围内。
呈现以下实施例来例示本文中所描述的发明,但是不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
为了本发明可以得到更好的理解,列出了以下实施例。这些实施例仅出于例示目的,并且不要以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中所提及的所有出版物。
实施例1:对GPIIb/IIIa结合具有高亲和力的经修饰的RGD肽
已经描述了环肽有力地且选择性地结合GPIIb/IIIa。使用一种此类肽,即Integrilin作为靶向域以与FVIII连接,因为已经显示了Integrilin能选择性结合GPIIb/IIIa。通过在马来酰亚胺模块中添加能选择性与蛋白质中游离的半胱氨酸残基偶联的短PEG接头末端来修饰Integrilin。经修饰的Integrilin称作仅具有接头的BHRF-1(图2A),和具有接头和荧光素(FITC)的BHRF-3(图2B)。如图3中所显示的,经修饰的Integrilin保留对GPIIb/IIIa的亲和力,因为它们有力地阻断血纤蛋白原(Fbn)结合固定化的GPIIa/IIIb。
使用固相结合测定法来测量肽对GPIIb-IIIa的结合,其中测量测试化合物竞争血纤蛋白原结合。如下实施测定法。以0.mL/孔x2μg/mL(缓冲液A(20mM Tris pH7.5、0.15M NaCl、和1mM各种MgCl2、CaCl2、和MnCl2)中稀释的)将纯化的GPIIb-IIIa(Innovative Research,Novi,MI)包被至96孔Immulon-B板上。于4℃温育过夜后,用缓冲液B(50mM Tris pH7.5、0.1MNaCl、和各1mM MgCl2、CaCl2、和MnCl2)中的3.5%BSA将平板于30℃封闭1小时。用缓冲液B清洗3次后,将稀释的肽或蛋白质溶液与0.1%BSA/缓冲液B中的3.5nM生物素化的血纤蛋白原组合,并添加至孔,于30℃温育2小时。清洗(3次,缓冲液B)后,于30℃添加1:4000链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)达1小时。最终的清洗步骤(3次,缓冲液B)后,用Ultra TMB(3,3’,5,5’-四苯基联苯胺)(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)将平板显影5分钟,用等体积的2M硫酸停止。于450nm读取平板吸光度,并使用4参数Logistic拟合来测定IC50值。
然后,经由位于FVIII的B域中的半胱氨酸(Cys)残基来将经修饰的Integrilin肽(BHRF1)与FVIII偶联。
实施例2:偶联GPIIb/IIIa结合肽与FVIII
全长FVIII的多肽序列是本领域中已知的(参见例如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、和如WO2006/053299中所披露的)。
FVIII的浓缩和游离巯基基团的脱帽
可以在蛋白质表达过程中通过培养基中存在的半胱氨酸来为位于重组FVIII的B域中的Cys残基加帽,但是它容易如下通过还原剂诸如TCEP的处理来除去。将FVIII(20mL)融化,并在于2000x g(约3153rpm)在低温(cold)中旋转25分钟的两个-15筒(Millipore,Billerica,MA)中浓缩。2.8mL保留物的浓度是约0.8-0.9mg/mL,其通过使用Nano分光光度计(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)的A280得到。然后使用10mL Zeba脱盐筒来交换缓冲液,所述10mL Zeba脱盐筒用50mM Tris、150mM NaCl、2.5mM CaCl2和100ppm -80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)预平衡。获得具有0.88mg/mL浓度的2.8mL蛋白质溶液。然后将TCEP添加至终浓度0.68mM,并于4℃将混合物温和地颠转约3小时。通过两次连续的Zeba筒旋转来除去TCEP,并容许FVIII再次氧化至少30分钟,之后添加肽。除去TCEP后,FVIII浓度测量为0.768mg/mL(“KG-R”)。
RGD靶向肽的偶联
为了将经修饰的Integrilin肽BHRF-1偶联至FVIII,将0.294mg肽(M.W.1225)添加至48μL干的二甲亚砜(DMSO)以制备5mM储备溶液。然后将此储备溶液(34.4μL)添加至2.8mL KG-R。80分钟后,通过添加等摩尔量的半胱氨酸来淬灭反应。然后针对起始Tris缓冲液(2升)广泛透析反应混合物。BHRF-1-FVIII的终浓度是0.74mg/mL,而产量是2mg。也使用类似的方法来制备BHRF-3-FVIII。
如图3中所显示的,经修饰的Integrilin肽,即BHRF-1和BHRF-3保留对GPIIb/IIIa的亲和力,因为它们有力地阻断血纤蛋白原(Fbn)结合固定化的GPIIa/IIIb。与BHRF-1偶联的FVIII(FVIII-BHRF-1)显示在抑制血纤蛋白原结合固定化的GPIIb/IIIa上的高效力(IC50=0.043+/-0.05nM(N=3))。这甚至比亲本BHRF-1肽更有力。表1中显示了结果。
表1
RGD靶向肽与B域缺失型FVIII的偶联
若使用B域缺失型FVIII(“BDD”)进行偶联,则可以使用如WO2006/053299中所披露的多种B域缺失型FVIII Cys突变蛋白来将BDD与靶向域诸如如本文中所公开的经修饰的RGD肽偶联。
实施例3:BHRF-1-FVIII结合固定化的GPIIb/IIIa
为了测试BHRF-1-FVIII对GPIIb/IIIa的结合活性,将生物素化的GPIIb/IIIa在链霉抗生物素蛋白平板上固定化,并用BHRF-1-FVIII或未修饰的FVIII(这两者都在结合缓冲液(50mM Tris,pH7.5、100mM NaCl2、1mMCaCl2、1mM MgCl2、1mM MnCl2和1mg/mL BSA)中)处理。通过用结合缓冲液清洗三次来除去未结合的蛋白质。将测定缓冲液(25μL)添加至平板,并使用生色测定试剂盒(SP4,Chromogenix,Lexington,MA)来测定FVIII活性。如图4中所显示的,有BHRF-1-FVIII的结合,而检测到仅很少的未修饰FVIII的结合。通过添加竞争BHRF-1对GPIIb/IIIa的结合的环状RGD肽(GpenGRGDSPCA;SEQ ID NO:5)来完全消除BHRF-1-FVIII的结合升高。此外,在没有GPIIb/IIIa在平板上固定化时,仅低背景水平的任一蛋白质结合。这些数据显示了可以经由肽靶向域将BHRF-1-FVIII靶向至GPIII/IIIIa。
由于没有从BHRF1-FVIII的制备物除去未偶联的FVIII,进行实验来测定存在的未偶联FVIII的量。使用含有过量水平的固定化GPIIb/IIIa的珠来消减BHRF1-FVIII活性。可以消减大约80%的BHFR1-FVIII活性,指明制备物中约20%的FVIII活性来自未偶联的FVIII。
实施例4:用BHRF-1-FVIII和FVIII进行的体外全血凝固活性测定法
为了评估BHRF-1-FVIII的血小板结合对止血活性的影响,使用旋转血小板弹性测定法(Rotational Thromboelastometry)(Pentapharm GmbH)系统来比较其活性与未偶联FVIII的活性,如Landskroner等(Haemophilia11:346-352,2005)中所描述的。与凝固活性的测量诸如生色测定法或激活部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time,aPTT)测定法不同,测定法依赖于血小板的功能,因此可以显示BHRF-1-FVIII结合血小板的效果。为了实施该测定法,于室温将柠檬酸化(citrate)血友病A小鼠全血与等剂量的BHRF-1-FVIII(1mIU)或未偶联的FVIII(基于生色测定法)混合。通过用自动化移液管将300μL经处理的血液分配入具有20μL CaCl2(200mmol)而没有内源激活物(NATEM)的杯中来再钙化样品。最后的移液后立即开始测量,并于37℃连续监测血液凝块形成达2小时(7200秒)。
用于止血的分析参数包括凝固时间(CT)、启动测量后获得2mm凝块硬度(firmness)所需要的时间、凝块形成时间(CFT)、从2mm凝块硬度直至20mm凝块强度的时间、和α-角,即凝块形成的速度。
如图5中所显示的,BHRF-1-FVIII比等剂量(基于生色测定法)的未偶联FVIII需要更少的时间来在测定法中形成凝块,指明更高的凝固效率。基于FVIII标准曲线,CT的差异是约400秒,其对应于多约2-3倍的FVIII活性。
可以使用血友病A小鼠模型来在体内评估靶向性凝固因子的止血活性和药动学参数。可以通过尾静脉静脉内注射来施用靶向性凝固因子。在处理后的多个时间点时,会以%柠檬酸钠收集血液,并会在输注期后48小时里(其等价于小鼠中大于6的FVIII半衰期(t1/2))使用ROTEM来测量止血活性。
实施例5:针对人和小鼠血小板的体外结合测定法
FVIII-BHRF-1对人血小板的结合
以5x109个血小板/管在14mL血浆中自Allcells(Emeryville,CA)获得人血小板。将血小板和所有清洗液、缓冲液、试剂、和离心机加热至室温,并在实验过程期间于室温维持。用于血小板的清洗缓冲液(WB)是补充有20mMHEPES、0.5%BSA、和50ng/mL PGE1和2.5U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶的蒂罗德氏(Tyrode’s)缓冲液,pH7.4。
以700x g于25℃将细胞离心15分钟,然后小心地除去上清液,并添加14mL WB。将细胞在WB中温和地重悬,并离心,如所描述的。
第二次离心后,除去上清液,并将血小板在15mL WB中重悬。在此点时,将细胞分成各5mL的三份相等的等分试样。如先前所描述的,离心三份等分试样,然后将三份血小板沉淀物在下列任一中重悬:
A.5mL结合缓冲液+5mg/mL BSA(BBB,50mM Tris、100mM NaCl、各1mM CaCl2、MgCl2、和MnCl2)
B.5mL HemA血浆,其缺乏FVIII,但是存在vWF
C.5mL免疫消减的血浆,其缺乏FVIII和vWF两者。
对于缓冲液(A)或血浆(B或C),使用下列条件:
1.缓冲液/单独的血浆+2.5nM BHRF-1-FVIII(含有约20%的未偶联FVIII(参见实施例3))
2.缓冲液/血浆+血小板+2.5nM BHRF-1-FVIII(含有约20%的未偶联FVIII)
3.缓冲液/单独的血浆+2.5nM重组FVIII
4.缓冲液/血浆+血小板+2.5nM重组FVIII
对于各条件1-4,于室温将100μL A、B、或C移入微量离心管中,然后将BHRF-1-FVIII或未偶联的FVIII添加至管。于37℃将管温育1.5小时(在不摇动的情况中)。温育期后,以最大速度(16,000rpm)将管离心5分钟以使血小板沉淀。收集上清液以测定FVIII活性。上清液中的活性量反映未结合的FVIII或BHRF-1-FVIII的量。数据表明所有条件中BHRF1-FVIII对人血小板的结合(图6中显示的)。因为对于条件A和条件C,BHRF-1-FVIII含有大约20%的未偶联FVIII,数据指明结合高百分比的偶联物。对条件A和条件B没有观察到FVIII的结合,而在条件C中结合35%的FVIII活性。该图还显示了对此条件观察到对于对35%FVIII非特异性结合校正的条件C剩余的FVIII活性水平(即将起始FVIII活性降低35%以计算百分比结合)。
FVIII-BHRF-1对小鼠血小板的结合
BHRF-1-FVIII也结合小鼠血小板,如图7中所显示的。如对人血小板所描述的那样实施相似的结合测定法,只是以200x g将柠檬酸化的小鼠血液离心15分钟以收获富含血小板的血浆(PRP)。用柠檬酸盐清洗缓冲液(11mM葡萄糖、128mM NaCl、4.3mM NaH2PO4、7.5mM Na2HPO4、4.8mM柠檬酸钠、2.4mM柠檬酸、0.35%BSA,pH6.5)+50ng/mL PGE1稀释PRP,并在柠檬酸盐清洗缓冲液+50ng/mL PGE1中清洗两次(通过以1200x g离心10分钟来进行)。最后,将血小板在结合缓冲液(50mM Tris、100mM NaCl、各1mM CaCl2、MgCl2、和MnCl2)+5mg/mL BSA中重悬。将未偶联的FVIII和BHRF-1-FVIII添加至血小板,并于37℃2小时后,通过离心来除去血小板,并测定上清液中未结合的FVIII活性。
如图7中所显示的,未偶联FVIII的59%活性结合血小板。为了计算所添加的BHRF-1-FVIII活性经由BHRF-1肽结合血小板的百分比,将起始FVIII活性的量校正59%以反映FVIII非特异性结合(不经由该肽发生)的水平。对BHRF-1-FVIII校正的数值是31%未结合的(69%结合的)。在添加100uMIntegrilin以竞争肽结合时,未结合的活性上升至82%未结合的(18%结合的)(也对非特异性FVIII活性校正)。这些数据表明BHRF-1-FVIII能经由BHRF-1靶向域结合小鼠血小板。
实施例6:药动学研究
使用全血凝固测定法诸如上文所描述的(其反映血浆和结合细胞(例如血小板)两者中的FVIII活性)来测定注射入血友病A小鼠中后在多个时间时的血液中的FVIII水平。
实施例7:用于评估FVIII活性的生色测定法
使用SP测定试剂盒(Chromogenix,Lexington,MA)来评估纯化的蛋白质和偶联物的FVIII活性。遵循制造商的指令在96孔板形式中实施测定法。简言之,按次序组合含有FVIII或偶联物的稀释样品与激活性FIX/FX/磷脂的混合物,接着为25mM CaCl2和显色底物S-2765/I-2581。每次试剂添加之间,于37℃将样品温育5分钟。最后添加显色底物后,5分钟后用20%乙酸停止反应,并在405nm读取平板吸光度,相对于490nm背景标准化。针对具有运行范围0.3-40mIU/mL的WHO/NIBSC血浆衍生的FVIII标准曲线校准样品吸光度。
实施例8:血友病小鼠中的体内功效测定法
为了显示靶向性FVIII分子在促进血液凝固中的功效并为了评估这些效果的持续时间,可以如下文所描述的那样使用尾夹损伤(tail clip injury)或尾静脉横断模型,其使用血友病小鼠(HemA)小鼠。
尾夹损伤模型
经由尾静脉注射对小鼠施用测试样品。施用后,用氯胺酮/赛拉嗪(100mg/kg,10mg/kg)腹膜内(IP)麻醉小鼠。在完全麻醉动物时,将尾部个别地放置在13mL37℃预热的盐水中达约10分钟。用锋利的解剖刀产生尾部切口,并立即将尾部放置在具有9mL37℃温盐水的新管中。连续收集血液达30分钟。通过血液收集管的重量增加来测定或者通过血液收集管中血液/盐水混合物的光学密度来测定血液损失体积。
尾静脉横断
将HemA雄性小鼠按其体重随机化入不同处理组中。通过尾静脉注射来对小鼠给药(dose),24小时后进行尾静脉横断。尾静脉横断前,用含有50μg/kg氯胺酮和1mg/kg美托咪定的混合物麻醉(IP)小鼠。使用French导管在2.7mm直径处标记尾部。用1mg/kg阿替美唑通过IP注射来反转美托咪定的麻醉效果。用解剖刀刀刃横断尾静脉。然后将尾部浸没入37℃盐水管中,并旋转该管以自切口漂洗去血液。在盐水变得太不透明以致不能显现时,用新管替换它,直至尾部停止出血。停止出血所花费的时间记录为急性凝固时间(acuteclotting time)。然后将小鼠返回其单独的干净的笼,其中在4x8英寸加热垫上放置白纸衬垫。对于过量血液损失,每小时监测到再出血和垂死的时间达接着的9-11小时。
实施例9:靶向性FVIII的重组表达
在一个实施方案中,将HKB11细胞在悬浮培养中在轨道摇动器(100-125rpm)上在5%CO2培养箱中于37℃在没有蛋白质的培养基中培养,并维持在0.25-1.5x106个细胞/mL的密度。通过离心来收集用于转染的HKB11细胞,然后在表达培养基诸如FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以1.1x106个细胞/mL重悬。将细胞在6孔板(4.6mL/孔)中接种,并在轨道摇动器(125rpm)上在37℃ CO2培养箱中温育。对于每孔,将5μg质粒DNA与0.2mL Opti-I培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合。对于每孔,将7μL293fectinTM试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)温和地与0.2mL Opti-I培养基混合,并于室温温育5分钟。将稀释的293fectinTM添加至稀释的DNA溶液,温和地混合,于室温温育20-30分钟,然后添加至已经用5x106个(4.6mL)HKB11细胞接种的每孔。然后将细胞在轨道摇动器(125rpm)上在CO2培养箱中于37℃温育3天,之后通过以1000rpm离心5分钟来沉淀细胞,并收集上清液。
使用以下方法来获得HKB11细胞的稳定转染。使用293fectinTM试剂,用质粒DNA转染HKB11细胞,如瞬时转染中所描述的。以多种稀释(1:100、1:1000、1;10,000)将经转染的细胞分入100-mm培养皿中,并在补充有5%FBS和200ug/mL潮霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM-F12培养基中维持约2周。使用无菌克隆盘(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)来挑选个别的单克隆,并将它们转移入6孔板中。将克隆建立并存储(bank)。通过FVIII活性测定法(例如和aPTT测定法)以及通过FVIII ELISA对这些克隆筛选融合蛋白的高表达。
可以使用商品化显色测定试剂盒(SP4FVIII,Chromogenix,Lexington,MA)在96孔形式中测定培养上清液和纯化级分中的凝血因子VIII活性水平,如上文所描述的。也可以使用aPTT测定法在FVIII缺乏型人血浆中通过1800C自动凝固分析仪(Beckman Coulter,Fullerton,CA)来测定凝血因子VIII凝固活性。简言之,通过该仪器来创建上清液样品在凝固稀释剂中的三种稀释物,然后将100μL与100μL FVIII缺乏型血浆和100μL自动化aPTT试剂(兔脑磷脂和微粉化硅土,Biomerieux,Durham,NC)混合。添加100μL25mM CaCl2溶液后,记录到凝块形成的时间。使用连续稀释的使用的与ELISA测定法中的标准品相同的纯化的FVIII对每次运行产生标准曲线。
虽然本发明已经参照具体的实施方案和实施例进行了描述,但是应当理解可以进行各种修饰和变化,而且可以在不背离本发明的真实精神和范围的前提下替代等同方案。因而,要以例示性而不是限制性意义看待说明书和实施例。此外,通过提及而将本文中所提及的所有文章、专利申请和专利完整收入本文。
Claims (10)
1.一种靶向性凝固因子,其包含与至少一个特异性结合血细胞上的膜蛋白质的域连接的凝固因子。
2.权利要求1的靶向性凝固因子,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX;和/或其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子;和/或其中所述血细胞是血小板,而所述膜蛋白质是GPIIb/IIIa;和或其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽;和/或其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
3.权利要求1的靶向性凝固因子,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽,而所述域是与所述FVIII的B域连接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
4.权利要求3的靶向性凝固因子,其中所述血细胞是血小板,而所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
5.一种药物组合物,其包含治疗有效量的权利要求1的靶向性凝固因子和药学可接受赋形剂或载体。
6.一种用于治疗血液学疾病的方法,包括对有所需要的患者施用有效量的权利要求1的靶向性凝固因子。
7.一种用于将凝固因子靶向至血细胞表面的方法,包括连接所述凝固因子与至少一种结合血细胞上的膜蛋白质的域。
8.权利要求7的方法,其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽或FIX;和/或其中所述血细胞是血小板或红细胞;和/或其中所述域是抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子;和/或其中所述血细胞是血小板,而所述膜蛋白质是GPIIb/IIIa;和/或其中所述凝固因子是功能性FVIII多肽;和/或其中所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段,和/或其中进一步从所述血细胞的表面释放所述凝固因子。
9.权利要求7的方法,其中所述凝固因子是FVIII,而所述域是与所述FVIII的B域连接的抗体片段、肽、肽模拟物、或小分子。
10.权利要求9的方法,其中所述血细胞是血小板,而所述域是RGD肽或抗GPIIb/IIIa抗体的单链片段。
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