JP2020504084A - 赤血球標的化第ｖｉｉｉ因子およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

赤血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのドメインに連結された第ＶＩＩＩ因子を含む標的化第ＶＩＩＩ因子分子を提供する。開示されている標的化凝固因子はその作用持続時間を延長させ、したがって、血友病Ａのような血液疾患の治療のための改良である。【選択図】図１

Description

本発明は、改善した半減期および／または増強した有効性を有する、赤血球に標的化される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）化合物を提供する。更に、生物学的作用部位に選択的に標的化することによる、例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を赤血球に標的化することによる、凝固因子欠乏障害に罹患した患者の治療方法を提供する。また、本発明は赤血球上のグリコホリンＡに対する一本鎖抗体を提供する。

生物学的薬物の有効性は、特に疾患が薬物による連続的調節を要する場合には、患者におけるそれらの作用の持続時間によって、しばしば制限される。したがって、臨床における治療剤の成功のためには、薬物の効力の最適化よりも薬物動態学的特性の向上のほうが重要であることが多い。半減期を延長するために種々のクリアランス機構から薬物を保護するための１つのアプローチは、マトリックスタンパク質のような循環中の長寿命タンパク質、または血液細胞もしくは内皮細胞のような細胞の表面への薬物結合を促進する標的化ドメインを付加することである。例えば、血液細胞への治療用ペプチドまたはタンパク質の局在化は、正常なクリアランス機構から逃れることにより、それらの循環半減期を延長することが示されている（Ｃｈｅｎら，Ｂｌｏｏｄ １０５（１０）：３９０２−３９０９，２００５）。多種多様な分子が標的化ドメインとして使用されうる。

もう１つの例においては、アニオン性リン脂質でありホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）結合性タンパク質であるアネキシンＶ（ＡＮＶ）にダニ抗凝固タンパク質のクニッツ型プロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）ドメインが連結された場合、その融合タンパク質（ＡＮＶ−ＫＰＩ）は非融合対応物より活性であり、より高いインビボ抗血栓活性を有することが示された（Ｃｈｅｎら，２００５）。ＡＮＶはＰＳおよびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に対する強いアフィニティを有するため、融合タンパク質ＡＮＶ−ＫＰＩは、血栓形成部位に存在する、ＰＳ／ＰＥに富むアニオン性膜結合凝固酵素複合体に特異的に標的化されうると仮定される。同様に、Ｄｏｎｇらは、フィブリン選択的デスモドゥス・ロツンドゥス（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ ｒｏｔｕｎｄｕｓ）唾液ＰＡα１（ｄｓＰＡα１）をウロキナーゼ（ｕＰＡ）／抗Ｐ−セレクチン抗体（ＨｕＳＺ５１）に融合させて、インビトロアッセイにおいて非融合対応物に類似した抗血栓活性を有する完全に機能的な融合タンパク質を製造することを報告した。更に、融合タンパク質ＨｕＳＺ５１−ｄｓＰＡα１はトロンビン活性化ヒトおよびイヌ血小板に結合することが示された（Ｄｏｎｇら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９２：９５６−９６５，２００４）。

凝血を予防し、血栓性疾患に関連する死亡率を低下させるための、抗凝固物質の標的化において、他の努力もなされている（例えば、ＷＯ ９４／０９０３４を参照されたい）。より最近の進展は、Ｓｔｏｌｌら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２７：１２０６−１２１２，２００７）により示されており、それにおいては、第Ｘａ因子（ＦＸａ）インヒビターであるダニ抗凝固ペプチド（ＴＡＰ）が、血小板表面上で豊富に発現される糖タンパク質であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）に、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ_{抗ＬＩＢＳ}）によって標的化された。融合タンパク質ｓｃＦｖ_{抗ＬＩＢＳ}−ＴＡＰは、非標的化対応物が示すことができなかった低い用量でも有効な抗凝固活性を有することが示された。

前記の標的化抗凝固物質は、特定の細胞を標的とするように設計された融合タンパク質であった。Ｓｔｏｌｌらによれば、標的化抗凝固物質は、抗体と融合している間も保有される非常に強力な凝固抑制活性を有する小分子であるべきである。標的部位における融合タンパク質からの抗凝固物質の放出は考察されていない。

Ｍｕｚｙｋａｎｔｏｖら（米国特許第８，３３３，９７３号）は、抗血栓物質、特にトロンボモジュリンに対する一本鎖抗原結合ドメインの融合タンパク質を開示している。Ｍｕｚｙｋａｎｔｏｖらは、グリコホリンＡをｓｃＦｖで標的化することをも示唆しているが、グリコホリンＡに対するマウス抗体が開示されているに過ぎない。他の抗体もｓｃＦｖも何ら開示されていない。

また、他の血液細胞を標的化するために努力している研究者もいる。例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（ＵＳ２０１６／０２６３２３０Ａ１）は、ＴＲＥＭ様転写産物１タンパク質（ＴＬＴ−１）に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントへの融合による血小板へのＦＶＩＩａの標的化を開示している。該抗体は、グリコシル化部位へのコンジュゲート化またはＦＶＩＩａへの直接的な遺伝的融合のいずれかにより、ＦＶＩＩａに結合された。

本開示は、血友病のような血液疾患の治療のための治療用タンパク質の標的化に焦点を合わせている。例えば、ＦＶＩＩＩ濃縮物または組換えＦＶＩＩＩでの血友病Ａ患者の現在の治療は、これらの因子の高いコストおよびそれらの比較的短い作用持続時間によって制限されている。血友病Ａ患者は現在、必要に応じて、または週数回投与される予防療法として、ＦＶＩＩＩの静脈内投与により治療されている。予防的治療の場合、ＦＶＩＩＩは週３回投与される。残念ながら、この頻度は多数の患者にとって法外な負担である。ＦＶＩＩＩは、ヒトにおけるその半減期が短いため、頻繁に投与される必要がある。ＦＶＩＩＩは、全長タンパク質に関する３００ｋＤを超えるその大きなサイズにもかかわらず、ヒトにおいて僅か約１１〜１８（平均１４）時間の半減期を有するに過ぎない（Ｇｒｕｐｐｏら，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌａ ９：２５１−２６０，２００３）。推奨される頻繁な投与の余裕がある者にとっても、そのタンパク質を頻繁に静脈内注射することは非常に不便である。より長い半減期を有し、したがって、低頻度の投与で十分なＦＶＩＩＩ製品を開発することができれば、患者にとって、より好都合であろう。更に、半減期が延長された場合には、より少量の投与量で十分になりうるため、治療コストが削減されうるであろう。したがって、有効量を減少させ、または作用持続期間を延長させて、血友病の治療選択肢を有意に改善しうる、より効率的な形態のＦＶＩＩＩを得ることが望ましい。

また、標的化ＦＶＩＩＩの持続的な血漿濃度は、ＦＶＩＩＩのトラフ対ピーク値を減少させて早い時点で超生理学的レベルのタンパク質を導入する必要性を排除するることにより、有害な副作用の度合を低減しうる。したがって、現在市販されている形態より長い半減期および持続的な存続時間を有するＦＶＩＩＩの形態を得ることが望ましい。また、ＦＶＩＩＩのトラフレベルを正常ＦＶＩＩＩレベルの５％超（すなわち、５％を超えるレベル）、または１０％超、理想的には１５％超に維持することが望ましい。なぜなら、これらのレベルは、ＦＶＩＩＩレベルが１％〜５％ ＦＶＩＩＩである場合に生じうる破綻的出血を軽減または排除するからである。

現在の療法の追加的な欠点は、患者の約２５〜３０％が、ＦＶＩＩＩ活性を阻害する抗体を産生することである（Ｓａｅｎｋｏら，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ８：１−１１，２００２）。抗体の産生は補充療法としてのＦＶＩＩＩの使用を妨げて、この群の患者に、高用量組換え第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）および免疫寛容療法での、より一層高価な治療を求めることを余儀なくさせる。したがって、より低い免疫原性のＦＶＩＩＩ代替製品が望ましい。

血友病の治療の改善における１つのアプローチは遺伝子治療を含む。血小板におけるＦＶＩＩＩ発現を導くことによりＦＶＩＩＩを血小板に異所的に標的化することは動物モデルにおける血友病Ａの治療において治療効果をもたらしうる（Ｓｈｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６（７）：１９７４−１９８２，２００６）。

非標的化タンパク質と比較して延長した作用持続時間、高い有効性、少ない副作用および低い免疫原性を有する標的凝固因子を提供することが１つの目的である。

もう１つの目的は、所望の作用の特定の部位にタンパク質を標的化し、それにより、望ましくない副作用をもたらしうる他の潜在的な生物活性部位への該タンパク質の曝露を低減することにより、治療用タンパク質の投与に関連した副作用を低減することである。

もう１つの目的は、治療用タンパク質がインビボでのその作用部位の直近で標的化ドメインから放出される、標的化治療用凝固因子を設計することにより、更なる利点を得ることである。非融合活性化タンパク質の高い局所濃度が得られうる。したがって、該タンパク質の治療有効性が増強される。

概略
本発明は、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと、赤血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインとを含む組換え融合タンパク質を提供する。

幾つかの実施形態においては、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは全長第ＶＩＩＩ因子またはＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である。幾つかの実施形態においては、膜タンパク質はグリコホリンＡまたはバンド（Ｂａｎｄ）３である。

幾つかの実施形態においては、結合ドメインは抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子である。更なる実施形態においては、結合ドメインはｓｃＦｖであり、膜タンパク質はグリコホリンＡである。

幾つかの実施形態においては、ｓｃＦｖは、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７からなる群から選択される重鎖を含み、ならびに／または、ｓｃＦｖは、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６からなる群から選択される軽鎖を含む。

幾つかの実施形態においては、ｓｃＦｖは第ＶＩＩＩ因子に戦略的に配置されうる。幾つかの実施形態においては、ｓｃＦｖはＢドメインにおける機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド内に挿入されており、Ｂドメインの大部分は除去されている。幾つかの実施形態においては、ｓｃＦｖは機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＮ末端に融合している。他の実施形態においては、ｓｃＦｖは機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端に融合している。

幾つかの実施形態においては、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ｖＷＦへの、低減した結合を含み、またはｖＷＦへの結合を含まない。これを達成するために、幾つかの実施形態においては、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのａ３ドメインの欠失を含む。幾つかの実施形態においては、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのａ３ドメインの欠失は第ＶＩＩＩ因子の残基１６５２〜１６８２の欠失を含む。

幾つかの実施形態においては、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、主に一本鎖形態の組成物を含む。一本鎖形態は、機能的第ＶＩＩＩ因子の残基１６４８におけるフューリンタンパク質分解切断部位を除去することにより、または機能的第ＶＩＩＩ因子の残基１６４５〜１６４８を欠失させることにより、または機能的第ＶＩＩＩ因子の残基１６３７〜１６５１を欠失させることにより生成されうる。

特定の実施形態においては、請求項１記載の組換え融合タンパク質においては、該組換え融合タンパク質は、配列番号１１３〜１３３からなる群から選択される配列を含む。

また、前記の組換え融合タンパク質の治療的有効量と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物も開示する。更に、血液疾患の治療を要する患者に組換え融合タンパク質の有効量を投与することを含む、血液疾患の治療方法を開示する。

本開示の大部分は第ＶＩＩＩ因子に焦点を合せているが、そのような標的化ドメインは、半減期の延長が望まれる任意のタンパク質の半減期を延長するために使用されうると想定される。したがって、循環半減期の延長が患者にとって有益であるタンパク質と、赤血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインとを含む組換え融合タンパク質も開示する。幾つかの実施形態においては、膜タンパク質はグリコホリンＡまたはバンド３である。幾つかの実施形態においては、結合ドメインは抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子である。幾つかの実施形態においては、結合ドメインはｓｃＦｖであり、膜タンパク質はグリコホリンＡである。

幾つかの実施形態においては、ｓｃＦｖは、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７からなる群から選択される重鎖を含み、ならびに／または、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６からなる群から選択される軽鎖を含む。

説明
本開示は、循環半減期を延長させて凝固因子の投与の頻度を減少させるための、血液細胞への凝固因子の標的化に関する。１つの実施形態においては、赤血球の表面上の膜タンパク質に結合する少なくとも１つのドメインに凝固因子を連結することにより赤血球に特異的に標的化される標的化凝固因子を提供する。

赤血球はＲＢＣとも称され、非常に豊富に存在し、正常ヒト血液１ｍｌ当たり約５×１０^９の細胞密度を有し、全血体積の約５０％を構成する。また、赤血球は、ヒトにおいては約１２０日、霊長類においては９５日、マウスにおいては約３０日の長い循環寿命を有する。豊富な存在量および長い寿命は、赤血球を、循環半減期を延長させるために凝固因子を結合させる魅力的な標的細胞にする。また、赤血球は血餅の一般的な成分であり、赤血球の表面上に存在する凝固因子は、安定な血餅形成を促進するために損傷部位において利用可能でありうる。

凝固因子が標的化される赤血球上の細胞表面タンパク質は、標的化凝固因子の効率的な結合を促進するためには、理想的には、豊富に存在するタンパク質であるべきである。また、この細胞表面タンパク質への結合は赤血球の機能を妨げるべきではない。これらの特徴を有するタンパク質の例としては、グリコホリンＡおよびバンド３（ＡＥ１）が挙げられる。グリコフォリンＡタンパク質の約０．５×１０^６〜１×１０^６コピーが各赤血球上に存在する。グリコホリンＡ（本開示においてはＧＰＡとも称される）は赤血球膜の構造成分であり、赤血球表面の全体的な負電荷に寄与する。同様に、バンド３は赤血球膜の構造成分であり、赤血球当たり約１０^６コピーで存在する。バンド３は赤血球の構造成分であるが、それはアニオン輸送体としても機能する。

凝固因子を血液細胞（血球）に標的化するためのドメインは、血液細胞の表面上の膜タンパク質に対して高いアフィニティを有する抗体フラグメント、抗体、ペプチド、受容体リガンド、炭水化物または小分子でありうるが、これらに限定されるものではない。血液細胞は、例えば赤血球または血小板である。

本明細書中で用いる「凝固因子」は、凝固カスケードに関与し主に凝固促進活性を有するタンパク質を意味する。凝固因子は当技術分野においてよく知られており、凝固因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩならびにプロテインＳを包含するが、これらに限定されるものではない。凝固因子は血漿から濃縮されることが可能であり、または組換え製造されうる。組換え製造される場合、凝固因子は、天然構造と異なるアミノ酸構造を有しうる。ただし、その変異体が治療的に有用であるように、十分な凝固促進活性が維持される必要がある。１つの実施形態においては、凝固因子は、機能的ＦＶＩＩＩポリペプチド、例えば、血漿由来のＦＶＩＩＩ濃縮物、または組換え製造されたＦＶＩＩＩ、または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）（これらに限定されるものではない）である。

本明細書中で用いる「機能的ＦＶＩＩＩポリペプチド」は、例えば血友病Ａにより特徴づけられるヒトＦＶＩＩＩ欠乏症をインビボまたはインビトロで矯正しうる機能的ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せを意味する。ＦＶＩＩＩは天然状態において複数の分解または加工形態を有する。これらは前駆体一本鎖タンパク質からタンパク質分解により誘導される。機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドはそのような一本鎖タンパク質を含み、そしてまた、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を矯正する生物活性を有するこれらの種々の分解産物を提供する。対立遺伝子変異が存在する可能性がある。機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの誘導体を与える全てのそのような対立遺伝子変異、グリコシル化形態、修飾体および断片を含む。ただし、それらは、ヒトＦＶＩＩＩの機能的セグメント、および必須の特徴的ヒトＦＶＩＩＩ機能的活性を含有する必要がある。必要な機能的活性を有するＦＶＩＩＩのそれらの誘導体は、本明細書に記載されている直接的なインビトロ試験により、容易に特定されうる。更に、機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドは、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、カルシウムおよびリン脂質の存在下、第Ｘ因子（ＦＸ）からＦＸａへの変換を触媒し、血友病Ａ罹患個体由来の血漿における凝固欠損を矯正しうる。ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列の公開配列およびその機能的領域に関する公開情報から、ＤＮＡの制限酵素切断またはヒトＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質分解もしくは他の分解により誘導されうる断片が当業者に明らかであろう。機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドには、全長ヒトＦＶＩＩＩ（例えば、配列番号１および配列番号２）、およびＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（例えば、配列番号３および配列番号４）、およびＷＯ２００６／０５３２９９に開示されているアミノ酸配列を有するものが、特に含まれるが、これらに限定されるものではない。

全長ＦＶＩＩＩおよびＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩの両方の一次ポリペプチド鎖は、通常、それらの発現中に部分的にタンパク質分解切断されて、非共有結合相互作用により会合した重鎖および軽鎖から構成される分子ならびにより小さい比率の未切断一本鎖ＦＶＩＩＩの混合物を生成する。主に一本鎖であるＦＶＩＩＩは、既に記載されているとおり（Ｐｉｔｔｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９４）ｖｏｌ ２６９，ｐ１７３２９−１７３３７）、全長ヒトＦＶＩＩＩ内の２つの残基Ｒ１３１３およびＲ１６４８の突然変異により生成されうる。残基Ｒ１３１３の突然変異はＦＶＩＩＩのＢドメイン内のタンパク質分解切断部位を不活性化し、一方、残基Ｒ１６４８の突然変異は、Ｂドメインの末端とａ３ドメインの開始部位との間に位置するタンパク質分解切断部位を不活性化する。したがって、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子の場合、主に一本鎖であるＦＶＩＩＩタンパク質を生成させるにはＲ１６４８におけるタンパク質分解切断部位の不活性化で十分であると推定されうる。Ｒ１６４８におけるタンパク質分解切断はズブチリシンファミリーのプロテアーゼ酵素により触媒されると考えられている。残基Ｒ１６４８に隣接する全長ヒトＦＶＩＩＩ内の配列ＲＨＱＲ（残基１６４５〜１６４８）はフューリンプロテアーゼのものに類似しており、したがって、フューリン切断部位と称されている。したがって、突然変異または欠失のいずれかによるこのフューリン切断部位の不活性化は、主に一本鎖であるＦＶＩＩＩタンパク質の生成をもたらすことが十分に記載されている。一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質の潜在的利点は安定性の改善である。なぜなら、重鎖と軽鎖とが共有結合および非共有相互作用により会合するからである。また、主に一本鎖であるＦＶＩＩＩタンパク質は、治療用製品の好ましい特性である、より均質な分子である。

ＦＶＩＩＩは、ヒトおよび哺乳動物種の血液において見出されるタンパク質であるフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）に高いアフィニティ（ＫＤ約０．５ｎＭ）で結合する。したがって、ＦＶＩＩＩはｖＷＦとの複合体として血中を循環する。ｖＷＦとの相互作用は、肝臓を介したＦＶＩＩＩのクリアランスを低減する。これはおそらく、ｖＷＦがクリアランス受容体への結合を低減するからである。ＦＶＩＩＩ内の、ｖＷＦに対する結合部位は、主に、ＢドメインとＡ３ドメインとの間の４３アミノ酸のドメインである酸性ａ３ドメイン内に位置する（Ｆａｙ，Ｉｎｔ．Ｊ Ｈｅｍａｔ（２００６）８３，１０３−１０８）。ａ３ドメインの欠失はｖＷＦへの結合を妨げ、マウスにおいて、より短い半減期をもたらすことが報告されている（Ｔａｎｇら，２０１３，Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ １９，５３９−５４５）。ＦＶＩＩＩへのｖＷＦの結合は循環半減期を延長するが、ｖＷＦの結合は、標的化部分が赤血球上のその標的に結合する能力を立体的に遮ることにより、赤血球への標的化ＦＶＩＩＩ分子の結合を妨げる可能性がある。

ＦＶＩＩＩの「凝固促進活性」は凝固カスケードにおけるＦＶＩＩＩの活性を意味する。ＦＶＩＩＩ自体は凝固を引き起こさないが、凝固カスケードにおいて必須の役割を果たす。凝固におけるＦＶＩＩＩの役割は、内因性ＦＸ活性化のための触媒補因子であるＦＶＩＩＩａへと活性化されることである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：１１−２２，２００３）。ＦＶＩＩＩはトロンビンまたはＦＸａによってタンパク質分解的に活性化され、これはそれをフォンビルブラント因子（ｖＷｆ）から解離させ、カスケードにおけるその凝固促進機能を活性化する。ＦＶＩＩＩａは、その活性形態として、血液凝固の内因性経路においてＦＸ活性化酵素複合体のための補因子として機能し、血友病Ａ患者においては、それは減少しているか、または非機能的である。

「ＦＩＸ」は凝固因子ＩＸ（第ＩＸ因子）を意味し、これはヒト凝血因子ＩＸまたは血漿トロンボプラスチン成分としても公知である。

本明細書中で用いる「標的化凝固因子」なる語は、血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのドメインと結合している凝固因子を意味する。標的化凝固因子は血液細胞に強力に、例えば１０ｎＭ未満のアフィニティで結合すべきである。結合は、例えば、標的化細胞上で選択的に発現される膜タンパク質への結合により、標的化血液細胞に特異的であるべきである。

本明細書中で用いる「標的化ドメイン」は、標的細胞上の膜タンパク質に対して高いアフィニティを有する部分を意味するす。本発明に適した標的化ドメインには、血液細胞の表面上の膜タンパク質に対して高いアフィニティを有する抗体、抗体フラグメント、例えば一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦＡＢフラグメント、抗体模倣物およびペプチドまたは小分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。

凝固因子は、化学的に、または融合タンパク質の組換え発現により、該ドメインに結合（連結）されうる。化学結合は、凝固因子および標的化ドメイン上に存在する化学的部分を互いに結合させることにより達成可能であり、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル基および炭水化物基のような部分を使用する化学結合を含む。これらの部分を連結するように活性化されている又は活性化されうる基を有する種々のホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーが使用されうる。リンカー分子上の幾つかの有用な反応基には、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸エステルおよびヒドラジドが含まれる。これらの反応性基を分け隔てるためには、種々の化学的組成および長さの多種多様なスペーサーが使用可能であり、例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体１〜２０個の長さのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂肪族基、アルキレン基、シクロアルキレン基、縮合または結合アリール基、ペプチドおよび／またはペプチジル模倣物を包含する。例えば、インビボで凝固因子の機能的形態がその標的化ドメインから放出されるように、または該放出が体内の凝固因子の生物活性部位またはその近傍で生じるように、該ドメインは凝固因子に連結されうる。

もう１つの方法においては、凝固因子は一本鎖抗体フラグメントまたはペプチドに融合されることが可能であり、ここで、組換え技術を用いて融合タンパク質を得るために、そのコード配列はＦＶＩＩＩコード配列に遺伝的に連結されうる。ｓｃＦｖの使用は結合部位または決定基の架橋を回避し、それにより、潜在的に有害な細胞膜修飾および細胞凝集を回避しうる。

したがって、本発明の１つの実施形態において提供する標的化凝固因子においては、凝固因子を血液細胞に標的化するために凝固因子を標的化ドメインに連結する結合が切断または分解されることが可能であり、それにより、凝固因子がコンジュゲートから放出されうる。

本明細書に記載されている標的化凝固因子は、赤血球の表面上で発現される決定基に結合しうる前記ｓｃＦｖを凝固因子、例えばＦＶＩＩＩに連結（融合）することにより製造されうる。更に、遺伝子工学は、化学的コンジュゲート化を用いては達成され得ない、疾患部位で生成される病態生理学的に関連する酵素により切断されうる標的化凝固因子の設計および合成を可能にする。

前記のとおり、リンカーは、可変重鎖フラグメントおよび可変軽鎖フラグメントを連結するためにも使用されうる。本明細書中で用いるリンカーは約１アミノ酸〜約１００アミノ酸またはそれ以上の長さの鎖を意味する。もう１つの実施形態においては、リンカーは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長である。１つの実施形態においては、リンカーは１３アミノ酸長である。

更に、切断配列、例えばトロンビン感受性開裂配列または他の酵素切断配列をリンカー内に挿入して、薬物が標的化されるＲＢＣが（例えば、活発な凝固の際の）病態部位における適切な切断酵素と遭遇した際に薬物の放出をもたらすことが可能である。この切断配列はリンカー内またはその末端に位置しうる。

もう１つの実施形態においては、トロンビン放出部位を含有する抗体由来ｓｃＦｖが上流プライマーによりクローニングされることが可能であり、該プライマーはカルボキシ末端にアニールし、トロンビン切断部位を含有する短いペプチドリンカーを含む配列を導入する。更にもう１つの実施形態においては、切断部位は標的化凝固因子自体の内部に存在する。

凝固因子の、それらのコンジュゲート形態からの（すなわち、標的化凝固因子からの）の放出は、その活性化プロセス中に除去される凝固因子上の部位に標的ドメインを連結することにより、または制御された様態で血中の酵素により分解されるリンカーを使用することにより達成されうる。例えば、一般的な血液プロテアーゼまたは加水分解酵素に対して感受性である糖重合体またはペプチドが使用されうる。種々のそのような技術が当技術分野において公知であり、プロドラッグを製造するために使用されている。リンカーは、凝固因子が最も必要とされる部位、例えば外傷誘発性血液凝固または炎症の部位において特異的に切断されるように更に操作されうるであろう。例えば、リンカーは、所望の作用部位でのみ生成される特定のプロテアーゼ、例えば、炎症過程により放出される又は血液凝固カスケードにより生成されるプロテアーゼに対して感受性でありうる。治療用タンパク質のこの選択的放出は副作用の可能性を低減し、その作用部位におけるタンパク質の効率を増加させうる。

ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの標的化
ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸを血小板または赤血球のような血液細胞の表面に標的化することは、これらの分子を循環から通常は排除するメカニズムを妨げることによりこれらの凝固因子のクリアランスを遅くするのに役立ちうる。タンパク質クリアランスのそのようなメカニズムは血漿中の遊離タンパク質と１以上の特異的エンドサイトーシス受容体との相互作用、タンパク質分解、腎臓経由の分泌および血管外遊出を含みうる。ＦＶＩＩＩの場合、肝細胞上のＬＲＰ１およびアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）はＦＶＩＩＩ因子のクリアランスの重要な手段である。ＦＶＩＩＩの作用持続時間におけるタンパク質分解の役割は不明である。しかし、ＲＢＣに結合したＦＶＩＩＩは、他の分子に関して既に実証されているとおり、グリカンのその密集細胞表面層の作用によってタンパク質分解に対して潜在的に保護しうる。ほとんどの血漿ＦＶＩＩＩはｖＷＦとの複合体を形成するため、ｖＷＦに関するクリアランスメカニズムは血漿ＦＶＩＩＩクリアランスの重要な経路でもありうる。ｖＷＦクリアランスのメカニズムは十分には特徴づけられていない。ＦＶＩＩＩを赤血球の表面に標的化することは、それらの長い循環時間ゆえに、特に興味深い。ヒトにおいては、赤血球の平均寿命は約１２０日であり、血中の存在量は５×１０^９細胞／ｍｌである。比較すると、血小板の平均寿命はヒトにおいては僅か７〜１０日であり、それらの存在量は１．５×１０^８〜４×１０^８／ｍｌである。血小板と比較した場合の、赤血球の、より長い寿命およびより高い存在量は、赤血球を、標的化凝固因子の半減期を延長させるための、より魅力的な標的細胞にする。

標的化ＦＶＩＩＩが凝固を促進するためには、該分子は機能的形態（ＦＶＩＩＩａ）へと加工されうるものでなければならない。また、ＦＶＩＩＩがその結合部位（例えば、グリコホリンＡ）から放出されるのが有利でありうる。しかし、結合したままの活性化ＦＶＩＩＩも、ＦＩＸａおよびＸ因子との複合体形成により凝固を促進するのに機能的である可能性がある。１つの実施形態においては、これは、ＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりにグリコホリンＡ標的化ドメインをＦＶＩＩＩに連結することにより達成される（図１を参照されたい）。Ｂドメインは、凝固促進性環境において、トロンビンまたはＦＸａ媒介性タンパク質分解により除去されて、成熟ＦＶＩＩＩａ分子が得られる。したがって、ＦＶＩＩＩａは、活性化されると、グリコホリンＡから放出され、ＦＸ活性化複合体の形成に利用可能となる。

他の実施形態においては、標的化ドメインはＦＶＩＩＩのＮ末端またはＣ末端に連結可能であり、その場合、プロテアーゼ切断部位、例えばトロンビン切断部位を含有するリンカー配列が、凝固促進環境において、赤血球表面からのＦＶＩＩＩの放出を可能にする。

ＦＶＩＩＩと標的化ドメインとの連結は、本明細書に記載されている架橋アプローチを用いて、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル基およびカルボニル基を含むＦＶＩＩＩ上の反応性基に標的化ドメインを共有結合させることにより達成されうる。標的化ドメインはまた、ＦＶＩＩＩ分子のＢドメイン上に主に存在する炭水化物に結合されうる。例えば、過ヨウ素酸塩を使用するＦＶＩＩＩの穏やかな酸化は炭水化物鎖上にアルデヒドを生成し、ついでそれをアミンまたはヒドラジドと反応させ、ついで、所望により還元して、より安定な結合を形成させることが可能である。

遊離システインは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での穏やかな還元により、組換えＦＶＩＩＩのＢドメイン上で選択的に生成されて、遊離システインと反応する標的化ドメイン（例えば、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、オキシラン、Ｓ−ピリジルまたはマレイミド部分を含有するドメイン）とのＢドメインの特異的連結を可能にする。更に、標的化ドメインへの結合のための特定の位置を付与するために、アミノ酸残基をシステインで置換するために、ＦＶＩＩＩを修飾することが可能である。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩを使用する場合、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの種々のシステインムテイン（例えば、ＷＯ２００６／０５３２９９に開示されているもの）を使用して、表面システイン残基における化学結合によりＦＶＩＩＩを標的ドメインに連結することが可能である。アミノ酸残基をシステインで置換するために修飾されうるアミノ酸残基の例には、８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４（アミノ酸残基は全長ＦＶＩＩＩの配列におけるその位置により示される）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

凝固因子はまた、組換え技術を用いて、標的化ドメインに結合されうる。宿主細胞は、ＦＶＩＩＩと標的化ドメインとの融合タンパク質を含むベクターでトランスフェクトされうる。１つの実施形態においては、標的化ドメインはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりに挿入されうる。図１に示されているとおり、生理学的条件下でＢドメインの生物学的処理および除去を可能にする、Ｂドメインの残部が特定される。１つの実施形態においては、標的化ドメインはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩまたは全長ＦＶＩＩＩのＮ末端に挿入されうる。もう１つの実施形態においては、標的化ドメインはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩまたは全長ＦＶＩＩＩのＣ末端に挿入されうる。

宿主細胞系は、凝固因子の産生に有用であることが当業者に公知である任意の細胞、例えば限定的なものではないが、ＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞およびＨＫＢ１１細胞（ヒト胎児腎細胞系ＨＥＫ２９３とヒトバーキットＢ細胞リンパ腫系２Ｂ８とのハイブリッド）でありうる。

ＦＶＩＩＩを赤血球の表面上のグリコホリンＡに標的化するためには、多数のドメインがＦＶＩＩＩに化学的に連結され、またはＦＶＩＩＩと共に組換え発現されうる。そのようなドメインの例には、グリコホリンＡに対する抗体、ペプチド模倣体または小分子模倣体であって、グリコホリンＡを標的化するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。グリコホリンＡを標的化する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のような抗体またはＦＡＢフラグメントは標的化ドメインとして特に有用である。

ＦＶＩＩＩのＢドメインは、ＦＶＩＩＩ機能の喪失を伴うことなく除去されうることが示されている。また、ＦＶＩＩＩの種々のＢドメイントランケート化形態および他のタンパク質ドメインとのＢドメイン融合体も機能的に活性なＦＶＩＩＩを与えうることが示されている。１つの態様においては、本発明は、活性ＦＶＩＩＩが得られるように操作されうる標的化ドメインを含み、該操作においては、該分子の通常の加工（プロセシング）を妨げることなく、ＦＶＩＩＩのＢドメイン内への挿入、該Ｂドメインの置換または部分的置換がもたらされる。例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて、一本鎖抗体フラグメントがＦＶＩＩＩのＢドメインのＣ末端に融合しているＦＶＩＩＩ分子が製造されうる。あるいは、ｓｃＦｖフラグメントは、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全部または一部を置換するためにも使用されうる。これは、インフレームでｓｃＦｖフラグメントをコードするＤＮＡ配列をＢドメインコード配列の後に挿入することにより、またはＢドメインコード配列の一部または全部を置換することにより達成されうる。この戦略は、ＦＶＩＩＩの正常なタンパク質分解活性化に必要なトロンビン切断部位を維持するであろう。

標的化ドメインとしての抗体の使用
本明細書中で用いる「抗体」は全抗体およびその任意の抗原結合性フラグメント（すなわち、「抗原結合性部分」）またはその一本鎖を意味する。この語は、天然に存在する、または通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換え過程により形成される全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または特異的結合活性を保有する、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば抗体フラグメントを含む。構造に無関係に、抗体フラグメントは、全長抗体により認識されるのと同じ抗原に結合する。例えば、抗グリコホリンＡモノクローナル抗体フラグメントはグリコホリンＡのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントによりもたらされうる。抗体の「抗原結合性部分」なる語に含まれる結合フラグメントの例には以下のものが含まれる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる１価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわち、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、別々の遺伝子によりコードされるが、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域とがペアになって１価分子を形成している単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。そのような一本鎖抗体も抗体の「抗原結合性部分」なる語に含まれると意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の通常の技術を用いて得られ、フラグメントは、完全抗体の場合と同じ方法で有用性に関して分析される。

抗体が標的化ドメインとして使用される場合、抗体の一本鎖フラグメント、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントが使用されうる。

更に、抗原結合性フラグメントは抗体模倣物に含まれうると想定される。本明細書中で用いる「抗体模倣物」または「模倣物」なる語は、抗体に類似した結合を示すタンパク質を意味するが、より小さい代替抗体または非抗体タンパク質である。そのような抗体模倣物はスカフォールドに含まれうる。「スカフォールド」なる語は、個別対応の機能および特徴を有する新規製品の設計のためのポリペプチドプラットフォームを意味する。

本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる語は単一分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は個々のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティを示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」なる語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含みうる。

本明細書中で用いる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含有しない抗体（例えば、グリコホリンＡに結合する単離された抗体は、グリコホリンＡ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含有しない）を意味すると意図される。しかし、ヒトグリコホリンＡのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に結合する単離された抗体は、他の関連抗原、例えば他の種由来のもの（例えば、グリコホリンＡ種ホモログ）に対して交差反応性を有しうる。更に、単離された抗体は他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含有しないことが可能である。

本明細書中で用いる「特異的結合」は所定の抗原への抗体結合を意味する。典型的には、抗体は少なくとも約１０^５Ｍ^−１のアフィニティで結合し、所定の抗原以外または密接に関連した抗原以外の無関係な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に関するそのアフィニティより高い、例えば少なくとも２倍高いアフィニティで所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」なる語は本明細書においては「抗原に特異的に結合する抗体」なる語と互換的に用いられる。

本明細書中で用いる、ＩｇＧ抗体に関する「高アフィニティ」なる語は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、幾つかの実施形態においては少なくとも約１０^８Ｍ^−１、幾つかの実施形態においては少なくとも約１０^９Ｍ^−１、１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１またはそれ以上、例えば１０^１３Ｍ^−１までまたはそれ以上の結合アフィニティを意味する。しかし、「高アフィニティ」結合は他の抗体アイソタイプでは異なりうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに関する「高アフィニティ」結合は少なくとも約１．０×１０^７Ｍ^−１の結合アフィニティを意味する。本明細書中で用いる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を意味する。ｓｃＦｖに関する高アフィニティ結合は少なくとも１０^９Ｍ^−１またはそれ以上の結合アフィニティを意味する。

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合抗原の三次元構造に相補的であるＮ末端抗原結合性表面を形成する、抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３つの超可変領域の１つを意味する。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの相補性決定領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表される。ＣＤＲは抗原−抗体結合に関与し、重鎖のＣＤＲ３は、特異的な抗原−抗体結合にとってしばしば特に重要である特有の領域を含む。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれからのＣＤＲ領域を含む６つのＣＤＲを含みうる。

本明細書中で用いる「保存的置換」は、類似した生化学的特性を有するアミノ酸により１以上のアミノ酸が置換されているポリペプチドの修飾であって、ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の喪失をもたらさない修飾を意味する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基により置換されているものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定められている。これらのファミリーには以下のものが含まれる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。本発明の抗体は保存的アミノ酸置換を有することが可能であり、活性を尚も保有しうると想定される。

核酸およびポリペプチドに関する「実質的相同性」なる語は、２つの核酸もしくは２つのポリペプチドまたはそれらの指定配列が、最適にアラインメント（整列）され比較された場合に、適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または欠失を伴って、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、通常は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％において同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合、核酸に関する実質的相同性が存在する。本発明は、本明細書に記載されている特定の核酸配列およびアミノ酸配列に対して実質的相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列を含む。

２つの配列の間の同一性の割合（％）は、配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、相同性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、この場合、それらの２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さが考慮される。２つの配列の間の配列の比較および同一性の割合（％）の決定は、数学的アルゴリズム、例えばＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（商標）のＡｌｉｇｎＸ（商標）モジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（これに限定されるものではない）を使用して達成されうる。ＡｌｉｇｎＸ（商標）の場合、マルチプルアラインメントのデフォルトパラメーターは以下のとおりである：ギャップ・オープニング・ペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アライメント遅延に関する同一性（％）：４０（更なる詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｏｎｌｉｎｅ−Ｇｕｉｄｅｓ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ／Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ−ａｎｄ−ｄａｔａ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−ｆｏｒ−ＰＣｓ／ＡｌｉｇｎＸ−Ｍｏｄｕｌｅ−ｆｏｒ−Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ａｄｖａｎｃｅ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌにおいて見出される）。

クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的一致を決定するためのもう１つの方法はグローバル配列アラインメントとも称され、Ｈｉｇｇｉｎｓら（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ），１９９２，８（２）：１８９−１９１）のアルゴリズムに基づくＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２（２２）：４６７３−４６８０）を用いて決定されうる。配列アラインメントにおいては、クエリー配列および対象配列は共にＤＮＡ配列である。前記のグローバル配列アラインメントの結果は同一性の割合（％）として示される。ペアワイズアラインメントにより同一性の割合（％）を計算するためにＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは以下のとおりである：マトリックス＝ＩＵＢ、ｋタプル＝１、上部対角線（Ｔｏｐ Ｄｉａｇｏｎａｌ）の数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップ・オープン・ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１。マルチプルアラインメントの場合、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメータが好ましい：ギャップ・オープニング・ペナルティ＝１０、ギャップ伸長パラメータ＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アライメント遅延に関する同一性（％）＝４０。

核酸は、全細胞中、細胞ライセート中、または部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸が「単離」されてる又は「実質的に純粋」にされていると言えるのは、天然環境においてそれに通常付随している他の細胞成分からそれが精製されている場合である。核酸を単離するためには、以下のような標準的な技術が用いられうる：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野でよく知られている他のもの。

該抗体作製戦略の目的は、ヒト由来の赤血球上の細胞表面タンパク質に結合する抗体であって、他の哺乳類種（例えば、サル）とも交差反応する抗体を特定することであった。ヒトおよびサルに交差反応する抗体は、ヒトでの試験に進む前のサルでの試験を可能にするために不可欠である。また、赤血球のみに結合し、末梢血単核球および内皮細胞のような他の細胞型には結合しない抗体が、オフターゲット効果を回避するために不可欠である。更に、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）に特異的に結合する抗体が非常に望ましい。なぜなら、ＧＰＡは赤血球特異的であり、赤血球表面上に非常に豊富に（細胞当たり０．５〜１×１０^６コピー）存在するからであり、また、ＧＰＡを天然で欠いているヒトおよびマウスにおけるＧＰＡのノックアウトは病状を何ら示さないからである。したがって、ＧＰＡに結合する抗体が、望ましくない副作用を示す可能性は低い。ＧＰＡに対する抗体が赤血球の溶解（溶血）を引き起こしうることは公知であるが、これは補体活性化を必要とし、それは、多数の抗体が所与赤血球に結合することを要する。赤血球を標的化する第ＶＩＩＩ因子分子の治療用量においては、細胞当たりのコピー数は１００未満であると推定され、したがって、補体系を活性化するのに十分ではない。赤血球上のもう１つの潜在的に適切な標的はＢａｎｄ３であり、これは、同様に赤血球特異的であり赤血球表面上に非常に豊富に存在する膜貫通タンパク質である。したがって、候補抗体をＧＰＡまたはＢａｎｄ３への結合に関してスクリーニングした。

サル赤血球表面タンパク質と交差反応するヒト赤血球表面タンパク質に対する抗体を作製するために２つのアプローチを用いた。１つの方法においては、マウスを無傷赤血球で免疫化した。第２のアプローチにおいては、ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーを無傷赤血球に対してパンニングした。無傷赤血球の使用は、対応抗体が産生されうる細胞表面タンパク質がそれらの天然の生理学的コンホメーションをとることを保証する。膜貫通領域を含有し、天然コンホメーションで組換え発現されるのが典型的には困難である細胞表面タンパク質にとっては、これは特に重要である。特定の実施形態の詳細は後記の実施例に記載されている。

医薬組成物および用途
本発明はまた、本発明の標的化凝固因子の治療有効量と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物に関する。「薬学的に許容される賦形剤または担体」は、製剤の処方（製剤化）または安定化を助けるために有効成分に添加されうる物質であって、患者に対する有意で有害な毒性作用を引き起こさないものである。そのような賦形剤または担体の例は当業者によく知られており、水、糖、例えばマルトースまたはスクロース、アルブミン、塩などを包含する。他の賦形剤または担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００）に記載されている。そのような組成物は、それを要する患者への有効な投与に適した薬学的に許容される組成物を製造するための適量の賦形剤または担体と共に、標的化凝固因子の有効量を含む。

例えば、該コンジュゲートは、出血症状の重症度によって変動しうる投与量で、血友病Ａに罹患している対象に非経口投与されうる。

１つの実施形態においては、本発明は、血液疾患の治療を要する患者に、前記の標的化凝固因子の治療的有効量を投与することを含む、血液疾患の治療方法に関する。

本明細書中で用いる「治療的有効量」は、血流内または標的組織内で標的化因子（または標的化形態から放出された対応非コンジュゲート化因子）の所望のレベルをもたらすのに必要な標的化凝固因子の量を意味する。その厳密な量は、治療用組成物の成分および物理的特性、投与頻度、意図される患者集団、個々の患者の考慮事項など（これらに限定されるものではない）を含む多数の要因に左右され、当業者によって容易に決定されうる。

本明細書中で用いる「患者」は、医療および／または治療を受けるヒトまたは動物個体を意味する。

本明細書に記載されているポリペプチド、材料、組成物および方法は本発明の代表例であると意図され、本発明の範囲は実施例の範囲によっては限定されないと理解されるであろう。本発明は、開示されているポリペプチド、材料、組成物および方法に対する変形で実施されることが可能であり、そのような変形も本発明の範囲内であるとみなされる、と当業者は認識するであろう。

（Ａ）全長ＦＶＩＩＩ（「全長ＦＶＩＩＩ」）、（Ｂ）標的化ドメイン（「ＴＤ」）がＢドメイン内に挿入されており、Ｂドメインの大部分が除去されている、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（「ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＴＤ」）、（Ｃ）Ｂドメインに挿入され、そしてＢドメインの大部分が除去され、（Ｃ）標的化ドメインがＦＶＩＩＩのＮ末端において融合している、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ、および（Ｄ）標的化ドメインがＦＶＩＩＩのＣ末端において融合している、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの概要図。 グリコホリンＡ抗体を特定するためのハイブリドーマスクリーニングカスケードの流れ図を示す。 ＲＢＣ結合およびＧＰＡ結合に関して選択された１０個のモノクローナル抗体の可変ドメイン配列のアラインメント。図の上半分に重鎖配列が示されており、下半分に軽鎖が示されている。ＣＤＲ領域が枠で囲まれている。 抗体４Ｃ１２（ＴＰＰ−３４２２）、１３Ｇ７（ＴＰＰ−３４２３）、７Ｇ４（ＴＰＰ−３４２４）および１０Ｆ７（ＴＰＰ−３４３０）を使用した、（Ａ）親ＣＨＯ−ＱＭＣＦ１細胞および（Ｂ）ヒトＧＰＡトランスフェクト化ＣＨＯ−ＱＭＣＦ１細胞の蛍光活性化細胞選別分析。 ６Ｃ１２のヒト化変異体の重鎖可変ドメインの配列の比較。 表面プラズモン共鳴を用いた、ヒト赤血球膜へのヒト化６Ｃ１２抗体結合の速度論的分析。 （Ａ）７つの親和性成熟Ｆａｂに関するアラニンスキャニングペプチドを使用するエピトープマッピング研究（ＴＰＰ＃７７８２、７７８３、７７７８、７７９０、７７９２、７７９３、７７９７）。ＧＰ５−１、５−２、５−３、５−４、５−５、５−６、５−７および５−８への結合の平均の百分率としての各ペプチドへの平均結合をプロットする。（Ｂ）ヒト化および生殖系列化Ｆａｂ ＴＰＰ−５９０６に関するアラニンスキャニングペプチドを使用するエピトープマッピング研究。ＧＰ５−１、５−２、５−３、５−４、５−５、５−６、５−７および５−８への結合の平均の百分率としての各ペプチドへの平均結合をプロットする。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡトランスジェニックマウスＲＢＣおよびヒトＲＢＣにおけるヒトＧＰＡレベルのＦＡＣＳ測定。 ＲＯＴＥＭ装置においてトロンボエラストグラフィーによりエクスビボで測定された全血凝固。Ｘ軸は秒単位の時間であり、Ｙ軸は、血餅の硬さに比例する振幅である。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−８２７７、ＴＰＰ−９７１１およびＴＰＰ−９１６１のＰＤプロファイルを示す。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるイロクテイト（Ｅｌｏｃｔａｔｅ）と比較した場合のＴＰＰ ８８２０、８７４３および８７４４のＰＤプロファイルを示す。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ ８７４１および８７４３のＰＤプロファイルを示す。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−８７４１、ＴＰＰ−８７９８およびＴＰＰ−９０４９のＰＤプロファイルを示す。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−９１６１、ＴＰＰ−９７１１、ＴＰＰ−８２７７およびＴＰＰ−６１９５のＰＤプロファイルを示す。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−９４２４およびＴＰＰ−９４２３のＰＤプロファイルを示す。 ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−９９００、９９０１および９９７６のＰＤプロファイルを示す図である。 尾静脈切断の２４時間後の生存により測定された、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−９４２３の有効性。マウスに２００ＩＵ／ｋｇのＴＰＰ−９４２３を注射した。 ヘモクロンａＰＴＴアッセイを用いた、カニクイザル全血における凝固時間の阻害におけるＢＯ２Ｃ１１ ｍＡＢの力価測定。 ＢＯ２Ｃ１１ ｍＡＢの存在下の、カニクイザル全血凝固アッセイ（ヘモクロンにおいて測定されたａＰＴＴ）におけるＴＰＰ−９１６１の用量反応。 ＰＤ試験に使用した４頭のカニクイザルにおけるＴＰＰ−９４２３のエクスビボ全血凝固用量反応曲線。 ＢＯ２Ｃ１１ ｍＡＢの存在下の、ヘモクロンを使用したエクスビボ全血凝固時間により測定された、４頭のカニクイザルにおけるＴＰＰ−９４２３の薬力学的プロファイル。

以下の実施例は、本明細書に記載されている本発明を例示するために記載されており、本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。

実施例
本発明がより深く理解されうるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示目的で記載されているに過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。本明細書中で挙げられている全ての刊行物の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。

実施例１：抗ＧＰＡ抗体産生：マウスハイブリドーマ
ヒトおよびサルの赤血球（ＲＢＣ）の細胞表面タンパク質に対する抗体をヒト赤血球でのマウスの免疫化およびそれに続くサル赤血球での追加免疫化により産生させた。これらのマウスの脾臓細胞からハイブリドーマを得、これらのハイブリドーマを、まず、単離されたヒトおよびサル（カニクイザルおよびアカゲザル）赤血球（ＲＢＣ）に対する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、ついで精製ヒトグリコホリンＡタンパク質（ＧＰＡ）に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。単離されたＲＢＣを正常なヒト、カニクイザルおよびビーグル犬からの全血から調製し、ヘパリンナトリウム（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）で抗凝固処理した。２〜３ｍＬの全血を３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の最上部に静かにローディングし、ついで５００ｇ、室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離した。ＲＢＣペレットを１０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、４００ｇ、室温で１０分間遠心分離した。ＲＢＣペレットを、元の血液体積と同じ総体積のＰＢＳ中に再懸濁させて、全血と同じＲＢＣ細胞密度にし、該ペレットを４℃で保存した。精製ヒトグリコホリンＡタンパク質をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、ＥＬＩＳＡプレート上に２μｇ／ｍｌでコーティングした。ヒトＧＰＡへの抗体の結合を、当技術分野でよく知られた方法を用いて、適切な二次抗体を使用して検出した。

ヒトおよびサルの両方のＲＢＣに結合し、ＥＬＩＳＡによりＧＰＡ結合に関して陽性であるクローンを選択した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびヒト内皮細胞に結合した抗体クローンを除外した。ハイブリドーマのスクリーニングの流れの概要を図２に示す。

以下の表１に示されているとおり、１２個のクローンが、ＦＡＣＳによりヒトおよびサル赤血球への結合に関して、ならびにＥＬＩＳＡによりヒトＧＰＡへの結合に関して陽性であることが確認された。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてはバックグラウンド結合のみが観察され、イヌ赤血球においては非常に低い結合が見られた。ハイブリドーマ上清をＩｇＧ形態の抗体の起源として使用した。クローン１０Ｂ７および８Ｇ８は、これらのクローンからＶＨ配列を生成させることができなかったため、更なる分析から除外した。

ヒトおよびサルの両方の赤血球に結合した１０個のハイブリドーマクローンからの抗体可変領域の配列のアラインメントは、１０個中９個の抗体が、特有であるが密接に関連した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することを示した。図３を参照されたい。ＣＤＲ配列は抗体の抗原認識特異性の主要決定因子であるため、これは、これらの９個の抗体がＧＰＡ内の同じまたは非常に類似したエピトープを認識する可能性が高いことを示唆している。これらの９個の抗体は「６Ｃ１２」クラスターと称される。７Ｇ４Ｅ９／Ａ８と称される残りの抗体の配列は、その他の９個の抗体と比較してＣＤＲドメイン内で有意な配列差異を示し、このことは、７Ｇ４Ｅ９／Ａ８が、ＧＰＡ上の異なるエピトープを認識する可能性が高いことを示しており、これは、この抗体がヒトＲＢＣのみに結合し、サルＲＢＣには結合しなかったという観察と合致している。

１０個中９個の抗体を、該タンパク質の発現および安定性を改善するために該タンパク質のＣ末端においてマウスＦｃフラグメントに融合された一本鎖Ｆｖ形態として、哺乳類細胞において組換え発現させた。抗体クローン名（ＩＤ）は識別名の最初の部分として略称されている。例えば、「６Ｃ１２Ｂ８／Ｈ８」は「６Ｃ１２」として略称されている。これらのｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質を、表２に示されているとおり、ヒト、アカゲザル、カニクイザルおよびイヌ赤血球への結合に関してＦＡＣＳにより評価した。「６Ｃ１２クラスター」からの２つの抗体を除く全ての抗体はヒトＲＢＣおよびアカゲザルＲＢＣならびに３頭中２頭のカニクイザルから単離されたＲＢＣに同様に結合することを、結果は示した。クローン１Ｂ３および１Ｈ５はＲＢＣへの結合を示さなかった。これはこれらのタンパク質調製物の品質に関連している可能性がある。ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の７Ｇ４抗体はヒトＲＢＣには結合したが、サルまたはイヌＲＢＣには結合しなかった。

表３に示されているのは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態を使用した場合にＦＡＣＳにおいて陽性であった抗体の７つの、ＣＤＲ領域の配列の概要である。１３Ｇ７抗体のＣＤＲの配列との相違が示されている（アスタリスク［^＊］はその位置における同一残基を示し；ダッシュ［−］は欠失残基を示す）。

これらのデータに基づいて、６Ｃ１２クラスターからの２つの抗体、すなわち、１３Ｇ７および６Ｃ１２を、７Ｇ４（ヒトＧＰＡ特異的抗体）と共に、更に詳細な分析のために選択した。これら３つの抗体のＩｇＧ形態を均一になるまで精製し、ついでヒトＧＰＡの種々の調製物に対してＥＬＩＳＡで試験した。「シグマＧＰＡ」は、ヒト赤血球から抽出されたヒトＧＰＡの粗調製物であり、したがって、天然タンパク質の高グリコシル化形態の代表例である。ヒトＧＰＡの組換え発現エクトドメインへの結合の動力学を、表面プラズモン共鳴を用いて測定された。エクトドメインは、ＧＰＡの細胞外領域：ＬＳＴＴＥＶＡＭＨＴＳＴＳＳＳＶＴＫＳＹＩＳＳＱＴＮＤＴＨＫＲＤＴＹＡＡＴＰＲＡＨＥＶＳＥＩＳＶＲＴＶＹＰＰＥＥＥＴＧＥＲＶＱＬＡＨＨＦＳＥＰＥ（配列番号５）を含む７２アミノ酸から構成される。

脱シアル化ヒトＧＰＡ（アシアロＧＰＡ）および組換えＧＰＡ（グリコシル化が不十分であったもの；データ非表示）への７Ｇ４ ＩｇＧ抗体の結合の欠如は、この抗体に対するエピトープがグリカン成分を含有することを示唆している（表４）。これとは対照的に、６Ｃ１２および１３Ｇ７抗体の結合はヒトＧＰＡのシアリル化状態には左右されなかった。

ヒトＧＰＡの種々の調製物に対してＥＬＩＳＡを行った。表４を参照されたい。抗体の希釈曲線からＥＣ５０値を決定した。Ｓｉｇｍａ ＧＰＡは、ヒト赤血球から抽出された部分精製ＧＰＡであり、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（カタログ番号Ｇ５０１７）から購入した。アシアロｈＧＰＡは、脱シアル化されたヒトＧＰＡであり、ＥＣＤは、ＧＰＡの細胞外部分である組換え発現エクトドメインである。

表５に示されているとおり、表面プラズモン共鳴を行って、組換えヒトＧＰＡエクトドメインへの３つの抗体のＩｇＧ形態の結合の動力学を決定した。

抗体６Ｃ１２および１３Ｇ７がＧＰＡに特異的に結合することを更に確認するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＱＭＣＦ１細胞）を、ヒトＧＰＡをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。６Ｃ１２および１３Ｇ７抗体は未トランスフェクト化親ＱＭＣＦ１細胞には結合しなかったが、両抗体は、ヒトＧＰＡ発現プラスミドでトランスフェクトされたＱＭＣＦ１細胞には良好に結合した（図４）。該表面上のヒトＧＰＡの発現は抗ＧＰＡツール抗体１０Ｆ７の結合によって確認された。

これらのデータに基づいて、６Ｃ１２抗体配列を配列のヒト化およびアフィニティの最適化のために選択した。しかし、６Ｃ１２抗体は、６Ｃ１２クラスターにおいて特定された９つの抗体の全ての代表例であると認識されるべきである。なぜなら、これらの抗体は全て、密接に関連したＣＤＲ配列、および赤血球への類似した結合を示すからである。

ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態としてのマウスハイブリドーマ由来抗体の配列を配列番号６〜１４に示す。これらの配列のドメイン構造は、（Ｎ末端からＣ末端へ）：シグナルペプチド、軽鎖可変ドメイン、人工リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ，配列番号１５）、重鎖可変ドメイン、２３０アミノ酸のＦｃフラグメントドメインである。ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の人工リンカー配列は下線で示されている。太字は重鎖可変ドメイン（リンカーのＮ末端側に位置する）および軽鎖可変ドメイン（リンカーのＣ末端側に位置する）を示す。Ｃ末端の２３０アミノ酸は、発現および安定性を改善するために各抗体に付加された共通の抗体Ｆｃドメインである。

実施例３：選択抗体のヒト化および生殖系列化
抗ＧＰＡ抗体６Ｃ１２をヒト化するために、マウスフレームワーク領域をヒトフレームワーク領域により置換する。可変領域は不変のままであるが、フレームワーク配列は、該抗体がそのエピトープに結合する能力に影響を及ぼしうる。したがって、重鎖および軽鎖の両方に関して多数の異なるヒトフレームワーク配列を試験することが重要である。表６および７に概要が示されているとおり、重鎖（列）および軽鎖（行）フレームワーク配列の種々のペアを含む多数の変異体を作製することにより、抗体６Ｃ１２のヒト化を行った。８つの異なる重鎖フレームワーク配列および３つの異なる軽鎖フレームワーク配列を使用して、合計２３個の変異体を作製した。

前記表における抗体を該ＩｇＧ形態で発現させ、ヒトグリコホリンＡへのそれらの結合を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験した。結果を表８に示す。

ヒト（Ｈｕ０１〜０３；３個体）、アカゲザル（Ｒｈ０１〜０３；３個体）およびカニクイザル（Ｃｙ０１〜０２；２個体）からの無傷赤血球（ＲＢＣ）へのヒト化変異体の結合を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定した。表９に示されている結果によると、幾つかの変異体（−３、−７、−１９、−２０、−２２、−２３、−２４）はヒトおよびサルの両方のＲＢＣへの結合を保持していた。幾つかの変異体（−３、−５、−６、−１１、−１２、−１４、−１５、−１６）はヒトＲＢＣへの結合の低減を示した。幾つかの変異体（−１、−４、−９、−１０、−１３、−１７、−１８、−２１）はヒトＲＢＣへの全ての結合を喪失した。ＧＰＡ ＥＬＩＳＡの結果とヒトＲＢＣへの結合との間には良好な相関関係があった。特に、変異体１９、２０、２２、２３、２４はヒトおよびサルの両方のＲＢＣへの最高レベルの結合を維持しており、したがって、可能な治療候補として選択された。生殖系列配列との差異ゆえに、ヒト化変異体２０、２３および２４が好ましかった。Ｈｕ６Ｃ１２−２０、Ｈｕ６Ｃ１２−２３およびＨｕ６Ｃ１２−２４の軽鎖配列は同一である。Ｈｕ６Ｃ１２−２０、Ｈｕ６Ｃ１２−２３およびＨｕ６Ｃ１２−２４の重鎖配列は１〜３個のアミノ酸においてのみ、互いに異なっている。ヒトＧＰＡおよびヒトＲＢＣへの結合を保持していたヒト化抗体は、３つの異なる軽鎖（ＶＫ．１、ＶＫ．１ａおよびＶＫ．１ｂ）と６つの異なる重鎖（ＶＨ．１ｂ、ＶＨ．１ｃ、ＶＨ．１ｄ、ＶＨ．１ｅ、ＶＨ．１ｆ、ＶＨ．１ｇ）（それらの配列は附録Ａに含まれている）との組合せを含有していた。最も有望な候補であるＨｕ６Ｃ１２−２０、Ｈｕ６Ｃ１２−２３およびＨｕ６Ｃ１２−２４は、それぞれ重鎖ＶＨ．１ｃ、ＶＨ．１ｆおよびＶＨ．１ｇと組合された同じ軽鎖ＶＫ．１ｂから構成される。特に、Ｈｕ６Ｃ１２−２４は、ヒト生殖系列配列とのアミノ酸相違の数が最小であるため、好ましい。

６Ｃ１２のヒト化変異体の重鎖可変ドメインの配列の比較（図５）は、残基Ｔ９８の、Ｒへの変化が、ヒトＧＰＡへの結合の喪失の原因であったことを示している。したがって、残基Ｔ９８はＧＰＡへの結合に決定的に重要であると示唆される。変異体Ｈｕ６Ｃ１２−１７もサルＧＰＡへの乏しい結合を示し、このことは、残基９７がサルＧＰＡへの結合において何らかの役割を果たしていることを示唆しており、結合の改善のためには、この位置においてはＡよりもＱが好ましい。

Ｈｕ６Ｃ１２−２４の生殖系列変異体の作製およびＧＰＡへの結合の試験を行った。生殖系列化は、ヒト生殖系列配列とは異なる残基が生殖系列残基に戻されるプロセスである。これは免疫原性のリスクを更に低減するために行われるが、抗体のその標的への結合にどの残基が決定的に重要であるかに関する情報をも提供しうる。Ｈｕ６Ｃ１２−２４の可変ドメインの配列とヒト生殖系列の配列との比較は、生殖系列とは異なるアミノ酸を特定した。

重鎖可変ドメインに関しては、２２個の生殖系列の逸脱が特定された（フレームワーク領域における７個、ＣＤＲ領域における１５個）。軽鎖可変ドメインに関しては、１６個の生殖系列の逸脱が特定された（フレームワーク領域における２個、ＣＤＲ領域における１４個）。生殖系列から逸脱した各残基を生殖系列残基に個々に変化させ、タンパク質をＦａｂ形態として大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）において発現させた。ＧＰＡは膜貫通タンパク質であり、したがって、ＧＰＡの適切な生理学的構造は、該タンパク質が細胞膜内に存在する場合にのみ存在しうる。赤血球膜の天然の状況でのＧＰＡへの抗体の結合を評価するために、本発明者は、赤血球ゴーストとも称される単離された赤血球膜を利用した。これらの膜は、まず、クエン酸添加全血から赤血球を単離することにより調製される。クエン酸添加全血をＦｉｃｏｌ上に重層し、低速で２０分間遠心分離して赤血球をペレット化する。血漿および他の血液細胞を含有する上清を捨て、ついで、赤血球ペレットを１０細胞容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄する。精製赤血球の１０ｍｌペレットを３０ｍｌの冷低浸透圧２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に再懸濁させ、３０分間インキュベートしてＲＢＣを破壊する。５℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離の後、ヘモグロビン含有上清を捨てる。該膜ペレットに、更に３０ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファーを加え、サンプルを再度、５℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、膜画分をペレット化する。この洗浄および遠心分離工程を更に４回繰り返す。ついで、赤血球膜を２０ｍＬのＰＢＳに再懸濁させて、約２．５Ｅ９細胞／ｍＬに相当する量にし、−２０℃で凍結保存する。ＲＢＣゴーストへの抗体の結合はＥＬＩＳＡにより測定可能であり、この場合、平底９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（２ＨＢ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ）の各ウェルにＲＢＣゴースト懸濁液（１００μｌのＰＢＳ中の５×１０^６）を加え、該プレートを４℃で一晩インキュベートした。該プレートを開始ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングした。抗体または他の試験分子を各ウェルに加え、室温で１．５時間インキュベートした。４回の洗浄の後、１００μｌの適切な検出抗体を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。４回の洗浄の後、適切な検出試薬を使用して、検出抗体を測定した。

生殖系列化変異体をＧＰＡタンパク質およびＲＢＣゴースト膜への結合に関してＥＬＩＳＡによりアッセイし、結果を表１０に要約する。結合および発現はｈｕ６Ｃ１２−２４親抗体に対するものである。相対発現（Ｒｅｌ Ｅｘｐｎ）の列は親Ｆａｂ ＴＰＰ−４９３５の発現レベルに対するＦａｂタンパク質の発現レベルを示す。ｈＲＢＣの列はヒトＲＢＣ膜への結合である。ｎａｔＧＰＡおよびｒｅｃＧＰＡの列は、それぞれ、天然ヒトＧＰＡタンパク質および組換えヒトＧＰＡエクトドメインタンパク質への結合である。

これらの結果は、非生殖系列残基の多くに関しては、生殖系列への復帰がＧＰＡタンパク質および／または赤血球への結合に負の効果を及ぼしたことを示している。特に、Ｔ３３Ｙ、Ｙ５０Ｉ、Ｒ５９ＳおよびＴ９８Ｒの重鎖におけるアミノ酸変化は結合を有意に低減し、このことは、これらの残基がエピトープの認識に重要であることを示している。特に、Ｙ３３Ａ、Ｔ５０Ａ、Ｈ８８Ｑ、Ｒ９０Ｌ、Ｆ９３Ｙの軽鎖におけるアミノ酸変化は結合を有意に低減し、このことは、これらの残基もエピトープの認識に重要であることを示している。しかし、重鎖における６個の残基（Ｅ１Ｑ、Ｉ４８Ｍ、Ｄ５６Ｇ、Ｄ６６Ｇ、Ｌ７０Ｍ、Ｔ７２Ｒ）および軽鎖における５個の残基（Ｓ２４Ｒ、Ａ２６Ｓ、Ｓ４９Ａ、Ｐ５４Ｑ、Ｆ９５Ｙ）は、結合に影響を及ぼさないか又は結合を増強するかのいずれかであることが確認された。残基Ｄ５６Ｇ、Ｓ４９ＡおよびＰ５４ＱはＧＰＡおよびＲＢＣ膜への結合を有意に増強した。

ＣＤＲ−Ｌ１ループは１０個のアミノ酸の非典型的な長さを有すること、および３０位のセリンの挿入によるこのループの長さの修復はＧＰＡへの結合を約７０〜８０％阻止することが認められ、このことは該非典型的ＣＤＲ−Ｌ１ループ構造の重要性を示している。

生殖系列へと突然変異した場合にＧＰＡへの結合の８０％超が阻害される決定的に重要な残基が全てのＣＤＲにおいて特定された。ＣＤＲ−Ｌ３の主な役割は、ＧＰＡへの結合を劇的に低減するＣＤＲ−Ｌ３内の突然変異Ｈ８８Ｑ、Ｒ９０ＬおよびＦ９３Ｙによって明らかにされた。これらのデータは、非典型的な重鎖ＣＤＲ３残基Ｔ９８が結合に決定的に重要であるというヒト化からの知見をも証明している。

単一タンパク質内で、結合に影響を及ぼさない又は結合を改善する個々の生殖系列復帰を組合わせることも調べた。これらの組合わせの結果を表１１に示す（相対発現：Ｆａｂタンパク質の相対的発現レベル；Ｈｕ−ｎａｔ ＧＰＡ：天然ヒトＧＰＡタンパク質；Ｈｕ−ｒｅｃ ＧＰＡ；組換えヒトＧＰＡエクトドメインタンパク質；ｈＲＢＣ：ヒトＲＢＣ膜；Ｃｙｎｏ ｒｅｃ ＧＰＡ：カニクイザル組換えＧＰＡエクトドアミン；Ｃｙｎｏ ＲＢＣ：カニクイザルＲＢＣ膜。タンパク質または膜をプレート上にコーティングし、抗体の結合をＥＬＩＳＡにより決定した。結合は親抗体に対する相対値として示されている。空欄は、結合が試験されなかったことを示す。

特に、ＴＰＰ−５９０６およびＴＰＰ−５９０７の場合のように１０個または１１個の生殖系列復帰が単一タンパク質内に含まれる場合、ヒトＧＰＡタンパク質への結合は７倍〜１３倍増加し、ヒトＲＢＣ膜への結合は９０倍増加した。Ｃｙｎｏ ＧＰＡタンパク質およびＣｙｎｏ ＲＢＣ膜への結合も、これらの変異体に関して、約１．５〜２．５倍増加した。これらのデータは、突然変異ＶＬ：（Ｓ２４Ｒ、Ａ２６Ｓ、Ｓ４９Ａ、Ｐ５４Ｑ、Ｆ９５Ｙ）；ＶＨ：（Ｉ４８Ｍ、Ｄ５６Ｇ、Ｄ６６Ｇ、Ｌ７０Ｍ、Ｔ７２Ｒ）またはＶＬ：（Ｓ２４Ｒ、Ａ２６Ｓ、Ｓ４９Ａ、Ｐ５４Ｑ、Ｆ９５Ｙ）；ＶＨ：（Ｉ４８Ｍ、Ｓ５４Ｇ、Ｄ５６Ｇ、Ｄ６６Ｇ、Ｌ７０Ｍ、Ｔ７２Ｒ）が、ヒト生殖系列に対する配列相違を減少させる一方で、ヒトおよびカニクイザルのＧＰＡおよび赤血球への結合を改善することが可能であったことを示している。ヒト化６Ｃ１２親Ｆａｂ抗体および最終生殖系列６Ｃ１２ Ｆａｂ抗体の配列を表１２に示す。

Ｂｉａｃｏｒｅ装置を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ヒト赤血球膜への抗体結合の動力学的分析も行った。このアッセイにおいては、ヒト赤血球から調製した膜をＬ１センサーマトリックスに付着させ、抗体をＲＢＣ膜上に流した。図６に示されている単一サイクル動態からのデータは、アフィニティ（ＫＤ）が、親６Ｃ１２抗体に関する１３０ｎＭから、軽鎖における単一アミノ酸変化Ｓ２４ＲまたはＡ２６Ｓによりそれぞれ２５ｎＭまたは３４ｎＭへと改善されることを示した。

表１３に示されているとおり、ｈｕ６Ｃ１２−２４の種々の生殖系列化変異体の追加的なＳＰＲ分析は、ＥＬＩＳＡアッセイによって見られた結果を証明した。特に、ＴＰＰ−５９０６およびＴＰＰ−５９０７は、０．９および０．８ｎＭの、ヒトＲＢＣ膜に対するアフィニティを示し、これは、親抗体と比較して、約２００倍改善されている。したがって、Ｈｕ６Ｃ１２抗体変異体ＴＰＰ５９０６およびＴＰＰ−５９０７はヒト赤血球上のＧＰＡへの結合のための魅力的なリード候補に相当する。

実施例４：選択された抗体のアフィニティ成熟
ヒトＲＢＣ膜へのヒト化および生殖系列化６Ｃ１２抗体ＴＰＰ−５９０６結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析は、この抗体が、比較的速いオン速度（Ｋａ＝４Ｅ＋０６）を有し、速いオフ速度（Ｋｄ＝３．４ Ｅ−０３）を有することを示した。したがって、約０．９ｎＭのアフィニティ（ＫＤ）を有するにもかかわらず、ＲＢＣ膜からの５０％解離に関する推定時間は僅か数分であった。Ｂドメインの代わりに挿入されたこの親抗体を含有するＦＶＩＩＩ融合タンパク質は無傷ヒト赤血球に結合することが可能であったが、血漿マトリックス中で約１時間後には約６０％の結合しか観察されなかった。したがって、赤血球へのＦＶＩＩＩ−抗体融合体の結合を増強するためには、より遅いオフ速度を有する抗体が有益であろう。６Ｃ１２抗体のオフ速度を改善するために、アフィニティ（親和性）成熟プロセスを用いた。アフィニティ成熟の出発点は、ヒトＧＰＡを認識しサルＧＰＡと交差反応するヒト化６Ｃ１２−２４抗体であった。ＣＤＲ領域内の全ての位置にアミノ酸置換を含有するＣＤＲ集中（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーを作製した。このライブラリーを、ヒトおよびカニクイザルの両方のＲＢＣ膜ならびに組換えグリコホリンＡタンパク質への結合における変化に関してスクリーニングした。結合を改善する、または結合を低減する、または特定のアミノ酸で置換された場合に効果を示さない、ＣＤＲ内の位置の特定を、これは可能にした。これらの結果に基づいて、特定のアミノ酸に改変された場合に結合の改善をもたらすＣＤＲ内の１１個の位置を選択した。これらの位置に関する結合の改善は、ヒトおよびカニクイザルＲＢＣのＦＡＣＳ分析を用いて確認された。ついで、コンビナトリアルライブラリーをヒト化および生殖系列化６Ｃ１２抗体変異体ＴＰＰ−５９０６のバックボーン上で作製し、この場合、これらの１１個の位置のそれぞれを親残基から変化させて、２０４８個の異なるＣＤＲ配列の理論的複雑性を得た。全体として、このライブラリーは約７００個のユニーク抗体を含有していた。ヒトおよびカニクイザルＲＢＣ膜ならびに組換えグリコホリンＡタンパク質への結合に関するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、このライブラリーをスクリーニングした。これらの結果に基づいて、ヒトおよびカニクイザルＲＢＣ膜ならびに組換えＧＰＡタンパク質への最も改善された結合を示す２４個の抗体のセットを特定した。表１４はこれら２４個の抗体の配列を示す。

アフィニティ成熟Ｆａｂ抗体の結合動力学も測定した。ヒト化および生殖系列化６Ｃ１２抗体の約７００個のユニーク変異体のライブラリーのハイスループットスクリーニングから特定された最良の２４個のアフィニティ成熟抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ装置における表面プラズモン共鳴を用いて、ヒトＲＢＣ膜へのそれらの結合に関して評価した。該Ｆａｂのうちの１５個が、解釈可能なデータを与え、他の４個は、遅いオフ速度を示したが、動力学的値が割り当てられることができず、他の６個は、解釈可能なデータを与えなかった。ＴＰＰ−５９０６はアフィニティ成熟前の親ヒト化および生殖系列化抗体である。結果を、オン速度（Ｋａ）、オフ速度（ｋｄ）、アフィニティ（ＫＤ）、および５０％解離までの推定時間（Ｔ１／２）として、表１５に要約する。

無傷ヒトＲＢＣに対するアフィニティ成熟Ｆａｂ抗体の結合も測定した。フィコール勾配による遠心分離およびＰＢＳバッファー中での洗浄により、ヒトＲＢＣを新鮮な抗凝固処理正常ヒト血液から単離した。正常ヘマトクリットの１／１０に希釈されたＲＢＣを最終濃度７μｇ／ｍｌの精製Ｆａｂ抗体と共に回転振盪機上で室温で１時間インキュベートし、ついでサンプルを採取し、ＲＢＣを遠心分離によりペレット化し、上清を集めた。残りのＲＢＣ懸濁液をＰＢＳバッファー中で２００倍希釈し、回転振盪機上で室温で合計２時間インキュベートし、サンプルを０、５分、２０分、１時間および２時間の時点で取り出し、ＲＢＣをペレット化し、上清を集めた。ついで、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、上清中のＦａｂの量を測定し、その結果を用いて、ＲＢＣに結合した投入Ｆａｂの百分率を計算した。希釈後、より速いオフ速度および／または全体的なより低いアフィニティを有する抗体はＲＢＣから解離し、新たな平衡結合に達すると予想される。ＲＢＣ懸濁液の２００倍希釈の後に結合したままである百分率はヒトＲＢＣへの結合の全体的な強度の指標である。結果を以下の表１６に要約する。親抗体（ＴＰＰ−５９０６）と比較して、アフィニティ成熟抗体は、２００倍希釈後に結合が保持されるという観察により示されるとおり、有意に改善した結合を示したことが認められうる。これとは対照的に、親抗体はＲＢＣから急速に解離し、２０分後には５％未満が結合したままであるに過ぎなかった。一般に、無傷ＲＢＣへの結合とＳＰＲにより測定されたアフィニティ（ＫＤ）との間には良好な相関性が認めれらた。例えば、無傷ＲＢＣへの最強の結合を示したＴＰＰ−７７９２、７７９７、７７９３、７７９４、７７９０および７７８３は最高のアフィニティをも有していた。これらの結果から、ＴＰＰ−７７９６は潜在的候補としては排除された。残りの１０個の抗体（「最良１０セット」）を、Ｃ末端の６×ＨＩＳタグを有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）として再設計し、哺乳類ＨＥＫ−２９３細胞内で発現させ、ＮｉＮＴＡカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

無傷カニクイザルＲＢＣに対するアフィニティ成熟Ｆａｂ抗体の結合を測定した。フィコール勾配による遠心分離およびＰＢＳバッファー中での洗浄により、カニクイザルＲＢＣを新鮮な抗凝固処理血から単離した。正常ヘマトクリットの１／１０に希釈されたＲＢＣを最終濃度７μｇ／ｍｌのＦａｂ抗体と共に回転振盪機上で室温で１時間インキュベートし、ついでサンプルを採取し、ＲＢＣを遠心分離によりペレット化し、上清を集めた。残りのＲＢＣ懸濁液をＰＢＳバッファー中で２００倍希釈し、回転振盪機上で室温で合計２時間インキュベートし、サンプルを０、５分、２０分、１時間および２時間の時点で取り出し、ＲＢＣをペレット化し、上清を集めた。希釈後、より速いオフ速度および／または全体的なより低いアフィニティを有する抗体は解離し、新たな平衡結合に達すると予想される。ついで、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、上清中のＦａｂの量を測定し、その結果を用いて、ＲＢＣに結合した投入Ｆａｂの百分率を計算した。結果を表１７に要約する。アフィニティ成熟抗体は、２００倍希釈後に結合が保持されるという観察により示されるとおり、カニクイザルＲＢＣへの強力な結合を示したことが認められうる。特に、抗体ＴＰＰ−７７９２およびＴＰＰ−７７９０は、２００倍希釈後２時間の時点で８９％および８５％が結合したままであった。その他の抗体は、希釈後のそれらの低減した結合により示されるとおり、カニクイザルＲＢＣへのより弱い結合を示した。これらの結果に基づいて、ヒトおよびカニクイザルの両方のＲＢＣへの最強結合を示す抗体候補として抗体ＴＰＰ−７７９２およびＴＰＰ−７７９０を選択した。カニクイザルにおける薬物候補の試験を可能にするためには、カニクイザルＲＢＣへの強力な結合を示す抗体が望ましい。

実施例５：無傷ヒトＲＢＣへのアフィニティ成熟ｓｃＦｖ抗体の結合
フィコール勾配による遠心分離およびＰＢＳバッファー中での洗浄により、ヒトＲＢＣを新鮮な抗凝固処理正常ヒト血液から単離した。正常ヘマトクリットの１／１０に希釈されたＲＢＣを最終濃度７μｇ／ｍｌの「最良１０」精製ｓｃＦｖ抗体のセットと共に回転振盪機上で室温で１時間インキュベートし、ついでサンプルを採取し、ＲＢＣを遠心分離によりペレット化し、上清を集めた。残りのＲＢＣ懸濁液をＰＢＳバッファー中で２００倍希釈し、回転振盪機上で室温で合計２時間インキュベートし、サンプルを０、５分、２０分、１時間および２時間の時点で取り出し、ＲＢＣをペレット化し、上清を集めた。ついで、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、上清中のｓｃＦｖの量を測定し、その結果を用いて、ＲＢＣに結合した投入ｓｃＦｖの百分率を計算した。希釈後、より速いオフ速度および／または全体的なより低いアフィニティを有するｓｃＦｖ抗体はＲＢＣから解離し、新たな平衡結合に達すると予想される。希釈後に結合したままである百分率はヒトＲＢＣへの結合の全体的な強度の指標である。結果を表１８に要約する。親ｓｃＦｖ（ＴＰＰ−５９０６）は希釈後にヒトＲＢＣへの乏しい結合を示した。正常ヘマトクリットの１／１０のＲＢＣの存在下の初期インキュベーションの後（標的タンパク質の有効濃度が高い場合）、親ｓｃＦｖの全てがＲＢＣに結合したが、２００倍希釈後５分の時点では１６％のみが維持され、２０分後にはｓｃＦｖの全てがＲＢＣから解離していた。これとは対照的に、最良の１０個のアフィニティ成熟ｓｃＦｖは全て、ヒトＲＢＣへの結合の有意な改善を示した。アフィニティ成熟ｓｃＦｖの１０個全てが希釈後２時間の時点で７６％以上の結合を維持していた。該ｓｃＦｖの幾つか、例えばＴＰＰ−７７９２、７７９７、７７８３、７７８１は２時間の時点で９０％を超える結合を維持していた

実施例６：アフィニティ成熟Ｆａｂ抗体のエピトープマッピング
初期ペプチドマッピング研究を行った。この場合、ヒトＧＰＡ細胞外ドメインに由来する一連の重複する２０残基ペプチドをプレートに結合させ、ついで抗体と共にインキュベートした（データ非表示）。これらの実験は、６Ｃ１２ ＩｇＧ抗体により結合されるヒトグリコホリンＡ細胞外ドメインの残基４２〜６１を含有する２０アミノ酸のペプチド（ＧＰ５と称される）を特定した。アフィニティ成熟抗体が同一ペプチドに結合したかどうかを判定し、結合に必要な該ペプチドにおける特定のアミノ酸を更にマッピングするために、表１９に示されているＧＰ５ペプチドの配列を含む一連の重複する８アミノ酸長のペプチドを合成した。

これらのペプチドを、各ペプチドのＮ末端に存在するビオチン部分を介して、ストレプトアビジン被覆プレートの表面に結合させた。２つの濃度の該アフィニティ成熟Ｆａｂの２つ（ＴＰＰ−７７９２およびＴＰＰ−７７９０）を、親ヒト化および生殖系列化６Ｃ１２ Ｆａｂ（ＴＰＰ−５９０６）と共に、ペプチド被覆プレート上でインキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％ ｔｗｅｅｎでの一連の洗浄工程の後、Ｆａｂ上に存在する６×ＨＩＳタグに対する二次抗体を使用して、結合抗体の量を検出した。結果を表２０に要約する。アフィニティ成熟抗体ＴＰＰ−７７９２およびＴＰＰ−７７９０は、親抗体６Ｃ１２に対するエピトープを含有する２１アミノ酸のペプチドＧＰ５に結合した。アフィニティ成熟抗体は８量体ＧＰ８ペプチドにも結合したが、隣接ペプチドＧＰ９には弱くしか結合せず、その他の８アミノ酸の重複ペプチドのいずれにも結合しなかった。８アミノ酸のＧＰ８ペプチドへの結合は、より低い抗体濃度でのより弱いシグナルにより示されるとおり、２０アミノ酸のＧＰ５ペプチドへの結合より弱いようであった。親抗体は、８アミノ酸のペプチドのいずれにも結合できなかった。これはおそらく、この抗体の、より低いアフィニティによるものであろう。これらの結果は、アフィニティ成熟抗体により認識されるコアエピトープが、ＶＲＴＶＹＰＰＥであるペプチドＧＰ８の８アミノ酸配列内に存在することを示している。ペプチドＧＰ７（ＳＶＲＴＶＹＰＰ）はアフィニティ成熟抗体によって認識されず、このことは、ＧＰ８のＣ末端におけるグルタミン酸（Ｅ）が結合に必須であることを示している。同様に、ペプチドＧＰ９（ＲＴＶＹＰＰＥＥ）はアフィニティ成熟抗体によって弱くしか認識されず、このことは、ＧＰ８ペプチドのＣ末端におけるバリン（Ｖ）が結合に重要であることを示している。

アフィニティ成熟抗体のエピトープを更に詳細に定めるために、２０アミノ酸のＧＰ５ペプチドに対応する配列を含有する一連のペプチドを合成した。それらにおいては、各ペプチドは、表２１に示されているとおり、アラニン（Ａ）で置換された１個の残基を含有していた。

Ｎ末端のビオチンをも含有するこれらのアラニンスキャニングペプチドをストレプトアビジンプレートに結合させ、ついでアフィニティ成熟Ｆａｂ抗体ＴＰＰ−７７９０およびＴＰＰ−７７９２または親Ｆａｂ ＴＰＰ−５９０６と共にインキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ ｔｗｅｅｎバッファーでの徹底的な洗浄の後、Ｆａｂ上に存在する６×ＨＩＳタグに対する二次抗体を使用して結合抗体を検出した。結果を表２２に要約する。

２０個のアラニンスキャニングペプチドに関する同一エピトープマッピング研究を、合計７個のアフィニティ成熟Ｆａｂ（ＴＰＰ＃７７８２、７７８３、７７７８、７７９０、７７９２、７７９３、７７９７）について行った。結合における類似した傾向が見られた。ペプチドＧＰ５−１、５−２、５−３、５−４、５−５、５−６、５−７および５−８への結合は同様に強く、このことは、アラニンへの最初の８残基の置換が結合に影響を及ぼさないことを示した。種々のペプチドへの７個全てのアフィニティ成熟Ｆａｂの平均結合を視覚化するために、ＧＰ５−１、５−２、５−３、５−４、５−５、５−６、５−７および５−８への結合の平均の百分率としての各ペプチドへの平均結合を計算した。それは、図７Ａに示されているとおり、グラフにおいてプロットされている。比較のために、図７Ｂに示されているとおり、親抗体ＴＰＰ−５９０６に関して、同じ分析を行った。

ペプチドＧＰ５−１１（ＥＶＳＥＩＳＶＲＴＶＡＰＰＥＥＥＴＧＥＲ）およびＧＰ５−１４（ＥＶＳＥＩＳＶＲＴＶＹＰＰＡＥＥＴＧＥＲ）に存在するアラニン置換はアフィニティ成熟Ｆａｂの結合をそれぞれ１００％および９０％低減し、一方、ＧＰ５−１０（ＥＶＳＥＩＳＶＲＴＡＹＰＰＥＥＥＴＧＥＲ）に存在するアラニン置換は結合を約２０％低減した。したがって、ＧＰ５のＮ末端から数えることにより定めた場合の１１位（チロシン）および１４位（グルタミン酸）の残基がアフィニティ成熟Ｆａｂへの結合に必須である。１０位の残基（バリン）はそれほど重要でない役割を果たす。これらの結果は前記観察と合致している。前記観察においては、ペプチドスキャニング分析は、ＧＰ８に存在する８アミノ酸配列（ＶＲＴＶＹＰＰＥ）としてのコアエピトープを定めた。それはＧＰ５の残基８から１４を含み、したがって、アラニンスキャニングにより決定的に重要なものであると定められた残基１１〜１４を含有する。

アラニンスキャニングペプチドへの親６Ｃ１２ Ｆａｂ抗体の結合のパターンは、アフィニティ成熟Ｆａｂに関して見られたものとは異なっていた。親Ｆａｂの結合は追加的な５つの位置におけるアラニン置換に対して感受性であった。結合は、１０、１１、１２、１４および１５位におけるアラニン置換により９５％以上低減し、残基１３および１６における置換によって７０％および５０％低減した。これは、親抗体に対するエピトープを、７アミノ酸配列ＶＹＰＰＥＥＥに対応する伸長残基１０〜１６として定め、ここで、残基バリン、チロシン、プロリンおよびグルタミン酸（下線部）が決定的に重要である。親Ｆａｂは、アフィニティ成熟Ｆａｂ（ＶＲＴＶＹＰＰＥ）により認識される「コア」配列と重複する一方で、１５位および１６位の追加的残基ＥＥを必要とするようである。追加的残基の置換が親抗体の結合を妨げるという知見は、この抗体の、より低いアフィニティに関連している可能性があり、結合はより容易に妨げられうる。

要約すると、アフィニティ成熟抗体のコアエピトープは配列ＶＲＴＶＹＰＰＥであり、それにおいてはチロシン（Ｙ）およびグルタミン酸（Ｅ）が必須であり、したがって、該抗体に対する決定的に重要な接触点である可能性がある。

Ｈａｂｉｂら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３，ｖｏｌ ４３８ ｐ８２−８９）は抗ＧＰＡナノボディＩＨ４のエピトープをマッピングし、その結果が、同じＧＰＡペプチド配列上のアフィニティ成熟６Ｃ１２ Ｆａｂに関するエピトープマッピングデータと比較して、表２３に要約されている。ＩＨ４ナノボディはＧＰ９、ＧＰ１１およびＧＰ１２ペプチドに良好に結合したが、６Ｃ１２ Ｆａｂはこれらのペプチドのいずれにも結合しなかった。ＩＨ４ナノボディの最強の結合は、６Ｃ１２によっては結合されなかったＧＰ１１ペプチドに対するものであった。アフィニティ成熟６Ｃ１２ Ｆａｂに関するペプチドマッピングデータが示すところによると、それらは、ＧＰ８のＮ末端に存在する配列ＶＲＴＶを必要とし、このＶＲＴＶ配列は、ＩＨ４に対する最強結合体であったＧＰ１１ペプチドには存在しない。したがって、６Ｃ１２ ＦａｂおよびＩＨ ４ナノボディに対するエピトープは別個である。

実施例７：第ＶＩＩＩ因子−ｓｃＦｖ因子融合構築物の作製およびＨＫＢ−１１細胞における発現
Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩと種々のｓｃＦＶ抗体との種々の融合体をコードするＤＮＡを、当技術分野でよく知られた標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。合成的に合成されたＤＮＡ断片、ＰＣＲ、および制限酵素に基づくクローニング技術の組合せを用いた。天然ヒトＦＶＩＩＩシグナルペプチドを全ての構築物において使用した。例えば、ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩのＮ末端において融合した構築物においては、天然ＦＶＩＩＩシグナルペプチドと成熟ＦＶＩＩＩタンパク質の開始部位との間にｓｃＦｖを挿入した。ヒトＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質をコードする得られたｃＤＮＡ配列を哺乳類発現ベクターｐＳＳ２０７に導入した（ｐＳＳ２０７はＭｅｉら，２００６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３４：１６５−１７８に記載されている）。哺乳類細胞系ＨＫＢ１１を該発現ベクターで安定にトランスフェクトし、細胞培養上清においてＦＶＩＩＩ発色活性を測定することにより、対応ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を発現するクローンを選択した。ＦＶＩＩＩ ｓｃＦｖ融合タンパク質を産生させるために、安定にトランスフェクトされたＨＫＢ１１細胞を、ウェーブ（Ｗａｖｅ）発酵槽を使用して１０リットルの規模で培養し、分泌されたＦＶＩＩＩタンパク質を含有する条件培地を回収し、３〜５倍に濃縮し、ついで−８０℃で凍結した。

実施例８：第ＶＩＩＩ因子−ｓｃＦｖ融合タンパク質の精製
ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を、当技術分野でよく知られた方法を用いて精製した。ＦＶＩＩＩ活性のピークを含有する画分をプールし、スクロースを１％の最終濃度で加え、タンパク質濃度をｓｏｌｏＶＰＥにより測定した。アリコートを急速冷凍し、−８０℃で貯蔵した。精製ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥおよび分析用ＳＥＣにより評価した。二段階Ｃｏａｔｅｓｔ ＦＶＩＩＩ発色アッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ活性を評価した。

実施例９：赤血球上にヒトグリコホリンＡを発現する血友病Ａマウスの作製。

ＦＶＩＩＩに基づく治療用物質を評価するために最も広く使用されている動物モデルは、マウスＦＶＩＩＩ遺伝子が破壊されてマウスＦＶＩＩＩタンパク質が完全に欠如している血友病Ａマウスである。これらのマウスは、凝血塊を形成できないこと、および尾部損傷後の急死により特徴づけられる血友病表現型を示す。本明細書に記載されている抗ＧＰＡ抗体はマウスＧＰＡに結合しないため、本発明者らは、ヒトＧＰＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製した。これを行うために、ヒトグリコホリンＡ遺伝子ゲノム配列と周辺調節領域とを含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）をＢＡＣ ＩＤのＲＰ１１−５０５（ＢＡＣの中央にヒトＧＹＰＡ遺伝子を含有する１７６Ｋｂのサイズ）から選択した。クローニングベクター部分を除去した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの受精卵母細胞の前核にＢＡＣを使用した。ゲノム内に挿入されたＢＡＣを含有するファウンダーマウスを、ＢＡＣの５’末端、ＢＡＣの３’末端およびグリコホリンＡ遺伝子のエクソン５に相同なプライマーペアを使用するＰＣＲ分析により特定した。ＰＣＲプライマーの３セット全てに関して陽性であるマウスのみを選択した。ヒトＧＰＡに結合する抗体ＢＲＩＣ２５６を使用するＦＡＣＳ分析により、ファウンダーマウスをそれらの赤血球の表面上のヒトＧＰＡの発現に関してスクリーニングした。マウスＧＰＡを認識するＴｅｒ１１９抗体を対照として使用した。正常ヒトＲＢＣ上で測定されたものと同様のレベルでＲＢＣ上でヒトＧＰＡを発現する１匹のファウンダー動物を特定した。この動物を非トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させてＦ１動物を作製し、これをトランスジーンの存在に関してＰＣＲによりスクリーニングした。ＰＣＲ陽性Ｆ１マウスを、それらのＲＢＣ上のヒトＧＰＡの発現に関して、ＦＡＣＳによりスクリーニングした。ヒトＧＰＡ発現を示す幾つかのＦ１マウスを特定し、（ＢＲＩＣ２５６抗体または６Ｃ１２抗体のいずれがＦＡＣＳ分析に使用されたかに応じて）正常ヒトＲＢＣのヒトＧＰＡレベルの１５〜３０％のヒトＧＰＡレベルを有する１匹の動物（Ｍ９）を選択した。

ついで、Ｍ９ Ｆ１マウスを血友病Ａマウス系統（同様にＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるもの）と交配させて、それらのＲＢＣ上にヒトＧＰＡを発現する血友病Ａマウスを作製した。ヒトグリコホリンＡトランスジーンに関してホモ接合性のマウスは作製不可能であったが、これは、トランスジーンの存在がホモ接合性致死性であるからだと推定された。これは必須遺伝子内へのＢＡＣの組込みによって引き起こされた可能性が高いが、正確な原因は検討しなかった。ヘミ接合性ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスを、７７９２抗ＧＰＡ ｓｃＦＶ（ＰＰＢ−６６７６）を使用するＦＡＣＳにより、それらのＲＢＣの表面上のヒトＧＰＡの発現に関して評価し、正常ヒトＲＢＣ上のシグナルと比較した（図８）。ヒトＲＢＣと比較して小さいサイズのマウスＲＢＣに関する補正の後、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるヒトＧＰＡのレベルはヒトＲＢＣ上のものの５％と計算された。ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスＲＢＣ上のヒトＧＰＡのレベルは低いが、これは尚も、ＲＢＣ当たり約２．５×１０^４〜５×１０^４コピーに相当し、インビトロおよびインビボでＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子の結合を可能にするのに十分であった。

実施例１０：最適特性を有するＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の設計
理想的なＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、十分な凝固活性を維持する一方で、赤血球への迅速かつ強固な結合の特性を有するであろう。これらの特性の幾つかはインビトロで評価されうるが、凝固系の複雑さおよびＦＶＩＩＩの天然クリアランス機構を考慮すると、インビボでの評価も必要であるとも理解される。ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体を設計する際には、いくつかの設計変数を考慮した。これらには以下のものが含まれた：（ｉ）実施例４に記載されているアフィニティ成熟ｓｃＦｖから選択されるべき特異的抗ＧＰＡ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩに融合するＦＶＩＩＩ内の位置；（ｉｉｉ）ｓｃＦｖをＦＶＩＩＩに融合させるためのポリペプチドリンカーの長さおよび組成；（ｉｖ）ａ３ドメインの存在または非存在によって決定される該分子のｖＷＦ結合能；ならびに（ｖ）フューリン切断部位の存在または非存在によって定められる融合タンパク質の鎖組成。最適な特性を有するＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の設計における第１工程は、インビボで最長作用持続時間をもたらす特異的ｓｃＦｖ抗体を定めることであった。異なるアフィニティ成熟変異体間の結合動力学における相違が、ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩに融合された場合に、異なるＲＢＣ結合特性をもたらしうると想定された。

単離されたヒトＲＢＣ膜上の結合動力学ならびに無傷ヒトおよびカニクイザルＲＢＣへの結合の組合せに基づいて、７７９０、７７９２および７７９３と称される抗体６Ｃ１２のｓｃＦｖ変異体をＦＶＩＩＩへの融合のために選択した。これらのｓｃＦｖ変異体は、それらの正味正電荷の度合に基づくことによっても選択された。親ｓｃＦｖである６Ｃ１２は正味の正電荷を帯びており、アフィニティ成熟ｓｃＦｖ変異体の全ては、より一層、正味の正電荷を帯びている。ＧＰＡは正味の負電荷を帯びている。しかし、望ましくない負荷電部分、例えば、ＧＰＡ以外のタンパク質、ＲＢＣ以外の細胞への非特異的結合のリスクを最小にするために、またはＦＶＩＩＩの負荷電領域への分子内結合を回避するために、正味の正電荷の増加が最小であるｓｃＦｖを選択した。

変異体７７９０および７７９２は無傷ヒトおよびカニクイザルＲＢＣに対する最良結合体の１つであり、７７９０はそれらの種々のｓｃＦｖ変異体のうちで最低のＫＤ値を有していた。ヒトＲＢＣ膜へのｓｃＦｖ変異体７７９２の結合動力学は定量不可能であったが、Ｂｉａｃｏｒｅ装置によって定量化されるには遅すぎる低いオフ速度を有することが認められた。ｓｃＦｖ７７９３は、７７９０変異体より速いオン速度を示したが、より速いオフ速度をも示して、全体的なアフィニティはより低かった（ＫＤ ２．４６Ｅ−１１；一方、７７９０に関しては１．５６ Ｅ−１５の推定ＫＤ）。また、７７９３変異体は、無傷ヒトＲＢＣに対しては、より低い結合強度を示したが、無傷カニクイザルＲＢＣに対しては、類似した結合強度を示した。したがって、遅いオフ速度を含む非常に強固な結合を示すｓｃＦｖの具体例として、７７９０および７７９２を選択した。一方、より速いオフ速度を有するが、より速いオン速度を有するｓｃＦｖが、インビボでＦＶＩＩＩをＲＢＣに標的化するのに、より有益でありうるかどうかを評価するために、７７９３を選択した。３つ全てのｓｃＦｖを、Ｂドメインの代わりに、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩに融合させた。融合タンパク質内のＶＨおよびＶＬドメインの順序はＮ末端−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−Ｃ末端として確定された。重鎖および軽鎖のこの順序は、凝集レベルの低下ゆえに、ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体の、より有効な精製を可能にするようであった（データ非表示）。

ｓｃＦｖの場合におけるＶＨおよびＶＬ領域の適切なフォールディングを維持するためには、ＧＧＧＧＳリピートから構成される１５アミノ酸以上のリンカーが必要であることが、当技術分野において十分に確立されている（Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，ＰＮＡＳ ｖｏｌ ８５，５８７９；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９１，ｖｏｌ ２０３ ｐ４６−８８）。グリシンおよびセリン残基から構成されるリンカーの使用は、そのような配列の構造上の柔軟性ゆえに、そして、そのようなリンカーを含有するタンパク質薬を使用して確認された患者における免疫原性の、低いリスクゆえに、当技術分野において十分に確立されている。反復モチーフＧＧＧＧＳの使用は、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９１，ｖｏｌ ２０３ ｐ４６−８８に記載されているとおり、当技術分野でよく知られている。より長いリンカー、例えば２０アミノ酸以上のリンカーは、あるｓｃＦｖ分子の場合に、改善されたフォールディングおよび安定性をもたらすのに有益でありうることも、当技術分野でよく認識されている（例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔら，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００６，ｖｏｌ ３１０ ｐ１００−１１６）。ＶＨ−ＶＬの鎖順序でＶＨ領域とＶＬ領域との間に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１０６）を含む抗体６Ｃ１２のｓｃＦｖ形態とのＦＶＩＩＩ融合体を使用した予備実験は、該タンパク質が、精製中に、予想外に高いレベルの凝集を示すことを示唆した。これは過去に、マウスＧＰＡ特異的抗体Ｔｅｒ１１９由来のｓｃＦｖに対する類似のＦＶＩＩＩ融合体を使用した場合には見られなかった。より長い２０アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１０７）を使用し、ｓｃＦｖの重鎖と軽鎖との順序をＶＬ−ＶＨに変更した場合、タンパク質凝集のレベルは有意に低下し、精製ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の収率は増加した。これらの観察に基づいて、その後の全てのＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質には、配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する２０アミノ酸のリンカーによって隔てられたＶＬおよびＶＨドメインをＶＬ−ＶＨ（Ｎ末端からＣ末端へ）のドメイン順序で含有するｓｃＦｖを含ませた。

ｓｃＦｖのようなＲＢＣ標的化部分をＢドメインの代わりに通常の二本鎖形態のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤに融合させる場合、フューリン部位のＮ末端側またはフューリン部位のＣ末端側のいずれかにｓｃＦｖを配置して成熟二本鎖タンパク質を得ることが可能であり、この場合、それぞれ、重鎖のＣ末端において（ＦＶＩＩＩのＡ１−Ａ２ドメインから構成される）、または軽鎖のＮ末端において（ＦＶＩＩＩのＡ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインから構成される）、ｓｃＦｖを融合させる。どちらの場合も、融合タンパク質は、トロンビンまたは凝固系の他の関連プロテアーゼ、例えば第Ｘａ因子（ＦＸａ）または第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の存在下でｓｃＦｖからＦＶＩＩＩが放出されるように、天然ＦＶＩＩＩトロンビン部位を含むように設計されうる。そのような融合タンパク質設計は、損傷部位での凝固カスケードの活性化の際に、実質的に正常なＦＶＩＩＩａ分子をＲＢＣ表面から放出させる。実験的に証明されていないが、ＲＢＣ結合ｓｃＦｖからのＦＶＩＩＩａの放出は出血の正常な制御をもたらすと予想される。しかし、ＲＢＣに結合したままの活性化ＦＶＩＩＩが、ＦＩＸａおよび第Ｘ因子との複合体形成により、凝固の促進において機能的である可能性もある。全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩのＮ末端またはＣ末端においてｓｃＦｖのようなＲＢＣ標的化部分を融合させる場合、リンカー配列は標的化部分とＦＶＩＩＩとの間に含まれうる。２つの異なるタンパク質またはタンパク質ドメインを融合させる場合、リンカーが有益でありうる、と当技術分野において十分に認識されている。なぜなら、それは構造上の柔軟性をもたらして、２つのタンパク質またはタンパク質ドメインの適切なフォールディング、立体的接近可能性および機能を保証するからである。タンパク質工学の分野で使用される典型的なリンカーは４〜２０アミノ酸の柔軟な配列からなる。リンカーは、典型的には、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９１，ｖｏｌ ２０３ ｐ４６−８８に記載されているとおり、グリシンおよびセリン残基の組合せから構成される。凝固の活性化に際してＲＢＣの表面からのＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体の放出を可能にするためには、プロテアーゼトロンビンおよび／またはＦＸａおよび／またはＦＸＩａの切断部位が含まれうる。トロンビン、ＦＸａおよびＦＸＩａは全て、凝固カスケードの活性化中に生成され、したがって、ＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩタンパク質の放出を可能にするためのプロテアーゼとしての良好な候補である。トロンビン、ＦＸａおよびＦＸＩａの切断部位の配列は当技術分野においてよく知られており、融合タンパク質内のこれらのプロテアーゼ切断部位の使用は既に記載されている（Ｊｅｎｎｙら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖｏｌ ３１，ｐ１−１１）。トロンビンおよびＦＸａは、塩基性アミノ酸残基（典型的にはアルギニン（Ｒ）であり、Ｐ１’残基と称される）のＣ末端側で切断するセリンプロテアーゼである。トロンビンおよびＦＸａおよびＦＸＩａの切断部位は、ＦＶＩＩＩ自体を含む、これらの酵素によって切断されることが知られているタンパク質に由来しうる。あるいは、種々のタンパク質内の切断部位を比較することにより誘導されるコンセンサス（共通）切断部位が誘導されうる。また、認識配列を更に詳細に定めるために、プロテアーゼの基質特異性がインビトロで研究されている（Ｂａｃｋｅｓら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ １８，ｐ１８７−１９３，Ｇａｌｌｗｉｔｚら，２０１２，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（２）：ｅ３１７５６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３１７５６）。

一般的に使用されるトロンビン切断部位はＬＶＰＲＧＳ（配列番号１０８）であり、ここで、Ｒ残基はＰ１’残基である。プロトロンビンから得られた配列ＩＥＧＲはＦＸａの切断部位として一般的に使用されている。種々の異なる配列がトロンビンまたはＦＸａまたはＦＸＩａの切断部位として機能しうることが当技術分野でよく知られている。理論的には、これらのプロテアーゼの切断部位として機能する任意の配列が使用されうる。これらの切断部位は、プロテアーゼ認識配列のいずれかの側に少なくとも４個で最大１５個またはそれ以上のグリシンまたはセリン残基を有する柔軟なグリシンセリンリンカー内に優先的に組込まれる。プロテアーゼ部位は、柔軟なリンカー、例えば、配列ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＬＶＰＲＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１０９）の中央に位置することが可能であり、それは、トロンビン認識配列ＬＶＰＲＧＳのいずれかの部位における１０および１０アミノ酸グリシンセリン柔軟リンカーからなる。あるいは、２以上のプロテアーゼ部位が、リンカー、例えば、配列ＧＧＥＧＲＴＡＴＧＧＧＳＧＬＶＰＲＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１０）のＮ末端に位置することが可能であり、それは、ＦＸａ部位（ＧＥＧＲＴＡＴ；配列番号１１１）、およびそれに続く５残基の柔軟なリンカー、トロンビン認識配列（ＬＶＰＲＧＳ）、およびそれに続く１０残基の柔軟なリンカーからなる。あるいは、プロテアーゼ部位は、柔軟なリンカー、例えば、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１２）のＣ末端に位置することが可能であり、それは、Ｎ末端の１２残基の柔軟なリンカー、およびそれに続くトロンビン認識配列、およびＣ末端の短い４残基の柔軟なリンカーを含有する。リンカー内のプロテアーゼ部位の位置に応じて、そして融合タンパク質における隣接タンパク質ドメインに関連して、切断後の隣接配列上に、異なるリンカー配列が残る。ＦＶＩＩＩのＮ末端におけるｓｃＦｖの融合体の場合、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＬＶＰＲＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧは、ＦＶＩＩＩのＮ末端に結合した配列ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧを残す。ＦＶＩＩＩのＣ末端におけるｓｃＦｖの融合体の場合、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＬＶＰＲＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧは、ＦＶＩＩＩのＣ末端に結合した配列ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＬＶＰを残す。理論的には、多数の異なるリンカー配列が融合タンパク質の適切なフォールディングおよび選択されたプロテアーゼによる効率的な切断をもたらしうるであろう。

標準的な分子生物学的技術を用いて、表２４に列挙されている特徴を有するタンパク質をコードする一連のＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合遺伝子発現カセットを構築した。これらの構築物によりコードされるタンパク質をＨＫＢ１１細胞内で発現させ、精製した。

標準的な分子生物学的技術を用いて、表２４に列挙されている特徴を有するタンパク質をコードする一連のＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合遺伝子発現カセットを構築した。これらの構築物によりコードされるタンパク質をＨＫＢ１１細胞内で発現させ、精製した。

実施例１１：全血中のＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子のインビトロ分配アッセイ
全血を、ｈｕＧＰＡ／Ｈｅｍ Ａマウスから、４％ クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する抗凝固剤中に採取した。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）およびＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合分子を１ ＩＵ／ｍＬでヒトＧＰＡ／Ｈｅｍ Ａマウス由来の抗凝固処理された新鮮な全血に添加（スパイク）し、穏やかに回転させながら室温で２〜３時間インキュベートした。０、５、１５、３０、４５、６０、１２０、１８０分間のインキュベーションの後、１０００ｇで３分間の遠心分離により、血液のアリコートから血漿を調製し、血漿中に残存しているＦＶＩＩＩ活性を、発色アッセイを用いて決定した。添加したＦＶＩＩＩ活性の量から血漿中のＦＶＩＩＩ活性の量を差し引くことにより、ＲＢＣに結合したＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体の量を計算した。

カニクイザルまたはヒト赤血球への分配を評価するために、全血を、カニクイザルまたは正常ヒトボランティアから、４％ クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する抗凝固剤中に採取した。全血をフィコール上に重層し、ついで低速遠心分離を行うことにより、赤血球を精製した。血漿、血小板および白血球を含有する上清を捨て、赤血球ペレットを１０ペレット容量のＰＢＳ（５０ｍＭ リン酸バッファー，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁させた。ついで、赤血球を低速遠心分離によりペレット化し、赤血球を１０容量のＰＢＳ中に再懸濁させた。この洗浄工程を更に４回繰り返し、正常レベルの１％未満のＦＶＩＩＩを有する血友病患者からの血漿（ＧｅｏｒｇｅＫｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ，ＫＳ）に該赤血球を最終的に再懸濁させて、初期血液体積と同等の合計体積にして、ＲＢＣ密度を正常全血のものと同等にした。ついで、ＢＤＤおよびＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子を１ ＩＵ／ｍＬでＨｅｍＡ血漿中のＲＢＣ懸濁液に添加し、穏やかに回転させながら室温で２〜３時間インキュベートした。０、５、１５、３０、４５、６０、１２０、１８０分間のインキュベーションの後、該懸濁液のサンプルを取り出し、遠心分離してＲＢＣをペレット化し、該血漿を集め、凍結した。追加的な対照実験を行い、この場合、ＢＤＤまたはＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子を１ ＩＵ／ｍｌで同じヒト血友病Ａ血漿に添加し、５分間および１８０分間インキュベートした。これらのサンプルを使用して、血漿の存在下での投入ＦＶＩＩＩ活性を決定し、これを用いて、ＲＢＣに結合した分子の百分率を計算した。ついで、Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰアッセイ（ＤｉａＰｈａｒｍａ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて、ＦＶＩＩＩ活性に関して、全ての血漿サンプルを一緒にアッセイした。該アッセイは、９６ウェルプレート形態で、製造業者の説明に従い行った。簡潔に説明すると、５０μＬのＷＨＯ８キャリブレータ、１×Ｃｏａｔｅｓｔバッファーで１００倍希釈された血漿サンプル、および活性化ＦＩＸ／ＦＸ／リン脂質の５０μＬの混合物を各ウェルに加え、ついで、２５μＬの２５ｍＭ ＣａＣｌ２および５０μＬの発色基質Ｓ−２７６５／Ｉ−２５８１を加えた。各試薬添加の間に、振盪しながらプレートを３７℃で１０分間インキュベートした。発色基質の最終添加の後、各ウェルにおけるＦＶＩＩＩ活性を反映する生成したＦＸａの動態（Ｖｍａｘ、ｍＩＵ／分）を、３７℃、４０５ｎｍで１０分間、３０秒間隔で読み取った。血漿中のＦＶＩＩＩ活性の量は未結合ＦＶＩＩＩの量を反映する。血友病Ａ血漿のみ（ＲＢＣ無し）に添加され、５分間インキュベートされた同じ分子のＦＶＩＩＩ活性を１００％に対して正規化した。

データ（表２５を参照されたい）は、血漿中に存在するＢＤＤの量が経時的に有意に変化しないことを示しており、このことは、予想通り、ＢＤＤがＲＢＣに結合しなかったことを示している。しかし、経時的なｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の結合の増加が観察され、このことは、抗ＧＰＡ ｓｃＦｖがヒトＲＢＣへのｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体の結合を媒介していたことを示している（表２６）。特にＴＰＰ−８７９８は、実験をｖＷＦ欠損血漿中で行った場合に、ヒトＲＢＣとの非常に速い結合を示した。ＴＰＰ−８７９８は、ａ３ドメインを含有し主に２本鎖分子であるＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＮ末端に融合した７７９２ ｓｃＦｖからなる。ｖＷＦを含有するヒトヘムＡ血漿の存在下ではＴＰＰ−８７９８がヒトＲＢＣへの結合を示さないという観察は、ＲＢＣへのｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体の結合をｖＷＦが妨げるという証拠を示している。ＴＰＰ−８７４１およびＴＰＰ−８７９８は、７７９２ ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩに融合している部位においてのみ異なり、ＴＰＰ−８７４１は、Ｂドメインの代わりに融合したｓｃＦｖを有し、ＴＰＰ−８７９８は、ＦＶＩＩＩのＮ末端に融合したｓｃＦｖを有する。ＴＰＰ−８７４１およびＴＰＰ−８７９８は共に１２０分後に同様のレベルのＲＢＣ結合を達成したが、ＴＰＰ−８７９８はＲＢＣに、より迅速に結合し、１分後に７６％が結合し、一方、Ｂドメイン融合ＴＰＰ−８７４１は３５％が結合した。これらのデータは、ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩのＮ末端において融合しているＦＶＩＩＩ分子が、より迅速にＲＢＣに結合する分子をもたらすことを示した。それは好ましい特性である。なぜなら、特に、ｖＷＦまたは他の血漿タンパク質がＲＢＣへの結合を妨げうる状況においては、それは、インビボでの、ＲＢＣへの、より完全な結合を可能にするはずだからである。フューリン部位およびａ３ドメインの欠失を含有するＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＮ末端において融合した７７９２ ｓｃＦｖからなるタンパク質ＴＰＰ−９４２３もヒトＲＢＣへの迅速かつ完全な結合を示した。また、ａ３ドメインおよびフューリン部位を含有するＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＣ末端において７７９２ ｓｃＦｖが融合しているＴＰＰ−９０４９は、同じｓｃＦｖを含有する対応Ｎ末端融合体（ＴＰＰ−８７９８）より遅いＲＢＣへの結合を示し、このことは、ＦＶＩＩＩのＣ末端がＲＢＣ標的化ｓｃＦｖへの融合にそれほど好ましくない位置であることを示唆している。

ヒトにおける状況を最もよく模擬している、ヒト血友病Ａ血漿におけるヒトＲＢＣへの分配を、表２６に示す。ａ３ドメインおよびフューリン部位を含有するＦＶＩＩＩ−ＢＤＤにおいてＢドメインの代わりに融合した７７９２ ｓｃＦｖからなるＴＰＰ−８７４１はヒトＲＢＣへの遅く不完全な結合を示し、１２０分後に僅か５２％の結合に達したに過ぎなかった。ＴＰＰ−８７４１の遅い結合は血友病Ａ血漿中のｖＷＦの存在によるものである。フューリン部位およびａ３ドメインの欠失を含有するＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＮ末端において融合した７７９２ ｓｃＦｖからなるＴＰＰ−９４２４は、ヒト血友病Ａ血漿の存在下、ヒトＲＢＣへの非常に迅速で完全な結合を示し、１分以内に７６％が結合し、１５分までに約９５％の飽和結合に達した。興味深いことに、２コピーの７７９２ ｓｃＦｖを含有するｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体は、血友病Ａ血漿において、１コピーのｓｃＦｖを含有するＴＰＰ−９４２４より遅い、ヒトＲＢＣへの結合を示した。各ｓｃＦｖが単一の抗原結合部位しか含有しないことを考えると、１つのｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体中に２コピーのｓｃＦｖを含めることは、アビディティ効果により、ＧＰＡに対するアフィニティを増加させた可能性があると予想されたかもしれない。驚くべきことに、２コピーのＧＰＡ標的化ｓｃＦｖを含有するｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体は、Ｎ末端に１コピーの同じｓｃＦｖを含有するｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体より遅い結合を示したことを、これらのデータは示している。２コピーの７７９２ ｓｃＦｖを含有する３つのｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体のうち、ＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりに２タンデムコピーのｓｃＦｖを含有するＴＰＰ−９９７６はヒトＲＢＣへの最速で最も完全な結合を示した。興味深いことに、２コピーのｓｃＦｖを含むＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖのうち、ＴＰＰ−９９７６はｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおいてインビボで最長の持続性をも示した。

表２７に示されているとおり、特異的ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質は、ヒトＨｅｍＡ血漿において、カニクイザル（Ｃｙｎｏ）由来のＲＢＣにも結合した。ＴＰＰ−９４２４に関して、最速で最も完全な結合が観察され、このことは、この分子がカニクイザルにおける評価のための良好な候補であることを示している。ＴＰＰ−９７１１、ＴＰＰ−９１６１およびＴＰＰ−９９７６もカニクイザルＲＢＣへの良好な結合を示した。ＴＰＰ−８７４１およびＴＰＰ−８７９８のようなα３ドメインを含有していてｖＷＦに高いアフィニティで結合しうるｓｃＦｖ融合体は、ｖＷＦを含有するヒトＨｅｍＡ血漿におけるカニクイザルＲＢＣへの結合をほとんど又は全く示さないことが明らかであった。これらの同じタンパク質（ＴＰＰ−８７４１およびＴＰＰ−８７９８）はｖＷＦ欠損血漿におけるカニクイザルＲＢＣに結合し（表２８）、３０分後に７０〜８０％の結合を達成した。

与えられたｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の、ヒトＲＢＣへの結合は、同じヒトＨｅｍＡ血漿マトリックスにおけるカニクイザルＲＢＣへの結合より速く、より完全であることも認められうる。これはおそらく、ヒトＧＰＡと比較して、カニクイザルＧＰＡに対する抗ＧＰＡ ｓｃＦｖのアフィニティが低いためである。６Ｃ１２抗体に対するエピトープの領域におけるＧＰＡの配列（サル；ＧＲＴＨＹＰＰＥＥおよびヒト；ＶＲＴＶＹＰＰＥＥ）が同一でないことを考えると、これは予想されることである。

実施例１２：グリコホリンＡペプチドＧＰ５へのＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合の動力学
グリコホリンＡへのＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体の結合動力学は、当技術分野でよく知られた技術である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて評価されうる。ヒトＲＢＣからの膜調製物へのＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合のＳＰＲ分析を行う試みは技術的な理由で成功しなかった。しかし、ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体において使用された抗ＧＰＡ抗体６Ｃ１２に対するエピトープを含有することが実施例６において確認されたペプチドを使用することにより、結合データは入手可能であった。ペプチドＧＰ５（ＥＶＳＥＡＳＶＲＴＶＹＰＰＥＥＥＴＧＥＲ）を、精製ＦＶＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の溶液中に浸されたＯＣＴＥＴ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）のプローブに結合させ、結合動力学を該装置により測定し、１：１結合モデルにフィットさせた。選択されたＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質に関する結果を表２９に要約する。ＧＰＡペプチドに対するアフィニティは１３．３〜１．３ｎＭの範囲であり、オフ速度は２．７Ｅ−３〜６．６Ｅ−４の範囲であり、オン速度は３．５Ｅ＋５〜１．２７Ｅ＋６の範囲であることを、該結果は示している。ＲＢＣ膜における適切にフォールディングした無傷ＧＰＡタンパク質に対する真のアフィニティは、２０残基のペプチドへの結合に関して得られた値より高いと予想される。これは、ＲＢＣ膜へのアフィニティ成熟抗ＧＰＡ ６Ｃ１２抗体の結合のアフィニティがＧＰ５ペプチドの場合より約１０倍高いという観察により裏付けられた。

実施例１３：インビトロＲＯＴＥＭ全血凝固アッセイ
最適化ＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合分子の大多数は、循環中への注射後、ＲＢＣに迅速に結合して、血漿中には低レベルのＦＶＩＩＩ活性が残存するであろう。したがって、伝統的な血漿ベース発色アッセイおよびａＰＴＴアッセイはＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩレベルのモニタリングに適さない。したがって、ＲＯＴＥＭ（登録商標）全血凝固アッセイを用いて、ＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子をＨｅｍＡ全血中に添加（スパイク）した後のＦＶＩＩＩ活性を評価した。アッセイを行うために、大静脈を介して採取されたｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスからのクエン酸添加全血を等しいＩＵのＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）発色アッセイに基づく）と室温で混合した。外因性アクチベーター（ＮＡＴＥＭ）の非存在下、２０μＬのｓｔａｒ−ｔｅｍ（登録商標）（２００ｍＭ ＣａＣｌ_２，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＲＯＴＥＭ（登録商標）カップ内に、自動ピペットを使用して３００μＬの処理血液を分注することにより、サンプルを脱灰した。最後のピペッティングの直後に凝固を開始させ、血餅形成を３７℃で２時間連続的にモニターした。ＲＯＴＥＭ（登録商標）分析パラメータには、凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）およびα角度が含まれる。内因性ヒトＦＶＩＩＩを中和するために抗ＦＶＩＩＩ中和モノクローナル抗体ＢＯ２Ｃ１１を使用することにより、正常ヒト全血において、同じアッセイを行った。正常ヒト全血への１００μｇ／ｍｌのＢＯ２Ｃ１１の添加およびＲＯＴＥＭによる分析の後、血餅形成は観察されなかった（図９における「誘導ＨｅｍＡ」）。ＢＯ２Ｃ１１および１ ＩＵ／ｍｌまたは３ ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−Ｆ２１９６Ｋタンパク質の両方の添加、ならびに再石灰化前の２０分間のプレインキュベーションの後、添加ＢＯ２Ｃ１１ ９の非存在下のヒト全血におけるものに類似したレベルにまで凝固を回復させた（図９）。Ｆ２１９６Ｋアミノ酸変化を含有するＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質ＴＰＰ−９４２３の添加は、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−Ｆ２１９６Ｋに関して見られたとおり、ＲＯＴＥＭにおける凝固の同様の回復をもたらした。このアッセイ形態においては、再石灰化による血餅形成の開始の前の２０分のインキュベーション時間内に、添加されたＴＰＰ−９４２３の８０〜９０％がＲＢＣに結合していると予想される。したがって、このアッセイ形態においてＴＰＰ−９４２３に関して観察された凝固活性は、主に、ＲＢＣに結合したＴＰＰ−９４２３に由来し、したがって、血漿中で遊離状態のままであるＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−Ｆ２１９６Ｋと同様の凝固活性をＲＢＣ結合ＴＰＰ−９４２３が示すことを示している。

実施例１４：エクスビボＲＯＴＥＭアッセイを用いたｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩのインビボ薬力学の測定
ＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩタンパク質の薬力学をｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおいて評価した。タンパク質の循環半減期を延長させるためにヒトＦＶＩＩＩがヒトＦｃドメインに遺伝的に融合している、市販のＦＶＩＩＩに基づく薬物であるＥｌｏｃｔａｔｅを、比較体として使用した。Ｅｌｏｃｔａｔｅは、マウスにおいて未修飾ＦＶＩＩＩより２倍長いＴ１／２を有し、未修飾ＦＶＩＩＩタンパク質の場合の約２倍の長さにわたって、出血からＨｅｍＡマウスを保護する（Ｄｕｍｏｎｔら，Ｂｌｏｏｄ ２９，ｐ３０２４−３０３０，２０１２）。ＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子またはＥｌｏｃｔａｔｅを２００ ＩＵ／ｋｇの尾静脈注射によりＨｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスに投与した。２時間〜１６日の範囲の注射後の種々の時点で、４０μＬの４％クエン酸ナトリウムが充填された２５Ｇシリンジを使用して、４００μＬの全血を４匹のマウスから大静脈を介して採取した。３００μＬの全血および２０μＬのｓｔａｒ−ｔｅｍ（登録商標）（０．２ｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）をＲＯＴＥＭ（登録商標）デルタ機のキュベットに直ちに移すことにより、ＲＯＴＥＭにより凝固時間を測定した。時点当たり４匹のマウスの凝固時間中央値を計算した。凝固時間をＦＶＩＩＩ活性のレベルと相関させるために、０．６％〜６０％のＦＶＩＩＩ活性範囲の種々の量の未修飾ＦＶＩＩＩ（発色アッセイからの単位に基づいており、１ ＩＵ／ｍｌの血漿は１００％ ＦＶＩＩＩに等しいと仮定している）をｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスからの抗凝固処理全血に加え、凝固時間をＲＯＴＥＭにより測定した。０．６％ ＦＶＩＩＩは約１４５０秒の凝固時間に相当し、２％ ＦＶＩＩＩは約１１５０秒の凝固時間に相当し、６％ ＦＶＩＩＩは約８００秒の凝固時間に相当し、６０％ ＦＶＩＩＩは約７５０秒の凝固時間に相当することを、これらの結果は示した。ＦＶＩＩＩを含有しないｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスからの未処理全血は２２５０秒以上のＲＯＴＥＭにおける凝固時間を示した。

実施例１５：ｓｃＦｖ抗体のアフィニティ成熟はインビボでのｓｃＦＶ−ＦＶＩＩＩ融合体の薬力学を延長させる
抗ＧＰＡ標的化抗体６Ｃ１２のアフィニティ成熟が、ＦＶＩＩに融合した場合の作用持続時間の改善につながることを確認するために、分子ＴＰＰ−８２７７およびＴＰＰ−９７１１を作製した。ＴＰＰ−８２７７およびＴＰＰ−９７１１は共に、ａ３ドメインおよびフューリン部位が欠失しているＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりに挿入された６Ｃ１２ ｓｃＦｖの変異体を含有する。ＴＰＰ−８２７７はヒト化および生殖系列化形態の６Ｃ１２ ｓｃＦｖ（抗体ＴＰＰ−５９０６）を含有し、一方、ＴＰＰ−９７１１はアフィニティ成熟ｓｃＦｖ変異体７７９２を含有する。追加的な比較分子は、３ａドメインの欠失およびＢドメインの代わりにＦＶＩＩＩに融合したアフィニティ成熟７７９２ ｓｃＦｖを含有するＴＰＰ−９１６１であるが、主に二本鎖の分子である。ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスへの注射の後の種々の時点で、全血凝固時間を、実施例１４に記載されているとおりにＲＯＴＥＭにより測定し、結果を図１０に示す。ヒト化および生殖系列化６Ｃ１２ ｓｃＦｖに融合したＦＶＩＩＩは、約１２００秒の凝固時間により示されるとおり、投与の２４時間後、循環中で、検出可能なＦＶＩＩＩ活性を有していた。しかし、ＴＰＰ−８２７７の注射後３日までに、凝固時間は血友病の範囲に戻り、このことは、ヒト化および生殖系列化６Ｃ１２ ｓｃＦｖに融合したＦＶＩＩＩが急速に循環から排除されたことを示している。これとは対照的に、アフィニティ成熟ｓｃＦｖ ７７９２を共に含有するＴＰＰ−９７１１および９１６１は、延長したＰＤプロファイルを示し、凝固時間は、８〜１０日後になって初めて、血友病の範囲に戻った。このことから、ＫＤを改善し、特にオフ速度を低減する６Ｃ１２抗体のアフィニティ成熟は、ＦＶＩＩＩに融合した場合に循環中の長期持続を達成するために不可欠であったと結論づけられうる。

実施例１６：インビボで薬力学の最大延長を伴うｓｃＦｖ抗体の選択
ＦＶＩＩＩに融合した場合にマウスの循環中で最長の持続性を示したアフィニティ成熟６Ｃ１２ ｓｃＦｖ抗体の特定の変異体を特定するために、ａ３ドメインが欠失しているＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりに融合したそれぞれ７７９０、７７９２および７７９３ ｓｃＦｖ変異体を含有する融合タンパク質ＴＰＰ−８８２０、８７４３および８７４４をｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスに注射し、それらの薬力学（ＰＤ）プロファイルを、読出しとしてエクスビボＲＯＴＥＭを使用して測定し、Ｅｌｏｃｔａｔｅの場合と比較した。図１１に示されているとおり、ＴＰＰ−８７４３（７７９２ ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体）は最長のＰＤ効果を示し、凝固時間は研究期間中（１０日間）に１５００秒以下のままであった。ＴＰＰ−８８２０（ｓｃＦｖ ７７９０）は第６日まではＴＰＰ−８７４３と同様のプロファイルを示したが、第８日までに凝血時間は血友病の範囲（２２５０秒超）まで増加した。ＴＰＰ−８７４４（ｓｃＦｖ７７９３）は非常に短い血中持続性を示し、凝固時間は第３日までに血友病の範囲に戻った。ＴＰＰ−８７４４の迅速なクリアランスは未修飾ＦＶＩＩＩのものに類似している（データ非表示）。結論としては、これらのインビボデータは、ＴＰＰ−８７４３において存在する特定のｓｃＦｖ変異体７７９２が、ＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりに融合した場合に最長持続性をもたらしたことを示している。マウスにおけるＴＰＰ−８７４３の作用持続性もＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合体（Ｅｌｏｃｔａｔｅ）のものより優れていた。

実施例１７：ＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子の薬力学的プロフィールの持続時間に対するＦＶＩＩＩへのフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の結合の効果の評価
ＦＶＩＩＩへのｖＷＦの結合は未修飾ＦＶＩＩＩの循環時間を延長させることが公知であるが、ｖＷＦは、ＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩ分子がＲＢＣに結合する能力を妨げる可能性がある。ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩに融合した抗ＧＰＡ ｓｃＦｖがＲＢＣに結合する能力を立体的に妨げうる大きな多量体タンパク質である。ＲＢＣ標的化ＦＶＩＩＩへのｖＷＦの結合がインビボでの循環時間に正または負の影響を及ぼすのかどうかを決定するために、共にＦＶＩＩＩのＢドメインの代わりに融合した７７９２ ｓｃＦｖから構成される分子ＴＰＰ−８７４１およびＴＰＰ−８７４３を比較した。ＴＰＰ−８７４１は、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤにおいて見出される完全ＦＶＩＩＩ配列を含有するが、ＴＰＰ−８７４３は、ＦＶＩＩＩの主要ｖＷＦ結合領域を含有することが知られているＦＶＩＩＩのａ３ドメインを含む残基１６５２〜１６８２の欠失を含有する。図１２は、ＴＰＰ−８７４３が、ＴＰＰ−８７４１の場合より長い、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおける作用持続時間を有することを示しており、このことは、ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質がより長く循環中で持続することを、ａ３ドメインの欠失が可能にすることを示している。このデータは、ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体へのｖＷＦの結合がＲＢＣへの結合を妨げうることを示唆している。この結論は、ａ３ドメインが欠失したｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質のＲＢＣ結合の増強を示したインビトロでのＲＢＣ分配研究により支持された。

実施例１８：マウスにおける薬力学的プロフィールの持続時間に対する抗ＧＰＡ ｓｃＦｖへの融合のＦＶＩＩＩ内の位置の評価
抗ＧＰＡ ｓｃＦｖが配置されるＦＶＩＩＩ内の位置は、ＲＢＣへの結合の動力学に影響を及ぼしうると理解されうる。ＦＶＩＩＩ内のｓｃＦｖの位置は、ｓｃＦｖがＧＰＡ上のそのエピトープに接近し適切なコンホメーションで結合する能力に影響を及ぼしうる。ｓｃＦｖの領域におけるタンパク質の局所正味電荷のような他の要因も、ＲＢＣの高度負荷電表面上のＧＰＡと相互作用するｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体の能力に影響を及ぼしうる。分子ＴＰＰ−８７４１、８７９８および９０４９は、Ｂドメインの位置において（ＴＰＰ−８７４１）またはＦＶＩＩＩのＮ末端において（ＴＰＰ−８７９８）またはＦＶＩＩＩのＣ末端において（ＴＰＰ−９０４９）ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤに融合した最適なｓｃＦｖ７７９２から構成される。Ｎ末端およびＣ末端における融合のためには、凝固系の局所的活性化の際にＲＢＣ表面からＦＶＩＩＩが除去されることを可能にするために、コンセンサストロンビン切断部位（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＬＶＰＲＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）を含有するリンカーをｓｃＦｖとＦＶＩＩＩとの間に配置した。これらの分子の３つの全てがａ３ドメインを含有し、したがって、ｖＷＦに結合可能である。図１３はｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−８７４１、ＴＰＰ−８７９８およびＴＰＰ−９０４９のＰＤプロファイルを示す。ｓｃＦｖがＢドメイン内に存在するＴＰＰ−８７４１は最短の作用持続時間を有し、第６日までに血友病の範囲に戻った。ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩのＣ末端において融合しているＴＰＰ−９０４９は中間的な作用持続時間を有していた。ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩのＮ末端において融合しているＴＰＰ−８７９８は、ＴＰＰ−８７４１よりも有意に長い作用持続時間を示し、ＴＰＰ−９０４９よりも僅かに改善されていた。これらのデータは、ＦＶＩＩＩのＮ末端へのｓｃＦｖの融合がＢドメインの位置における融合体よりも有意に長いインビボ作用持続時間をもたらしたことを示している。ＦＶＩＩＩのＣ末端におけるｓｃＦｖの融合は、ＦＶＩＩＩのＮ末端での融合と同様に延長した作用持続時間をもたらした。これらの結果は、ＦＶＩＩＩのＮ末端およびＣ末端が、循環中の持続性を延長させるためにＦＶＩＩＩをＲＢＣに標的化するように設計されたｓｃＦｖへの融合のための好ましい部位であることを示している。Ｎ末端における融合はＣ末端における融合に対する僅かな改善をもたらした。

実施例１９：ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の一本鎖および二本鎖形態の比較
内因性ＦＶＩＩＩタンパク質は主に、残基１６４８のフューリン部位での一次ポリペプチドのタンパク質分解切断に由来する２本鎖分子として存在するが、一本鎖ＦＶＩＩＩ分子は、インビボで、より安定でありうる。一本鎖分子はより均質でもあり、したがって、製造がより簡便でありうる。ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の主に一本鎖の形態を作製するために、残基１６４５と残基１６４８との間に位置するフューリン部位（ＲＨＱＲ）を欠失させた。分子ＴＰＰ−９１６１は、Ｂドメインの代わりにＦＶＩＩＩに融合した７７９２ ｓｃＦｖから構成され、ここで、ａ３ドメインは欠失しているが、フューリン部位は完全なままである。分子ＴＰＰ−９７１１は、フューリン部位（ＲＨＱＲ）を含有する残基１６３７〜１６５１の配列ＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲＥＩＴが欠失していること以外はＴＰＰ−９１６１と同一である。ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体ＴＰＰ−６１９５およびＴＰＰ−８２７７は共に、Ｂドメインの代わりにヒト化および生殖系列化６Ｃ１２ ｓｃＦｖ（ｓｏ６Ｃ１２）を含有し、ＴＰＰ−８２７７の場合にはａ３ドメインの欠失により、またはＴＰＰ−６１９５の場合には残基Ｙ１６８０からＦへの突然変異により、共にｖＷＦ結合において欠損している。Ｙ１６８０からＦへの突然変異はｖＷＦ結合を有意に低減することが公知である（Ｌｅｙｔｅら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ ２６６，ｐ７４０−７４６）。ＴＰＰ−６１９５はフューリン部位を含有し、主に二本鎖の分子であり、一方、ＴＰＰ−８２７７はフューリン部位を欠いており、約９０％の一本鎖分子から構成される。図１４はｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるＴＰＰ−９１６１、ＴＰＰ−９７１１、ＴＰＰ−６１９５およびＴＰＰ−８２７７のＰＤプロファイルを示す。アフィニティ成熟ｓｃＦｖ７７９２とのＦＶＩＩＩ融合体の場合、ＰＤプロファイルは、主に一本鎖である１つの分子（ＴＰＰ−９７１１）および主に二本鎖である分子（ＴＰＰ−９１６１）（二本鎖形態は絶対的な凝固活性において若干の利点を有する）の場合に類似していた。予想されたとおり、アフィニティ成熟ｓｃＦｖより低い、ＧＰＡに対するアフィニティを有するヒト化および生殖系列化６Ｃ１２ ｓｃＦｖとのＦＶＩＩＩ融合体は、循環中で短い持続性を示した。主に一本鎖である分子（ＴＰＰ−８２７７）は、主に二本鎖から構成される分子（ＴＰＰ−６１９５）と比較して、２４時間の時点で遥かに良好な凝固活性を示した。投与後３日までに、ＴＰＰ−８２７７および６１９５の両方によりもたらされた凝固活性は血友病の範囲に戻った。ＴＰＰ−８２７７は、ＴＰＰ−６１９５に存在するＹ１６８０Ｆ突然変異より完全なｖＷＦ結合遮断をもたらすと予想されるａ３ドメイン欠失を含有する。ｖＷＦ結合がＲＢＣ結合を低減することを考慮すると、ＴＰＰ−８２７７におけるａ３ドメイン欠失によりもたらされる、より完全なｖＷＦ結合遮断は、Ｙ１６０Ｆ突然変異のみを含有するＴＰＰ−６１９５と比較して優れたＲＢＣ結合および観察された優れた凝固活性をもたらすことが可能であったであろう。全体として、これらのデータは、ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体の一本鎖形態がマウスにおいて有意に改善されたＰＤプロファイルを有さないことを示唆している。しかし、主に一本鎖であるＦＶＩＩＩから構成されるｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体はマウスにおいて有意に劣ったＰＤプロファイルを有さず、より均質な産物に相当し、したがって、製造上の観点から好ましい可能性があるであろう。

実施例２０：１つのｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体における最適なｓｃＦｖ、融合部位およびｖＷＦ結合状態の組合せ
実施例１５〜１９は、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおける最長の持続性が（ｉ）７７９２アフィニティ成熟抗ＧＰＡ ｓｃＦｖ、（ｉｉ）ＦＶＩＩＩのＮ末端におけるｓｃＦｖの融合、（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩへのｖＷＦの結合を阻止または低減するためのＦＶＩＩＩのａ３ドメインの欠失によりもたらされることを実証した。また、ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の一本鎖形態は、タンパク質の均一性がより高いため、好ましい可能性があり、主に二本鎖の形態のタンパク質と比較して、ＰＤプロファイルに負の悪影響を及ぼさない。

したがって、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩのＮ末端において融合した７７９２ ｓｃＦｖから構成される分子ＴＰＰ−９４２４を構築した。これは、同様にａ３ドメインが欠失しており、フューリン部位が欠失している。ＴＰＰ−９４２３と称される、この分子の変異体も構築した。それは、該タンパク質のＦＶＩＩＩ部分内に点突然変異Ｆ２１９６Ｋを含有すること以外はＴＰＰ−９４２４と同一である。Ｆ２１９６Ｋ突然変異は抗ＦＶＩＩＩ抗体ＢＯ２Ｃ１１による中和に対してＦＶＩＩＩを耐性にする。この突然変異は、特に、正常レベルの内因性ＦＶＩＩＩを含有する非ヒト霊長類のような正常動物の血液中で該分子の凝固活性が検出されることを可能にする目的で導入された。ＢＯ２Ｃ１１抗体の添加による内因性ＦＶＩＩＩの中和は血液を血友病性にし、したがって、導入されたＦＶＩＩＩ−Ｆ２１９６Ｋ変異体タンパク質の凝固活性が測定されることを可能にする。

ＴＰＰ−９４２４およびＴＰＰ−９４２３のＰＤプロファイルをｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおいて評価し、結果を図１５に示す。注射後第１０日から、一部のマウスはヒトＦＶＩＩＩに対する抗体を生成していた。これは、ヒトＦＶＩＩＩがマウスにおける外来タンパク質であることを考慮すれば、予想されることである。ある群内のマウスが、同じ群内のマウスよりも有意に長い凝固時間を示した場合、これらの抗ＦＶＩＩＩ抗体の結果として、注射されたＦＶＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を該マウスが排除したと仮定し、該マウスを分析から除外した。結果（図１５）が示すところによると、ＴＰＰ−９４２３およびＴＰ−９４２４は共に、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスの循環における長期持続性を示し、エクスビボ凝固時間は、該試験の最終日である第１６日まで、非血友病の範囲内のままである。

実施例２１：ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおける２コピーの抗ＧＰＡ ｓｃＦｖを含有するｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体のＰＤプロファイル
抗体のｓｃＦｖ形態は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインから構成される単一の抗原結合ドメインを含有し、したがって、エピトープへの結合の観点からは単量体である。ＩｇＧのような全長抗体形態は２つの抗原結合ドメインを含有し、したがって、表面結合エピトープに対する見掛け結合強度は、両方の結合ドメインが隣接エピトープに嵌合するアビディティ効果によって増強されうる。したがって、２コピーの抗ＧＰＡ ｓｃＦｖを含有するｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質は、ＲＢＣの表面上のＧＰＡに対する、増強した結合強度を有しうると予想された。そのような増強した結合強度は、ＲＢＣへの結合の速度を増加させる点、およびｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質がＲＢＣ表面に結合したままである時間を延長させる点で有益であると期待されるであろう。アビディティ効果は、ＲＢＣ表面からのオフ速度を減少させるのに特に重要でありうる。そのようなオフ速度の減少は、循環における、より長い持続性につながるはずであり、それは本発明の主要目的である。したがって、フューリン部位およびａ３ドメインの欠失を含有するＦＶＩＩＩ−ＢＤＤに２コピーの７７９２ ｓｃＦｖが融合しているｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質を構築した。これらの分子における融合部位は以下のとおりであった：（ｉ）ＴＰＰ−９９００；Ｎ末端およびＣ末端、（ｉｉ）ＴＰＰ−９９０１；ＢドメインおよびＣ末端、（ｉｉｉ）ＴＰＰ−９９７６；Ｂドメインの代わりに２個のタンデムｓｃＦｖ、および（ｉｖ）ＴＰＰ−９９７７；Ｎ末端およびＢドメイン。タンパク質ＴＰＰ−９９００、９９０１および９９７６を精製し、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおけるそれらのＰＤプロファイルを、図１６に示されているとおりに決定した。ＴＰＰ−９９７６およびＴＰＰ−９９００が投与されたマウスの幾つかは、血友病の範囲内の凝固時間により示されるとおり、投与分子に対する抗体を第１０日および第１３日に生成していたようであった。それでも、該データは、ＴＰＰ−９９７６およびＴＰＰ−９９０１が長い作用持続時間を示すことを示した。ＴＰＰ−９９００のＰＤプロファイルはＴＰＰ−９９７６およびＴＰＰ−９９０１のものより劣っていたが、このことは、Ｎ末端およびＣ末端にｓｃＦｖを含有する二価融合体は、Ｃ末端に及びＢドメインの代わりにｓｃＦｖを含有する二価融合体、またはＢドメインの代わりにｓｃＦｖの２つのタンデムコピーを含有する二価融合体ほどは好ましくなかったことを示している。７７９２ ｓｃＦｖの単一コピーがＮ末端においてＦＶＩＩＩに融合しているＴＰＰ−９４２３に関するマウスＰＤデータとの比較は、２コピーの７７９２ ｓｃＦｖを含有するｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体がマウスにおける作用持続時間の更なる改善をもたらさなかったことを示している。

実施例２２：ＨｕＧＰＡ／ＨｅｍＡ尾静脈離断マウス出血モデルにおけるｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の有効性の評価
８週齢の雄マウスを、それらの体重によって異なる処置群に無作為化した。尾静脈離断前の種々の時点で尾静脈注射によりマウスに投与した。尾静脈切断の前に、７０μｇ／ｋｇのケタミンおよび０．７ｍｇ／ｋｇのメデトミジンを含有するカクテルでマウスを麻酔（ＩＰ）した。直径が約２．７ｍｍである位置に尾に印を付けた。メデトミジンの麻酔効果を０．７ｍｇ／ｋｇのアチパメゾールでＩＰ注射により逆転させた。印が付けられた部位で尾静脈をメスの刃で切断した。ついで尾を３７℃の生理食塩水チューブ内に３分間浸して、切断による血液を洗い流した。ついでマウスを、４×８インチの加熱パッド上に配置された白い紙の寝具を含む清潔な檻に戻した。罹患状態の観察を、次の９時間は１時間ごとに行い、ついで、切断の２４時間後に最終的な観察を行った。ＴＶＴ損傷の２４時間後の生存率を図１７においてプロットした。これらの結果は、ＴＰＰ−９４２３が、該タンパク質の単回注射後第３、４、６および７日に、出血に対する防御をもたらしたことを示している。生存により測定された、出血に対する防御のレベルは、同じマウスにおけるこの分子のＰＤプロファイルと合致しており、それは第３日〜第７日に６％〜２％のＦＶＩＩＩレベルと同等の凝固活性を示した（図１５）。

実施例２３：カニクイザルにおけるＴＰＰ−９４２３の測定
カニクイザル（Ｃｙｎｏ）のような非ヒト霊長類は、ヒトに、より密接に関連した種を代表するものであり、したがって、ＦＶＩＩＩ分子に対する患者の応答を予測する可能性が高い。カニクイザルにおけるｓｃＦＶ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の持続性を評価するために、１つのアミノ酸変化Ｆ２１９６Ｋを該タンパク質のＦＶＩＩＩ部分に施した。この単一アミノ酸変化は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＢＯ２Ｃ１１によるＦＶＩＩＩ活性の中和を阻止する一方で、ＦＶＩＩＩ自体の凝固活性には影響を及ぼさない（Ｌｉｎら，２０１５，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，１０（１） ｅ０１ １６５７７．ｄｏｉ：１０．１３７１）。ＢＯ２Ｃ１１ ｍＡＢはサルＦＶＩＩＩをも中和しうる。Ｆ２１９６Ｋ突然変異の効果がｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体に移されうることを確認するために、タンパク質ＴＰＰ−９４２３を、ヘモクロン・シグネチャ・エリート（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｅｌｉｔｅ）装置（Ａｃｃｒｉｖａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用する全血凝固アッセイにおいて試験した。全血をカニクイザルから３．２％ シトラート中に９：１（血液対シトラート）の比で集め、必要になるまで最長４８時間、４℃で保存した。抗凝固処理したカニクイザル全血を種々の濃度のＢＯ２Ｃ１１ ｍＡＢと共にインキュベートし、または未処理のままに、ついでヘモクロン（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ）キュベットに加え、ａＰＴＴプログラム設定を用いて凝固時間を測定した。正常ＦＶＩＩＩレベルを含む正常凝固系を有する正常カニクイザルから血液が採取されたことを考えると予想通り、ＢＯ２Ｃ１１の非存在下、カニクイザル全血は約８０秒の凝固時間で急速に凝固した（図１８）。予想通り、中和抗ＦＶＩＩＩ ｍＡＢ ＢＯ２Ｃ１１を漸増濃度で抗凝固処理カニクイザル全血に添加したところ、凝固時間は増加し、やがて、約１８０秒でプラトーに達した（図１８）。これらの結果に基づいて、内因性サルＦＶＩＩＩを完全に中和するのに十分な濃度として１００μｇ／ｍｌのＢＯ２Ｃ１１濃度を選択し、この濃度を全ての後続アッセイにおいて用いた。

ＢＯ２Ｃ１１による阻害に対するＴＰＰ−９１６１（７７９２ ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＢドメインの代わりに融合しており、ａ３ドメインが欠失しており、Ｆ２１９６Ｋを含有する）の耐性を評価するために、抗凝固処理カニクイザル全血を１００μｇ／ｍｌのＢＯ２Ｃ１１および漸増濃度のＴＰＰ−９１６１と混合した。ついで凝固時間をヘモクロン装置で測定した。ＴＰＰ−９１６１に対する直線的な用量応答が認められ（図１９）、１００％の正常ＦＶＩＩＩと同等である１ ＩＵ／ｍｌのＴＰＰ−９１６１は、凝固時間を、ＢＯ２Ｃ１１の非存在下のカニクイザル全血の凝固時間に戻した。これらのデータは、ＴＰＰ−９１６１がＢＯ２Ｃ１１に対して耐性であることを示している。残基２１９６ＦがＫに改変された任意のＦＶＩＩＩ含有タンパク質のＦＶＩＩＩ活性は、外挿により、このエクスビボアッセイにおいて測定可能であろう。更に、このアッセイ形態は、カニクイザル由来の全血において、ＴＰＰ−９１６１のＦＶＩＩＩ活性、またはＦ２１９６Ｋを含有する他の任意のＦＶＩＩＩベースのタンパク質のＦＶＩＩＩ活性の定量を可能にする。

実施例２４：カニクイザルにおけるＴＰＰ−９４２３の薬力学的プロファイル
投与前に、ＴＰＰ−９４２３（７７９２ ｓｃＦｖがＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＮ末端において融合しており、ａ３ドメインおよびフューリン部位が欠失しており、Ｆ２１９６Ｋを含有する）の用量応答曲線を、同じヘモクロン（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ）アッセイを用いるＰＤ試験において使用された４頭の成体雄カニクイザルから採取された全血において作成した。２つの別々の採血物からの三重のサンプルにおいてアッセイを行った。２つの採血物からの平均が図２０にプロットされている。４頭全ての動物が、７．５％ ＦＶＩＩＩから１００％ ＦＶＩＩＩの範囲にわたる直線的な用量応答を示した（図２０）。該用量応答曲線は各動物において異なっていたため、個々の曲線を用いて、ＰＤ試験における各動物に存在する同等のＦＶＩＩＩレベルを推定した。

ＴＰＰ−９４２３に対する用量応答曲線を作成するために使用したのと同じ４頭のカニクイザルに、２００ ＩＵ／ｋｇ（発色アッセイに基づく単位）のＴＰＰ−９４２３を投与し、種々の時点で全血サンプルを３．２％ シトラート（シトラート：血液の１：９の比）中に採取した。内因性サルＦＶＩＩＩを中和するために１００μｇ／ｍｌのＢＯ２Ｃ１１を加えた後、全血の凝固時間を、ａＰＴＴプログラムを用いてヘモクロンにおいて測定した。各血液サンプルに関して二重または三重アッセイを行い、平均値を計算した。結果を図２１に要約する。投与前の凝固時間は、予想通り、１３０〜１５０秒の範囲であった。なぜなら、サルＦＶＩＩＩはＢＯ２Ｃ１１により中和されていたからである。投与後、４頭全ての動物において凝固時間は８０〜９０秒に低下し、これは、エクスビボ用量応答曲線に基づいて、１００％を超えるＦＶＩＩＩ活性であると解釈される。したがって、ＴＰＰ−９４２３は、４頭全てのカニクイザルにおいて、明らかな薬力学的効果を示した。投与後の時間の経過と共に、４頭全ての動物における凝固時間は徐々に増加した。特に興味深いのは、約１５％ ＦＶＩＩＩと同等のレベルで凝固時間が維持される持続時間である。なぜなら、１０％〜１５％のＦＶＩＩＩレベルは全ての出血事象から血友病Ａ患者を防御する、と十分に理解されているからである。図２１のエクスビボ用量応答曲線に基づいて、正常レベルの約１５％のＦＶＩＩＩ活性レベルに相当する各動物に関する凝固時間を確立することが可能であった。図２１には、１５％のＦＶＩＩＩレベルが点線で示されている。これらの基準に基づいて、ＦＶＩＩＩレベルは、カニクイザル２においては第１１日まで、そしてカニクイザル１、３および４においては第９〜１０日まで、１５％以上に維持された。比較すると、２００ ＩＵ／ｋｇの同じ用量において、カニクイザルにおける実験的薬物動態データに基づけば、未修飾組換え全長ＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩ活性を１５％以上に１日間しか維持しないと予想された。したがって、ＴＰＰ−９４２３はカニクイザルの循環において未修飾組換えＦＶＩＩＩより約１０倍長い持続性を示す。公開されている薬物動態学に基づく、カニクイザルにおける２００ ＩＵ／ｋｇ用量のＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合体のモデリングは、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が投与後第３日までＦＶＩＩＩレベルを１５％以上に維持すると予測した。したがって、ＴＰＰ−９４２３は、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃより約３倍長く、ＦＶＩＩＩレベルを１５％以上に維持した。抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体生成により示されるとおり、ヒトＦＶＩＩＩはサルにおいて免疫原性であることが当技術分野でよく知られている［Ｃａｎａｄｉａｎ ＰＲＯＤＵＣＴ ＭＯＮＯＧＲＡＰＨ，Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）Ｓｏｌｏｆｕｓｅ（商標）（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）、（登録商標）Ｔ．Ｍ．Ｗｙｅｔｈ ＬＬＣ Ｐｆｉｚｅｒ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．，Ｌｉｃｅｎｓｅｅ（承認日：２０１３年７月１０日）およびＦＤＡ（ＣＢＥＲ Ｈｏｍｅ Ｐａｇｅ）９．２６．２００７ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ，９／２６／２００７］。抗体生成は、典型的には、ヒトＦＶＩＩＩの投与後最初の２週間以内、そして早くも７日目に見られる。ＴＰＰ−９４２３のカニクイザルＰＤ試験において、動物１、３および４は、第１２日までに検出可能な結合性抗薬物抗体（ＡＤＡ）を生成したが、動物２においては、ＡＤＡは測定できなかった。また、ＰＤ試験からの全血のアリコート中へのＴＰＰ−９４２３のエクスビボスパイクイン、およびそれに続く、ヘモクロンにおける凝固時間の測定（ＢＯ２Ｃ１１の存在下）は、動物１、３および４においては、早くも第１０日に中和性ＡＤＡが出現していたが（データ非表示）、動物２においてはそうではなかったたことを示している。したがって、ヒトＦＶＩＩＩに対する抗体の生成は動物１、３および４におけるＰＤ効果の持続期間に負の影響を及ぼした可能性がある。したがって、ＡＤＡを生成しなかった動物２における、１５％以上のＦＶＩＩＩの、１１日の時間は、より妥当な値である可能性が高い。一方、動物１、３および４における、１５％以上の、９〜１０日は、ＡＤＡ生成ゆえに、低減していた可能性がある。

実施例２５：主に１本鎖である分子から構成されるように設計されたＴＰＰ−９４２４の追加的変異体
ＴＰＰ−９４２４／９４２３は、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスおよびカニクイザルの両方において、望ましい薬力学を示したが、ＨＫＢ１１細胞から発現および精製されたこのタンパク質は、約６５％の一本鎖分子と３５％の二本鎖分子との混合物から構成される。一本鎖分子の割合は、未修飾ＦＶＩＩＩ分子に関して典型的に見られるものより高いが（これは、ＴＰＰ−９４２４／９４２３におけるフューリン部位の欠失に起因する特徴である）、製造の目的には、該分子の一本鎖形態の割合を＞７０％、または＞８０％、または＞９０％、または＞９５％、または＞９８％、または１００％へと更に増加させることが望ましいかもしれない。ＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖を生成する、フユーリン部位（ＲＨＱＲ）におけるＦＶＩＩＩの通常の切断は、プロテアーゼであるフューリン（ＰＡＣＥとも称される）または同様のプロテアーゼにより触媒されると考えられている。この切断はゴルジ−ＥＲ系におけるＦＶＩＩＩの翻訳後修飾中に生じる。翻訳後修飾は、しばしば、細胞型依存的であり、したがって、ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体の一本鎖形態の割合は、発現に使用される細胞型に応じて、そして同じ細胞型において生成された安定なクローン間でも変動する可能性がある。したがって、ＦＶＩＩＩに基づく薬物の製造に典型的に使用されるＢＨＫ２１またはＣＨＯ細胞を使用することにより、一本鎖ｓｃＦＶ−ＦＶＩＩＩ融合体の割合は、本明細書に記載されているｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質を製造するために使用されるＨＫＢ１１細胞において得られたものから変化する可能性がある。

ＴＰＰ−９４２４およびＴＰＰ−９４２３がフリン部位の欠失にもかかわらず切断されて重鎖および軽鎖を生成するメカニズムは完全には解明されていない。ＴＰＰ−９４２３に存在するＮ末端配列の分析は、該タンパク質の一本鎖形態の、予想されるＮ末端と、配列ＳＦＳＱＮＤＥ（全長ＦＶＩＩＩにおける残基７４１〜７４７）を含有する第２の種のＮ末端との両方を特定した。このことは、切断部位が配列ＥＰＲＳＦ（全長ＦＶＩＩＩの残基７３８〜７４２）における残基Ｒ７４０と残基Ｓ７４１との間に存在していたことを示している。残基Ｒ７４０は、全長ＦＶＩＩＩにおけるＡ２ドメインとＢドメインとの間の天然に存在するトロンビン部位である。セリンプロテアーゼ、例えばフューリンおよびトロンビンは関連配列においてタンパク質を切断するため、通常のフューリン切断部位の非存在下では、フューリンは、ＴＰＰ−９４２３およびＴＰＰ−９４２４内にフューリン部位が存在したであろう位置から１０アミノ酸以内に存在するＲ７４０トロンビン部位を切断する。

フューリン部位が欠失しているＦＶＩＩＩタンパク質の状況において、ｓｃＦｖがＢドメインの代わりに融合している場合、該分子は、例えばＴＰＰ−９７１１の場合と同様に、９０％を超える一本鎖の分子として産生されたことも、本発明者らは観察している。これは、Ｒ７４０トロンビン部位と、フリン部位が通常ＦＶＩＩＩ中に見出される場所との間の、追加的なアミノ酸配列の存在が、フユーリンがＲ７４０において効率的に切断するのを妨げることを示唆している。

これらの観察に基づいて、フューリンによる切断を低減するために、２つの追加的なｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合分子を設計した。該設計は、Ｒ７４０トロンビン部位の欠失、およびＢドメインの位置の柔軟な非免疫原性リンカーの挿入を含む。特定の配列設計が例示として記載されているが、Ｒ７４０トロンビン認識配列（ＩＥＰＲＳＦ）の一部もしくは全部の欠失、および／または、より長くてもより短くてもよく、あるいはＧもしくはＳ以外のアミノ酸を含みうる異なるリンカー配列を含む代替的配列設計が、同じ目的に役立つ可能性があり、本発明に含まれる、と理解されるべきである。分子ＴＰＰ−１０２９７およびＴＰＰ−１０２９８を設計した。ＴＰＰ−１０２９７はＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖との間に２０残基の柔軟なリンカー（太字）を含み、その結果、配列は、…ＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳＱＮＧＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＧＤＥＮＱＳＰＲ…となり、これは全長ＦＶＩＩＩの残基７３２〜１６８９に及ぶ。ＴＰＰ−１０２９８はＲ７４０トロンビン部位の欠失および６残基の柔軟なグリシンリンカー（太字）を含有し、その結果、ＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖との間の配列は、…ＳＫＮＮＡＩＥＰＧＧＧＧＧＧＤＥＮＱＳＰＲ…となり、これは全長ＦＶＩＩＩの残基７３２〜１６８９に及ぶ。

ＴＰＰ−１０２９７およびＴＰＰ−１０２９８は共に、ＨＫＢ１１または他の適切な哺乳類細胞型において発現され、発現されたｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質は精製され、該タンパク質の鎖組成はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価されるであろう。これらのタンパク質のいずれかが主に一本鎖分子である場合、例えば＞７０％または＞８０％または＞９０％または＞９５％または＞９８％が一本鎖である場合、これらのタンパク質のＰＤプロファイルは、前記実施例に記載されているとおり、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおいて評価されるであろう。ＴＰＰ−１０２９７およびＴＰＰ−１０２９８内へのＦ２１９６Ｋアミノ酸変化の組込みは、それらのＰＤプロファイルがカニクイザルにおいて評価されることを可能にするであろう。

実施例２６：主に二本鎖の分子から構成されるように設計されたＴＰＰ−９４２４の追加的変異体
本明細書に記載されているＴＰＰ−９４２３および９４２４のような、主に一本鎖形態のｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質は、動物モデルにおいて延長した作用持続時間を有するが、主に二本鎖の形態もインビボでの長い作用持続時間を有すると予想されることも理解される。実施例１９は、ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合体のうちの１つの一本鎖形態がｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおける作用持続時間の有意な改善をもたらさなかったことを示している。ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の二本鎖形態は、潜在的により大きい不均質性ゆえに、製造にそれほど望ましくない可能性があるが、既存の未修飾組換えＦＶＩＩＩ薬は、大部分が二本鎖であるＦＶＩＩＩと、典型的には５〜２０％の範囲の可変量の一本鎖ＦＶＩＩＩとから構成されることも理解される。本明細書に記載されている最適化ｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の全ての二本鎖形態は、望ましい薬理学的特性、特に、現在市販されているＦＶＩＩＩ系薬物と比較して有意に長い循環時間を有すると予想され、したがって、明示的に含まれる。

ＴＰＰ−１０２９９は、ＨＫＢ１１または他の適切な哺乳類細胞型において発現され、発現されたｓｃＦｖ−ＦＶＩＩＩ融合タンパク質は精製され、該タンパク質の鎖組成はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価されるであろう。該タンパク質が主に二本鎖分子である場合、例えば＞７０％または＞８０％または＞９０％または＞９５％または＞９８％が二本鎖である場合、ＰＤプロファイルは、前記実施例に記載されているとおり、ｈｕＧＰＡ／ＨｅｍＡマウスにおいて評価されるであろう。ＴＰＰ−１０２９９内へのＦ２１９６Ｋアミノ酸変化の組込みは、ＰＤプロファイルがカニクイザルにおいて評価されることを可能にするであろう。

実施例２６：追加的配列
以下に追加的な配列を示す。

本発明は特定の実施形態および実施例に関して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修飾および変更が施されることが可能であり、均等物が代用されうる、と理解されるべきである。したがって、本明細書および実施例は限定的なものではなく、例示的なものとみなされるべきである。更に、本明細書において言及されている全ての論文、特許出願および特許の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。

Claims (28)

1. 機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと、赤血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインとを含む組換え融合タンパク質。
2. 機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが全長第ＶＩＩＩ因子またはＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
3. 膜タンパク質がグリコホリンＡまたはバンド（Ｂａｎｄ）３である、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
4. 結合ドメインが抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子である、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
5. 結合ドメインがｓｃＦｖであり、膜タンパク質がグリコホリンＡである、請求項４記載の組換え融合タンパク質。
6. ｓｃＦｖが、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７からなる群から選択される重鎖を含む、請求項５記載の組換え融合タンパク質。
7. ｓｃＦｖが、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６からなる群から選択される軽鎖を含む、請求項５記載の組換え融合タンパク質。
8. ｓｃＦｖが、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７からなる群から選択される重鎖と、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６からなる群から選択される軽鎖とを含む、請求項５記載の組換え融合タンパク質。
9. ｓｃＦｖがＢドメインにおける機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド内に挿入されており、Ｂドメインの大部分が除去されている、請求項５記載の組換え融合タンパク質。
10. ｓｃＦｖが機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＮ末端に融合している、請求項５記載の組換え融合タンパク質。
11. ｓｃＦｖがＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩであり、ここで、標的化ドメインが機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端に融合している、請求項５記載の組換え融合タンパク質。
12. 機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、ｖＷＦへの、低減した結合を含み、またはｖＷＦへの結合を含まない、請求項１〜１１のいずれか１項記載の組換え融合タンパク質。
13. 機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのａ３ドメインの欠失を含む、請求項１２記載の組換え融合タンパク質。
14. 機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのａ３ドメインの欠失が第ＶＩＩＩ因子の残基１６５２〜１６８２の欠失を含む、請求項１３記載の組換え融合タンパク質。
15. 機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが主に一本鎖形態の組成物を含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の組換え融合タンパク質。
16. 一本鎖形態が、機能的第ＶＩＩＩ因子の残基１６４８におけるフューリンタンパク質分解切断部位を除去することにより生成される、請求項１５記載の組換え融合タンパク質。
17. 一本鎖形態が、機能的第ＶＩＩＩ因子の残基１６４５〜１６４８を欠失させることにより生成される、請求項１５記載の組換え融合タンパク質。
18. 一本鎖形態が、機能的第ＶＩＩＩ因子の残基１６３７〜１６５１を欠失させることにより生成される、請求項１５記載の組換え融合タンパク質。
19. 組換え融合タンパク質が、配列番号１１３〜１３３からなる群から選択される配列を含む、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
20. 請求項１〜１９のいずれか１項記載の組換え融合タンパク質の治療的有効量と薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物。
21. 血液疾患の治療を要する患者に、請求項１〜１９のいずれか１項記載の組換え融合タンパク質の有効量を投与することを含む、血液疾患の治療方法。
22. 循環半減期の延長が患者にとって有益であるタンパク質と、赤血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインとを含む組換え融合タンパク質。
23. 膜タンパク質がグリコホリンＡまたはバンド３である、請求項２２記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
24. 結合ドメインが抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、ペプチド、ペプチド模倣物または小分子である、請求項２２記載の組換え融合タンパク質。
25. 結合ドメインがｓｃＦｖであり、膜タンパク質がグリコホリンＡである、請求項２４記載の組換え融合タンパク質。
26. ｓｃＦｖが、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７からなる群から選択される重鎖を含む、請求項２５記載の組換え融合タンパク質。
27. ｓｃＦｖが、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６からなる群から選択される軽鎖を含む、請求項２５記載の組換え融合タンパク質。
28. ｓｃＦｖが、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７からなる群から選択される重鎖と、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６からなる群から選択される軽鎖とを含む、請求項２５記載の組換え融合タンパク質。

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