KR20110022604A - 표적화 응고 인자 및 그의 사용 방법 - Google Patents

표적화 응고 인자 및 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

혈액 세포 상의 막 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 도메인과 연결된 응고 인자를 포함하는 표적화 응고 인자가 제공된다. 개시된 표적화 응고 인자는 응고 인자의 효율을 증가시키고, 그의 작용 지속기간을 연장하며, 따라서 혈우병 A와 같은 혈액학적 질환의 치료가 향상된다.

Description

표적화 응고 인자 및 그의 사용 방법 {TARGETED COAGULATION FACTORS AND METHOD OF USING THE SAME}
본 출원은 2008년 5월 16일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제61/053,932호의 이익을 청구하며, 상기 가출원의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 증가된 효능을 갖는 표적화 응고 인자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 응고 인자를 그의 생물학적 작용 부위로 선택적으로 표적화함에 의해, 예를 들면 인자 VIII (FVIII)를 적혈구 및 혈소판으로 표적화함에 의해 응고 인자 결핍 장애로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 표적화 응고 인자를 포함하는 제약 조성물도 제공된다.
생물학적 약물의 유효성은 흔히 환자에서, 특히 질환이 약물에 의한 일정한 조절을 필요로 할 때 약물 작용의 지속기간에 의해 제한된다. 따라서, 약동학적 특성의 강화는 임상에서 치료제의 성공에 있어서 약물 효능의 최적화보다 종종 더 중요하다. 반감기를 연장하기 위해 다양한 클리어런스 메카니즘으로부터 약물을 보호하기 위한 한가지 접근은, 약물이 순환 중의 수명이 긴 단백질, 예를 들어 기질 단백질, 또는 세포의 표면, 예를 들어 혈액 세포 또는 내피 세포에 결합하는 것을 촉진하는 표적화 도메인을 첨가하는 것이다. 예를 들어, 혈액 세포 표면으로의 치료 펩티드 또는 단백질의 국소화는 정상적인 클리어런스 메카니즘의 방지에 의해 그의 순환 반감기를 연장하는 것으로 나타났다 (문헌 [Chen, et al., Blood 105(10):3902-3909, 2005]). 광범위한 분자가 표적화 도메인으로서 사용될 수 있다.
또 다른 예로, 틱 (tick) 항응고 단백질의 쿠니츠-타입 (Kunitz-type) 프로테아제 억제제 (KPI) 도메인이 음이온성 인지질, 포스파티딜-L-세린 (PS) 결합 단백질, 아넥신 V (annexin V) (ANV)와 연결되었을 때, 융합 단백질 (ANV-KPI)이 더 활성을 나타내었고, 비-융합 대응물보다 더 높은 생체내 항혈전 활성을 소유한다 (문헌 [Chen, et al., 2005]). ANV가 PS 및 포스파티딜에탄올아민 (PE)에 대해 강한 친화성을 갖기 때문에, 융합 단백질 ANV-KPI가 혈전형성 부위에 존재하는 PS/PE-풍부한 음이온성 막-연관된 응고 효소 복합체로 특이적으로 표적화 될 수 있다는 가설이 세워진다. 유사하게, 동 (Dong) 등은 피브린-선택적 데스모두스 로툰두스 타액 PA α1 (Desmodus rotundus salivary PA α1) (dsPA α1)을 유로키나제 (uPA)/항-P-셀렉틴 항체 (HuSZ51)에 융합시켜, 시험관내 검정에서 비-융합 대응물과 유사한 항혈전 활성으로 완전하게 기능하는 융합 단백질을 생성함을 보고하였다. 또한, 융합 단백질 HuSZ51-dsPA α1은 트롬빈-활성화 인간 및 개 (dog) 혈소판에 결합하는 것으로 나타났다 (문헌 [Dong, et al., Thromb. Haemost. 92:956-965, 2004]).
응고를 방지하고 혈전성 질환과 연관된 사망률을 감소시키는 항응고제를 표적화하는데 있어서 다른 노력들이 있어 왔다 (예를 들어, WO 94/09034를 참조). 더 최근의 발전이 스톨 (Stoll) 등에 의해 입증되는데 (문헌 [Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27:1206-1212, 2007]), 여기서 틱 항응고 펩티드 (TAP)인 인자 Xa (FXa) 억제제가 GPIIb/IIIa 상의 리간드-유도 결합 부위 (LIBS)로 표적화되었고, 당단백질은 항-LIBS 단일 쇄 항체 (scFv항- LIBS)를 통해 혈소판 표면상에서 풍부하게 발현되었다. 융합 단백질 scFv항- LIBS-TAP는 비-표적화 대응물이 실패한 낮은 투여량에서도 효과적인 항응고 활성을 소유하는 것으로 나타났다.
상기 언급된 표적화 항응고제는 특이적 세포를 표적화하도록 고안된 융합 단백질이었다. 스톨 (Stoll) 등에 따르면, 표적화 항응고제는 초강력 응고 저해 활성이 유지되며 항체에 융합된 소분자이어야 한다. 항응고제의 표적화 부위에서 융합 단백질로부터 항응고제의 방출은 논의되지 않았다.
본 발명은 혈액학적 질환, 예를 들면 혈우병의 치료를 위한, 표적화 치료 단백질에 초점을 맞추고 있다. 예를 들어, FVIII 농축물 또는 재조합 FVIII을 갖는 혈우병 A 환자에 대한 현재의 치료는 이들 인자의 높은 비용 및 그들의 상대적으로 짧은 작용 지속기간에 의해 제한된다. 현재 혈우병 A 환자는 필요시 FVIII의 정맥 내 투여에 의해, 또는 일주일에 수회 투여되는 예방 요법으로서 처치된다. 예방 처치를 위해, FVIII는 일주일에 3회 투여된다. 유감스럽게도, 이러한 빈도는 많은 환자에서 엄청난 비용이든다. 사람에서 FVIII의 짧은 반감기때문에, FVIII는 빈번하게 투여되어야 한다. 전장 단백질에 있어서 300 kD를 초과하는 FVIII의 큰 크기에도 불구하고, FVIII는 인간에서 약 11-18 (평균 14) 시간의 반감기를 갖는다 (문헌 [Gruppo, et al., Haemophila 9:251-260, 2003]). 그렇지만, 권장되는 빈번한 복용을 할 여유가 있는 사람의 경우라도, 빈번하게 정맥내로 단백질을 주사하는 것은 매우 불편하다. 더 긴 반감기를 가져서 덜 빈번한 투여를 요하는 FVIII 생성물이 개발될 수 있다면 환자에게 더 편할 수 있을 것이다. 또한, 반감기가 증가된다면 더 적은 투여량이 필요할 것이므로 치료 비용이 감소될 수 있다. 따라서 유효 투여량을 낮출 수 있거나 또는 연장된 작용 지속기간을 가져서 혈우병에 관한 치료 선택을 상당히 개선시킬 수 있는 FVIII의 더 유효한 형태를 갖는 것이 바람직하다.
또한 표적화 FVIII의 지속되는 혈장 농도는 FVIII의 저점을 피크 수준으로 되돌리고, 이에 따라 초기 시점에서 단백질의 초-생리학적 수준을 도입할 필요성을 제거함으로써 불리한 부작용의 정도를 감소시킬 수 있다. 따라서, 현재의 시판 형태보다 지속되는 지속기간 및 더 긴 반감기를 갖는 FVIII의 형태를 갖는 것이 바람직하다.
현재의 요법에 대한 추가적 단점은 환자의 약 25-30％가 FVIII 활성을 저해하는 항체를 발생한다는 것이다 (문헌 [Saenko, et al., Haemophilia 8:1-11, 2002]). 항체 발생은 대체 요법으로서 FVIII의 사용을 방지하며, 이는 상기 환자 군이 심지어 높은 투여량의 재조합 인자 VIIa (FVIIa) 및 면역 내성 요법이 포함된 훨씬 더 비싼 치료법을 찾도록 강요한다. 따라서 덜 면역성인 FVIII 대체 생성물이 바람직하다.
혈우병에 대한 치료를 개선시키는 한가지 접근법은 유전자 요법을 포함한다. 혈소판에서 FVIII 발현을 지시함으로써 FVIII를 혈소판으로 이소성적으로 (ectopically) 표적화하는 것은 혈우병 A의 치료에서 치료 효과를 가질 수 있다 (문헌 [Shi, et al., J. Clin. Invest. 116(7):1974-1982, 2006]).
본 발명의 목적은 비표적화 단백질과 비교하여 연장된 작용 지속기간, 더 나은 효능, 더 적은 부작용 및 적은 면역원성을 갖는 표적화 응고 인자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단백질을 목적하는 특이적 작용 부위로 표적화하여 그에따라 단백질이 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수 있는 다른 잠재적인 생물학적 활성 부위들에 노출되는 것을 감소시킴으로써 치료 단백질 투여와 연관된 부작용을 감소시키는 것이다.
본 발명의 추가의 목표는 표적화 치료 응고 인자를 고안하여 추가의 이점을 얻는 것인데, 여기서 치료 단백질은 생체내 그의 작용 부위의 인접지에서 표적화 도메인으로부터 방출된다. 비-융합, 활성화된 단백질의 높은 국소 농도가 달성될 수 있다. 따라서, 단백질의 치료 효능이 강화된다.
<발명의 개요>
본 발명에 따른 표적화 응고 인자는 혈액 세포 상의 막 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 도메인과 연결된 응고 인자를 포함한다. 또한, 신규 개시된 표적화 응고 인자를 포함하는 제약 조성물 및 표적화 응고 인자를 사용하여 혈액학적 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 추가로, 본 발명은 응고 인자를 사용한 혈액적 질환의 치료의 효율을 증가시키기 위해 신규 개시된 표적화 응고 인자를 사용하여 응고 인자를 혈액 세포의 표면으로 표적화하는 방법을 제공한다.
<도면의 간단한 설명>
도 1: 전장 FVIII ("전체 길이 FVIII") 및 B-도메인 결실 FVIII ("FVIII-BDD-TD")의 개요도, 여기서 표적화 도메인 ("TD")은 B-도메인으로 삽입되고 대부분의 B-도메인은 제거된다.
도 2: B-도메인 시스테인을 통해 FVIII로 연결하기 위한 변형된 시클릭 펩티드 인테그릴린, "BHRF-1" (A) 및 "BHRF-3" (B)의 구조.
도 3: 고정된 GPIIa/IIIb에 대한 BHRF-1 및 BFRH-3의 결합 친화성.
도 4: 고정된 GPIIa/IIIb에 대한 BHRF-1-FVIII 결합 검정.
도 5: FVIII과 비교한 BHRF-1-FVIII의 시험관내 응고 활성.
도 6: 인간 혈소판에 대한 BHRF-1-FVIII의 시험관내 결합.
도 7: 마우스 혈소판에 대한 BHRF-1-FVIII의 시험관내 결합.
본 발명의 기술
본 발명은 응고 인자를 그의 작용 부위 또는 작용 부위들, 예를 들면 혈액 세포로 표적화하는 것에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 혈액 세포 상의 막 단백질에 결합하는 하나 이상의 도메인에 표적화 응고 인자를 연결하여 혈액 세포로 특이적으로 표적화되는 표적화 응고 인자가 제공된다. 응고 인자를 혈액 세포로 표적화하는 도메인은 혈액 세포의 표면 상의 막 단백질에 대해 높은 친화성을 갖는 항체 단편, 항체, 펩티드, 수용체 리간드, 탄수화물, 또는 소분자일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 혈액 세포는 적혈구 또는 혈소판이다.
본원에 사용된 바와 같이, "응고 인자"는 응고 캐스케이드 중 포함되고, 우세한 응고유발 활성을 갖는 단백질을 지칭한다. 응고 인자는 당업계에 충분히 공지되어 있으며, 응고 인자 I, II, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, 및 XIII, 및 단백질 S를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 응고 인자는 혈장으로부터 농축될 수 있거나 재조합적으로 생성될 수 있다. 응고 인자가 재조합적으로 생성되는 경우, 응고 인자는 변이체가 치료적으로 유용하도록 충분한 응고유발 활성이 유지되는 한 천연 구조와 다른 아미노산 구조를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 응고 인자는 기능성 FVIII 폴리펩티드, 예를 들면 혈장으로부터의 FVIII 농축물 또는 재조합적으로 생성된 FVIII, 또는 인자 IX (FIX)이지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 "기능성 FVIII 폴리펩티드"는 생체내 또는 시험관내에서, 예를 들어 혈우병 A를 특징으로 하는 인간 FVIII 결핍을 고칠 수 있는 기능성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합물을 나타낸다. FVIII는 천연 상태에서 다중 분해 또는 처리된 형태를 갖는다. 이들은 전구체인 1쇄 단백질로부터 단백질분해적으로 유도된다. 기능성 FVIII 폴리펩티드는 이러한 단일 쇄 단백질을 포함하고, 또한 인간 FVIII 결핍을 고치는 생물학적 활성을 갖는 상기 다양한 분해 생성물을 제공한다. 대립유전자 변화가 존재할법하다. 기능성 FVIII 폴리펩티드는 그들이 인간 FVIII의 기능성 단편 및 본질적 특징의 인간 FVIII 기능성 활성을 함유하는 한 FVIII의 유도체를 야기하는 모든 이러한 대립유전자 변화, 글리코실화된 형태, 변형 및 단편을 포함한다. 필요한 기능성 활성을 소유하는 FVIII의 이들 유도체는 본원에 기재된 간단한 시험관내 시험에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 또한, 기능성 FVIII 폴리펩티드는 인자 IXa (FIXa), 칼슘, 및 인지질의 존재 하에 인자 X (FX)의 FXa로의 전환을 촉매 할 수 있고, 혈우병 A에 걸린 개체로부터 유도된 혈장 중 응고 결함을 고칠 수 있다. 인간 FVIII 아미노산 서열의 공개된 서열 및 그의 기능성 영역에 대한 공개된 정보로부터, DNA의 제한 효소 절단 또는 인간 FVIII 단백질의 단백질분해 또는 다른 분해를 통해 유도될 수 있는 단편은 당업자에게는 명백할 것이다. 기능성 FVIII 폴리펩티드 내에는 특히, WO 2006/053299에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 전장 인간 FVIII (예, 서열 1 및 서열 2) 및 B-도메인 결실 인자 VIII (예, 서열 3 및 서열 4)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
FVIII의 "응고유발 활성"은 응고 캐스케이드 중 FVIII의 활성을 지칭한다. FVIII 그 자체는 응고를 유발하지 않지만 응고 캐스케이드에서 본질적인 역할을 한다. 응고에서 FVIII의 역할은 FVIIIa로 활성화되는 것이고, 이는 내재적 FX 활성화를 위한 촉매 보조인자이다 (문헌 [Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29 :11-22, 2003]). FVIII는 트롬빈 또는 FXa에 의해 단백질분해적으로 활성화되는데, 이는 FVIII를 본 빌레브란트 (von Willebrand) 인자 (vWf)로부터 해리시키고, 캐스케이드에서 그의 응고유발 기능을 활성화시킨다. FVIIIa의 활성 형태에서, FVIIIa는 혈액 응고의 내재적 경로에서 FX 활성화 효소 복합체를 위한 보조인자로서 기능하며, 이는 혈우병 A에 걸린 환자에서 감소되거나 또는 비기능성이다.
"FIX"는 응고 인자 IX를 의미하며, 이는 인간 응고 인자 IX, 또는 혈장 트롬보플라스틴 성분으로도 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 응고 인자"는 혈액 세포 상의 막 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 도메인과 결합하는 응고 인자를 지칭한다. 표적화 응고 인자는 혈액 세포에 강력하게, 예를 들어 최대 결합의 반값 < 10 nM로 결합해야 한다. 결합은, 예를 들어 표적화 세포 상에서 선택적으로 발현되는 막 단백질에 대한 결합을 통해 표적화 혈액 세포에 특이적이어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이 "도메인" 또는 "표적화 도메인"은 표적 세포 상의 막 단백질에 대해 높은 친화성을 갖는 잔기를 지칭한다. 본 발명에 적합한 도메인은 항체, 혈액 세포의 표면 상의 막 단백질에 높은 친화성을 갖는 항체 단편, 예를 들어 단일 쇄 항체 (svFv) 또는 FAB 단편, 항체 모방체, 및 펩티드 또는 소분자를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다. 한 측면에서, 단일 쇄 항체 단편 또는 펩티드는 그의 코딩 서열이 FVIII 코딩 서열과 연결될 수 있고, 융합 단백질이 재조합 기술을 사용하여 생성될 수 있기 때문에 사용된다.
응고 인자는 화학적으로 또는 융합 단백질의 재조합 발현에 의해 도메인과 결합될 수 있다. 잔기, 예를 들어 아미노, 카르복실, 술피드릴, 히드록실기, 및 탄수화물기를 사용하는 화학적 연결을 비롯한 화학적 연결은 응고 인자 상에 존재하는 화학적 잔기와 표적화 도메인을 함께 연결시켜 달성될 수 있다. 활성화되는 기를 갖거나 또는 활성화되어 이들 잔기를 연결 또는 부착할 수 있는 다양한 동형- 및 이형-이관능성 링커가 사용될 수 있다. 링커 분자 상의 몇몇 유용한 반응성 기는 말레이미드, N-히드록시-숙시남산 에스테르 및 히라지드를 포함한다. 상이한 화학적 조성 및 길이의 많은 다른 스페이서는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 지방족 기, 알킬렌 기, 시클로알킬렌 기, 융합된 아릴 기 또는 연결된 아릴 기, 아미노산 또는 아미노산 유사체 1개 내지 20개 길이의 펩티드 및/또는 펩티딜 모방체를 비롯하여 상기 반응성 기를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 도메인은 생체내에서 응고 인자의 기능성 형태가 그의 표적화 도메인으로부터 방출되거나 또는 방출이 체내에서 응고 인자의 생물학적 활성 부위 또는 그 근처에서 일어나도록 하는 방식으로 응고 인자와 연결될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 응고 인자를 혈액 세포로 표적화하기 위한 도메인에 응고 인자를 부착하는 연결이 절단 또는 분해되어 컨쥬게이트로부터 응고 인자를 방출할 수 있는 것인 표적화 응고 인자가 제공된다.
응고 인자의 그의 컨쥬게이트 형태 (즉, 표적화 응고 인자로부터)로부터의 방출은 표적화 도메인을 응고 인자의 활성화 공정 동안 제거되는 응고 인자 상의 부위로 연결함으로써 또는 혈액 중의 효소에 의해 조절된 방식으로 분해되는 링커를 사용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 일반 혈액 프로테아제 또는 가수분해효소에 대해 감수성이 있는 슈가 중합체 또는 펩티드가 사용될 수 있다. 다양한 이러한 기술이 당업계에 공지되어 있고 전구-약물을 제조하는데 사용되어 왔다. 또한 링커는 응고 인자가 가장 필요한 부위, 예를 들어 트라우마를 통해 발발되는 염증 또는 혈액 응고의 부위에서 특이적으로 절단되도록 추가로 조작될 수 있다. 예를 들어, 링커는 목적 작용 부위에서만 생성되는 특이적 프로테아제, 예를 들어 염증 공정에 의해서 방출되거나 또는 혈액 응고 캐스케이드에 의해 발생되는 프로테아제에 대해 감수성이 있을 수 있다. 치료 단백질의 이러한 선택적 방출은 부작용에 대한 잠재성을 낮출 수 있고, 그의 작용 부위에서 단백질의 효율을 증가시킬 수 있다.
혈액 세포 상의 다양한 막 단백질은 본 발명에 따라 표적화될 수 있다. 그러나 응고 인자를 혈액 세포로 특이적이고 효율적으로 표적화하기 위해서는 표적화 막 단백질이 혈액 세포 표면 상에 풍부하게 존재하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 당단백질 GPIIb/IIIa은 혈소판 표면 상에서 가장 풍부하게 발현되는 분자 중 하나인 것으로 나타난다.
따라서, 한 실시양태에서, 응고 인자는 혈소판 막 단백질, 예를 들어 당단백질 GPIIb/IIIa에 특이적으로 결합하는 도메인을 통해 혈소판으로 표적화된다. 응고 인자를 GPIIb/IIIa로 표적화하는 이러한 도메인의 예는 RGD 함유 펩티드 및 모방체 (선형 펩티드, 뱀 독 펩티드, 및 시클릭 펩티드), 예를 들어 인테그릴린 (RGD 모방체 서열, 동형-아르기닌, 글리신 아스파르트산을 함유함), 비-펩티드 RGD 모방체, 및 항-GPIIb/IIIa 항체를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다. 항체가 표적화 도메인으로서 사용되는 경우, 항체의 단일 쇄 단편, 예를 들어 svFv 또는 FAB 단편이 사용될 수 있다.
FVIII 및 FIX 표적화
FVIII 및 FIX를 혈액 세포, 예를 들어 혈소판 또는 적혈구의 표면으로 표적화하는 것은, 이들 응고 인자의 클리어런스를 늦추는 역할을 할 수 있다. FVIII를 혈소판 세포의 표면으로 표적화하는 것은 특히 흥미롭다. FVIII는 응고 부위에서 축적되는 활성화된 혈소판 세포의 표면 상에서 주로 일어나는 FX의 FIX-매개 활성화에서 중요한 보조인자이다. 혈소판의 활성화는 이들 응고 인자가 그의 표면에 결합하도록 유발하여 FXa 생성을 촉진시키는 복합체를 형성한다. 혈소판은 순환에서 약 9일의 평균 수명을 갖는다. 대조적으로, 혈장 내 FVIII (주로 본 빌레브란트 인자에 결합됨)는 약 14 시간의 반감기를 나타낸다. 따라서, 혈소판에 대한 FVIII의 결합은 분자의 순환 시간을 크게 연장시키는 잠재성을 갖는다. 본 발명에 따라 표적화 도메인을 통해 FVIII를 혈소판 세포의 표면으로 표적화하는 것은 FVIII 작용의 효율을 증가시키고, FVIII의 반감기를 연장할 것이라고 예상된다.
GPIIb/IIIa에 더하여, 혈소판 상의 다른 단백질이 표적화 FVIII, 예를 들어 GP1a 및 아넥신 V에 대한 수용체로서 작용할 수 있다. 당단백질 GPIIb/IIIa는 그가 혈소판 표면 상에서 가장 풍부하게 발현되는 분자들 중의 하나이므로 바람직하다. 혈액 중 GPIIb/IIIa의 농도는 혈소판 상의 그의 표면 밀도를 기준으로 약 75 nM인 것으로 추정된다. 이는 FVIII의 치료 적용 후에 달성되는 FVIII의 최대 농도의 100-배를 초과하는 농도를 나타낸다 (Cmax 약 0.7 nM). 따라서, FVIII의 혈소판으로의 표적화는 혈소판 상의 이용가능한 GPIIb/IIIa 부위들의 대략 1％ 또는 그 미만을 차지할 것이다. 이러한 낮은 점유 수준으로는 혈소판 기능을 변화시키는 것을 기대할 수 없고, 이러한 기능 변화에는 훨씬 큰 비율 (즉, >50-60％)의 GPIIb/IIIa 분자가 차단되는 것이 필요하다. 또한 고농도의 GPIIb/IIIa는 혈소판 표면에 대한 표적화 FVIII의 결합 평형을 움직일 것이다.
어떤 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, FVIII를 GPIIb/IIIa로 표적화하는 것은 또한 응고 인자 중 일부가 혈소판의 열린 소관내 계를 통한 GPIIb/IIIa의 세포내이입 및 재생을 통해 내재화 될 수 있다는 이점을 가질 수 있다. 이 FVIII는 알파 과립 중에 이를 수 있고, 혈소판 활성화시 재방출될 수 있어서, 응고에 필요한 경우에 FVIII의 공급원을 제공한다. 혈소판으로 표적화된 결합된 FVIII 또는 내재화된 FVIII는 많은 환자에게서 존재하는 억제제 (예, FVIII 항체)로부터 보호될 수 있다. 따라서, 표적화 FVIII는 이 중요한 환자 군에 치료 선택권을 제공할 수 있다.
응고를 촉진하는 표적화 FVIII의 경우에, 분자는 기능성 형태 (FVIIIa)로 프로세싱될 수 있어야 하고, 그의 GPIIb/IIIa 결합 부위로부터 방출될 수 있어야 한다. 한 실시양태에서, 이것은 GPIIb/IIIa 표적화 도메인을 FVIII의 B-도메인에 연결시켜 달성된다. B-도메인은 트롬빈 또는 FXa 매개된 단백질분해에 의해 응고유발성 환경에서 제거되고, 성숙한 FVIIIa 분자를 생성한다. 따라서, 활성화시, FVIIIa는 GPIIb/IIIa로부터 방출될 것이고, FX 활성화 복합체의 형성을 위해 이용가능할 것이다.
FVIII 및 표적화 도메인 사이의 연결은 본원에 기재된 가교결합 접근법을 사용하여 아미노, 술프히드릴, 카르복실 기 및 카르보닐 기를 비롯한 FVIII 상의 반응성 기에 표적화 도메인을 공유 결합시켜 달성될 수 있다. 또한 표적화 도메인은 FVIII 분자의 B-도메인 상에 대부분 존재하는 탄수화물에 결합될 수 있다. 예를 들어, 퍼요오데이트를 이용한 FVIII의 약한 산화로 탄수화물 쇄 상에서 알데히드가 생성된 다음, 이는 아민 또는 히라지드와 반응될 수 있고, 이어서 임의로 환원에 의해 더 안정한 연결을 형성한다.
유리 시스테인은 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)과의 약한 환원을 통해 재조합 FVIII의 B-도메인 상에서 선택적으로 발생될 수 있으며 유리 시스테인과 반응하는 표적화 도메인, 예를 들어 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜, 또는 말레이미드 잔기를 함유하는 도메인과 B-도메인의 특이적 연결을 허용한다. 또한, FVIII는 아미노산 잔기를 시스테인으로 대체하여 표적화 도메인에 부착하기 위한 특정적 위치를 제공하도록 변형될 수 있다. B-도메인 결실 FVIII이 사용되면, 예를 들어 WO 2006/053299에 개시되어 있는 B-도메인 결실 FVIII의 다양한 시스테인 뮤테인은 표면 시스테인 잔기에서 화학적 결합을 통해 표적화 도메인과 FVIII를 연결시키는데 사용될 수 있다. 아미노산 잔기를 시스테인으로 대체하여 변형될 수 있는 아미노산 잔기의 예는 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1911, 2091, 2118, 및 2284를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다 (아미노산 잔기는 전장 FVIII의 서열에서 그의 위치에 의해 지정되었음).
응고 인자는 또한 재조합 기술을 사용하여 표적화 도메인과 결합될 수 있다. 숙주 세포는 FVIII 및 표적화 도메인의 융합 단백질을 포함하는 벡터로 트렌스펙션될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화 도메인은 FVIII의 B-도메인으로 삽입될 수 있고, B-도메인의 대부분은 결실되어 B-도메인의 일부만이 카르복시 및 아미노 말단에 남게 됨으로써 B-도메인의 생물학적 프로세싱이 그를 전장 분자로부터 결실시키는 것을 허용한다. 도 1에 예시된 바와 같이, 생리학적 조건 하에 B-도메인의 생물학적 프로세싱 및 제거를 허용하는 B-도메인의 남은 부위가 명시된다.
숙주 세포주는 응고 인자를 생성하는데 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 세포, 예를 들어 FVIII CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, 및 HKB11 세포 (인간 배아 신장 세포주, HEK293 및 인간 버킷(Burkitt) B 세포 림프종 라인, 2B8의 하이브리드)일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
많은 도메인이 FVIII에 화학적으로 연결되거나 또는 FVIII와 함께 재조합적으로 발현되어 FVIII를 혈소판의 표면 상의 GPIIb/IIIa로 표적화할 수 있다. 이러한 도메인의 예는 GPIIb/IIIa에 대한 항체, RGD 펩티드, 펩티드 모방체, 또는 소분자 모방체 (GPIIb/IIIa를 표적화함)를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다. 항체, 예를 들어 GPIIb/IIIa를 표적화하는 단일 쇄 항체 (svFv) 또는 FAB 단편은 표적화 도메인으로서 특히 유용하다.
FVIII의 B-도메인은 FVIII 기능의 소실 없이 제거될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 추가로, FVIII의 다양한 B-도메인 말단절단된 형태 및 다른 단백질 도메인과의 B-도메인 융합물은 기능적으로 활성인 FVIII를 산출할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 한 측면에서, 본 발명은 활성 FVIII을 산출하는 분자의 정상적인 프로세싱을 차단하지 않고 FVIII의 B-도메인에 삽입하거나, 그를 대체하거나 또는 그를 부분적으로 대체하도록 조작될 수 있는 표적화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여, FVIII 분자가 생성될 수 있고, 여기서 단일 쇄 항체 단편은 FVIII의 B-도메인의 C-말단에 융합된다. 별법으로, svFv 단편은 또한 FVIII의 B-도메인의 전체 또는 일부를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 이는 svFv 단편을 코딩하는 DNA 서열을 프레임에서 B-도메인 코딩 서열 뒤쪽에 삽입하거나 또는 B-도메인의 코딩 서열 일부 또는 전체를 대체하여 달성될 수 있다. 이 전략은 FVIII의 정상적인 단백질분해 활성화에 필요한 트롬빈 절단 부위을 보존할 것이다. 혈소판으로 효율적으로 국소화하는 GPIIb/IIIa에 대한 다양한 항체가 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Schwarz, et al., Circ. Res. 99(1):25-33, 2006; Jacobin, et al., Clin. Immunol. 108(3):199-210, 2003; Christopoulos, et al., Blood Coagul. Fibrinolysis 4(5):729-37, 1993; and Chung, et al., FASEB J. 18(2):361-363, 2004]을 참조함).
마찬가지로, RGD 또는 RGD 모방체 함유 펩티드는 이러한 펩티드의 다수가 GPIIb/IIIa에 대해 높은 결합 친화성을 갖는다고 기재되어 왔기 때문에 FVIII를 표적화하는데 있어서 유용한 리간드이기도 하다. 이들은 선형 펩티드, 뱀 독 펩티드, 및 시클릭 펩티드를 포함한다. 비-펩티드 RGD 모방체도 사용될 수 있다. 항체 단편과 유사하게, RGD 펩티드는 화학적으로 FVIII에 결합될 수 있다. 별법으로, RGD 서열은 B-도메인 코딩 서열로 삽입될 수 있거나, 또는 전체 또는 부분에서, FVIII의 B-도메인 코딩 서열을 대체하기 위해 사용될 수 있고, 재조합 DNA 기술을 사용하여 발현될 수 있다.
표적화 FIX가 유사한 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적화 도메인은 FIX 분자의 활성화 도메인 (아미노산 잔기 191-226 또는 145-180, 선호도에 따름, 즉 +/- 신호 서열)에 연결될 수 있고, 이는 FIX에서 FIXa로의 활성화에서 단백질분해적으로 제거된다. 도메인은 FVIII에 대해 상기 논의한 바와 같이 예를 들어 활성화 도메인에서 술프히드릴, 아민, 및 카르복실 기와 같은 아미노산 측쇄기와 반응성인 가교-링커를 사용하여 화학적으로 연결될 수 있거나 또는 탄수화물 쇄를 통해 연결될 수 있다. 융합 분자는 또한 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 여기서 표적화 도메인의 아미노산 서열은 FIX 활성화 펩티드로 삽입되거나 또는 활성화 펩티드 서열의 일부를 대체한다. 삽입된 표적화 도메인 서열은 단일 쇄 항체, 또는 다른 혈소판 결합 펩티드 서열, 예를 들어 RGD 결합 펩티드를 코딩할 수 있다.
제약 조성물 및 용도
또한 본 발명은 치료상 유효량의 본 발명의 표적화 응고 인자 및 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. "제약상 허용되는 부형제 또는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화하는데 도움을 주기 위해 활성 성분에 첨가될 수 있는 물질이고, 환자에서 유의한 불리한 독성학적 효과를 야기하지 않는다. 이러한 부형제 또는 담체의 예는 당업자에게 충분히 공지되어 있으며, 물, 슈가, 예를 들어 말토스 또는 수크로스, 알부민, 염 등을 포함한다. 다른 부형제 또는 담체가 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000)]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 필요한 환자에 대한 효과적인 투여에 적합한 제약상 허용되는 조성물을 제조하기 위해 적합한 양의 부형제 또는 담체와 함께 유효량의 표적화 응고 인자를 함유할 것이다.
예를 들어, 컨쥬게이트는 출혈 에피소드의 중증도에 따라 다양할 수 있는 투여량으로 혈우병 A로 고통받고 있는 대상체에 비경구로 투여될 수 있다. 정맥내로 투여되는 평균 투여량은 수술전 적응증의 경우에 킬로그램 당 40 단위, 작은 출혈의 경우에 킬로그램 당 15 내지 20 단위, 8-시간의 기간에 걸쳐 투여되는 유지 투여의 경우 킬로그램 당 20 내지 40 단위의 범위이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 혈액학적 질환의 치료가 필요한 환자에게 치료상 유효량의 상기 언급된 표적화 응고 인자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료상 유효량"은 혈류 또는 표적 조직 내에서 표적화 인자 (또는 표적화 형태로부터 방출된 상응하는 컨쥬게이트되지 않은 인자)의 목적 수준을 제공하기 위해 필요한 표적화 응고 인자의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 조성물의 성분 및 물리적 특징, 대상 환자 집단 및 개별 환자 고려사항 등을 비롯하지만 이들로만 한정되지는 않는 다수의 인자에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "환자"는 의학적 관리 및/또는 치료를 받는 인간 또는 동물 개체를 지칭한다.
본원에 기재된 폴리펩티드, 물질, 조성물, 및 방법은 본 발명의 대표적인 실시예를 의미하고, 본 발명의 범위가 실시예의 범위에 의해 제한되지는 않는다고 이해될 것이다. 본 발명은 개시된 폴리펩티드, 물질, 조성물 및 방법을 변화시켜 실시될 수 있고, 이러한 변화가 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
하기 실시예는 본원에 기재된 본 발명을 예시하기 위해 제시되지만 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
본 발명을 더 잘 이해하기 위해서 하기 실시예를 제시한다. 이들 실시예는 예시의 목적만을 갖고, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 언급된 모든 출판물은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1: GPIIb / IIIa 결합에 대해 높은 친화성을 갖는 변형된 RGD 펩티드
시클릭 펩티드는 강력하고 선택적으로 GPIIb/IIIa에 결합하는 것으로 기재되어 왔다. 이러한 펩티드 중 하나인 인테그릴린은 인테그릴린이 GPIIb/IIIa에 선택적으로 결합할 수 있는 것으로 나타났기 때문에 FVIII과 연결하기 위한 표적화 도메인으로서 사용되었다. 인테그릴린은 단백질내 유리 시스테인 잔기에 선택적으로 결합할 수 있는 말레이미드 잔기로 종결되는 짧은 PEG 링커의 첨가에 의해 변형시켰다. 변형된 인테그릴린은 링커만을 갖는 BHRF-1 (도 2A), 및 링커 및 플루오레세인 (FITC)을 갖는 BHRF-3 (도 2B)으로 지칭하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 변형된 인테그릴린은 이들이 고정된 GPIIa/IIIb에 결합하는 피브리노겐 (Fbn)을 강력하게 차단하였기 때문에 GPIIb/IIIa에 대해 친화도를 보유한다.
GPIIb-IIIa에 대한 펩티드 결합은 화합물을 시험하여 피브리노겐 결합의 경쟁을 측정하는 고상 결합 검정을 이용하여 측정하였다. 검정을 하기와 같이 수행하였다. 정제된 GPIIb-IIIa (Innovative Research, Novi, MI)을 96-웰 임뮬론 (Immulon)-B 플레이트 상에 0.mL/웰 x 2 ㎍/mL로 코팅하고, 완충액 A (20 mM 트리스 (Tris) pH 7.5, 0.15 M NaCl, 및 각각 1 mM의 MgCl2, CaCl2, 및 MnCl2)에서 희석하였다. 밤새 4˚C에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 완충액 B (50 mM 트리스 pH 7.5, 0.1 M NaCl, 및 각각 1 mM의 MgCl2, CaCl2, 및 MnCl2)에서 3.5％ BSA와 함께 30˚C에서 1 시간 동안 차단하였다. 완충액 B로 3 회 세척 후, 희석된 펩티드 또는 단백질 용액을 0.1％ BSA/완충액 B 중에서 3.5 nM 비오티닐화 피브리노겐과 합하고, 웰로 첨가하여 2 hr 동안 30˚C에서 인큐베이션하였다. 세척 후 (3 회, 완충액 B), 1:4000 스트렙타비딘-서양고추냉이 (streptavidin-horseradish) 과산화효소 (HRP)를 30˚C에서 1시간 동안 첨가하였다 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). 최종 세척 단계 (3 회, 완충액 B) 후, 플레이트는 울트라 (Ultra) TMB (3,3’,5,5’-테트라멘틸벤지딘) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)로 5 분 동안 발생시키고, 같은 부피의 2 M 황산으로 정지시켰다. 플레이트 흡광도는 450 nm에서 판독하고, IC50 값은 4-파라미터 로지스틱 피트를 사용하여 결정하였다.
그 후, 변형된 인테그릴린 펩티드 (BHRF1)를 FVIII의 B-도메인에 위치하는 시스테인 (Cys) 잔기를 통해 FVIII와 결합시켰다.
실시예 2: FVIII 에 대한 GPIIb / IIIa 결합 펩티드의 결합
전장 FVIII의 폴리펩티드 서열은 WO 2006/053299에 개시되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 서열 1, 서열 2 참조).
FVIII 의 농도 및 유리 술프히드릴 기의 캡 제거
하기와 같이 재조합 FVIII의 B-도메인에 위치하는 Cys 잔기는 단백질 발현 동안 배지에 존재하는 시스테인에 의해 캡을 씌울 수 있지만 환원제, 예를 들면 TCEP로의 처리에 의해 쉽게 제거될 수 있다. FVIII (20 mL)를 해동하고, 두 개의 아미콘 (Amicon (등록상표))-15 카트리지 (Millipore, Billerica, MA)에서 농축하고, 2000 x g (약 3153 rpm)에서 25분 동안 냉각 조건하에 회전시켰다. 2.8 mL 잔류물의 농도는 나노드롭 (NanoDrop (등록상표)) 분광광도계 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 A280에서 약 0.8-0.9 mg/mL였다. 그 후, 10 mL 제바 (Zeba) 탈염 카트리지를 사용하여 완충액을 교환하고, 50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2 및 100 ppm 트윈 (Tween (등록상표))-80 (폴리옥시에틸렌솔비탄 모노올레에이트)으로 예비-평형시켰다. 0.88 mg/mL의 농도로 2.8 mL의 단백질 용액을 수득하였다. 그 후, TCEP를 0.68 mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 4˚C에서 약 3 시간 동안 부드럽게 회전시켰다. TCEP를 2 연속의 제바 카트리지 스핀에 의해 제거하고, FVIII를 펩티드의 첨가 전에 30 분 이상 동안 재산화하도록 하였다. TCEP 제거 후, FVIII 농도를 0.768 mg/mL ("KG-R")에서 측정하였다.
RGD 표적화 펩티드의 결합
변형된 인테그릴린 펩티드 BHRF-1를 FVIII에 결합하기 위해, 0.294 mg의 펩티드 (M.W. 1225)를 48 ㎕ 건조 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 첨가하여 5 mM 스탁 용액을 제조하였다. 그 후 이 스탁 용액 (34.4 ㎕)을 2.8 mL KG-R에 첨가하였다. 반응을 80 분 후 등-몰 양의 시스테인을 첨가하여 켄칭시켰다. 그 후 반응 혼합물을 시작 트리스 완충액 (2 리터)에 대하여 광범위하게 투석하였다. BHRF-1-FVIII의 최종 농도는 0.74 mg/mL이고, 수율은 2 mg이었다. BHRF-3-FVIII를 제조하기 위해 유사한 절차를 또한 사용하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 변형된 인테그릴린 펩티드, BHRF-1 및 BHRF-3은 이들이 고정된 GPIIa/IIIb에 결합하는 피브리노겐 (Fbn)을 강력하게 차단하였기 때문에 GPIIb/IIIa에 대한 친화도를 유지하였다. BHRF-1에 결합된 FVIII (FVIII-BHRF-1)는 고정된 GPIIb/IIIa에 결합하는 피브리노겐을 저해하는 높은 효능을 나타내었다 (IC50 = 0.043 +/- 0.05 nM (N = 3)). 이는 모 BHRF-1 펩티드보다 훨씬 더 강력하였다. 결과를 표 1에 나타냈다.
컨쥬게이트 잔기 nM (N)
인테그렐린 1.3 +/- 1.0 4
BHRF-1 (+ 링커) 1.2 +/- 0.6 2
BHRF-3
(+ 링커 + FITC)		 1.5 +/- 1.3 3
B-도메인 결실 FVIII 에 대한 RGD 표적화 펩티드의 결합
B-도메인 결실 FVIII ("BDD")을 결합에 사용하는 경우, WO 2006/053299에 개시된 바와 같은, B-도메인 결실 FVIII의 다양한 Cys 뮤테인을 사용하여 BDD를 표적화 도메인, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 변형된 RGD 펩티드에 결합시킬 수 있었다.
실시예 3: 고정된 GPIIb / IIIa 에 대한 BHRF -1- FVIII 결합
GPIIb/IIIa에 대한 BHRF-1-FVIII의 결합 활성을 시험하기 위해, 비오티닐화 GPIIb/IIIa를 스트렙타비딘 (streptavidin) 플레이트 상에 고정하고, 결합 완충액 (50 mM 트리스, pH 7.5, 100 mM NaCl2, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2 및 1 mg/mL BSA) 중의 BHRF-1-FVIII 또는 변형된 FVIII로 처리하였다. 비결합 단백질을 결합 완충액으로 3 회 세척하여 제거하였다. 검정 완충액 (25 ㎕)을 플레이트에 가하고, 발색성 검정 키트 (코아테스트 (Coatest (등록상표)) SP4, Chromogenix, Lexington, MA)를 사용하여 FVIII 활성을 결정하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, BHRF-1-FVIII의 결합은 존재했겠만, 비변형된 FVIII의 결합은 아주 적게만 검출되었다. BHRF-1-FVIII의 증가된 결합은, GPIIb/IIIa에 결합하는 BHRF-1에 대해 경쟁하는 시클릭 RGD 펩티드 (GpenGRGDSPCA; 서열 5)의 첨가에 의해 완전하게 제거되었다. 또한, GPIIb/IIIa가 플레이트 상에 고정되지 않은 경우, 각각의 단백질의 낮은 배경 수준만이 결합하였다. 이들 데이터는 BHRF-1-FVIII가 펩티드 표적화 도메인을 통해 GPIII/IIIIa로 표적화될 수 있음을 보여주었다.
컨쥬게이트되지 않은 FVIII가 BHRF1-FVIII의 제제에서 제거되지 않았기 때문에, 컨쥬게이트되지 않은 FVIII의 존재량을 결정하기 위해 실험을 수행하였다. BHRF1-FVIII 활성은 고정된 GPIIb/IIIa의 초과 수준을 함유하는 비드를 사용하여 소모시켰다. BHFR1-FVIII 활성의 대략 80％가 소모될 수 있었는데, 이는 제제 중 FVIII 활성의 약 20％가 컨쥬게이트되지 않은 FVIII로부터 기인한다는 것을 암시한다.
실시예 4: BHRF -1- FVIII 및 FVIII 를 이용한 시험관내 전혈 응고 활성 검정
지혈 활성에 있어서 BHRF-1-FVIII의 혈소판 결합의 효과를 평가하기 위해, 그의 활성을 문헌 [Landskroner, et al., (Haemophilia 11:346-352, 2005)]에 기재된 바와 같은 회전 혈액응괴분석기 (펜타팜 (Pentapharm) GmbH사의 ROTEM (등록상표)) 시스템을 사용하여 컨쥬게이트되지 않은 FVIII의 것과 비교하였다. 응고 활성의 측정, 예를 들어 코아테스트 (등록상표) 발색성 검정 또는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 검정과 달리, ROTEM (등록상표) 검정은 혈소판의 기능에 따라 달라지고, 따라서 혈소판에 결합하는 BHRF-1-FVIII의 효과를 나타낼 수 있다. 검정을 수행하기 위해, 시트르산첨가된 혈우병 A 마우스 전혈을 같은 투여량의 BHRF-1-FVIII (1 mIU) 또는 컨쥬게이트되지 않은 FVIII (코아테스트 (등록상표) 발색성 검정에 기초함)과 실온에서 혼합하였다. 자동화된 피펫으로 처리된 혈액 300 ㎕를 외인성 활성제 (NATEM) 없이 20 ㎕ CaCl2 (200 mmol)를 갖는 ROTEM (등록상표) 컵에 분배하여 샘플을 경화시켰다. 마지막 피펫팅 직후에 측정을 시작하고, 혈액 응고 형성을 37℃에서 2 시간 (7200 초)동안 연속하여 모니터링하였다.
지혈을 위한 ROTEM (등록상표) 분석 파라미터는 응고 시간 (CT), 측정의 개시 후 2 mm의 응고 견고성을 얻기 위해 필요한 시간, 응고 형성 시간 (CFT), 2 mm의 응고 견고성부터 20 mm의 응고 강도까지의 시간, 및 α-각, 응고 형성 속도를 포함하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, BHRF-1-FVIII는 컨쥬게이트되지 않은 FVIII의 같은 투여량 (발색성 검정을 기준으로)보다 ROTEM (등록상표) 검정에서 응고를 형성하기 위한 시간이 덜 필요했고, 이는 응고의 높은 효율을 암시하였다. CT에서의 차이는 약 400 초이고, 이는 FVIII 표준 그래프를 기준으로 대략 2-3 배 더 많은 FVIII 활성에 해당하였다.
표적화 응고 인자의 지혈 활성 및 약동학적 파라미터는 혈우병 A 마우스 모델을 사용하여 생체내 평가할 수 있었다. 표적화 응고 인자는 미부 정맥의 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있었다. 치료 후 여러 시점에서, 혈액은 구연산 나트륨%중에 수집될 것이고, 지혈 활성은 주입 후 48시간의 기간에 걸쳐 ROTEM를 사용하여 측정될 것이며, 이는 마우스에서 6을 초과하는 FVIII (t1 /2)의 반감기와 등가이다.
실시예 5: 인간 및 마우스 혈소판에 대한 시험관내 결합 검정
인간 혈소판에 대한 FVIII - BHRF -1의 결합
14 mL 혈장 중 5 x 109 혈소판/튜브로 올셀(Allcells) (Emeryville, CA)로부터 인간 혈소판을 얻었다. 혈소판 및 모든 세척물, 완충액, 시약, 및 원심분리기를 실온으로 가온하고, 실험 과정 동안 실온에서 유지하였다. 혈소판에 대한 세척 완충액 (WB)은 20 mM HEPES, 0.5％ BSA, 및 50 ng/mL PGE1 및 2.5 U/mL 아피라제(apyrase)가 보충된 티로드(Tyrode) 완충액 (pH 7.4)이었다.
세포를 25 ℃에서 15 분 동안 700 x g로 원심분리한 다음, 상등액을 주의해서 제거하고, 14 mL WB를 가하였다. 세포를 WB 중에 서서히 재현탁시키고, 기술한 바와 같이 원심분리하였다.
제2 원심분리 후, 상등액을 제거하고, 혈소판을 15 mL WB 중에 재현탁시켰다. 이 시점에서, 세포를 각각 5 mL의 3개의 동등 분액으로 분리하였다. 3개의 분액을 앞서 기술한 바와 같이 원심분리하고, 이후 3개의 혈소판 펠릿을 하기 중 어느 하나에 재현탁시켰다:
A. 5 mL 결합 완충액 + 5 mg/mL BSA (BBB, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM 각각 CaCl2, MgCl2, 및 MnCl2)
B. FVIII이 결여되어 있지만 vWF는 존재하는 HemA 혈장 5 mL
C. FVIII 및 vWF 둘 다가 결여된 면역-결핍 혈장 5 mL.
완충액 (A) 또는 혈장 (B 또는 C)의 경우, 하기 조건이 사용되었다:
1. 완충액/혈장 단독 + 2.5 nM BHRF-1-FVIII (약 20％의 컨쥬게이트되지 않은 FVIII 함유 (실시예 3 참조))
2. 완충액/혈장 + 혈소판 + 2.5 nM BHRF-1-FVIII (약 20％의 컨쥬게이트되지 않은 FVIII 함유)
3. 완충액/혈장 단독 + 2.5 nM 재조합 FVIII
4. 완충액/혈장 + 혈소판 + 2.5 nM 재조합 FVIII
각 조건 1-4에서, 100 ㎕의 A, B, 또는 C를 실온에서 미량원심분리기(microfuge) 튜브에 피펫팅하고, 이어서 BHRF-1-FVIII 또는 컨쥬게이트되지 않은 FVIII을 튜브에 첨가하였다. 튜브를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 (진탕 없이) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 튜브를 최대 속도 (16,000 rpm)로 5 분 동안 원심분리하여 혈소판을 펠릿화하였다. 상등액을 수집하여 FVIII 활성에 대하여 검정하였다. 상등액 중 활성의 양은 결합되지 않은 FVIII 또는 BHRF-1-FVIII의 양을 반영한다. 데이터는 모든 조건에서 인간 혈소판에 대한 BHRF1-FVIII의 결합을 입증하였다 (도 6에 나타냄). BHRF-1-FVIII이 조건 A 및 C에 대하여 대략 20％ 컨쥬게이트되지 않은 FVIII을 함유하기 때문에, 데이터는 높은 퍼센트의 컨쥬게이트가 결합되었음을 암시한다. 조건 A 및 B에 대해 관찰된 FVIII의 결합은 없었지만, 조건 C에서는 FVIII 활성의 35％가 결합되었다. 도는 또한 FVIII의 35％ 비-특이적 결합에 대하여 정정된 조건 C에 대한 나머지 FVIII 활성의 수준이 상기 조건에서 관찰되었음을 보여준다 (즉, 출발 FVIII 활성은 결합된 페센트로 계산하여 35％ 만큼 감소하였다).
마우스 혈소판에 대한 FVIII - BHRF -1의 결합
BHRF-1-FVIII은 또한 도 7에 나타낸 바와 같이 마우스 혈소판에 결합되었다. 시트레이트화된 마우스 혈액을 200 x g에서 15 분 동안 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 수확한 것을 제외하면, 유사한 결합 검정을 인간 혈소판에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다. PRP를 시트레이트 세척 완충액 (11 mM 글루코스, 128 mM NaCl, 4.3 mM NaH2PO4, 7.5 mM Na2HPO4, 4.8 mM Na-시트레이트, 2.4 mM 시트르산, 0.35％ BSA, pH 6.5) + 50 ng/mL PGE1으로 희석시키고, 시트레이트 세척 완충액 + 50 ng/mL PGE1 (1200 x g로 10 분 동안 원심분리함)으로 2회 세척하였다. 마지막으로 혈소판을 결합 완충액 (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1mM 각각의 CaCl2, MgCl2, 및 MnCl2) + 5 mg/mL BSA 중에 재현탁시켰다. 컨쥬게이트되지 않은 FVIII 및 BHRF-1-FVIII을 혈소판에 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 후, 혈소판을 원심분리에 의해 제거하고, 상등액 중 결합되지 않은 FVIII 활성을 결정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 컨쥬게이트되지 않은 FVIII 활성의 59％가 혈소판에 결합하였다. BHRF-1 펩티드를 통한 혈소판에 대한 첨가된 BHRF-1-FVIII 활성 결합의 퍼센트를 계산하기 위해, 출발 FVIII 활성의 양을 59％ 만큼 정정하여 FVIII의 비-특이적 결합 (펩티드를 통해 일어나지 않음)의 수준을 반영하였다. BHRF-1-FVIII에 대한 정정된 값은 31％가 결합되지 않았다 (69％가 결합됨). 100 uM 인테그릴린이 펩티드 결합을 위해 첨가 완료되었을 때, 결합되지 않은 활성은 82％가 결합되지 않은 것으로 상승하였다 (18％가 결합됨) (또한, 비특이적 FVIII 결합에 대해 정정됨). 이들 데이터는 BHRF-1-FVIII이 BHRF-1 표적화 도메인을 통해 마우스 혈소판에 결합할 수 있음을 입증한다.
실시예 6: 약동학적 연구
혈우병 마우스 A에 대한 주사 후 다양한 시간에서 혈액 중 FVIII의 수준을, 전혈 응고 검정, 예를 들어 전술한 로템 (ROTEM (등록상표))을 이용해서 결정하였으며, 이는 두 혈장 중의 세포 (예, 혈소판)에 결합된 FVIII 활성을 반영한다.
실시예 7: FVIII 활성의 평가를 위한 발색 검정
정제된 단백질 및 컨쥬게이트의 FVIII 활성을, 코아테스트 (Coatest (등록상표) SP 검정 키트 (Chromogenix, Lexington, MA)를 사용하여 평가하였다. 검정은 제조자의 지시에 따라 96-웰 플레이트 포맷으로 수행하였다. 요컨대, FVIII 또는 컨쥬게이트를 함유하는 희석된 샘플을 순서대로 활성화된 FIX/FX/인지질의 혼합물에 이어서 25 mM CaCl2 및 발색 기질 S-2765/I-2581과 합하였다. 각 시약 첨가 사이에서, 샘플을 37 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 발색 기질의 최종 첨가 후, 20％ 아세트산으로 5 분 후에 반응을 중단시키고, 플레이트 흡광도를 405 nm에서 판독하고, 490 nm 배경값에 대하여 정규화하였다. 샘플 흡광도를 WHO/NIBSC 혈장-유래 FVIII 표준 그래프 (0.3-40 mIU/mL의 작용 범위를 가짐) 에 대하여 측정하였다.
실시예 8: 혈우병 마우스에서의 생체내 효능 검정
혈액 응고를 촉진하는데 있어서 표적화 FVIII 분자의 효능을 나타내고 이러한 효과의 지속기간을 평가하기 위해, 혈우병 (HemA) 마우스를 이용하는 미부 클립 손상 또는 미부 정맥 횡절단 모델을 이하 기술하는 바와 같이 사용할 수 있다.
미부 클립 손상 모델
시험 샘플을 미부 정맥 주사에 의해 마우스에게 투여하였다. 투여 후, 케타민/크실라진 (100 mg/kg, 10 mg/kg)을 복강내 (IP) 투여하여 마우스를 마취시켰다. 동물이 완전히 마취되었을 때, 미부를 13 mL의 37 ℃ 예비-가온된 염수 중에 대략 10 분 동안 개별적으로 위치시켰다. 예리한 수술칼로 미부 절단을 수행하고, 미부를 9 mL의 37 ℃ 가온 염수가 들어 있는 신규 튜브에 즉시 위치시켰다. 혈액을 30 분 동안 계속 수집하였다. 혈액 소실 부피를 혈액 수집 튜브의 중량 획득에 의해 측정하거나 또는 혈액 수집 튜브 중 혈액/염수 혼합물의 광학 밀도를 측정하였다.
미부 정맥 횡절단
HemA 수컷 마우스들을 그들의 체중에 의해 여러 처리군들로 무작위로 나누었다. 마우스에게 미부 정맥 트랜스액션(transaction) 전 24 시간에 미부 정맥 주사에 의해 투여하였다. 미부 정맥 횡절단에 앞서, 50 ㎍/kg의 케타민 및 1 mg/kg의 메데토미딘을 함유하는 칵테일로 마우스를 마취시켰다 (IP). 프렌치 카테터를 사용해서 2.7 mm의 직경으로 미부에 마킹하였다. 1 mg/kg의 아티파메졸을 IP 주사로 투여하여 메데토미딘의 마취 효과를 보존하였다. 미부 정맥을 수술칼(scalpel) 날로 횡절단하였다. 이어서, 미부를 37 ℃ 염수 튜브에 액침시키고, 튜브를 회전시켜 절단부로부터 혈액을 세정 제거하였다. 염수가 너무 불투명해져 가시화될 수 없게 되었을 때, 미부 출혈이 멈출 때까지 신규 튜브로 대체하였다. 출혈을 중단시키는데 걸리는 시간을 급성 응고 시간으로 기록하였다. 이어서, 마우스를 그의 개별 클린 케이지로 복귀시키고, 흰색 종이를 4 x 8 인치 가열 패드의 상부에 배치하였다. 재출혈 및 빈사(moribund) 시간을 다음 9-11 시간 동안 과도한 혈액 소실에 대하여 매시간 모니터링하였다.
실시예 9: 표적화 FVIII 의 재조합 발현
한 실시양태에서, HKB11 세포를, 단백질-무함유 배지에서 37 ℃의 5％ CO2 인큐베이터 내에서 오비탈 쉐이커 (100-125 rpm) 상에서 현탁 배양으로 배양하고, 0.25 내지 1.5 x 106 세포/mL의 밀도로 유지하였다. HKB11 세포를 트렌스펙션을 위해 원심분리에 의해 수집한 다음, 발현 배지, 예를 들어 프리스타일 (FreeStyle (상표명)) 293 발현 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 1.1 x 106 세포/mL로 재현탁시켰다. 세포를 6-웰 플레이트 (4.6 mL/웰)에 시딩하고, 37 ℃ CO2 인큐베이터 내의 오비탈 로테이터 (125 rpm) 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 대하여, 5 ㎍의 플라스미드 DNA를 0.2 mL의 옵티 (Opti)-MEM (등록상표) I 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 혼합하였다. 각각의 웰에 대하여, 7 ㎕의 293펙틴(fectin (상표명)) 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 0.2 mL의 옵티-MEM (등록상표) I 배지와 서서히 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 293펙틴 (상표명)을 희석된 DNA 용액에 첨가하고, 서서히 혼합하고, 실온에서 20-30 분 동안 인큐베이션한 다음, 5 x 106 (4.6 mL)의 HKB11 세포가 시딩된 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포를 37 ℃에서 CO2 인큐베이터 내의 오비탈 로테이터 (125 rpm) 상에서 인큐베이션하고, 이후 3일 동안 세포를 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 상등액을 수집하였다.
하기 절차를 이용해서 HKB11 세포의 안정한 트렌스펙션을 달성하였다. 일시적인 트랜스펙션에서 기술된 바와 같이 293펙틴 (상표명) 시약을 사용해서 플라스미드 DNA로 HKB11 세포를 트렌스펙션시켰다. 트렌스펙션된 세포를 100-mm 배양 디쉬에 다양한 희석물 (1:100, 1:1000, 1;10,000)로 분할하고, 5％ FBS 및 200 ug/mL 히그로마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA)이 보충된 DMEM-F12 배지에서 약 2 주 동안 유지하였다. 개별 단일 콜로니들을 피킹하고, 무균 클로닝 디스크 (Scienceware (등록상표), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하여 6-웰 플레이트로 옮겼다. 클론을 확립하고, 뱅킹하였다. 이들 클론을 FVIII 활성 검정 (예, 코아테스트 (Coatest (등록상표)) 및 aPTT 검정) 및 FVIII ELISA에 의해 융합 단백질의 높은 발현에 대하여 스크리닝하였다.
배양 상등액 및 정제 분획 중의 인자 VIII 활성 수준을, 상기 기술된 바와 같이 96-웰 포맷에서 시판 발색 검정 키트 (코아테스트 (등록상표) SP4 FVIII, Chromogenix, Lexington, MA)를 사용해서 결정할 수 있다. 인자 VIII 응고 활성은, 일렉트라 (Electra (등록상표)) 1800C 자동 응고 분석기 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)에 의해 FVIII-결핍 인간 혈장에서 aPTT 검정을 이용해서 결정할 수도 있다. 요컨대, 응고 희석제 중 상등액 샘플의 세 가지 희석물을 기기에 의해 생성한 다음, 100 ㎕를 100 ㎕의 FVIII-결핍 혈장 및 100 ㎕의 자동화 aPTT 시약 (토끼 뇌 인지질 및 초미분(micronized) 실리카 (Biomerieux, Durham, NC))과 함께 혼합하였다. 100 ㎕의 25mM CaCl2 용액을 가한 다음, 응고 형성에 대한 시간을 기록하였다. 각각의 수행에 대하여 ELISA 검정에서 표준으로 사용된 것과 동일한 정제된 FVIII의 일련의 희석액을 사용하여 표준 그래프를 생성시켰다.
본 발명이 특이적 실시양태 및 실시예에 대하여 기술되었지만, 다양한 변형 및 변화가 수행될 수 있고 본 발명의 실제 사상 및 범위를 벗어남 없이 등가물로 대체될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 명세서 및 실시예는 제한적인 의미보다는 예시적인 것으로서 간주된다. 또한, 본원에 언급된 모든 문헌, 특허 출원 및 특허는 그 전체내용이 본원에 참고로 도입된다.
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Zhao, Xiao-Yan <120> Targeted Coagulation Factors and Method of Using the Same <130> MSB-7328 <150> US 61/053,932 <151> 2008-05-16 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2351 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala 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Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 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925 Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe 930 935 940 Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro 945 950 955 960 Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln 965 970 975 Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr 980 985 990 Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro 995 1000 1005 Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1010 1015 1020 Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu 1025 1030 1035 Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met 1040 1045 1050 Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val 1055 1060 1065 Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 1070 1075 1080 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys 1085 1090 1095 Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His 1100 1105 1110 Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln 1115 1120 1125 Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile 1130 1135 1140 Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg 1145 1150 1155 Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro 1160 1165 1170 Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His 1175 1180 1185 Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1190 1195 1200 Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 1205 1210 1215 Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe 1220 1225 1230 Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro 1235 1240 1245 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1250 1255 1260 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn 1265 1270 1275 Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp 1280 1285 1290 Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr 1295 1300 1305 Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn 1310 1315 1320 Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn 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Claims (20)

  1. 혈액 세포 상의 막 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 도메인과 연결된 응고 인자를 포함하는 표적화 응고 인자.
  2. 제1항에 있어서, 응고 인자가 기능성 FVIII 폴리펩티드 또는 FIX인 표적화 응고 인자.
  3. 제1항에 있어서, 도메인이 항체 단편, 펩티드, 펩티드 모방체, 또는 소분자인 표적화 응고 인자.
  4. 제1항에 있어서, 혈액 세포가 혈소판이고, 막 단백질이 GPIIb/IIIa인 표적화 응고 인자.
  5. 제4항에 있어서, 응고 인자가 기능성 FVIII 폴리펩티드인 표적화 응고 인자.
  6. 제4항에 있어서, 도메인이 항-GPIIb/IIIa 항체의 단일 쇄 단편 또는 RGD 펩티드인 표적화 응고 인자.
  7. 제1항에 있어서, 응고 인자가 기능성 FVIII 폴리펩티드이고, 도메인이 FVIII의 B-도메인에 연결되는 항체 단편, 펩티드, 펩티드 모방체, 또는 소분자인 표적화 응고 인자.
  8. 제7항에 있어서, 혈액 세포가 혈소판이고, 도메인이 항-GPIIb/IIIa 항체의 단일 쇄 단편 또는 RGD 펩티드인 표적화 응고 인자.
  9. 치료상 유효량의 제1항의 표적화 응고 인자 및 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  10. 유효량의 제1항의 표적화 응고 인자를 혈액학적 질환의 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈액학적 질환의 치료 방법.
  11. 응고 인자를 혈액 세포 상의 막 단백질에 결합하는 하나 이상의 도메인과 연결하는 것을 포함하는, 응고 인자를 혈액 세포의 표면으로 표적화하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 응고 인자가 기능성 FVIII 폴리펩티드 또는 FIX인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 혈액 세포가 혈소판 또는 적혈구인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 도메인이 항체 단편, 펩티드, 펩티드 모방체, 또는 소분자인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 혈액 세포가 혈소판이고, 막 단백질이 GPIIb/IIIa인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 응고 인자가 기능성 FVIII 폴리펩티드인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 도메인이 항-GPIIb/IIIa 항체의 단일 쇄 단편 또는 RGD 펩티드인 방법.
  18. 제11항에 있어서, 응고 인자가 FVIII이고, 도메인이 FVIII의 B-도메인과 연결되는 항체 단편, 펩티드, 펩티드 모방체, 또는 소분자인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 혈액 세포가 혈소판이고, 도메인이 항-GPIIb/IIIa 항체의 단일 쇄 단편 또는 RGD 펩티드인 방법.
  20. 제11항에 있어서, 응고 인자를 혈액 세포의 표면으로부터 추가로 방출시키는 방법.
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