KR20160013868A - 키메라 fvii-xten 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20160013868A
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gpiib
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조 살라스
시위안 탄
로버트 피터스
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바이오젠 엠에이 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 FVII, XTEN 폴리펩타이드, 및 GPIIb/IIIIa 수용체의 비활성 형태의 α 및/또는 β 아단위에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 FVII 분자를 제공한다. 항체 및 항원 결합 분자는 이종성 모이어티, 예를 들어 반감기 연장 모이어티에 유전적으로 융합되고/되거나 접합될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 분자를 제조하고 사용하는 방법을 포함한다.

Description

키메라 FVII-XTEN 분자 및 이의 용도{CHIMERIC FVII-XTEN MOLECULES AND USES THEREOF}
응고 인자는 약간의 시간 동안 지혈을 개선하기 위해 환자에게 투여된다. 재조합 DNA 기술의 도래는 응고 장애를 갖는 환자의 치료를 상당히 개선하여, 안전하고 일관된 단백질 치료제의 개발을 허용한다. 예를 들어, 재조합 활성화된 VII 인자("FVII")는 예컨대 A형 또는 B형 혈우병, FVII, XI 응고 인자의 결핍증, 결함적 혈소판 기능, 혈소판 감소증, 또는 폰 빌레브란트 질환(von Willebrand's disease)을 갖는 환자에서 발생하는 주요 출혈의 치료에 널리 사용되고 있다.
이러한 재조합 분자가 효과적이지만, 응고 부위에 치료제를 국재화하거나, 약동학적 특성이 개선되거나, 제조능력이 개선되거나, 트롬보겐생성(thrombogenicity)이 감소하거나, 활성이 증대되거나, 하나 초과의 이들 특징을 갖는, 개선된 버전에 대한 수요가 존재한다.
대체 치료에 의한 혈우병의 치료는 응고 활성의 복구를 표적화한다. 온디맨드식으로(on-demand) 출혈 삽화를 치료하기 위해 또는 예방학적으로 치료함으로써 출혈 삽화가 발생하는 것을 방지하기 위해 이용 가능한, 혈장 유래 및 재조합 응고 인자 제품이 존재한다. 이 제품의 반감기에 기초하여, 치료 섭생은 빈번한 정맥내 투여를 요한다. 이러한 빈번한 투여는 고통스럽고 불편하다. 응고 인자의 반감기를 연장하는 전략은 페길화(Rostin J, et al., Bioconj . Chem . 2000;11:387-96), 글라이코페길화(Stennicke HR, et al., Thromb . Haemost . 2008;100:920-8), 페길화 리포솜을 갖는 제형(Spira J, et al., Blood 2006;108:3668-3673, Pan J, et al., Blood 2009;114:2802-2811), 및 알부민과의 접합(Schulte S., Thromb. Res. 2008;122 Suppl 4:S14-9)을 포함한다.
재조합 활성화된 FVII(rFVIIa; 노보세븐(등록상표(Novoseven)))은 (ⅰ) FVIII 또는 FIX(저해제)에 대한 중화 항체를 갖는 혈우병 환자, (ⅱ) FVII 결핍증을 갖는 환자, 또는 (ⅲ) 수술 절차를 겪은 저해제에 의한 A 또는 B형 혈우병을 갖는 환자에서 출혈 삽화를 치료하기 위해 사용된다. 그러나, 노보세븐(등록상표)은 빈약한 효율을 나타낸다. 고농도의 FVIIa의 반복 투약은 대개, 조직 인자의 부재 하의 활성화된 혈소판에 대한 이의 낮은 친화도, 짧은 반감기 및 빈약한 효소 활성으로 인해, 출혈을 조절하기 위해 필요하다. 따라서, FVIII 및 FIX 저해제 및/또는 FVII 결핍증을 갖는 혈우병 환자에 대한 더 우수한 치료 및 예방 옵션을 위한 충족되지 않은 의학적 수요가 있다.
본 발명은 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 FVII 분자를 개시하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기 특징 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 동일한 GPIIb/IIIa 에피토프에 특이적으로 결합하는 특징;
(b) 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체에 대한 GPIIb/IIIa 결합을 경쟁적으로 저해하는 특징; 또는
(c) 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4의 CDR로부터 선택된, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 상보성 결정 구역(complementarity determining region: CDR) 또는 이의 변이체를 포함하는 특징.
예를 들어, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 6개의 CDR 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
일 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 25, 31, 37, 43 또는 111 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 26, 32, 38, 44 또는 112 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 27, 33, 39, 45 또는 113 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 28, 34, 40, 117 또는 114 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 29, 35, 41, 118 또는 115 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 30, 36, 42, 119 또는 116 중 임의의 하나와 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
또 다른 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 공통 서열 X1YAMS(여기서, X1은 아미노산 잔기 Thr(T), Ser(S) 또는 Ala(A)를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR1;
(ⅱ) 공통 서열 SIX2X3GX4X5TYX6X7DSVKX8(여기서, X2는 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Asn(N)을 나타내고, X3은 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Gly(G)를 나타내며, X4는 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Gly(G)를 나타내고, X5는 아미노산 잔기 Ser(S), Asn(N) 또는 Thr(T)을 나타내며, X6은 아미노산 잔기 Tyr(Y) 또는 Phe(F)를 나타내고, X7은 아미노산 잔기 Leu(L) 또는 Pro(P)를 나타내며, X8은 아미노산 Gly(G) 또는 Arg(R)를 나타냄)을 포함하는 VH-CDR2;
(ⅲ) 공통 서열 GGDYGYAX9DY(여기서, X9는 아미노산 잔기 Leu(L) 또는 Met(M)를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR3;
(ⅳ) 서열 RASSSVNYMY(서열 번호 28)를 포함하는 VL-CDR1;
(ⅴ) 서열 YTSNLAP(서열 번호 29)를 포함하는 VL-CDR2; 및
(ⅵ) 서열 QQFSSSPWT(서열 번호 30)를 포함하는 VL-CDR3.
일 실시형태에서, 키메라 분자에 유용한 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 25, 31, 37, 43 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열;
(ⅱ) 서열 번호 26, 32, 38, 44 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR2 서열;
(ⅲ) 서열 번호 27, 33, 39, 45 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR3 서열;
(ⅳ) 서열 번호 28, 34, 40, 117 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열;
(ⅴ) 서열 번호 29, 35, 41, 118 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR2 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 30, 36, 42, 119 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR3 서열.
또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 97 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 2, 4, 6, 99 또는 98 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 2(34D10 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 4(2A2 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 6(36A8 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 99(4B11 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 98(35D1 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인 또는 GPIIb/IIIa 복합체의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하지 않는다.
몇몇 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 46, 52, 120 또는 126 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 47, 53, 121 또는 127 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 48, 54, 122 또는 128 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 49, 55, 123 또는 129 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 50, 56, 124 또는 130 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 51, 57, 125 또는 131 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
다른 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 8, 10, 100 또는 102 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 9, 11, 101 또는 103 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 9(1H6 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 11(38A8 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 101(38G8 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 103(21F10 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁한다.
소정의 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 58과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 59와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 60과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 61과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 62와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 63과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
일 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 12와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 13(18F7 항체)과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁한다.
FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자가 또한 제공되고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 64, 70 또는 135 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 65, 71 또는 136 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 66, 72 또는 137 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 67, 132 또는 138 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 68, 133 또는 139 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 69, 134 또는 140 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
다른 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 SYWIE(서열 번호 64)를 포함하는 VH-CDR1;
(ⅱ) 공통 서열 EILPGX14GX15TKYNX16KFKG(서열 번호 __)(여기서, X14는 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Thr(T)을 나타내고, X15는 아미노산 잔기 Ile(I) 또는 Tyr(Y)를 나타내며, X16은 아미노산 잔기 Asp(D) 또는 Glu(E)를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR2;
(ⅲ) 서열 LISYYYAMDY(서열 번호 66)를 포함하는 VH-CDR3;
(ⅳ) 서열 RASQDISNYLN(서열 번호 67)을 포함하는 VL-CDR1;
(ⅴ) 서열 YTSRLHS(서열 번호 68)를 포함하는 VL-CDR2; 및
(ⅵ) 서열 QQGNTLPPT(서열 번호 69)를 포함하는 VL-CDR3.
일 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 14, 16 또는 105 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 15, 104 또는 106 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 15(12B2 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 104(38F6 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 106(13C1 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합한다. 여전히 다른 실시형태에서, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하지 않는다.
다른 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 73, 76, 79, 85 또는 147 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 74, 77, 80, 86 또는 148 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 75, 78, 81, 87 또는 149 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 141, 144, 82, 88 또는 150 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 142, 145, 83, 89 또는 151 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 143, 146, 84, 90 또는 152 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
일 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 17, 18, 19, 21 또는 109 중 임의의 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 107, 108, 20, 22 또는 110 중 임의의 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 107(5C4 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 108(23C10 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 110(37C7 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 20(28C2 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 22(9D6 항체)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁한다.
몇몇 양상에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 91과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 92와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 93과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 94와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 95와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 96과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
일 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 23과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 24(28F4 항체)와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합한다.
다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 (a) 단일 사슬 Fv("scFv"); (b) 다이아바디; (c) 미니바디; (d) 항체의 폴리펩타이드 사슬; (e) F(ab')2; 또는 (f) F(ab)를 포함한다.
본 발명의 몇몇 양상에서, 키메라 분자는 FVII와 XTEN 폴리펩타이드 사이, FVII와 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 사이, 또는 XTEN 폴리펩타이드와 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 사이의 임의의 링커를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 키메라 분자는 (ⅰ) FVII-(L1)-X-(L2)-Tm; (ⅱ) FVII-(L1)-Tm-(L2)-X; (ⅲ) Tm-(L1)-X-(L2)-FVII; (ⅳ) Tm-(L1)-FVII-(L2)-X; (ⅴ) X-(L1)-Tm-(L2)-FVII; 및 (ⅵ) X-(L1)-FVII-(L2)-Tm(식 중, FVII는 활성화된 FVII("FVIIa")를 포함하고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; Tm은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이고; L1은 제1 임의의 링커이며, L2는 제2 임의의 링커임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고,
(a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하거나;
(b) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하거나;
(c) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 임의의 순서로 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄를 포함하거나;
(d) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 임의의 순서로 포함한다.
다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고,
(a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X 또는 X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH의 화학식을 포함하거나,
(b) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm 또는 Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X 또는 X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
(c) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
(d) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
(e) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH의 화학식을 포함하거나;
(f) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH의 화학식을 포함하고,
FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는
(a) X-FVIIL:FVIIH-Tm;
(b) Tm-FVIIL:FVIIH-X;
(c) FVIIL:FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH:FVIIL;
(d) FVIIL:FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH:FVIIL;
(e) FVIIL-X-Tm:FVIIH 또는 FVIIH:Tm-X-FVIIL; 및
FVIIL-Tm-X:FVIIH 또는 FVIIH:Tm-X-FVIIL(식 중, FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합임)로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함한다.
제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 공유 결합, 예를 들어 이황화 결합 또는 비공유 결합일 수 있다.
본 발명의 소정의 양상에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, (a) FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자; 또는 (b) FVII의 경쇄, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 프로테아제 개열 부위는 프로단백질 전환효소에 의해 프로세싱될 수 있는 세포내 프로세싱 부위일 수 있다.
몇몇 양상에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고,
(a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 사슬 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하거나;
(b) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하거나;
(c) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하거나;
(d) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 또는 XTEN 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 양상에서, 키메라 단백질은 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고,
(a) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm 또는 Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X 또는 X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
(b) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X 또는 X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
(c) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
(d) 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH의 화학식을 포함하고,
FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이다.
또한 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함하는 키메라 분자가 제공된다:
(a) X-FVIIL:FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH:FVIIL-X;
(b) Tm-FVIIL:FVIIH-X 또는 X-FVIIH:FVIIL-Tm;
(c) FVIIL:FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH:FVIIL; 및
(d) FVIIL:FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH:FVIIL(식 중, FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합임). 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 공유 결합, 예를 들어 이황화 결합 또는 비공유 결합일 수 있다.
소정의 양상에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, 하기를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다:
(a) FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티;
(b) FVII의 경쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드;
(c) FVII의 경쇄, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티; 또는
(d) FVII의 경쇄, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 및 XTEN 폴리펩타이드. 프로테아제 개열 부위는 프로단백질 전환효소에 의해 프로세싱된 세포내 프로세싱 부위일 수 있다.
키메라 분자에 유용한 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 수용체의 수용체 결합 부분 및 혈소판에 결합하는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 비활동 혈소판 또는 활성화된 혈소판에 선택적으로 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표적화 모이어티는 GPIba, GPVI, GPIX, 당단백질 IIb/IIIa("GPIIb/IIIa")의 비활성 형태, GPIIb/IIIa의 활성 형태, P 설렉틴, GMP-33, LAMP-1, LAMP-2, CD40L, LOX-1 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 선택적으로 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자 내의 FVII의 반감기는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 FVIIa와 비교하여 증가한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자 내의 FVII의 응고 활성은 중쇄 및 경쇄로 이루어진 FVIIa와 동일하거나 이보다 크다. 응고 활성은 ROTEM 검정, aPTT 검정, 또는 임의의 공지된 검정에 의해 측정될 수 있다.
소정의 실시형태에서, XTEN 폴리펩타이드는 AE 모티프, AG 모티프, AD 모티프, AM 모티프, AQ 모티프, AF 모티프, BC 모티프, BD 모티프, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 분자에 대한 XTEN 폴리펩타이드는 약 42개의 아미노산, 약 72개의 아미노산, 약 108개의 아미노산, 약 144개의 아미노산, 약 180개의 아미노산, 약 216개의 아미노산, 약 252개의 아미노산, 약 288개의 아미노산, 약 324개의 아미노산, 약 360개의 아미노산, 약 396개의 아미노산, 약 432개의 아미노산, 약 468개의 아미노산, 약 504개의 아미노산, 약 540개의 아미노산, 약 576개의 아미노산, 약 612개의 아미노산, 약 624개의 아미노산, 약 648개의 아미노산, 약 684개의 아미노산, 약 720개의 아미노산, 약 756개의 아미노산, 약 792개의 아미노산, 약 828개의 아미노산, 약 836개의 아미노산, 약 864개의 아미노산, 약 875개의 아미노산, 약 912개의 아미노산, 약 923개의 아미노산, 약 948개의 아미노산, 약 1044개의 아미노산, 약 1140개의 아미노산, 약 1236개의 아미노산, 약 1318개의 아미노산, 약 1332개의 아미노산, 약 1428개의 아미노산, 약 1524개의 아미노산, 약 1620개의 아미노산, 약 1716개의 아미노산, 약 1812개의 아미노산, 약 1908개의 아미노산, 약 2004개의 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, XTEN 폴리펩타이드는 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 링커를 추가로 포함하고, 링커는 키메라 분자의 임의의 성분, 예를 들어 XTEN 폴리펩타이드를 갖는 FVII의 경쇄, 표적화 모이어티를 갖는 FVII의 중쇄, 또는 둘 다, 또는 표적화 모이어티를 갖는 FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드를 갖는 FVII의 경쇄, 또는 둘 다를 연결한다. 다른 실시형태에서, 링커는 화학식 [(Gly)x-Sery]z(여기서, x는 1 내지 4이고, y는 0 또는 1이며, z는 1 내지 50임)을 갖는 펩타이드를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII의 중쇄, FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 표적화 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합에 융합된 이종성 모이어티를 추가로 포함한다. 이종성 모이어티는 폴리펩타이드 모이어티 또는 비폴리펩타이드 모이어티일 수 있고, FVII의 반감기를 추가로 연장시킨다. 몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티는 이종성 모이어티를 포함하지 않는 FVII와 비교하여 대상체에게 투여될 때 키메라 분자의 반감기를 연장시킨다. 특정한 실시형태에서, 이종성 모이어티는 알부민, 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 지방산, Fc, 트랜스페린, PAS, 인간 융모성 고나트로핀(human chorionic gonadotropin)의 β 아단위의 C 말단 펩타이드(C-terminal peptide: CTP), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol: PEG), 하이드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch: HES), 알부민 결합 소분자, vWF, 추가의 XTEN 폴리펩타이드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
키메라 분자, 키메라 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 일련의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 일련의 벡터, 벡터 또는 일련의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 숙주 세포를 벡터 또는 일련의 벡터에 의해 형질감염시키는 단계 및 세포를 키메라 분자를 발현하기에 적합한 조건 하에 배지 중에 배양하는 단계를 포함하는 키메라 분자를 제조하는 방법이 또한 제공된다.
키메라 분자, 폴리뉴클레오타이드, 일련의 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 일련의 벡터, 또는 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는 출혈 삽화의 빈도 또는 정도의 감소, 또는 출혈 삽화의 발생의 예방을 필요로 하는 대상체에서 출혈 삽화의 빈도 또는 정도를 감소시키거나 출혈 삽화의 발생을 예방하는 방법이 추가로 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 FVIII, FIX, 또는 둘 다에 대한 저해제, 예를 들어 FVIII, FIX, 또는 둘 다에 대한 중화 항체를 발생시키거나, 이를 발생시킬 능력을 가진다.
도 1은 FVII, XTEN 폴리펩타이드(X) 및 34D10과 같은 항-GPIIb/IIIa 항체로부터 유래한 scFv를 포함하는 키메라 분자의 도식적 다이어그램이다. FVII는 활성화된 FVII일 수 있다. XTEN 폴리펩타이드, FVII 및 scFv는 하나 이상의 임의의 링커에 의해 연결될 수 있다. 키메라 분자 내의 ScFv는 임의의 순서로 VH 및 VL, 즉 VH - VL 또는 VL - VH를 함유할 수 있다.
도 2A 내지 도 2D는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자의 다이어그램을 보여준다. 도 2A는 서로 회합된 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자(예를 들어, FVII-211)의 도식적 다이어그램을 보여주고, 제1 사슬은 FVII의 경쇄 및 XTEN 폴리펩타이드(링커에 의해 임의로 융합됨)를 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄 및 항-GPIIb/IIIa 항체로부터 유래한 scFv(또 다른 링커에 의해 융합됨)를 포함한다. 도 2B는 서로 회합된 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자의 도식적 다이어그램을 보여주고, 제1 사슬은 FVII의 경쇄 및 항-GPIIb/IIIa 항체로부터 유래한 scFv를 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, FVII의 경쇄는 제1 임의의 링커에 의해 scFv에 융합되고, FVII의 중쇄는 제2 임의의 링커에 의해 XTEN 폴리펩타이드에 융합된다. 도 2C는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자(예를 들어, FVII-200)의 도식적 다이어그램이고, 제1 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체로부터 유래한 scFv를 포함하고, 중쇄는 제1 임의의 링커에 의해 XTEN 폴리펩타이드에 융합되고, XTEN 폴리펩타이드는 제2 임의의 링커에 의해 scFv에 융합된다. 도 2D는 서로 회합된 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자의 도식적 다이어그램이고, 제1 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄, 항-GPIIb/IIIa 항체로부터 유래한 scFv 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 중쇄는 제1 임의의 링커에 의해 scFv에 융합되고, scFv는 제2 임의의 링커에 의해 XTEN 폴리펩타이드에 융합된다. 키메라 분자 내의 ScFv는 임의의 순서로 VH 및 VL, 즉 VH - VL 또는 VL - VH를 함유할 수 있다.
도 3A 및 도 3B는, 음영의 세포가 어떠한 항체가 동일한 VL 또는 VH 서열을 공유하는지를 나타내는, GPIIb/IIIa에 대한 중쇄 가변 도메인(VH) 서열(도 3A) 및 경쇄 가변 도메인(VL) 서열(도 3B)에 상응하는 동일성 매트릭스를 보여준다.
도 4는, 상보성 결정 구역(CDR)의 위치를 나타내는, 1H6, 38A8, 12B2, 38F6, 2A2, 36A8, 4B11, 34D10, 28F4, 23C10, 28C2, 5C4, 9D6 및 18F7 항체의 VH 서열의 ClustalX 다중 서열 정렬을 보여준다. EU 인덱스에 따른 각각의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)의 위치가 표시된다. 동일한, 보전된 및 부분적으로 보전된 아미노산 잔기의 위치가 정렬 아래에 표시된다.
도 5는, EU 인덱스에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3의 위치를 나타내는, 28C2, 9D6, 1H6, 38A8, 12B2, 18F7, 28F4, 34D10, 36A8 및 2A2 항체의 VL 서열의 ClustalX 다중 서열 정렬을 보여준다. 동일한, 보전된 및 부분적으로 보전된 아미노산 잔기의 위치가 정렬 아래에 표시된다.
도 6은 도 5(상부 매트릭스) 및 도 4(하부 매트릭스)에 도시된 ClustalX 다중 서열 정렬에 포함된 서열에 상응하는 백분율 동일성 매트릭스를 보여준다.
도 7은 GPIIb/IIIa의 α 또는 β 아단위에 대한 특이성에 따라 클러스터링된 도 4에서 VH 서열에 상응하는 ClustalX 다중 서열 정렬을 보여준다.
도 8은 GPIIb/IIIa의 α 또는 β 아단위에 대한 특이성에 따라 클러스터링된 도 5에서 VL 서열에 상응하는 ClustalX 다중 서열 정렬을 보여준다.
도 9는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하는 능력에 따라 클러스터링된 도 4에서 VH 서열에 상응하는 ClustalX 다중 서열 정렬을 보여준다.
도 10은 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하는 능력에 따라 클러스터링된 도 5에서 VL 서열에 상응하는 ClustalX 다중 서열 정렬을 보여준다.
도 11A는 가용성 조직 인자 의존적 프로트롬빈 시간(soluble tissue factor dependent prothrombin time: sTF-PT) 검정에 의해 측정된 rFVIIa 및 rFVII-XTEN의 FVIIa 활성을 보여준다(도 11A). rFVIIa는 재조합으로 생성된 활성화된 FVII이고, rFVIIa-XTEN은 활성화된 FVII이고, 여기서 FVII의 중쇄는 XTEN 폴리펩타이드에 융합된다. x축은 시간 단위의 시간이고, y축은 투약된 HemA 마우스에서의 혈장으로부터의 FVIIa 활성 회복률(activity recovery)(%)이다. 도 11B는 ROTEM 검정에 의해 측정된 rFVIIa 및 rFVIIa-XTEN의 응고 시간(CT)을 보여준다. x축은 시트레이트화 인간 A형 혈우병 혈액에서 스파이킹된 표시된 단백질의 nM 단위의 농도를 보여주고, y축은 ROTEM에 의해 기록된 응고 시간을 보여주고; 응고는 칼슘에 의해 개시된다.
도 12A는 인간 전혈에서의 혈소판 결합을 보여준다. 단백질은 희석된(1:50) 전혈 중에 스파이킹되고, FITC-항-FVII 및 APC-CD42b에 의해 염색되고, 혈소판에서의 FVII 평균 형광성 값(FVII MPV)은 유세포 분석법에 의해 측정된다. 3개의 작제물(FVII-200(원형), FVII-189(삼각형) 및 FVII-211(x)(상기 기재됨)을 혈소판 결합에 대해 시험하였다. x축은 인간 혈액에서 스파이킹된 단백질의 농도를 보여주고, y축은 혈소판에 결합하는 단백질의 상대 양을 나타내는 FVII 평균 형광성 값(FVII MFV)을 보여주다. 도 12B는 ROTEM 검정에 의해 측정된 rFVIIa(원형) 및 FVII-200(삼각형)의 응고 활성을 보여준다. x축은 nM 단위의 농도를 보여주고, y축은 응고 시간이다.
도 13A는 αIIb 형질전환 마우스로부터의 혈액에서의 FVII-200(원형), FVII-189(삼각형) 및 FVII-211(x)의 혈소판 결합을 보여준다. x축은 nM 단위의 농도를 보여주고, y축은 혈소판에서의 FVII 평균 형광성 값(FVII MFV)을 보여준다. 도 13B는 단백질 투여 이후의 시간의 함수로서의 인간 αIIb 형질전환 마우스로부터의 혈소판에서의 rFVII-200(원형), FVII-211(x) 및 FVII-179(삼각형)의 FVII 회복율(recovery)을 보여준다. 마우스에 5nmol/㎏의 표시된 단백질을 투약하였고, 혈소판에서의 FVII 평균 형광성 값을 유세포 분석법에 의해 생성하였다. FVII 회복율(%)은 투약 후 5분에서의 값에 관한 혈소판에서의 남은 FVII MFV의 %를 의미한다.
도 14A 내지 도 14F는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 분자의 도식적 다이어그램을 보여준다. 도 14A는, PDG13 항체로부터 유래한 scFv(즉, 혈소판 표적화 항체)에 추가로 융합된, FVII의 중쇄와 공유로 회합된 FVII의 경쇄를 포함하는 키메라 단백질을 보여준다. 도 14B는, XTEN 폴리펩타이드에 추가로 융합된, FVII의 중쇄와 공유로 회합된 FVII의 경쇄를 포함하는 키메라 단백질을 보여준다. 도 14C 및 도 14D는, PDG13 항체로부터 유래한 scFv 및 XTEN 폴리펩타이드(도 14C)에 추가로 연결되고, XTEN 폴리펩타이드 및 PDG13 항체로부터 유래한 scFv(도 14D)에 추가로 연결된, FVII의 중쇄와 공유로 회합된 경쇄를 보여준다. 도 14E는 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자를 보여주고, 제1 폴리펩타이드 사슬은 PDG13 항체로부터 유래한 scFv에 융합된 FVII 경쇄를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 FVII 중쇄를 포함한다. 도 14F는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자를 보여주고, 제1 사슬은 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 FVII 경쇄를 포함하고, 제2 사슬은 PDG13 항체로부터 유래한 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함한다.
도 15A 내지 도 15D는 키메라 FVII 분자와의 rFVIIa의 응고 시간을 비교하는 ROTEM 검정을 보여준다. 도 15A는 항-FVIII 항체에 의해 자극된 인간 혈우병 혈액에서의 rFVIIa, FVII-165 및 FVII-178의 응고 시간을 보여준다. 정상 인간 도너로부터의 시트레이트화 혈액을 항-FVIII 항체 및 표시된 단백질에 의해 처리하였다. 응고를 칼슘에 의해 개시시키고, 응고 시간을 ROTEM 기계에 의해 기록하였다. BL(기준선), 미가공(naive) 혈액으로부터의 기준; BL+Ab, 항-FVIII 항체 치료에 의한 기준 수치. 도 15B는 ROTEM에 의한 시트레이트화 인간 A형 혈우병 혈액에서의 rFVIIa 및 FVII-179의 응고 시간을 보여주고; 응고를 칼슘에 의해 개시시켰다. 도 15C 및 도 15D는 ROTEM에 의한 시트레이트화 인간 A형 혈우병 혈액에서의 rFVIIa, FVII-175, 177, 178의 응고 시간을 보여주고, 응고를 조직 인자 및 칼슘에 의해 개시시켰다.
도 16은 혈소판/NSG 마우스에서의 혈소판 결합 FVIIa 청소율을 보여준다. FVII-211 및 FVII-179 작제물 둘 다가 상기 기재되어 있다. NSG 마우스에 인간 혈소판 수혈 후 30분에 25nmol/㎏의 FVII-211 또는 FVII-179를 투약하였다. 각각의 시점에서의 인간 혈소판 결합 FVII의 평균 형광성 값을 단백질 투여 후 5분에서의 용적으로 정규화하였다. x축은 FVII-211 또는 FVII-179를 투약한 후 시간(h)을 보여주고, y축은 수혈된 인간 혈소판에서의 FVII 회복율(%)을 보여준다.
도 17A는 XTEN AE288의 서열을 보여준다. 도 17B는 항-GFP 항체에 의해 검출된 실험실내 원숭이 혈장(상부 열), 생체내 원숭이 샘플(중간 열) 및 실험실내 랫트 신장 파쇄액(하부 열)에서의 GFP-XTEN의 안정성을 보여준다. rFVIIa 및 rFVIIa-XTEN의 도식적 다이어그램은 하부에 도시되어 있다.
도 18은 rFVIIa 및 rFVII-XTEN의 FVIIa 혈장 활성을 보여준다. rFVIIa는 재조합으로 생성된 활성화된 FVII이고, rFVIIa-XTEN은 활성화된 FVII이고, 여기서 FVII의 중쇄는 XTEN 폴리펩타이드에 융합된다. x축은 시간 단위의 시간이고, y축은 용량 정규화 FVIIa 혈장 활성(%)이다.
도 19는 rFVIIa 및 FVII-200의 FVIIa 혈장 활성을 보여준다. FVII-200은 활성화된 FVII(즉, 중쇄 및 경쇄)를 함유하고, 활성화된 FVII의 중쇄는 XTEN 서열(예를 들어, AE288)에 융합되고, 항-GPIIb/IIIa 항체로부터의 scFv에 추가로 융합된다. x축은 시간 단위의 시간이고, y축은 용량 정규화 FVIIa 혈장 활성(%)이다.
도 20A 내지 도 20C는 sTF-PT 방법에 의해 결정된 혈소판 표적화된 rFVIIa-XTEN 변이체의 활성을 보여준다. 도 20A는 XTEN(즉, 72개의 아미노산, 144개의 아미노산, 또는 288개의 아미노산)에 융합된 FVII 경쇄 및 링커에 의해 34D10 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함하는 A 구성의 도식적 다이어그램, 3개의 작제물, 즉 FVII-227, FVII-228 및 FVII-211의 표, 및 작제물 및 rFVIIa 및 FVII-189의 sTF-PT 검정을 보여준다. FVII-189의 작제물은 상기 기재되어 있다. 도 20B는 XTEN(즉, 72개의 아미노산, 144개의 아미노산, 또는 288개의 아미노산)에 의해 34D10 scFv에 융합된 FVII 중쇄 및 FVII 경쇄를 포함하는 B 구성의 도식적 다이어그램, 3개의 작제물, 즉 FVII-231, FVII-232 및 FVII-200의 표, 및 작제물 및 rFVIIa의 sTF-PT 검정을 보여준다. 도 20C는 XTEN(즉, 42개의 아미노산, 72개의 아미노산, 또는 72개의 아미노산)에 융합된 FVII 경쇄 및 XTEN(즉, 72개의 아미노산, 42개의 아미노산, 또는 72개의 아미노산)에 의해 34D10 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함하는 C 구성의 도식적 다이어그램, 3개의 작제물, 즉 FVII-242, FVII-243 및 FVII-238의 표, 및 작제물 및 rFVIIa의 sTF-PT 검정을 보여준다.
도 21A 내지 도 21D는 ROTEM 방법에 의해 결정된 혈소판 표적화된 rFVIIa-XTEN 변이체의 활성을 보여준다. 도 21A는 FVII-227, FVII-228 및 FVII-211의 도식적 다이어그램 및 XTEN 연결 및 길이, 및 FVII-227, FVII-228 및 FVII-211의 FVII 활성을 보여준다. 도 21B는 FVII-231, FVII-232 및 FVII-200의 도식적 다이어그램 및 XTEN 연결 및 길이, 및 FVII-231, FVII-232 및 FVII-200의 FVII 활성을 보여준다. 도 21C는 FVII-242, FVII-243 및 FVII-238의 도식적 다이어그램 및 XTEN 연결 및 길이, 및 FVII-242, FVII-243 및 FVII-238의 FVII 활성을 보여준다. FVII 활성은 rFVIIa와 비교된 FVII 활성의 배수 차이로 표시된다. 도 21D는 FVII-200의 도식적 다이어그램, 및 FVII-189(FVII 경쇄:FVII 중쇄-표적화 모이어티), FVII-165(FVII 경쇄:FVII 중쇄-XTEN) 및 FVII-200(FVII 경쇄:FVII 중쇄-XTEN-표적화 모이어티) 중에서 FVII 활성의 비교를 보여준다. FVII 활성은 rFVIIa와 비교된 FVII 활성의 배수 차이로 표시된다. 작제물 내의 ScFv는 임의의 순서로 VH 및 VL, 즉 VH - VL 또는 VL - VH를 함유할 수 있다.
도 22는 288의 아미노산을 갖는 단일 XTEN이 PK 개선에 충분하다는 것을 보여준다. 다양한 FVIIa-XTEN 작제물, 즉 FVIIaXTEN864, FVIIaXTEN288 및 rFVIIa를 HemA 마우스에 투여하였다. 투약된 동물로부터의 혈장 내의 FVII 활성을 sTF-PT 검정에 의해 측정하였다. x축은 시간 단위의 시간을 보여주고, y축은 정규화 활성 회복률(%)을 보여준다.
도 23은 144개 또는 72개로 XTEN 길이를 감소시키는 것이 청소율을 증가시킨다는 것을 보여준다. 투약된 동물의 혈장으로부터의 3개의 작제물, 즉 FVII-200/Hc-XTEN288, FVII-232/Hc-XTEN144 및 FVII-231/Hc-XTEN72의 FVII 활성을 sTF-PT 검정에 의해 측정하였다. x축은 시간 단위의 시간을 보여주고, y축은 정규화 활성 회복률(%)을 보여준다.
도 24는 72개 각각 대 단일 XTEN 288의 2개의 XTEN에 대한 필적하는 데이터를 보여준다. FVII-238/Hc-XTEN72/Lc-XTEN72의 FVII 활성을 FVII-200/Hc-XTEN288 및 rFVIIa의 활성과 비교하였다. y축은 정규화 활성 회복률(%)을 보여준다.
도 25는 72개 각각 대 단일 XTEN 288의 2개의 XTEN에 대한 필적하는 데이터를 보여준다. 단백질을 꼬리 정맥 주사를 통해 αIIb 형질전환 마우스에서 투여하였다. 전혈을 수집하고, 형광성 표지된 항체에 의해 염색하여, 유세포 분석법에 의해 혈소판 및 FVII를 가시화하였다. 혈소판 결합 단백질 농도는 혈소판에서의 평균 형광성 강도(median fluorescent intensity: MFI)를 정량화함으로써 측정되고, 투약 후 5분에 MFI와 관련하여 회복율의 백분율로 표시된다. FVII-238/Hc-XTEN72/Lc-XTEN72의 회복률(%)을 (임의의 XTEN이 없는) FVII-200/Hc-XTEN288 및 FVII-189와 비교하였다.
도 26은 중쇄 및 경쇄에서의 XTEN 길이에서의 필적하는 데이터를 보여주고: aIIb 형질전환 마우스에서의 혈소판 PK 및 회복률은 도 25와 유사하게 계산되었다. FVII-238/Hc-XTEN72/Lc-XTEN72의 회복률(%)을 FVII-243/Hc-XTEN42/Lc-XTEN72 및 FVII-242/Hc-XTEN72/Lc-XTEN42와 비교하였다.
본 발명은 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자)를 포함하는 키메라 분자에 관한 것이다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 응고 인자의 효율, 약동학적 특성 및/또는 제조능력을 증대시키는 새로운 방식의 개발에 기초한다. 키메라 분자는 응고 부위에서의 개선된 응고촉진 활성 및 개선된 약동학적 특성을 갖는 방식으로 개발된다. 우회 치료에서의 사용을 위해, 외인성 응고 인자는 활성화 형태로 제공될 때에 오직 효율적이다. 그러나, 이러한 활성화된 응고 인자는 내인성 경로(예를 들어, 항트롬빈 III, TFPI)에 의해 신속히 불활성화되어서, 활성 형태의 청소율(clearance) 및 짧은 유효 반감기를 발생시킨다. 더 높은 용량을 제공하는 것은 혈전생성 효과를 발생시킬 수 있으므로 이 문제를 해결하지 못한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 손상 부위에 응고 인자를 가져오는 표적화 모이어티에 융합된 FVII를 포함하는 활성 증대 키메라 FVII 분자 작제물에 관한 것이다. 이 분자는 또한 PK 증대 모이어티, 즉 반감기와 같은 다양한 약동학적 특성을 개선할 수 있는 XTEN 폴리펩타이드를 함유한다.
본 발명의 예시적인 작제물은 수반된 도면 및 서열 목록에 예시되어 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 도면에 기재된 바와 같은 구조를 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 수반된 서열 목록에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 수반된 서열 목록에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드의 성숙 형태에 관한 것이다. 이 작제물 및 이를 코딩하는 핵산 분자가 대상체에서 지혈을 개선하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 청구범위의 명확한 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 하기 제공된다.
정의
용어 "일" 또는 "하나"의 집합체는 이 집합체의 하나 이상을 의미한다는 것에 주의해야 하고; 예를 들어, "일 뉴클레오타이드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 그러므로, 용어 "일"(또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에 상호 교환되어 사용될 수 있다.
더욱이, 본 명세서에 사용되는 "및/또는"는 2개의 언급된 피처(feature) 또는 성분의 각각의 구체적인 개시내용으로(다른 것과 함께 또는 이것 없이) 취해져야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 구절에서 사용되는 용어 "및/또는"는 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 구절에서 사용되는 용어 "및/또는"는 하기 실시형태의 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
어디든 실시형태가 본 명세서에 언어 "포함하는"으로 기재되면, "이루어진" 및/또는 "실질적으로 이루어진"의 용어에 기재된 달리 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 명세서에 언급된 다양한 범위에서의 숫자 값의 사용은, 달리 명확히 기재되지 않은 한, 마치 언급된 범위 내의 최소 값 및 최대 값이 둘 다 "약"의 단어가 선행하는 것처럼, 근사치로 기술된다. 이러한 방식으로, 범위 내의 값과 실질적으로 동일한 결과를 성취하기 위해 기술된 범위 위 및 아래의 약간의 변동을 이용할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "약" 및 "대략"은, 숫자 값을 언급할 때, 해당 범위 또는 요소에 관련된 당해 분야의 당업자에게 이의 평범하고 일상적인 의미를 가져야 한다.
엄격한 숫자 경계로부터의 확대의 양은 많은 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 고려되어야 하는 인자 중 몇몇은 요소의 임계점 및/또는 소정의 양의 변동이 청구된 대상의 성과에 갖는 효과, 및 당해 분야의 당업자에게 공지된 다른 고려사항을 포함할 수 있다. 따라서, 일반적인 문제로서, "약" 또는 "대략"은 숫자 값을 확대시킨다. 예를 들어, 몇몇 경우에, "약" 또는 "대략"은 관련 기술에 따라 ±5% 또는 ±10%를 의미할 수 있다. 또한, 범위의 개시내용은 기재된 최소 값과 최대 값 사이의 모든 값을 포함하는 연속 범위로서 의도된다.
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 당해 분야의 당업자가 보통 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 기술자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 이의 국제 단위계(Systeme International de Unites: SI) 허용 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 달리 기재되지 않은 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 본 명세서에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 실시형태(전체로서 본 명세서에 참조로 될 수 있음)의 제한이 아니다. 따라서, 바로 하기에 규정된 용어는 그 전문이 본 명세서에 참조문헌으로 더욱 완전히 규정된다. 아미노산은 이의 보통의 공지된 3개 철자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)가 추천하는 1개 철자 기호에 의해 본 명세서에 언급된다. 뉴클레오타이드는, 마찬가지로, 이의 보통의 승인된 단일 철자 코드로 언급된다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드" 및 복수의 "폴리펩타이드들"을 포함하도록 의도되고, 아마이드 결합(또한 펩타이드 결합으로 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 사슬 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬을 의미하고, 생성물의 특이적 길이를 의미하지 않는다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "아미노산 사슬", 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 의미하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 이들과 상호 교환되어 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "단백질"은, 몇몇 경우에 아마이드 결합 이외의 결합에 의해 회합될 수 있는, 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 분자를 포함하도록 의도된다.
폴리펩타이드는 단량체 또는 다합체일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 항체, 이의 항원 결합 분자, 또는 키메라 분자는 이합체 폴리펩타이드일 수 있다. 이합체 항체, 이의 항원 결합 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬를 포함할 수 있거나, (예를 들어, scFc 분자의 경우에) 1개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 이합체는 2개의 동일한 단량체 아단위 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 2개의 동일한 Fc 모이어티 또는 2개의 동일한 생물학적 활성 모이어티)를 포함하는 동종이합체일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이합체는 2개의 동일하지 않은 단량체 아단위 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 2개의 상이한 응고 인자 또는 이의 일부 또는 오직 하나의 응고 인자)를 포함하는 이종이합체이다. 예를 들어, 미국 특허 제7,404,956호(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 또한, 제한 없이, 공지된 보호기/차단기에 의한 글라이코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 유도체화, 단백질 제거 개열, 또는 비천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 발현 후 변형의 생성물을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 천연 생물학적 공급원으로부터 유래하거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되지 않는다. 이것은 화학 합성을 포함하는 임의의 방식에 의해 생성될 수 있다.
"단리된" 폴리펩타이드는 천연에서 발견되지 않는 형태인 폴리펩타이드이다. 단리된 폴리펩타이드는 더 이상 천연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드는 실질적으로 순수하다.
GPIIb/IIIa 항체, 이의 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 키메라 분자의 "유도체"는 천연 폴리펩타이드 또는 단백질에서 발견되지 않는 추가의 특징을 나타내도록 변경된 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩타이드가 또한 "유도체"로서 포함된다. 지정된 폴리펩타이드 또는 단백질"로부터 유래한" 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 기원을 의미한다. 일 실시형태에서, 특정한 서열로부터 유래한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 이 서열 또는 이의 일부(이의 일부는 적어도 약 10개 내지 약 20개의 아미노산, 적어도 약 20개 내지 약 30개의 아미노산, 또는 적어도 약 30개 내지 약 50개의 아미노산으로 이루어짐)와 본질적으로 동일하거나, 그렇지 않으면 서열에서 이의 기원을 갖는 것으로서 당해 분야의 당업자에게 식별 가능한 아미노산 서열을 가진다.
또 다른 폴리펩타이드의 "변이체"인 폴리펩타이드는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는 시작 폴리펩타이드, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기에 비해 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 발생이 아닌 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변이체는 필수적으로 시작 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 가진다. 또 다른 실시형태에서, 변이체는 예를 들어 변이체 분자의 길이에 걸쳐 시작 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 예를 들어 약 80% 내지 100% 미만, 약 85% 내지 100% 미만, 약 90% 내지 100% 미만(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%), 및 약 95% 내지 100% 미만인 아미노산 서열을 가질 것이다. 일 실시형태에서, 시작 폴리펩타이드 서열과 이로부터 유래한 서열 사이의 하나의 아미노산 차이가 존재한다.
용어 "단편"은, GPIIb/IIIa 항체, 이의 항원 결합 분자, 본 발명의 키메라 분자, 또는 응고 인자를 언급할 때, 기준 폴리펩타이드 또는 단백질의 특성의 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 폴리펩타이드의 단편은 단백분해 단편, 및 결실 단편을 포함한다. 예를 들어, 항-GPIIb/IIIa 항체의 단편은 항-GPIIb/IIIa 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 예는 FVII의 응고 활성, 예를 들어 rFVIIa에 필적하는 FVII 응고 활성을 갖는 FVII의 단편이다.
용어 "서열"은, 단백질 서열, 펩타이드 서열, 폴리펩타이드 서열, 또는 아미노산 서열을 언급하도록 사용될 때, 표시에서 서로 이웃하는 잔기가 폴리펩타이드의 1차 구조에서 인접한, 아미노 말단에서 카복실 말단 방향으로의, 폴리펩타이드 내의 아미노산 구성성분의 직선 표시를 의미한다.
용어 "아미노산"은 알라닌(Ala 또는 A); 아르기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴(Asn 또는 N); 아스파르트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(Gln 또는 Q); 글루탐산(Glu 또는 E); 글라이신(Gly 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 아이소류신(Ile 또는 I): 류신(Leu 또는 L); 라이신(Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 타이로신(Tyr 또는 Y); 및 발린(Val 또는 V)을 포함한다.
비전통적인 아미노산은 또한 본 발명의 범위 내에 있고, 노르류신, 오미딘, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌[Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기재된 것을 포함한다. 이러한 비천연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌[Noren et al. Science 244:182 (1989)] 및 상기 엘만(Ellman) 등의 문헌의 절차를 이용할 수 있다. 간단히 말하면, 이 절차는 비천연 발생 아미노산 잔기에 의한 억제자 tRNA의 화학적 활성화, 이어서 RNA의 실험실내 전사 및 번역을 포함한다. 비전통적인 아미노산의 도입은 또한 당해 분야에 공지된 펩타이드 화학을 이용하여 성취될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "극성 아미노산"은 순 전하가 0이 이지만, 이의 측쇄(예를 들어, M, F, W, S, Y, N, Q 및 C)의 상이한 부분의 부분 전하가 0이 아닌 아미노산을 포함한다. 이 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전 상호작용에 참여할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "하전 아미노산"은 이의 측쇄(예를 들어, R, K, H, E 및 D)에서 순 전하가 0이 아닌 아미노산을 포함한다. 이 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전 상호작용에 참여할 수 있다.
"아미노산 치환"은 제2의, 상이한 "대체" 아미노산 잔기에 의한, 미리 결정된 아미노산 서열(시작 폴리펩타이드의 아미노산 서열)에서의 적어도 하나의 존재하는 아미노산 잔기의 대체를 의미한다. "아미노산 삽입"은 미리 결정된 아미노산 서열로의 적어도 하나의 추가의 아미노산의 편입을 의미한다. 삽입이 보통 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어지지만, 존재하는 더 큰 "펩타이드 삽입", 예를 들어 약 3개 내지 약 5개, 또는 심지어 약 10개, 15개 또는 20개 이하의 아미노산 잔기의 삽입이 이루어질 수 있다. 삽입된 잔기(들)는 상기 개시된 바대로 천연 발생 또는 비천연 발생일 수 있다. "아미노산 결실"은 미리 결정된 아미노산 서열로부터의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 제거를 의미한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, Lys, Arg 및 His), 산성 측쇄(예를 들어, Asp 및 Glu), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 및 Cys), 비극성 측쇄(예를 들어, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 및 Trp), 베타 분지 측쇄(예를 들어, Thr, Val 및 Ile) 및 방향족 측쇄(예를 들어, Tyr, Phe, Trp 및 His)를 포함하는, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩타이드 내의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 생각된다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
비보존적 치환은 (ⅰ) 양전기 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Arg, His 또는 Lys)가 음전기 잔기(예를 들어, Glu 또는 Asp)에 대해 또는 이것에 의해 치환된 것, (ⅱ) 친수성 잔기(예를 들어, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들어, Ala, Leu, He, Phe 또는 Val)에 대해 또는 이것에 의해 치환된 것, (ⅲ) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기에 대해 또는 이것에 의해 치환된 것, 또는 (ⅳ) 벌키한 소수성 또는 방향족 측쇄(예를 들어, VaI, He, Phe 또는 Trp)를 갖는 잔기가 더 작은 측쇄를 갖는 것(예를 들어, Ala 또는 Ser) 또는 측쇄를 갖지 않는 것(예를 들어, Gly)에 대해 또는 이것에 의해 치환된 것을 포함한다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 사이의 용어 "서열 동일성 백분율"은, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 부가 또는 결실(즉, 갭)을 고려하여, 비교 윈도우에 걸쳐 서열이 공유한 동일한 일치된 위치의 수를 의미한다. 일치된 위치는 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 표적 서열 및 기준 서열 둘 다에서 존재하는 임의의 위치이다. 갭이 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 아니므로, 표적 서열에 존재하는 갭은 고려되지 않는다. 마찬가지로, 표적 서열 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 고려되고, 기준 서열로부터의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 고려되지 않으므로, 기준 서열에 존재하는 갭은 고려되지 않는다.
서열 동일성의 백분율은 일치된 위치의 수를 생성시키는 서열 둘 다에서 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 발생하는 위치의 수를 결정함으로써 계산되고, 비교의 윈도우에서 일치된 위치의 수를 전체 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여, 서열 동일성의 백분율을 생성한다. 온라인 이용 및 다운로드 둘 다를 위해 용이하게 이용 가능한 소프트웨어를 이용하여 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 서열 동일성 백분율의 결정을 성취할 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램은 단백질 및 뉴클레오타이드 서열 둘 다에 대한 정렬에 대해 다양한 공급원으로부터 이용 가능하다.
서열 동일성 백분율을 결정하는 하나의 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 바이오기술 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용 가능한 프로그램의 BLAST 스위트의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 2개의 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하도록 사용되지만, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하도록 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어 Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher이고, 생물정보 프로그램의 EMBOSS 스위트의 일부이고, 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보 기관(European Bioinformatics Institute: EBI)으로부터 이용 가능하다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 기준 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 표적 서열 내의 상이한 구역은 각각 이의 자체의 서열 동일성 백분율을 가질 수 있다. 서열 동일성 백분율 값이 가장 가까운 1/10으로 반내림 반올림이 된다는 것에 유의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반내림이 되지만, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 반올림이 된다. 길이 값이 항상 정수이라는 것에 또한 유의한다.
소정의 실시형태에서, 제2 서열 아미노산에 대한 제1 아미노산 서열의 백분율 동일성 "X"는 100 x (Y/Z)(여기서, Y는 (육안 검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬된 바와 같은) 제1 서열 및 제2 서열의 정렬에서의 동일한 일치로 점수 매긴 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열에서의 잔기의 전체 수임)로 계산된다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 길면, 제2 서열에 대한 제1 서열의 백분율 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 백분율 동일성보다 클 것이다.
당해 분야의 당업자는 서열 동일성 백분율의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터로부터 배타적으로 추진된 2원 서열-서열 비교로 제한되지 않는다고 이해할 것이다. 서열 정렬은 다중 서열 정렬로부터 유래할 수 있다. 다중 서열 정렬을 생성하기에 적합한 하나의 프로그램은 www.clustal.org(ClustalX는 윈도우 환경에 포팅된 ClustalW2 프로그램의 버전임)로부터 이용 가능한 ClustalW2이다. 또 다른 적합한 프로그램은 www.drive5.com/muscle로부터 이용 가능한 근육이다. ClustalW2 및 MUSCLE는 대안적으로 예를 들어 EBI로부터 이용 가능하다.
서열 데이터를 이종성 공급원으로부터의 데이터, 예컨대 구조 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터(예를 들어, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생 데이터와 통합함으로써 서열 정렬이 생성될 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 이종성 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용 가능하고, 대안적으로 예를 들어 EBI로부터 이용 가능한 T-Coffee이다. 서열 동일성 백분율을 계산하기 위해 이용된 최종 정렬이 자동으로 또는 수동으로 보조될 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 분자, 및 키메라 분자는 인간 단백질 서열로부터 유래한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 분자, 및 키메라 분자는 또 다른 포유동물 종으로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 분자, 및 키메라 분자는 면역원성이 아니다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "연결된" "융합된" 또는 "융합"은 펩타이드 결합(예를 들어, 유전적 융합), 화학 접합, 또는 당해 분야에 공지된 다른 수단을 통한 연결을 의미한다. 예를 들어, 분자 또는 모이어티가 연결될 수 있는 방식은 펩타이드 결합을 통해 분자 또는 모이어티를 연결하는 펩타이드 링커를 이용한다. 용어 "유전적으로 융합된", "유전적으로 연결된" 또는 "유전적 융합"은 상호 교환되어 사용되고, 2개 이상의 단백질, 폴리펩타이드, 또는 단편을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드 분자의 유전자 발현에 의한, 이의 개별적인 펩타이드 골격을 통한, 이 단백질, 폴리펩타이드, 또는 단편의 동일 선형의, 공유 연결 또는 부착을 의미한다. 이러한 유전적 융합은 단일 인접 유전자 서열을 발현시킨다.
바람직한 유전적 융합은 인프레임으로 있고, 즉 2개 이상의 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)은 오리지널 ORF의 정확한 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 더 긴 인접 ORF을 형성하도록 융합된다. 따라서, 생성된 재조합 융합 단백질은 오리지널 ORF(이의 분절은 보통 자연에서 연결되지 않음)에 의해 코딩된 폴리펩타이드에 상응하는 2개 이상의 단백질 분절을 함유하는 단일 폴리펩타이드이다. 이러한 경우에, 단일 폴리펩타이드는 프로세싱 동안 개열되어 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이합체 분자를 생성한다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "회합된"은 제1 아미노산 사슬과 제2 아미노산 사슬 사이에 형성된 공유 결합 또는 비공유 결합을 의미한다. 일 실시형태에서, 용어 "회합된"은 공유, 비펩타이드 결합 또는 비공유 결합을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "회합된"은 화학적으로 가교결합되지 않은 공유, 비펩타이드 결합 또는 비공유 결합을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, 이것은 펩타이드 결합을 제외한 공유 결합을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 이 회합은 콜론, 즉 (:)으로 표시된다. 예를 들어, FVII의 구조를 나타낼 때, "FVIIH:FVIIL"은 N 말단에서 C 말단 배향의 FVIIL의 경쇄에 이황화 결합된 FVIIH의 중쇄를 포함하는 이합체를 의미한다.
공유 결합의 예는 펩타이드 결합, 금속 결합, 수소 결합, 이황화 결합, 시그마 결합, 파이 결합, 델타 결합, 글라이코시드 결합, 아그노스틱(agnostic) 결합, 굽은 결합, 이극성 결합, 파이 역결합, 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 오중 결합, 육중 결합, 접합, 과접합, 방향족성, 촉각성(hapticity) 또는 반결합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비공유 결합의 비제한적인 예는 이온성 결합(예를 들어, 양이온 파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합(예를 들어, 다이하이드로겐 결합, 다이하이드로겐 복합체, 저장벽 수소 결합, 또는 대칭 수소 결합), 반 데르 발스 힘, 런던 분산 힘, 기계적 결합, 할로겐 결합, 친금성(aurophilicity), 치윤(intercalation), 스태킹(stacking), 엔트로피 힘 또는 화학 극성을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "화학적으로 가교결합된" 및 "접합된"은 상호 교환되어 사용되고, 직접적으로 또는 링커, 예를 들어 펩타이드 링커를 통해 아미노산의 산성 측쇄 사이의 공유 결합에 의해 화학적으로 연결하는 것을 의미한다. 화학 가교결합은 이합체 Fc 구역의 Fc 모이어티 사이의 분자내 또는 분자간 이황화 결합, 또는 활성화된 응고 인자의 아미노산과 인핸서 모이어티의 아미노산 사이의 비조작된 이황화 결합을 포함하지 않는다. 화학 가교결합은 일반적으로 가교결합제, 예를 들어 헤테로이작용성 가교결합제의 첨가에 의해 발생한다. 화학 가교결합의 예는 포토-Ile, 포토-Met 및 포토-Leu의 화학적 연결에 의한 하나 이상의 광반응성 결합을 포함한다(문헌[Suchanek et al., (2005) Nature Methods, 2: 261-267] 참조).
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 구역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해, 표적, 예컨대 단백질(예를 들어, GPIIb/IIIa 수용체, 이의 아단위, 또는 수용체 복합체), 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄화수소, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 또는 상기의 조합을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다.
통상적인 항체는 이황화 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함한다. 각각의 중쇄는 "중쇄 가변 구역" 또는 "중쇄 가변 도메인"(본 명세서에 VH라 축약됨) 및 중쇄 불변 구역으로 이루어진다. 중쇄 불변 구역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 "경쇄 가변 구역" 또는 "경쇄 가변 도메인"(본 명세서에 VL이라 축약됨) 및 경쇄 불변 구역으로 이루어진다. 경쇄 불변 구역은 Cl인 하나의 도메인을 이루어진다. VH 구역 및 VL 구역은, 프레임워크 구역(FW)이라 칭하는, 더 보전된 구역에 의해 배치된, 상보성 결정 구역(CDR)이라 칭하는, 초가변의 구역으로 추가로 세분될 수 있다.
각각의 VH 및 VL 구역은 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FW로 이루어진다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 구역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "항체"는, 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 온전한 다중클론 항체, 온전한 단일클론 항체, 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 사슬 Fv(scFv), 미니바디, 다중특이적 항체, 예컨대 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 적어도 2개의 온전한 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 융합 단백질로부터 생성된 이중특이적 항체, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 따라서, 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 또는 이의 단일 사슬을 포함한다. 항체는 나출형이거나, 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성 동위원소 등에 접합될 수 있다.
CDR의 위치를 결정하기 위한 적어도 2개의 기법이 존재한다: (1) 교차 종 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani et al. (1997) J. Molec . Biol . 273:927-948)). 또한, CDR을 결정하기 위해 이 2개의 접근법의 조합이 때때로 당해 분야에서 이용된다.
카밧에서와 같은 아미노산 위치 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서의 항체의 목록의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 의미한다. 이 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은, 가변 도메인의, FW 또는 CDR의 단축, 또는 이로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 52번 잔기 후 단일 아미노산 삽입물(카밧에 따른 52a번 잔기) 및 중쇄 FW 82번 잔기 후에 삽입된 잔기(예를 들어, 카밧에 따른 82a번, 82b번 및 82c번 잔기 등)를 포함할 수 있다.
"표준" 카밧 넘버링된 서열에 의한 항체의 서열의 상동성의 구역에서의 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 잔기의 카밧 넘버링을 결정할 수 있다. 쵸티아는 대신 구조 루프의 위치를 의미한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 쵸티아 CDR-H1 루프의 말단은, 카밧 넘버링 관례를 이용하여 넘버링될 때, 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에 변한다(이는 카밧 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에서 삽입을 위치시키기 때문이다; 35A도 35B도 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종료하고; 오직 35A가 존재하는 경우, 루프는 33에서 종료하며; 35A 및 35B 둘 다가 존재하는 경우, 루프는 34에서 종료한다). AbM 초가변 구역이 카밧 CDR과 쵸티아 구조 루프 사이의 절충을 나타내고, 옥스포드 분자(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
IMGT(ImMunoGeneTics)는 또한 CDR을 포함하는 면역글로불린 가변 구역에 대한 넘버링 시스템을 제공한다. 예를 들어, 문헌[Lefranc, M.P. et al., Dev . Comp. Immunol. 27: 55-77(2003)]을 참조한다. IMGT 넘버링 시스템은 5,000개 초과의 서열의 정렬, 구조 데이터 및 초가변 루프의 규명에 기초하고, 모든 종에 대한 가변 및 CDR 구역의 용이한 비교를 허용한다. IMGT 넘버링 계획에 따르면, VH-CDR1은 26번 내지 35번 위치에 있고, VH-CDR2는 51번 내지 57번 위치에 있고, VH-CDR3은 93번 내지 102번 위치에 있고, VL-CDR1은 27번 내지 32번 위치에 있고, VL-CDR2는 50번 내지 52번 위치에 있고, VL-CDR3은 89번 내지 97번 위치에 있다.
본 명세서에 걸쳐 사용되는 것처럼, 본 명세서에 기재된 VH CDR 서열은 전통적인 카밧 넘버링 위치에 상응하고, 즉 카밧 VH-CDR1은 31-35번 위치에 있고, VH-CDR2는 50-65번 위치에 있고, VH-CDR3은 95-102번 위치에 있다. VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3은 또한 전통적인 카밧 넘버링 위치, 즉 각각 14-24번, 50-56번 및 89-97번 위치에 상응한다.
용어 "공통 서열"은, 경쇄(VL) 또는 중쇄(VH) 가변 구역에서의 CDR과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바대로, 어떠한 아미노산 잔기가 다중 서열 정렬에 기초하여 소정의 위치에 존재하는지에 대한 정보에 기초하여 한정된 복합적인 또는 포괄적인 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, VL 또는 VH 사슬 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 대한 "공통 서열"에서, 소정의 아미노산 위치를 그 위치에서의 다수의 가능한 아미노산 잔기 중 하나가 점유한다. 예를 들어, 아르기닌(R) 또는 세린(S)이 특정한 위치 X에 존재하는 경우, 공통 서열 내의 이 특정한 위치는 아르기닌 또는 세린(R 또는 S)일 수 있다. 이러한 존재는, 예를 들어 N-Z1Z2XnZt-1Zt-C(여기서, Z1>t는 다중 서열 정렬에서의 불변 아미노산이고, X는 가변 아미노산(예를 들어, R 또는 S)이 점유한 위치를 나타내며, 첨자 n은 서수임)로 표시될 것이다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 공통 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 것으로 폴리펩타이드 서열을 언급하는 것은 폴리펩타이드 서열이 공통 서열로 표시되는 다수의 가능한 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 이루어진다는 것을 의미한다.
용어 "항원 결합 단편"은 온전한 항체의 일부를 의미하고, 온전한 항체의 항원 결정 가변 구역을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "Fab"는 효소 파파인에 의한 면역글로불린(통상적으로 IgG)의 분해에 의해 얻은 단편과 본질적으로 동등한 항체 단편을 의미한다. Fab 단편의 중쇄 분절은 Fd 조각이다. 이러한 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소로 또는 화학적으로 생성되거나, 부분 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합으로 생성될 수 있거나, 이것은 전부 또는 부분적으로 합성으로 생성될 수 있다.
용어 "Fab"는 F(ab')2 단편에서의 2개의 중쇄 조각을 결합시키는 이황화 브릿지 또는 브릿지들의 환원으로부터 얻은 단편과 본질적으로 동등한 항체 단편을 의미한다. 이러한 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소로 또는 화학적으로 생성되거나, 부분 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합으로 생성될 수 있거나, 이것은 전부 또는 부분적으로 합성으로 생성될 수 있다.
용어 "F(ab')2"는 pH 4.0-4.5에서 효소 펩신에 의한 면역글로불린(통상적으로 IgG)의 분해에 의해 얻은 단편과 본질적으로 동등한 항체 단편을 의미한다. 이러한 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소로 또는 화학적으로 생성되거나, 부분 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합으로 생성될 수 있거나, 이것은 전부 또는 부분적으로 합성으로 생성될 수 있다.
용어 "Fv"는 비공유 상호작용에 의해 함께 합쳐진 하나의 NH 및 하나의 N 도메인으로 이루어진 항체 단편을 의미한다.
용어 "단일클론 항체"는 단일 항원 결정부위, 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 집단을 의미한다. 이는 상이한 항원 결정부위에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다중클론 항체와 반대이다. 용어 "단일클론 항체"는 온전한 단일클론 항체 및 전장 단일클론 항체 둘 다, 및 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 Fv), 단일 사슬(scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 더욱이, "단일클론 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 형질전환 동물(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 방식으로 만들어진 항체를 의미한다.
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 또는 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 이용하여 만들어진 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이 정의는 온전한 항체 또는 전장 항체, 이들의 단편 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 예를 들어 쥣과 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다. 용어 "인간화 항체"는 최소 비인간(예를 들어, 쥣과) 서열을 함유하도록 조작된 비인간(예를 들어, 쥣과) 면역글로불린으로부터 유래한 항체를 의미한다. 용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래한 항체를 의미한다. 통상적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 구역은 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 래빗 등)의 하나의 종으로부터 유래한 항체의 가변 구역에 상응하지만, 불변 구역은 또 다른 종(보통 인간)으로부터 유래한 항체에서의 서열에 상동성이어서 그 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 피한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항-GPIIb/IIIa 항체는 항체 변이체를 포함한다. 용어 "항체 변이체" 또는 "변형된 항체"는 자연에서 존재하지 않고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 또는 아미노산 변형으로 자연 유래 항체와 다른 아미노산 서열 또는 아미노산 측쇄 화학을 갖는 항체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "항체 변이체"는 천연 발생이 아니게 변경된 항체의 합성 형태, 예를 들어 2개의 완전한 중쇄(예컨대, 도메인 결실된 항체 또는 미니바디)를 포함하지 않고 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하는 항체; 2개 이상의 상이한 항원 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 항체의 다중특이적 형태(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 등); scFv 분자에 연결된 중쇄 분자; 단일 사슬 항체; 다이아바디; 트라이아바디; 및 이팩터 기능이 변경된 항체 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "scFv" 또는 "scFv 분자"는 하나의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 이의 일부 및 하나의 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 이의 일부로 이루어진 결합 분자를 포함하고, 각각의 가변 도메인(또는 이의 일부)은 동일한 또는 상이한 항체로부터 유래한다. 단일 사슬 Fv 분자는 바람직하게는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 배치된 scFv 링커를 포함한다. 일 실시형태에서, scFv는 (N 말단) VH - 임의의 scFv 링커 - VL(C 말단)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, scFv는 (N 말단) VL - 임의의 scFv 링커 - VH(C 말단)를 포함한다. 예시적인 scFv 분자는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,892,019호; 문헌[Ho et al., Gene 77:51 (1989); Bird et al., Science 242:423 (1988); Pantoliano et al., Biochemistry 30:10117 (1991); Milenic et al., Cancer Research 51:6363 (1991); Takkinen et al., Protein Engineering 4:837 (1991)]에 기재되어 있다.
용어 "scFv 링커"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, scFv의 VL 도메인과 VH 도메인 사이에 배치된 모이어티를 의미한다. scFv 링커는 바람직하게는 항원 결합 입체구성에서 scFv 분자를 유지한다. 일 실시형태에서, scFv 링커는 scFv 링커 펩타이드를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, scFv 링커 펩타이드는 gly-ser 펩타이드 링커를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, scFv 링커는 이황화 결합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "항원 결합 분자"는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항-GPIIb/IIIa 항체로부터의 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 항-GPIIb/IIIa 항체 단편, 이의 변이체, 또는 유도체를 포함하는 분자를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 분자는 단백질이다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 분자는 본 명세서에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 중 하나로부터의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단백질 스캐폴드(예를 들어, 피브로넥틴 III형 도메인) 또는 비단백질 스캐폴드이다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 분자는 본 명세서에 개시된 CDR 서열 중 하나와 동일한 적어도 하나의 CDR을 포함하는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 확인된 항-GPIIb/IIIa 항체이다. 용어 "항원 결합 분자"는 또한 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항-GPIIb/IIIa 항체로부터의 VH 구역 및/또는 VL 구역을 포함하는 임의의 분자를 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"는 단일의 핵산 및 복수의 핵산을 포함하도록 의도되고, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 종래의 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들어, 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견되는, 예컨대 아마이드 결합)을 포함한다.
용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 의미한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 예는 이종성 숙주 세포에 유지되거나 용액 중의 다른 폴리뉴클레오타이드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 실험실내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성으로 생성된 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "코딩 구역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드의 부분이다. "중지 코돈"(tag, tga 또는 taa)이 통상적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 이것은 코딩 구역의 일부인 것으로 생각될 수 있지만, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 구역의 일부가 아니다. 코딩 구역의 경계는 생성된 폴리펩타이드의 아미노 말단을 코딩하는 5' 말단에서의 시작 코돈 및 생성된 폴리펩타이드의 카복실 말단을 코딩하는 3' 말단에서의 번역 중지 코돈으로 통상적으로 결정된다.
본 발명의 2개 이상의 코딩 구역은 예를 들어 단일 벡터 상의 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물, 또는 예를 들어 별개의(상이한) 벡터 상의 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물로 존재할 수 있다. 따라서, 이의 결과로서, 단일 벡터는 단지 단일 코딩 구역을 함유하거나, 2개 이상의 코딩 구역을 포함할 수 있고, 예를 들어 단일 벡터는 하기 기재된 바와 같은 결합 도메인 A 및 결합 도메인 B를 별도로 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은, 본 발명의 결합 도메인을 코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 채, 이종성 코딩 구역을 코딩할 수 있다. 이종성 코딩 구역은 제한 없이 특수 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩타이드 또는 이종성 기능적 도메인을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 세포에서 원하는 폴리뉴클레오타이드로 도입하거나 이를 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하도록 본 명세서에 사용된다. 당해 분야의 당업자에게 공지된 바대로, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 적합한 벡터는 선택 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 수월하게 하는 적절한 제한 부위, 및 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 진입하고/하거나 복제하는 능력을 포함할 것이다.
수많은 발현 벡터 시스템은 항체, 이의 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 키메라 분자를 생성하도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 일 종류는 동물 바이러스, 예컨대 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 바큘로바이러스(baculovirus), 레트로바이러스(retrovirus)(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래한 DNA 요소를 이용한다. 추가로, 형질감염된 숙주 세포의 선택이 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써, DNA를 염색체로 통합시킨 세포를 선택할 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 원영양성(prototrophy), 살생제 내성(예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현시키고자 하는 DNA 서열로 직접 연결되거나, 동시형질전환에 의해 동일한 세포로 도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 유도성 발현 시스템을 이용할 수 있다. mRNA의 최적 합성을 위해 추가의 요소가 또한 필요할 수 있다. 이 요소는 신호 서열, 스플라이스 신호, 및 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 분비 신호, 예를 들어 몇몇 잘 규명된 박테리아 리더 펩타이드(예를 들어, pelB, phoA 또는 ompA) 중 임의의 하나는 폴리펩타이드의 최적 분비를 얻도록 본 발명의 폴리펩타이드의 N 말단에 인프레임으로 융합될 수 있다. (Lei et al. (1988), Nature, 331:543; Better et al. (1988) Science, 240:1041; Mullinax et al., (1990). PNAS , 87:8095).
포유동물 세포가 분비한 소정의 단백질은, 조면소포체를 통한 성장하는 단백질 사슬의 배출이 개시되면, 성숙 단백질로부터 개열된 분비 신호 펩타이드와 회합된다. 당해 분야의 당업자는 신호 펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N 말단에 융합되고, 완전한 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 개열되어, 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성한다는 것을 알 것이다. 소정의 실시형태에서, 천연 신호 펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드, 또는 이것과 작동 가능하게 회합된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 서열의 기능적 유도체를 사용한다. 대안적으로, 이종성 포유동물 신호 펩타이드, 예를 들어 인간 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator: TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제 신호 펩타이드, 또는 이의 기능적 유도체를 사용할 수 있다.
"재조합" 폴리펩타이드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩타이드 및 단백질은, 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분별화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩타이드가 그런 것처럼, 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 생각된다.
용어 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용하여 작제된 벡터에 의해 형질전환되고, 적어도 하나의 이종성 유전자를 코딩하는 세포를 의미한다. 재조합 숙주로부터의 단백질의 단리를 위한 과정의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은, 달리 명확히 기재되지 않은 한, 단백질의 공급원을 나타내도록 상호 교환되어 사용된다. 즉, "세포"로부터의 단백질의 회수는 스핀 다운된 전체 세포, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다. 단백질 발현에 사용된 숙주 세포주는 가장 바람직하게는 포유동물 기원이고; 당해 분야의 당업자는 내부에서 발현시키고자 하는 원하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정한 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력을 믿는다. 예시적인 숙주 세포주는 CHO 세포주, BHK 세포주, HEK 세포주, DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), PerC6 세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포) 및 RAJI(인간 림프구)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 숙주 세포주는 상업적 서비스, 미국 조직 배양 협회(American Tissue Culture Collection)로부터 또는 공개 문헌으로부터 통상적으로 이용 가능하다.
II. 키메라 FVII 분자
II.A. 항-GPIIb/IIIa 항체 및 XTEN을 포함하는 키메라 분자
본 발명은 FVII, XTEN 폴리펩타이드, 및 혈소판의 표면에 위치한 GPIIb/IIIa 수용체에 특이적으로 결합하는 항-GPIIb/IIIa 항체 및 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 키메라 분자는 FVII의 순환 반감기를 연장하고 활성화된 혈소판에 대한 결합 친화도를 개선하여, 투약 빈도를 감소시키도록 작제된다. 따라서, 본 발명의 키메라 분자는 반감기 연장을 활성 개선과 조합하는 FVII 변이체의 오래 지속하고 더 강력한 형태이다. 순환 반감기를 개선하기 위해, rFVIIa는 페이로드 단백질의 유체역학 반경을 증가시키는 친수성 및 비구조화 폴리펩타이드인 XTEN 폴리펩타이드에 융합된다. 또한, 응고 활성은 고친화도로 혈소판 수용체 αIIβ3에 결합하는 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자에 의해 혈소판에 rFVIIa를 표적화함으로써 증대된다.
키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드, 또는 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 임의의 순서로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, XTEN 폴리펩타이드, FVII 및 본 명세서에 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, FVII 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, XTEN 폴리펩타이드, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 및 FVII를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, XTEN 폴리펩타이드 및 FVII를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 (a) FVII-(L1)-X-(L2)-Tm; (b) FVII-(L1)-Tm-(L2)-X; (c) Tm-(L1)-X-(L2)-FVII; (d) Tm-(L1)-FVII-(L2)-X; (e) X-(L1)-Tm-(L2)-FVII; 및 (f) X-(L1)-FVII-(L2)-Tm(식 중, FVII는 FVIIa를 포함하고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; Tm은 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이고; L1은 제1 임의의 링커이며, L2는 제2 임의의 링커임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 단일 폴리펩타이드 사슬 또는 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 2개의 폴리펩타이드 사슬이다.
일 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 임의의 순서로 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 사슬은 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 임의의 순서로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X 또는 X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH의 화학식을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm 또는 Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X 또는 X-FVIIH의 화학식을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH의 화학식을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH의 화학식을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH의 화학식을 포함한다. 몇몇 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH의 화학식을 포함한다. 키메라 분자의 각각의 성분은 하기한 바대로 표시된다: FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 X-FVIIL:FVIIH-Tm, X-FVIIL:Tm-FVIIH, FVIIL-X:FVIIH-Tm, FVIIL-X:Tm-FVIIH, Tm-FVIIH:X-FVIIL, Tm-FVIIH:FVIIL-X, FVIIH-Tm:FVIIL-X, 또는 FVIIH-Tm:X- FVIIL(식 중, FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합임)의 화학식을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVIIL:FVIIH-X-Tm; Tm-X-FVIIH:FVIIL; FVIIL:FVIIH-Tm-X; 또는 X-Tm-FVIIH:FVIIL(식 중, FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 부문 II.A.1.에 기재된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합임)의 화학식을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 예를 들어 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 회합된다. 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 응고 인자의 중쇄와 경쇄 사이의 공유 결합이다. 구체적인 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 이황화 결합이다.
본 발명의 키메라 분자는 단일 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드 사슬 또는 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 코딩된 단일 폴리펩타이드 사슬은 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬로 프로세싱될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII의 경쇄, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII의 경쇄, 임의의 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII의 경쇄, 임의의 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 임의의 프로테아제 개열 부위 및 FVII의 중쇄를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII의 경쇄, 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, XTEN 폴리펩타이드, 임의의 프로테아제 개열 부위 및 FVII의 중쇄를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 다른 실시형태에서, 프로테아제 개열 부위는 세포내 프로세싱 부위이다. 세포내 프로세싱 부위는 임의의 프로테아제 효소, 예를 들어 프로단백질 전환효소, 예를 들어 PC5, PACE, PC7, 및 이들의 임의의 조합에 의해 프로세싱될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 서열 번호 192 또는 서열 번호 193에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 키메라 분자는 서열 번호 192 또는 서열 번호 193에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
II.A.1 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자
용어 "GPIIb/IIIa 항체", "항-GPIIb/IIIa 항체", "항-GPIIb/IIIa", "GPIIb/IIIa에 결합하는 항체" 및 이의 임의의 문법상 변형어는 항체가 GPIIb/IIIa를 표적화하는 데 있어서 치료제 또는 진단학적 시약의 일부로서 유용하도록 충분한 친화도로 GPIIb/IIIa 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 비관련, 비-GPIIb/IIIa 단백질에 대한 본 명세서에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사면역검정(radioimmunoassay: RIA), 비아코어(BIACORE)(상표명)(분석물질로서의 재조합 GPIIb/IIIa 및 리간드로서의 항체(또는 이의 반대)를 사용하여), 또는 당해 분야에 공지된 다른 결합 검정에 의해 측정된, GPIIb/IIIa에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 소정의 실시형태에서, GPIIb/IIIa에 결합하는 항체는 해리 상수(KD)가 ≤1μM, ≤100nM, ≤50nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤10pM, ≤1pM, 또는 ≤0.1pM이다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "GPIIb/IIIa" 및 "GPIIb/IIIa 수용체"는 혈소판에서 발견되는 인테그린 복합체인 당단백질 IIb/IIIa(또한 인테그린 αIIbβ3으로서 공지됨)를 의미한다. 인테그린은 칼슘 독립적 방식으로 비공유 결합에 의해 함께 보유된, α 아단위 및 β 아단위인, 2개의 사슬로 이루어진다. GPIIb는 2가 양이온 결합 도메인을 포함하는 α 아단위를 구성하고, GPIIIa는 프로 통상적 β 아단위(β3)이다. 각각의 순환 혈소판 상에, 35,000개 내지 100,000개의 GPIIb/IIIa 복합체가 존재하고; 대부분 혈소판 표면에 분포되고, 더 적은 풀(pool)이 내부 저장소(reserve) 내에 있다. 혈소판이 외인성 효현제, 예컨대 ADP 또는 트롬빈에 의해 활성화될 때까지, GPIIb/IIIa 복합체는 이의 혈장 리간드와 상호작용하지 않는다. 이것이 일어날 때, 분자가 피브리노겐 및 다른 리간드와 결합할 수 있게 하는, 복합체의 세포외 부분의 형태학적 변화를 발생시키는 내외(inside-out) 신호가 생성된다. 유니버셜 단백질 리소스(Universal Protein Resource)(유니프로트(Uniprot)) 데이터베이스 발간 2013_05(2013년 5월 1일)(그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 공표된 유니프로트 목록 P05106(ITB3_HUMAN; GPIIIa: CD61; 인테그린 베타-3; 인테그린 β3) 및 P08514(ITA2B_HUMAN; GPIIb; CD41; 인테그린 알파-2b; 인테그린 αII)을 참조한다.
본 발명의 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드, 및 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4(표 3 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 GPIIb/IIIa 결합 에피토프를 포함하거나 이것과 중첩되는, GPIIb/IIIa 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드, 및 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4(표 3 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 동일한 GPIIb/IIIa 결합 에피토프인 GPIIb/IIIa 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "에피토프"는 특이적 아미노산 서열, 변형된 아미노산 서열, 또는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 단백질 2차 또는 3차 구조를 지칭한다. 용어 "특이적으로 인식하는", "특이적으로 인식한다" 및 임의의 문법상 변형어는 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 에피토프, 예를 들어 GPIIb/IIIa 에피토프의 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산과 특이적으로 상호작용하고/하거나, 이에 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 결합은 "락 앤 키(lock-and-key) 원칙"의 특이성으로 예시될 수 있다. 따라서, 항원 결합 도메인, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 및 에피토프의 아미노산 서열에서의 특이적 모티프는 이의 1차, 2차 또는 3차 구조, 및 이 구조의 2차 변형의 결과로서 서로에 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4(표 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체에 대한 GPIIb/IIIa 결합을 경쟁적으로 저해한다. 다른 실시형태에서, GPIIb/IIIa 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 표 1에 개시된 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4 항체 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 상보성 결정 구역(CDR) 또는 이의 변이체를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, GPIIb/IIIa 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 본 명세서에 개시된 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 6개의 CDR 또는 이의 변이체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CDR은 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 6개의 항체의 VH 구역 및/또는 VL 구역으로부터 유래한 CDR 또는 이의 변이체로부터 독립적으로 선택된다.
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR1과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR3과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR1과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열, 및/또는
(ⅵ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR3과 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 항체의 VH-CDR1 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열; 및
(ⅲ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR3과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열.
다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR1과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅱ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열, 및
(ⅲ) 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR3과 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 34D10, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8 및 18F7로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR1과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 34D10, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8 및 18F7로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 34D10, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8 및 18F7로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR3과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 34D10, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8 및 18F7로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR1과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 34D10, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8 및 18F7로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열, 및/또는
(ⅵ) 34D10, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8 및 18F7로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR3과 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 12B2, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR1과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 12B2, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 12B2, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH-CDR3과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 12B2, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR1과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 12B2, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR2와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열, 및/또는
(ⅵ) 12B2, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VL-CDR3과 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 25, 31, 37, 43 또는 111 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 26, 32, 38, 44 또는 112 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 27, 33, 39, 45 또는 113 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 28, 34, 40, 117 또는 114 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 29, 35, 41, 118 또는 115 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 30, 36, 42, 119 또는 116 중 임의의 하나와 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 공통 서열 X1YAMS(여기서, X1은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄 또는 비극성 측쇄, 예를 들어 Thr(T), Ser(S) 또는 Ala(A)를 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR1;
(ⅱ) 공통 서열 SIX2X3GX4X5T YX6X7DSVKX8(여기서, X2는 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Ser(S) 또는 Asn(N)을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고, X3은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Ser(S) 또는 Gly(G)를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며, X4는 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Ser(S) 또는 Gly(G)를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고, X5는 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Ser(S), Asn(N) 또는 Thr(T)을 갖는 아미노산 잔기를 나타내며, X6은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 방향족 측쇄, 예를 들어 Tyr(Y) 또는 Phe(F)를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고, X7은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비극성 측쇄, 예를 들어 Leu(L) 또는 Pro(P)를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며, X8은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 염기성 측쇄 또는 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Gly(G) 또는 Arg(R)를 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)을 포함하는 VH-CDR2;
(ⅲ) 공통 서열 GGDYGYAX9DY(여기서, X9는 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비극성 측쇄, 예를 들어 Leu(L) 또는 Met(M)를 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR3;
(ⅳ) 서열 RASSSVNYMY(서열 번호 28)를 포함하는 VL-CDR1;
(ⅴ) 서열 YTSNLAP(서열 번호 29)를 포함하는 VL-CDR2; 및
(ⅵ) 서열 QQFSSSPWT(서열 번호 30)를 포함하는 VL-CDR3.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 25, 31, 37, 43 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열;
(ⅱ) 서열 번호 26, 32, 38, 44 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR2 서열;
(ⅲ) 서열 번호 27, 33, 39, 45 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR3 서열;
(ⅳ) 서열 번호 28, 34, 40, 117 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열;
(ⅴ) 서열 번호 29, 35, 41, 118 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR2 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 30, 36, 42, 119 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR3 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 97 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 2, 4, 6, 99 또는 98 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인에 위치한 GPIIb/IIIa 에피토프 또는 GPIIb/IIIa 복합체의 세포외 도메인에 의해 형성된 결합 부위에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 46, 52, 120 또는 126 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 47, 53, 121 또는 127 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 48, 54, 122 또는 128 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 49, 55, 123 또는 129 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 50, 56, 124 또는 130 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 51, 57, 125 또는 131 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서. 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 NYLIE(서열 번호 46)를 포함하는 VH-CDR1;
(ⅱ) 서열 VINPGSGGTNYNEKFKG(서열 번호 47)를 포함하는 VH-CDR2;
(ⅲ) 서열 GRYEWYFDV(서열 번호 48)를 포함하는 VH-CDR3;
(ⅳ) 공통 서열 RASQDIX10NYLN(여기서, X10은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Ser(S) 또는 Thr(T)을 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)을 포함하는 VL-CDR1;
(ⅴ) 서열 YTSRLHS(서열 번호 50)를 포함하는 VL-CDR2; 및
(ⅵ) 서열 QQGYTLPYT(서열 번호 51)를 포함하는 VL-CDR3.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 46, 52, 120 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열;
(ⅱ) 서열 번호 47, 53, 121 및 127로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR2 서열;
(ⅲ) 서열 번호 48, 54, 122 및 128로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR3 서열;
(ⅳ) 서열 번호 49, 55, 123 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열;
(ⅴ) 서열 번호 50, 56, 124 및 130으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR2 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 51, 57, 125 및 131로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR3 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 8, 10, 100 또는 102 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 9, 11, 101 또는 103 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인에 위치한 GPIIb/IIIa 에피토프 또는 GPIIb/IIIa 복합체의 세포외 도메인에 의해 형성된 결합 부위에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁한다.
몇몇 실시형태에서 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 58과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 59와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 60과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 61과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 62와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 63과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 58을 포함하는 VH-CDR1 서열;
(ⅱ) 서열 번호 59를 포함하는 VH-CDR2 서열;
(ⅲ) 서열 번호 60을 포함하는 VH-CDR3 서열;
(ⅳ) 서열 번호 61을 포함하는 VL-CDR1 서열;
(ⅴ) 서열 번호 62를 포함하는 VL-CDR2 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 63을 포함하는 VL-CDR3 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 12와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 13과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체의 에피토프 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인에 위치한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 64, 70 또는 135 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 65, 71 또는 136 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 66, 72 또는 137 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 67, 132 또는 138 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 68, 133 또는 139 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 69, 134 또는 140 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다: (ⅰ) 서열 SYWIE(서열 번호 64)를 포함하는 VH-CDR1; (ⅱ) 공통 서열 EILPGX14GX15TKYNX16KFKG(서열 번호 __)(식 중, X14는 임의의 아미노산, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Ser(S) 또는 Thr(T)을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고, X15는 임의의 아미노산, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄 또는 베타 분지 측쇄, 예를 들어 Ile(I) 또는 Tyr(Y)를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며, X16은 임의의 아미노산, 예를 들어 산성 측쇄, 예를 들어 Asp(D) 또는 Glu(E)를 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR2; (ⅲ) 서열 LISYYYAMDY(서열 번호 66)를 포함하는 VH-CDR3; (ⅳ) 서열 RASQDISNYLN(서열 번호 67)을 포함하는 VL-CDR1; (ⅴ) 서열 YTSRLHS(서열 번호 68)를 포함하는 VL-CDR2; 및 (ⅵ) 서열 QQGNTLPPT(서열 번호 69)를 포함하는 VL-CDR3.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 64, 70 및 135로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열;
(ⅱ) 서열 번호 65, 71 및 136으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR2 서열;
(ⅲ) 서열 번호 66, 72 및 137로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR3 서열;
(ⅳ) 서열 번호 67, 132 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열;
(ⅴ) 서열 번호 68, 133 및 139로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR2 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 69, 134 및 140으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR3 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 14, 16 또는 105 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 15, 104 또는 106 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 GPIIb/IIIa 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 73, 76, 79, 85 또는 147 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 74, 77, 80, 86 또는 148 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 75, 78, 81, 87 또는 149 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 141, 144, 82, 88 또는 150 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 142, 145, 83, 89 또는 151 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 143, 146, 84, 90 또는 152 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 공통 서열 TSGX11GVG(여기서, X11은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비극성 측쇄, 예를 들어 Met(M) 또는 Leu(L)를 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR1;
(ⅱ) 공통 서열 HIWWDDDKRYNPX12LKS(여기서, X12는 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비극성 측쇄 또는 베타 분지 측쇄, 예를 들어 Ala(A) 또는 Thr(T)을 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR2;
(ⅲ) 공통 서열 SHYX13GTFYFDX14(여기서, X13은 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 비하전된 극성 측쇄, 예를 들어 Tyr(Y) 또는 Asn(N)을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고, X14는 임의의 아미노산 잔기, 예를 들어 방향족 측쇄, 예를 들어 Tyr(Y) 또는 Phe(F)를 갖는 아미노산 잔기를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR3;
(ⅳ) 서열 RASKSISKYLA(서열 번호 82)를 포함하는 VL-CDR1;
(ⅴ) 서열 SGSTLQS(서열 번호 83)를 포함하는 VL-CDR2; 및
(ⅵ) 서열 QQHIEYPWT(서열 번호 84)를 포함하는 VL-CDR3.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 73, 76, 79, 85 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열;
(ⅱ) 서열 번호 74, 77, 80, 86 및 148로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR2 서열;
(ⅲ) 서열 번호 75, 78, 81, 87 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR3 서열;
(ⅳ) 서열 번호 141, 144, 82, 88 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열;
(ⅴ) 서열 번호 142, 145, 83, 89 및 151로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR2 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 143, 146, 84, 90 및 152로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR3 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 분자는 서열 번호 17, 18, 19, 21 또는 109 중 임의의 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 107, 108, 20, 22 또는 110 중 임의의 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 분자는 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 분자는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 분자는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 GPIIb/IIIa 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 91과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
(ⅱ) 서열 번호 92와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
(ⅲ) 서열 번호 93과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
(ⅳ) 서열 번호 94와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
(ⅴ) 서열 번호 95와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 96과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호 91을 포함하는 VH-CDR1 서열;
(ⅱ) 서열 번호 92를 포함하는 VH-CDR2 서열;
(ⅲ) 서열 번호 93을 포함하는 VH-CDR3 서열;
(ⅳ) 서열 번호 94를 포함하는 VL-CDR1 서열;
(ⅴ) 서열 번호 95를 포함하는 VL-CDR2 서열; 및
(ⅵ) 서열 번호 96을 포함하는 VL-CDR3 서열.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 23과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 구역 및 서열 번호 24와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 구역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 세포외 도메인에 위치한 GPIIb/IIIa 에피토프에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁한다.
몇몇 실시형태에서, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 (a) 단일 사슬 Fv("scFv"); (b) 다이아바디; (c) 미니바디; (d) 항체의 폴리펩타이드 사슬; (e) F(ab')2; 또는 (f) F(ab)를 포함하거나 이들로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, 적합한 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는, 예를 들어 본 명세서에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체로부터 유래한, 특이적 결합 쌍의 임의의 구성원, 항체, 단일클론 항체, 또는 유도체 또는 유사체, 예컨대 (제한 없이) Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단일 도메인 항체, 카멜라이드화 항체 및 항체 단편, 인간화 항체 및 항체 단편 및 상기의 다가 버전; 다가 결합 시약, 예컨대 (제한 없이) 단일특이적 또는 이중특이적 항체, 예컨대 이황화 안정화 Fv 단편, scFv 탠덤((scFv) 단편), 다이바디, 트라이바디 또는 테트라바디(통상적으로 공유 연결되거나 그렇지 않으면 안정화됨(즉, 류신 지퍼 또는 나선 안정화)) scFv 단편을 포함한다.
II.B. 표적화 모이어티 및 XTEN을 포함하는 키메라 분자
본 발명은 또한 FVII의 경쇄, FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티의 조합을 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 응고 활성 및 약동학적 특성을 개선하기 위해, 키메라 분자는 반감기 연장 모이어티, 즉 XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판 표적화 모이어티를 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 사슬 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 또는 XTEN 폴리펩타이드를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm 또는 Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X 또는 X-FVIIH의 화학식을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X 또는 X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH의 화학식을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH의 화학식을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로와 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH의 화학식을 포함한다. 키메라 분자의 각각의 성분은 하기한 바대로 표시된다: FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이다.
다른 실시형태에서, 키메라 분자는 X-FVIIL:FVIIH-Tm, X-FVIIL:Tm-FVIIH, FVIIL-X:FVIIH-Tm, FVIIL-X:Tm-FVIIH, Tm-FVIIH:X-FVIIL, Tm-FVIIH:FVIIL-X, FVIIH-Tm:FVIIL-X, 또는 FVIIH-Tm:X- FVIIL(식 중, FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합임)의 화학식을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVIIL:FVIIH-X-Tm; Tm-X-FVIIH:FVIIL; FVIIL:FVIIH-Tm-X; 또는 X-Tm-FVIIH:FVIIL(식 중, FVIIH는 FVII의 중쇄이고; Tm은 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티이며; FVIIL은 FVII의 경쇄이고; X는 XTEN 폴리펩타이드이며; (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합임)의 화학식을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 키메라 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 회합된다. 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 FVII의 중쇄와 경쇄 사이의 공유 결합이다. 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 공유 결합, 즉 이황화 결합이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는, N 말단으로부터 C 말단으로, 하기를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함한다:
(a) FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티;
(b) FVII의 경쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드;
(c) FVII의 경쇄, 임의의 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티; 또는
(d) FVII의 경쇄, 임의의 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 및 XTEN 폴리펩타이드. 일 실시형태에서, 프로테아제 개열 부위는 세포내 프로세싱 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포내 프로세싱 부위는 프로단백질 전환효소, 예를 들어 PC5, PACE, PC7, 및 이들의 임의의 조합에 의해 프로세싱된다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 서열 번호 191 또는 서열 번호 192에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 서열 번호 188 또는 서열 번호 190에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 분자는 72개의 아미노산(예를 들어, AE72, AE72_2, 또는 AE72_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 FVII 경쇄 및 항-GPIIb/IIIa 항체(예를 들어, 34D10)의 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 분자는 144개의 아미노산(예를 들어, AE144, AE144_2, AE144_3, 또는 AG144)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 FVII 경쇄 및 항-GPIIb/IIIa 항체(예를 들어, 34D10)의 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII 경쇄 및 FVII 중쇄를 포함하고, 여기서 FVII 중쇄는 72개의 아미노산(예를 들어, AE72, AE72_2, 또는 AE72_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 의해 항-GPIIb/IIIa 항체(예를 들어, 34D10)의 scFv에 융합된다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII 경쇄 및 FVII 중쇄를 포함하고, 여기서 FVII 중쇄는 144개의 아미노산(예를 들어, AE144, AE144_2, AE144_3, 또는 AG144)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 의해 항-GPIIb/IIIa 항체(예를 들어, 34D10)의 scFv에 융합된다. 소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 42개의 아미노산(예를 들어, AE42, AE42_2, 또는 AE42_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 FVII 경쇄 및 72개의 아미노산(예를 들어, AE72, AE72_2, 또는 AE72_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 의해 항-GPIIb/IIIa 항체의 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 72개의 아미노산(예를 들어, AE72, AE72_2, 또는 AE72_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 FVII 경쇄 및 42개의 아미노산(예를 들어, AE42, AE42_2, 또는 AE42_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 의해 항-GPIIb/IIIa 항체의 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 72개의 아미노산(예를 들어, AE72, AE72_2, 또는 AE72_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 융합된 FVII 경쇄 및 72개의 아미노산(예를 들어, AE72, AE72_2, 또는 AE72_3)을 갖는 XTEN 폴리펩타이드에 의해 항-GPIIb/IIIa 항체의 scFv에 융합된 FVII 중쇄를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 수용체의 수용체 결합 부분 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 표적화 모이어티는 비활동 혈소판 또는 활성화된 혈소판에 선택적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 표적화 모이어티는 GPIba, GPVI, GPIX, 당단백질 IIb/IIIa("GPIIb/IIIa")의 비활성 형태, GPIIb/IIIa의 활성 형태, P 설렉틴, GMP-33, LAMP-1, LAMP-2, CD40L, LOX-1 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 선택적으로 결합한다. 구체적인 실시형태에서, 표적화 모이어티는 GPIIb/IIIa 에피토프("항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자")에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 분자이다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 구절 "혈소판에 결합하는", "혈소판에 대한 결합" 및 이의 변형어는 일반적으로 혈소판의 표면 상의 항원 부위, 예를 들어 GPIIb/IIIa 수용체의 α 및/또는 β 아단위의 세포외 도메인 상의 에피토프에 대한 (ⅰ) GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 또는 (ⅱ) 본 개시내용의 키메라 분자의 특이적 결합을 의미한다. 당해 분야에서 GPIIb/IIIa가 2개의 풀(혈소판의 비활동 상태에 존재하는 혈장 막 풀 및 혈소판 활성화 시 발현되는 GPIIb/IIIa의 내부 풀)에 존재하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Quinn et al., J. Pharmacol . Exp . Ther. 297:496-500 (2001)]을 참조한다. 따라서, 몇몇 구체적인 실시형태에서 및 특히 혈소판의 혈장 막이 투과성이 될 수 있는 진단학적 용도를 위해, 혈소판에 대한 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 결합, 또는 혈소판에 대한 본 개시내용의 키메라 분자의 결합은 혈장 막 풀 및/또는 GPIIb/IIIa의 내부 풀에 대한 결합을 의미할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자 내의 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 수용체의 수용체 결합 부분 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 표적화 모이어티는 비활동 혈소판 또는 활성화된 혈소판에 선택적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 표적화 모이어티는 GP1ba(유니프로트: E7ES66; E7ES66_HUMAN), GPVI(유니프로트: Q9HCN6; GPVI_HUMAN), GPIX(유니프로트: P14770; GPIX_HUMAN), 당단백질 IIb/IIIa("GPIIb/IIIa")의 비활성 형태, GPIIb/IIIa의 활성 형태, P-설렉틴(유니프로트: Q14242; SELPL_HUMAN), GMP-33(예를 들어, 문헌[Damas et al., Thromb. Haemost. 86:887-93 (2001)] 참조), LAMP-1(유니프로트: P11279; LAMP1_HUMAN), LAMP-2(유니프로트: P13473; LAMP2_HUMAN), CD40L(유니프로트: P29965; CD40L_HUMAN), LOX-1(유니프로트: P78380; OLR1_HUMAN) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 선택적으로 결합한다. 상기 언급된 유니프로트 식별자는 유니버셜 단백질 리소스(유니프로트) 데이터베이스 발간 2013_05(2013년 5월 1일)(그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 공표된 목록에 상응한다. 소정의 실시형태에서, 표적화 모이어티는 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 부문 II.A.1.에 개시된 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이다.
II.C. XTEN 폴리펩타이드
본 명세서에 사용되는 바대로, "XTEN 서열"은 주로 작은 친수성 아미노산으로 이루어진 비천연 발생, 실질적으로 비반복적인, 생리학적 조건 하에 낮은 정도의 2차 또는 3차 구조를 갖거나 갖지 않는, 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩타이드를 의미한다. 키메라 분자 파트너로서, XTEN은 응고 인자, 응고 인자의 중쇄, 경쇄 또는 응고 인자, 표적화 모이어티, 또는 키메라 분자 상의 임의의 다른 서열 또는 분자에 연결될 때 소정의 바람직한 약동학적, 생리화학적 및 약제학적 특성을 부여하는 캐리어로서 작용할 수 있다. 이러한 바람직한 특성은 증대된 약동학적 매개변수 및 용해도 특징을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "XTEN"은 항체 또는 항체 단편, 예컨대 단일 사슬 항체 또는 경쇄 또는 중쇄의 Fc 단편을 구체적으로 배제한다.
본 발명의 키메라 분자는 단일 XTEN 폴리펩타이드 또는 2개 이상의 XTEN 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 제1 XTEN 폴리펩타이드, 제2 XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함한다. 따라서, 키메라 분자는 FVII-(L1)-X1-(L2)-Tm-(L3)-X2, X2-(L1)-Tm-(L2)-X1-(L3)-FVII, FVII-(L1)-X1-(L2)-X2-(L3)-Tm, 또는 Tm-(L3)-X2-(L2)-X1-(L1)-FVII(식 중, FVII는 FVIIa를 포함하고, X1은 제1 XTEN 폴리펩타이드이며, X2는 제2 XTEN 폴리펩타이드이고, Tm은 부문 II.A.1.에 기재된 바와 같은 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며, L1은 제1 임의의 링커이고, L2는 제2 임의의 링커이며, L3은 제3 임의의 링커임)의 화학식을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로 회합된 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 제1 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, 제2 XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 임의의 순서로 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 서로 회합된 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 제1 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은, N 말단으로부터 C 말단으로, FVII의 중쇄, 제2 XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 또는 FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 및 제2 XTEN 폴리펩타이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 XTEN 서열은 약 20개 초과, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1200개, 1400개, 1600개, 1800개 또는 2000개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개의 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개의 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개의 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개의 잔기, 60개 초과 내지 약 1000개의 잔기, 70개 초과 내지 약 900개의 잔기, 80개 초과 내지 약 800개의 잔기, 90개 초과 내지 약 700개의 잔기, 100개 초과 내지 약 600개의 잔기, 110개 초과 내지 약 500개의 잔기, 또는 120개 초과 내지 약 400개의 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 XTEN 서열은 9개 내지 14개의 아미노산 잔기의 하나 이상의 서열 모티프 또는 서열 모티프와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 모티프는 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 내지 6개 유형의 아미노산을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. US 2010-0239554 A1을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, XTEN은, 서열의 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 또는 약 100%가 패밀리 서열을 발생시키는 표 1로부터 선택된 단일 모티프 패밀리로부터 선택된 비중첩 서열의 다중 단위로 이루어진, 비중첩 서열 모티프를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "패밀리"는 XTEN이 오직 표 1로부터의 단일 모티프 카테고리로부터 선택된 모티프; 즉 AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, 또는 BD XTEN을 가진다는 것 및 패밀리 모티프로부터가 아닌 XTEN 내의 임의의 다른 아미노산이 필요한 특성을 성취하도록, 예컨대 코딩 뉴클레오타이드에 의한 제한 부위의 편입, 개열 서열의 편입을 허용하도록, 또는 FVII에 대한 더 우수한 연결을 성취하도록 선택된다는 것을 의미한다. XTEN 패밀리의 몇몇 실시형태에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리, 또는 AE 모티프 패밀리, 또는 AF 모티프 패밀리, 또는 AG 모티프 패밀리, 또는 AM 모티프 패밀리, 또는 AQ 모티프 패밀리, 또는 BC 패밀리, 또는 BD 패밀리의 비중첩 서열 모티프의 다중 단위를 포함하고, 생성된 XTEN은 상기 기재된 상동성의 범위를 나타낸다. 다른 실시형태에서, XTEN은 표 1의 2개 이상의 모티프 패밀리로부터 모티프 서열의 다중 단위를 포함한다. 이 서열은 순 전하, 친수화도, 2차 구조의 결여, 또는 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여된 반복성의 결여(하기 더 자세히 기재됨)와 같은 특성을 포함하는 원하는 물리/화학 특징을 성취하도록 선택될 수 있다. 이 문단에서 상기 기재된 실시형태에서, XTEN으로 편입된 모티프는 약 36개 내지 약 3000개의 아미노산 잔기의 XTEN을 성취하기 위해 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 선택되고 조립될 수 있다. FVII에 연결된 XTEN의 추가의 비제한적인 예는 미국 특허 공보 제2012/0263701호(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
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XTEN은 다양한 길이를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, XTEN 폴리펩타이드(들)의 길이는 융합 단백질에서 성취하고자 하는 특성 또는 기능에 기초하여 선택된다. 의도하는 특성 또는 기능에 따라, XTEN은 캐리어로서 작용할 수 있는 짧은 또는 중간 길이의 서열 또는 더 긴 서열일 수 있다. 소정의 실시형태에서, XTEN은 약 6개 내지 약 99개의 아미노산 잔기의 짧은 분절, 약 100개 내지 약 399개의 아미노산 잔기의 중간 길이 및 약 400 내지 약 1000 및 약 3000개 이하의 아미노산 잔기의 더 긴 길이를 포함한다. 따라서, FVII(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄) 또는 표적화 모이어티에 연결된 XTEN은 약 6개, 약 12개, 약 36개, 약 40개, 약 42개, 약 72개, 약 96개, 약 144개, 약 288개, 약 400개, 약 500개, 약 576개, 약 600개, 약 700개, 약 800개, 약 864개, 약 900개, 약 1000개, 약 1500개, 약 2000개, 약 2500개, 또는 약 3000개 이하의 길이의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, XTEN 서열은 약 6개 내지 약 50개, 약 50개 내지 약 100개, 약 100개 내지 150개, 약 150개 내지 250개, 약 250개 내지 400개, 약 400개 내지 약 500개, 약 500개 내지 약 900개, 약 900개 내지 1500개, 약 1500개 내지 2000개, 또는 약 2000개 내지 약 3000개의 길이의 아미노산 잔기이다. FVII(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄) 또는 표적화 모이어티(Tm)에 연결될 수 있는 XTEN 폴리펩타이드의 정확한 길이는 FVII의 활성에 부정적으로 영향을 미치는 일 없이 변할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 XTEN 중 하나 이상은 약 42개의 아미노산, 약 72개의 아미노산, 약 108개의 아미노산, 약 144개의 아미노산, 약 180개의 아미노산, 약 216개의 아미노산, 약 252개의 아미노산, 약 288개의 아미노산, 약 324개의 아미노산, 약 360개의 아미노산, 약 396개의 아미노산, 약 432개의 아미노산, 약 468개의 아미노산, 약 504개의 아미노산, 약 540개의 아미노산, 약 576개의 아미노산, 약 612개의 아미노산, 약 624개의 아미노산, 약 648개의 아미노산, 약 684개의 아미노산, 약 720개의 아미노산, 약 756개의 아미노산, 약 792개의 아미노산, 약 828개의 아미노산, 약 836개의 아미노산, 약 864개의 아미노산, 약 875개의 아미노산, 약 912개의 아미노산, 약 923개의 아미노산, 약 948개의 아미노산, 약 1044개의 아미노산, 약 1140개의 아미노산, 약 1236개의 아미노산, 약 1318개의 아미노산, 약 1332개의 아미노산, 약 1428개의 아미노산, 약 1524개의 아미노산, 약 1620개의 아미노산, 약 1716개의 아미노산, 약 1812개의 아미노산, 약 1908개의 아미노산, 또는 약 2004개의 길이의 아미노산을 갖고, XTEN 패밀리 서열; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, BD, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 사용된 XTEN 폴리펩타이드는 AE42, AG42, AE42_2, AE42_3, AE48, AM48, AE72, AE72_2, AE72_3, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AE144_2, AE144_3, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE295, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AE872, AE884, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, AG2004 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. US 2010-0239554 A1을 참조한다.
일 실시형태에서, XTEN 서열은 AE42, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 또 다른 실시형태에서, XTEN 서열은 AE42, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, XTEN 서열은 AE288이다. 본 발명의 소정의 XTEN 서열에 대한 아미노산 서열은 표 2에 기재되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
XTEN이 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택된 4개, 5개 또는 6개 유형의 아미노산으로 이루어진 이의 아미노산의 100% 미만, 또는 표 1로부터의 서열 모티프 또는 표 2의 XTEN 서열로 이루어진 서열의 100% 미만을 갖는 몇몇 실시형태에서, XTEN의 다른 아미노산 잔기는 임의의 다른 14개의 중성 L-아미노산으로부터 선택되지만, 친수성 아미노산으로부터 우선적으로 선택되어서, XTEN 서열은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99%의 친수성 아미노산을 함유한다. 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P) 이외의 개별적인 아미노산 또는 아미노산의 짧은 서열은 필요한 특성을 성취하기 위해, 예컨대 코딩 뉴클레오타이드에 의한 제한 부위의 편입을 허용하기 위해, 또는 페이로드 성분에 대한 연결, 또는 개열 서열의 편입을 수월하게 하도록 XTEN으로 편입될 수 있다. 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)이 아닌 XTEN 아미노산은 XTEN 서열에 걸쳐 배치되거나, 서열 모티프 내에 또는 사이에 위치하거나, 또는 예컨대 N 또는 C 말단에서 또는 그 근처에서 XTEN 서열의 하나 이상의 짧은 스트레치에 집중된다. 소수성 아미노산이 폴리펩타이드에 구조를 부여하므로, 본 발명은 접합 작제물에서 사용되는 XTEN 내의 소수성 아미노산의 함량이 통상적으로 5% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만의 소수성 아미노산 함량일 것이라는 것을 제공한다. XTEN의 작제에서 덜 선호되는 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 류신, 아이소류신, 발린 및 메티오닌을 포함한다. 추가로, 하기 아미노산을 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만으로 함유하거나 전혀 함유하지 않도록 XTEN 서열을 설계할 수 있다: 메티오닌(산화를 피하기 위해), 아스파라긴 및 글루타민(탈아마이드화(desamidation)를 피하기 위해). 다른 실시형태에서, 접합 작제물에서 사용되는 XTEN 성분에서의 메티오닌 및 트립토판의 아미노산 함량은 통상적으로 5% 미만, 또는 2% 미만 및 가장 바람직하게는 1% 미만이다. 다른 실시형태에서, XTEN은 10% 미만의 양전하를 갖는 아미노산 잔기, 또는 약 7% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 2% 미만의 양전하를 갖는 아미노산 잔기를 갖는 서열을 가질 것이고, 메티오닌 및 트립토판 잔기의 합은 2% 미만일 것이고, 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 합은 전체 XTEN 서열의 5% 미만일 것이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 XTEN 폴리펩타이드는 본 발명의 키메라 분자의 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들어 약동학에 영향을 미친다. 본 발명에 사용된 XTEN 서열은 하기 유리한 특성: 형태학적 가요성, 수성 용해도 증가, 높은 정도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유동물 수용체에 대한 낮은 결합, 또는 유체역학(또는 스토크) 반경 증가 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 FVII 또는 표적화 모이어티(예를 들어, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자)에 연결된 XTEN 폴리펩타이드는 더 긴 최종 반감기 또는 곡선 하 면적(AUC)의 증가와 같이 약동학적 특성을 증가시켜서, 본 명세서에 기재된 키메라 분자는 야생형 응고 인자와 비교하여 증가한 기간 동안 생체내 머문다. 추가의 실시형태에서, 본 발명에 사용된 XTEN 폴리펩타이드는 더 긴 최종 반감기 또는 곡선 하 면적(AUC)의 증가와 같이 약동학적 특성을 증가시켜서, 응고 인자는 야생형 FVIIa와 비교하여 증가한 기간 동안 생체내 머문다.
XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 단백질의 물리적/화학적 특성을 결정하기 위해 다양한 방법 및 검정을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 분석용 원심분리, EPR, HPLC-이온 교환, HPLC 크기 배제, 역상 HPLC, 광 산란, 모세관 전기영동, 원편광 이색성, 시차 주사 열량법, 형광, HPLC-이온 교환, HPLC 크기 배제, IR, NMR, 라만 분광법, 굴절계법 및 UV/가시광선 분광법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가의 방법은 문헌[Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006)]에 개시되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 XTEN 폴리펩타이드의 추가의 예는 미국 특허 제7,855,279호 및 제7,846,445호, 미국 특허 공보 제2009/0092582호 A1, 제2010/0239554호 A1, 제2010/0323956호 A1, 제2011/0046060호 A1, 제2011/0046061호 A1, 제2011/0077199호 A1, 제2011/0172146호 A1, 제2013/0017997호 A1, 또는 제2012/0263701호 A1, 국제 특허 공보 WO 제2010091122호 A1, WO 제2010144502호 A2, WO 제2010144508호 A1, WO 제2011028228호 A1, WO 제2011028229호 A1, 또는 WO 제2011028344호 A2; 또는 국제 출원 제PCT/US2011/48517호(2011년 8월 19일 출원)에 개시되어 있다.
II.D. 이종성 모이어티를 추가로 포함하는 키메라 분자
본 개시내용은 또한 적어도 하나의 이종성 모이어티에 추가로 융합되고/되거나, 접합되고/되거나, 그렇지 않으면 회합된 "키메라 분자"를 제공한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 키메라 분자(예를 들어, FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.에 개시된 바와 같은 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 중 적어도 하나를 포함하는 키메라 분자, 또는 FVIIH, FVIIL, XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.B.에 개시된 바와 같은 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 분자)는 적어도 하나의 이종성 모이어티(예를 들어, 반감기 연장 모이어티)를 추가로 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 키메라 단백질, 즉 모든 성분(이종성 모이어티 및/또는 링커)이 폴리펩타이드인 키메라 분자이다. 다른 키메라 분자는 비폴리펩타이드 이종성 모이어티(예를 들어, PEG, 지질, 탄화수소, 핵산, 소분자 치료제, 방사성핵종, 형광성 프로브 등) 및/또는 비폴리펩타이드 링커를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "모이어티"는 본 발명의 키메라 분자의 성분 일부 또는 구성성분을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "이종성 모이어티"는 키메라 분자의 임의의 성분에 유전적으로 융합되고/되거나, 접합되고/되거나, 그렇지 않으면 회합된 모이어티를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 이종성 모이어티를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 키메라 분자의 이종성 모이어티 또는 모이어티들은 예방제 및/또는 치료제(예를 들어, 응고 인자), 약동학적(PK) 특성(예를 들어, 혈장 반감기 연장 모이어티)을 개선할 수 있는 분자, 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 형광성 분자 또는 방사성핵종) 등을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 이들로 실질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티는 이러한 이종성 모이어티가 결여된 키메라 분자의 물리화학적 특성을 변형시킬 수 있고, 예를 들어 키메라 분자의 유체역학 반경을 증가시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자로의 이종성 모이어티의 편입은 이의 생물학적 활성 또는 기능(예를 들어, FVII를 포함하는 키메라 분자에서의 응고촉진 활성)에 상당히 영향을 미치지 않으면서 하나 이상의 약동학적 특성을 개선할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티는 적어도 약 10개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2000개, 2500개, 3000개, 또는 4000개의 아미노산을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 이종성 모이어티는 약 100개 내지 약 200개의 아미노산, 약 200개 내지 약 300개의 아미노산, 약 300개 내지 약 400개의 아미노산, 약 400개 내지 약 500개의 아미노산, 약 500개 내지 약 600개의 아미노산, 약 600개 내지 약 700개의 아미노산, 약 700개 내지 약 800개의 아미노산, 약 800개 내지 약 900개의 아미노산, 또는 약 900개 내지 약 1000개의 아미노산을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 폴리펩타이드이다.
다른 실시형태에서, 이종성 모이어티는 본 발명의 키메라 분자 또는 이의 단편의 안정성을 증가시킨다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "안정성"은 환경 조건(예를 들어, 온도 증가 또는 감소)에 반응하여 키메라 분자의 하나 이상의 물리적 특성의 유지의 분야에서 인정된 측정을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 물리적 특성은 키메라 분자의 공유 구조의 유지(예를 들어, 단백 제거 개열, 원치않는 산화 또는 탈아마이드화의 부재)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 물리적 특성은 또한 적절히 폴딩된 상태의 키메라 분자의 존재(예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집물 또는 침전물의 부재)일 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 분자의 안정성은 키메라 분자 등의 생물물리 특성, 예를 들어 열 안정성, pH 비폴딩 프로필, 글라이코실화의 안정한 제거, 용해도, 생화학 기능(예를 들어, 단백질, 수용체 또는 리간드에 결합하는 능력), 및/또는 이들의 조합을 평가함으로써 측정된다. 또 다른 실시형태에서, 생화학 기능은 상호작용의 결합 친화도에 의해 입증된다. 일 실시형태에서, 단백질 안정성의 측정치는 열 안정성, 즉 열 공격에 대한 저항이다. 안정성은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), SEC(크기 배제 크로마토그래피), DLS(동적 광 산란) 등을 이용하여 측정될 수 있다. 열 안정성을 측정하는 방법은 시차 주사 열량법(differential scanning calorimetry: DSC), 시차 주사 형광측정법(differential scanning fluorimetry: DSF), 원편광 이색성(circular dichroism: CD) 및 열 공격 검정을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 "반감기 연장 모이어티"인 적어도 하나의 이종성 모이어티를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "반감기 연장 모이어티"는 단백질, 예를 들어 키메라 분자의 생체내 반감기를 증가시키는 이종성 모이어티를 의미한다. 용어 "반감기"는 생체내 특정한 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 개시된 응고 인자 또는 키메라 분자)의 생물학적 반감기를 의미한다. 반감기는 대상체에게 투여되는 분량의 절반이 동물에서의 순환 및/또는 다른 조직으로부터 청소되는 데 필요한 시간으로 표시될 수 있다. 소정의 폴리펩타이드 또는 본 발명의 키메라 분자의 청소 곡선이 시간의 함수로서 작도될 때, 곡선은 보통 신속한 α 단계 및 더 긴 β 단계를 갖는 이상이다. α 단계는 통상적으로 맥관내 공간과 맥관외 공간 사이에 투여된 Fc 폴리펩타이드의 평형을 나타내고, 폴리펩타이드의 크기에 의해 부분적으로 결정된다. β 단계는 통상적으로 맥관내 공간에서의 폴리펩타이드의 이화작용을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 응고촉진 화합물은 단상이고, 따라서 알파 단계를 갖지 않고, 오직 단일 베타 단계를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 사용되는 바대로 용어 반감기는 β 단계에서의 응고촉진 화합물의 반감기를 의미한다. 인간에서의 인간 항체의 통상적인 β 단계 반감기는 21일이다. 키메라 분자의 생체내 반감기는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 비폴리펩타이드 모이어티(예를 들어, PEG)를 위한 부착 부위를 포함할 수 있다.
반감기 연장 모이어티는, 하기 자세히 기재된 바대로, 예를 들어 (ⅰ) 추가의 XTEN 폴리펩타이드, (ⅱ) 알부민, (ⅲ) 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 지방산, (ⅳ) Fc, (ⅴ) 트랜스페린, (ⅵ) PAS, (ⅶ) 인간 융모성 고나트로핀의 β 아단위의 C 말단 펩타이드(CTP), (ⅷ) 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), (ⅸ) 하이드록시에틸 전분(HES), (x) 알부민 결합 소분자, (xⅰ) vWF, (xⅱ) 제거 수용체(clearance receptor) 또는 제거 수용체에 대한 키메라 분자의 결합을 차단하는 이의 단편, 또는 (xⅲ) 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 Fc 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 링커에 의해 융합된 2개의 Fc 구역을 포함한다. 예시적인 이종성 모이어티는 또한 예를 들어 FcRn 결합 모이어티(예를 들어, FcRn에 결합하는, 완전한 Fc 구역 또는 이의 부분), 단일 사슬 Fc 구역(예를 들어, 미국 공보 제2008-0260738호 및 국제 공보 WO 제2008-012543호 및 WO 제2008-1439545호에 기재된 바와 같은 scFc 구역), 또는 프로세싱 가능한 scFc 구역을 포함하다. 몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티는 비폴리펩타이드 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 임의의 유도체, 변이체, 또는 이들 모이어티의 조합에 대한 부착 부위를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 분자는 이러한 이종성 모이어티가 결여된 상응하는 키메라 분자의 순환 반감기와 관련하여 키메라 분자의 순환 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 키메라 분자의 순환 반감기는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 활성 검정(발색 검정 또는 1단계 응고 aPTT 검정), ELISA 등에 의해 결정될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 반감기 연장 모이어티의 존재는 이러한 하나 이상의 반감기 연장 모이어티가 결여된 상응하는 키메라 분자의 반감기와 비교하여 키메라 분자의 반감기를 증가시킨다. 반감기 연장 모이어티를 포함하는 키메라 분자의 반감기는 이러한 반감기 연장 모이어티가 결여된 상응하는 키메라 분자의 순환 반감기보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 또는 적어도 약 12배 더 길다.
일 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티를 포함하는 키메라 분자의 반감기는 이러한 반감기 연장 모이어티가 결여된 상응하는 키메라 분자의 생체내 반감기보다 약 1.5배 내지 약 20배, 약 1.5배 내지 약 15배, 또는 약 1.5배 내지 약 10배 더 길다. 또 다른 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티를 포함하는 키메라 분자의 반감기는 이러한 반감기 연장 모이어티가 결여된 상응하는 키메라 분자의 생체내 반감기와 비교하여 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 9배, 약 2배 내지 약 8배, 약 2배 내지 약 7배, 약 2배 내지 약 6배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 4배, 약 2배 내지 약 3배, 약 2.5배 내지 약 10배, 약 2.5배 내지 약 9배, 약 2.5배 내지 약 8배, 약 2.5배 내지 약 7배, 약 2.5배 내지 약 6배, 약 2.5배 내지 약 5배, 약 2.5배 내지 약 4배, 약 2.5배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 10배, 약 3배 내지 약 9배, 약 3배 내지 약 8배, 약 3배 내지 약 7배, 약 3배 내지 약 6배, 약 3배 내지 약 5배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 6배, 약 5배 내지 약 7배, 또는 약 6배 내지 약 8배 연장된다.
II.D.1. Fc 구역
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 Fc 구역을 포함하는 적어도 이종성 모이어티를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바대로 "Fc" 또는 "Fc 구역"은, 달리 기재되지 않은 한, Fc 도메인, 이의 변이체, 또는 단편을 포함하는 기능적 신생 Fc 수용체(FcRn) 결합 파트너를 의미한다. FcRn 결합 파트너는 FcRn 수용체가 특이적으로 결합할 수 있는(결과적으로 FcRn 결합 파트너가 FcRn 수용체에 의해 능동 전달됨) 임의의 분자이다. 따라서, 용어 Fc는 기능적인 IgG Fc의 임의의 변이체를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 구역은 X선 결정학(Burmeister et al., Nature 372:379 (1994)(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨))에 기초하여 기재되어 있다. Fc와 FcRn의 주요 접촉 면적은 CH2 및 CH3 도메인의 연접부의 근처이다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편 및 FcRn의 완전한 결합 구역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. Fc는 면역글로불린의 힌지 구역과 함께 또는 이것 없이 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 분자에서의 Fc 구역의 바람직한 특성, 예를 들어 반감기, 예를 들어 생체내 반감기의 증가를 유지시키는 Fc 단편, 변이체, 또는 유도체가 또한 포함된다. 미리어드(Myriad) 돌연변이체, 단편, 변이체 및 유도체가 예를 들어 PCT 공보 WO2011/069164, WO2012/006623, WO2012/006635, 또는 WO 2012/006633(이들 모두 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 Fc 구역을 포함한다.
II.D.2. scFc(단일 사슬 Fc) 구역
일 실시형태에서, 키메라 분자는 단일 폴리펩타이드 사슬(즉, 단일 사슬 Fc(scFc) 구역) 내에 하나의 유전적으로 융합된 Fc 구역 또는 이의 일부를 포함하는 이종성 모이어티를 포함한다. 프로세싱되지 않은 폴리펩타이드는 Fc 펩타이드 링커에 의해 연결된 하나의 기능적 scFc 구역을 형성하기 위해 폴딩(예를 들어, 분자내 또는 분자간 폴딩)할 수 있는 동일한 선형 폴리펩타이드 사슬 내에 적어도 2개의 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 모이어티 또는 도메인(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 Fc 모이어티 또는 도메인))을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 반감기를 개선하거나 면역 이팩터 기능, 예를 들어 항체 의존적 세포독성(antibody-dependent cytotoxicity: ADCC), 식세포작용, 또는 보체 의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDCC)을 촉발하기 위해 및/또는 제조능력을 개선하기 위해 이의 scFc 구역을 통해 적어도 하나의 Fc 수용체(예를 들어, FcRn, FcγR 수용체(예를 들어, FcγRIII), 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q))에 결합할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 응고 인자(예를 들어, FVII), 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 scFc 구역을 포함한다.
II.D.3. 알부민
소정의 실시형태에서, 키메라 분자는 알부민을 포함하는 이종성 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 전장 형태의 609개의 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 혈청의 삼투압의 상당 부분을 책임지고, 또한 내인성 및 외인성 리간드의 캐리어로서 작용한다. 본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "알부민"은 전장 알부민 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체, 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체의 예는 미국 공보 US2008/0194481, US2008/0004206, US2008/0161243, US2008/0261877, 또는 US2008/0153751 또는 PCT 출원 공보 WO2008/033413, WO2009/058322, 또는 WO2007/021494(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 알부민을 포함한다.
II.D.4. 알부민 결합 폴리펩타이드 및 지질
소정의 실시형태에서, 이종성 모이어티는 알부민 결합 펩타이드, 박테리아 알부민 결합 도메인, 알부민 결합 항체 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 알부민 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 알부민 결합 단백질은 도메인 항체를 포함하는 박테리아 알부민 결합 단백질, 항체 또는 항체 단편일 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,696,245호 참조). 알부민 결합 단백질은 예를 들어 박테리아 알부민 결합 도메인, 예컨대 스트렙토코커스 단백질 G의 도메인일 수 있다(Konig and Skerra (1998)　J. Immunol . Methods　218, 73-83). 접합 파트너로서 사용될 수 있는 알부민 결합 펩타이드의 다른 예는 예를 들어 미국 공보 US2003/0069395 또는 문헌[Dennis et al. (2002)　J. Biol . Chem.　277, 35035-35043]에 기재된 바와 같은 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 공통 서열(여기서, Xaa1은 Asp, Asn, Ser, Thr 또는 Trp이고; Xaa2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu 또는 Lys이며; Xaa3은 Ala, Asp, Phe, Trp 또는 Tyr이고; Xaa4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser 또는 Thr임)을 갖는 것이다.
문헌[Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) 및 Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 바와 같은 스트렙토코커스 단백질 G의 도메인 3은 일련의 박테리아 알부민 결합 도메인이다. 알부민 결합 펩타이드의 예는 코어 서열 DICLPRWGCLW(서열 번호 __)를 갖는 일련의 펩타이드를 포함한다. 문헌[Dennis et al., J. Biol . Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)]을 참조한다. 알부민 결합 항체 단편의 예는 문헌[Muller and Kontermann, Curr . Opin . Mol . Ther. 9:319-326 (2007); Rooverset al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), 및 Holt et al., Prot . Eng . Design Sci., 21:283-288 (2008)(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다. 이러한 알부민 결합 모이어티의 예는 문헌[Trusselet al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)]에 개시된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-요오도페닐)뷰탄아미도) 헥사노에이트("Albu" 태그)이다. 지방산, 특히 장쇄 지방산(LCFA) 및 장쇄 지방산 유사 알부민 결합 화합물은 본 발명의 키메라 분자의 생체내 반감기를 연장하도록 사용될 수 있다. LCFA 유사 알부민 결합 화합물의 예는 16-(l-(3-(9-(((2,5-다이옥소피롤리딘-1-일옥시)카보닐옥시)-메틸)-7-설포-9H-플루오렌-2-일아미노)-3-옥소프로필)-2,5-다이옥소피롤리딘-3-일티오) 헥사데칸산(예를 들어, WO 2010/140148 참조)이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 지질을 포함한다.
II.D.5. CTP
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 분자는 인간 융모성 고나트로핀 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 C 말단 펩타이드(CTP)의 하나의 β 아단위를 포함하는 적어도 하나의 이종성 모이어티를 포함한다. 재조합 단백질로의 하나 이상의 CTP 펩타이드의 삽입은 그 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,712,122호(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다.
예시적인 CTP 펩타이드는 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(서열 번호 _) 또는 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(서열 번호 _)를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 US 제2009/0087411호(참조문헌으로 포함됨)를 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 CTP 서열인 2개의 이종성 모이어티를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티 중 3개는 CTP 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티 중 4개는 CTP 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티 중 5개는 CTP 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 이종성 모이어티 중 6개 이상은 CTP 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 CTP를 포함한다.
II.D.6. PAS
다른 실시형태에서, 적어도 하나의 이종성 모이어티는 PAS 서열이다. PAS 서열은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하거나 주로 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열은 생리학적 조건 하에 랜덤 코일 입체구성을 형성한다. 따라서, PAS 서열은 키메라 분자에서 이종성 모이어티의 일부로서 사용될 수 있는 알라닌, 세린 및 프롤린을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 빌딩 블록, 아미노산 중합체, 또는 서열 카세트이다. 그런데, 당업자는 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에서 소량 성분으로서 첨가될 때 아미노산 중합체가 또한 랜덤 코일 입체구성을 형성할 수 있다는 것을 알고 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "소량 성분"은 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 아미노산이 소정의 정도로, 예를 들어 약 12% 이하, 즉 PAS 서열의 100개 중 약 12개의 아미노산, 약 10% 이하, 즉 PAS 서열의 100개 중 약 10개의 아미노산, 약 9% 이하, 즉 100개 중 약 9개의 아미노산, 약 8% 이하, 즉 100개 중 약 8개의 아미노산, 약 6%, 즉 100개 중 약 6개의 아미노산, 약 5%, 즉 100개 중 약 5개의 아미노산, 약 4%, 즉 100개 중 약 4개의 아미노산, 약 3%, 즉 100개 중 약 3개의 아미노산, 약 2%, 즉 100개 중 약 2개의 아미노산, 약 1%, 즉 100개 중 약 1개의 아미노산으로 PAS 서열에 첨가될 수 있다는 것을 의미한다.
알라닌, 세린 및 프롤린과 다른 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생리학적 조건 하에, PAS 서열 스트레치는 랜덤 코일 입체구성을 형성하고, 이로써 키메라 분자에 대해 증가한 생체내 및/또는 실험실내 안정성을 매개할 수 있다. 랜덤 코일 도메인이 그 자체가 안정한 구조 또는 기능을 채택하지 않으므로, 키메라 분자에서의 활성화된 응고 인자에 의해 매개된 생물학적 활성은 본질적으로 보전된다. 다른 실시형태에서, 랜덤 코일 도메인을 형성하는 PAS 서열은 특히 혈액 혈장에서의 단백 분해, 면역원성, 등전점/정전 거동, 세포 표면 수용체에 대한 결합 또는 내재화와 관련하여 생물학적으로 불활성이지만, 여전히 생분해성이고, 이는 합성 중합체, 예컨대 PEG에 비해 명확한 이점을 제공한다.
랜덤 코일 입체구성을 형성하는 PAS 서열의 비제한적인 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(서열 번호 155), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(서열 번호 156), APSSPSPSAPSSPSPASPSS(서열 번호 157), APSSPSPSAPSSPSPASPS(서열 번호 158), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(서열 번호 159), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(서열 번호 160) 및 ASAAAPAAASAAASAPSAAA(서열 번호 161) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. PAS 서열의 추가의 예는 예를 들어 미국 특허 공보 제2010/0292130호 및 PCT 출원 공보 WO 제2008/155134호 A1로부터 공지되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 PAS를 포함한다.
II.D.7. HAP
소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 이종성 모이어티는 글라이신 농후 호모-아미노산 중합체(homo-amino-acid polymer: HAP)이다. HAP 서열은 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 120개의 아미노산, 140개의 아미노산, 160개의 아미노산, 180개의 아미노산, 200개의 아미노산, 250개의 아미노산, 300개의 아미노산, 350개의 아미노산, 400개의 아미노산, 450개의 아미노산, 또는 500개의 아미노산 길이를 갖는 글라이신의 반복 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장할 수 있다. HAP 서열의 비제한적인 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20임)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 또 다른 실시형태에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다. 예를 들어, 문헌[Schlapschy M et al ., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)]을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 HAP를 포함한다.
II.D.8. 트랜스페린
소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 이종성 모이어티는 트랜스페린 또는 펩타이드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체이다. 임의의 트랜스페린은 본 발명의 키메라 분자를 만들도록 사용될 수 있다. 예로서, 야생형 인간 TF(TF)는, 유전자 중복으로부터 생기는 것으로 보이는, N(약 330개의 아미노산) 및 C(약 340개의 아미노산)인, 2개의 주요 도메인을 갖는, 대략 75KDa(글라이코실화를 고려하지 않음)의 679개의 아미노산 단백질이다. N 도메인은 N1 도메인 및 N2 도메인인 2개의 하위도메인을 포함하고, C 도메인은 C1 도메인 및 C2 도메인인 2개의 하위도메인을 포함한다. 진뱅크 수탁 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)(이들 모두 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)을 참조한다. 일 실시형태에서, 트랜스페린 이종성 모이어티는 트랜스페린 스플라이스 변이체를 포함한다. 일 예에서, 트랜스페린 스플라이스 변이체는 인간 트랜스페린의 스플라이스 변이체, 예를 들어 진뱅크 수탁 번호 AAA61140일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자의 트랜스페린 부분은 트랜스페린 서열의 하나 이상의 도메인, 예를 들어 N 도메인, C 도메인, N1 도메인, N2 도메인, C1 도메인, C2 도메인 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
트랜스페린은 트랜스페린 수용체(TfR) 매개 내포작용을 통해 철을 수송한다. 철이 엔도솜 구획으로 방출되고 Tf-TfR 복합체가 세포 표면으로 재순환된 후, Tf는 철 수송의 다음 사이클 동안 세포외 공간 뒤로 방출된다. Tf는 14일 내지 17일 초과의 긴 반감기를 보유한다(Li et al ., Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002)). 트랜스페린 융합 단백질은 반감기 연장, 암 치료제의 표적화된 전달, 경구 전달 및 프로인슐린의 활성화 지속에 대해 연구된다(Brandsma et al ., Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011); Bai et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005); Kim et al ., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010); Wang et al ., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)).
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 트랜스페린을 포함한다.
II.D.9. PEG
몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 이종성 모이어티는 폴리에틸렌 글라이콜, 에틸렌 글라이콜/프로필렌 글라이콜 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 또는 폴리비닐 알코올(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 당해 분야에 공지된 가용성 중합체이다. 몇몇 실시형태에서, PEG 이종성 모이어티를 포함하는 키메라 분자는 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 구역), PAS 서열, HES 및 알부민, 이의 단편, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 모이어티를 추가로 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 활성화된 응고 인자 또는 이의 단편 및 PEG 이종성 모이어티를 포함하고, 키메라 분자는 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 모이어티), PAS 서열, HES 및 알부민, 이의 단편, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 모이어티를 추가로 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 응고 인자 또는 이의 단편, 제2 응고 인자 또는 이의 단편, 및 PEG 이종성 모이어티를 포함하고, 키메라 분자는 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 모이어티), PAS 서열, HES 및 알부민, 이의 단편, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 모이어티를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 키메라 분자는 응고 인자 또는 이의 단편, 합성 응고촉진(procoagulant) 폴리펩타이드 및 PEG 이종성 모이어티를 포함하고, 키메라 분자는 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 구역), PAS 서열, HES 및 알부민, 이의 단편, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 2개의 합성 응고촉진 펩타이드 및 PEG 이종성 모이어티를 포함하고, 키메라 분자는 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 구역), PAS 서열, HES 및 알부민, 이의 단편, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 모이어티를 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 키메라 분자는 응고 인자 또는 이의 단편, 응고 인자 보조인자(예를 들어, 응고 인자가 VII 인자인 경우 조직 인자) 및 PEG 이종성 모이어티를 포함하고, 키메라 분자는 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 구역), PAS 서열, HES 및 알부민, 이의 단편, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종성 모이어티를 추가로 포함한다.
중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지 또는 비분지일 수 있다. 폴리에틸렌 글라이콜의 경우, 일 실시형태에서, 분자량은 취급 및 제조 용이성을 위해 약 1kDa 내지 약 100kDa이다. 원하는 프로필(예를 들어, 원하는 방출 지속의 기간, 있다면 생물학적 활성에 대한 효과, 취급 용이성, 항원성의 정도 또는 결여, 및 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글라이콜의 다른 공지된 효과)에 따라 다른 크기를 이용할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜은 평균 분자량이 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 또는 100,000kDa일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 폴리에틸렌 글라이콜은 분지 구조를 가질 수 있다. 분지된 폴리에틸렌 글라이콜은 예를 들어 미국 특허 제5,643,575호; 문헌[Morpurgo et al., Appl . Biochem . Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al ., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); 및 Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999)](각각 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
본 발명의 각각의 키메라 분자에 부착된 폴리에틸렌 글라이콜 모이어티의 수(즉, 치환도)는 또한 변할 수 있다. 예를 들어, 페길화 키메라 분자는 평균 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 분자에 연결될 수 있다. 유사하게, 평균 치환도는 예컨대 단백질 분자당 1개 내지 3개, 2개 내지 4개, 3개 내지 5개, 4개 내지 6개, 5개 내지 7개, 6개 내지 8개, 7개 내지 9개, 8개 내지 10개, 9개 내지 11개, 10개 내지 12개, 11개 내지 13개, 12개 내지 14개, 13개 내지 15개, 14개 내지 16개, 15개 내지 17개, 16개 내지 18개, 17개 내지 19개 또는 18개 내지 20개의 폴리에틸렌 글라이콜 모이어티 범위이다. 치환도를 결정하는 방법은 예를 들어 문헌[Delgado et al ., Crit . Rev . Thera . Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)]에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 페길화될 수 있다. 페길화 키메라 분자는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 분자를 포함한다. 다른 실시형태에서, 중합체는 수용성일 수 있다. 중합체의 비제한적인 예는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 또는 폴리(아크릴로일모폴린)일 수 있다. 응고 인자에 대한 중합체 접합의 추가의 유형은 미국 특허 제7,199,223호에 개시되어 있다. 또한, 문헌[Singh et al. Curr. Med. Chem. 15:1802-1826 (2008)]을 참조한다.
문헌[Malik F et al., Exp . Hematol. 20:1028-35 (1992); Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992)]; 유럽 특허 공보 EP0401384, EP0154316 및 EP0401384; 및 국제 특허 출원 공보 WO92/16221 및 WO95/34326과 같은 당해 분야의 당업자에게 이용 가능한 다수의 PEG 부착 방법이 존재한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 PEG를 포함한다.
II.D.10 HES
소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 이종성 모이어티는 중합체, 예를 들어 하이드록시에틸 전분(HES) 또는 이의 유도체이다. 하이드록시에틸 전분(HES)은 천연 발생 아밀로펙틴의 유도체이고, 신체에서 알파-아밀라제에 의해 분해된다. HES는 95중량% 이하의 농도로 옥수수 전분에 존재하는 탄화수소 중합체 아밀로펙틴의 치환된 유도체이다. HES는 유리한 생물학적 특성을 나타내고, 혈액 용적 대체 물질로서 및 클리닉에서 혈액희석 치료에서 사용된다(Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); 및 Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)).
아밀로펙틴은 주쇄에서 알파-1,4-글라이코사이드 결합이 존재하고 분지 부위에서 알파-1,6-글라이코사이드 결합이 발견되는 글루코스 모이어티를 포함한다. 이 분자의 물리화학적 특성은 주로 글라이코사이드 결합의 유형에 의해 결정된다. 닉킹된 알파-1,4-글라이코사이드 결합으로 인해, 회전당 약 6개의 글루코스 단량체를 갖는 나선 구조가 생성된다. 중합체의 물리화학적 및 생화학적 특성은 치환을 통해 변형될 수 있다. 하이드록시에틸기의 도입은 알칼리 하이드록시에틸화를 통해 성취될 수 있다. 반응 조건을 채택함으로써, 하이드록시에틸화와 관련하여 비치환 글루코스 단량체에서의 각각의 하이드록시기의 상이한 반응성을 조사할 수 있다. 이러한 사실로 인해, 당업자는 제한된 정도로 치환 패턴에 영향을 미칠 수 있다.
HES는 주로 분자량 분포 및 치환도를 특징으로 한다. 몰 치환을 의미하는 DS로 표시된 치환도는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 인용된 문헌[Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987)], 특히 273페이지를 참조한다.
일 실시형태에서, 하이드록시에틸 전분은 평균 분자량(중량 평균)은 1 내지 300kD, 2 내지 200kD, 3 내지 100kD, 또는 4 내지 70kD이다. 하이드록시에틸 전분은 0.1 내지 3, 바람직하게는 0.1 내지 2, 더 바람직하게는 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.1 내지 0.8의 몰 치환도 및 하이드록시에틸기에 대한 2 내지 20의 범위의 C2:C6 치환 사이의 비율을 추가로 나타낼 수 있다. 평균 분자량이 약 130kD인 HES의 비제한적인 예는 치환도가 0.2 내지 0.8, 예컨대 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8, 바람직하게는 0.4 내지 0.7, 예컨대 0.4, 0.5, 0.6, 또는 0.7인 HES이다. 구체적인 실시형태에서, 평균 분자량이 약 130kD인 HES는 프레세니우스(Fresenius)사제의 볼루벤(Voluven)(등록상표)이다. 볼루벤(등록상표)은 예를 들어 저혈량증의 치료 및 예방을 위한 치료학적 적응증에서 사용되는 용적 대체에 이용되는 인공 콜로이드이다. 볼루벤(등록상표)의 특징은 130,000+/-20,000D의 평균 분자량, 0.4의 몰 치환 및 약 9:1의 C2:C6 비율이다. 다른 실시형태에서, 하이드록시에틸 전분의 평균 분자량의 범위는 예를 들어 4 내지 70kD, 또는 10 내지 70kD, 또는 12 내지 70kD, 또는 18 내지 70kD, 또는 50 내지 70kD, 또는 4 내지 50kD, 또는 10 내지 50kD, 또는 12 내지 50kD, 또는 18 내지 50kD, 또는 4 내지 18kD, 또는 10 내지 18kD, 또는 12 내지 18kD, 또는 4 내지 12kD, 또는 10 내지 12kD, 또는 4 내지 10kD이다. 여전히 다른 실시형태에서, 사용되는 하이드록시에틸 전분의 평균 분자량은 4kD 초과 및 70kD 미만의 범위, 예컨대 약 10kD, 또는 9 내지 10kD, 또는 10 내지 11kD, 또는 9 내지 11kD, 또는 약 12kD의 범위, 또는 11 내지 12kD, 또는 12 내지 13kD, 또는 1l 내지 13kD, 또는 약 18 kD의 범위, 또는 17 내지 18kD, 또는 18 내지 19kD, 또는 17 내지 19kD, 또는 약 30kD의 범위, 또는 29 내지 30kD, 또는 30 내지 31kD, 또는 약 50kD의 범위, 또는 49 내지 50kD 또는 50 내지 51kD 또는 49 내지 51kD의 범위이다.
소정의 실시형태에서, 이종성 모이어티는 상이한 평균 분자량 및/또는 상이한 치환도 및/또는 상이한 C2:C6 치환의 비율을 갖는 하이드록시에틸 전분의 혼합물일 수 있다. 따라서, 상이한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비율, 또는 상이한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 동일하거나 거의 동일한 C2:C6 치환의 비율, 또는 상이한 평균 분자량 및 동일하거나 거의 동일한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비율, 또는 동일하거나 거의 동일한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비율, 또는 상이한 평균 분자량 및 동일하거나 거의 동일한 치환도 및 동일하거나 거의 동일한 C2:C6 치환의 비율, 또는 동일하거나 거의 동일한 평균 분자량 및 상이한 치환도 및 동일하거나 거의 동일한 C2:C6 치환의 비율, 또는 동일하거나 거의 동일한 평균 분자량 및 동일하거나 거의 동일한 치환도 및 상이한 C2:C6 치환의 비율, 또는 거의 동일한 평균 분자량 및 거의 동일한 치환도 및 거의 동일한 C2:C6 치환의 비율을 갖는 하이드록시에틸 전분의 혼합물을 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 HES를 포함한다.
II.D.11 PSA
소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 이종성 모이어티는 중합체, 예를 들어 폴리시알산(polysialic acid: PSA) 또는 이의 유도체이다. 폴리시알산(PSA)은 문헌[Roth　J.,　et al. (1993) in　Polysialic Acid : From Microbes to Man, eds　Roth　J.,　Rutishauser　U.,　Troy　F. A.　(Birkhauser Verlag,　Basel, Switzerland), pp　335-348]에서 포유동물에서 소정의 세포에서 소정의 박테리아 균주에서 생성된 시알산의 천연 발생 비분지 중합체이다. 이들은 제한된 산 가수분해에 의해 또는 뉴라미니다제에 의한 분해에 의해, 또는 중합체의 천연 박테리아 유래 형태의 분별화에 의해 다양한 n=약 80의 중합도 또는 n=2로 감소한 더 많은 시알산 잔기로 생성될 수 있다. 상이한 폴리시알산의 조성은 또한 단독중합체 형태, 즉 뉴런 세포 부착 분자(N-CAM)의 배아 형태에서 또한 발견되는 그룹 B 메닝고코커스(meningococci) 및 이. 콜라이 균주 K1의 캡슐형 폴리사카라이드를 포함하는 알파-2,8-연결 폴리시알산이 존재하도록 변한다. 헤테로중합체는 또한 기존의, 예컨대 N. 메닌기티디스(meningitidis)의 그룹 C 폴리사카라이드 및 이. 콜라이 균주 K92의 교대 알파-2,8 알파-2,9 폴리시알산을 형성한다. 시알산은 또한 N. 메닌기티디스의 그룹 W135 또는 그룹 Y와 같은 시알산 이외의 단량체와의 교대 공중합체에서 발견될 수 있다. 폴리시알산은 병원성 박테리아에 의한 면역 및 보체 시스템의 회피 및 태아 발생 동안 미성숙 뉴런의 신경교 유착성의 조절을 포함하는 중요한 생물학적 기능을 갖지만(여기서, 중합체는 유착 방지 기능을 가짐)(Cho and Troy, P.N.A.S ., USA, 91 (1994) 11427-11431), 포유동물에서 폴리시알산에 대한 공지된 수용체가 존재하지 않는다. 이. 콜라이 균주 K1의 알파-2,8-연결 폴리시알산은 또한 '콜로민산'으로 공지되어 있고, 본 발명을 예시하도록 (다양한 길이로) 사용된다. 폴리시알산을 폴리펩타이드에 부착하거나 접합하는 다양한 방법이 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,846,951호; WO-A-0187922 및 US 2007/0191597 A1(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 참조).
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 PSA를 포함한다.
II.D.12 제거 수용체
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 분자의 생체내 반감기는 연장될 수 있고, 키메라 분자는 제거 수용체, 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 적어도 하나의 이종성 분자를 포함한다. 키메라 분자가 X 인자를 포함하는 구체적인 실시형태에서, 제거 수용체의 가용성, 예컨대 저밀도 리포단백질 관련 단백질 수용체 LRP1, 또는 이의 단편이 제거 수용체에 대한 X 인자의 결합을 차단하여 이의 생체내 반감기를 연장할 수 있다.
LRP1은 FVIII 또는 X와 같은 다양한 단백질의 수용체 매개 청소율에 연루된 600kDa의 통합 막 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Narita et al., Blood 91:555-560 (1998); Lenting et al., Haemophilia 16:6-16 (2010)]을 참조한다. 다른 적합한 제거 수용체는 예를 들어 LDLR(저밀도 리포단백질 수용체), VLDLR(초저밀도 리포단백질 수용체) 및 메갈린(LRP-2), 또는 이의 단편이다. 예를 들어, 문헌[Bovenschen et al., Blood 106:906-912 (2005); Bovenschen, Blood 116:5439-5440 (2010); Martinelli et al., Blood 116:5688-5697 (2010)]을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 FVII, 표적화 모이어티(예를 들어, GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), XTEN 폴리펩타이드 및 제거 수용체, 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다.
II.E. VII 인자
키메라 분자는 VII 인자의 성숙 형태 또는 이의 변이체인 FVII를 포함한다. VII 인자(FVII, F7; 또한 7 인자, 응고 VII 인자, 혈청 VII 인자, 혈청 프로트롬빈 전환 촉진제, SPCA, 프로컨버틴(proconvertin) 및 엡타코그(eptacog) 알파라 칭함)는 응고 캐스케이드의 일부인 세린 프로테아제이다. FVII는 Gla 도메인, 2개의 EGF 도메인(EGF-1 및 EGF-2) 및 세린 프로테아제 도메인(또는 펩티다제 S1 도메인)(예를 들어, 키모트립신 등을 갖는 세린 프로테아제의 펩티다제 S1 패밀리의 모든 구성원 중에서 매우 보전됨)을 포함한다. FVII는 단일 사슬 지모겐, 활성화된 지모겐 유사 2개 사슬 폴리펩타이드(예를 들어, 활성화 가능한 FVII) 및 완전 활성화 2개 사슬 형태로서 존재한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "지모겐 유사" 단백질 또는 폴리펩타이드는 단백 분해 개열에 의해 활성화되지만, 예를 들어 낮은 활성 또는 불활성, 또는 단백질의 지모겐 형태의 입체구성을 닮은 입체구성과 같은 지모겐과 연관된 특성을 여전히 나타내는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 이것이 조직 인자에 결합하지 않을 때, FVII의 2개 사슬 활성화 형태는 지모겐 유사 단백질이고; 이것은 비개열된 FVII 지모겐과 유사한 입체구성을 보유하고, 따라서 매우 낮은 활성을 나타낸다. 조직 인자에 대한 결합 시, FVII의 2개 사슬 활성화 형태는 형태학적 변화를 겪고, 응고 인자로서 이의 완전 활성을 획득한다.
예시적인 FVII 변이체는 특이적 활성이 증가한 것, 예를 들어 효소 활성(Kcat 또는 Km)을 증가시킴으로써 FVII의 활성을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 이러한 변이체는 당해 분야에 기재되어 있고, 예를 들어 문헌[Persson et al., Proc . Natl . Acad Sci . USA 98:13583 (2001); Petrovan and Ruf, J. Biol. Chem . 276:6616 (2001); Persson et al., J. Biol . Chem . 276:29195 (2001); Soejima et al., J. Biol . Chem. 276:17229 (2001); Soejima et al., J. Biol . Chem . 247:49027 (2002)]에 기재된 바와 같은 분자의 돌연변이체 형태를 포함한다.
일 실시형태에서, FVII의 변이체 형태는 돌연변이, 예를 들어 V158D-E296V-M298Q를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FVII의 변이체 형태는 트립신의 170 루프로부터의 아미노산 EASYPGK(서열 번호 _)을 갖는 FVII 성숙 서열로부터의 608번 내지 619번 아미노산(LQQSRKVGDSPN, 170 루프에 상응)의 대체를 포함한다. FVII의 높은 특이적 활성 변이체는 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Simioni et al. (N.E . Journal of Medicine 361:1671, 2009)]은 R338L 돌연변이를 기술한다. 장(Chang) 등(J. Biol . Chem . 273:12089, 1988) 및 피에리(Pierri) 등(Human Gene Therapy 20:479, 2009)은 R338A 돌연변이를 기술한다. 다른 돌연변이가 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Zogg and Brandstetter, Structure 17:1669 (2009); Sichler et al., J. Biol . Chem . 278:4121 (2003); 및 Sturzebecher et al., FEBS Lett . 412:295 (1997)]에 기재된 것을 포함한다. 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
지모겐 유사 형태로부터의 형태학적 변화 시 발생하는 완전 활성화는 이의 보조인자, 즉 조직 인자에 대한 결합 시 발생한다. 또한, 조직 인자의 부재 하에 입체구성 변화를 발생시키는 돌연변이가 도입될 수 있다. 그러므로, FVIIa에 대한 언급은, 지모겐 유사 형태 및 완전 활성화 2개 사슬 형태의, 이의 2개 사슬 형태 둘 다를 포함한다.
일 실시형태에서, FVII의 중쇄는 서열 번호 178과 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄를 포함하는 FVII는 FVII 응고 활성을 가진다. 또 다른 실시형태에서, FVII의 경쇄는 서열 번호 179와 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄를 포함하는 FVII는 FVII 응고 활성을 가진다.
II.F. 링커
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "링커" 또는 "링커 모이어티"(본 명세서에 개시된 화학식에서 L, L1, 또는 L2로 표시됨)는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열), 또는 비펩타이드 링커(이의 주요 기능은 폴리펩타이드 사슬의 선형 아미노산 서열에서의 2개의 도메인, 예를 들어 본 발명의 키메라 분자에서 2개의 이종성 모이어티를 연결하는 것임)를 의미한다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 링커는 2개의 이종성 모이어티 사이, 이종성 모이어티와 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자) 사이, FVII(중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나)와 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자) 사이, 또는 FVII(중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나)와 이종성 모이어티 사이에 배치된다.
다중 링커가 본 발명의 키메라 분자에 존재할 때, 각각의 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 일반적으로, 링커는 키메라 분자에 가요성을 제공한다. 링커는 통상적으로 개열되지 않지만; 소정의 실시형태에서, 이러한 개열은 바람직할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 프로테아제 개열 가능한 부위를 포함할 수 있고, 이 부위는 링커의 서열 내에 위치할 수 있고, 링커의 서열의 어느 한 말단에서 링커를 플랭킹할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 하나 이상의 링커를 포함하고, 하나 이상의 링커는 펩타이드 링커를 포함한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 비펩타이드 링커를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개 또는 적어도 1,000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개 또는 2000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
펩타이드 링커는 1개 내지 5개의 아미노산, 1개 내지 10개의 아미노산, 1개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 100개의 아미노산, 100개 내지 200개의 아미노산, 200개 내지 300개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 400개 내지 500개의 아미노산, 500개 내지 600개의 아미노산, 600개 내지 700개의 아미노산, 700개 내지 800개의 아미노산, 800개 내지 900개의 아미노산, 900개 내지 1000개, 1000개 내지 1100개, 1100개 내지 1200개, 1200개 내지 1300개, 1300개 내지 1400개, 1400개 내지 1500개, 1500개 내지 1600개, 1600개 내지 1700개, 1700개 내지 1800개, 1800개 내지 1900개, 또는 1900개 내지 2000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
펩타이드 링커의 예는 예를 들어 화학식 [(Gly)x-Sery]z(여기서, x는 1 내지 4이고, y는 0 또는 1이며, z는 1 내지 50임)에 따른 펩타이드 링커와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 펩타이드 링커는 서열 Gn(여기서, n은 1 내지 100의 정수일 수 있음)을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 특정한 실시형태에서, 펩타이드 링커의 서열은 GGGG이다. 펩타이드 링커는 서열 (GA)n을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 서열 (GGS)n을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 펩타이드 링커는 서열 (GGGS)n(서열 번호 240)을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 펩타이드 링커는 서열 (GGS)n(GGGGS)n(서열 번호 241)을 포함한다. 이러한 경우에, n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 다른 경우에, n은 1 내지 20, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수일 수 있다. 링커의 예는 GGG, SGGSGGS(서열 번호 242), GGSGGSGGSGGSGGG(서열 번호 243), GGSGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 244), GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열 번호 245) 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 246)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 실시형태에서, 링커는 폴리-G 서열 (GGGG)n(여기서, n은 1 내지 100의 정수일 수 있음)(서열 번호 247)이다.
예시적인 Gly/Ser 펩타이드 링커는 아미노산 서열 (Gly4Ser)n(서열 번호 248)(여기서, n은 1 이상, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 46, 50, 55, 60, 70, 80, 90 또는 100의 정수임)을 포함한다. 일 실시형태에서, n=1이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)(서열 번호 249)이다. 일 실시형태에서, n=2이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)2(서열 번호 250)이다. 또 다른 실시형태에서, n=3이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)3(서열 번호 251)이다. 또 다른 실시형태에서, n=4이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)4(서열 번호 252)이다. 또 다른 실시형태에서, n=5이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)5(서열 번호 253)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=6이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)6(서열 번호 254)이다. 또 다른 실시형태에서, n=7이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)7(서열 번호 255)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=8이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)8(서열 번호 256)이다. 또 다른 실시형태에서, n=9이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)9(서열 번호 257)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=10이고, 즉 링커는 (Gly4Ser)10(서열 번호 258)이다.
또 다른 예시적인 Gly/Ser 펩타이드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n(서열 번호 248)(여기서, n은 1 이상, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 46, 50, 55, 60, 70, 80, 90 또는 100의 정수임)을 포함한다. 일 실시형태에서, n=1이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)(서열 번호 259)이다. 일 실시형태에서, n=2이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)2(서열 번호 260)이다. 또 다른 실시형태에서, n=3이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)3(서열 번호 261)이다. 또 다른 실시형태에서, n=4이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)4(서열 번호 262)이다. 또 다른 실시형태에서, n=5이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)5(서열 번호 263)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=6이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)6(서열 번호 264)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=7이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)7(서열 번호 265)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=8이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)8(서열 번호 266)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=9이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)9(서열 번호 267)이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, n=10이고, 즉 링커는 Ser(Gly4Ser)10(서열 번호 268)이다.
소정의 실시형태에서, 상기 Gly/Ser 펩타이드 링커는 펩타이드 링커의 2개의 다른 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 펩타이드 링커 서열) 사이에 삽입될 수 있다. 다른 실시형태에서, Gly/Ser 펩타이드 링커는 펩타이드 링커의 또 다른 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 펩타이드 링커 서열)의 말단 중 하나 또는 둘 다에서 부착된다. 여전히 다른 실시형태에서, 2개 이상의 Gly/Ser 링커는 펩타이드 링커에서 시리즈로 편입된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 상부 힌지 구역의 적어도 일부(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래), 중간 힌지 구역의 적어도 일부(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래) 및 일련의 Gly/Ser 아미노산 잔기(예를 들어, Gly/Ser 링커, 예컨대 (Gly4Ser)n)를 포함한다.
펩타이드 링커는 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 폴리펩타이드 서열로 도입될 수 있다. DNA 서열 분석에 의해 변형이 확인될 수 있다. 생성된 폴리펩타이드의 안정한 생성을 위해 숙주 세포를 형질전환하기 위해 플라스미드 DNA를 사용할 수 있다.
II. G. 프로테아제 개열 부위
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 키메라 분자의 임의의 2개의 성분, 예를 들어 FVII의 경쇄 및 FVII의 중쇄를 연결하는 프로테아제 개열 부위를 포함한다. 프로테아제 개열 부위는 효과적인 개열 및 활성화를 위한 세포내 프로세싱 부위일 수 있다. 예를 들어, 키메라 분자는 FVII의 경쇄, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드, 또는 FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 프로테아제 개열 부위 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 프로테아제 개열 부위는 숙주 세포에서 세포내 프로세싱 효소에 의해 또는 응고의 부위에서 프로테아제에 의해 개열될 수 있다.
세포내 프로세싱 효소의 예는 퓨린, 효모 Kex2, PCSK1(또한 PC1/Pc3으로 공지됨), PCSK2(또한 PC2로 공지됨), PCSK3(또한 퓨린 또는 PACE로 공지됨), PCSK4(또한 PC4로 공지됨), PCSK5(또한 PC5 또는 PC6으로 공지됨), PCSK6(또한 PACE4로 공지됨), 또는 PCSK7(또한 PC7/LPC, PC8, 또는 SPC7로 공지됨)을 포함한다. 다른 프로세싱 부위는 당해 분야에 공지되어 있다. 하나 초과의 프로세싱 또는 개열 부위를 포함하는 작제물에서, 이러한 부위가 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 예를 들어 FVII의 경쇄 지모겐 및 FVII의 중쇄 지모겐을 연결하는 프로테아제 개열 부위를 포함할 수 있다. FVII의 경쇄 지모겐 및 FVII의 중쇄 지모겐을 연결하는 프로테아제 개열 부위는 당해 분야에 공지된 임의의 프로테아제 개열 부위로부터 선택될 수 있다.
III. 제조 방법
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 분자를 코딩하는 핵산 분자 또는 일련의 핵산 분자, 또는 이의 보체를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 세포내 프로세싱 부위, FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자)를 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 FVII의 경쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자), 세포내 프로세싱 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 코딩한다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 FVII의 경쇄, 세포내 프로세싱 부위, FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자)를 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 FVII의 경쇄, 세포내 프로세싱 부위, FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자) 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 코딩한다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 FVII의 경쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자)를 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열인, 일련의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 FVII의 경쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열인, 일련의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 FVII의 경쇄를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자)를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열인, 일련의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 FVII의 경쇄를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티(예를 들어, 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자) 및 XTEN 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열인, 일련의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 189, 서열 번호 190, 서열 번호 191, 또는 서열 번호 192의 뉴클레오타이드 산 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
이러한 핵산 분자 또는 일련의 핵산 분자 또는 이의 보체를 포함하는 벡터 또는 일련의 벡터, 및 이 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 키메라 분자를 제조하는 방법을 제공하고, 이러한 방법은 본 명세서에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 키메라 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 분자는 제2 공급원으로부터 유래한 제2 아미노산 서열에 공유 또는 비공유 결합된, 제1 공급원으로부터 유래한 제1 아미노산 서열을 포함하고, 제1 공급원 및 제2 공급원은 동일하지 않다. 동일하지 않은 제1 공급원 및 제2 공급원은 2개의 상이한 생물학적 집합체, 또는 동일한 생물학적 집합체로부터의 2개의 상이한 단백질, 또는 생물학적 집합체 및 비생물학적 집합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자는 예를 들어 적어도 2개의 상이한 생물학적 공급원으로부터 유래한 단백질을 포함할 수 있다. 생물학적 공급원은 임의의 비합성으로 생성된 핵산 또는 아미노산 서열(예를 들어, 게놈 또는 cDNA 서열, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 천연 비리온, 또는 상기 중 임의의 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같은, 돌연변이체 또는 유사체)을 포함할 수 있다. 합성 공급원은 생물학적 시스템(예를 들어, 아미노산 서열의 고상 합성)에 의해서가 아니라 화학적으로 생성된 단백질 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 키메라 분자는 적어도 2개의 상이한 합성 공급원으로부터 유래한 단백질, 또는 적어도 하나의 생물학적 공급원 및 적어도 하나의 합성 공급원으로부터 유래한 단백질을 또한 포함할 수 있다. 키메라 분자는 임의의 공급원으로부터 유래한, 핵산에 공유 또는 비공유 연결된, 제1 공급원으로부터 유래한 제1 아미노산 서열, 또는 임의의 공급원으로부터 유래한 작은 유기 또는 무기 분자를 또한 포함할 수 있다. 키메라 분자는 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이 또는 제1 아미노산 서열과 핵산 사이, 또는 제1 아미노산 서열과 작은 유기 또는 무기 분자 사이의 링커 분자를 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 키메라 분자를 재조합으로 생성하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 코드의 축퇴성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 것으로 이해될 것이다. 원하는 폴리뉴클레오타이드는 이전에 제조된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 돌연변이유발에 의해 또는 신생 고상 DNA 합성에 의해 생성될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 매개 돌연변이유발은 아미노산 치환을 코딩하는 코돈을 (예를 들어, 키메라 분자로) 도입하기 위해 치환, 인프레임 삽입 또는 변경(예를 들어, 변경된 코돈)을 제조하는 일 방법이다. 예를 들어, 출발 폴리펩타이드 DNA는 단일 가닥 DNA 주형으로 원하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화함으로써 변경된다. 하이브리드화 후, 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 편입시키는 주형의 전체 제2 상보성 가닥을 합성하기 위해 DNA 중합효소를 사용한다. 일 실시형태에서, 예를 들어 프라이머 기반 PCR 돌연변이유발을 유전자 조작하는 것은 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위해, 본 명세서에 정의된 바와 같은, 변경을 편입시키기에 충분하다.
재조합 생성을 위해, 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 발현 비히클, 즉 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에는, 복제 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유하는 벡터로 삽입된다.
본 명세서에 개시된 임의의 키메라 분자를 코딩하는 핵산은 적절한 리딩 프레임에서의 벡터로 삽입된다. 이후, 발현 벡터는 폴리펩타이드를 발현하는 적합한 표적 세포로 형질감염된다. 당해 분야에 공지된 형질감염 기법은 인산칼슘 침전(Wigler et al. 1978, Cell 14:725) 및 전기천공(Neumann et al. 1982, EMBO J. 1:841)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다양한 숙주 발현 벡터 시스템은 진핵생물 세포에서 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 분자를 발현하도록 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포(예를 들어, 293 세포, PerC6, CHO, BHK, Cos, HeLa 세포)를 포함하는 동물 세포이다. 폴리펩타이드가 진핵생물 세포에서 발현될 때, 본 명세서에 개시된 임의의 키메라 분자를 코딩하는 DNA는 폴리펩타이드가 분비되게 하는 신호 서열을 또한 코딩할 수 있다. 당해 분야의 당업자는, 폴리펩타이드가 번역되지만, 신호 서열은 세포에 의해 개열되어 성숙 키메라 분자를 형성한다는 것을 이해할 것이다. 천연 FVII 신호 서열, 천연 FIX 신호 서열, 천연 FX 신호 서열, 천연 GPIIb 신호 서열, 천연 GPIIIa 신호 서열 및 마우스 IgK 경쇄 신호 서열과 같은 다양한 신호 서열이 당해 분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 신호 서열이 포함되지 않는 경우, 본 명세서에 개시된 키메라 분자는 세포를 용해시킴으로써 회수될 수 있다.
본 명세서에 개시된 키메라 분자는 형질전환 동물, 예컨대 설치류, 염소, 양, 돼지 또는 소에서 합성될 수 있다. 용어 "형질전환 동물"은 게놈으로 외래 유전자를 편입시킨 비인간 동물을 의미한다. 이 유전자가 생식선 조직에 존재하므로, 이것은 부모로부터 자손으로 전달된다. 외인성 유전자는 단세포 배아로 도입된다(Brinster et al. 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:4438). 면역글로불린 분자를 생성하는 형질전환을 포함하는, 형질전환 동물을 생성하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다(Wagner et al. 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:6376; McKnight et al. 1983, Cell 34:335; Brinster et al. 1983, Nature 306:332; Ritchie et al. 1984, Nature 312:517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59:831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59:107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10: 267).
발현 벡터는 재조합으로 생성된 폴리펩타이드의 용이한 정제 또는 동정을 허용하는 태그를 코딩할 수 있다. 예는 벡터 pUR278(Ruther et al. 1983, EMBO J. 2:1791)(여기서, 하이브리드 폴리펩타이드가 생성되도록 본 명세서에 개시된 키메라 분자 코딩 서열이 lac z 코딩 구역과 인프레임으로 벡터에 결찰될 수 있고; pGEX 벡터는 글루타티온 S-전환효소(GST) 태그를 갖는 단백질을 발현하도록 사용될 수 있음)을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 이 단백질은 보통 가용성이고, 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착, 이어서 유리 글루타티온의 존재 하의 용리에 의해 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 벡터는 정제 후에 태그의 용이한 제거를 위한 개열 부위, 예를 들어 프리시젼 프로테아제(PreCission Protease)(파마시아(Pharmacia)(뉴저지주 피팩)를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 수많은 발현 벡터 시스템을 사용할 수 있다. 이 발현 벡터는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 또는 에피솜으로서 숙주 유기체에서 통상적으로 복제 가능하다. 발현 벡터는 프로모터(예를 들어, 천연 연관 또는 이종성 프로모터), 인핸서, 신호 서열, 스플라이스 신호, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵생물 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터에서 진핵생물 프로모터 시스템이다. 발현 벡터는 동물 바이러스, 예컨대 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 또는 SV40 바이러스로부터 유래한 DNA 요소를 또한 사용할 수 있다. 다른 것은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 다시스트론성 시스템(polycistronic system)의 사용을 포함한다.
흔히, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열에 의해 형질전환된 이 세포의 검출을 허용하는 선택 마커(예를 들어, 암피실린 내성, 하이그로마이신 내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성)를 함유한다(예를 들어, 이타쿠라(Itakura) 등의 미국 특허 제4,704,362호 참조). 염색체로 DNA를 통합시킨 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택이 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 원영양성, 살생제(예를 들어, 항생제) 내성 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현시키고자 하는 DNA 서열에 직접 연결되거나, 동시형질전환에 의해 동일한 세포로 도입될 수 있다.
예시적인 발현 벡터는 NEOSPLA(미국 특허 제6,159,730호)이다. 이 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디하이드로엽산 환원효소 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 이 벡터는 가변 및 불변 구역 유전자의 편입, 세포에서의 형질감염, 이어서 G418 함유 배지 중의 선택 및 메토트렉세이트 증폭 시 항체의 매우 높은 발현 수준을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 벡터 시스템은 미국 특허 제5,736,137호 및 제5,658,570호(이들 각각은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 또한 교시되어 있다. 이 시스템은 높은 발현 수준, 예를 들어 30pg/세포/일 초과를 제공한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은 예를 들어 미국 특허 제6,413,777호에 개시되어 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 폴리펩타이드는 다시스트론성 작제물을 사용하여 발현될 수 있다. 이 발현 시스템에서, 관심 있는 다중 유전자 생성물, 예컨대 다합체 결합 단백질의 다중 폴리펩타이드는 단일 다시스트론성 작제물로부터 생성될 수 있다. 이 시스템은 유리하게는 진핵생물 숙주 세포에서 비교적 높은 수준의 본 발명의 폴리펩타이드를 제공하도록 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site: IRES)를 이용한다. 상용성 IRES 서열은 미국 특허 제6,193,980호(또한 본 명세서에 포함됨)에 개시되어 있다. 당해 분야의 당업자는 본원에 개시된 폴리펩타이드의 완전 범위를 효과적으로 생성하기 위해 이러한 발현 시스템을 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
더 일반적으로, 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 즉, 숙주 세포는 형질전환될 수 있다. 숙주 세포로의 플라스미드의 도입은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 성취될 수 있다. 이것은 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 프로토플라스트 융합, 인산칼슘 침전, 봉입된 DNA와의 세포 융합, 미량주사 및 온전한 바이러스에 의한 감염을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 문헌[Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)]을 참조한다. 가장 바람직하게는, 숙주로의 플라스미드 도입은 전기천공을 통해 한다. 형질전환된 세포를 경쇄 및 중쇄의 생성에 적절한 조건 하에 성장시키고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 평가한다. 예시적인 검정 기법은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 유세포 분석법, 면역조직화학 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "형질전환"은 광의로 유전자형을 변경시키고 결과적으로 수혜자 세포를 변경시키는 수혜자 숙주 세포로의 DNA의 도입을 의미한다.
이 동일한 라인과 함께, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용하여 작제되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 코딩하는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 의미한다. 재조합 숙주로부터의 폴리펩타이드의 단리를 위한 과정의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물은", 이것이 명확히 달리 기재하지 않는 한, 폴리펩타이드의 공급원을 의미하도록 상호 교환되어 사용된다. 즉, "세포"로부터의 폴리펩타이드의 회수는 스핀 다운된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 성숙 폴리펩타이드를 형성하기 위해 프로세싱 동안 scFc 링커(예를 들어, 이러한 링커가 존재하고, 세포내 프로세싱 부위(들)를 함유하는 경우)를 개열하기 위해 필요한 효소(또는 효소들)를 내인성으로 발현한다. 이 프로세싱 동안, scFc 링커는 관련 없는 아미노산의 존재를 감소시키기 위해 실질적으로 제거될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 scFc 링커의 프로세싱이 발생하거나 개선되도록 세포에 외인성인 하나 이상의 효소를 발현하도록 형질전환된다.
일 실시형태에서, 세포에 의해 내인성으로 또는 외인성으로 발현될 수 있는 효소는 효소의 퓨린 패밀리의 구성원이다. 인간 퓨린(즉, PACE)의 완전한 cDNA 및 아미노산 서열은 1990년에 공개되었다. Van den Ouweland A M et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:664; Erratum in: Nucleic Acids Res. 18:1332 (1990). 미국 특허 제5,460,950호(Barr 등에 허여)는 재조합 PACE, 및 활성 성숙 이종성 단백질의 발현을 개선하기 위한 이종성 단백질의 기질 전구체 폴리펩타이드와의 PACE의 동시발현을 기술한다. 미국 특허 제5,935,815호는 마찬가지로 재조합 인간 퓨린(즉, PACE) 및 활성 성숙 이종성 단백질의 발현을 개선하기 위한 이종성 단백질의 기질 전구체 폴리펩타이드와의 퓨린의 동시발현을 기술한다. 이 특허에 개시된 가능한 기질 전구체는 IX 인자의 전구체를 포함한다. 포유동물 퓨린에서의 다른 패밀리/서브틸리신/PACE 이외의 Kex2p 유사 프로단백질 전환효소(PC) 패밀리는 PCSK1(또한 PC1/Pc3으로 공지됨), PCSK2(또한 PC2로 공지됨), PCSK3(또한 퓨린 또는 PACE로 공지됨), PCSK4(또한 PC4로 공지됨), PCSK5(또한 PC5 또는 PC6으로 공지됨), PCSK6(또한 PACE4로 공지됨), 또는 PCSK7(또한 PC7/LPC, PC8 또는 SPC7로 공지됨)을 포함하는 것으로 보고되었다. 이 다양한 구성원이 소정의 보전된 전체 구조 특징을 공유하지만, 이것은 이의 조직 분포, 세포이하 국재화, 개열 특이성 및 바람직한 기질이 다르다. 검토를 위해, 문헌[Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35]을 참조한다. PACE와 유사하게, 이 프로단백질 전환효소는 일반적으로, 아미노 말단으로부터 시작하여, 신호 펩타이드, 프로펩타이드(자체촉매적으로 개열될 수 있음), Asp, His, Ser 및 Asn/Asp 잔기를 특징으로 하는 서브틸리신 유사 촉매 도메인, 및 촉매 활성에 또한 필수적이고 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 특징으로 하는 호모 B 도메인을 포함한다. PACE, PACE4 및 PC5는 또한 기능이 공지되지 않은 Cys 농후 도메인을 포함한다. 또한, PC5는 막관통 도메인과 함께 및 이것 없이 아이소폼을 갖고; 이 상이한 아이소폼은 각각 PC5B 및 PC5A로 공지되어 있다. PACE의 촉매 도메인의 아미노산 서열과 프로단백질 전환효소의 이 패밀리의 다른 구성원의 촉매 도메인의 아미노산 서열 사이의 비교는 하기 정도의 동일성을 나타낸다: PC4에 대해 70%; PACE4 및 PC5에 대해 65%; PC1/PC3에 대해 61%; PC2에 대해 54%; 및 LPC/PC7/PC8/SPC7에 대해 51%. Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35.
PACE 및 PACE4는 부분적으로 중첩하지만 구별되는 기질을 갖는 것으로 보고되었다. 특히, PACE4는, PACE와 놀랍게도 반대로, FIX의 전구체 폴리펩타이드를 프로세싱할 수 없는 것으로 보고되었다(Wasley et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:8458-65; Rehemtulla et al. (1993) Biochemistry. 32:11586-90). 미국 특허 제5,840,529호는 인간 PC7에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열, 및 다른 PC 패밀리 구성원과 비교하여, HIV gp160을 gp120 및 gp41로 개열하는 PC7의 특별한 능력을 개시한다.
설치류 PC5의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 우선 문헌[Lusson et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6691-5]에 의해 PC5로서 및 문헌[Nakagawa et al. (1993) J Biochem (Tokyo) 113:132-5]에 의해 PC6으로서 기재되어 있다. 미국 특허 제6,380,171호는 막관통 도메인이 없는 아이소폼인, 인간 PC5A에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 개시한다. 이 효소의 서열 및 이의 클로닝 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자는 비포유동물 세포, 예컨대 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포에서 또한 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 단세포 비포유동물 미생물, 예컨대 박테리아가 또한 형질전환될 수 있다고(즉, 배양 또는 발효에서 성장할 수 있는 것) 이해될 것이다. 형질전환이 되기 쉬운 박테리아는 엔테로박테리아세아(enterobacteriacea), 예컨대 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella)의 균주; 바실라세아(Bacillacea), 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza)의 구성원을 포함한다. 박테리아에서 발현될 때, 폴리펩타이드가 통상적으로 봉입체의 일부가 되는 것으로 추가로 이해될 것이다. 폴리펩타이드를 단리하고, 정제하고, 이후 기능적 분자로 조립해야 한다.
원핵생물 이외에, 진핵생물 미생물을 또한 사용할 수 있다. 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 또는 보통의 베이커 효모가 진핵생물 미생물 중에서 가장 흔히 사용되지만, 다수의 다른 균주가 흔히 이용 가능하다.
사카로마이세스에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7이 흔히 사용된다(Stinchcomb et al ., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). 이 플라스미드는 이미 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 수탁 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유한다(Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 이후, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서의 trpl 병소의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
다른 효모 숙주, 예컨대 피치아(Pichia)를 또한 사용할 수 있다. 효모 발현 벡터는 원하는 바대로 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 복제 기원, 종결 서열 등을 가진다. 통상적인 프로모터는 3-포스포글라이세레이트 키나제 및 다른 해당 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 무엇보다도 알코올 탈수소효소, 아이소사이토크롬 C 및 메탄올, 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
대안적으로, 폴리펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열은 형질전환 동물의 게놈으로의 도입 및 형질전환 동물의 젖에서의 후속하는 발현을 위해 전이유전자에서 편입될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,741,957호; 제5,304,489호; 및 제5,849,992호 참조). 적합한 전이유전자는 카세인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동 가능한 연결에 있는 폴리펩타이드를 위한 코딩 서열을 포함한다.
실험실내 생성은 규모 확대를 허용하여 다량의 원하는 폴리펩타이드를 생성시킨다. 조직 배양 조건 하의 포유동물 세포 배양을 위한 기법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 에어리프트 반응기 내의 또는 연속 교반기 반응기, 또는 부동화된 또는 포획된 세포 배양물 내의, 예를 들어 중공 섬유, 마이크로캡슐 내의, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상의 동종 현탁액 배양을 포함한다. 필요한 경우 및/또는 원하는 경우, 예를 들어 합성 힌지 구역 폴리펩타이드의 우선적 생합성 후에 또는 본 명세서에 기재된 HIC 크로마토그래피 단계 전에 또는 이에 후속하여 관습적 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 위로의 크로마토그래피 또는 (면역-)친화도 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드의 용액을 정제할 수 있다. 친화도 태그 서열(예를 들어, His(6) 태그)은 하류 정제를 수월하게 하도록 폴리펩타이드 서열 내에 임의로 부착되거나 포함될 수 있다.
발현되면, 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등(일반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982))] 참조 그리고 구체적으로 본 실시예에 사용된 방법을 참조)을 포함하는 당해 분야의 표준 절차에 따라 키메라 분자를 정제할 수 있다. 약제학적 용도를 위해, 적어도 약 90% 내지 95%의 동질성의 실질적으로 순수한 단백질이 바람직하고, 98% 내지 99% 이상의 동질성이 가장 바람직하다.
IV. 사용 방법
본 개시내용은 또한
(ⅰ) 본 명세서에 개시된 키메라 분자;
(ⅱ) 본 명세서에 개시된 핵산 분자 또는 일련의 핵산 분자;
(ⅲ) 본 명세서에 개시된 벡터 또는 일련의 벡터; 또는
(ⅳ) 이들의 임의의 조합,
및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, (ⅰ) 본 명세서에 개시된 키메라 분자, (ⅱ) 본 명세서에 개시된 핵산 분자 또는 일련의 핵산 분자, (ⅲ) 본 명세서에 개시된 벡터 또는 일련의 벡터, 또는 (ⅲ) 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물의 투여는 예를 들어 이를 필요로 하는 대상체에서 출혈 삽화의 빈도 또는 정도를 감소시키기 위해, 및/또는 이를 필요로 하는 대상체에서 출혈 삽화의 발생을 감소시키거나 예방하기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 FVIII, FIX, 또는 둘 다에 의한 치료에 대해 저해제를 발생시키거나 이를 발생시킬 능력을 가진다. 몇몇 실시형태에서, FVIII 또는 FIX에 대한 저해제는 FVIII, FIX, 또는 둘 다에 대한 중화 항체이다.
몇몇 실시형태에서, 출혈 삽화는 혈액 응고 장애, 예를 들어 A형 혈우병 또는 B형 혈우병에 의해 발생할 수 있다. 다른 실시형태에서, 출혈 삽화는 관절혈종(hemarthrosis), 근육 출혈, 경구 출혈, 출혈증, 근육으로의 출혈증, 경구 출혈증, 외상, 외상 널판근(trauma capitis), 위장관 출혈, 두개 내 출혈증, 복부 내 출혈증, 흉내 출혈증, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두 뒤 공간에서의 출혈, 복막 뒤 공간에서의 출혈, 장요근 초(illiopsoas sheath)에서의 출혈, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 마우스 대상체이다.
본 개시내용은 또한
(a) 혈소판의 표면에 대해 FVII를 표적화하는 방법(여기서, 이 방법은 XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.1.에 개시된 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 중 하나 또는 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티에 대해 물질을 융합하는 단계를 포함함);
(b) FVII를 XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 또는 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티에 융합하는 단계를 포함하는 FVII의 활성을 증가시키는 방법; 또는
(c) FVII를 XTEN 폴리펩타이드 및 부문 II.A.1.에 개시된 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 또는 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티에 융합하는 단계를 포함하는 FVII의 약동학적 특성을 개선하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 발명의 키메라 분자를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에 대한 지혈 장애를 치료하거나, 경감시키거나, 예방하는 방법에 관한 것이다. 키메라 분자에 의한 치료, 경감 및 예방은 우회 치료일 수 있다. 우회 치료 중인 대상체는 응고 인자, 예를 들어 FVIII 또는 FIX에 대해 저해제를 이미 발생시켰거나, 대상체는 응고 인자 저해제를 발생시킬 수 있다. 대상체에 대한 투여를 위한 조성물은 본 발명의 키메라 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 분자 조성물을 지혈을 증대시키는 적어도 하나의 다른 물질과 조합하여 투여한다. 제한이 아닌, 예로서, 지혈제는 FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, 프로트롬빈, 또는 임의의 상기의 것의 피브리노겐 또는 활성화된 형태를 포함할 수 있다. 응고 인자 또는 지혈제는 항섬유소용해성 약물, 예를 들어 입실론-아미노-카프로산, 트라넥사민산을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 키메라 분자는 정맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어 경구로, 설하로, 협측으로, 설하로, 비강으로, 직장으로, 질내로 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 키메라 분자는 바이오중합체 고체 지지체 내에 이식되거나 이에 연결될 수 있고, 이는 원하는 부위로의 키메라 분자의 느린 방출을 허용한다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 종래의 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 액체, 예를 들어 시럽 또는 현탁액으로서 또한 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들어, 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방), 유화제(레시틴 또는 아카시아), 비수성 비히클(예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스터, 에틸 알코올, 또는 분별화 식물성 오일) 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 솔빈산)를 포함할 수 있다. 상기 제제는 항료, 착색제 및 감미료를 또한 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 물 또는 또 다른 적합한 비히클과의 구성을 위한 건조 생성물로서 제시될 수 있다. 협측 및 설하 투여를 위해, 상기 조성물은 종래의 프로토콜에 따른 정제, 로젠지제 또는 신속 용해 필름의 형태를 위할 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 키메라 분자는 적합한 추진체에 의한 가압 팩 또는 (예를 들어, PBS 중의) 분무기로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 편리하게 전달된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 투여 경로는 비경구이다. 본 명세서에 사용되는 바대로 용어 비경구는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내 형태가 바람직하다. 모든 이러한 투여 형태가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 명확히 고려되지만, 투여 형태는 주사, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적(drip)을 위한 용액일 것이다. 보통, 주사를 위해 적합한 약제학적 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리솔베이트), 임의로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서의 교시내용과 양립되는 다른 방법에서, 폴리펩타이드는 불리한 세포 집단의 부위에 직접적으로 전달되어 치료제에 대한 이환된 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 무균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 예컨대 식염수 및 완충 배지를 포함한다. 본 발명에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 0.01 내지 0.1M 및 바람직하게는 0.05M 포스페이트 완충제 또는 0.8% 식염수를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 흔한 비경구 비히클은 인산나트륨 용액, 덱스트로스 링거 수액, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 수액, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 덱스트로스 링거 수액에 기초한 것 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
더욱 특히, 주사용 용도에 적합한 약제학적 조성물은 무균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 상기 조성물은 무균이어야 하고, 용이한 주사 가능성(syringability)이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 이것은 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 바람직하게는 보존될 것이다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 성취될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에서 등장성 물질, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 주사용 조성물의 연장된 흡수가 발생할 수 있다.
임의의 경우에, 적절한 용매 중의 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, 폴리펩타이드 단독으로 또는 다른 활성제와 조합하여)을 필요한 바대로 본 명세서에 열거된 일 성분 또는 이의 조합과 혼입한 후, 무균 여과에 의해 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 기본적 분산액 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 무균 비히클로 혼입함으로써 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이고, 이것은 이의 이전에 무균 여과된 용액으로부터의 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성시킨다. 주사를 위한 제제를 가공하고, 용기, 예컨대 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이알로 충전하고, 당해 분야에 공지된 방법에 따라 무균성 조건 하에 밀봉한다. 추가, 제제를 패킹하고 키트 형태로 판매할 수 있다. 이러한 제조 물품은 바람직하게는, 관련 조성물이 응고 장애를 겪거나 이의 소인이 있는 대상체를 치료하는 데 유용하다는 것을 나타내는, 라벨 또는 패키지 삽입물을 가질 것이다.
약제학적 조성물은 예를 들어 종래의 좌제 기제, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글라이세라이드를 함유하는 좌제 또는 정체 관장으로서 직장 투여를 위해 또한 제제화될 수 있다.
병증의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제 및 치료가 예방학적 또는 치료학적인지의 여부를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 변한다. 보통, 환자는 인간이지만, 형질전환 포유동물을 포함하는 비인간 포유동물이 또한 치료될 수 있다. 안전성 및 효율을 최적화하기 위해 당해 분야의 당업자에게 공지된 일상적 방법을 이용하여 치료 투약량이 적정될 수 있다.
일 실시형태에서, (예를 들어, FVII를 포함하는) 생물학적 활성 모이어티의 용량은 약 90 내지 270㎍/㎏ 또는 0.090 내지 0.270㎎/㎏의 범위일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, (예를 들어, FX를 포함하는) 생물학적 활성 모이어티의 용량은 약 1㎍/㎏ 내지 400㎎/㎏의 범위일 수 있다.
투약량은 1000㎍/㎏ 내지 0.1 ng/㎏(체중)의 범위일 수 있다. 일 실시형태에서, 투약량 범위는 1㎍/㎏ 내지 100㎍/㎏이다. 단백질을 연속하여 또는 특정한 시간 간격으로 투여할 수 있다. 투여를 위한 최적 용량 범위 및/또는 스케줄을 결정하기 위해 실험실내 검정을 이용할 수 있다. 응고 인자 활성을 측정하는 실험실내 검정, 예를 들어 STA-CLOT Vlla-rTF 응고 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 추가로, 유효 용량은 동물 모델, 예를 들어 혈우병 개로부터 얻은 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다(Mount et al. 2002, Blood 99: 2670).
상기 범위의 중간인 용량은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 또한 의도된다. 대상체는 1일마다, 격일로, 1주마다 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케줄에 따라 이러한 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 예를 들어 적어도 6달의 연장 기간에 걸친 다중 투약량의 투여를 포함한다. 몇몇 방법에서, 2개 이상의 폴리펩타이드를 동시에 투여할 수 있고, 이런 경우 투여되는 각각의 폴리펩타이드의 투약량은 표시된 범위 내에 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 다수의 경우에 투여될 수 있다. 단일 투약량 사이의 간격은 1일, 1주, 1달 또는 1년일 수 있다. 환자에서의 변형된 폴리펩타이드 또는 항원의 혈액 수치를 측정함으로써 표시된 바대로 간격은 또한 불규칙일 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 지속 방출 제형으로 투여될 수 있고, 이런 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투약량 및 빈도는 환자에서의 폴리펩타이드의 반감기에 따라 변한다.
투여의 빈도 및 투약량은 치료가 예방학적 또는 치료학적인지에 따라 변할 수 있다. 예방학적 분야에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 환자의 내성을 증대시키거나 질환의 효과를 최소화하기 위해 질환 상태에 이미 있지 않은 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방학적 유효 용량"인 것으로 정의된다. 비교적 낮은 투약량을 긴 시간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여한다. 몇몇 환자는 이들의 삶의 나머지 동안 치료를 계속해서 받는다.
본 발명의 폴리펩타이드는 치료(예를 들어, 예방학적 또는 치료학적)를 필요로 하는 장애 또는 병증을 치료하는 데 효과적인 다른 물질과 조합되어 임의로 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 보조 치료와 함께 또는 이것과 조합된 본 발명의 폴리펩타이드의 투여는 치료제 및 개시된 폴리펩타이드의 순차, 동시, 동일 시간, 공존, 병존 또는 동시 발생 투여 또는 적용을 의미한다. 당해 분야의 당업자는 조합된 치료학적 섭생의 다양한 성분의 투여 또는 적용이 치료의 전체 유효성을 증대시키도록 시간이 맞춰질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자(예를 들어, 의사)는 선택된 보조 치료 및 본 명세서의 교시내용에 기초하여 부당한 실험 없이 효과적인 조합된 치료학적 섭생을 용이하게 알아차릴 수 있을 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드가 (예를 들어, 조합된 치료학적 섭생을 제공하기 위한) 물질 또는 물질들과 함께 또는 이것과 조합되어 사용될 수 있다는 것이 추가로 이해될 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드가 조합될 수 있는 예시적인 물질은 치료되는 특정한 장애에 대한 현재의 치료 표준을 나타내는 물질을 포함한다. 이러한 물질은 성질상 화학적 또는 생물학적일 수 있다. 용어 "생물학적" 또는 "생물학적 물질"은 살아 있는 유기체로부터 제조된 임의의 약제학적 활성제 및/또는 치료제로서의 사용에 대해 의도되는 이의 생성물을 의미한다.
본 발명의 폴리펩타이드와 조합되어 사용하고자 하는 물질의 양은 대상체에 따라 변할 수 있거나, 당해 분야에 공지된 것에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)]을 참조한다. 또 다른 실시형태에서, 치료 표준과 일치하는 이러한 물질의 양을 투여한다.
상기 기재된 바대로, 응고 장애의 생체내 치료를 위해 본 발명의 폴리펩타이드를 약제학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 투여를 수월하게 하고 활성제의 안정성을 증대시키기 위해 본 발명의 폴리펩타이드가 제제화될 수 있는 것을 이해될 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는, 비독성, 무균 담체, 예컨대 생리학적 식염수, 비독성 완충제, 보존제 등을 포함한다. 물론, 폴리펩타이드의 약제학적 유효량을 제공하기 위해 본 발명의 약제학적 조성물을 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 분자를 핵산 분자로서 투여한다. 벡터, 플라스미드, 리포솜, DNA 주사, 전기천공, 유전자 총, 정맥내 주사 또는 간동맥 점적주사를 통한 것과 같은 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 핵산 분자를 투여할 수 있다. 유전자 치료 실시형태에 사용하기 위한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다.
본 개시내용의 범위를 유념하면서, 치료학적 또는 예방학적 효과를 생성하기에 충분한 양으로 상술된 치료 방법에 따라 본 발명의 키메라 분자를 인간 또는 다른 동물에게 투여할 수 있다.
본 발명의 키메라 분자는, 당해 분야의 당업자가 인식하는 바와 같은, 질환 또는 병증을 갖는 대상체를 치료하는 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 많은 용도를 갖는다. 질환 또는 병증은 지혈 장애를 포함할 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 키메라 분자를 투여하는 단계를 포함하는 지혈 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 키메라 분자는 피브린 응고의 형성을 촉진함으로써 지혈 장애를 치료하거나 예방한다. 본 발명의 키메라 분자는 응고 캐스케이드의 임의의 구성원을 활성화할 수 있다. 응고 인자는 외인성 경로, 내인성 경로 또는 둘 다에서 참여자일 수 있다. 본 발명의 키메라 분자는 키메라 분자에 존재하는 특정한 응고 인자에 의해 치료될 수 있는 것으로 공지된 것과 같은 지혈 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라 분자의 투여에 의해 치료될 수 있는 지혈 장애는 A형 혈우병, B형 혈우병, 폰 빌레브란트 질환, XI 인자 결핍증(PTA 결핍증), XII 인자 결핍증, 및 피브리노겐, 프로트롬빈, V 인자, VII 인자, X 인자, 또는 XIII 인자의 결핍증 또는 구조 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 지혈 장애는 유전성 장애이다. 일 실시형태에서, 대상체는 A형 혈우병을 갖고, 키메라 분자는 XTEN 폴리펩타이드 및 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자에 연결되거나 회합된 활성화된 FVII를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 B형 혈우병을 갖고, 키메라 분자는 XTEN 폴리펩타이드 및 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자에 연결되거나 회합된 활성화된 FVII를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 FVIII 또는 FVIIIa에 대한 저해 항체를 갖고, 키메라 분자는 XTEN 폴리펩타이드 및 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자에 연결되거나 회합된 활성화된 FVII를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 대상체는 FIX 또는 FIXa에 대한 저해 항체를 갖고, 키메라 분자는 XTEN 폴리펩타이드 및 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자에 연결되거나 회합된 활성화된 FVII를 포함한다.
FVII를 포함하는 본 발명의 키메라 분자는 지혈 장애를 갖는 대상체를 예방학적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다. FVII를 포함하는 본 발명의 키메라 분자는 지혈 장애를 갖는 대상체에서 급성 출혈 삽화를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 지혈 장애는 응고 인자, 예를 들어 FVII, FIX, 또는 FVIII의 결핍증의 결과이다. 또 다른 실시형태에서, 지혈 장애는 결함적 응고 인자의 결과일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 지혈 장애는 후천성 장애일 수 있다. 후천성 장애는 기초하는 속발성 질환 또는 병증으로부터 생길 수 있다. 비관련 장애는, 제한이 아니라, 예로서, 암, 자가면역 질환, 또는 임신일 수 있다. 후천성 장애는 고령 또는 기초하는 속발성 장애를 치료하기 위한 약제(예를 들어, 암 화학치료)로부터 생길 수 있다.
본 발명은 또한 지혈 장애, 또는 지혈 장애의 획득을 발생시키는 속발성 질환 또는 병증을 갖지 않는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 키메라 분자를 투여하는 단계를 포함하는 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술 진행 중이거나, 이를 막 겪으려 한다. 본 발명의 키메라 분자를 예방제로서 수술 전에 또는 후에 투여할 수 있다. 본 발명의 키메라 분자를 급성 출혈 삽화를 조절하기 위해 수술 동안에 또는 후에 투여할 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제, 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 분자는 지혈 장애를 갖지 않는 급성 출혈 삽화를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 급성 출혈 삽화는 심각한 외상, 예를 들어 수술, 자동차 사고, 상처, 총기 열상, 또는 비조절 출혈을 발생시키는 임의의 다른 외상 사건으로부터 생길 수 있다.
본 발명이 지금 자세히 기재되어 있지만, 동일 사항이 하기 실시예를 참조하여 더 명확히 이해될 것이고, 이 실시예는 오직 예시의 목적을 위해 본 명세서에 포함되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 명확히 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
실시예
일반 재료 및 방법
일반적으로, 본 발명의 실행은, 달리 기재되지 않은 한, 화학, 생물물리, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학의 종래의 기법(특히, 예를 들어 항체 기술) 및 전기영동에서의 표준 기법을 이용한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)]을 참조한다.
실시예 1
혈소판 표적화된 항체의 확인 및 규명
당해 분야에 공지된 방법에 따라 GPIIb/IIIa를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 183 및 서열 번호 184)을 함유하는 플라스미드에 의해 면역화된 BALB/C 마우스로부터 하이브리도마를 생성하였다. 이후, 유세포 분석법을 이용하여 인간 및 사이노몰거스 원숭이 혈소판에 대한 결합 및 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 이용하여 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 하이브리도마를 스크리닝하였다. 인간 및 원숭이 혈소판에 대한 결합을 결정하기 위해, 타이로드(Tyrode) 완충제 중의 겔 정제된 인간 또는 원숭이(사이노몰거스) 혈소판을 하이브리도마 상청액과 항온처리하였다. 30분 항온처리 후, 세포를 1% 폼알데하이드 중에 고정하였다. 고정 후, 세포를 타이로드 완충제 중에 세척하고, (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) 염소 항-마우스 IgG-PE 접합된) 검출 항체를 첨가하였다. 유세포 분석법에 의해 항체 결합을 검출하였다.
인간 GPIIb/IIIa(αIIbβ)에 대한 하이브리도마로부터의 상청액의 결합을 하기한 바대로 ELISA를 이용하여 결정하였다. 코스타(Costar) 플레이트(카탈로그 3590호)를 측정 완충제(20mM 트리스, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM MgCl2 및 1mM MnCl2) 중의 5㎍/㎖의 인간 GPIIb/IIIa(칼바이오켐(Calbiochem) 카탈로그 528240호)의 100㎕/웰로 코팅하고, 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 웰을 플레이트 세척기를 사용하여 TBST에 의해 3회 세척하였다. 웰당 5% BSA(소 혈청 알부민, 잭슨 카탈로그 001 000 173호)를 함유하는 200㎕의 측정 완충제를 사용하여 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 항온처리함으로써 차단을 수행하였다. 100㎕의 하이브리도마 상청액을 검정 웰에 첨가하고, 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 TBST에 의해 3회 세척하였다. 측정 완충제 중의 염소 항-마우스 IgGHRP(써던 바이오테크(Southern Biotech)(카탈로그 1010 05호)의 1:10,000 희석물을 첨가하고, 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 TBST에 의해 3회 세척하였다. 모레큘러 디바이시스(Molecular Devices) 플레이트 판독기를 사용하여 450㎚에서의 O.D. 판독 및 TMB를 이용하여 HRP 존재를 발전시켰다.
ELISA 검정에서 양성 시험된 하이브리도마로부터의 상청액을 혈소판과 혼합하고, 하기한 바대로 유세포 분석법을 이용하여 혈소판 활성화에 대해 스크리닝하였다.
(a) 시약: 시트레이트화 인간 전혈; 세파로스(Sepharose) 2B 비드(지이 헬쓰케어(GE Healthcare)); 1㎎/㎖의 BSA(칼슘 무함유)를 갖는 타이로드 완충제; 5mM CaCl2 및 1㎎/㎖의 BSA를 갖는 타이로드 완충제; 32% 파라폼알데하이드(PFA)(이엠 사이언시스(EM Sciences)); PAC1 FITC 항체(BD 카탈로그 340507호); CD62 PE 항체(BD 카탈로그 555524호); ADP; SFFLRN 펩타이드(아나스펙(Anaspec), 카탈로그 24191호); IV.3 Fabb 항 CD32(스템셀(StemCell), 카탈로그 01470호).
(b) 혈소판 정제: 10㎖의 세파로스 2B 비드 칼럼을 충전하고, 1㎎/㎖의 BSA를 함유하는 30㎖의 타이로드 완충제와 평형화시켰다. 1 내지 1.5㎖의 용적의 혈소판 농후 혈장(PRP)을 평형화된 세파로스 칼럼에 로딩하고, 충전된 비드, 이어서 대략 5㎖의 타이로드 완충제가 중력에 의해 진입하게 하였다. 혈소판을 함유하는 혼탁한 분액(drop)을 수집하였다.
(c) 검정: 처음에, 하이브리도마 상청액의 50㎕의 분취량을 96웰 둥근 바닥 플레이트의 검정 웰에 첨가하였다. 10㎕의 PAC1 FITC 및 10㎕의 CD62PE를 모든 대조군 및 검정 웰에 첨가하였다. 10㎕의 ADP 및 10㎕의 SFFLRN을 모든 대조군 웰(하이브리도마 상청액 무)에 첨가하였다. 활성화가 Fc 또는 항체 매개되는지를 확인하기 위해, 10㎕의 IV.3 저해제(FcγRIIA에 대한 항체)를 웰에 첨가하였다. 다음에, 상기 기재된 바대로 정제된, 농축 비활동 혈소판의 50㎕의 분취량을 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 및 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 1% PFA(최종 농도)에 의해 고정하였다(각각의 웰의 함량에 동등한 2%의 용적의 PFA를 첨가하였다). 고정 후, 유세포 분석법에 의해 샘플을 분석하였다.
GPIIb/IIIa에 대한 결합 시 혈소판을 활성화시키지 않는 항체를 응고 인자 표적화 모이어티에 대한 후보물질로서 선택하였다. 선택으로부터 GPIIb/IIIa에 대한 결합 시 혈소판을 활성화시키는 항체를 배제하였다.
항원 결합 부분이 Fc 구역을 함유하지 않고 따라서 FcγRIIA 수용체에 결합하지 않으므로, 선택으로부터 배제되지 않은 Fc 구역을 통한 FcγRIIA 수용체에 대한 결합에 의해 항체는 혈소판을 또한 활성화시킬 수 있다. FcγRIIA 수용체를 저해제에 의해 차단함으로써 이 항체를 확인할 수 있다.
비활성화 하이브리도마로부터의 상청액을 (ⅰ) 인간 및 사이노몰거스 혈소판에 대한 항체 결합을 확인하기 위해, (ⅱ) GPIIb/IIIa의 α 및/또는 β 아단위에 대한 항체 결합 특이성을 결정하기 위해 및 (ⅲ) 혈소판에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁할 수 있는지를 결정하기 위해 추가의 규명 검정으로 처리하였다. 피브리노겐은 GPIIb/IIIa의 천연 리간드이고, GPIIbIIIa에 대한 이의 결합은 혈소판 응집을 매개하는 데 필수적이다. 따라서, GPIIb/IIIa에 대한 피브리노겐의 결합과 경쟁하는 항체는 선택으로부터 배제된다.
ELISA를 이용하여 GPIIb/IIIa의 α 및/또는 β 아단위에 대한 항체 결합을 평가하지만, 유세포 분석법을 이용하여 피브리노겐과의 항체 경쟁을 평가하였다. 비활성화인 것으로 결정된 항체(예를 들어, 클론 34D10, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 12B2, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6, 13A1)를 VH 도메인 서열 유사성, α 또는 β 아단위 특이성, 피브리노겐과 경쟁하는 능력, 및 ELISA 및 유세포 분석법을 통해 결정된 신호의 상대 강도에 따라 6개의 상이한 그룹으로 클러스터링하였다(표 3 참조).
Figure pct00005
상기 기재된 스크리닝 방법을 이용하여 확인된 몇몇 비활성화 항체는 도 3에 도시된 바와 같은 동일한 VH 또는 VL 도메인을 공유하였다. 예를 들어, 35D1 및 34D10은 동일한 VH 도메인을 공유하였다.
상기 확인된 항체의 VH 및 VL 도메인에 상응하는 다중 서열 정렬은 각각 도 4 및 도 5에 도시되어 있다. 다중 서열 정렬은 VH 및 VL 도메인에서의 상보성 결정 구역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 위치, 및 EU 넘버링 시스템(Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K., and Foeller, C. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 4th ed., U.S. Govt. Printing Off. No. 165-492, Nethesda, MD)에 따른 이의 위치를 나타낸다.
도 6은 도 4 및 도 5의 다중 서열 정렬에 정렬된 VH 및 VL 서열의 각각의 쌍 중에서 서열 동일성의 백분율을 나타내는 백분율 동일성 매트릭스를 보여준다. 행 지칭은 매트릭스에서의 각각의 열에 적용되는 지칭에 상응한다. 예를 들어, 2 행은 "2: 서열 22-9D6LC"에 상응한다. 도 4 및 도 5에 정렬된 서열은 GPIIb/IIIa의 α 또는 β 아단위에 대한 항체의 특이성에 따라(도 7 및 도 8 참조) 및 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하는 이의 능력에 따라(도 9 및 도 10 참조) 클러스터링되었다.
실시예 2
항-GPIIb/IIIa 항체, XTEN 및 FVIIa를 포함하는 혈소판 표적화된 키메라 분자의 작제
혈소판의 표면에 대해 FVIIa 응고 인자를 표적화하기 위해 GPIIb/IIIa에 대한 단일클론 항체를 사용하였다. 따라서, 당해 분야에 공지된 분자 생물학 방법을 이용하여 부문 II.A.1.에서 확인된 혈소판 특이적 단일클론 항체로부터 유래한 scFv를 FVIIa에 융합하였다. 작제물을 HEK 293 세포에서 일시적으로 발현시키고 당해 분야에서 이용 가능한 표준 방법에 의해 정제하였다. 생성된 키메라 분자에서, FVIIa의 중쇄의 C 말단을 비활동 혈소판 표적화 항체로부터 유래한 VH 및 VL 도메인을 포함하는 scFv의 N 말단에 융합하고, FVII의 경쇄의 C 말단을 XTEN 폴리펩타이드의 N 말단에 융합하였다(도 2A 참조). FVII의 중쇄에 융합된 GPIIb/IIIa α 아단위 특이적 34D10 항체로부터 유래한 scFv 및 FVII의 경쇄에 융합된 XTEN 폴리펩타이드(즉, ____)를 포함하는 키메라 분자를 "FVII-211"이라 지칭한다. FVII의 경쇄, 및 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드(즉, AE288) 및 GPIIb/IIIa α 아단위 특이적 34D10 항체로부터 유래한 scFv로 이루어진 융합 펩타이드를 포함하는 제2 키메라 분자를 "FVII-200"이라 지칭한다. FVII 및 FVII의 중쇄의 C 말단에 융합된 GPIIb/IIIa α 아단위 특이적 34D10 항체로부터 유래한 scFv를 포함하는 키메라 분자를 "FVII-189"라 지칭한다. 이 혈소판 표적화된 FVIIa 변이체를 동물에서 혈소판에 결합하는 이의 능력, 이의 응고촉진 활성 및 이의 약동학적 특성에 대해 규명하였다.
실시예 3
XTEN은 rFVIIa의 약동학적 특성을 개선하지만 이의 활성을 감소시킨다
약동학적 특성을 평가하기 위해, HemA 마우스에 20 nmol/㎏의 rFVIIa 또는 FVIIa-XTEN의 단일 정맥내 용량을 투여하였다. FVIIa 특이적, 가용성 조직 인자 의존적 프로트롬빈 시간(sTF-PT) 검정에 의해 투약 및 FVIIa 활성을 결정한 후 다양한 시간에 혈장 샘플을 수집하였다(도 11A). 휘닉스 6 프로그램(Phoenix 6 program)(Pharsight)을 이용하여 PK 매개변수를 추론하였다.
도 11A 및 표 4에 도시된 바대로, rFVIIa의 C 말단에 연결된 XTEN은 HemA 마우스에서 순환 FVIIa의 반감기를 약 8배 연장시켰다. 다른 PK 매개변수는, 평균 잔류 시간(MRT)의 0.82시간으로부터 11시간의 증가 및 시간에 대한 혈장 활성 차트에서 용량 정규화 곡선 하 면적(AUC)의 거의 5배 증가로 표시되는 것처럼, 또한 개선되었다(도 11A).
Figure pct00006
XTEN이 rFVIIa의 약동학을 개선하지만, ROTEM에 의해 인간 A형 혈우병 혈액에서 측정된 rFVIIa-XTEN의 응고 활성은 rFVIIa의 약 25%로 감소하였다(도 11B).
실시예 4
혈소판 표적화와 XTEN의 조합은 이의 활성을 증가시키고 PK를 개선한다
혈소판에 대해 rFVIIa 또는 rFVIIa-XTEN을 표적화하는 것은 응고의 부위(혈소판)에서 단백질의 국소 농도를 증가시켜, 응고 활성을 증대시킬 수 있다. 표적화 모이어티로서 단일클론 항체 34D10으로부터의 scFv를 함유하도록 혈소판 표적화된 키메라 분자 FVII-200, FVII-211 및 FVII-189를 작제하였다. 작제물의 구조는 상기 기재되어 있다. 모든 3개의 분자는 용량 의존적 방식으로 인간 혈소판에 결합할 수 있고(도 12A), 이 결합은 34D10에 의존한다. 그러나, rFVIIa 그 자체는 이 검정에서 검출 가능한 혈소판 결합 활성을 갖지 않는다. 따라서, 34D10으로부터의 scFv는 혈소판으로 rFVIIa(FVII-189) 또는 rFVIIa-XTEN(FVII-200 및 FVII-211)을 지시할 수 있다.
혈소판 결합 능력으로부터의 결과로서, 34D10 표적화된 rFVIIa-XTEN 키메라 분자는, ROTEM에 의해 인간 A형 혈우병 혈액에서 평가할 때, 증대된 응고 활성을 나타냈다(도 12B). ROTEM에 의해 기록된 응고 시간에 기초하여, FVII-200은 rFVIIa보다 2배 내지 5배 더 활성인 것으로 예측되었다. 비교하면, rFVII-XTEN은 rFVIIa에 불과 25% 활성이다(도 11B). 따라서, 34D10에 의해 혈소판에 대해 rFVIIa-XTEN을 표적화하는 것은 실질적으로 활성을 개선시켰다.
단일클론 항체 34D10이 마우스 혈소판에 결합하지 않지만, 이것은 인간 αIIb 형질전환(Tg) 마우스로부터의 혈액에서 혈소판에 결합한다(hallb+/mallb-). 더구나, 34D10 표적화된 FVIIa(FVII-189) 및 FVIIa-XTEN(FVII-200 및 FVII-211)은 인간 αIIb Tg 마우스로부터의 혈소판에 결합하는 이의 능력을 보유하여서(도 13A), 34D10 함유 rFVIIa 키메라 분자의 약동학적 특성을 평가하는 이 Tg 마우스의 용도를 정당화한다.
도 13B에 도시된 바대로, αIIb Tg 마우스에서의 혈소판 결합 FVIIa 키메라 분자의 청소율은 2단계 감소 모델과 일치하였다. 34D10 표적화된 rFVIIa(FVII-189)와 비교하여, XTEN(FVII-200 및 FVII-211)의 첨가는 이의 최종 반감기를 연장하지만, 또한 초기 α 단계 감소를 완화시켰다. 특히, FVII-200의 PK 프로필이 FVII-211보다 현저히 우수하면서, PK 개선은 XTEN 배치의 위치에 의해 영향을 받았다. rFVIIa보다 2배 내지 5배 더 우수한 응고 활성과 함께 개선된 PK 특성은 연장된 치료학적 효율에 대한 이 키메라 분자의 잠재력을 보여준다.
실시예 5
대안적인 XTEN을 갖는 혈소판 표적화된 FVIIa XTEN 키메라 분자 및 표적화 모이어티 배치
단일클론 항체 PDG13으로부터의 scFv를 이용하여, FVIIa, PDG13 및 XTEN을 포함하는 키메라 분자의 종류(FIG 14)를 작제하고, HEK 293 세포에서 발현시키고, 정제하였다. 시험된 PDG13 및 XTEN 작제물의 대안적인 배치(도 14C, 도 14D, 도 14E, 도 14F) 중에서, rFVIIa의 경쇄에서 XTEN을 함유하고 중쇄에서 PDG13을 함유하는 FVII-179(도 14F)는 가장 활성이었다. FVII-179는 rFVIIa와 비교할 때 인간 A형 혈우병 혈액에서 응고 활성의 약 5배 증가를 나타냈다(도 15B). 모든 다른 키메라 분자, 즉 FVII-175(도 14C, 도 15C), FVII-178(도 14D, 도 15A, 도 15D), FVII-177(도 14D, 도 15D)은 rFVIIa와 필적하는 응고 활성을 보여주어, 혈소판 표적화 모이어티가 없는 XTEN 융합 및 rFVIIa를 함유하는 키메라 분자인 FVII-165에 비해 약간의 배수 개선을 나타냈다(도 14B).
PK에 대한 표적화 모이어티의 효과를 조사하였다. 도 16에 도시된 바대로, NSG 마우스에서 시간에 걸쳐 수혈된 인간 혈소판에서 투여된 단백질의 회수율을 분석할 때, FVII-211이 단백질 투여 5분 후에 모든 시간에 FVII-179보다 높은 회수를 보여주어, FVII-179보다 FVII-211의 혈소판에 더 느린 청소율을 나타내지만, 이 2개의 단백질은 혈소판 표적화 모이어티를 제외하고 구조적으로 동일하고, FVII-211은 34D10이고, FVII-179는 PDG13이다. 결과는 표적화 모이어티가 PK 개선에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6
마우스에서 증대된 실험실내 활성 및 개선된 반감기를 갖는 재조합 인자 FVIIa 융합 단백질
예방이 잠재적으로 가능하도록 반감기 연장을 성취하기 위해, XTEN 기술의 이용을 조사하였다. XTEN 서열은, 치료학적 펩타이드 및 단백질에 부착될 때, 개선된 약동학적 특성을 부여하는 6개의 상이한 아미노산(G, S, E, T, A, P)의 반복 서열을 포함하는 비구조화 단백질 서열이다(도 17). XTEN 기술은 융합 단백질의 유체역학 반경을 증가시켜, 신장 청소율을 예방하고, 제거 수용체 및/또는 프로테아제 개열로부터 보호할 수 있다. 재조합 성질은, 화학 변형 없이, 다중 삽입을 포함하는, 조성, 길이 및 배치의 정확한 제어를 허용한다. XTEN은, 신장 파쇄액에 의해 실험실내 입증된 바대로, 생체내 대사될 수 있는 천연 아미노산을 함유한다(도 17B). XTEN AE 288 서열은 rFVIIa의 C 말단에 재조합으로 융합되고, 실험실내 및 생체내 규명되었다. 이 목표는 저해제에 의해 혈우병을 갖는 사람에서 예방이 잠재적으로 가능하도록 FVIIa의 반감기를 연장시키는 XTEN 기술을 이용하는 것이다.
rFVIIa의 C 말단에 XTEN을 연결하는 것은 A형 혈우병 마우스에서 이의 순환 반감기를 8배 연장시키고(도 18), 전체 약물 노출(AUC)을 5배 증가시켰다. 그러나, rFVIIa-XTEN의 활성은 ROTEM 검정에 기초하여 rFVIIa의 대략 25%로 감소하였다. rFVIIa를 갖는 XTEN 융합 및 scFv의 다수의 구성을 A형 혈우병 마우스에서의 약동학 및 ROTEM 검정에서의 활성에 대해 시험하였다. 최적 구성은 반감기 및 rFVIIa에 대한 전체 노출(AUC)을 상당히 증가시키고(도 19), ROTEM에 의해 측정할 때 rFVIIa에 비해 활성을 2배 내지 5배 증가시켰다.
결론으로, 혈소판 표적화된 rFVIIa 분자는 ROTEM에 의해 rFVIIa에 비해 25배 내지 50배 활성을 나타내고/내거나, 혈소판 기능을 활성화하거나 저해하지 않고/않거나, 생체내 혈소판 청소율에 영향을 미치지 않았다. 혈소판 표적화된 rFVIIa 분자에 대한 XTEN 기술의 적용은 rFVIIa에 비해 반감기를 8배를 증가시키지만, ROTEM 활성을 4배 감소시켰다. 혈소판 표적화 및 XTEN 기술의 조합은 XTEN 및 scFv 모이어티의 최적 구성이 AUC를 6배 증가시키고 ROTEM 활성을 2배 내지 5배 증가시킨다는 것을 입증한다. 기술의 이 조합은 야생형 FVII 서열을 이용하는 개선된 우회 치료를 발생시킬 수 있다.
실시예 7
혈소판 표적화된 작제물 FVII-227, FVII-228, FVII-231, FVII-232, FVII-242, FVII-243 및 FVII-238의 작제 및 발현
혈소판 표적화된 rFVIIa-XTEN 변이체의 세 개(3)의 구성을 생성하였다: 구성 A(FVII-227, FVII-228, FVII-211), XTEN 및 표적화 모이어티는 각각 FVIIa의 경쇄 및 중쇄의 C 말단에 융합됨; 구성 B(FVII-231, FVII-232, FVII-200), XTEN 및 혈소판 표적화 모이어티 둘 다는 rFVIIa의 중쇄의 C 말단에 융합됨; 및 구성 C(FVII-242, FVII-243 및 FVII-238), XTEN은 중쇄 XTEN의 C 말단에서의 표적화 모이어티와 함께 중쇄 및 경쇄 둘 다의 C 말단에 융합됨. 각각의 구성을 위해, 72개 내지 288개의 아미노산 범위의 다중 XTEN 길이를 시험하였다. 당해 분야에 공지된 분자 생물학 방법을 이용하여 이 단백질을 코딩하는 DNA를 생성하였다. 작제물을 HEK 293 세포에서 일시적으로 발현시키고, 표준 방법에 의해 정제하였다.
실시예 8
단백질 FVII-165, FVII-189, FVII-200, FVII-227, FVII-228, FVII-231, FVII-232, FVII-242, FVII-243 및 FVII-238의 활성의 규명
혈소판 독립적(sTF-PT) 및 혈소판 의존적(ROTEM) 방법에 의해 이 변이체의 활성을 규명하였다. sTF-PT 방법에 기초하여, 모든 구성에서의 혈소판 표적화된 rFVIIa-XTEN 변이체의 특이적 활성은 몰 기준으로 rFVIIa보다 낮았다(도 20A 내지 도 20C). 구성 A 변이체는 rFVIIa의 44% 내지 15%의 범위의 가장 높은 특이적 활성을 나타내고, 활성은 매우 의존적이고 XTEN 길이에 역상관되었다. 구성 B 변이체의 활성은 더 낮고 XTEN 길이에 덜 의존적이었다. 구성 C 작제물은 이 방법에 의해 가장 낮은 활성을 나타냈다. A형 혈우병 도너로부터의 인간 전혈에서 혈소판 의존적 방법(ROTEM)에서 시험할 때, 모든 구성은 rFVIIa와 동등하거나 이를 초과하는 활성을 나타냈다(도 21A 내지 도 21C). 구성 A 변이체는 이 방법에 의해 가장 높은 활성을 나타내어, rFVIIa보다 15배 더 높은 활성에 도달하고, 활성은 XTEN 길이에 역상관되었다. 구성 B 및 C 변이체의 활성은 XTEN의 길이에 덜 의존적이었다. 도 21D는 FVII-200(LC:HC-XTEN 표적화 모이어티)이 ROTEM 검정에 의해 FVII-165(LC:HC-XTEN)보다 높은 FVII 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 결과는 혈소판 표적화 모이어티를 첨가하는 것이 XTEN 모이어티에 의해 발생하는 활성의 소실을 부분적으로 보상한다는 것을 나타낸다.
실시예 9
PK에 대한 XTEN 길이의 효과
288개의 아미노산을 갖는 단일 XTEN이 PK 개선에 충분한 것으로 밝혀졌다. 288개 또는 864개의 아미노산의 XTEN은 각각 FVIIa-XTEN288 및 FVIIa-XTEN864를 생성하도록 FVIIa의 C 말단에 융합되었다. 단백질은 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 조건 배지로부터 생성되고 정제되었다. PK를 평가하기 위해, 단백질을 HemA 마우스에 주입하고, 투약 후 다양한 시간으로부터의 혈장 활성을 FVIIa 의존적 가용성 조직 인자 - 프로트롬빈 시간(sTF-PT) 검정에 의해 측정하였다. 도 22에 도시된 바대로, FVIIa에 XTEN288을 융합하는 것은 더 느린 청소율을 발생시키지만, 288개보다 긴 XTEN은 추가의 PK 이익을 제공하지 않아서, 단일 XTEN에 의해, 288개의 아미노산의 길이가 PK 개선에 충분히 길다는 것을 나타낸다.
다음에, 288개 미만의 아미노산을 갖는 XTEN을 평가하였다. 도 23의 실험에서, 288개, 144개, 또는 72개의 XTEN을 FVIIa의 중쇄의 C 말단, 이어서 단일클론 항체 34D10의 단일 사슬 가변 구역에 융합하였다. 단백질을 hemA 마우스에 투여하고, 투약된 마우스로부터의 혈장 활성을 sTF-PT 검정에 의해 측정하였다. 도 23에 도시된 바대로, 시간에 대한 활성 회수율 차트는 각각 144개 및 72개의 아미노산의 XTEN을 함유하는 FVII232 및 231이 FVII200보다 신속히 청소된다는 것을 나타내어, 288개로부터 144개로 아미노산의 XTEN 길이를 감소시키는 것이 마우스에서 청소율을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
288개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 단일 XTEN이 완전 PK 이익을 제공하기에 충분히 길지 않으므로, 이중 XTEN의 작용을 조사하였다. 도 24의 실험에서, 72개의 아미노산의 2개의 XTEN을 FVIIa에 융합하였다; 하나는 FVIIa의 중쇄의 C 말단과 34D10의 N 말단 사이에 삽입되고, 하나는 FVIIa의 경쇄의 C 말단에 연결된다. HemA 마우스에서 FVII238인 생성된 단백질을 혈장 활성 PK에 대해 분석하였다. 도 24에 도시된 바대로, 오직 72개의 아미노산의 이중 XTEN은 각각 109㎖/시간/㎏으로부터 약 15㎖/시간/㎏로 청소율을 감소시켜, HemA 마우스에서 전체 단백질 노출을 7배 증가시켰다. 이 PK 개선은 288개의 아미노산의 단일 XTEN에 필적하거나 이보다 우수하였다(FVII-200, 도 24).
인간화 αIIb 형질전환 마우스에서 FVII-238의 PK를 또한 평가하였다. 도 25의 실험에서, FVII-238을 αIIb 마우스에 주입하고, 전혈을 투약 후 다양한 시간에 꼬리 정맥을 통해 수집하였다. 인간 FVII에 대해 형광성으로 표지된 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해 혈소판에서의 FVII 단백질 농도를 측정하였다. FVII-200 및 FVII-189를 유사하게 투약하고 분석하였다. 도 25에 도시된 바대로, 항체 34D10으로부터 혈소판 결합 단일 사슬 가변 구역을 함유하는 FVII-189은 전통적인 2단계 감소를 나타냈다: 순환에서 rFVIIa와 유사한 속도의 신속한 초기 단계 및 rFVIIa보다 현저히 더 느린 종료 단계. 288개의 아미노산의 단일 XTEN(FVII-200), 또는 72개의 아미노산의 이중 XTEN(FVII-238)의 각각의 첨가는 초기 청소율을 급격히 감소시켜서, 유사하게 개선된 PK 프로필을 발생시켰다. 흥미롭게도, 이중 XTEN과 관련하여, 중쇄(FVII-243) 또는 경쇄(FVII-242)에서 72개로부터 42개로 하나의 XTEN의 길이를 감소시키는 것은 도 25에 기재된 혈소판 PK에 의해 측정할 때. 청소율을 증가시켰다(도 26).
따라서, rFVIIa의 중쇄의 C 말단에 연결된 288개의 아미노산의 단일 XTEN(즉, FVII-200), 또는 하나는 중쇄에 융합되고 하나는 경쇄에 융합된 72개의 아미노산의 이중 XTEN(즉, FVII-238)은 혈소판 표적화된 FVIIa의 약동학을 개선하여, 전체 노출(AUC)을 6배 내지 7배 증가시켰다.
실시예 7 내지 실시예 9는 무엇보다도 XTEN 모이어티에 융합되고, 혈소판 표적화 모티프를 갖는 FVIIa 변이체(scFv는 혈소판 수용체 GPIIbIIIa에 지시됨)를 생성함으로써 rFVIIa의 활성 및 약동학적 특성을 개선할 수 있다는 것을 보여준다. 각각 PK 및 활성에 대한 XTEN 및 혈소판 표적화의 영향을 최대화하기 위해, 혈소판 표적화된 rFVIIa-XTEN 변이체의 3개의 구성을 생성하였다: 구성 A, XTEN 및 표적화 모이어티는 각각 FVIIa의 경쇄 및 중쇄의 C 말단에 융합됨; 구성 B, XTEN 둘 다는 rFVIIa의 중쇄의 C 말단에 융합되고, 표적화 모이어티는 XTEN의 C 말단에 융합됨; 및 구성 C, XTEN은 중쇄 XTEN의 C 말단에서의 표적화 모이어티와 함께 중쇄 및 경쇄 둘 다의 C 말단에 융합됨. 각각의 구성을 위해, 72개 내지 288개의 아미노산 범위의 다중 XTEN 길이를 시험하였다.
혈소판 독립적 방법(sTF-PT)에 기초하여, 모든 구성에서의 이 변이체의 특이적 활성은 몰 기준으로 rFVIIa보다 낮았다. 구성 A 변이체는 rFVIIa의 44%만큼 높은 가장 높은 특이적 활성을 나타내고, 중쇄의 C 말단에서의 XTEN의 배치(구성 B)는 sTF 기반 활성에 더 큰 영향을 가졌다. 구성 C 변이체는 이 방법에 의해 가장 낮은 활성을 나타냈다. 그러나, ROTEM에 의해 전혈에서 혈소판 의존적 방법에서 시험할 때, 모든 구성은 rFVIIa와 동등하거나 이를 초과하는 활성을 나타냈다. 구성 A 변이체는 이 방법에 의해 가장 높은 활성을 나타내어, rFVIIa보다 15배 더 높은 활성에 도달하였다. 일반적으로, XTEN 요소의 길이는 활성과 역상관되었다. 혈소판 표적화에 대한 XTEN 모이어티의 영향을 평가하기 위해, 각각의 구성으로부터의 GPIIb/IIIa로의 대표적인 변이체의 결합을 바이오층 간섭계(bio-layer interferometry)에 의해 측정하였다. 이 검정은 GPIIb/IIIa에 대한 혈소판 표적화된 FVIIa-XTEN 변이체의 친화도가 XTEN의 길이와 역상관된다는 것을 나타낸다. 혈소판 표적화 및 XTEN 기술을 조합함으로써, 전혈 응고 검정에서 rFVIIa보다 더 강력한 rFVIIa 변이체를 생성하였다. 몇몇 경우에, XTEN은 αIIbβ3에 대한 rFVIIa 변이체의 친화도에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, XTEN이 rFVIIa의 약동학적 특성을 개선할 수 있고, 이의 배치 및 길이는 혈소판 표적화 기술의 영향을 최대화하도록 최적화되어야 한다.
실시예 5 내지 실시예 9는 XTEN이 상이한 길이로 통합될 수 있다는 것을 추가로 나타낸다. FVIIa 특이적 가용성 조직 인자 - 프로트롬빈 시간(sTF-PT) 검정에 의해 측정된 A형 혈우병 마우스에서의 혈장 활성 PK에 기초하여, 단일 XTEN에 의해 PK를 개선하기 위해, 864개의 아미노산의 XTEN이 추가의 PK 이익을 제공하지 않으므로, 288개의 아미노산의 길이(XTEN288)가 충분한 것으로 밝혀졌다. αIIbβ3 표적화된 FVIIa의 PK를 개선하기 위해 단일 XTEN288을 조사하였다. FVIIa와 동등하거나 이보다 우수한 지혈 활성을 나타낸 2개의 구성을 조사하였다: 1) 중쇄 XTEN(여기서, XTEN288은 중쇄에 융합되고 αIIbβ3-scFv는 XTEN288에 추가로 연결됨) 및 2) 경쇄 XTEN(여기서, αIIbβ3-scFv는 중쇄에 융합되고 XTEN288은 경쇄에 융합됨). 인간화 αIIb 형질전환 마우스에서 혈소판 PK 분석(여기서, 혈소판 결합 단백질은 형광성으로 표지된 FVII 항체를 사용하여 유세포 분석법을 이용하여 정량화됨)에 의해 판단된 바대로, 중쇄 XTEN은 경쇄 XTEN보다 순환에서 혈소판에서 더 신속히 청소되었다. rFVIIa와 비교할 때, 중쇄 XTEN의 혈장 활성 PK 분석은 청소율의 약 7배 감소 및 전체 노출의 6배 증가를 나타냈다. 144개 또는 72개로 XTEN 길이를 감소시키는 것이 청소율을 증가시키지만, 72개의 아미노산의 2개의 XTEN의 부착(하나는 중쇄에 부착하고 하나는 경쇄에 부착함)은 중쇄 XTEN288과 유사한 정도로 혈소판 및 혈장 PK를 효과적으로 개선하였다.
본 발명은 특정한 기능 및 이의 관계의 실행을 설명하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 상기 기재되어 있다. 이 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본 명세서에 임의로 규정되어 있다. 특정한 기능 및 이의 관계가 적절하게 수행되는 한, 대안적인 경계가 규정될 수 있다.
특정한 실시형태의 상기 설명은, 다른 사람이, 당해 기술 내의 지식을 적용함으로써, 부당한 실험 없이, 본 발명의 일반적인 개념을 벗어남이 없이, 이러한 특정한 실시형태를 다양한 적용을 위해 용이하게 변형하고/하거나 채택할 수 있도록, 본 발명의 일반적인 성질을 완전히 밝힌다. 따라서, 이러한 채택 및 변형은, 본 명세서에 제시된 교시내용 및 지시사항에 기초하여, 개시된 실시형태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에서의 어법 또는 전문용어는 제한이 아니라 설명의 목적을 위한 것이고, 그래서 본 명세서의 전문용어 또는 어법이 교시내용 및 지시사항의 견지에서 당업자에 의해 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 임의의 상기 기재된 예시적인 실시형태에 의해 제한되지 않아야 하지만, 하기 청구범위 및 이의 등가물에 따라서만 한정되어야 한다. 본 발명의 다른 실시형태는 본 명세서의 고려 및 본 명세서에 개시된 본 발명의 실행으로부터 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 공보는 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN MA INC. <120> CHIMERIC FVII-XTEN MOLECULES AND USES THEREOF <130> WO2014/194282 <140> PCT/US2014/040370 <141> 2014-05-30 <150> US 61/829,878 <151> 2013-05-31 <150> US 61/883,707 <151> 2013-09-27 <150> US 61/901,954 <151> 2013-11-08 <150> US 61/988,105 <151> 2014-05-02 <160> 275 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 34D10 HC <400> 1 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Gly Asp Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> 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aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggtggc ggcggatcag gtgggggtgg atcaggcggt 600 ggaggttccg gtggcggggg atccggcggt ggaggttccg gtgggggtgg atcaggctcg 660 agtggtacct cagagtctgc tacccccgag tcagggccag gatcagagcc agccacctcc 720 gggtctgaga cacccgggac ttccgagagt gccacccctg agtccggacc cgggtccgag 780 cccgccactt ccggctccga aactcccggc acaagcgaga gcgctacccc agagtcagga 840 ccaggaacat ctacagagcc ctctgaaggc tccgctccag ggtccccagc cggcagtccc 900 actagcaccg aggagggaac ctctgaaagc gccacacccg aatcagggcc agggtctgag 960 cctgctacca gcggcagcga gacaccaggc acctctgagt ccgccacacc agagtccgga 1020 cccggatctc ccgctgggag ccccacctcc actgaggagg gatctcctgc tggctctcca 1080 acatctactg aggaaggtac ctcaaccgag ccatccgagg gatcagctcc cggcacctca 1140 gagtcggcaa ccccggagtc tggacccgga acttccgaaa gtgccacacc agagtccggt 1200 cccgggactt cagaatcagc aacacccgag tccggccctg ggtctgaacc cgccacaagt 1260 ggtagtgaga caccaggatc agaacctgct acctcagggt cagagacacc cggatctccg 1320 gcaggctcac caacctccac tgaggagggc accagcacag aaccaagcga gggctccgca 1380 cccggaacaa gcactgaacc cagtgagggt tcagcacccg gctctgagcc ggccacaagt 1440 ggcagtgaga cacccggcac ttcagagagt gccacccccg agagtggccc aggcactagt 1500 accgagccct ctgaaggcag tgcgccaacc ggtggtggcg gtggctccgg cggaggtggg 1560 tccggtggcg gcggatcagg tgggggtgga tcaggcggtg gaggttccgg tggcggggga 1620 tcaagaaaga gaaggaaaag aattgtgggg ggcaaggtgt gccccaaagg ggagtgtcca 1680 tggcaggtcc tgttgttggt gaatggagct cagttgtgtg gggggaccct gatcaacacc 1740 atctgggtgg tgtccgcggc ccactgtttc gacaaaatca agaactggag gaacctgatc 1800 gcggtgctgg gcgagcacga cctcagcgag cacgacgggg atgagcagag ccggcgggtg 1860 gcgcaggtca tcatccccag cacgtacgtc ccgggcacca ccaaccacga catcgcgctg 1920 ctccgcctgc accagcccgt ggtcctcact gaccatgtgg tgcccctctg cctgcccgaa 1980 cggacgttct ctgagaggac gctggccttc gtgcgcttct cattggtcag cggctggggc 2040 cagctgctgg accgtggcgc cacggccctg gagctcatgg 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ggtccctgaa actctcctgt 2940 gcagcctctg gattcacttt cagtgcctat gccatgtctt gggttcgcca gactccagag 3000 aagaggctgg agtgggtcgc atccattagt agtggtggta ccacctacta tccagacagt 3060 gtgaaacgcc gattcaccat ctccagagat aatgccagga acatcctgta cctgcaaatg 3120 agcagtctga ggtctgagga cacggccatg tattactgta caagaggcgg ggactacggc 3180 tacgctctgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 3228 <210> 194 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AD Family Motif <400> 194 Gly Glu Ser Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ser 1 5 10 <210> 195 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AD Family Motif <400> 195 Gly Ser Glu Gly Ser Ser Gly Pro Gly Glu Ser Ser 1 5 10 <210> 196 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AD Family Motif <400> 196 Gly Ser Ser Glu Ser Gly Ser Ser Glu Gly Gly Pro 1 5 10 <210> 197 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AD Family Motif <400> 197 Gly Ser Gly Gly Glu Pro Ser Glu Ser Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 198 <211> 12 <212> PRT <213> 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360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggtggc ggcggatcag gtgggggtgg atcaggcggt 600 ggaggttccg gtggcggggg atccggcggt ggaggttccg gtgggggtgg atcaggctcg 660 agtagtcccg ctggaagccc aactagcacc gaagagggga cctcagagtc cgccaccccc 720 gagtccggcc ctggctctga gcctgccact agcggctccg agactcctgg cacatccgaa 780 agcgctacac ccgagagtgg acccggcacc tctaccgagc ccagtgaggg ctccgcccct 840 ggaacaagca ccgagcccag cgaaggcagc gccccaggga ccggtggtgg cggtggctcc 900 ggcggaggtg ggtccggtgg cggcggatca ggtgggggtg gatcaggcgg tggaggttcc 960 ggtggcgggg gatcaagaaa gagaaggaaa agaattgtgg ggggcaaggt gtgccccaaa 1020 ggggagtgtc catggcaggt cctgttgttg gtgaatggag ctcagttgtg tggggggacc 1080 ctgatcaaca ccatctgggt ggtgtccgcg gcccactgtt tcgacaaaat caagaactgg 1140 aggaacctga tcgcggtgct gggcgagcac gacctcagcg agcacgacgg ggatgagcag 1200 agccggcggg 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gtacaccagg gtctcccagt acatcgagtg gctgcaaaag 1920 ctcatgcgct cagagccacg cccaggagtc ctcctgcgag ccccatttcc cggtggcggt 1980 ggctccggcg gaggtgggtc cggtggcggc ggatcaggtg ggggtggatc aggcggtgga 2040 ggttccggtg gcgggggatc cgaaaatgtg ctcacccagt ctccagcaat catgtctgca 2100 tctctagggg agaaggtcac catgagctgc agggccagct caagtgtaaa ttacatgtac 2160 tggtaccagc agaagtcaga tgcctccccc aaactatgga tttattacac atccaacctg 2220 gctcctggag tcccagctcg cttcagtggc agtgggtctg ggaactctta ttctctcaca 2280 atcagcagca tggagggtga agatgctgcc acttattact gccagcagtt tagtagttcc 2340 ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gcggtggcgg cggatcaggt 2400 ggaggtggat caggtggcgg tggcagtggt ggcggtggat cagaagtgaa gctggtggag 2460 tctgggggag gcttagtgaa gcctggaggg tccctgaaac tctcctgtgc agcctctgga 2520 ttcactttca gtgcctatgc catgtcttgg gttcgccaga ctccagagaa gaggctggag 2580 tgggtcgcat ccattagtag tggtggtacc acctactatc cagacagtgt gaaacgccga 2640 ttcaccatct ccagagataa tgccaggaac atcctgtacc tgcaaatgag cagtctgagg 2700 tctgaggaca cggccatgta ttactgtaca agaggcgggg actacggcta cgctctggac 2760 tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcaggtg gcggaggttc ccatcatcac 2820 catcaccatt ga 2832 <210> 271 <211> 2418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of FVII-231 <400> 271 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtgtcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc ccgggtctcc aggtacctca gagtctgcta cccccgagtc agggccagga 1380 tcagagccag ccacctccgg gtctgagaca cccgggactt ccgagagtgc cacccctgag 1440 tccggacccg ggtccgagcc cgccacttcc ggctccgaaa ctcccggcac aagcgagagc 1500 gctaccccag agtcaggacc aggaacatct acagagccct ctgaaggctc cgctccaggt 1560 ggcggtggct ccggcggagg tgggtccggt ggcggcggat caggtggggg tggatcaggc 1620 ggtggaggtt ccggtggcgg gggatccgaa aatgtgctca cccagtctcc agcaatcatg 1680 tctgcatctc taggggagaa ggtcaccatg agctgcaggg ccagctcaag tgtaaattac 1740 atgtactggt accagcagaa gtcagatgcc tcccccaaac tatggattta ttacacatcc 1800 aacctggctc ctggagtccc agctcgcttc agtggcagtg ggtctgggaa ctcttattct 1860 ctcacaatca gcagcatgga gggtgaagat gctgccactt attactgcca gcagtttagt 1920 agttccccgt ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgcgg tggcggcgga 1980 tcaggtggag gtggatcagg tggcggtggc agtggtggcg gtggatcaga agtgaagctg 2040 gtggagtctg ggggaggctt agtgaagcct ggagggtccc tgaaactctc ctgtgcagcc 2100 tctggattca ctttcagtgc ctatgccatg tcttgggttc gccagactcc agagaagagg 2160 ctggagtggg tcgcatccat tagtagtggt ggtaccacct actatccaga cagtgtgaaa 2220 cgccgattca ccatctccag agataatgcc aggaacatcc tgtacctgca aatgagcagt 2280 ctgaggtctg aggacacggc catgtattac tgtacaagag gcggggacta cggctacgct 2340 ctggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct caggtggcgg aggttcccat 2400 catcaccatc accattga 2418 <210> 272 <211> 2634 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of FVII-232 <400> 272 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtgtcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc ccgggtctcc aggtacctca gagtctgcta cccccgagtc agggccagga 1380 tcagagccag ccacctccgg gtctgagaca cccgggactt ccgagagtgc cacccctgag 1440 tccggacccg ggtccgagcc cgccacttcc ggctccgaaa ctcccggcac aagcgagagc 1500 gctaccccag agtcaggacc aggaacatct acagagccct ctgaaggctc cgctccaggg 1560 tccccagccg gcagtcccac tagcaccgag gagggaacct ctgaaagcgc cacacccgaa 1620 tcagggccag ggtctgagcc tgctaccagc ggcagcgaga caccaggcac ctctgagtcc 1680 gccacaccag agtccggacc cggatctccc gctgggagcc ccacctccac tgaggaggga 1740 tctcctgctg gctctccaac atctactgag gaaggtggcg gtggctccgg cggaggtggg 1800 tccggtggcg gcggatcagg tgggggtgga tcaggcggtg gaggttccgg tggcggggga 1860 tccgaaaatg tgctcaccca gtctccagca atcatgtctg catctctagg ggagaaggtc 1920 accatgagct gcagggccag ctcaagtgta aattacatgt actggtacca gcagaagtca 1980 gatgcctccc ccaaactatg gatttattac acatccaacc tggctcctgg agtcccagct 2040 cgcttcagtg gcagtgggtc tgggaactct tattctctca caatcagcag catggagggt 2100 gaagatgctg ccacttatta ctgccagcag tttagtagtt ccccgtggac gttcggtgga 2160 ggcaccaagc tggaaatcaa acgcggtggc ggcggatcag gtggaggtgg atcaggtggc 2220 ggtggcagtg gtggcggtgg atcagaagtg aagctggtgg agtctggggg aggcttagtg 2280 aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cagtgcctat 2340 gccatgtctt gggttcgcca gactccagag aagaggctgg agtgggtcgc atccattagt 2400 agtggtggta ccacctacta tccagacagt gtgaaacgcc gattcaccat ctccagagat 2460 aatgccagga acatcctgta cctgcaaatg agcagtctga ggtctgagga cacggccatg 2520 tattactgta caagaggcgg ggactacggc tacgctctgg actactgggg tcaaggaacc 2580 tcagtcaccg tctcctcagg tggcggaggt tcccatcatc accatcacca ttga 2634 <210> 273 <211> 2751 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of FVII-242 <400> 273 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctacg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggtggc ggcggatcag gtgggggtgg atcaggcggt 600 ggaggttccg gtggcggggg atccggcggt ggaggttccg gtgggggtgg atcaggctcg 660 agtggtacct cagagtctgc tacccccgag tcagggccag gatcagagcc agccacctcc 720 gggtctgaga cacccgggac ttccgagagt gccacccctg agtccggacc cgggtccgag 780 cccgccacta ccggtggtgg cggtggctcc ggcggaggtg ggtccggtgg cggcggatca 840 ggtgggggtg gatcaggcgg tggaggttcc ggtggcgggg gatcaagaaa gagaaggaaa 900 agaattgtgg ggggcaaggt gtgccccaaa ggggagtgtc catggcaggt cctgttgttg 960 gtgaatggag ctcagttgtg tggggggacc ctgatcaaca ccatctgggt ggtgtccgcg 1020 gcccactgtt tcgacaaaat caagaactgg aggaacctga tcgcggtgct gggcgagcac 1080 gacctcagcg agcacgacgg ggatgagcag agccggcggg tggcgcaggt catcatcccc 1140 agcacgtacg tcccgggcac caccaaccac gacatcgcgc tgctccgcct gcaccagccc 1200 gtggtcctca ctgaccatgt ggtgcccctc tgcctgcccg aacggacgtt ctctgagagg 1260 acgctggcct tcgtgcgctt ctcattggtc agcggctggg gccagctgct ggaccgtggc 1320 gccacggccc tggagctcat ggtcctcaac gtgccccggc tgatgaccca ggactgcctg 1380 cagcagtcac ggaaggtggg agactcccca aatatcacgg agtacatgtt ctgtgccggc 1440 tactcggatg gcagcaagga ctcctgcaag ggggacagtg gaggcccaca tgccacccac 1500 taccggggca cgtggtacct gacgggcatc gtcagctggg gccagggctg cgcaaccgtg 1560 ggccactttg gggtgtacac cagggtgtcc cagtacatcg agtggctgca aaagctcatg 1620 cgctcagagc cacgcccagg agtcctcctg cgagccccat ttcccgggtc tccaggtacc 1680 tcagagtctg ctacccccga gtcagggcca ggatcagagc cagccacctc cgggtctgag 1740 acacccggga cttccgagag tgccacccct gagtccggac ccgggtccga gcccgccact 1800 tccggctccg aaactcccgg cacaagcgag agcgctaccc cagagtcagg accaggaaca 1860 tctacagagc cctctgaagg ctccgctcca ggtggcggtg gctccggcgg aggtgggtcc 1920 ggtggcggcg gatcaggtgg gggtggatca ggcggtggag gttccggtgg cgggggatcc 1980 gaaaatgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga gaaggtcacc 2040 atgagctgca gggccagctc aagtgtaaat tacatgtact ggtaccagca gaagtcagat 2100 gcctccccca aactatggat ttattacaca tccaacctgg ctcctggagt cccagctcgc 2160 ttcagtggca gtgggtctgg gaactcttat tctctcacaa tcagcagcat ggagggtgaa 2220 gatgctgcca cttattactg ccagcagttt agtagttccc cgtggacgtt cggtggaggc 2280 accaagctgg aaatcaaacg cggtggcggc ggatcaggtg gaggtggatc aggtggcggt 2340 ggcagtggtg gcggtggatc agaagtgaag ctggtggagt ctgggggagg cttagtgaag 2400 cctggagggt ccctgaaact ctcctgtgca gcctctggat tcactttcag tgcctatgcc 2460 atgtcttggg ttcgccagac tccagagaag aggctggagt gggtcgcatc cattagtagt 2520 ggtggtacca cctactatcc agacagtgtg aaacgccgat tcaccatctc cagagataat 2580 gccaggaaca tcctgtacct gcaaatgagc agtctgaggt ctgaggacac ggccatgtat 2640 tactgtacaa gaggcgggga ctacggctac gctctggact actggggtca aggaacctca 2700 gtcaccgtct cctcaggtgg cggaggttcc catcatcacc atcaccattg a 2751 <210> 274 <211> 2751 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of FVII-243 <400> 274 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctacg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggtggc ggcggatcag gtgggggtgg atcaggcggt 600 ggaggttccg gtggcggggg atccggcggt ggaggttccg gtgggggtgg atcaggctcg 660 agtagtcccg ctggaagccc aactagcacc gaagagggga cctcagagtc cgccaccccc 720 gagtccggcc ctggctctga gcctgccact agcggctccg agactcctgg cacatccgaa 780 agcgctacac ccgagagtgg acccggcacc tctaccgagc ccagtgaggg ctccgcccct 840 ggaacaagca ccgagcccag cgaaggcagc gccccaggga ccggtggtgg cggtggctcc 900 ggcggaggtg ggtccggtgg cggcggatca ggtgggggtg gatcaggcgg tggaggttcc 960 ggtggcgggg gatcaagaaa gagaaggaaa agaattgtgg ggggcaaggt gtgccccaaa 1020 ggggagtgtc catggcaggt cctgttgttg gtgaatggag ctcagttgtg tggggggacc 1080 ctgatcaaca ccatctgggt ggtgtccgcg gcccactgtt tcgacaaaat caagaactgg 1140 aggaacctga tcgcggtgct gggcgagcac gacctcagcg agcacgacgg ggatgagcag 1200 agccggcggg tggcgcaggt catcatcccc agcacgtacg tcccgggcac caccaaccac 1260 gacatcgcgc tgctccgcct gcaccagccc gtggtcctca ctgaccatgt ggtgcccctc 1320 tgcctgcccg aacggacgtt ctctgagagg acgctggcct tcgtgcgctt ctcattggtc 1380 agcggctggg gccagctgct ggaccgtggc gccacggccc tggagctcat ggtcctcaac 1440 gtgccccggc tgatgaccca ggactgcctg cagcagtcac ggaaggtggg agactcccca 1500 aatatcacgg agtacatgtt ctgtgccggc tactcggatg gcagcaagga ctcctgcaag 1560 ggggacagtg gaggcccaca tgccacccac taccggggca cgtggtacct gacgggcatc 1620 gtcagctggg gccagggctg cgcaaccgtg ggccactttg gggtgtacac cagggtgtcc 1680 cagtacatcg agtggctgca aaagctcatg cgctcagagc cacgcccagg agtcctcctg 1740 cgagccccat ttcccgggtc tccaggtacc tcagagtctg ctacccccga gtcagggcca 1800 ggatcagagc cagccacctc cgggtctgag acacccggga cttccgagag tgccacccct 1860 gagtccggac ccgggtccga gcccgccact ggtggcggtg gctccggcgg aggtgggtcc 1920 ggtggcggcg gatcaggtgg gggtggatca ggcggtggag gttccggtgg cgggggatcc 1980 gaaaatgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga gaaggtcacc 2040 atgagctgca gggccagctc aagtgtaaat tacatgtact ggtaccagca gaagtcagat 2100 gcctccccca aactatggat ttattacaca tccaacctgg ctcctggagt cccagctcgc 2160 ttcagtggca gtgggtctgg gaactcttat tctctcacaa tcagcagcat ggagggtgaa 2220 gatgctgcca cttattactg ccagcagttt agtagttccc cgtggacgtt cggtggaggc 2280 accaagctgg aaatcaaacg cggtggcggc ggatcaggtg gaggtggatc aggtggcggt 2340 ggcagtggtg gcggtggatc agaagtgaag ctggtggagt ctgggggagg cttagtgaag 2400 cctggagggt ccctgaaact ctcctgtgca gcctctggat tcactttcag tgcctatgcc 2460 atgtcttggg ttcgccagac tccagagaag aggctggagt gggtcgcatc cattagtagt 2520 ggtggtacca cctactatcc agacagtgtg aaacgccgat tcaccatctc cagagataat 2580 gccaggaaca tcctgtacct gcaaatgagc agtctgaggt ctgaggacac ggccatgtat 2640 tactgtacaa gaggcgggga ctacggctac gctctggact actggggtca aggaacctca 2700 gtcaccgtct cctcaggtgg cggaggttcc catcatcacc atcaccattg a 2751 <210> 275 <211> 2841 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of FVII-238 <400> 275 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctacg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggtggc ggcggatcag gtgggggtgg atcaggcggt 600 ggaggttccg gtggcggggg atccggcggt ggaggttccg gtgggggtgg atcaggctcg 660 agtagtcccg ctggaagccc aactagcacc gaagagggga cctcagagtc cgccaccccc 720 gagtccggcc ctggctctga gcctgccact agcggctccg agactcctgg cacatccgaa 780 agcgctacac ccgagagtgg acccggcacc tctaccgagc ccagtgaggg ctccgcccct 840 ggaacaagca ccgagcccag cgaaggcagc gccccaggga ccggtggtgg cggtggctcc 900 ggcggaggtg ggtccggtgg cggcggatca ggtgggggtg gatcaggcgg tggaggttcc 960 ggtggcgggg gatcaagaaa gagaaggaaa agaattgtgg ggggcaaggt gtgccccaaa 1020 ggggagtgtc catggcaggt cctgttgttg gtgaatggag ctcagttgtg tggggggacc 1080 ctgatcaaca ccatctgggt ggtgtccgcg gcccactgtt tcgacaaaat caagaactgg 1140 aggaacctga tcgcggtgct gggcgagcac gacctcagcg agcacgacgg ggatgagcag 1200 agccggcggg tggcgcaggt catcatcccc agcacgtacg tcccgggcac caccaaccac 1260 gacatcgcgc tgctccgcct gcaccagccc gtggtcctca ctgaccatgt ggtgcccctc 1320 tgcctgcccg aacggacgtt ctctgagagg acgctggcct tcgtgcgctt ctcattggtc 1380 agcggctggg gccagctgct ggaccgtggc gccacggccc tggagctcat ggtcctcaac 1440 gtgccccggc tgatgaccca ggactgcctg cagcagtcac ggaaggtggg agactcccca 1500 aatatcacgg agtacatgtt ctgtgccggc tactcggatg gcagcaagga ctcctgcaag 1560 ggggacagtg gaggcccaca tgccacccac taccggggca cgtggtacct gacgggcatc 1620 gtcagctggg gccagggctg cgcaaccgtg ggccactttg gggtgtacac cagggtgtcc 1680 cagtacatcg agtggctgca aaagctcatg cgctcagagc cacgcccagg agtcctcctg 1740 cgagccccat ttcccgggtc tccaggtacc tcagagtctg ctacccccga gtcagggcca 1800 ggatcagagc cagccacctc cgggtctgag acacccggga cttccgagag tgccacccct 1860 gagtccggac ccgggtccga gcccgccact tccggctccg aaactcccgg cacaagcgag 1920 agcgctaccc cagagtcagg accaggaaca tctacagagc cctctgaagg ctccgctcca 1980 ggtggcggtg gctccggcgg aggtgggtcc ggtggcggcg gatcaggtgg gggtggatca 2040 ggcggtggag gttccggtgg cgggggatcc gaaaatgtgc tcacccagtc tccagcaatc 2100 atgtctgcat ctctagggga gaaggtcacc atgagctgca gggccagctc aagtgtaaat 2160 tacatgtact ggtaccagca gaagtcagat gcctccccca aactatggat ttattacaca 2220 tccaacctgg ctcctggagt cccagctcgc ttcagtggca gtgggtctgg gaactcttat 2280 tctctcacaa tcagcagcat ggagggtgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagttt 2340 agtagttccc cgtggacgtt cggtggaggc accaagctgg aaatcaaacg cggtggcggc 2400 ggatcaggtg gaggtggatc aggtggcggt ggcagtggtg gcggtggatc agaagtgaag 2460 ctggtggagt ctgggggagg cttagtgaag cctggagggt ccctgaaact ctcctgtgca 2520 gcctctggat tcactttcag tgcctatgcc atgtcttggg ttcgccagac tccagagaag 2580 aggctggagt gggtcgcatc cattagtagt ggtggtacca cctactatcc agacagtgtg 2640 aaacgccgat tcaccatctc cagagataat gccaggaaca tcctgtacct gcaaatgagc 2700 agtctgaggt ctgaggacac ggccatgtat tactgtacaa gaggcgggga ctacggctac 2760 gctctggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctcaggtgg cggaggttcc 2820 catcatcacc atcaccattg a 2841

Claims (122)

  1. VII 인자("FVII"), XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 하기 특징 중 하나 이상을 나타내는, 키메라 분자:
    (a) 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 동일한 GPIIb/IIIa 에피토프에 특이적으로 결합하는 특징;
    (b) 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체에 대한 GPIIb/IIIa 결합을 경쟁적으로 저해하는 특징; 또는
    (c) 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 또는 28F4의 CDR로부터 선택된, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 상보성 결정 구역(complementarity determining region: CDR) 또는 이의 변이체를 포함하는 특징.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 34D10, 12B2, 2A2, 35D1, 36A8, 4B11, 1H6, 38G8, 21F10, 38A8, 18F7, 38F6, 13C1, 5C4, 23C10, 37C7, 28C2, 9D6 및 28F4로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 6개의 CDR 또는 이의 변이체를 포함하는, 키메라 분자.
  3. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 25, 31, 37, 43 또는 111 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 26, 32, 38, 44 또는 112 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 27, 33, 39, 45 또는 113 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 28, 34, 40, 117 또는 114 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 29, 35, 41, 118 또는 115 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 30, 36, 42, 119 또는 116 중 임의의 하나와 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  4. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 공통 서열 X1YAMS(X1은 아미노산 잔기 Thr(T), Ser(S) 또는 Ala(A)를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR1;
    (ⅱ) 공통 서열 SIX2X3GX4X5TYX6X7DSVKX8(X2는 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Asn(N)을 나타내고, X3은 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Gly(G)를 나타내며, X4는 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Gly(G)를 나타내고, X5는 아미노산 잔기 Ser(S), Asn(N) 또는 Thr(T)을 나타내며, X6은 아미노산 잔기 Tyr(Y) 또는 Phe(F)를 나타내고, X7은 아미노산 잔기 Leu(L) 또는 Pro(P)를 나타내며, X8은 아미노산 Gly(G) 또는 Arg(R)를 나타냄)을 포함하는 VH-CDR2;
    (ⅲ) 공통 서열 GGDYGYAX9DY(X9는 아미노산 잔기 Leu(L) 또는 Met(M)를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR3;
    (ⅳ) 서열 RASSSVNYMY(서열 번호 28)를 포함하는 VL-CDR1;
    (ⅴ) 서열 YTSNLAP(서열 번호 29)를 포함하는 VL-CDR2; 및
    (ⅵ) 서열 QQFSSSPWT(서열 번호 30)를 포함하는 VL-CDR3
    을 포함하는, 키메라 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는
    (ⅰ) 서열 번호 25, 31, 37, 43 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 26, 32, 38, 44 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR2 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 27, 33, 39, 45 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR3 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 28, 34, 40, 117 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 29, 35, 41, 118 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR2 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 30, 36, 42, 119 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR3 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  6. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서, 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 97 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 2, 4, 6, 99 또는 98 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 키메라 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 2(34D10 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  8. 제6항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 4(2A2 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 6(36A8 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  10. 제6항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 99(4B11 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  11. 제6항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 98(35D1 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인 또는 GPIIb/IIIa 복합체의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는, 키메라 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하지 않는, 키메라 분자.
  14. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 46, 52, 120 또는 126 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 47, 53, 121 또는 127 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 48, 54, 122 또는 128 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 49, 55, 123 또는 129 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 50, 56, 124 또는 130 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 51, 57, 125 또는 131 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  15. 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 8, 10, 100 또는 102 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 9, 11, 101 또는 103 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 키메라 분자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 9(1H6 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  17. 제15항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 11(38A8 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  18. 제15항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 101(38G8 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  19. 제15항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 103(21F10 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  20. 제1항, 제2항 및 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는, 키메라 분자.
  21. 제1항, 제2항 및 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하는, 키메라 분자.
  22. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 58과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 59와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 60과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 61과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 62와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 63과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  23. 제1항, 제2항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 12와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 13(18F7 항체)과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 키메라 분자.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 알파 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는, 키메라 분자.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하는, 키메라 분자.
  26. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 64, 70 또는 135 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 65, 71 또는 136 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 66, 72 또는 137 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 67, 132 또는 138 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 68, 133 또는 139 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 69, 134 또는 140 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  27. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 SYWIE(서열 번호 64)를 포함하는 VH-CDR1;
    (ⅱ) 공통 서열 EILPGX14GX15TKYNX16KFKG(서열 번호 __)(X14는 아미노산 잔기 Ser(S) 또는 Thr(T)을 나타내고, X15는 아미노산 잔기 Ile(I) 또는 Tyr(Y)를 나타내며, X16은 아미노산 잔기 Asp(D) 또는 Glu(E)를 나타냄)를 포함하는 VH-CDR2;
    (ⅲ) 서열 LISYYYAMDY(서열 번호 66)를 포함하는 VH-CDR3;
    (ⅳ) 서열 RASQDISNYLN(서열 번호 67)을 포함하는 VL-CDR1;
    (ⅴ) 서열 YTSRLHS(서열 번호 68)를 포함하는 VL-CDR2; 및
    (ⅵ) 서열 QQGNTLPPT(서열 번호 69)를 포함하는 VL-CDR3
    을 포함하는, 키메라 분자.
  28. 제1항, 제2항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 14, 16 또는 105 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 15, 104 또는 106 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 키메라 분자.
  29. 제28항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 15(12B2 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  30. 제28항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 104(38F6 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  31. 제28항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 106(13C1 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는, 키메라 분자.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하지 않는, 키메라 분자.
  34. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 73, 76, 79, 85 또는 147 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 74, 77, 80, 86 또는 148 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 75, 78, 81, 87 또는 149 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 141, 144, 82, 88 또는 150 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 142, 145, 83, 89 또는 151 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 143, 146, 84, 90 또는 152 중 임의의 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  35. 제1항, 제2항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 17, 18, 19, 21 또는 109 중 임의의 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 107, 108, 20, 22 또는 110 중 임의의 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 키메라 분자.
  36. 제35항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 107(5C4 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  37. 제35항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 108(23C10 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  38. 제35항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 110(37C7 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  39. 제35항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 20(28C2 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  40. 제35항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열 번호 22(9D6 항체)의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  41. 제1항, 제2항 및 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는, 키메라 분자.
  42. 제1항, 제2항 및 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하는, 키메라 분자.
  43. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 91과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 92와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 93과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 94와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 95와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 96과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  44. 제1항, 제2항 및 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 서열 번호 23과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 24(28F4 항체)와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 키메라 분자.
  45. 제44항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa의 베타 아단위의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는, 키메라 분자.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 GPIIb/IIIa에 대한 결합에 대해 피브리노겐과 경쟁하는, 키메라 분자.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는
    (a) 단일 사슬 Fv("scFv");
    (b) 다이아바디(diabody);
    (c) 미니바디(minibody);
    (d) 항체의 폴리펩타이드 사슬;
    (e) F(ab')2; 또는
    (f) F(ab)를 포함하는, 키메라 분자.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 혈소판 기능을 저해하지 않는, 키메라 분자.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 혈소판을 활성화하지 않는, 키메라 분자.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 분자는 혈소판 감소증(thrombocytopenia)을 유도하지 않는, 키메라 분자.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, FVII는 활성화된 FVII("FVIIa")인, 키메라 분자.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, FVII와 상기 XTEN 폴리펩타이드 사이, FVII와 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 사이, 또는 상기 XTEN 폴리펩타이드와 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자 사이의 임의의 링커를 추가로 포함하는, 키메라 분자.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) FVII-(L1)-X-(L2)-Tm;
    (b) FVII-(L1)-Tm-(L2)-X;
    (c) Tm-(L1)-X-(L2)-FVII;
    (d) Tm-(L1)-FVII-(L2)-X;
    (e) X-(L1)-Tm-(L2)-FVII; 및
    (f) X-(L1)-FVII-(L2)-Tm으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함하되, 식 중,
    FVII는 FVIIA이고;
    X는 상기 XTEN 폴리펩타이드이며;
    Tm은 항-GPIIB/IIIA 항체 또는 이의 항원 결합 분자이고;
    L1은 제1 임의의 링커이며,
    L2는 제2 임의의 링커인, 키메라 분자.
  54. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하되,
    (a) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 상기 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, 및 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하거나;
    (b) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 상기 XTEN 폴리펩타이드를 포함하거나;
    (c) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄, 상기 XTEN 폴리펩타이드 및 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 임의의 순서로 포함하고, 상기 제2 사슬은 FVII의 중쇄를 포함하거나;
    (d) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 상기 제2 사슬은 FVII의 중쇄, 상기 XTEN 폴리펩타이드 및 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 임의의 순서로 포함하는, 키메라 분자.
  55. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하되,
    (g) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X 또는 X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (h) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm 또는 Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X 또는 X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (ⅰ) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (j) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (k) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (l) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH의 화학식을 포함하되, 식 중,
    FVIIH는 FVII의 중쇄이고;
    Tm은 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며;
    FVIIL은 FVII의 경쇄이고;
    X는 상기 XTEN 폴리펩타이드인, 키메라 분자.
  56. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    (f) X-FVIIL:FVIIH-Tm;
    (g) Tm-FVIIL:FVIIH-X;
    (h) FVIIL:FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH:FVIIL;
    (ⅰ) FVIIL:FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH:FVIIL;
    (j) FVIIL-X-Tm:FVIIH 또는 FVIIH:Tm-X-FVIIL; 및
    (k) FVIIL-Tm-X:FVIIH 또는 FVIIH:Tm-X-FVIIL로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함하되, 식 중,
    FVIIH는 FVII의 중쇄이고;
    Tm은 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자이며;
    FVIIL은 FVII의 경쇄이고;
    X는 상기 XTEN 폴리펩타이드이며;
    (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합인, 키메라 분자.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 공유 결합 또는 비공유 결합인, 키메라 분자.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 상기 FVII의 중쇄와 경쇄 사이의 공유 결합인, 키메라 분자.
  59. 제58항에 있어서, 상기 공유 결합은 이황화 결합인, 키메라 분자.
  60. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, N 말단으로부터 C 말단으로,
    (a) FVII의 경쇄, 상기 XTEN 폴리펩타이드, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, 및 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자; 또는
    (b) FVII의 경쇄, 상기 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드
    를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 키메라 분자.
  61. 제60항에 있어서, 상기 프로테아제 개열 부위는 세포내 프로세싱 부위인, 키메라 분자.
  62. 제61항에 있어서, 상기 세포내 프로세싱 부위는 프로단백질 전환효소에 의해 프로세싱된, 키메라 분자.
  63. 제62항에 있어서, 상기 프로단백질 전환효소는 PC5, PACE, PC7, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키메라 분자.
  64. 서로 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자로서,
    (e) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하거나;
    (f) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드를 포함하거나;
    (g) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하거나;
    (h) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 경쇄를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 또는 XTEN 폴리펩타이드
    를 포함하는, 키메라 분자.
  65. 제64항에 있어서,
    (e) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-Tm 또는 Tm-FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X 또는 X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (f) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL-X 또는 X-FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (g) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH의 화학식을 포함하거나;
    (h) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIIL의 화학식을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH의 화학식을 포함하되,
    식 중, FVIIH는 상기 FVII의 중쇄이고;
    Tm은 상기 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티이며;
    FVIIL은 상기 FVII의 경쇄이고;
    X는 상기 XTEN 폴리펩타이드인, 키메라 분자.
  66. 제64항에 있어서,
    (e) X-FVIIL:FVIIH-Tm 또는 Tm-FVIIH:FVIIL-X;
    (f) Tm-FVIIL:FVIIH-X 또는 X-FVIIH:FVIIL-Tm;
    (g) FVIIL:FVIIH-X-Tm 또는 Tm-X-FVIIH:FVIIL; 및
    (h) FVIIL:FVIIH-Tm-X 또는 X-Tm-FVIIH:FVIIL로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함하되,
    식 중, FVIIH는 상기 FVII의 중쇄이고;
    Tm은 상기 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티이며;
    FVIIL은 상기 FVII의 경쇄이고;
    X는 상기 XTEN 폴리펩타이드이며;
    (:)은 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합인, 키메라 분자.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 공유 결합 또는 비공유 결합인, 키메라 분자.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 회합은 상기 FVII의 중쇄와 경쇄 사이의 공유 결합인, 키메라 분자.
  69. 제68항에 있어서, 상기 공유 결합은 이황화 결합인, 키메라 분자.
  70. 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 분자로서, N 말단으로부터 C 말단으로,
    (a) FVII의 경쇄, XTEN 폴리펩타이드, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티;
    (b) FVII의 경쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄 및 XTEN 폴리펩타이드;
    (c) FVII의 경쇄, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, XTEN 폴리펩타이드 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티; 또는
    (d) FVII의 경쇄, 프로테아제 개열 부위, FVII의 중쇄, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 및 XTEN 폴리펩타이드
    를 포함하는, 키메라 분자.
  71. 제70항에 있어서, 상기 프로테아제 개열 부위는 세포내 프로세싱 부위인, 키메라 분자.
  72. 제71항에 있어서, 상기 세포내 프로세싱 부위는 프로단백질 전환효소에 의해 프로세싱된, 키메라 분자.
  73. 제72항에 있어서, 상기 프로단백질 전환효소는 PC5, PACE, PC7, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키메라 분자.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 분자, 수용체의 수용체 결합 부분 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된, 키메라 분자.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 비활동 혈소판 또는 활성화된 혈소판에 선택적으로 결합하는, 키메라 분자.
  76. 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 GPIba, GPVI, GPIX, 당단백질 IIb/IIIa("GPIIb/IIIa")의 비활성 형태, GPIIb/IIIa의 활성 형태, P 설렉틴(selectin), GMP-33, LAMP-1, LAMP-2, CD40L, LOX-1 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 선택적으로 결합하는, 키메라 분자.
  77. 제76항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 GPIIb/IIIa 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 분자인, 키메라 분자.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVII의 반감기는 상기 중쇄 및 상기 경쇄로 이루어진 FVIIa와 비교하여 증가된, 키메라 분자.
  79. 제78항에 있어서, 상기 FVII의 반감기는 상기 중쇄 및 상기 경쇄로 이루어진 FVIIa와 비교하여 적어도 약 1.5배, 약 2.0배, 약 2.5배, 약 3.0배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배 또는 약 15배 연장된, 키메라 분자.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVII의 응고 활성은 상기 중쇄 및 상기 경쇄로 이루어진 FVIIa와 같거나 이보다 큰, 키메라 분자.
  81. 제80항에 있어서, 상기 응고 활성은 ROTEM 검정에 의해 측정된, 키메라 분자.
  82. 제81항에 있어서, 상기 응고 활성은 aPTT 검정에 의해 측정된, 키메라 분자.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 폴리펩타이드는 AE 모티프, AG 모티프, AD 모티프, AM 모티프, AQ 모티프, AF 모티프, BC 모티프, BD 모티프, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 키메라 분자.
  84. 제83항에 있어서, 상기 XTEN 폴리펩타이드는 약 42개의 아미노산, 약 72개의 아미노산, 약 108개의 아미노산, 약 144개의 아미노산, 약 180개의 아미노산, 약 216개의 아미노산, 약 252개의 아미노산, 약 288개의 아미노산, 약 324개의 아미노산, 약 360개의 아미노산, 약 396개의 아미노산, 약 432개의 아미노산, 약 468개의 아미노산, 약 504개의 아미노산, 약 540개의 아미노산, 약 576개의 아미노산, 약 612개의 아미노산, 약 624개의 아미노산, 약 648개의 아미노산, 약 684개의 아미노산, 약 720개의 아미노산, 약 756개의 아미노산, 약 792개의 아미노산, 약 828개의 아미노산, 약 836개의 아미노산, 약 864개의 아미노산, 약 875개의 아미노산, 약 912개의 아미노산, 약 923개의 아미노산, 약 948개의 아미노산, 약 1044개의 아미노산, 약 1140개의 아미노산, 약 1236개의 아미노산, 약 1318개의 아미노산, 약 1332개의 아미노산, 약 1428개의 아미노산, 약 1524개의 아미노산, 약 1620개의 아미노산, 약 1716개의 아미노산, 약 1812개의 아미노산, 약 1908개의 아미노산, 약 2004개의 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 키메라 분자.
  85. 제84항에 있어서, 상기 XTEN 폴리펩타이드는 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키메라 분자.
  86. 제85항에 있어서, 상기 XTEN 폴리펩타이드는 서열 번호 224 내지 239, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키메라 분자.
  87. 제54항 내지 제59항, 제64항 내지 제69항 및 제74항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 링커를 추가로 포함하고, 상기 링커는 상기 FVII의 경쇄를 상기 XTEN 폴리펩타이드와 연결시키거나, 상기 FVII의 중쇄를 상기 표적화 모이어티와 연결시키거나, 또는 둘 다인, 키메라 분자.
  88. 제54항 내지 제59항, 제64항 내지 제69항 및 제74항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 링커를 추가로 포함하고, 상기 링커는 상기 FVII의 경쇄를 상기 표적화 모이어티와 연결시키거나, 상기 FVII의 경쇄를 상기 XTEN 폴리펩타이드와 연결시키거나, 또는 둘 다인, 키메라 분자.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 상기 링커는 적어도 약 1개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 20개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 40개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 60개의 아미노산, 약 70개의 아미노산, 약 80개의 아미노산, 약 90개의 아미노산, 약 100개의 아미노산, 약 110개의 아미노산, 약 120개의 아미노산, 약 130개의 아미노산, 약 140개의 아미노산, 약 150개의 아미노산, 약 160개의 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 키메라 분자.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 화학식 [(Gly)x-Sery]z를 갖는 펩타이드를 포함하되, x는 1 내지 4이고, y는 0 또는 1이며, z는 1 내지 50인, 키메라 분자.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVII의 중쇄는 서열 번호 178과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVII의 경쇄는 서열 번호 179과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 192 또는 서열 번호 193에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  94. 제93항에 있어서, 상기 키메라 분자는 서열 번호 192 또는 서열 번호 193에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVII의 중쇄, 상기 FVII의 경쇄, 상기 XTEN 폴리펩타이드, 상기 표적화 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합에 융합된 이종성 모이어티를 추가로 포함하는, 키메라 분자.
  96. 제95항에 있어서, 상기 이종성 모이어티는 폴리펩타이드 모이어티 또는 비폴리펩타이드 모이어티인, 키메라 분자.
  97. 제96항에 있어서, 상기 이종성 모이어티는 FVII의 반감기를 연장시키는, 키메라 분자.
  98. 제97항에 있어서, 상기 이종성 모이어티는 알부민, 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 지방산, Fc, 트랜스페린, PAS, 인간 융모성 고나트로핀의 β 아단위의 C 말단 펩타이드(C-terminal peptide: CTP), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol: PEG), 하이드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch: HES), 알부민 결합 소분자, vWF, 추가의 XTEN 폴리펩타이드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키메라 분자.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 키메라 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  100. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 키메라 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체.
  101. 제54항 내지 제59항, 제64항 내지 제69항 및 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항의 키메라 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체 및 상기 키메라 분자의 제2 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체를 포함하는 일련의 폴리뉴클레오타이드.
  102. 제100항의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체 또는 제101항의 일련의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체를 포함하는 벡터.
  103. 제101항의 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체를 포함하는 제1 벡터 및 제2 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 보체를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 일련의 벡터.
  104. 세포내 프로세싱 부위를 프로세싱하는 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 제102항의 벡터 또는 제103항의 일련의 벡터.
  105. 제102항 또는 제104항의 벡터 또는 제103항 또는 제104항의 일련의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  106. 제105항에 있어서, 상기 세포내 프로세싱 부위를 프로세싱하는 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 숙주 세포.
  107. 숙주 세포를 제102항 또는 제104항의 벡터 또는 제103항 또는 제104항의 일련의 벡터에 의해 형질감염시키는 단계 및 적합한 조건 하에 배지 중에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 키메라 분자의 제조 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 키메라 분자를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 키메라 분자의 제조 방법.
  109. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 제99항의 조성물, 제100항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제101항의 일련의 폴리뉴클레오타이드, 제102항 또는 제104항의 벡터 또는 제103항 또는 제104항의 일련의 벡터, 또는 제105항 또는 제106항의 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 출혈 삽화의 빈도 또는 정도의 감소를 필요로 하는 대상체에서 출혈 삽화의 빈도 또는 정도를 감소시키는 방법.
  110. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 제99항의 조성물, 제100항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제101항의 일련의 폴리뉴클레오타이드, 제102항 또는 제104항의 벡터 또는 제103항 또는 제104항의 일련의 벡터, 또는 제105항 또는 제106항의 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 출혈 삽화의 발생의 예방을 필요로 하는 대상체에서 출혈 삽화의 발생을 예방하는 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 대상체는 VIII 인자("FVIII"), IX 인자("FIX"), 또는 둘 다에 대한 저해제를 발생시키거나, 저해제를 발생시킬 능력을 갖는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 FVIII 또는 FIX에 대한 저해제는 FVIII, FIX, 또는 둘 다에 대한 중화 항체인 방법.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출혈 삽화는 혈액 응고 장애에 의해 야기되는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애는 A형 혈우병 또는 B형 혈우병인 방법.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출혈 삽화는 관절혈종(hemarthrosis), 근육 출혈, 경구 출혈, 출혈증, 근육으로의 출혈증, 경구 출혈증, 외상, 외상 널판근(trauma capitis), 위장관 출혈, 두개 내 출혈증, 복부 내 출혈증, 흉내 출혈증, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두 뒤 공간에서의 출혈, 복막 뒤 공간에서의 출혈, 장요근 초(illiopsoas sheath)에서의 출혈, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래하는 방법.
  116. 제109항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인 방법.
  117. 출혈 삽화의 빈도 또는 정도의 감소, 또는 출혈 삽화의 발생의 감소 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 출혈 삽화의 빈도 또는 정도를 감소시키거나, 출혈 삽화의 발생을 감소 또는 예방하도록 사용하기 위한, 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 제99항의 조성물, 제100항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제101항의 일련의 폴리뉴클레오타이드, 제102항 또는 제104항의 벡터 또는 제103항 또는 제104항의 일련의 벡터, 또는 제105항 또는 제106항의 숙주 세포.
  118. 출혈 삽화의 빈도 또는 정도의 감소, 또는 출혈 삽화의 발생의 감소 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 출혈 삽화의 빈도 또는 정도를 감소시키거나, 출혈 삽화의 발생을 감소 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 제99항의 조성물, 제100항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제101항의 일련의 폴리뉴클레오타이드, 제102항 또는 제104항의 벡터 또는 제103항 또는 제104항의 일련의 벡터, 또는 제105항 또는 제106항의 숙주 세포의 용도.
  119. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 31과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 32와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 33과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 34와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 35와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 36과 적어도 약 60, 70, 80, 90, 또는 95% 동일한 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  120. FVII, XTEN 폴리펩타이드 및 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서,
    (ⅰ) 서열 번호 31의 가변 중쇄 CDR-1(VH-CDR1) 서열;
    (ⅱ) 서열 번호 32의 가변 중쇄 CDR-2(VH-CDR2) 서열;
    (ⅲ) 서열 번호 33의 가변 중쇄 CDR-3(VH-CDR3) 서열;
    (ⅳ) 서열 번호 34의 가변 경쇄 CDR-1(VL-CDR1) 서열;
    (ⅴ) 서열 번호 35의 가변 경쇄 CDR-2(VL-CDR2) 서열; 및
    (ⅵ) 서열 번호 36의 가변 경쇄 CDR-3(VL-CDR3) 서열
    을 포함하는, 키메라 분자.
  121. FVII, XTEN 폴리펩타이드, 및 VH 및 VL을 포함하는 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서, 상기 VH는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
  122. FVII, XTEN 폴리펩타이드, 및 VH 및 VL를 포함하는 항-GPIIb/IIIa 항체 또는 이의 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 분자로서, 상기 VL는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 분자.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160023654A (ko) * 2013-06-28 2016-03-03 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 Xten을 지닌 트롬빈 절단가능한 링커 및 이의 용도

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
LT2814840T (lt) 2012-02-15 2020-02-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii kompozicijos ir jų gavimo ir naudojimo būdai
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
WO2014190305A2 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Anti-gpiib/iiia antibodies or uses thereof
EP3033097B1 (en) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
WO2016208695A1 (ja) * 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体
KR20180020279A (ko) 2015-06-24 2018-02-27 제이씨알 파마 가부시키가이샤 Bdnf를 포함하는 융합 단백질
AU2016301303B2 (en) 2015-08-03 2021-10-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
EP4129327A1 (en) * 2015-08-28 2023-02-08 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
BR112018067458A2 (pt) 2016-03-04 2019-01-02 Abmuno Therapeutics Llc anticorpos para tigit
CN106226535B (zh) * 2016-08-01 2018-03-09 中国科学院广州生物医药与健康研究院 Cd61作为生血内皮细胞标志物的用途
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CN106317226B (zh) 2016-08-19 2017-09-05 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
BR112019009316A2 (pt) 2016-12-26 2019-08-06 Japan Chem Res anticorpo antirreceptor de transferrina humana, proteína de fusão, fragmento de dna, vetor de expressão, célula de mamífero, complexo de composto farmacologicamente ativo e de anticorpo antirreceptor de transferrina humana, usos do anticorpo antirreceptor de transferrina humana e da proteína de fusão, e, métodos para tratamento de um distúrbio do sistema nervoso central e de uma doença do sistema nervoso central que acompanha a doença de pompe, a síndrome de hurler ou a síndrome de hurler-scheie.
CN108727498B (zh) * 2018-04-24 2021-11-26 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
AU2019270184A1 (en) 2018-05-18 2020-11-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia A
CN109486907B (zh) * 2018-12-21 2022-02-11 陕西师范大学 一种可常温运输的环介导等温扩增试剂、制备方法及应用
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
CA3176246A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Arcus Biosciences, Inc. Antibodies to tigit

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010091122A1 (en) * 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
HUE036233T2 (hu) * 2009-12-06 2018-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc VIII-FC Faktor kimérás és hibrid polipeptidek, és ezek használati módszerei
KR20140002601A (ko) * 2010-07-09 2014-01-08 바이오겐 이데크 헤모필리아 인코포레이티드 키메라 응고 인자
EP3527218A1 (en) * 2011-06-10 2019-08-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
US10656167B2 (en) * 2011-07-25 2020-05-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Assays to monitor bleeding disorders

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160023654A (ko) * 2013-06-28 2016-03-03 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 Xten을 지닌 트롬빈 절단가능한 링커 및 이의 용도

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