JP2001504813A - 代用血小板、及びそれらの製造に適した抱合法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 フィブリノーゲン、もしくは類似物を含有する、治療に有用な代用血小板は、ＲＧＤ配列を含む本質的に性能の低下していない活性のある蛋白質が結合された不溶性のキャリアを含んでなるものである。このような抱合体は、抱合法により、活性のあるフィブリノーゲンを０．０１〜２．５重量％と、不活性なフィブリノーゲンを５０％以下含むように作ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 代用血小板、及びそれらの製造に適した抱合法 発明の分野 本発明は、代用血小板、すなわちフィブリノーゲンを含んでなる組成物、及び 中でも、フィブリノーゲンを特定のキャリアと結合させるのに用いることのでき る抱合法に関するものである。発明の背景 有効な薬物とキャリアとからなる共有結合抱合体は、薬物を、例えば特定の作 用部位に運ぶ手段として有用である。この目的に対しては、キャリアとして、ア ルブミンが提案されている。アルブミンの微粒子、それらの製造、及びそれらの キャリアとしての使用が、国際特許出願第Ａ−９６１８３８８号明細書に記載さ れている。 大きなペプチドや蛋白質をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）製のマイクロカプセ ルに共有結合させると、数多くの問題が生じることがある。蛋白質とマイクロカ プセル表面との接触が不十分な為に、架橋の為に十分な結合部位が得られないこ とがある。また、グリコールアルデヒドやＥＤＣのような、それぞれ長さが短い か、もしくは零である架橋剤を用いると、分子間というよりは分子内架橋をコン トロールするのが難しい。これにより、マイクロカプセルの充填量が少なくなっ たり、蛋白質が不活性化することがある。 AgamとLivneは、一連の論文Blood，55:186-191(1983)、Thromb．Haemostasis ，51:145-9(1984)、及び59:504-6（1988）、並びにEur．J．Clin．Invest．(199 1)で、固定された血小板を覆っているフィブリノーゲンが血小板の凝集を増大さ せること、またフィブリノーゲンに覆われた赤血球が血 小板減少症のラットの出血回数を減らすことを示した。固定は、ホルムアルデヒ ドの使用を伴うものであった。 Coller等，J．Clin．Invest．89:546-555（1992）には、血小板輸血に代わる 自己由来の半人工代替品である「凝集性赤血球」について記載されている。新鮮 な血小板を用いることの限界や欠点を避ける為に、二官能価の架橋剤を用いて、 赤血球をＲＧＤ細胞認識配列を含むペプチドと結合させた。 １９９５年６月１１〜１６日にイスラエルのエルサレムで行われたInternatio nal Society on Thrombosis and Haemostasisの第１５回会議の要旨集に、Yen等 は「凝集性球体」、すなわち、ヒトフィブリノーゲンが表面に共有結合している 、平均直径が１．１〜１．３μｍの架橋ＨＳＡ小球体の止血能力について報告し た。血小板減少症のウサギのモデルでは、耳からの出血が減少した。このＨＳＡ 小球体は、米国特許第Ａ−５０６９９３６号明細書に記載されている手順、すな わち、架橋剤としてグルタルアルデヒドを、沈殿を起こす為にエタノールを、ま た架橋蛋白質分子の表面を変性するのに界面活性剤を用いる、溶液／脱溶媒法に より調製したとのことである。これらの工程では小球体の大きさをコントロール することができず、それらの工程により、結合させた蛋白質の性能が低下するこ とがあり、またそれらの工程は、代用血小板の大きなスケールでの製造には不適 切である。 米国特許第Ａ−５０６９９３６号明細書には、フィブリノーゲンではない様々 な生物学的な分子の共有結合が記載されている。ポリアルデヒドが、共有結合剤 として提案されている。例１２、及び例１４では、それぞれ抗体と、及び酵素( アルカリ性のホスファターゼ)と結合させる為に、グルタルアルデヒドを用いて いる。 国際特許出願第Ａ−９６３９１２８号（１９９６年１２月１２日公開）にも、 「凝集性球体」が記載されている。ここでも、具体的な配合物は示されていない 。 フィブリノーゲンは、ＲＧＤ（Ｓ）配列を含む粘着性のある糖蛋白質である。 それと、（中でも、フィブロネクチンやコラーゲンを含む）その他のこのような 糖蛋白質は、腫瘍細胞の内皮下層への付着を媒介することがある。これらの糖蛋 白質は、腫瘍細胞中にあるインテグリン、例えばフィブロネクチン受容体、及び 血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体と相互に作用する。Dardik等，Int．J． Cancer，70:201-7(1997)を参照のこと。 癌の外科的な治療に於ける大きな問題の一つは、腫瘍細胞が循環系に放出され る危険性が高いという点である。このことは、術後、前立腺癌の患者に合併症が 発現する頻度が高いことの一つの理由である。循環している転移性の腫瘍細胞を 除去するか、もしくはそれらが血管の表面に沈着するのを防ぐのが望ましい。発明の要旨 本発明の一つの態様によれば、フィブリノーゲンのようなペプチド（ペプチド とは、あらゆるペプチド、ポリペプチド、蛋白質、もしくはそれらの抱合体を意 味する）をマイクロカプセルに結合させる為の新しい方法により、蛋白質とマイ クロカプセルとの間にスペーサー（例えば、小さいペプチド、もしくは脂肪酸） を挿入できるようになる。より詳しくは、本発明は、ＨＳＡのようなキャリアが 遊離チオール基をもっていて、それと二官能価の化合物が反応できる、という事 を利用するものである。この二官能価の化合物は、抱合させようとする有効成分 （薬物）と選択的に反応することができる基を一つもつものである。 本発明によって、ＨＳＡのようなキャリアにある遊離チオール基に対する、結 合基の内の一つの基がもつ特異性の為に、コントロール可能な架橋を行うことが できる。コントロール可能な架橋というのは、それが結合させた分子の活性に対 して直接的な関係をもつことがあるので、本発明の一つの重要な点である。 スペーサーは、用途により異なる要求に応じて、酵素により裂開可能なペプチ ドや、酸もしくはアルカリに対して不安定な結合を含むことができ、また様々な 長さであってよい。スペーサーの長さは、フィブリノーゲンをＧＰＩＩｂ／ＩＩ Ｉａに抱合させるような、ターゲット受容体への抱合能力を決定することがある ので、それは、本発明のもう一つの重要な点であることがある。 本発明の第二の態様によれば、例えばこの新規な方法を用いることにより、薬 学的に許容される新規生成物が代用血小板としての有用性をもつ。このような生 成物は、フィブリノーゲンを結合させた不溶性のキャリア、例えば安定化させた アルブミンを、本質的にフィブリノーゲンの活性を失うことなしに含んでなるも のである。結合は、例えば吸着による非化学的なものであってもよいし、例えば 長さが少なくとも１０ｎｍのリンカーを用いる化学なものであってもよい。 本発明は、先ず初めに、純粋で丈夫な、治療上許容される代用血小板を提供す るものである。純粋とは、化学的な架橋剤、及び／又は界面活性剤が存在してい ないということで、具体に表すことができる。それら代用血小板は、血小板減少 症の治療に用いるのに適している。 本発明の付加的な特徴は、フィブリノーゲンがターゲティング剤として作用す るので、本発明の生成物は、結合させた他の有効な薬剤を有するのが有益なこと があるという点である。このような薬剤は、一般的には創傷、もしくは他の出血 位置である作用部位、及び扱っている問題の性質に注目して選択する。発明の説明 本発明で用いるキャリアは、粒度、及び粒度分布を上手くコントロールできる条 件下で、噴霧乾燥により作るのが好ましい。例えば、粒子が毛細血管を通過でき るよう、好ましい大きさは６μｍ以下、例えば１〜４μｍである。 適切な材料、及び手順、並びに熱により、もしくは化学的な架橋により微粒子 を安定化させる為の方法は、国際特許出願第Ａ−９２１８１６４号、国際特許出 願第Ａ−９６１５８１４号、及び国際特許出願第Ａ−９６１８３８８号の各明細 書に十分に記載されている。それらの内容は、参考として本明細書に記載するも のである。後者の刊行物中で説明されているように、記載されている条件は、ア ルブミン中のチオール基のような官能基に影響を与えるものではない。従って、 官能基が残って、生物学的な分子との反応に利用される。 本発明に用いる微粒子は、上に示した二つの刊行物に記載されている、例えば 滑らかな球状であって、空気を含んでいるといった物理的な特性を有していてよ い。不溶性の架橋マイクロカプセルを得る為に、噴霧乾燥生成物を化学的な架橋 剤と反応させることができる。しかしながら、熱、及びγ−線照射が好ましく、 また乾燥粉末生成物を殺菌してもよい。 本発明の一つの態様に於いては、フィブリノーゲン（もしくは他のＲＧＤペプ チド）を、リンカーを用いずに、例えば吸着によってこのようなキャリアと結合 させることができる。これは、当業者には明らかなように、例えばｐＨやその他 の条件をコントロールすることにより、ペプチドを小球体の表面に沈澱させて行 うことができる。その後で、過剰な／未結合のフィブリノーゲンを洗い流す。 他の態様に於いては、フィブリノーゲンを、ポリアルデヒドのような従来の二 官能価の試薬を用いて結合させる。グリコアルデヒドが好ましい。スペーサーの 他の例は、（水溶性の）スルホスクシンイミジル４−（ヨードアセチル）アミノ ベンゾエートである。その長さは、約１ｎｍである。 本発明の第一の態様として上で定義した抱合法に於いては、結合させたペプチ ドは、少なくともフィブリノーゲンからなっているのが好ましい。他の例は、第 ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、その他の血液因子、凝固カスケードの蛋白質、血栓 崩壊剤、抗体、α−１−アンチトリプシンである。例えば、フィブリノーゲンと 第ＶＩＩＩ因子を組み合わせることにより、本発明の生成物が血友病の治療に有 用になることがある。ウロキナーゼのような血栓崩壊薬を用いるのに加えて、も しくはその代わりとして、血餅を超音波を用いて処理してもよい。この目的に対 しては、本発明の空気を含んだマイクロカプセルが特に適している。 本発明に用いる二官能価の化合物（例えばＹ¹−Ｙ−Ｙ²）そのものは、より単 純な化合物であるＹ¹−Ｙ³−Ｙ⁴とＹ⁵−Ｙ⁶−Ｙ²との反応により作り出すことが できる。式中、Ｙ¹はチオールに対して特異性のある反応性基であり、Ｙ⁴とＹ⁵ は、Ｙ³とＹ⁶が一緒になってスペーサーＹとなるように反応し、またＹ²は薬物 に対して反応性のある基である。従って、例えばＹ¹はチオールと反応するＩで あり、及び／又は、Ｙ⁴はＩＣＨ₂ＣＯＯＨに於けるようなＣＯＯＨである。より 具体的には、ＥＤＣを添加してヨード酢酸を活性化させる（ＥＤＣにより触媒さ れるアミド化反応を助ける為に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを組み入れて、 活性スクシンイミジルエステルを生成させることができる）。その後、活性化し た種を、ペプチド、もしくは遊離アミノ（Ｙ⁵）基と遊離カルボキシル（Ｙ²）末 端基をもつ分子と共に定温放置する。適切なペプチドは、例えば、ＧｌｙやＡｌ ａのような、アミノ酸を３〜６分子含んでなるものである。 その後、この中間抱合体のカルボキシル基を、ＥＤＣで活性化させる。この活 性化したスペーサーを蛋白質と共に定温放置して、蛋白質のリシンアミノ側鎖と 共にペプチド結合を形成させる。スペーサーの一方の端だけが蛋白質と結合する ことができるので、この時点では架橋は起こり得ない。ＨＳＡは例外であるが、 殆どの血漿蛋白質は遊離チオール基を含んでおらず、その為、蛋白質の分子内架 橋が防がれる。 例としては、スペーサーは、ＨＳＡマイクロカプセルのＣｙｓ−３４残基に位 置する遊離チオールと選択的に反応するＮ−末端ヨードアセチル官能性を有して いる。このスペーサーは、例えば１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピル カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて活性化させることができる、ペプチド上のア ミン基と結合した遊離カルボン酸も有していてよい。 ＥＤＣによるスペーサーの活性化は、０．０５Ｍの４−モルフォリノエタンス ルホン酸緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）中で、ｐＨ６で行うことができる。フィブリノ ーゲンのあらゆる吸着を防ぐ為に、フィブリノーゲンを、活性化させたＮ−ヨー ドアセチルペプチド、例えばＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅと一旦反応させ、緩衝液を ｐＨ８の０．１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液に変える。フィブリノーゲンの吸着は、 このような高いｐＨでは生じない。フィブリノーゲンとＨＳＡマイクロカプセル との結合はいずれも、ＨＳＡマイクロカプセルからの遊離チオールが、スペーサ ーのＮ−末端にある沃素分子と隣り合う炭素原子と反応した結果としてのみ生じ る。チオール−沃素の相互作用に最適なｐＨは、ｐＨ８である。 スペーサーを介してのフィブリノーゲン（例として）とマイクロカプセルとの 結合を高める為に、マイクロカプセルの遊離チオール含有量を、トラウト試薬( ２−イミノチオラン）を用いて増すことができる。この試薬により、リシンのε −アミノ基がチオール基に変わるので、その結果、スペーサーとの、従ってフィ ブリノーゲンとの結合に役立つ遊離チオールの数が増える。 興味のある蛋白質（例えば、システイン、還元グルタチオン）を結合させる前 に、含チオールアミノ酸もしくはペプチドをマイクロカプセルと架橋させること によっても、充填量を増すことができる。チオール基を導入する為に（また、チ オール基の数を増す為に）、イミノチオランのような化学的なリンカーを用いる ことができる。ＨＳＡの固有の特性（すなわち遊離チオール基）を用いる代わり に、チオール基を蛋白質の表面に添加するのであれば、マイクロカプセルを作る 為に、他の蛋白質を用いることができる。 その後、蛋白質とスペーサーを、遊離チオール基を含んでいるＨＳＡマイクロ カプセルと共に定温放置する。官能基が失われることのない、噴霧乾燥によるこ のようなマイクロカプセルの製造は、国際特許出願第Ａ−９６１５１８４号、及 び国際特許出願第Ａ−９６１８３８８号の各明細書に記載されている。 スペーサーと蛋白質のモル比は、マイクロカプセルとの架橋に十分な基を蛋白 質に結合させるのに必要なだけ高く、しかし蛋白質を非活性化させることのない よう十分に低くなければならない。この特定の手順により、中間抱合体ＩＣＨ₂ ＣＯ（Ａ）_nＣＯＯＨが作り出される。式中、（Ａ）_nは、同じであるか、もしく は異なるアミノ酸のｎ個の残基を示す。例えば１０〜６００ｎｍ（１〜６０オン グストローム）であるスペーサーの長さを調節するｎの選択は、予定している用 途により異なるが、少なくとも５０ｎｍであることが多い。 上記の方法の工程は、主として水をベースとする溶剤系中で実施することがで きる。反応副生物は、容易に除去することができる。 架橋技術は、マイクロカプセルとのペプチドや蛋白質のコントロールされた結 合をもたらし、蛋白質の活性をより良く保たせ、また長さと裂開性に関してスペ ーサーを変性させる能力をもたらすものでなければならない。 上で示したように、フィブリノーゲンを含む本発明の生成物は、腫瘍の側面で 作用することがある。その為、それらを、例えば本発明の特定の方法により、も しくは国際特許出願第Ａ−９６１８３８８号明細書に記載されている方法により 細胞毒性剤を結合させて、腫瘍の治療に用いてもよい。適切な細胞毒性剤には、 メトトレキサート、ドキソルビシン、シスプラチン、もしくは５−フルオロ−２ ’−デオキシユリジンが含まれる。 腫瘍細胞への薬物のターゲティングは、本発明の生成物を、細胞と直接的に反 応するベヒクルとして、もしくは細胞付着部位に於けるフィブリンの凝集、及び 沈着に関与するベヒクルとして用いることにより行うことができる。 本発明の生成物には、細胞毒性剤、もしくは細胞毒性剤とターゲティング剤と を組み合わせたものを充填することができる。その後、それらを、細胞糖蛋白受 容体との（見つけ出して破壊する）特定の相互作用によるか、もしくは付着部位 に於ける血小板の凝集プロセスへの関与により、循環している散在性の腫瘍細胞 に標的を定めるのに用いることができる。どちらの場合も、細胞毒性薬は、侵入 した腫瘍細胞の部位に集まる。 或いは、腫瘍細胞表面を本発明の生成物で覆い、血小板を活性化させる部位／ メカニズムをブロックすることにより、循環系内で、もしくは付着部位に於いて さえも、腫瘍の凝集を防ぐことができる。これにより、この後、身体の自然の防 御メカニズムにより、腫瘍細胞の除去が促進される。 例えば（フォン・ウィレブランド因子と相互に反応する）ＧＰＩｂ受容体、も しくはコラーゲンや他の内皮下マトリックス成分の受容体を含有する生成物も、 内皮下マトリックスを覆うことで腫瘍細胞の結合部位を潜在的にブロックする為 に、送り出すことができる。生成物は、創傷の部位で血小板と相互に作用しなけ ればならないが、あらゆる固定された腫瘍細胞が血管壁から侵入するのを制限す るものでもなければならない。 本発明の重要な利点は、フィブリノーゲン（もしくは他のＲＧＤペプチド）の 活性を実質的に保持することができる、という点である。活性のあるフィブリノ ーゲンの含有量は、フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）についてのＥＬＩＳＡによ り測定することができる。 ＦＰＡについての分析に於いて、一定量の過剰のフィブリノペプチドＡ抗体を サンプル（もしくは標準品）と定温放置することにより、抗原−抗体複合体が形 成される。残りの過剰の抗体の濃度は、サンプル（もしくは標準品）中のＦＰＡ の量と反比例する。 抗体の濃度を測定する為に、定温放置混合物のアリコートを、その後の定温放 置の為に、過剰のＦＰＡで被覆した反応容器中に移す。壁と結合した、得られた 抗原−抗体複合体は、ペルオキシダーゼ標識付き抗１ｇＧ抗体と共にサンドイッ チ状の複合体を形成する。これらの複合体の量が、サンプル中のＦＰＡの濃度の 直接的な尺度となる。 得られたサンドイッチ状の複合体を、ペルオキシダーゼとＨ₂Ｏ₂／オルト−フ ェニレンジアミン（クロモゲン）との酵素反応、及びその後の４９２ｎｍでの分 光光度測定により測定する。結合した酵素の活性と抗原の濃度との逆比例関係に より、サンプル中のＦＰＡ濃度が増すにつれ、測定される吸光度が低下する。濃 度が分かっている標準品により参照曲線を描いて、結果を評価する。 本発明の代用血小板は、活性のあるフィブリノーゲンを通常、少なくとも０． ０１％、好ましくは少なくとも０．０１５％、より好ましくは少なくとも０．０ ２％、最も好ましくは少なくとも０．０２５％含んでいる。凝集を防止する為に 、フィブリノーゲンの量は多すぎてはならず、例えば１％以下、１．５％以下、 ２％以下、もしくは２．５％以下である。フィブリノーゲン含有量の内、少なく とも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％が 活性をもっているのが望ましい。これは、フィブリノーゲンの全含有量について 測定することができる。これも、ＥＬＩＳＡのような方法で測定することができ る。全フィブリノーゲンは、例えば¹²⁵Ｉを用いた放射性同位元素標識や、従来 の手順による計数によっても測定することができる。 フィブリノーゲンは、血液に由来する形質転換型、もしくは組み換え型の、全 体にわたる長さの、もしくはそのいずれかの活性のあるフラグメントであってよ い。フラグメントは、中でも、前述のColler等の論文中に開示されている。 治療薬として用いる為には、本発明の生成物をそのまま、もしくは当業者に知 られているいずれかの適切なキャリアと混合して投与することができる。生成物 の投与量は、主として、創傷、もしくは治療しようとする他の症状の重篤度によ り決定する。典型的な投与量は、体重１ｋｇ当たりマイクロカプセル１．５×１ ０⁹個である。 以下の例は、本発明を説明するものである。 例で用いたフィブリノーゲンは、ウイルスにより二重に不活性化された、全体 にわたる長さの、血液由来の市販品である。 例で用いたＨＳＡマイクロカプセルは、国際特許出願第Ａ−９６１５８１４号 明細書に記載されているように、噴霧乾燥により調製し、その後、加熱して安定 化させた。マイクロカプセルを１％のトゥウィーン８０と共に沈め、使用前にＰ ＦＰＷで十分に洗浄して、トゥウィーン８０と賦形剤を除去した。 ＰＦＰＷ＝発熱物質の入っていない純水 ＤＴＮＢ＝５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸） 遊離チオールの含有量は、ＤＴＮＢを用いてエルマン分析により測定した。こ の試薬は、試験中の蛋白質に存在しているあらゆる遊離チオールとのチオール交 換のメカニズムに関与して（ＴＮＢ）を放出するので、それをＵＶ／ＶＩＳ分光 測光を用いて、４１２ｎｍで測定することができる。例１ メタノールと蒸留水の混合物中で、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（ＩＡＡＥ）をテトラ−アラニン（ＡＡＡＡ）と、室温で１時間反応さ せた。蒸留水中のＡＡＡＡに対して１．２モルの比率で、５分間にわたりＥＤＣ を添加し、その後、蒸留水中に再懸濁させておいたフィブリノーゲンを添加した 。室温で１時間攪拌した後、マイクロカプセルを添加し、その混合物を室温で更 に１６時間攪拌した。 反応後にマイクロカプセルを蒸留水で六回洗浄して、あらゆる未反応のフィブ リノーゲンとスペーサーを除去し、その後、蒸留水に再懸濁させて最終的なマイ クロカプセルの濃度を１００ｍｇ／ｍｌとした。 フィブリノーゲンの使用量（５４ｍｇ）を計算したところ、マイクロカプセル （２０ｍｇ）に対して０．５モル当量であった。これは、マイクロカプセルの遊 離チオール含有量が与えられたとすると、可能な最大充填量であると考えられた 。 ＥＬＩＳＡの結果、ＨＳＡ１００ｍｇにつきフィブリノーゲンが０．５ｍｇ充 填されたことが分かった。標識付けしたマイクロカプセルを５ｍｇと、トロンビ ンを０．１５単位用いて行ったスライドテストの結果は、ポジティブであった。 トロンビンを添加すると、直ちに凝集が生じた。 同じ量のマイクロカプセルとフィブリノーゲンを用い、ＩＡＡＥ、ＡＡＡＡ、 もしくはＥＤＣは用いずに、コントロール実験も行った。このサンプルから得ら れたＥＬＩＳＡの結果、ＨＳＡ１００ｍｇにつきフィブリノーゲンが０．０６ｍ ｇ充填されたことが分かった。これは、架橋剤を用いることなしに生じた。この サンプルも、スライドテストの結果はポジティブであったが、トロンビンを添加 してから約１２秒後迄、凝集は起きなかった。例２ 例１の手順を繰り返した。しかし、ＩＡＡＥとＡＡＡＡの反応を最適化する為 に、逆相ＨＰＬＣを用いて反応を追跡した。この目的に対しては、ＩＡＡＥを全 て生成物に転換させるのに必要なＡＡＡＡの量を調べる必要があった。あらゆる 未反応のＩＡＡＥが好ましくない副反応に関与して、合成が進んだようであった 。その結果、ＩＡＡＥの使用量を一定に保っても、ＡＡＡＡの反応量は、１モル 当量から４モル当量に増加した。例３ 例１の手順を繰り返した。しかし、所定量のフィブリノーゲンに必要とされる スペーサーの量を、ＩＡＡＥとＡＡＡＡの比を１：４として、またＡＡＡＡに対 して１．２モル当量の過剰のＥＤＣを用いて調べた。スペーサーの使用量を、存 在しているＩＡＡＥのモル数を用いて計算した。ＩＡＡＥが有効成分であり、ま たスペーサー調製の限定因子だからである。ＩＡＡＥ−ＡＡＡＡ−ＥＤＣとフィ ブリノーゲンの比は、１：１から１：５に増した。 ＥＬＩＳＡの結果から、フィブリノーゲンとＩＡＡＥ−ＡＡＡＡ−ＥＤＣの比 が１：２の時に、フィブリノーゲンの充填量が再現性良く、最大になることが分 かった。充填量を計算したところ、ＨＳＡ１００ｍｇにつき０．０６ｍｇであっ た。また、スライドテスト分析では、サンプルは５秒以内に凝集した。例４ 更なる最適化実験では、フィブリノーゲンの量を減らして例１を繰り返した。 マイクロカプセルに対するＩＡＡＥ−ＡＡＡＡ−（ＥＤＣ）−フィブリノーゲン の比を、０．５、０．３、０．１、０．０５、及び同値というように変えた。 ＥＬＩＳＡの結果から、比が１：０．０１であるサンプル以外の全てのサンプ ルが、許容される充填量のフィブリノーゲンを有していることが分かった。サン プルを、ＨＳＡ１００ｍｇに対してフィブリノーゲンが０．１〜０．２ｍｇとな るように変えた。実験から、フィブリノーゲンの量を僅か０．０５モル当量に減 らすと、０．５モル当量を用いた時のような高い充填量が得られた。例５ 例４で得られた結果がかなり均一であったので、二つの実験を行った。表１は 、フィブリノーゲンの充填量を調べる為に、以下の比を用いた第一の実験に使用 した量を示す。 ＩＡＡＥ：ＡＡＡＡ（１：４） ＩＡＡＥ−ＡＡＡＡ−ＥＤＣ：フィブリノーゲン（２：１） ＩＡＡＥ−ＡＡＡＡ−（ＥＤＣ）−フィブリノーゲン： マイクロカプセル（０．３：１） 第一の実験と同じ量を用いた第二の実験（但し、ＩＡＡＥ−ＡＡＡＡ−（ＥＤ Ｃ）−フィブリノーゲン：マイクロカプセル（０．０５：１））に必要とされた 量を、表２にまとめる。 どちらの実験に於いても、０．１Ｍ燐酸ナトリウムと０．１５Ｍ塩化ナトリウ ムのｐＨ８の緩衝液中で、室温で、マイクロカプセルをスペーサーと１６時間反 応させた。その後、マイクロカプセルをＰＦＰＷで十分に洗浄し、再懸濁させ、 最終的なマイクロカプセルの濃度を１００ｍｇ／ｍｌとした。 比率が０．３と０．０５であるサンプルについて得られたＥＬＩＳＡの結果か ら、ＨＳＡ１００ｍｇに対して、フィブリノーゲンがそれぞれ０．３８ｍｇ、及 び０．４２ｍｇ結合していることが分かった。これら二つのサンプルについての スライドテストの結果はポジティブであり、トロンビンを添加してから約２秒後 に凝集が生じた。例６ １ｍｇ／ｍｌのテトラ−アラニン（ＡＡＡＡ）を準備する。テトラ−アラニン (シグマ)を３ｍｇ、７ｍｌのビジュー中に測り入れ、３ｍｌのＰＦＰＷに溶かし て渦動させる。 ３ｍｇ／ｍｌのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＩＡＡＥ ）を準備する。それ（シグマ）を３ｍｇ、７ｍｌのビジュー中に測り入れ、１ｍ ｌのメタノールに溶かす。これを渦動させる。 ７０μｌのテトラ−アラニンを、次いで５．７μｌのＩＡＡＥを７ｍｌのビジ ューにピペットで加える。これを渦動させる。ＩＡＡＥとテトラ−アラニンのモ ル比は１：４である。 マイクロカプセル２．３ｍｇとグルコースを配合する。この混合物は、蛋白質 約８００ｍｇとグルコース１６００ｍｇからなるものである。１％（ｖ／ｖ）の トゥウィーン８０（シグマ）で蛋白質の濃度を５０ｍｇ／ｍｌとする。 内容物を渦動させ、室温で約３０分問静置して、中空のマイクロカプセルを沈 める。渦動させた後、４００μｌのアリコートをエッペンドルフ中に添加する。 このサンプルを、ベックマンＧＳ−１５中で、室温で３０００ｒｐｍで２分間、 遠心分離（相対遠心力ＲＣＦ＝１５０２ラジアン／秒）する。その後、これを１ ｍｌのＰＦＰＷで三回洗浄する。必要になる迄、ペレットを室温で保存する。 バイアル一本分のヒトフィブリノーゲンを、０．１Ｍ食塩水／０．０２５Ｍ燐 酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍｌ中で再形成させると、理諭的なフィ ブリノーゲン濃度である６０ｍｇ／ｍｌとなる。緩衝液で処理した３５％（ｗ／ ｖ）のＰＥＧ溶液を４ｍｌ添加することにより、フィブリノーゲン溶液をＰＥＧ １０００に対して５．８％（ｗ／ｖ）とする。得られる溶液を反転によってのみ 混合し、その後、氷の上で１５〜２０分間冷やす。得られる沈澱物を遠心分離機 にかける（４０００ｒｐｍ／４分／ベックマンＧＳ１５）。上澄み液を除去し、 体積を測定する。 その後、７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／０．１Ｍ食塩水／０．０２５Ｍ燐酸ナトリウ ム緩衝液（ｐＨ７．２）を添加して、ペレットを洗浄する。ペレットを洗浄する のに、初めの原料フィブリノーゲンの体積の半分を用いる。ペレットをこの緩衝 液中に再懸濁させ、キュベット攪拌機で攪拌する。この溶液を、４０００ｒｐｍ で４分間、遠心分離機にかける。洗浄したペレットから上澄み液を取り除き、体 積を測定する。ペレットを、ｐＨ７．２の０．０２５Ｍ燐酸ナトリウム／Ｏ．１ Ｍ食塩水緩衝液２０ｍｌ中で再形成させる。精製したフィブリノーゲン溶液の体 積を測定する。全蛋白質濃度をＢＣＡ分析により測定する。フィブリノーゲンの 濃度を、２８０ｎｍに於けるＵＶ吸光度を読み取って計算する。１％（ｗ／ｖ） のフィブリノーゲン溶液は、２８０ｎｍでの吸光係数が１５．５であることが分 かっているので、フィブリノーゲンの濃度を計算することができる（R.F．Dooli ttle著、「Haemostasis and Thrombosis」、第Ｉ巻、第３版、４９２頁を参照の こと）。 １ｍｇ／ｍｌのＥＤＣを、新しいＰＦＰＷを用いて調製する。ＥＤＣ（シグマ ）を３ｍｇ、７ｍｌのビジュー中に測り入れ、３ｍｌのＰＦＰＷに溶かす。これ を渦動させる。反応したスペーサーの入っているビジューを、攪拌機から取り出 す。反応混合物に、ＥＤＣを５３μｌ添加する。ＥＤＣとテトラ−アラニンのモ ル比は１：１．２である。これを渦動させて、約５分間攪拌する。 ４０ｍｇ／ｍｌのものを２５８μｌ用いて、フィブリノーゲンを１０．３ｍｇ 添加する。フィブリノーゲンとＨＳＡマイクロカプセルのモル比は、０．１：１ である。ＩＡＡＥとフィブリノーゲンのモル比は２：１である。ビジューを反転 させ、約６０分間攪拌する。 洗浄したマイクロカプセル２０ｍｇを緩衝液、すなわちｐＨ８．０の０．１Ｍ 燐酸水素二ナトリウム／０．１５ＭＮａＣｌ中に再懸濁させる。ｐＨを、１２Ｎ のＨＣｌで調節する。マイクロカプセルに、緩衝液を６１３μｌ添加する。これ を３８７μｌの反応混合物に添加する。これにより、最終的な体積が１ｍｌとな る。これを室温で一晩、攪拌する。この反応は、約１６時間である。 ビジューを攪拌板から取り出す。それを、４５００ｒｐｍで１分間、遠心分離 機にかける（ＲＣＦ＝３３７９ラジアン／秒）。上澄み液を除去して、ＥＬＩＳ Ａにより分析する。 ペレットを１ｍｌのＰＦＰＷで六回、洗浄する。物質収支を測定する為のＥＬ ＩＳＡ用に、洗浄液も保存しておく。その後、ペレットを２００μｌのＰＦＰＷ 中に再懸濁させる。ＥＬＩＳＡ（１００μｌ）用、及びスラィドテスト測定（１ ００μｌ)用にサンプルを供給する。 生成物のサンプルを、４℃で保存する。例７ 蛋白質を約１ｇとマンニトールを２ｇ含む、バイアル一本分の配合マイクロカ プセルを調製する。放射線を照射したバイアルを、４℃で保存する。１％（ｖ／ ｖ）のトゥウィーン８０で、蛋白質の濃度を５０ｍｇ／ｍｌとする。内容物を渦 動させ、室温で約３０分間静置して中空のマイクロカプセルを沈める。 渦動させた後、配合物１ｇにつき２０ｍｌのアリコートを、５０ｍｌのベック マン遠心分離機用試験管に添加する。これを、ベックマン・アバンティＪ−２５ で、室温で５０００ｒｐｍで３分間、遠心分離する（相対遠心力ＲＣＦ＝４６４ ８ラジアン／秒）。その後、これを２０ｍｌのＰＦＰＷを用い、室温で３３００ ｒｐｍで２分間、遠心分離機にかけて（ＲＣＦ＝２０２５ラジアン／秒）二回洗 浄する。 最後に、マイクロカプセルを、１０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）を２０ ｍｌ用いて、室温で３３００ｒｐｍで２分間、遠心分離機にかけて（ＲＣＦ＝２ ０２５ラジアン／秒）洗浄する。ペレットを、１０ｍＭの燐酸塩緩衝液 （ｐＨ６．０）２０ｍｌ中に再懸濁させ、磁気攪拌機を取り付けた７０ｍｌのス ターリリン容器に移す。 フィブリノーゲンをＷＦＩで再形成させて、理論的なフィブリノーゲン濃度で ある約４０ｍｇ／ｍｌとする。この懸濁液を、２０分間、ローラーミキサーで穏 やかに攪拌する。過剰なフィブリノーゲンを、極低温ナルジーンバイアルに入れ た液体窒素中でフラッシュ冷凍させて、保存する（−２０℃）。 配合物１ｇにつきフィブリノーゲン（４０ｍｇ／ｍｌのもの）を０．２５ｍｌ 、攪拌しながらマイクロカプセルに添加する。フィブリノーゲンとＨＳＡマイク ロカプセルのモル比は０．００２：１である。この混合物を、約４時間攪拌する 。 容器を攪拌板から取り出して、内容物を５０ｍｌのベックマン試験管に移す。 それを、室温で３３００ｒｐｍで２分間、速心分離機にかける（ＲＣＦ＝２０２ ５ラジアン／秒）。上澄み液を捨てる。ペレットを、２０ｍｌのＷＦＩで三回洗 浄する。洗浄液を捨てる。その後、ＷＦＩを用いてペレットを再懸濁させて、１ ０ｍｌとする。サンプル５００μｌをＥＬＩＳＡＮスライドテスト測定、及びコ ールターカウンターに用いる。 コールターカウント終了時に、原料マンニトール（１５３ｍｇ／ｍｌ）と原料 燐酸塩緩衝液（２５０ｍＭ）を添加してサンプルを調合し、等張のマンニトール （５１ｍｇ／ｍｌ）、２５ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．０±０．２）、及びマ イクロカプセルの総数１，５００，０００，０００個／ｍｌを得る。例８ ＨＳＡマイクロカプセル（５０ｍｇ、０．７５７μｍｏｌ）を、ｐＨ８．０５ の０．１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液（８３２μｌ）中に再懸濁させ、ｐＨ８．０５ の０．１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液（１６８μｌ）に入れた２−イミノチオラン（ ５２０ｇ、３．７８μｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１時間攪拌 し、その後、マイクロカプセルを蒸留水中で洗浄した（５×５ｍｌ）。最後に マイクロカプセルをｐＨ８．０５の０．１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液で洗浄して、 同緩衝液（２ｍｌ）中に再懸濁させた。コントロール フィブリノーゲン（２０ｍｇ、０．０５８μｍｏｌ）を、ｐＨ６．０３の０． ０５Ｍ ＭＥＳ緩衝液（１．２ｍｌ）中に再懸濁させ、室温で２時間攪拌した。 ＨＳＡマイクロカプセル（５０ｍｇ、０．７５７μｍｏｌ）を、ｐＨ８．０５の ０．１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液（２ｍｌ）に添加し、反応混合物を室温で更に２ 時間攪拌した。例 Ｎ−ヨードアセチルＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（３ｍｇ、５．９５μｍｏｌ）を 、ｐＨ６．０３の０．０５Ｍ ＭＥＳ（１．２ｍｌ）中に再懸濁させ、ＥＤＣ（ ２ｍｇ、１０．４μｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で５〜７分間攪拌した 。フィブリノーゲン（２０ｍｇ、０．０５８μｍｏｌ）を添加し、混合物を室温 で２時間攪拌した。ｐＨ８．０５の０．１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液（２ｍｌ）に 入れたＨＳＡマイクロカプセル（５０ｍｇ、０．７５７μｍｏｌ）を添加し、反 応混合物を、室温で更に２時間攪拌した。 遊離チオールを測定する為に、コントロール反応混合物と実験反応混合物のそ れそれからサンプルを採った。コントロール物質と実験物質の残りのサンプルを 蒸留水で洗浄し（２×５ｍｌ）、再懸濁させて、ＨＳＡマイクロカプセル濃度を １００ｍｇ／ｍｌとした。 この実施例では、ＨＳＡマイクロカプセルの遊離チオール含有量は、ＨＳＡＩ ナノモルにつき、ＳＨが０．２１１ナノモルから１．７３ナノモルに増加した。 コントロールサンプル（スペーサーなし）の活性に対する効果は、見られなかっ た。しかしながら、変性したマイクロカプセルを、スペーサーと共に定温放置し たフィブリノーゲンと反応させた時に、活性のあるサンプルがスライドテストに より得られた。より高い遊離チオール含有量をもつＨＳＡマイクロカプセルによ り、スライドテスト活性が５〜１５秒に増した。このことは、ＨＳＡマイクロカ プセルの遊離チオール含有量を高めると、スペーサーの結合を、従ってフィブリ ノーゲンの結合を増加させることができるという事実により、最終生成物の活性 が増すことを示唆している。例９ ＥＤＣ（０．５ｍｇ／ｍｌ水溶液６９．８：１）をＮ−ヨードアセチルテトラ グリシン（０．５ｍｇ／ｍｌ水溶液１２５．５：１）に添加し、この混合物を室 温で５分間攪拌した。フィブリノーゲン（５５．５ｍｇ／ｍｌ溶液１８６：１） を添加し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。 ＨＳＡ１モル（１００ｍｇ）につき薬物を０．５６モル含有するドキソルビシ ン充填マイクロカプセルを水１．６１９ｍｌに再懸濁させ、それを、活性化させ たフィブリノーゲン溶液に添加した。この混合物を室温で１６時間攪拌した。 ３５００ｒｐｍで２分間、遠心分離機にかけてマイクロカプセルを集め、上澄 み液を除去して捨てた。マイクロカプセルを水で洗浄し（４×５ｍｌ）、１ｍｌ の水中に再懸濁させて、最終的なＨＳＡの濃度を約１００ｍｇ／ｍｌとした。 このサンプルを活性についてテストしたところ、フィブリノーゲンを添加して もマイクロカプセルからいずれのドキソルビシンも失われることがない、という ことが分かった。更に、二倍充填したマイクロカプセルはトロンビンにより活性 を示した。これは、ドキソルビシンが存在しているにもかかわらず、結合させた フィブリノーゲンが活性をもったままでいたことを示すものである。存在してい るフィブリノーゲンのレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。これらの結果に より、フィブリノーゲンが適度に充填されていることが示された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１０月２１日（１９９８．１０．２１） 【補正内容】 請求の範囲 １． 血小板凝集作用をもつ、本質的に性能の低下していない活性のあるフィ ブリノーゲン、もしくはそのフラグメントが結合された不溶性のキャリアを含ん でなる、薬学的に許容される生成物。 ２． 結合が、例えば吸着による非化学的なものである、請求項１に記載の生 成物。 ３． 結合が、界面活性剤不在下での、化学的なリンカーを介しての共有結合 性のものである、請求項１に記載の生成物。 ４． 結合が、少なくとも１０ｎｍの長さの化学的なリンカーを介しての共有 結合性のものである、請求項１に記載の生成物。 ５． キャリアが架橋蛋白質微粒子を含んでなるものである、先行する請求項 のいずれか一項に記載の生成物。 ６． 微粒子の蛋白質がアルブミンである、請求項５に記載の生成物。 ７． フィブリノーゲンが全体にわたる長さのものである、先行する請求項の いずれか一項に記載の生成物。 ８． 活性のあるフィブリノーゲンを０．０１〜２．５重量％と、不活性なフ ィブリノーゲンを５０％以下含んでなる、請求項７に記載の生成物。 ９． 式Ｘ−Ｓ−Ｙ−Ｚ（Ｘ−ＳＨは遊離チオール基をもつキャリア成分であ り、Ｙはスペーサーであり、Ｚは有効成分である）の共有結合抱合体の製造法で あって、 有効成分を、式Ｙ¹−Ｙ−Ｙ²（Ｙ¹は遊離チオール基と選択的に反応する 基であり、Ｙ²は有効成分と反応するがチオール基とは反応しない基である）を もつ二官能価の試剤と反応させる工程、及び 得られたＹ¹−Ｙ−Ｚをキャリア成分と反応させる工程 からなる方法。 １０． Ｙ¹がＩである、請求項９に記載の方法。 １１． Ｙ²がＣＯＯＨである、請求項９、もしくは請求項１０に記載の方法 。 １２． 二官能価の試剤が、スペーサー成分とオプションとして活性化させた ヨード酢酸との反応により得られるものである、請求項１０に記載の方法。 １３． スペーサーが脂肪酸もしくはペプチド鎖を含んでいる、請求項９〜１ ２のいずれか一項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 サラ、マーガレット、ミドルトン イギリス国ノッティンガム、ラディント ン、ミアー、ウェイ、１ クウォドラン ト、ヘルスケアー、（ユーケー）、リミテ ッド内 (72)発明者 ロイ、ハリス イギリス国ノッティンガム、ラディント ン、ミアー、ウェイ、１ クウォドラン ト、ヘルスケアー、（ユーケー）、リミテ ッド内 (72)発明者 ニコラ、ジャーン、チャーチ イギリス国ノッティンガム、ラディント ン、ミアー、ウェイ、１ クウォドラン ト、ヘルスケアー、（ユーケー）、リミテ ッド内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＲＧＤ配列を含む本質的に性能が低下していない活性のある蛋白質が結 合された不溶性のキャリアを含んでなる、薬学的に許容される生成物。 ２． 結合が、例えば吸着による非化学的なものである、請求項１に記載の生 成物。 ３． 結合が、界面活性剤不在下での、化学的なリンカーを介しての共有結合 性のものである、請求項１に記載の生成物。 ４． 結合が、少なくとも１０ｎｍの長さの化学的なリンカーを介しての共有 結合性のものである、請求項１に記載の生成物。 ５． キャリアが架橋蛋白質微粒子を含んでなるものである、先行する請求項 のいずれか一項に記載の生成物。 ６． 微粒子の蛋白質がアルブミンである、請求項５に記載の生成物。 ７． ＲＧＤ蛋白質がフィブリノーゲンである、先行する請求項のいずれか一 項に記載の生成物。 ８． 活性のあるフィブリノーゲンを０．０１〜２．５重量％と、不活性なフ ィブリノーゲンを５０％以下含んでなる、請求項７に記載の生成物。 ９． 式Ｘ−Ｓ−Ｙ−Ｚ（Ｘ−ＳＨは遊離チオール基をもつキャリア成分であ り、Ｙはスペーサーであり、Ｚは有効成分である）の共有結合抱合体の製造法で あって、 有効成分を、式Ｙ¹−Ｙ−Ｙ²（Ｙ¹は遊離チオール基と選択的に反応する 基であり、Ｙ²は有効成分と反応するがチオール基とは反応しない基である）を もつ二官能価の試剤と反応させる工程、及び 得られたＹ¹−Ｙ−Ｚをキャリア成分と反応させる工程 からなる方法。 １０． Ｙ¹がＩである、請求項９に記載の方法。 １１． Ｙ²がＣＯＯＨである、請求項９、もしくは請求項１０に記載の方法 。 １２． 二官能価の試剤が、スペーサー成分とオプションとして活性化させた ヨード酢酸との反応により得られるものである、請求項１０に記載の方法。 １３． スペーサーが脂肪酸もしくはペプチド鎖を含んでいる、請求項９〜１ ２のいずれか一項に記載の方法。 １４． 有効成分がＮＨ₂基を有している、請求項９〜１３のいずれか一項に 記載の方法。 １５． スペーサーの長さが１０〜６００ｎｍである、請求項９〜１４のいず れか一項に記載の方法。 １６． キャリア成分が微粒子の形にある、請求項９〜１５のいずれか一項に 記載の方法。 １７． 有効成分がＲＧＤＳ配列を含む蛋白質である、請求項９〜１５のいず れか一項に記載の方法。 １８． ＲＧＤ蛋白質がフィブリノーゲンである、請求項１７に記載の方法。 １９． キャリアがアルブミンである、請求項９〜１８のいずれか一項に記載 の方法。 ２０． キャリアがヒト血清アルブミンである、請求項１９に記載の方法。 ２１． アルブミンのチオール基を介して、少なくとも５０ｎｍの長さのスペ ーサーによって有効成分に抱合されているアルブミン。 ２２． 請求項１８、もしくは請求項２０に記載の方法により得られる、請求 項２１に記載のアルブミン。 ２３． 微粒子の形の請求項２１、もしくは請求項２２に記載のアルブミン。 ２４． 有効成分がフィブリノーゲンである、代用血小板として用いる為の請 求項２０〜２２のいずれか一項に記載のアルブミン。 ２５． フィブリノーゲンが請求項８で定義したものである、詰求項２４に記 載のアルブミン。 ２６． メトトレキサート、ドキソルビシン、シスプラチン、もしくは５−フ ルオロ−２’−デオキシユリジンのような結合された細胞毒性剤を付加的に含む 、請求項１〜８、及び２１〜２５のいずれか一項に記載の生成物。