KR20140002601A - 키메라 응고 인자 - Google Patents

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KR20140002601A
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chimeric
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조 살라스
로버트 피터스
앨런 비톤티
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바이오겐 이데크 헤모필리아 인코포레이티드
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Abstract

치료제를 응고 부위에 국한시키고 (가령, 혈소판에 표적화됨으로써, 또는 응고 부위에서 활성화가능함으로써), 감소된 제거율을 갖거나, 향상된 제조가능성을 갖거나, 감소된 혈전생성을 갖거나, 증강된 활성을 갖거나, 또는 이들 특징 중에서 한 가지 이상을 갖는 키메라 응고 인자가 기술되고, 또한 키메라 응고 인자를 만들기 위한 방법 및 이들 응고 인자를 이용하여 지혈을 개선하기 위한 방법이 기술된다.

Description

키메라 응고 인자{CHIMERIC CLOTTING FACTORS}
관련된 출원
본 특허 출원은 2010년 7월 9일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/363,183호: 2010년 7월 9일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/363,186호; 2011년 2월 11일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/442,029호; 2011년 2월 11일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/442,150호; 2011년 2월 11일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/442,055호; 2011년 3월 25일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/467,880호; 그리고 2011년 5월 31일 제출된 U.S. 특허가출원 제61/491,762호에 우선권을 주장한다. 앞서 언급된 특허가출원의 전체 내용은 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다.
발명의 배경기술
외부 응고 경로의 시작은 혈관 벽에 대한 손상의 결과로서 노출되는 조직 인자, 그리고 인자 VIIa 사이에 복합체의 형성에 의해 매개된다. 이러한 복합체는 이후, 인자 IX와 X를 그들의 활성 형태로 전환시킨다. 인자 Xa는 조직 인자-보유 세포 상에서 제한된 양의 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킨다. 이러한 결과의 트롬빈은 이후, 조직-인자 보유 세포로부터 멀리 확산하고 혈소판, 그리고 인자 V와 VIII를 활성화시켜 인자 Va와 VIIIa를 만들 수 있다. 응고의 확대 기 (propagation phase) 동안, 인자 Xa는 활성화된 혈소판의 표면 상에서 인자 IXa (인자 VIIIa와 복합으로)에 의해 산출된다. 인자 Xa는 보조인자 인자 Va와 복합으로, 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키고 트롬빈 폭발 (thrombin burst)을 발생시킨다. 캐스케이드는 트롬빈에 의한 섬유소원의 섬유소로의 전환에서 정점에 달하고, 이것은 섬유소 덩어리의 형성을 유발한다. 인자 VII와 조직 인자는 혈액 응고의 시작에서 핵심적인 플레이어다.
인자 VII는 혈액 내에서 단일-사슬 치모겐 (zymogen)으로서 순환하는 혈장 당단백질이다. 치모겐은 촉매적으로 비활성이다. 비록 단일-사슬 인자 VII가 시험관내에서 다양한 인자에 의해 2-사슬 인자 VIIa로 전환될 수 있긴 하지만, 인자 Xa는 인자 VII의 중요한 생리학적 활성자이다. 치모겐 인자 VII의 활성화된 2-사슬 분자로의 전환은 아미노산 위치 152에서 아르기닌 잔기 및 아미노산 위치 153에서 Ile 잔기를 연결하는 펩티드 결합의 개열에 의해 발생한다. 조직 인자, 인지질과 칼슘 이온의 존재에서, 2-사슬 인자 VIIa는 인자 X 또는 인자 IX를 활성화시킨다. 인자 VIIa는 TF-보유 세포, 전형적으로 손상된 내피 세포의 표면에서 작용하고, 그리고 초기 량의 트롬빈을 산출함으로써 응고 캐스케이드의 생리학적 기폭약인 것으로 생각되고, 트롬빈은 이후, 혈소판으로 확산하여 이들을 활성화시키고 트롬빈 산출의 확대 기를 위해 이들을 기폭한다. 치료적으로, 재조합 FVIIa는 활성화된 혈소판의 표면 상에서 인자 X를 활성화시키고, 응고의 확대 기 동안 트롬빈 폭발을 발생시키기 위한 FIXa 또는 FVIIIa에 대한 요구를 우회함으로써 작용한다. FVIIa가 혈소판에 대한 상대적으로 낮은 친화성을 갖기 때문에, 재조합 FVIIa는 초-생리학적 수준에서 투약된다. 이러한 과정은 조직 인자-독립성인 것으로 생각된다.
인간 인자 IX는 단일-사슬 당단백질 (mol wt 57,000)로서 순환한다. 이것은 혈장 내에서 치모겐으로서 존재하고, 그리고 칼슘 이온의 존재에서 인자 XIa (활성화된 혈장 트롬보플라스틴 선조)에 의해, 세린 프로테아제, 인자 IXaβ (더욱 통상적으로, FIXa)로 전환된다. 활성화 반응에서, 2개의 내부 펩티드 결합은 인자 IX에서 가수분해된다. 이들 개열은 특정한 아르기닐-알라닌 펩티드 결합 및 특정한 아르기닐-발린 펩티드 결합에서 발생한다. 이것은 전구체 분자의 내부 영역으로부터 활성화 펩티드 (11,000에 대략 동등한 mol wt)의 방출 및 인자 IXaβ (46,000에 대략 동등한 mol wt)의 산출을 유발한다. 인자 IXaβ는 경쇄 (18,000에 대략 동등한 mol wt) 및 중쇄 (28,000에 대략 동등한 mol wt)로 구성되고, 그리고 이들 사슬은 이황화 결합에 의해 서로 묶여진다.
인자 X 역시 Arg-Lys-Arg 트리펩티드에 의해 연결된 경쇄와 중쇄를 내포하는 단일-사슬 폴리펩티드로서 합성된다. 단일-사슬 분자는 이후, 2개 (또는 그 이상의) 내부 펩티드 결합의 개열에 의해 경쇄와 중쇄로 전환된다. 혈장 내에서, 이들 두 사슬은 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 인자 X를 형성한다. 활성화된 인자 X, 인자 Xa는 최종 공통 경로에 참여하고, 여기서 프로트롬빈은 트롬빈으로 전환되고, 이것은 차례로, 섬유소원을 섬유소로 전환시킨다.
응고 인자는 일정한 시간 동안 지혈을 향상시키기 위해 환자에 투여된다. 재조합 DNA 기술의 도래는 응고 장애를 앓는 환자에 대한 치료를 유의미하게 향상시키고, 안전하고 안정된 단백질 치료제의 개발을 가능하게 하였다. 가령, 재조합 활성화된 인자 VII는 대출혈 (major bleeding), 예를 들면, 혈우병 A 또는 B, 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍, 결함성 혈소판 기능, 혈소판 감소증, 또는 폰빌레브란트병을 앓는 환자에서 발생하는 대출혈의 치료에 폭넓게 이용되고 있다. 재조합 인자 IX 역시 치료적으로 유용하다.
비록 이런 재조합 분자가 효과적이긴 하지만, 치료제를 응고 부위에 국한시키거나, 향상된 약물동력학적 성질을 갖거나, 감소된 제거율을 갖거나, 향상된 제조가능성을 갖거나, 감소된 혈전생성을 갖거나, 또는 증강된 활성을 갖거나, 또는 이들 특징 중에서 한 가지 이상을 갖는 향상된 이형이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 증강된 활성을 갖는 키메라 응고 인자에 관계한다. 본 발명은 그 중에서 특히, 키메라 응고 인자를 만들기 위한 방법, 이들 방법을 이용하여 만들어진 키메라 응고 인자, 그리고 이들 응고 인자를 이용하여 지혈을 개선하기 위한 방법을 특징으로 한다. 본 발명의 키메라 응고 인자는 증강된 약물동력학적 성질을 갖거나, 감소된 제거율을 갖거나, 향상된 제조가능성을 갖거나, 감소된 혈전생성을 갖거나, 증강된 활성을 갖거나, 또는 이들 특징 중에서 하나 이상을 갖는다. 한 구체예에서, 본 발명의 향상된 응고 인자는 예로써, 응고 인자를 혈소판에 표적화시킴으로써, 또는 덩어리 형성의 부위에서 활성화되는 활성화가능 형태 (비-자연적으로 발생하는 활성화가능 형태)로 개체 내에 존재함으로써 필요한 경우에 증가된 활성을 갖는다.
한 가지 양상에서, 본 발명은 FVII, FIX와 FX로 구성된 군에서 선택되는 응고 인자 및 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 및 선택적으로, 응고 인자와 표적화 모이어티 사이에 스페이서 모이어티를 포함하는 키메라 응고 인자에 관계한다.
한 구체예에서, 응고 인자는 화학식 A B C로 표시되는 구조를 포함하고, 여기서 A는 응고 인자이고; B는 스페이서 모이어티이고; 그리고 C는 혈소판에 결합하는 적어도 하나의 표적화 모이어티이다.
한 구체예에서, 응고 인자는 A B C; C B A로 구성된 군에서 선택되는 화학식으로 표시되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 구조를 포함한다:
한 구체예에서, 응고 인자는 적어도 하나의 표적화 모이어티가 없는 적절한 대조와 비교하여, 혈소판의 존재에서 트롬빈의 증가된 생산을 나타낸다.
한 구체예에서, 응고 인자는 스카폴드 모이어티, 그리고 선택적으로, 두 번째 스페이서 모이어티를 포함한다.
한 구체예에서, 응고 인자는 D와 E를 더욱 포함하고, 여기서 D는 스페이서 모이어티이고; 그리고 E는 스카폴드 모이어티이고, 그리고 여기서 키메라 응고 인자는 A B C D E; A D E B C; E D A B C; C B A D E; E D C B A; 그리고 C B E D A로 구성된 군에서 선택되는 화학식으로 표시되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 구조를 포함한다.
한 구체예에서, E는 첫 번째 Fc 모이어티, F1 및 두 번째 Fc 모이어티, F2를 포함하는 이합성 Fc 영역이다.
한 구체예에서, 응고 인자는 2개의 Fc 모이어티 사이에 넣어진 개열가능 scFc (cscFc) 링커를 포함하는 폴리펩티드로서 발현되고, 여기서 cscFc 링커는 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 인접하고, 이것은 cscFc 폴리펩티드 링커의 개열을 유발한다.
한 구체예에서, cscFc 링커는 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 인접하고, 이것은 cscFc 링커의 개열을 유발한다.
한 구체예에서, 청구항 9의 키메라 응고 인자, 여기서 적어도 하나의 효소적 개열 부위는 세포내 가공 부위이다.
한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 2개의 효소적 개열 부위에 접하고, 이들은 동일한 또는 상이한 효소에 의해 인식된다.
한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 약 10 내지 약 50개 아미노산의 길이를 갖는다.
한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 약 20 내지 약 30개 아미노산의 길이를 갖는다.
한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 gly/ser 펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, gly/ser 펩티드는 화학식 (Gly4Ser)n, 또는 Ser(Gly4Ser)n을 갖고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9와 10으로 구성된 군에서 선택되는 양의 정수이다. 한 구체예에서, (Gly4 Ser)n 링커는 (Gly4 Ser)6, Ser(Gly4 Ser)6, (Gly4 Ser)4 및 Ser(Gly4 Ser)4로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 응고 인자는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
한 구체예에서, 키메라 응고 인자는 스페이서 모이어티를 거쳐 F1에 연결된 A 및 F2에 연결된 C; 스페이서 모이어티를 거쳐 F1에 연결된 A 및 스페이서 모이어티를 거쳐 F2에 연결된 C; F1에 연결된 A 및 스페이서 모이어티를 거쳐 F2에 연결된 C; 스페이서 모이어티를 거쳐 F1에 연결된 A 및 스페이서 모이어티를 거쳐 F2에 연결된 C로 구성된 군에서 선택되는 구조를 갖는다.
한 구체예에서, 키메라 응고 인자는 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 모이어티 A B F1; A B F1; A B F1; 또는 A B F1 D C를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 모이어티 C F2; C D F2; F2 D C; 또는 F2 D C를 포함하고, 여기서 이들 2개의 폴리펩티드 사슬 Fc 영역을 형성한다.
한 구체예에서, 표적화 모이어티는 Fc 영역의 폴리펩티드 사슬 중에서 적어도 하나에 융합된다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 F1과 F2 중에서 적어도 하나에 직접적으로 융합된다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 스페이서 모이어티를 거쳐 F1과 F2 중에서 적어도 하나에 융합된다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 개열가능 링커를 거쳐 F1과 F2 중에서 적어도 하나에 융합된다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 항체 분자, 항체 분자의 항원 결합 단편, scFv 분자, 수용체의 수용체 결합 부분, 펩티드로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 휴지 혈소판에 결합한다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 활성화된 혈소판에 선별적으로 결합한다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIba, GPVI, 그리고 GPIIb/IIIa의 비활성 형태로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합한다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIIb/IIIa의 활성 형태, P 셀렉틴, GMP-33, LAMP-1, LAMP-2, CD40L, 그리고 LOX-1로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합한다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIb 복합체에 결합한다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 PS4, OS1, 그리고 OS2로 구성된 군에서 선택되는 펩티드이다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 SCE5, MB9, 그리고 AP3으로 구성된 군에서 선택되는 항체로부터 항체 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 응고 인자는 인자 VII이다.
한 구체예에서, 응고 인자는 인자 VII의 높은 특이적 활성 변이체이다. 한 구체예에서, 응고 인자는 인자 IX이다. 한 구체예에서, 응고 인자는 인자 IX의 높은 특이적 활성 변이체이다. 한 구체예에서, 응고 인자는 인자 X이다. 한 구체예에서, 응고 인자는 인자 X의 높은 특이적 활성 변이체이다.
한 구체예에서, 응고 인자는 세포에 의해 활성 형태로 분비된다. 한 구체예에서, 응고 인자는 생체내에서 활성화된다.
한 구체예에서, 키메라 응고 인자는 응고 인자 내에 자연적으로 존재하지 않는 이종성 효소적 개열 부위를 포함한다.
한 구체예에서, 효소적 개열 부위는 응고 인자의 중쇄 모이어티의 아미노 말단에 유전적으로 융합된다.
한 구체예에서, 응고 인자는 키메라 응고 인자의 수력학적 반지름을 증가시키는 단백질 분자인 스카폴드 모이어티를 포함한다. 한 구체예에서, 스카폴드 모이어티는 존재하면, 알부민 및 XTEN®로 구성된 군에서 선택된다.
다른 양상에서, 본 발명은 FVII를 포함하는 폴리펩티드에 관계하고, FVII는 응고 캐스케이드의 성분에 의해 활성화가능한 이종성 효소적 개열 부위를 포함한다.
한 구체예에서, 폴리펩티드는 스카폴드 모이어티, 그리고 선택적으로, 스페이서 모이어티를 포함한다.
한 구체예에서, 스카폴드 모이어티는 첫 번째 Fc 모이어티, F1 및 두 번째 Fc 모이어티, F2를 포함하는 이합성 Fc 영역이다.
한 구체예에서, 응고 인자는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
한 구체예에서, 키메라 응고 인자는 스페이서 모이어티를 거쳐 첫 번째 Fc 모이어티에 연결된 응고 인자; 스페이서 모이어티를 거쳐 두 번째 Fc 모이어티에 연결된 응고 인자; F1에 직접적으로 연결된 응고 인자; 그리고 F2에 직접적으로 연결된 응고 인자로 구성된 군에서 선택되는 구조를 갖는다.
한 구체예에서, 키메라 응고 인자는 표적화 모이어티를 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 키메라 응고 인자는 cscFc 링커를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성된다. 한 구체예에서, cscFc 링커는 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 연결되고 (가령, 직접적으로 연결되거나, 또는 인접하고), 이것은 링커의 개열을 유발한다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 효소적 개열 부위는 세포내 가공 부위이다. 한 구체예에서, cscFc 링커는 2개의 효소적 개열 부위에 접하고, 이들은 동일한 또는 상이한 효소에 의해 인식된다. 한 구체예에서, cscFc 링커는 약 10 내지 약 50개 아미노산의 길이를 갖는다. 한 구체예에서, cscFc 링커는 약 20 내지 약 30개 아미노산의 길이를 갖는다.
한 구체예에서, cscFc 링커는 gly/ser 펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, gly/ser 펩티드는 화학식 (Gly4Ser)n, 또는 Ser(Gly4Ser)n을 갖고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9와 10으로 구성된 군에서 선택되는 양의 정수이다. 한 구체예에서, (Gly4 Ser)n 링커는 (Gly4 Ser)6, Ser(Gly4 Ser)6, (Gly4 Ser)4 및 Ser(Gly4 Ser)4로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 응고 인자는 인자 VII의 높은 특이적 활성 변이체이다. 한 구체예에서, 키메라 응고 인자 내에 존재하는 이종성 효소적 개열 부위는 덩어리 형성의 부위에서 개열된다. 한 구체예에서, 개열 부위는 인자 XIa 개열 부위, 인자 Xa 개열 부위, 그리고 트롬빈 개열 부위로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 효소적 개열 부위는 응고 인자의 중쇄 모이어티의 아미노 말단에 유전적으로 융합된다.
한 구체예에서, 표적화 모이어티는 휴지 혈소판에 결합한다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 활성화된 혈소판에 선별적으로 결합한다.
한 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIba, GPVI, 그리고 GPIIb/IIIa의 비활성 형태로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합한다. 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIIb/IIIa의 활성 형태, P 셀렉틴, GMP-33, LAMP-1, LAMP-2, CD40L, 그리고 LOX-1로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합한다.
한 구체예에서, 스카폴드 모이어티는 키메라 응고 인자의 수력학적 반지름을 증가시키는 단백질 분자이다. 한 구체예에서, 스카폴드 모이어티는 존재하면, 알부민 및 XTEN®로 구성된 군에서 선택된다.
한 가지 양상에서, 본 발명은 A B C; C B A; A B C D E; A D E B C, E D A B C, C B A D E, E D C B A, C B E D A로 구성된 군에서 선택되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 모이어티의 선형 서열에 관계하고, 여기서 A는 활성화가능 응고 인자이고, B는 부재하거나, 또는 링커이고, C는 표적화 모이어티이고, D는 부재하거나, 또는 링커이고, 그리고 E는 스카폴드 모이어티이다.
한 구체예에서, 응고 인자는 응고 인자의 경쇄와 중쇄를 포함하고, 그리고 경쇄와 중쇄 각각은 별개의 폴리펩티드 사슬로서 발현된다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 응고 인자를 인코딩하는 핵산 분자에 관계한다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 벡터 내에 존재한다. 한 구체예에서, 벡터는 효소적 개열 부위 중에서 적어도 하나를 개열하는 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 호스트 세포에 관계한다. 한 구체예에서, 호스트 세포는 세포내 가공 (intracellular processing)을 수행할 수 있는 효소를 발현한다. 한 구체예에서, 효소는 세포에 내인성이다. 한 구체예에서, 효소는 세포에 이종성이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 키메라 응고 인자를 생산하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 배양 동안 호스트 세포를 배양하는 단계, 그리고 배지로부터 키메라 응고 인자를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 가공된 헤테로이합성 폴리펩티드에 관계하고, 상기 가공된 헤테로이합성 폴리펩티드는 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서 벡터를 발현하고, 그리고 배양 배지로부터 성숙 헤테로이합성 폴리펩티드를 분리함에 의해 만들어진다.
한 구체예에서, 본 발명은 키메라 응고 인자 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관계한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관계한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 개체에서 지혈 (hemostasis)을 개선하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
한 가지 양상에서, 본 발명은 응고 인자의 경쇄 모이어티와 중쇄 모이어티, 그리고 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 응고 인자에 관계하고, 여기서 상기 표적화 모이어티는 (i) 혈소판에 특이적으로 결합하고, (ii) 응고 인자의 경쇄와 중쇄 사이에 넣어지지 않고, 그리고 여기서 상기 키메라 응고 인자는 적어도 하나의 표적화 모이어티가 없는 적절한 대조와 비교하여 혈소판의 존재에서 트롬빈의 증가된 산출을 나타낸다.
다른 양상에서, 본 발명은 키메라 응고 인자에 관계하고, 이것은 선형 서열에서 모이어티 A-B-C-D-E를 포함하고, 여기서 A는 응고 인자, 활성화가능 응고 인자, 또는 활성화된 응고 인자이고; B는 부재하거나, 또는 링커이고; C는 표적화 모이어티이고; D는 부재하거나, 또는 링커이고; 그리고 E는 부재하거나, 또는 스카폴드 모이어티이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 키메라 응고 인자에 관계하고, 이것은 ABC; ABCDE; ADEBC, EDABC, CBADE, EDCBA, CBEDA로 구성된 군에서 선택되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 모이어티의 선형 서열을 포함하고, 여기서 A는 응고 인자, 활성화가능 응고 인자 또는 활성화된 응고 인자이고, B는 부재하거나, 또는 링커이고, C는 표적화 모이어티이고, D는 부재하거나, 또는 링커이고, 그리고 E는 스카폴드 모이어티이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 키메라 응고 인자에 관계하고, 이것은 ABF1:F2; ABF1:CDF2; ABF1:F2DC, ABF1DC:F2DC로 구성된 군에서 선택되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 모이어티의 선형 서열을 포함하고, 여기서 A는 응고 인자, 활성화가능 응고 인자 또는 활성화된 응고 인자이고, B는 부재하거나, 또는 링커이고, C는 표적화 모이어티이고, D는 부재하거나, 또는 링커이고, 그리고 F1와 F2는 각각, Fc 모이어티이고, 그리고 :은 2개의 폴리펩티드 사슬의 F1과 F2 사슬에 의해 매개된 이합체화를 나타낸다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 응고 인자의 경쇄 모이어티와 중쇄 모이어티, 그리고 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 응고 인자에 관계하고, 여기서 상기 표적화 모이어티는 혈소판에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 키메라 응고 인자는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이황화 연결된 Fc 영역을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 키메라 응고 인자에 관계한다. 본 발명은 응고 인자의 효능, 약물동력학적 성질, 및/또는 제조가능성을 향상시키기 위한 신규한 방법의 개발에 적어도 부분적으로 기초한다. 한 구체예에서, 본 발명의 향상된 응고 인자는 예로써, 응고 인자를 혈소판에 표적화시킴으로써, 또는 덩어리 형성의 부위에서 활성화되는 활성화가능 형태 (비-자연적으로 발생하는 활성화가능 형태)로 개체 내에 존재함으로써 필요한 경우에 증가된 활성을 갖는다. 이것은 예로써, 응고 인자를 표적으로 함으로써, 또는 이들을 활성화가능 형태로 만듦으로써 달성될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 응고 인자는 응고 부위에 표적화된다. 응고 인자를 휴지 혈소판 또는 활성화된 혈소판으로 표적화시키는 표적화 모이어티를 통합함으로써, 응고 인자의 활성이 증강될 수 있다. 가령, 인자 VII의 경우에, 아마도 내피 세포 표면에서 조직 인자 (TF)에 의해 활성화되어 활성화된 인자 X (FXa)를 산출하는 내인성 FVII와 달리, 외인성 FVIIa는 아마도 TF 독립성 방식으로 FXa/FIXa를 산출하고, 다른 응고 인자가 국한되는 활성화된 혈소판의 표면에서 가장 효과적이다. 하지만, 생리학적으로 FVIIa는 TF-보유 세포, 예를 들면, 내피 세포의 표면에서 작용하고, 그리고 혈소판에 대한 낮은 친화성을 갖는다. 치료적 재조합 FVIIa는 활성화된 혈소판의 표면에서 인자 X를 인자 Xa로 전환시킴으로써 작용하는 것으로 가정되었다. 낮은 혈소판 친화성을 극복하고 출혈을 치료하는데 효과적이기 위하여, 재조합 FVIIa는 초-생리학적 수준에서 투약된다. 이런 이유로, FVIIa의 경우에, 혈소판 표면에 표적화는 이러한 분자의 효능을 유의미하게 증가시킬 수 있다. 비록 다른 응고 인자 (가령, FIX, FVIII, FX)가 혈소판에 대한 더욱 높은 친화성을 갖긴 하지만, 이들 역시 혈소판 표적화 모이어티를 통합함에 의해 증강된 활성을 나타낼 지도 모른다. 이에 더하여, FVIIa는 인간에서 상대적으로 짧은 반감기 (~2.3시간)를 갖는다. 이러한 짧은 반감기는 아마도 출혈을 제어하기 위해 재조합 FVIIa를 여러 번 투약해야 하는 필요성의 원인이 된다. 따라서 응고 인자, 그리고 특히 FVIIa를 혈소판에 표적화시키는 것은 효능을 향상시킨다.
표적화 모이어티는 키메라 응고 인자 내에 다수의 장소에 배치될 수 있다. 표적화된 키메라 응고 인자의 예시적인 구조는 예로써, 도 1-4, 7, 8, 17, 19, 21, 44, 46, 49, 51, 그리고 53에서 설명된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 응고의 부위에서 활성화가능한 형태로 만들어진다. 혈관우회 수술 (bypass therapy)에서 이용의 경우에, 외인성 응고 인자는 활성화된 형태로 제공될 때에만 유효하다. 하지만, 이런 활성화된 응고 인자는 내인성 경로 (가령, 항트롬빈 III, TFPI)에 의해 급속하게 비활성화되어, 활성 형태의 제거 및 짧은 효과 반감기로 귀결된다. 더욱 높은 용량을 제공하는 것은 이러한 문제점을 해결하지 못하는데, 그 이유는 이것이 혈전형성 효과 (thrombogenic effect)를 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명은 응고 인자 내에 정상적으로 존재하지 않는 이종성 효소적 개열 부위를 포함하는 "활성화가능" 키메라 응고 인자 구조체에 관계한다. 이들 분자는 증강된 치모겐으로서 순환하고, 그리고 투약 시에 비활성화의 없음으로 인해 더욱 긴 반감기를 갖지만, 효소에 의한 개열로 응고 부위에서 용이하게 활성화될 수 있다. 한 구체예에서, 이런 이종성 효소적 개열 부위는 응고 캐스케이드 동안 생산된 효소에 대한 것이다. 가령, 한 구체예에서, 활성화가능 구조체의 이종성 개열 부위는 인자 XIa, Xa, 또는 트롬빈 개열 부위를 포함한다. 예시적인 FXIa 개열 부위에는 예로써, TQSFNDFTR과 SVSQTSKLTR이 포함된다. 예시적인 트롬빈 개열 부위에는 예로써, DFLAEGGGVR, TTKIKPR, 그리고 ALRPR이 포함된다. 한 구체예에서, 이종성 개열 부위는 응고 인자의 경쇄와 중쇄 사이에 넣어진다. 다른 구체예에서, 이종성 개열 부위는 응고 인자의 두 사슬 사이에 넣어지지 않는다. 한 구체예에서, 이종성 개열 부위는 응고 인자의 중쇄의 아미노 말단이다.
개열가능 링커 내에 존재하는 이종성 개열 부위는 키메라 응고 인자 내에 다수의 장소에 배치될 수 있다. 활성화가능 키메라 응고 인자의 예시적인 구조는 예로써, 도 5, 6, 9, 29, 27, 31, 그리고 41에서 설명된다. 예시적인 이런 구조체는 덩어리 형성의 존재에서 활성화되고 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 예로써, 분자의 수력학적 반지름을 향상시키기 위한 스카폴드를 포함한다. 가령, 본 발명의 키메라 응고 인자는 융합 단백질일 수 있다. 예시적인 스카폴드에는 예로써, FcRn 결합 모이어티 (가령, 완전한 Fc 영역 또는 FcRn에 결합하는 이의 일부분), 단일 사슬 Fc 영역 (예로써, US 2008/0260738, WO 2008/012543, 또는 WO 2008/1439545에서 기술된 바와 같은 ScFc 영역), 개열가능 scFc 영역 (본 명세서에서 기술된 바와 같은 cscFc 영역을 포함), 덜 복잡한 단백질 또는 이의 일부분, 예를 들면, XTen 폴리펩티드®, 또는 알부민이 포함된다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 Fc 영역 또는 이의 FcRn 결합 부분을 스카폴드 모이어티로서 이용한다. 한 구체예에서, 키메라 응고 인자가 융합되는 Fc 모이어티는 자연적으로 발생하는 (또는 야생형 (WT)) Fc 모이어티이다. 다른 구체예에서, Fc 모이어티는 서열 내에 하나 이상의 변이를 포함한다.
다른 구체예에서, Fc 모이어티는 scFc 모이어티 (가령, 비-개열가능 또는 cscFc 링커를 포함)이다. cscFc 링커를 포함하는 구조체에서, 가공되지 않은 분자는 개열가능 단일 사슬 Fc 영역을 포함하고, 여기서 성분 Fc 모이어티들은 단일 폴리펩티드 사슬에서 유전적으로-융합되어 기능적 단일 사슬, 이합성 Fc 영역을 형성한다. cscFc 링커는 폴리펩티드의 이합성 Fc 영역을 포함하는 Fc 모이어티들을 나란히 연결할 수 있고, 또는 하나의 Fc 모이어티를 구조체의 비-Fc 모이어티, 예를 들면, 응고 인자 또는 표적화 모이어티에 연결할 수 있고, 이것은 차례로, 두 번째 Fc 모이어티에 연결된다. cscFc 링커는 scFc 영역을 포함하는 Fc 모이어티들 사이에 넣어지고 적어도 하나의 효소적 개열 부위, 예를 들면, 세포내 효소적 가공 부위에 접한다. 한 구체예에서, scFc 링커는 2개의 효소적 개열 부위에 접하고, 따라서 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질이 세포 내에서 가공될 때 상기 링커 (가령, 링커의 전체 또는 실질적으로 전체)는 제거된다. 다른 구체예에서, scFc 링커는 폴리펩티드가 세포에 의해 분비된 이후 시험관내에서 링커의 제거를 가능하게 하는 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 인접하거나, 또는 구조체가 개체에 투여된 이후 생체내에서 링커의 개열을 가능하게 하는 적어도 하나의 효소적 개열 부위를 포함한다. 따라서 한 구체예에서, 비록 이런 폴리펩티드가 가공되지 않은 형태로 인접하는 뉴클레오티드 서열의 일부로서 단일 개방 해독 틀 (open reading frame, ORF)에 인코딩된 scFc 영역(들)을 포함하긴 하지만, cscFc 링커가 효소적으로 개열되어 (가령, 투여에 앞서 또는 투여후 생체내에서), 단일 아미노산 사슬 내에 융합되지 않은 Fc 영역을 포함하는 헤테로이합성 분자인 폴리펩티드가 산출된다, 다시 말하면, 결과의 가공된 구조체는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 Fc 영역을 갖는다. 이런 구체예에서, 링커의 전체 또는 실질적으로 전체가 제거되고, 반면 일부 구체예에서, 개열 부위의 일부분, 예를 들면, RRRR 개열 부위의 4개 아르기닌이 남아있을 수 있다.
한 구체예에서, scFc 링커는 개열을 위해 2개의 가공 부위에 접한다. 이들 2개의 가공 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 가공 부위는 아르기닌 kex2/푸린 효소에 의해 인식되는 기본 아미노산 잔기의 클러스터이다. 이런 효소는 아르기닌 잔기의 바로 C-말단을 개열한다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 개열 부위는 생체내에서 개열될 수 있는 부위, 예를 들면, 트롬빈에 의해 인식되는 개열 부위이다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 csFc 링커를 포함하는 scFc 분자의 배경에서 활성화된 형태로 제조된다. 가령, 인자 VII는 일반적으로, 치모겐으로서 재조합 방식으로 생산되고, 그리고 투여를 위한 활성 형태를 생산하기 위해 제조 동안 활성화를 필요로 한다. 한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 세포로부터 분비되고, 여기서 상기 키메라 응고 인자는 제조가능성을 향상시키기 위해 활성 형태로 발현된다. 하기에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 이런 응고 인자는 단일 사슬 Fc 영역을 분자 내로 통합함으로써 생산될 수 있다. 단일 사슬 Fc 영역은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 Fc 모이어티의 이합체화에 의해 형성된다. 한 구체예에서, 이런 구조체는 적어도 하나의 세포내 가공 부위에 인접하는 scFc의 2개의 Fc 모이어티를 연결하는 scFc 폴리펩티드 링커를 포함한다. 이런 구조체의 개열은 분비 경로에서 후기까지, 예를 들면, 상기 단백질이 트랜스-골지체 (trans-Golgi apparatus) 내에서 활성 가공 효소와 공동-국한될 때까지 지연된다.
한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 구조체를 발현하는 세포는 하나 이상의 가공 부위에서 scFc 링커를 개열하여 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이합성 분자를 산출하는 효소를 내인성으로 발현한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 구조체를 발현하는 세포는 하나 이상의 가공 부위에서 scFc 링커를 개열하는 효소를 외인성으로 발현한다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 최적화된 구조체를 산출하기 위해 이들 특징 중에서 2가지 이상을 합동할 수 있고, 예를 들면, 활성화가능 융합 단백질 구조체를 휴지 혈소판에 표적화시킬 수 있고, 따라서 이것은 활성 응고의 부위에서 효율적으로 및 더욱 높은 국소 농도에서 활성화될 수 있다. 예시적인 이런 조합 구조체는 표적화될 뿐만 아니라 증강된 가공을 위한 scFc 링커를 포함하는 키메라 응고 인자를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 구조체는 표적화되고 활성화가능하다.
본 발명의 예시적인 구조체는 첨부된 도면 및 서열 목록에서 설명된다. 한 구체예에서, 본 발명은 이들 도면에서 설명된 구조를 갖는 폴리펩티드에 관계한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 첨부된 서열 목록에서 설명된 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이런 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관계한다. 한 구체예에서, 본 발명은 첨부된 서열 목록에서 설명된 서열을 갖는 폴리펩티드의 성숙 형태에 관계한다. 이들 구조체 및 이들을 인코딩하는 핵산 분자는 개체에서 지혈을 향상시키는데 이용될 수 있을 것으로 이해될 것이다.
명세서와 청구항의 명확한 이해를 제공하기 위해, 다음의 정의가 하기에 제공된다.
I. 정의
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 2개 이상의 자연 아미노산 또는 비-자연 아미노산의 중합체를 지칭한다.
용어 "아미노산"은 알라닌 (Ala 또는 A); 아르기닌 (Arg 또는 R); 아스파라긴 (Asn 또는 N); 아스파르트산 (Asp 또는 D); 시스테인 (Cys 또는 C); 글루타민 (Gln 또는 Q); 글루타민산 (Glu 또는 E); 글리신 (Gly 또는 G); 히스티딘 (His 또는 H); 이소류신 (Ile 또는 I): 류신 (Leu 또는 L); 리신 (Lys 또는 K); 메티오닌 (Met 또는 M); 페닐알라닌 (Phe 또는 F); 프롤린 (Pro 또는 P); 세린 (Ser 또는 S); 트레오닌 (Thr 또는 T); 트립토판 (Trp 또는 W); 티로신 (Tyr 또는 Y); 그리고 발린 (Val 또는 V)을 포함한다. 비-전통적인 아미노산 역시 본 발명의 범주 내에 있고, 여기에는 노르류신, 오미틴, 노르발린, 호모세린, 그리고 Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)에서 기술된 것과 같은 기타 아미노산 잔기 유사체가 포함된다. 이런 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 생성시키기 위해, Noren et al. Science 244:182 (1989) 및 Ellman et al., (상기 참조)의 절차가 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 이들 절차는 억제자 tRNA를 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화시키고, 그 이후에 시험관내에서 RNA를 전사 및 해독하는 것을 수반한다. 비-전통적 아미노산의 도입은 또한, 당분야에 공지된 펩티드 화학을 사용하여 달성될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "극성 아미노산"은 순 영 전하를 갖지만, 그들의 측쇄 (가령, M, F, W, S, Y, N, Q, C)의 상이한 부분에서 비-영 부분 전하를 갖는 아미노산을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호 작용 및 정전기적 상호작용에 참여할 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "하전된 아미노산"은 그들의 측쇄 (가령, R, K, H, E, D) 상에서 비-영 순전하를 가질 수 있는 아미노산을 포함한다. 이들 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용에 참여할 수 있다.
"아미노산 치환"은 미리 결정된 아미노산 서열 (출발 폴리펩티드의 아미노산 서열)에서 적어도 하나의 기존의 아미노산 잔기를 제2의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. "아미노산 삽입"은 미리 결정된 아미노산 서열 내로 적어도 하나의 추가의 아미노산을 통합하는 것을 지칭한다. 삽입은 통상적으로 1 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 구성되지만, 본 발명의 더욱 큰 "펩티드 삽입", 예를 들면, 약 3 내지 5개 또는 약 10, 15 또는 20개까지의 아미노산 잔기의 삽입이 이루어질 수 있다. 삽입된 잔기(들)는 전술한 바와 같이 자연적으로 발생하거나, 비-자연적으로 발생할 수 있다. "아미노산 결실"은 미리 결정된 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기를 제거를 지칭한다.
폴리펩티드는 단위체 또는 다합체일 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명의 단백질은 이합체이다. 본 발명의 이합성 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하거나, 또는 1개의 폴리펩티드 사슬 (가령, scFc 분자의 경우에)로 구성될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 이합체는 2개의 동일한 단위성 아단위 또는 폴리펩티드 (가령, 2개의 동일한 Fc 모이어티 또는 2개의 동일한 생물학적 활성 모이어티)를 포함하는 동종이합체이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 이합체는 2개의 비-동일한 단위성 아단위 또는 폴리펩티드 (가령, 2개의 상이한 응고 인자 또는 이의 일부분 또는 1개의 응고 인자 단독)를 포함하는 헤테로이합체이다. 예로써, 본 발명에 참고문헌으로서 편입되는 U.S. 특허 번호 7404956을 참조한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 링커"는 폴리펩티드 사슬의 선형 아미노산 서열 내에서 2개의 도메인을 연결하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 (가령, 합성 펩티드 또는 폴리펩티드 서열)을 지칭한다. 한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 구조체를 구성하는 2개의 Fc 모이어티를 직접적으로 또는 간접적으로 연결하는 폴리펩티드 링커를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 이들 링커는 본 명세서에서, "scFc 링커"로서 지칭되고, 그리고 이들 scFc 링커는 이를 포함하는 폴리펩티드의 2개의 Fc 모이어티 사이에 넣어진다. 만약 scFc 링커가 선형 폴리펩티드 서열 내에서 2개의 Fc 모이어티를 인접하게 연결하면, 이것은 "직접적인" 연쇄이다. 대조적으로, scFc 링커는 첫 번째 Fc 모이어티를 결합 모이어티에 연결할 수 있고, 이것은 차례로, 두 번째 Fc 모이어티에 연결되어 간접적인 연쇄를 형성한다. 이들 scFc 링커는 단일 사슬 유전자 구조체의 형성을 허용한다. 한 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 또한, 개열가능 scFc 링커 (cscFc 링커)를 발생시키고, 그리고 한 구체예에서, 실질적으로 제거되는 (가령, 세포에 의한 가공 동안) 효소적 개열 부위를 포함한다. 따라서 결과의 가공된 폴리펩티드는 적어도 2개의 아미노산 사슬을 포함하고 외부 링커 아미노산 서열이 실질적으로 없는 이합성 분자이다. 일부 구체예에서, 링커의 전체 또는 실질적으로 전체가 제거되고, 반면 일부 구체예에서, 개열 부위의 일부분, 예를 들면, RRRR 개열 부위의 4개 아르기닌이 남아있을 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 "스페이서"로서 지칭되는 다른 유형의 폴리펩티드 링커가 폴리펩티드 상에서 상이한 모이어티, 예를 들면, 응고 인자 또는 표적화 모이어티를 Fc 모이어티에 연결하는데 이용될 수도 있다. 이러한 유형의 링커는 폴리펩티드 분자에 유연성을 제공할 수 있다. 스페이서는 전형적으로 개열되지 않는다; 하지만 일정한 구체예에서, 이런 개열이 바람직할 지도 모른다. 스페이서의 예시적인 위치는 첨부된 도면에서 도시된다. 스페이서는 응고 인자, 표적화 모이어티, 및/또는 스카폴드 사이에, 예를 들면, 이들 모이어티의 N 또는 C 말단에서 위치될 수 있다. 한 구체예에서, 이들 링커는 가공 동안 제거되지 않는다.
본 발명의 키메라 응고 인자 내에 존재할 수 있는 세 번째 유형의 링커는 본 명세서에서 "개열가능 링커"로서 지칭되고, 이것은 이종성 개열 부위 (가령, 인자 XIa, Xa, 또는 트롬빈 개열 부위)를 포함하고, 그리고 개열 부위의 N 말단 또는 C 말단 중에서 어느 한쪽 또는 양쪽에서 추가의 스페이서 링커를 포함할 수 있다. 이런 부위에 대한 예시적인 위치는 첨부된 도면에서 도시되고, 예로써 표적화 모이어티에 인접한 배치를 포함한다. 다른 구체예에서, 이런 링커는 응고 인자 또는 이의 일부분에 인접할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 개열가능 링커는 응고 인자의 활성화가능 형태를 만들기 위해 응고 인자의 중쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 이런 경우에, 개열가능 링커는 개열 부위의 N 말단에서 추가의 스페이서 링커를 포함할 수도 있지만, 개열 부위의 C-말단에서 응고 인자의 중쇄의 아미노 말단에 직접적인 융합을 요구한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "gly-ser 폴리펩티드 링커"는 글리신과 세린 잔기로 구성되는 펩티드를 지칭한다. 예시적인 gly/ser 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 (Gly4 Ser)n. (SEQ ID NO:4)을 포함한다. 다른 예시적인 gly/ser 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 S(Gly4 Ser)n을 포함한다.
한 구체예에서, n=1이다. 한 구체예에서, n=2이다. 다른 구체예에서, n=3, 다시 말하면, (Gly4 Ser)3이다. 다른 구체예에서, n=4, 다시 말하면, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO:6)이다. 다른 구체예에서, n=5이다. 또 다른 구체예에서, n=6이다. 다른 구체예에서, n=7이다. 또 다른 구체예에서, n=8이다. 다른 구체예에서, n=9이다. 또 다른 구체예에서, n=10이다. 다른 예시적인 gly/ser 폴리펩티드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n (SEQ ID NO:26)을 포함한다. 한 구체예에서, n=1이다. 한 구체예에서, n=2이다. 바람직한 구체예에서, n=3이다. 다른 구체예에서, n=4이다. 다른 구체예에서, n=5이다. 또 다른 구체예에서, n=6이다.
지정된 폴리펩티드 또는 단백질"로부터 유래된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 기원을 지칭한다. 바람직하게는, 특정한 서열로부터 유래된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 상기 서열, 또는 이의 일부분과 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 여기서 상기 일부분은 적어도 10-20개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 20-30개의 아미노산, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 30-50개의 아미노산으로 구성되거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 상기 서열 내에서 기원을 갖는 것으로 당업자에게 확인될 수 있는 것이다.
다른 펩티드로부터 유래된 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드에 비해서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들면, 다른 아미노산 잔기로 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 이런 변이체는 반드시 출발 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 변이체는 예로써, 변이체 분자의 길이에 걸쳐서 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만, 더욱 바람직하게는 약 80% 내지 100% 미만, 더욱 바람직하게는 약 85% 내지 100% 미만, 더욱 바람직하게는 약 90% 내지 100% 미만 (가령, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 및 가장 바람직하게는, 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 한 구체예에서, 출발 폴리펩티드 서열과 이로부터 유래된 서열 사이에 1개의 아미노산 차이가 있다. 이러한 서열에 관한 동일성 또는 유사성은 본 명세서에서, 최대 퍼센트 서열 동일성이 달성되도록 서열을 정렬하고 필요한 경우, 갭 (gap)을 도입한 이후, 출발 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 (즉, 동일한 잔기)의 백분율로서 정의된다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 인간 단백질 서열로부터 유래된 아미노산 서열 (가령, 적어도 하나의 응고 인자 또는 Fc 모이어티 또는 도메인)을 포함한다. 하지만 폴리펩티드는 다른 포유동물 종으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 가령, 응고 인자, Fc 도메인 또는 표적화 모이어티가 비-인간 종으로부터 유래되고 대상 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 대안으로, 비-인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 내에 존재할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 면역원성이 아니다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 그들이 고유 폴리펩티드의 바람직한 활성을 유지하면서 그들이 유래된 자연적으로 발생하거나 고유인 폴리펩티드와 아미노산 서열에서 달라지도록 변화될 수 있음은 당업자에 의해 이해될 수 있을 것이다. 가령, "비-필수" 아미노산 잔기에서 보존적 치환 또는 변화를 유도하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 면역글로불린 (가령, Fc 도메인, 모이어티, 또는 항원 결합 부위)로부터 유래된 폴리펩티드의 비-자연 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 인코딩된 단백질 내로 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열 내로 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 도입함으로써 발생될 수 있다. 돌연변이는 특정 부위 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기에서, 예를 들면, 필수 또는 비-필수 아미노산 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 대체되는 것이다. 염기성 측쇄 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 비하전된 극성 측쇄 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯하여, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 집단은 당분야에서 정의되어 있다. 따라서 폴리펩티드 내에서 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 집단으로부터 유래하는 다른 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 다른 구체예에서, 아미노산의 단선 (string)은 측쇄 집단 구성원의 순서 및/또는 조성에서 상이한 구조적으로 유사한 단선에 의해 대체될 수 있다. 대안으로, 다른 구체예에서, 돌연변이는 예로써, 포화 돌연변이유발에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 그리고 생성된 돌연변이체는 본 발명의 폴리펩티드 내로 통합되고 원하는 표적에 결합하는 그들의 능력에 대해서 스크리닝될 수 있다.
폴리펩티드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 폴리펩티드에서 아미노에서 카르복실 말단 방향으로 아미노산의 순서이며, 여기서 서열 내에 서로에 이웃하는 잔기는 폴리펩티드의 일차 구조에서 인접한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 펩티드 결합 (가령, 유전자 융합), 화학적 접합 또는 다른 수단을 통한 연쇄를 지칭한다. 가령, 분자 또는 모이어티가 연결될 수 있는 한 가지 방법은 펩티드 결합을 통해 분자 또는 모이어티를 연결하는 폴리펩티드 링커를 이용한다. 용어 "유전적으로 융합된", "유전적으로 연결된" 또는 "유전적 융합"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 2개 이상의 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편이 이들 단백질, 폴리펩티드 또는 단편을 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현을 통해서, 그들의 개별적인 펩티드 주쇄를 거쳐 공동-선형 (co-linear), 공유 연쇄 또는 부착하는 것을 지칭한다. 이런 유전자 융합은 단일의 인접한 유전자 서열의 발현을 제공한다. 바람직한 유전자 융합은 프레임 내에서 이루어진다, 다시 말하면, 2개 이상의 개방 해독 틀 (ORF)은 원래 ORF의 정확한 해독 틀을 유지하는 방식으로 융합되어 연속적인 더욱 긴 ORF를 형성한다. 따라서 생성된 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 단백질 절편 (이들 절편은 통상적으로 자연 상태에서 그렇게 연결되지 않는다)을 내포하는 단일 폴리펩티드이다. 본 발명의 경우에, 단일 폴리펩티드는 가공 동안 개열되어 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이합성 분자가 산출된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 고유 면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는, 다시 말하면, 이의 2개 중쇄의 개별 Fc 도메인의 이합성 결합에 의해 형성되는 폴리펩티드의 일부분으로서 정의된다. 고유 Fc 영역은 동종이합성이고 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 대조적으로, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "유전적으로-융합된 Fc 영역" 또는 "단일-사슬 Fc 영역" (scFc 영역)은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 유전적으로 연결된 (즉, 단일의 인접한 유전자 서열에 인코딩된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이합성 Fc 영역을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 파파인 개열 부위 (즉, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기를 114로 하여 IgG 내의 잔기 216) 직상류의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C-말단에서 종료하는 단일 면역글로불린 중쇄의 일부분을 지칭한다. 따라서 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인 부분" 또는 "Fc 모이어티"는 Fc 도메인의 또는 Fc 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 구체예에서, Fc 모이어티는 힌지 (가령, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 또는 이들의 변이체, 일부분 또는 단편 중의 적어도 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 모이어티는 완전한 Fc 도메인 (즉, 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인)을 포함한다. 한 구체예에서, Fc 모이어티는 CH3 도메인 (또는 이의 일부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 이의 일부분)을 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 모이어티는 CH3 도메인 (또는 이의 일부분)에 융합된 CH2 도메인 (또는 이의 일부분)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, Fc 모이어티는 CH3 도메인 또는 이의 일부분으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, Fc 모이어티는 힌지 도메인 (또는 이의 일부분) 및 CH3 도메인 (또는 이의 일부분)으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, Fc 모이어티는 CH2 도메인 (또는 이의 일부분) 및 CH3 도메인으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, Fc 모이어티는 힌지 도메인 (또는 이의 일부분) 및 CH2 도메인 (또는 이의 일부분)으로 구성된다. 한 구체예에서, Fc 모이어티는 CH2 도메인의 적어도 일부분 (가령, CH2 영역의 전부 또는 일부)을 결여한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "반감기"는 생체내에서 특정 폴리펩티드의 생물학적 반감기를 지칭한다. 반감기는 개체에 투여된 양의 절반이 순환 및/또는 동물 내의 다른 조직으로부터 청소되도록 하는데 필요한 시간으로 나타낼 수 있다. 소정의 폴리펩티드의 청소 곡선이 시간의 함수로서 작성되는 경우에, 곡선은 통상적으로 급속한 α-상 및 더욱 긴 β-상을 갖는 이상성 (biphasic)이다. α-상은 전형적으로 혈관내와 혈관외 공간 사이에서 투여된 Fc 폴리펩티드의 평형을 나타내며, 부분적으로 폴리펩티드의 크기에 의해 결정된다. β-상은 전형적으로, 혈관내 공간에서 폴리펩티드의 이화작용을 나타낸다. 따라서 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 이용된 용어 반감기는 β-상에서 폴리펩티드의 반감기를 지칭한다. 인간에서 인간 항체의 전형적인 β상 반감기는 21일이다.
본 명세서에서, 용어 "모이어티"는 키메라 폴리펩티드의 성분 일부 또는 구성물을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "표적화 모이어티"는 본 발명의 폴리펩티드를 원하는 부위 또는 세포로 국한시키거나 지향시키는 폴리펩티드의 분자, 이의 단편 또는 성분을 지칭한다. 한 구체예에서, 본 발명의 구조체는 예로써, 분자를 원하는 부위로 국한시킴으로써 폴리펩티드의 활성을 증강시키는 "표적화 모이어티"를 포함한다. 이런 모이어티는 예로써, 항체 또는 이의 변이체 (가령, 그리고 scFv) 또는 펩티드일 수 있다. 다른 구체예에서, 이런 표적화 모이어티는 본 발명의 폴리펩티드에 연결되고 예로써, 세포 또는 조직 상에서 원하는 표적에 결합하는 폴리펩티드, 리간드의 수용체 결합 부분, 또는 수용체의 리간드 결합 부분일 수 있다. 표적화 모이어티는 구조체에 유전적으로 융합되거나, 구조체에 화학적으로 접합되거나, 또는 스페이서를 거쳐 구조체에 연결될 수 있다. 가령, 표적화 모이어티는 표적화 모이어티 및 구조체의 Fc 모이어티 사이에 결합의 형성에 의해 본 발명의 구조체에 부착될 수 있고, 여기서 표적화 모이어티는 첫 번째 기능기를 포함하고, 그리고 Fc 모이어티는 두 번째 기능기를 포함하고, 그리고 여기서 첫 번째와 두 번째 기능기는 서로 반응하여 화학적 결합을 형성할 수 있다 (예로써, U.S. 특허 번호 7381408을 참조한다). 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 혈소판에 결합한다. 예시적인 표적화 모이어티는 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
한 구체예에서, 본 발명의 구조체에서 이용을 위한 표적화 모이어티는 항체 변이체를 포함한다. 용어 "항체 변이체" 또는 "변형된 항체"는 자연적으로 발생하지 않고, 그리고 본 명세서에서 기술된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 또는 아미노산 변형에 의해 자연적으로-유래된 항체와 상이한 아미노산 서열 또는 아미노산 측쇄 화학을 갖는 항체를 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체 변이체"는 자연적으로 발생하도록 변경된 항체의 합성 형태, 예를 들면, 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하지만 2개의 완전한 중쇄를 포함하지 않는 항체 (가령, 도메인 결실된 항체 또는 미니바디); 2개 이상의 상이한 항원 또는 단일 항원 상에서 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 항체의 다중특이적 형태 (가령, 이중특이적, 삼중특이적 등); scFv 분자에 연결된 중쇄 분자; 단일-사슬 항체; 디아바디; 트리아바디; 그리고 변경된 효과기 기능 (effector function)을 등을 갖는 항체가 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "scFv 분자"는 1개의 경쇄 가변 도메인 (VL) 또는 이의 일부분, 그리고 1개의 중쇄 가변 도메인 (VH) 또는 이의 일부분으로 구성되는 결합 분자를 포함하고, 여기서 각 가변 도메인 (또는 이의 일부분)은 동일한 또는 상이한 항체로부터 유래된다. scFv 분자는 바람직하게는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 넣어진 scFv 링커를 포함한다. ScFv 분자는 당분야에 공지되어 있고, 예로써 US 특허 번호 5,892,019, Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837에서 기술된다.
본 명세서에서, "scFv 링커"는 scFv의 VL과 VH 도메인 사이에 넣어진 모이어티를 지칭한다. scFv 링커는 바람직하게는, scFv 분자를 항원 결합 입체형태에 유지시킨다. 한 구체예에서, scFv 링커는 scFv 링커 펩티드를 포함하거나, 또는 scFv 링커 펩티드로 구성된다. 일정한 구체예에서, scFv 링커 펩티드는 gly-ser 폴리펩티드 링커를 포함하거나, 또는 gly-ser 폴리펩티드 링커로 구성된다. 다른 구체예에서, scFv 링커는 이황화 결합을 포함한다.
용어 "당화"는 폴리펩티드에 하나 이상의 탄수화물의 공유 연결을 지칭한다. 전형적으로, 당화는 세포의 세포내 환경 또는 이로부터 추출물 내에서 발생할 수 있는 번역후 사건 (posttranslational event)이다. 용어 당화는 예로써, N-연결된 당화 (여기서 하나 이상의 당이 아스파라긴 잔기에 연결된다) 및/또는 O-연결된 당화 (여기서 하나 이상의 당이 히드록실 기를 갖는 아미노산 잔기 (가령, 세린 또는 트레오닌)에 연결된다)를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 분자는 당화된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 분자는 비당화된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 분자는 야생형 Fc 영역에서 당화와 비교하여 감소된 당화를 갖는다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 이황화 결합을 형성할 수 있거나, 또는 두 번째 티올 기와 가교를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연적으로 발생하는 IgG 분자에서, CH1과 CL 영역은 고유 이황화 결합에 의해 연결되고, 그리고 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 이용하여 239와 242에 상응하는 위치 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 고유 이황화 결합에 의해 연결된다.
본 명세서에서, 용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 원하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하고 이를 발현시키기 위한 운반제로서 본 발명에 따라 이용되는 벡터를 의미하도록 이용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이런 벡터는 플라스미드, 파아지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성되는 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 조화성인 벡터는 선별 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위, 그리고 진핵 또는 원핵 세포에 들어가고 및/또는 복제하는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 키메라 응고 인자를 생산하기 위해, 다수의 발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 가령, 벡터의 한 가지 부류는 소 유두종 바이러스 (bovine papilloma virus), 폴리오마 (polyoma) 바이러스, 아데노바이러스, 우두 (vaccinia) 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 이용한다. 추가적으로, DNA를 그들의 염색체 내에 함입시킨 세포는 형질감염된 호스트 세포의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는 영양요구성 호스트에 자가 영양, 살생물제 (가령, 항생제)에 대한 내성, 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 발현되는 DNA 서열에 직접 연결되거나, 또는 공동형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 한 구체예에서, 유도성 발현 시스템이 이용될 수 있다. mRNA의 최적 합성을 위해서 추가의 요소가 필요할 수도 있다. 이들 요소는 신호 서열, 스플라이스 (splice) 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 (enhancer) 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 분비 신호, 예를 들면, 몇몇 충분히 특정화된 세균성 리더 (leader) 펩티드 (가령, pelB, phoA, 또는 ompA) 중에서 임의의 하나를 프레임 내에서 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단에 융합시켜 폴리펩티드의 최적 분비를 수득할 수 있다 (Lei et al. (1988), Nature, 331:543; Better et al. (1988) Science, 240:1041; Mullinax et al., (1990). PNAS, 87:8095).
용어 "호스트 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제되고, 적어도 하나의 이종성 유전자를 인코딩하는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 지칭한다. 재조합 호스트로부터 단백질을 분리하기 위한 방법의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 명확하게 달리 특정되지 않으면, 단백질의 공급원을 나타내기 위해서 교체가능하게 이용된다. 다시 말하면, "세포"로부터 단백질의 회수는 스핀다운된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 모두를 내포하는 세포 배양물로부터 회수를 의미할 수 있다. 단백질 발현을 위해 이용된 호스트 세포주는 가장 바람직하게는, 포유동물 기원의 세포주이다; 당업자는 원하는 유전자 산물이 그 내부에서 발현되는데 가장 적합한 특정의 호스트 세포주를 우선적으로 결정하는 능력을 갖는 것으로 믿어진다. 예시적인 호스트 세포주에는 DG44 및 DUXB11 (중국 햄스터 (Chinese Hamster) 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA (인간 자궁경부 암종), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610 (중국 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3 (생쥐 섬유아세포), PerC6 세포, HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/O (생쥐 골수종), P3x63-Ag3.653 (생쥐 골수종), BFA-1c1BPT (소 내피세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장)이 포함되나, 이들에 국한되지 않는다. 호스트 세포주는 전형적으로, 상업적 서비스, American Tissue Culture Collection으로부터, 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능하다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 세균 또는 효모와 같은 비-포유동물 세포 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 세균과 같은 다양한 단세포성 비-포유동물 미생물, 즉 배양 또는 발효 시에 성장할 수 있는 것들 역시 형질전환될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 형질전환이 가능한 세균에는 대장균(Escherichia coli) 또는 살모넬라 (Salmonella)의 균주와 같은 엔테로박테리아세 (enterobacteriaceae); 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실라세 (Bacillaceae); 뉴모코커스 (Pneumococcus); 스트렙토코커스 (Streptococcus), 그리고 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)의 구성원이 포함된다. 또한, 세균 내에서 발현되는 경우에, 폴리펩티드는 전형적으로 봉입체 (inclusion body)의 일부가 되는 것으로 이해될 것이다. 폴리펩티드는 단리되고, 정제되고, 이후 기능적 분자로 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에, 진핵성 미생물 역시 이용될 수 있다. 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 빵 효모 (baker's yeast)가 진핵성 미생물 중에서 가장 통상적으로 이용되지만, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)를 비롯한 다수의 다른 균주가 통상적으로 이용될 수 있다. 사카로미세스에서 발현을 위해서, 예로써 플라스미드 YRp7 (Stinchcomb et al., (1979), Nature, 282:39; Kingsman et al., (1979), Gene, 7:141; Tschemper et al., (1980), Gene, 10:157)이 통상적으로 사용된다. 이 플라스미드는 이미, 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 내포하며, 예로써 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1이다 (Jones, (1977), Genetics, 85:12). 효모 호스트 세포 게놈의 특징으로서 trpl 병소의 존재는 트립토판 부재 하에 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "내인성"은 세포 내에 자연적으로 존재하는 분자 (가령, 핵산 및/또는 단백질 분자)를 지칭한다. 대조적으로, 용어 "외인성"또는 "이종성"은 소정의 배경에서, 예를 들면, 세포 또는 폴리펩티드에서 통상적으로 관찰되지 않는 이와 같은 분자를 지칭한다. 가령, 외인성 또는 이종성 분자는 세포 내로 도입될 수 있고, 그리고 예로써, 형질감염 또는 다른 형태의 유전자 조작에 의한 세포의 조작 이후에만 존재하고, 또는 이종성 아미노산 서열은 이 서열이 자연적으로 관찰되지 않는 단백질 내에 존재할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "개열 부위" 또는 "효소적 개열 부위"는 효소에 의해 인식되는 부위를 지칭한다. 일정한 효소적 개열 부위는 세포내 가공 부위를 포함한다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 응고 캐스케이드 동안 활성화된 효소에 의해 개열되는 효소적 개열 부위를 갖고, 따라서 이런 부위의 개열이 덩어리 형성의 부위에서 발생한다. 예시적인 이런 부위에는 예로써, 트롬빈, 인자 XIa 또는 인자 Xa에 의해 인식되는 것들이 포함된다. 예시적인 FXIa 개열 부위에는 예로써, TQSFNDFTR 및 SVSQTSKLTR이 포함된다. 예시적인 트롬빈 개열 부위에는 예로써, DFLAEGGGVR, TTKIKPR, LVPRG (SEQ ID NO:35) 및 ALRPR이 포함된다. 다른 효소적 개열 부위는 당분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "가공 부위" 또는 "세포내 가공 부위"는 폴리펩티드의 번역후 기능하는 효소에 대한 표적인 폴리펩티드에서 효소적 개열 부위의 한 가지 유형을 지칭한다. 한 구체예에서, 이런 효소는 골지 내강 (Golgi lumen)으로부터 트랜스-골지 구획 (trans-Golgi compartment)으로 수송 동안 기능한다. 세포내 가공 효소는 세포로부터 단백질의 분비에 앞서 폴리펩티드를 개열한다. 이런 가공 부위의 실례에는 예로써, 엔도펩티다아제 (endopeptidase)의 PACE/푸린 (여기서 PACE는 Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme에 대한 약칭이다) 집단에 의해 표적화된 것들이 포함된다. 이들 효소는 골지 막 (Golgi membrane)에 국한되고 서열 모티프 Arg-[임의의 잔기]-(Lys 또는 Arg)-Arg의 카르복시말단 쪽에서 단백질을 개열한다. 본 명세서에서, 효소의 "푸린" 집단은 예로써, 푸린, PC2, PC1/Pc3, PC4, PACE4, PC5/PC6, 그리고 LPC/PC7/PC8/SPC7을 포함한다. 다른 가공 부위는 당분야에 공지되어 있다.
하나 이상의 가공 또는 개열 부위를 포함하는 구조체에서, 이런 부위는 동일하거나 상이한 것으로 이해될 것이다.
시험관내 생산은 본 발명의 원하는 변경된 폴리펩티드를 대량으로 제공하기 위한 정률증가 (scale-up)를 가능하게 한다. 조직 배양 조건 하에서 포유동물 세포를 배양하기 위한 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 예로써 에어리프트 (airlift) 반응기 또는 연속 교반 반응기 내에서 균질한 현탁 배양, 또는 예로써, 중공 섬유, 마이크로캡슐 내에서, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서 고정화 또는 포획 세포 배양을 포함한다. 필요하고 및/또는 원하는 경우에, 폴리펩티드의 용액은 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), DEAE-셀룰로오스 위에서 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 구(句) "폴리펩티드의 투여로부터 이익을 얻는 개체"는 예로써, 지혈을 향상시키기 위해 본 발명의 폴리펩티드의 투여로부터 이익을 얻는 개체, 예를 들면, 포유동물 개체를 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 두 번째 공급원으로부터 유래된 두 번째 아미노산 서열에 공유 또는 비-공유 결합된, 첫 번째 공급원으로부터 유래된 첫 번째 아미노산 서열로 구성되는 임의의 단백질을 지칭하고, 여기서 첫 번째와 두 번째 공급원은 동일하지 않다. 동일하지 않은 첫 번째 공급원과 두 번째 공급원은 2개의 상이한 생물학적 실체, 또는 동일한 생물학적 실체로부터 2개의 상이한 단백질, 또는 생물학적 실체 및 비-생물학적 실체를 포함할 수 있다. 키메라 단백질은 예로써, 적어도 2개의 상이한 생물학적 공급원으로부터 유래된 단백질을 포함할 수 있다. 생물학적 공급원은 임의의 비-합성적으로 생산된 핵산 또는 아미노산 서열 (가령, 본 명세서에서 더욱 기술된 바와 같은, 전술한 것들 중에서 한 가지의 게놈 또는 cDNA 서열, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 고유 비리온 또는 돌연변이체 또는 유사체)을 포함할 수 있다. 합성 공급원은 화학적으로 생산되고 생물학적 시스템에 의해 생산되지 않은 단백질 또는 핵산 서열 (가령, 아미노산 서열의 고형 상 합성)을 포함할 수 있다. 키메라 단백질은 또한, 적어도 2개의 상이한 합성 공급원으로부터 유래된 단백질 또는 적어도 하나의 생물학적 공급원 및 적어도 하나의 합성 공급원으로부터 유래된 단백질을 포함할 수 있다. 키메라 단백질은 또한, 임의의 공급원으로부터 유래된 핵산, 또는 임의의 공급원으로부터 유래된 작은 유기 또는 무기 분자에 공유 또는 비-공유 연결된, 첫 번째 공급원으로부터 유래된 첫 번째 아미노산 서열을 포함한다. 키메라 단백질은 첫 번째와 두 번째 아미노산 서열 사이에 또는 첫 번째 아미노산 서열과 핵산 사이에, 또는 첫 번째 아미노산 서열과 작은 유기 또는 무기 분자 사이에 링커 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "응고 인자"는 개체에서 출혈 에피소드를 예방하거나 이의 지속 기간을 감소시키는 자연적으로 발생하는 또는 재조합 방식으로 생산된 분자 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 다시 말하면, 이것은 친-응고 활성을 갖는, 다시 말하면, 혈액의 응고를 유발하여 섬유소원의 불용성 섬유소의 그물로의 전환을 담당하는 분자를 의미한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 응고 활성은 섬유소 덩어리의 형성에서 정점에 이르는 생화학적 반응의 캐스케이드에 참여하고 및/또는 출혈 또는 유혈 에피소드의 심각도, 지속 기간 또는 빈도를 감소시키는 능력을 의미한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 지혈은 유혈 또는 출혈의 중단 또는 느려짐; 또는 혈관 또는 신체 부분을 통한 혈류의 중단 또는 느려짐을 의미한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 지혈 장애는 자발적으로, 또는 섬유소 덩어리를 형성하는 손상된 능력 또는 능력 없음에 기인한 외상의 결과로서, 출혈의 성향으로 특징되는 유전적으로 유전된 또는 획득된 장애를 의미한다. 이런 장애의 실례에는 혈우병이 포함된다. 3가지 주요 형태는 혈우병 A (인자 VIII 결핍), 혈우병 B (인자 IX 결핍 또는 "크리스마스병") 및 혈우병 C (인자 XI 결핍, 경등도 출혈 성향)이다. 폰빌레브란트병, 인자 Xi 결핍 (PTA 결핍), 인자 XII 결핍, 섬유소원, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII의 결핍 또는 구조적 비정상, 베르나르-술리에 증후군은 GPIb에서 결함 또는 결핍이다. vWF에 대한 수용체인 GPIb는 결함되고 일차 덩어리 형성 (일차 지혈)의 부재 및 증가된 출혈 성향, 그리고 글란즈만 네겔리 혈소판무력증 (글란즈만 혈소판무력증)을 유발할 수 있다. 간 부전 (급성과 만성 형태)에서 간에 의한 응고 인자의 생산이 충분하지 않다; 이것은 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 키메라 분자는 예방적으로 이용될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "예방적 처치"는 출혈 에피소드에 앞서 분자의 투여를 지칭한다. 한 구체예에서, 포괄적 지혈제 (general hemostatic agent)를 필요로 하는 개체는 수술을 받고 있거나, 또는 수술을 받을 예정이다. 본 발명의 키메라 단백질은 예방제로서 수술 이전에 또는 수술 이후에 투여될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질은 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 동안 또는 수술 이후에 투여될 수 있다. 수술에는 간 이식, 간 절제, 또는 줄기 세포 이식이 포함될 수 있지만 이들에 국한되지 않는다.
필요시 치료 (on-demand treatment)는 출혈 에피소드, 관절혈증, 근육내 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육 내로 출혈, 구강 출혈, 외상, 두부 외상 (head trauma), 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추신경계 출혈, 인두후강에서 출혈, 복막후극에서 출혈, 또는 엉덩허리 시스 (iliopsoas sheath)에서 출혈에 대한 치료를 포함한다. 개체는 외과적 예방, 수술전후 관리, 또는 수술을 위한 치료를 필요로 할 수도 있다. 이런 수술에는 예로써, 소수술, 대수술, 발치, 편도선 절제술, 서혜부 헤르니아 절제술, 윤활막 절제술, 슬관절 전치환술, 개두술, 골접합, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술, 또는 관절 치환 수술이 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "급성 출혈"은 기초 원인에 상관없이 출혈 에피소드를 지칭한다. 가령, 개체는 외상, 요독증, 유전성 출혈 장애 (가령, 인자 VII 결핍), 혈소판 장애, 또는 응고 인자에 대한 항체의 발생에 기인한 내성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "치료한다", "치료", "치료하는"은 예로써, 질환 또는 장애의 심각도에서 감소; 질환 과정의 지속 기간에서 감소; 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 개선; 질환 또는 장애를 반드시 치료하지는 않지만 질환 또는 장애를 앓는 개체에 유익한 효과의 제공, 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 예방을 지칭한다.
II. 응고 인자
특히, 본 발명은 인자 VII, IX, 그리고 X의 향상된 이형에 관계한다. 이들 인자는 각각에서 경쇄의 아미노 말단 단부가 추가의 모이어티의 통합을 쉽게 받아들이지 않는다는 점에서 모두 구조적으로 관련된다. 유사하게, 이들 3가지 응고 인자의 중쇄의 아미노 말단 단부는 개열가능 모이어티, 다시 말하면, 개열 부위를 통해 연결된 모이어티 또는 개열 부위로 구성되는 모이어티를 제외하고, 추가의 모이어티의 통합을 쉽게 받아들이지 않는다. 본 발명의 키메라 응고 인자 구조체는 이들 공유된 성질에 기초하여 설계되었고, 그리고 비록 인자 VII가 본 발명의 예시적인 구체예를 설명하기 위해 종종 도시되긴 하지만, 본 발명의 구조체는 인자 VII, IX, 또는 X를 이용하여 만들어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 가령, 당업자는 이들 응고 인자 중에서 한 가지의 증강된 이형을 만들기 위해 본 발명의 구조체의 FVII 부분이 FVIII, FIX 또는 FX 부분으로 대체될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 예시적인 키메라 응고 인자 구조체는 첨부된 도면에서 설명된다. 비록 이들 도면이 일반적으로, 응고 인자를 단일 사슬 (이의 치모겐 형태에서)로서 예시하긴 하지만, 응고 인자는 또한, 본 발명의 구조체에서 활성 형태, 예를 들면, 2개 사슬, 이황화 결합된 형태로서 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 세포에 의해 활성 형태로 발현된다. 다른 구체예에서, 키메라 응고 인자는 비활성 형태로 발현되고, 그리고 시험관내에서 적절한 조건 하에 차후 활성화되고, 따라서 응고 인자의 활성 형태가 구조체 내에 존재한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 비활성 형태로 응고 인자를 포함하고, 그리고 응고 인자는 투여후 생체내에서 활성화된다.
한 구체예에서, 분자의 활성 형태를 생산하기 위해 scFc 스카폴드가 이용될 수 있다. 일정한 응고 인자는 재조합 방식으로 치모겐으로서 생산되고, 따라서 제조 동안 활성화를 필요로 한다. 인자 VII, IX, 그리고 X의 활성 형태는 이합성 분자로 이루어지고, 여기서 중쇄와 경쇄는 이황화 결합으로만 연결된다.
한 구체예에서, 키메라 응고 인자는 지혈을 향상시키기 위해 개체에 투여에 앞서 활성화된다. 응고 인자를 활성화시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 대략 5 mM의 농도에서 CaCl2를 내포하는 매체와 접촉된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 이 인자가 발현되는 세포에 의해 활성 형태로 분비된다. 한 구체예에서, 활성 키메라 응고 인자는 응고 인자의 중쇄와 경쇄를 별개의 폴리펩티드로서 발현함으로써 만들어진다.
다른 구체예에서, 응고 인자의 중쇄의 N-말단은 분비 경로에서 후기까지 (즉, 단백질이 트랜스-골지 네트워크 (trans-Golgi network)에서 활성 가공 효소와 함께 공동-국한될 때까지) 합성 동안 응고 인자의 활성화를 지연시켜 더욱 큰 생산성을 유발하는 세포내 가공 부위를 포함하도록 변형된다. 예시적인 이런 세포내 가공 부위에는 푸린에 의해 인식되는 것들이 포함된다. 효소의 이러한 집단에 대한 예시적인 개열 부위에는 모티프 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg를 포함하는 아미노산 서열이 포함된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 활성 구조체는 예로써, scFc 링커 (가령, cscFc 링커)를 이용하여 Fc 융합 단백질의 배경에서 만들어진다.
예시적인 구조체는 첨부된 도면에서 도시된다.
한 구체예에서, 본 발명은 가공된 (가령, 성숙) 폴리펩티드에 관계하고, 여기서 scFc 폴리펩티드 링커에 인접한 적어도 하나의 개열 부위가 개열되고, 따라서 상기 분자는 더 이상 단일 폴리펩티드 사슬이 아니고, 상기 폴리펩티드는 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬 (효소적 개열 부위(들) P1 및/또는 P2에서 개열에 기인)로 이루어진다.
한 구체예에서, 이런 가공된 폴리펩티드는 폴리펩티드 링커의 개열후 유리 아미노 말단을 갖는 두 번째 Fc 모이어티 (즉, 폴리펩티드 링커의 개열에 앞서 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 계산할 때, 두 번째 Fc 모이어티)에 연결된 응고 인자 또는 이의 일부분을 포함한다.
한 구체예에서, 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착된 응고 인자는 촉매적으로 활성이다, 예를 들면, 효소적 활성을 갖는다. 다른 구체예에서, 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착된 응고 인자는 완전히 활성화되기 위하여 응고 인자의 추가의 효소적 가공을 필요로 하는 치모겐으로서 세포에 의해 분비된다.
한 구체예에서, 본 발명은 가공 동안 추가 활성화에 대한 필요 없이 활성 또는 활성화된 형태로 세포로부터 분비되는 응고 인자에 관계한다. 가령, 인자 VII는 일반적으로, 재조합 방식으로 치모겐으로서 생산되고, 그리고 투여를 위한 활성 형태를 생산하기 위해 제조 동안 활성화를 요구한다. 한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 제조가능성을 향상시키기 위해, 이 폴리펩티드가 활성 형태로 발현되는 세포로부터 분비된다. 하기에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 이런 응고 인자는 cscFc 링커를 포함하는 scFc 분자의 배경에서, 응고 인자의 경쇄 및 응고 인자의 중쇄를 별개로 발현함으로써 생산될 수 있다. 이런 구조체의 활성화는 가공 동안 분비 경로에서 후기까지, 예를 들면, 단백질이 트랜스-골지체 (trans-Golgi apparatus)에서 활성 가공 효소와 함께 공동-국한될 때까지 지연된다.
한 구체예에서, 본 발명의 응고 인자는 인자 VII의 성숙 형태 또는 이의 변이체이다. 인자 VII (FVII, F7; 일명 인자 7, 응고 인자 VII, 혈청 인자 VII, 혈청 프로트롬빈 전환 촉진제, SPCA, 프로콘버틴 (proconvertin) 및 엡타코그 알파 (eptacog alpha))는 응고 캐스케이드의 일원인 세린 프로테아제이다. FVII는 Gla 도메인, 2개의 EGF 도메인 (EGF-1과 EGF-2), 그리고 예로써 키모트립신과 같은 세린 프로테아제의 펩티다아제 S1 집단의 모든 구성원 사이에 고도로 보존되는 세린 프로테아제 도메인 (또는 펩티다아제 S1 도메인)을 포함한다. FVII는 단일 사슬 치모겐, 활성화된 치모겐-유사 2-사슬 폴리펩티드 및 완전히 활성화된 2-사슬 형태로서 발생한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "치모겐-유사" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백분해 개열에 의해 활성화되지만 치모겐과 연관된 성질, 예를 들면, 낮은 활성 또는 활성 없음을 여전히 나타내는 단백질, 또는 상기 단백질의 치모겐 형태의 입체형태와 유사한 입체형태를 지칭한다. 가령, 조직 인자에 결합되지 않을 때, FVII의 2-사슬 활성화된 형태는 치모겐-유사 단백질이다; 이것은 개열되지 않은 FVII 치모겐과 유사한 입체형태를 유지하고, 따라서 매우 낮은 활성을 나타낸다. 조직 인자에 결합 시에, FVII의 2-사슬 활성화된 형태는 입체형태적 변화를 겪고 응고 인자로서 완전한 활성을 획득한다.
예시적인 FVII 변이체에는 증가된 특이적 활성, 예를 들면, FVII의 효소적 활성 (Kcat 또는 Km)을 증가시킴으로써 FVII의 활성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 것들이 포함된다. 이런 변이체는 당분야에서 기술되고, 여기에는 예로써, Persson et al. 2001. PNAS 98:13583; Petrovan and Ruf. 2001. J. Biol. Chem. 276:6616; Persson et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:29195; Soejima et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:17229; Soejima et al. 2002. J. Biol. Chem. 247:49027에서 기술된 바와 같은 상기 분자의 돌연변이 형태가 포함된다. 한 구체예에서, FVII의 변이체 형태는 이들 돌연변이를 포함한다. 예시적인 돌연변이에는 V158D-E296V-M298Q가 포함된다. 다른 구체예에서, FVII의 변이체 형태는 FVII 성숙 서열로부터 아미노산 608-619 (LQQSRKVGDSPN, 170-루프에 상응)의 트립신의 170-루프로부터 아미노산 EASYPGK로의 대체를 포함한다. FIX의 높은 특이적 활성 변이체 역시 당분야에 공지되어 있다. 가령, Simioni et al., 2009 N.E. Journal of Medicine 361:1671에서는 R338L 돌연변이를 기술한다. Chang et al., 1988 JBC 273:12089 및 Pierri et al., 2009 Human Gene Therapy 20:479에서는 R338A 돌연변이를 기술한다. 다른 돌연변이는 당분야에 공지되어 있고 예로써, Zogg and Brandstetter. 2009 Structure 17:1669; Sichler etl al. 2003. J. Biol. Chem. 278:4121; 그리고 Sturzebecher et al. 1997. FEBS Lett 412:295에서 기술된 것들을 포함한다. 이들 참고문헌의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.
치모겐-유사 형태로부터 입체형태적 변화 시에 발생하는 완전한 활성화는 보조-인자 조직 인자에 결합 시에 발생한다. 또한, 조직 인자의 부재에서 입체형태적 변화를 유발하는 돌연변이가 도입될 수 있다. 따라서 FVIIa에 대한 언급은 이의 2-사슬 형태, 치모겐-유사 형태 및 완전히 활성화된 2-사슬 형태를 모두 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 응고 인자는 인자 VIII 또는 이의 변이체의 성숙 형태이다. FVIII는 혈액 응고의 내재성 경로에서, 칼슘 이온의 존재에서 음으로 하전된 인지질 표면에서 발생하는 반응인 인자 IXa에 의한 인자 X의 활성화를 촉진하는 보조인자로서 기능한다. FVIII는 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2를 갖는 2351개 아미노산 단일-사슬 폴리펩티드로서 합성된다. Wehar, G. A. et al., Nature 312:337-342 (1984) 및 Toole, J. J. et al., Nature 312:342-347 (1984). FVIII의 도메인 구조는 상동한 응고 인자, 인자 V (FV)의 도메인 구조와 동일하다. Kane, W. H. et al., PNAS (USA) 83:6800-6804 (1986) 및 Jenny, R. J. et al., PNAS (USA) 84:4846-4850 (1987). FVIII A-도메인은 330개 아미노산이고 서로에 대해, 그리고 FV의 A-도메인 및 혈장 구리-결합 단백질 세룰로플라스민 (ceruloplasmin)에 40% 아미노산 동일성을 갖는다. Takahashi, N. et al., PNAS (USA) 81:390-394 (1984). 각 C-도메인은 150개 아미노산이고 FV의 C-도메인에, 그리고 당접합체 (glycoconjugate)와 음으로 하전된 인지질에 결합하는 단백질에 40% 동일성을 나타낸다. Stubbs, J. D. et al., PNAS (USA) 87:8417-8421 (1990). FVIII B-도메인은 단일 엑손에 의해 인코딩되고, 그리고 FV B-도메인을 비롯한 임의의 공지된 단백질에 대한 상동성을 거의 나타내지 않는다. Gitschier, J. et al., Nature 312:326-330 (1984) 및 Cripe, L. D. et al., Biochemistry 31:3777-3785 (1992).
FVIII는 A1-과 A3-도메인 사이에 비공유 이가 금속 이온 연쇄를 통해 결합된 중쇄 (도메인 A1-A2-B)와 경쇄 (도메인 A3-C1-C2)의 헤테로이합체로서 혈장 내로 분비된다. 혈장 내에서, FVIII는 폰빌레브란트 인자에 결합함으로써 안정화된다. 더욱 구체적으로, FVIII 경쇄는 비공유 상호작용에 의해, 폰빌레브란트 인자의 아미노 말단에서 일차 결합 부위에 결합된다. 트롬빈에 의한 단백분해 활성화 시에, FVIII는 2개 중쇄 단편 (A1, 50 kDa 단편, 그리고 A2, 43 kDa 단편) 및 경쇄 (A3-C1-C2, 73 kDa 사슬)의 헤테로삼합체 (heterotrimer)로 활성화된다. FVIII의 활성 형태 (FVIIIa)는 따라서, 이가 금속 이온 연쇄를 통해, 트롬빈-개열된 A3-C1-C2 경쇄에 결합된 A1-아단위 및 이온 결합을 통해 A1 도메인과 결합된 유리 A2 아단위로 구성된다. Eaton, D. et al., Biochemistry 25: 505 (1986); Lollar, P. et al., J. Biol. Chem. 266: 12481 (1991); 그리고 Fay, P. J. et al., J. Biol. Chem. 266: 8957 (1991). 이러한 FVIIIa 헤테로삽합체는 불안정하고 생리학적 조건 하에 A2 아단위의 분리를 통한 급속한 비활성화에 종속된다.
한 구체예에서, 응고 인자는 인자 VIII의 B-도메인 결실된 이형을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 인자 VIII의 "B-도메인"은 내부 아미노산 서열 동일성 및 단백분해 개열의 부위, 예를 들면, 전장 인간 인자 VIII의 잔기 Ser741-Arg1648에 의해 정의되는 당분야에 공지된 B-도메인과 동일하다. 다른 인간 인자 VIII 도메인은 하기 아미노산 잔기에 의해 정의된다: A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; A3, 잔기 Ser1690-Asn2019; C1, 잔기 Lys2020-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 나머지 서열, 잔기 Glu1649-Arg1689는 통상적으로, a3 산성 영역으로 지칭된다. 돼지, 생쥐와 개 인자 VIII에 대한 B-도메인을 비롯한 모든 도메인에 대한 경계의 위치 역시 당분야에 공지되어 있다. 한 구체예에서, 인자 VIII의 B 도메인은 결실된다 ("B-도메인-결실된 인자 VIII" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 실례는 당분야에 공지된 REFACTO® (S743/Q1638 융합을 갖는 재조합 BDD FVIII)이다.
"B-도메인-결실된 인자 VIII"는 U.S. 특허 번호 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, 그리고 6,458,563에 개시된 완전한 또는 부분적인 결실을 가질 수 있고, 이들 각각은 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 B-도메인-결실된 인자 VIII 서열은 U.S. 특허 번호 6,316,226 (또한, US 6,346,513)의 칼럼 4, 라인 4 내지 칼럼 5, 라인 28 및 실시예 1-5에서 개시된 결실 중에서 임의의 한 가지를 포함한다. 다른 구체예에서, B-도메인 결실된 인자 VIII는 S743/Q1638 B-도메인 결실된 인자 VIII (SQ 이형 인자 VIII) (가령, 아미노산 744에서부터 아미노산 1637까지의 결실을 갖는 인자 VIII, 예를 들면, 아미노산 1-743 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1638-2332, 다시 말하면, SEQ ID NO: 2를 갖는 인자 VIII)이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 B-도메인-결실된 인자 VIII는 U.S. 특허 번호 5,789,203 (또한, US 6,060,447, US 5,595,886, 그리고 US 6,228,620)의 칼럼 2, 라인 26-51 및 실시예 5-8에서 개시된 결실을 갖는다. 일부 구체예에서, B-도메인-결실된 인자 VIII는 U.S. 특허 번호 5,972,885의 칼럼 1, 라인 25 내지 칼럼 2, 라인 40; U.S. 특허 번호 6,048,720의 칼럼 6, 라인 1-22 및 실시예 1; U.S. 특허 번호 5,543,502의 칼럼 2, 라인 17-46; U.S. 특허 번호 5,171,844의 칼럼 4, 라인 22 내지 칼럼 5, 라인 36; U.S. 특허 번호 5,112,950의 칼럼 2, 라인 55-68, 도 2, 그리고 실시예 1; U.S. 특허 번호 4,868,112의 칼럼 2, 라인 2 내지 칼럼 19, 라인 21 및 표 2; U.S. 특허 번호 7,041,635의 칼럼 2, 라인 1 내지 칼럼 3, 라인 19, 칼럼 3, 라인 40 내지 칼럼 4, 라인 67, 칼럼 7, 라인 43 내지 칼럼 8, 라인 26, 그리고 칼럼 11, 라인 5 내지 칼럼 13, 라인 39; 또는 U.S. 특허 번호 6,458,563의 칼럼 4, 라인 25-53에서 기술된 결실을 갖는다. 일부 구체예에서, B-도메인-결실된 인자 VIII는 B 도메인 중에서 대부분의 결실을 갖지만, 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입되는 WO 91/09122에서 개시된 바와 같이 일차 번역 산물의 2개의 폴리펩티드 사슬로의 생체내 단백분해 가공에 필수적인 B 도메인의 아미노-말단 서열을 여전히 내포한다. 일부 구체예에서, B-도메인-결실된 인자 VIII는 아미노산 747-1638의 결실, 다시 말하면, B 도메인의 실질적으로 완전한 결실로 작제된다. 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입되는 Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). B-도메인-결실된 인자 VIII는 또한, 인자 VIII의 아미노산 771-1666 또는 아미노산 868-1562의 결실을 내포할 수도 있다. 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입되는 Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). 본 발명의 일부인 추가의 B 도메인 결실에는 아미노산 982 내지 1562 또는 760 내지 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 내지 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 내지 1646 (Kaufman (PCT 공개된 출원 번호 WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al ., DNA (1987) 6:553-564)), 741 내지 1648 (Pasek (PCT 출원 번호 88/00831)), 또는 816 내지 1598 또는 741 내지 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597))의 결실이 포함되고, 이들 각각은 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입된다. 전술한 결실 각각은 임의의 인자 VIII 서열에서 만들어질 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 FVIII의 표적화된 이형에 관계하고, 여기서 표적화 모이어티는 (i) 혈소판에 특이적으로 결합하고, (ii) 응고 인자의 경쇄와 중쇄 사이에 넣어지지 않고, 그리고 여기서 상기 키메라 응고 인자는 적어도 하나의 표적화 모이어티가 없는 적절한 대조와 비교하여, 혈소판의 존재에서 트롬빈의 증가된 산출을 나타낸다.
한 구체예에서, 본 발명의 응고 인자는 인자 IX 또는 이의 변이체의 성숙 형태이다. 인자 IX는 415개 아미노산, 단일 사슬 혈장 치모겐으로서 순환한다 (A. Vysotchin et al., J. Biol. Chem. 268, 8436 (1993)). FIX의 치모겐은 FXIa 또는 조직 인자/FVIIa 복합체에 의해 활성화된다. 아르기닌-알라닌 145-146 및 아르기닌-발린 180-181 사이에 특정한 개열은 시스테인 132와 시스테인 289 사이에 단일 이황화 결합에 의해 연결된 경쇄와 중쇄를 산출한다 (S. Bajaj et al., Biochemistry 22, 4047 (1983)). FIX의 구조적 조직화는 비타민 K-의존성 혈액 응고 단백질 FVII, FX와 단백질 C의 것과 유사하다 (B. Furie and B. Furie, supra). 아미노 말단의 대략 45개 아미노산은 감마-카르복시글루타민산, 또는 gla 도메인을 포함한다. 이것은 2개의 표피 성장 인자 상동성 도메인 (EGF), 활성화 펩티드 및 세린 프로테아제 집단의 구성원인 촉매 "중쇄"가 뒤따른다 (A. Vysotchin et al., J. Biol. Chem. 268, 8436 (1993); S. Spitzer et al., Biochemical Journal 265, 219 (1990); H. Brandstetter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 9796 (1995)).
한 구체예에서, 본 발명의 응고 인자는 인자 X의 성숙 형태이다. 인자 X는 58.5 kDa 분자량의 비타민-K 의존성 당단백질이고, 이것은 간 세포로부터 혈장 내로, 치모겐으로서 분비된다. 초기에, 인자 X는 총 488개 아미노산에 있는 신호 펩티드를 갖는 프리프로펩티드로서 생산된다. 신호 펩티드는 소포체 (endoplasmatic reticulum) 내로 이출 (export) 동안 신호 펩티다아제에 의해 개열되고, 프로펩티드 서열은 감마 카르복실화가 성숙 N-말단 사슬의 N-말단에서 첫 11개 글루타민산 잔기에서 일어난 이후에 개열된다. 추가의 가공 단계는 Arg182와 Ser183 사이에 개열에 의해 발생한다. 이러한 가공 단계는 또한, 트리펩티드 Arg180-Lys181-Arg182의 결실을 부수적으로 유발한다. 결과의 분비된 인자 X 치모겐은 Cys172와 Cys342 사이에 이황화 가교를 거쳐 공유 연결되는 139개 아미노산 (M, 16,200)의 N-말단 경쇄 및 306개 아미노산 (M, 42,000)의 C-말단 중쇄로 구성된다. 추가의 번역후 가공 단계는 Asp103의 베타-히드록실화뿐만 아니라 N-과 O-유형 당화를 포함한다.
이들 응고 인자의 야생형 (WT) 이형 또는 이들의 생물학적 활성 부분 이외에, 본 발명은 또한, 활성을 갖는 이들의 전구체 절두된 형태, 대립유전자 변이체와 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 인코딩된 변이체, 그리고 응고 인자의 성숙 형태에 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖고 덩어리 형성을 촉진하는 능력을 유지하는 폴리펩티드를 비롯한 기타 변이체를 이용할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 가령, FVII의 적어도 한 가지 활성, 예를 들면, TF 결합, 인자 X 결합, 인지질 결합, 및/또는 FVII의 항응고 활성을 유지하는 변형된 FVII 폴리펩티드 및 이들의 변이체가 이용될 수 있다. 활성을 유지함으로써, 상기 활성은 유지된 활성의 수준이 검출가능한 효과를 산출할 만큼 충분하기만 하면, 야생형 응고 인자와 비교하여 변경, 예를 들면, 감소 또는 증가될 수 있다. 본 발명의 구조체에 이용될 수 있는 응고 인자의 예시적인 서열은 첨부된 서열 목록에서 확인된다.
예시적인 변형된 폴리펩티드에는 조직-특이적 아이소폼 (isoform)과 이들의 대립유전자 변이체, 핵산의 번역에 의해 제조된 합성 분자, 화학적 합성, 예를 들면, 재조합 방법을 통한 더욱 짧은 폴리펩티드의 결찰을 포함하는 합성에 의해 산출된 단백질, 인간과 비-인간 조직과 세포로부터 단리된 단백질, 키메라 폴리펩티드 및 이들의 변형된 형태가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 응고 인자는 또한, 충분한 길이를 갖거나, 또는 전장 성숙 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성 (필요하면 활성화 시에)을 유지하기 위한 적절한 영역을 포함하는 WT 분자의 단편 또는 일부분으로 구성될 수 있다. 예시적인 응고 인자 변이체는 당분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "Gla 도메인"은 비타민 K-의존성 단백질, 예를 들면, 프로트롬빈, 응고 인자 VII, IX와 X, 단백질 C, S와 Z 내에 존재하는 보존된 막 결합 모티프를 지칭한다. 이들 단백질은 이들 단백질의 N-말단 Gla 도메인에서 밀집하는 아미노산, g-카르복시글루타민산의 번역후 합성을 위해 비타민 K를 필요로 한다. 도메인 내에 존재하는 모든 글루타민산 잔기는 잠재적 카르복실화 부위이고, 따라서 이들 중에서 다수는 카르복실화에 의해 변형된다. 칼슘 이온의 존재에서, Gla 도메인은 포스파티딜세린을 포함하는 인지질 막과 상호작용한다. Gla 도메인은 또한, FVIIa 보조인자, 조직 인자 (TF)에 대한 결합에서 일정한 역할을 한다. TF와 복합될 때, FVIIa의 Gla 도메인은 7개의 Ca2+ 이온으로 적하 (loading)되고, 세포 표면에서 인지질과의 상호작용을 위해 세포 막의 방향으로 3개의 소수성 측쇄를 돌출시키고, 그리고 TF의 C-말단 도메인과 유의미한 접촉을 갖는다.
인자 VII의 Gla 도메인은 음으로 하전된 인지질 표면에 응고 인자의 결합에서 중추적인 역할을 하는 흔치 않은 아미노산 - 카르복시글루타민산 (Gla)을 포함한다.
GLA 도메인은 칼슘 이온의 높은-친화성 결합을 담당한다. 이것은 단백질의 성숙 형태의 N-말단 단부에서 시작하고 보존된 방향족 잔기에서 종결한다. 보존된 Gla-x(3)-Gla-x-Cys 모티프는 카르복실라아제에 의한 기질 인식에 중요한 것으로 생각되는 도메인의 중간에서 발견된다. 표면 플라스몬 공명 분석과 공동으로 정지-흐름 형광 동역학적 측정 (stopped-flow fluorescence kinetic measurement)을 이용하여, Gla 도메인은 FVIIa의 프로테아제 도메인이 sTF와의 접촉을 시작하는 일련의 사건에서 중요한 것으로 밝혀졌다 (Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. 337:1276). 이에 더하여, 응고 인자의 제거는 예로써, 간 세포 및 제거 수용체, 예를 들면, EPCR에서 Gla 상호작용을 통해 유의미하게 매개될 수 있다.
한 구체예에서, 표적화된 응고 인자는 Gla 도메인을 결여하도록 변형된다. Gla 도메인은 복수의 경로, 예를 들면, 간 세포, 제거 수용체, 예를 들면, EPCR 등에 결합을 통한 응고 인자의 제거를 매개하는 것을 담당한다. 따라서 Gla 도메인을 제거하는 것은 응고 인자의 반감기에 대한 유익한 효과를 갖는다. 비록 Gla 도메인이 일반적으로, 응고 인자를 응고 부위에 국한시킴으로써 활성에도 요구되긴 하지만, 혈소판 표적화 도메인 모이어티의 포함은 Gla 결실된 응고 인자를 혈소판에 표적화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명의 응고 인자는 표적화 모이어티를 포함하고 Gla 도메인이 없다. 가령, 인자 VII의 경우에, Gla 도메인은 경쇄의 아미노 말단에 존재하고 아미노산 1-35로 구성된다. 예시적인 응고 인자의 Gla 도메인은 첨부된 서열 목록에서 표시된다. 이러한 도메인은 표준 분자생물학 기술을 이용하여 제거되고, 표적화 도메인으로 대체되고, 그리고 변형된 경쇄가 본 발명의 구조체 내로 통합될 수 있다. 한 구체예에서, 개열 부위는 분자의 활성화를 촉진하기 위해, Gla 도메인이 없는 구조체 내로 도입될 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 이런 개열 부위는 응고 인자가 활성화될 때 개열되는 아미노산 (가령, 인자 VII의 경우에 아미노산 152와 153) 사이에 도입될 수 있다. Gla 도메인이 없는 예시적인 응고 인자는 첨부된 도면에서 도시된다.
한 구체예에서, 개열 부위는 분자의 활성화를 촉진하기 위해, Gla 도메인이 없는 구조체 내로 도입될 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 이런 개열 부위는 응고 인자가 활성화될 때 개열되는 아미노산 (가령, 인자 VII의 경우에 아미노산 152와 153) 사이에 도입될 수 있다. Gla 도메인이 없는 예시적인 응고 인자는 첨부된 도면에서 도시된다.
예시적인 응고 인자는 포유동물, 예를 들면, 인간 기원의 응고 인자이다. 예시적인 응고 인자의 서열은 예로써, 첨부된 서열 목록에서 단독으로 또는 키메라 응고 인자 구조체의 배경에서 제공된다.
III. 표적화 모이어티
한 구체예에서, 본 발명의 응고 인자는 혈소판에서 발현된 표적 분자에 결합하는 "표적화 모이어티"를 이용하여 응고 인자를 응고 부위에 국한시킴으로써 효능을 증강시키기 위해 혈소판에 표적화된다. 바람직하게는, 표적화된 분자는 혈소판 이외의 세포 또는 조직에서 발현되지 않는다, 다시 말하면, 표적화 모이어티는 혈소판에 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 휴지 혈소판에서 발견된 수용체/입체형태는 표적화된다. 이렇게 함으로써, 응고를 위한 부위는 증강된 효능에 대해 기폭될 수 있다. 이런 분자를 표적으로 하는 것은 또한, 응고 인자의 반감기를 연장시키고 및/또는 제거를 예방할 수 있다. 이런 표적의 실례에는 GpIb/V/IX 복합체의 GpIb, 그리고 GpVI 및 GPIIb/IIIa의 비활성 형태가 포함된다.
한 구체예에서, 활성화된 혈소판에서만 발견되는 수용체/입체형태는 응고 인자를 활성 응고의 부위에 국한시키기 위해 표적화된다. 이런 표적의 실례에는 예로써, GPIIb/IIIa의 활성 형태 및 CD62P가 포함된다.
한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 혈소판에 대한 친화성을 갖고 이들에 결합하는 "표적화 모이어티"를 포함한다. 가령, 한 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIb 복합체, 예를 들면, GPIb-알파에 결합한다. 이런 표적화 모이어티의 실례에는 활성 혈소판과 비활성 혈소판 둘 모두에 결합하는 펩티드 PS4, OS1, 그리고 OS2가 포함된다 (Benard et al. 2008 Biochemistry 47:4674); 다른 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIIbIIIa의 활성 입체형태에 결합한다. 이런 표적화 모이어티의 실례에는 활성 혈소판에만 결합하는 SCE5와 MB9 가변 영역이 포함된다 (Schwarz et al. 2004 FASEB Journal express article 10.1096/fj.04-1513fje; Schwarz et al. 2006 Circulation Research. 99:25-33; U.S. 특허 공개 번호 20070218067). 다른 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIIbIIIa의 활성/비활성 입체형태 둘 모두에 결합한다. 이런 표적화 모이어티의 실례는 AP3 항체의 가변 영역이다 (Peterson et al. 2003. Hemostasis, Thrombosis, and Vascular Biology 101:937; WO 2010115866). 다른 표적 및 표적화 모이어티는 당분야에 공지되어 있다. 증가된 응고 활성을 갖는 인자 IX의 다른 이형 (삼중 돌연변이체 V86A/E277A/R338A)은 Lin et al., 2010. Journal of Thrombosis and Haemostasis 8: 1773에서 기술되었다. 이들 참고문헌의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.
본 발명의 키메라 응고 인자는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적인 배열 (configuration)은 첨부된 도면에서 설명된다. 부가적으로, 2개 이상의 표적화 모이어티가 연속적으로 서로에 연결되고 (가령, 스페이서를 거쳐), 그리고 탄뎀 어레이 (tandem array)가 본 발명의 구조체에 작동가능하게 연결될 수 있다. 2개 이상의 표적화 모이어티가 본 발명의 키메라 응고 인자 내에 존재할 때, 이들 모이어티는 동일하거나 상이할 수 있다.
한 구체예에서, 표적화 모이어티는 덩어리의 부위에서 표적화 모이어티를 제거하기 위해 개열될 수 있는 개열가능 링커에 의해 본 발명의 키메라 응고 인자에 융합된다. 다른 구체예에서, 표적화 모이어티는 개열가능 링커를 통해 부착되지 않고, 따라서 덩어리의 부위에서 개열되지 않는다.
한 구체예에서, 표적화 모이어티는 인자 VIII의 N- 또는 C- 말단에 위치한다. 다른 구체예에서, 표적화 모이어티는 FVII, FIX, FX의 C-말단, 또는 FVIIa, FIXa, 또는 FXa의 어느 한쪽 또는 양쪽 사슬의 C-말단에 위치한다. Fc 영역 또는 이의 일부분이 이용되는 구체예에서, 표적화 모이어티는 두 번째 Fc 사슬의 N 또는 C 말단, 또는 어느 한쪽 또는 양쪽 Fc 사슬의 C-말단에 위치할 수 있다.
한 구체예에서, 표적화 모이어티는 구조체에 직접적으로 유전적으로 융합되지 않고, 오히려 스페이서 또는 화학적 결합을 거쳐 구조체에 연결된다. 가령, 표적화 모이어티는 표적화 모이어티 및 구조체의 Fc 모이어티 사이에 결합의 형성에 의해 본 발명의 구조체에 부착될 수 있고, 여기서 표적화 모이어티는 첫 번째 기능기를 포함하고, 그리고 Fc 모이어티는 두 번째 기능기를 포함하고, 그리고 여기서 첫 번째와 두 번째 기능기는 서로 반응하여 화학적 결합을 형성할 수 있다 (예로써, U.S. 특허 번호 7381408을 참조한다).
한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항원 결합 부위 (가령, 항체, 항체 변이체, 또는 항체 단편의 항원 결합 부위), 폴리펩티드, 리간드의 수용체 결합 부분, 또는 혈소판, 예를 들면, 휴지 혈소판 또는 활성화된 혈소판에 특이적으로 결합하는 수용체의 리간드 결합 부분 중에서 적어도 하나를 포함한다. 예시적인 표적화 모이어티에는 표적화되는 분자에 결합하는 scFv 분자 또는 펩티드를 포함한다. 표적화 모이어티의 실례는 본 발명의 실시예와 도면에서 확인된다. 표적화 모이어티로서 유용한 다른 분자는 본 발명의 교시에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
A. 혈소판에 결합하는 항원 결합 부위
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체의 적어도 하나의 항원 결합 부분 (가령, 결합 부위)를 포함한다. 한 구체예에서, 항원 결합 부분은 폴리펩티드를 혈소판에 표적화시킨다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 용어 "항원-결합 부분"은 항원에 결합하거나, 또는 항원 결합 (즉, 특이적 결합)에 대해 본래 항체 (즉, 그들이 유래된 본래 항체)와 경쟁하는 면역글로불린, 항체, 또는 항체 변이체의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 가령, 상기 항원 결합 부분은 앞서 기술된 임의의 항체 또는 항체 변이체로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 부분은 당분야에 충분히 공지된 재조합 또는 생화학적 방법에 의해 생산될 수 있다. 예시적인 항원-결합 부분에는 Fv, Fab, Fab', (Fab')2, 그리고 scFv 분자가 포함된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 단일 사슬 결합 분자로부터 결합 부위 (가령, 단일 사슬 가변 영역 또는 scFv)를 포함할 수 있다. 단일 사슬 항체의 생산을 위해 설명된 기술 (U.S. 특허 번호 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); 그리고 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989))은 단일 사슬 결합 분자를 생산하기 위해 개작될 수 있다. 단일 사슬 항체는 아미노산 가교를 거쳐 Fv 영역의 중쇄와 경쇄 단편을 연결하여 단일 사슬 항체를 산출함으로써 형성된다. 대장균 (E coli)에서 기능적 Fv 단편의 조립을 위한 기술 역시 이용될 수 있다 (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)).
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 단일 사슬 가변 영역 서열 (scFv)을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 하나 이상의 결합 부위 또는 영역을 포함한다. 단일 사슬 가변 영역 서열은 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들면, 유연성 링커에 의해 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드를 포함한다. VL 및/또는 VH 도메인은 앞서 기술된 임의의 항체 또는 항체 변이체로부터 유래될 수 있다. ScFv 분자는 VH-링커-VL 배향 또는 VL-링커-VH 배향으로 작제될 수 있다. 항원 결합 부위를 구성하는 VL과 VH 도메인을 연결하는 유연성 링커는 바람직하게는, 약 10개 내지 약 50개 아미노산 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 gly-ser 폴리펩티드 링커이다. 예시적인 gly/ser 폴리펩티드 링커는 화학식 (Gly4Ser)n을 갖고, 여기서 n은 양의 정수 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)이다. 다른 폴리펩티드 링커는 당분야에 공지되어 있다. 단일 사슬 가변 영역 서열을 갖는 항체 (가령, 단일 사슬 Fv 항체) 및 상기 단일 사슬 항체를 만드는 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (예로써, Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837을 참조한다).
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 이용된 scFv 분자는 안정화된 scFv 분자이다. 한 구체예에서, 안정화된 cFv 분자는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 넣어진 scFv 링커를 포함할 수 있고, 여기서 VH와 VL 도메인은 VH 내에 아미노산 및 VL 도메인 내에 아미노산 사이에 이황화 결합에 의해 연결된다. 다른 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 최적화된 길이 또는 조성을 갖는 scFv 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 적어도 하나의 안정화 아미노산 치환(들)을 갖는 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 앞서 열거된 안정화 특징 중에서 적어도 2가지를 가질 수 있다.
안정화된 scFv 분자는 향상된 단백질 안정성을 갖거나, 또는 이 분자가 작동가능하게 연결된 폴리펩티드에 향상된 단백질 안정성을 부여한다. 본 발명의 바람직한 scFv 링커는 전통적인 폴리펩티드와 비교하여, 본 발명의 폴리펩티드의 열적 안정성을 적어도 약 2℃ 또는 3℃ 향상시킨다. 비교는 예로써, 본 발명의 scFv 분자 간에 이루어질 수 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, 안정화된 scFv 분자는 (Gly4Ser)4 scFv 링커 및 VH 아미노산 44와 VL 아미노산 100을 연결하는 이황화 결합을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드에 이용될 수 있는 다른 예시적인 안정화된 scFv 분자는 2006년 12월 8일 제출된 US 특허가출원 번호 60/873,996, 또는 2007년 3월 19일 제출된 US 특허 출원 번호 11/725,970에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입된다.
본 발명의 폴리펩티드는 당분야에 공인된 프로토콜을 이용하여 항체로부터 유래된 가변 영역 또는 이의 일부분 (가령, VL 및/또는 VH 도메인)을 포함할 수 있다. 가령, 가변 도메인은 비-인간 포유동물, 예를 들면, 뮤린, 기니 피그, 영장류, 토끼 또는 쥐를 항원 또는 이의 단편으로 면역화시킴으로써 상기 포유동물에서 생산된 항체로부터 유래될 수 있다. 전체적으로 참조로서 편입되는 Harlow & Lane, supra를 참조한다. 면역글로불린은 관련된 항원 (가령, 정제된 종양 연관된 항원, 또는 이런 항원을 포함하는 세포 또는 세포 추출물) 및 어쥬번트의 복수 피하 또는 복막내 주입에 의해 산출될 수 있다. 이러한 면역화는 전형적으로, 활성화된 비장세포 또는 림프구로부터 항원-반응성 항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 유도한다.
가변 영역이 면역화된 포유동물의 혈청으로부터 수확된 다중클론 항체로부터 유래될 수 있긴 하지만, 원하는 가변 영역이 유래되는 단일클론 항체 (MAb)의 균질한 제조물을 제공하기 위해 비장, 림프절 또는 말초 혈액으로부터 개별 림프구를 단리하는 것이 종종 바람직하다. 토끼 또는 기니 피그는 전형적으로, 다중클론 항체를 만드는데 이용된다. 생쥐는 전형적으로, 단일클론 항체를 만드는데 이용된다. 단일클론 항체는 항원 단편을 생쥐 내로 주입하고, "하이브리도마"를 제조하고, 그리고 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 하이브리도마를 스크리닝함으로써 단편에 반하여 제조될 수 있다. 이러한 충분히 공지된 과정 (Kohler et al., (1975), Nature, 256:495)에서, 항원이 주입된 생쥐로부터 수명이 상대적으로 짧은, 또는 수명이 한정된 림프구는 불멸 종양 세포주 (가령, 골수종 세포주)와 융합되고, 따라서 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"가 생산되고, 이들 둘 모두 불멸이고 B 세포에 의해 유전적으로 인코딩된 항체를 생산할 수 있다. 결과의 하이브리드는 선별, 희석, 그리고 단일 항체의 형성을 위한 특정한 유전자를 포함하는 각 개별 계통 (strain)으로 재성장에 의해 단일 유전자 계통으로 분리된다. 이들은 원하는 항원에 대하여 균질한 항체를 생산하고, 그리고 그들의 순수한 유전자 혈통 (parentage)과 관련하여, "단일클론"으로 명명된다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 융합되지 않은, 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 가급적 내포하는 적절한 배양 배지에서 접종되고 성장된다. 당업자는 하이브리도마의 형성, 선별과 성장을 위한 반응물, 세포주와 배지가 다수의 공급원으로부터 상업적으로 구입가능하고 표준화된 프로토콜이 충분히 확립되어 있다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 원하는 항원에 대항하는 단일클론 항체의 생산에 대해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 검정, 예를 들면, 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된다. 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 이후, 이들 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986)). 이들 서브클론에 의해 분비되는 단일클론 항체는 전통적인 정제 절차, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피 (가령, 단백질-A, 단백질-G, 또는 단백질-L 친화성 크로마토그래피), 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 또는 투석에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리될 수 있는 것으로 더욱 인지될 것이다.
선택적으로, 항체는 특정한 활성화 상태의 혈소판에, 또는 항원의 다른 비중복 단편에 대한 결합 없이 항원의 특정한 영역 또는 원하는 단편에 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 후자 스크리닝은 항원의 결실 돌연변이체의 수집물에 대한 항체의 결합을 결정하고, 그리고 어떤 결실 돌연변이체가 항체에 결합하는 지를 결정함으로써 달성될 수 있다. 결합은 예로써, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 항체에 대한 특이적 결합을 보이는 가장 작은 단편은 상기 항체의 에피토프 (epitope)를 규정한다. 대안으로, 에피토프 특이성은 검사 항체와 기준 항체가 항원에 대한 결합에 대해 경쟁하는 경쟁 검정에 의해 결정될 수 있다. 검사 항체와 기준 항체가 경쟁하면, 이들은 한 항체의 결합이 다른 항체의 결합을 간섭할 만큼 동일한 에피토프 또는 충분히 인접한 에피토프에 결합한다.
원하는 단일클론 항체 또는 이의 결합 부위를 인코딩하는 DNA는 불변 영역 도메인 서열의 단리를 위한 앞서 기술된 임의의 전통적인 절차 (가령, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이런 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능한다. 더욱 구체적으로, 단리된 DNA (이것은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 합성될 수 있다)는 함입을 위한 원하는 가변 영역 서열을 본 발명의 폴리펩티드 내에 클로닝하는데 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 결합 부위는 완전 인간 항체로부터 유래된다. 인간 또는 실질적으로 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생산의 능력이 없는 유전자도입 동물 (가령, 생쥐)에서 산출될 수 있다 (예로써, U.S. 특허 번호 6,075,181, 5,939,598, 5,591,669와 5,589,369를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 참조로서 편입된다). 가령, 키메라와 생식계열 돌연변이 생쥐에서 항체 중쇄 연결 영역의 동종접합성 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 저해를 유발하는 것으로 기술된다. 이런 생식계열 돌연변이 생쥐에 인간 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격 시에 인간 항체의 생산을 유발할 것이다. SCID 생쥐를 이용하여 인간 항체를 산출하는 다른 바람직한 수단은 본 발명에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 5,811,524에서 개시된다. 이들 인간 항체와 연관된 유전 물질 역시 본 명세서에서 기술된 바와 같이 단리되고 조작될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체의 변형된 형태로부터 유래된 항원 결합 부위, 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 예시적인 이런 형태에는 예로써, 미니바디 (minibody), 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 나노바디 (nanobody), 카멜리드 (camelid), Dabs, 4가 (tetravalent) 항체, 인트라디아바디 (intradiabody) (가령, Jendreyko et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:47813), 융합 단백질 (가령, 항체 사이토킨 융합 단백질, Fc 수용체의 적어도 일부분에 융합된 단백질), 그리고 이중특이적 항체가 포함된다. 다른 변형된 항체는 예로써, U.S. 특허 번호 4,745,055; EP 256,654; Faulkner et al., Nature 298:286 (1982); EP 120,694; EP 125,023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255,694; EP 266,663; 그리고 WO 88/03559에서 기술된다. 재분류된 면역글로불린 사슬 역시 공지되어 있다. 예로써, U.S. 특허 번호 4,444,878; WO 88/03565; 그리고 EP 68,763 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 디아바디 또는 이로부터 유래된 항원 결합 부위인 항원 결합 부위 또는 영역을 포함한다. 디아바디는 이합성, 4가 분자이고, 이들 분자 각각은 scFv 분자와 유사한 폴리펩티드를 갖지만, 통상적으로 양쪽 가변 도메인을 연결하는 짧은 (가령, 10개 미만, 바람직하게는 1-5개) 아미노산 잔기 링커를 갖고, 따라서 동일한 폴리펩티드 사슬에서 VL과 VH 도메인이 상호작용할 수 없다. 그 대신에, 한 폴리펩티드 사슬의 VL과 VH 도메인이 두 번째 폴리펩티드 사슬에서 VH와 VL 도메인 (각각)과 상호작용한다 (예로써, WO 02/02781을 참조한다). 한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 유전적으로-융합된 Fc 영역 (즉, scFc 영역)의 N-말단 및/또는 C-말단에 작동가능하게 연결된 디아바디를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 단일 도메인 결합 분자 (가령, 단일 도메인 항체)를 표적화 모이어티로서 포함한다. 예시적인 단일 도메인 분자는 항체의 단리된 중쇄 가변 도메인 (VH), 다시 말하면, 경쇄 가변 도메인 없이 중쇄 가변 도메인, 그리고 항체의 단리된 경쇄 가변 도메인 (VL), 다시 말하면, 중쇄 가변 도메인 없이 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 본 발명의 결합 분자에 이용되는 예시적인 단일-도메인 항체는 예로써, Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), 그리고 Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)에서 기술된 바와 같은 카멜리드 중쇄 가변 도메인 (약 118개 내지 136개의 아미노산 잔기)을 포함한다. 다른 예시적인 단일 도메인 항체는 Dabs® (Domantis Ltd., Cambridge, UK)로 알려져 있는 단일 VH 또는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 단일 도메인 항체는 상어 항체 (가령, 상어 Ig-NAR)을 포함한다. 상어 Ig-NAR은 1개의 가변 도메인 (V-NAR) 및 5개의 C-유사 불변 도메인 (C-NAR)의 동종이합체를 포함하고, 여기서 다양성 (diversity)이 5 내지 23개 잔기 길이에서 변하는 신장된 CDR3 영역에서 집중된다. 카멜리드 종 (가령, 야마)에서, VHH로 지칭되는 중쇄 가변 영역이 전체 항원-결합 도메인을 형성한다. 카멜리드 VHH 가변 영역 및 전통적인 항체로부터 유래된 것들 (VH) 사이에 주요한 차이는 (a) VHH에서 상응하는 영역과 비교하여 VH의 경쇄 접촉 표면에서 더욱 소수성 아미노산, (b) VHH에서 더욱 긴 CDR3, 그리고 (c) VHH에서 CDR1과 CDR3 사이에 이황화 결합의 빈번한 발생을 포함한다. 단일 도메인 결합 분자를 만드는 방법은 US 특허 번호 6.005,079와 제6,765,087호에서 기술되고, 이들 둘 모두 본 발명에 참조로서 편입된다. VHH 도메인을 포함하는 예시적인 단일 도메인 항체에는 Nanobodies® (Ablynx NV, Ghent, Belgium)가 포함된다.
본 발명의 결합 분자에서 이용을 위한 결합 부위가 유래될 수 있는 예시적인 항체는 당분야에 공지되어 있다. 이런 표적화 모이어티의 실례에는 활성 혈소판에만 결합하는 SCE5와 MB9 가변 영역이 포함된다 (Schwarz et al. 2004 FASEB Journal express article 10.1096/fj.04-1513fje; Schwarz et al. 2006 Circulation Research. 99:25-33; U.S. Patent publication 20070218067). 다른 구체예에서, 표적화 모이어티는 GPIIbIIIa의 활성/비활성 입체형태 둘 모두에 결합한다. 이런 표적화 모이어티의 실례는 AP3 항체의 가변 영역이다 (Peterson et al. 2003. Hemostasis, Thrombosis, and Vascular Biology 101:937; WO 2010115866).
B. 비-면역글로불린 혈소판 결합 분자
일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 비-면역글로불린 결합 분자로부터 유래된 하나 이상의 혈소판 결합 부위를 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "비-면역글로불린 결합 분자"는 결합 부위가 면역글로불린 이외의 폴리펩티드로부터 유래된 부분 (가령, 스카폴드 또는 프레임워크)을 포함하지만, 혈소판 표적에 대한 원하는 결합 특이성을 공여하기 위해 조작 (가령, 돌연변이)될 수 있는 결합 분자이다. 항체 분자로부터 유래되지 않은 결합 부위를 포함하는 결합 분자의 다른 실례에는 수용체 결합 부위 및 혈소판에 결합하는 리간드 결합 부위가 포함된다.
비-면역글로불린 결합 분자는 인공적으로 다양화된 결합 부위를 갖는 결합 분자의 라이브러리로부터 표적-결합 변이체의 선별 또는 단리에 의해 확인될 수 있다. 다양화된 라이브러리는 완전한 무작위 접근법 (가령, 오류-유발 (error-prone) PCR, 엑손 재편성 (exon shuffling), 또는 유도 진화 (directed evolution))을 이용하여, 또는 당분야에 공인된 설계 전략의 보조를 받아 산출될 수 있다. 가령, 결합 부위가 이의 동족 (cognate) 표적 분자와 상호작용할 때 통상적으로 관련되는 아미노산 위치는 상응하는 위치에서 축퇴 코돈, 트리뉴클레오티드, 무작위 펩티드, 또는 전체 루프를, 결합 부위를 인코딩하는 핵산 내에 삽입함으로써 무작위화될 수 있다 (예로써, U.S. 공개 번호 20040132028을 참조한다). 아미노산 위치의 소재는 표적 분자와 복합된 결합 부위의 결정 구조의 조사에 의해 확인될 수 있다. 무작위화를 위한 후보 위치에는 루프, 편평한 표면, 나선, 그리고 결합 부위의 결합강 (binding cavity)이 포함된다. 일정한 구체예에서, 다양화를 위한 후보일 것으로 생각되는 결합 부위 내에 아미노산은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 무작위화 이후에, 다양화된 라이브러리는 이후, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 결합 특징을 갖는 결합 분자, 예를 들면, 특이적 결합 혈소판을 획득하기 위한 선별 또는 스크리닝 절차에 종속될 수 있다. 선별은 당분야에 공인된 방법, 예를 들면, 파아지 전시 (phage display), 효모 전시 (yeast display), 또는 리보솜 전시 (ribosome display)에 의해 달성될 수 있다. 한 구체예에서, 혈소판에 결합하는 것으로 당분야에 공지된 분자가 본 발명의 구조체에 이용될 수 있다. 가령, 당분야에 기술된 바와 같은 GPIba에 결합하는 펩티드 (가령, PS4, 0S1, 또는 0S2)가 이용될 수 있다 (Benard et al. 2008. Biochemistry 47:4674-4682).
IV. 활성화가능 응고 인자
우회 요법 (bypass therapy)을 위해 제공된 응고 인자는 활성화된 형태로 제공될 때 유효한데, 그 이유는 외인성 응고 인자가 종종, 효과적일 만큼 충분하게 동역학적으로 활성화되지 않기 때문이다. 하지만, 이들은 또한, 내인성 경로 (가령, 항트롬빈 III 또는 TFPI)에 의해 급속하게 비활성화되어, 활성 형태의 제거 및 짧은 효과적 반감기를 유발한다. 한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 "활성화가능"하다. 이런 활성화가능 구조체는 더욱 긴 반감기를 갖는 증강된 치모겐으로서 순환하지만, 필요할 때 응고 부위에서 용이하게 개열될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 활성화가능 구조체는 예로써, 인자 XIa, Xa, 또는 트롬빈 개열 부위를 포함하는 개열가능 링커 (이것은 각각, 인자 XIa, Xa, 또는 트롬빈에 의해 개열된다)를 포함하고 덩어리의 부위에서 응고 인자의 활성 형태의 형성을 유발한다. 예시적인 인자 FXIa 개열 부위에는 예로써, TQSFNDFTR 및 SVSQTSKLTR이 포함된다. 예시적인 트롬빈 개열 부위에는 예로써, DFLAEGGGVR, TTKIKPR, 그리고 ALRPR을 포함하거나 이것으로 구성되는 서열 (가령, ALRPRVVGGA)이 포함된다.
한 구체예에서, 개열가능 링커는 스페이서 모이어티에 의해 하나 이상의 측면 (상류, 하류 또는 둘 모두)에서 접할 수 있다.
한 구체예에서, 개열가능 링커는 응고 인자의 경쇄와 중쇄 사이에 넣어진다. 다른 구체예에서, 개열가능 링커는 응고 인자의 경쇄와 중쇄 사이에 넣어지지 않는다. 한 구체예에서, 개열가능 링커는 중쇄의 아미노 말단에 위치한다.
예시적인 활성화가능 구조체는 첨부된 도면 및 하기 실시예에서 도시된다.
V. 스카폴드 모이어티
본 발명의 일부 구체예는 스카폴드 모이어티를 포함하고, 이것은 예로써, 단백질 모이어티, cscFc 영역, Fc 모이어티, 알부민, XTEN 등에서 선택될 수 있다.
A. 단백질 모이어티
한 구체예에서, 스카폴드는 단백질 모이어티이다. 이런 모이어티는 완전 단백질 또는 이의 일부분, 또는 합성 분자를 포함할 수 있다. 바람직한 단백질 모이어티는 구조체 내로 통합될 때 본 발명의 키메라 응고 인자의 반감기를 향상시킬 만큼 충분한 분자 크기를 갖는다. 가령, 한 구체예에서, 인공 단백질, XTEN이 스카폴드로서 구조체 내에 포함될 수 있다 (Schellenberger et al. 2009. 27:1186). 다른 구체예에서, 알부민 (가령, 인간 혈청 알부민)이 본 발명의 구조체 내에 포함될 수 있다. 가령, 당분야에 공지된 바와 같이, 혈청 알부민 (가령, HSA)이 단백질 스카폴드로서 이용될 수 있다. 특히, HSA의 다양한 도메인과 하위-도메인은 혈청 알부민 스카폴드-기초된 단백질 라이브러리의 산출을 위한 돌연변이 또는 무작위화를 매우 쉽게 받아들이는 구조를 갖는다. 본 발명에 이용될 수 있는 알부민, 예를 들면, 이의 단편의 실례는 예로써, U.S. 특허 번호 7,592,010; U.S. 특허 번호 6,686,179; 그리고 Schulte, Thrombosis Res. 124 Suppl. 2:S6-S8 (2009)에 공지되어 있고, 이들 각각은 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입된다.
B. scFc 영역
한 구체예에서, 본 발명에서는 단일 폴리펩티드 사슬 내에 적어도 하나의 유전적으로 융합된 Fc 영역 또는 이의 일부분 (즉, 단일-사슬 Fc (scFc) 영역을 포함하는 폴리펩티드), 한 구체예에서, cscFc를 포함하는 폴리펩티드를 제시한다.
한 구체예에서, FVII, FIX와 FX로 구성된 군에서 선택되는 응고 인자, 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 및 선택적으로 응고 인자와 표적화 모이어티 사이에 스페이서 모이어티를 포함하는 키메라 응고 인자. 다른 구체예에서, FVII를 포함하는 폴리펩티드, 상기 FVII는 응고 캐스케이드의 성분에 의해 활성화가능한 이종성 효소적 개열 부위를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 가공되지 않은 폴리펩티드를 제시하고, 여기서 동일한 선형 폴리펩티드 사슬 내에 적어도 2개의 Fc 모이어티 또는 도메인 (가령, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상의 Fc 모이어티 또는 도메인)은 접힘 (가령, 분자내 또는 분자간 접힘)되어 Fc 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 1개의 기능적 scFc 영역을 형성할 수 있다. 가령, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 반감기를 향상시키거나 면역 효과기 기능 (immune effector function) (가령, 항체-의존성 세포독성 (ADCC), 식작용, 또는 보체-의존성 세포독성 (CDCC))을 유인하기 위해 및/또는 제조가능성을 향상시키기 위해, scFc 영역을 거쳐 적어도 하나의 Fc 수용체 (가령, FcRn, FcγR 수용체 (가령, FcγRIII), 또는 보체 단백질 (가령, C1q))에 결합할 수 있다.
대안적 설계의 다양한 폴리펩티드는 본 발명의 범위 내에 있다. 가령, 한 구체예에서, 폴리펩티드는 하기 모이어티를 포함한다:
A-F1-P1-L-P2-B-F2 (I)
아미노에서부터 카르복시 말단까지의 선형 서열에서, A는 존재하면, 응고 인자 또는 이의 일부분이고, F1은 첫 번째 Fc 모이어티 또는 도메인이고, P1은 효소적 개열 부위이고, L은 ScFc 링커이고, P2는 효소적 개열 부위이고, B는 존재하면, 응고 인자 또는 이의 일부분이고, F2는 두 번째 Fc 모이어티 또는 도메인이고, 그리고 "-"는 펩티드 결합이다. 화학식 (I)은 적어도 A 또는 B 및 선택적으로 둘 모두를 포함한다. A와 B는 둘 모두 존재하면, 응고 인자의 상응하는 중쇄와 경쇄일 수 있다. 화학식 (I)은 적어도 P1 또는 P2 및 선택적으로 둘 모두를 포함한다. P1과 P2는 둘 모두 존재하면, 동일하거나 상이할 수 있다. 화학식 (I)은 적어도 F1과 F2를 포함한다. F1과 F2는 둘 모두 존재하면, 동일하거나 상이할 수 있다.
화학식 I에 따른 예시적인 폴리펩티드에는 A-F1-P1-L-P2-F2; F1-P1-L-P2-B-F2; A-F1-P1-L-F2; F1-P1-L-B-F2; A-F1-L-P2-F2; 그리고 F1-L-P2-B-F2가 포함된다.
한 구체예에서, F1과 F2는 각각, CH2와 CH3 모이어티를 포함한다.
한 구체예에서, cscFc 링커 (L)의 개열과 실질적인 제거후, 본 발명의 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 첫 번째 Fc 모이어티에 연결된 A를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드 사슬은 두 번째 Fc 모이어티에 연결된 B를 포함하고, 여기서 F1과 F2는 이합체되어 Fc 영역을 형성한다. 한 구체예에서, A와 B는 선택적으로 존재하고 응고 인자 또는 이의 일부분이다.
한 구체예에서, A는 응고 인자의 경쇄이고, 그리고 B는 응고 인자의 중쇄이다. 한 구체예에서, B는 응고 인자의 경쇄이고, 그리고 A는 응고 인자의 중쇄이다. 한 구체예에서, A와 B가 폴리펩티드 내에서 연관할 때, 폴리펩티드는 기능적 응고 인자, 예를 들면, FVII, FIX 또는 FX를 형성한다. 한 구체예에서, 이런 폴리펩티드는 세포로부터 분비 시에 효소적으로 활성이다.
i) Fc 모이어티 또는 도메인
본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위한 F1과 F2로서 유용한 Fc 모이어티는 다수의 상이한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드의 Fc 모이어티는 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 하지만, Fc 모이어티는 예로써, 설치류 (가령, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니 피그) 또는 비-인간 영장류 (가령, 침팬지, 짧은꼬리원숭이) 종을 비롯한 다른 포유동물 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있는 것으로 이해된다. 게다가, 폴리펩티드 Fc 도메인 또는 이의 일부분은 IgM, IgG, IgD, IgA와 IgE를 비롯한 임의의 면역글로불린 부류, 그리고 IgG1, IgG2, IgG3과 IgG4를 비롯한 임의의 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인간 아이소타입 IgG1이 이용된다.
다양한 Fc 모이어티 유전자 서열 (가령, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공개적으로 접근가능한 기탁물의 형태로 가용하다. 특정 효과기 기능을 갖는 (또는 특정 효과기 기능이 없는), 또는 면역원성 (immunogenicity)을 감소시키기 위한 특정한 변형을 갖는 Fc 모이어티 서열을 포함하는 불변 영역 도메인이 선택될 수 있다. 항체와 항체-인코딩 유전자의 많은 서열이 공개되어 있고, 그리고 적절한 Fc 모이어티 서열 (가령, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 서열, 또는 이들의 일부분)이 당분야에 공인된 기술을 이용하여 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 전술한 임의의 방법을 이용하여 획득된 유전 물질은 이후, 본 발명의 폴리펩티드를 획득하기 위해 변경되거나 합성될 수 있다. 본 발명의 범위는 불변 영역 DNA 서열의 대립유전자, 변이체와 돌연변이를 포함하는 것으로 더욱 인지될 것이다.
Fc 모이어티 서열은 예로써, 목적 도메인을 증폭하기 위해 선택된 중합효소 연쇄 반응과 프라이머를 이용하여 클로닝될 수 있다. 항체로부터 Fc 모이어티 서열을 클로닝하기 위하여, mRNA는 하이브리도마, 비장, 또는 림프 세포로부터 단리되고, DNA로 역전사되고, 그리고 항체 유전자가 PCR에 의해 증폭될 수 있다. PCR 증폭 방법은 U.S. 특허 번호 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 그리고 예로써, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270)에서 상세하게 기술된다. PCR은 공통의 불변 영역 프라이머에 의해, 또는 공개된 중쇄와 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초된 더욱 특정한 프라이머에 의해 시작될 수 있다. 앞서 논의된 바와 같이, PCR은 또한, 항체 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 DNA 클론을 단리하는데 이용될 수 있다. 이러한 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더욱 큰 상동한 프로브, 예를 들면, 생쥐 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 다수의 프라이머 세트는 당분야에 공지되어 있다 (가령, 정제된 항체의 N-말단 서열에 기초된 5' 프라이머 (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); cDNA 단부의 신속한 증폭 (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); 항체 리더 서열 (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). 항체 서열의 클로닝은 1995년 1월 25일 제출된 Newman et al., U.S. 특허 번호 5,658,570에 더욱 기술되고, 이것은 본 발명에 참조로서 편입된다.
본 발명의 폴리펩티드는 2개 이상의 Fc 모이어티 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 Fc 모이어티)를 포함할 수 있다. 이들 2개 이상의 Fc 모이어티는 Fc 영역을 형성할 수 있다. 한 구체예에서, Fc 모이어티는 상이한 유형일 수 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드 내에 존재하는 적어도 하나의 Fc 모이어티는 힌지 도메인 또는 이의 일부분을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 일부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 CH4 도메인 또는 이의 일부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 힌지 도메인 또는 이의 일부분 및 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부분 (가령, 힌지-CH2 배향으로)을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부분 및 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 일부분 (가령, CH2-CH3 배향으로)을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예로써, 힌지-CH2-CH3, 힌지-CH3-CH2, 또는 CH2-CH3-힌지 배향으로 적어도 하나의 힌지 도메인 또는 이의 일부분, 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부분, 그리고 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 일부분을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다.
일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 적어도 하나의 완전한 Fc 영역 (가령, 힌지, CH2, 그리고 CH3 도메인을 포함하는 Fc 도메인, 하지만 이들은 동일한 항체로부터 유래될 필요가 없다)을 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 적어도 2개의 완전한 Fc 영역을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 완전한 Fc 모이어티는 인간 IgG 면역글로불린 중쇄 (가령, 인간 IgG1)로부터 유래된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 완전한 CH3 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티 (EU 넘버링에 따르면, 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 341-438)를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 완전한 CH2 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티 (EU 넘버링에 따르면, 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 231-340)를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 CH3 도메인, 그리고 적어도 하나의 힌지 영역 (EU 넘버링에 따르면, 항체 Fc 영역의 대략 아미노산 216-230), 그리고 CH2 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 힌지 및 CH3 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 힌지, CH2, 그리고 CH3 도메인을 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 바람직한 구체예에서, Fc 모이어티는 인간 IgG 면역글로불린 중쇄 (가령, 인간 IgG1)로부터 유래된다. 한 구체예에서, Fc 모이어티는 EU 번호 221 내지 447에 상응하는 아미노산을 포함하거나 이것으로 구성된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 FcRn 결합 상대를 포함하는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. FcRn 결합 상대는 FcRn 결합 상대의 FcRn 수용체에 의한 결과의 활성 수송으로 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자 또는 이의 일부분이다. "특이적으로 결합된"은 생리 조건 하에 상대적으로 안정된 복합체를 형성하는 2개의 분자를 지칭한다. 특이적 결합은 통상적으로 낮은 친화성 (affinity) 및 중간 내지 높은 수용력 (capacity)을 갖는 비-특이적 결합으로부터 구별되는, 높은 친화성 및 낮은 내지 중간 수용력으로 특징된다. 전형적으로, 결합은 친화성 상수 KA가 106 M-1, 또는 더욱 바람직하게는 108 M-1보다 높을 때 특이적인 것으로 간주된다. 필요하면, 결합 조건을 변화시킴으로써 특이적 결합에 실질적인 영향을 주지 않으면서 비-특이적 결합이 감소될 수 있다. 적절한 결합 조건, 예를 들면, 분자의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 차단제 (가령, 혈청 알부민, 동물성 카제인)의 농도 등은 일과적인 기술을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
FcRn 수용체는 인간을 비롯한 여러 포유동물 종으로부터 단리된다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 쥐 FcRn, 그리고 생쥐 FcRn의 서열은 공지되어 있다 (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn 수용체는 상대적으로 낮은 pH에서 IgG에 결합하고 (다른 면역글로불린 부류, 예를 들면, IgA, IgM, IgD, 그리고 IgE에 결합하지 않음), 내강에서 관세포로 IgG를 장막 방향으로 능동적으로 수송하고, 이후 간질액 (interstitial fluid)에서 발견되는 상대적으로 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이것은 폐와 장 상피 (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), 신장 근위 세뇨관 상피 (renal proximal tubular epithelium) (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), 그리고 코 상피, 질 표면 및 담도계 표면을 비롯한 성체 상피 조직 (U.S. 특허 번호 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1)에서 발현된다.
본 발명의 FcRn 결합 상대는 완전 IgG, IgG의 Fc 단편, 그리고 FcRn 수용체의 완전한 결합 영역을 포함하는 기타 단편을 비롯하여, FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X-선 결정학 (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379)에 기초하여 기술된다. Fc의 FcRn과의 주요 접촉 부위는 CH2와 CH3 도메인의 이음부 근처이다. Fc-FcRn 접촉은 전체가 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 상대에는 완전 IgG, IgG의 Fc 단편, 그리고 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 기타 단편이 포함된다. 주요 접촉 부위에는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311과 314, 그리고 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428과 433-436이 포함된다. 면역글로불린, 또는 면역글로불린 단편 또는 영역의 아미노산 넘버링에 대한 언급은 전체가 Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md에 기초된다.
IgG의 Fc 영역은 FcRn에 의해 결합되는 변형된 IgG 또는 이의 Fc 단편 또는 일부분을 산출하기 위해 널리 공지된 절차, 예를 들면, 특정 부위 돌연변이유발 등에 따라 변형될 수 있다. 이런 변형에는 FcRn 접촉 부위로부터 원위에 변형뿐만 아니라 FcRn에 대한 결합을 보존하거나 심지어 증강시키는 접촉 부위 내에 변형이 포함된다. 가령, 인간 IgG1 Fc (Fc γ1)에서 하기 단일 아미노산 잔기가 FcRn에 대한 Fc 결합 친화성의 유의미한 상실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, 그리고 K447A, 여기서 예로써, P238A는 위치 번호 238에서 알라닌에 의해 치환된 야생형 프롤린을 나타낸다. 실례로써, 한 가지 특정 구체예는 N297A 돌연변이를 통합하고 고도로 보존된 N-당화 부위를 제거한다. 알라닌 이외에, 다른 아미노산이 앞서 특정된 위치에서 야생형 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 돌연변이는 Fc 내로 단독으로 도입되어 고유 Fc와 상이한 100개 이상의 FcRn 결합 상대가 산출될 수 있다. 부가적으로, 이들 개별 돌연변이 중에서 2개, 3개, 또는 그 이상의 조합이 함께 도입되어 수백 개 이상의 FcRn 결합 상대가 산출될 수 있다. 게다가, 본 발명의 구조체의 FcRn 결합 상대 중에서 하나가 돌연변이되고 나머지 FcRn 결합 상대가 돌연변이되지 않거나, 또는 이들 모두 상이한 돌연변이로 돌연변이될 수 있다. 생물학적 활성 분자 (가령, EPO, IFN, 인자 VII, 인자 IX, T20)에 상관없이, N297A를 비롯한 본 명세서에서 기술된 임의의 돌연변이가 Fc를 변화시키는데 이용될 수 있다.
일정한 상기 돌연변이는 FcRn 결합 상대에 새로운 기능성 (functionality)을 공여할 수 있다. 가령, 한 구체예는 N297A를 통합하고 고도로 보존된 N-당화 부위를 제거한다. 이러한 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시켜 FcRn 결합 상대의 순환 반감기 (circulating half life)를 증강시키고, 그리고 FcRn에 대한 친화성을 약화시키지 않으면서 FcRn 결합 상대가 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 그리고 FcγRIIIA에 결합할 수 없도록 만드는 것이다 (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). 앞서 기술된 돌연변이로부터 발생하는 새로운 기능성의 추가 실례로서, FcRn에 대한 친화성이 일부 경우에 야생형의 친화성을 넘어 증가될 수 있다. 이러한 증가된 친화성은 증가된 "온 (on)" 비율, 감소된 "오프 (off)" 비율, 또는 증가된 "온" 비율과 감소된 "오프" 비율 둘 모두를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 증가된 친화성을 향상시키는 것으로 생각되는 돌연변이에는 T256A, T307A, E380A, 그리고 N434A가 포함된다 (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
부가적으로, 적어도 3개의 인간 Fc 감마수용체는 하부 힌지 영역 내에서 IgG 상에 결합 부위, 일반적으로 아미노산 234-237을 인식하는 것으로 생각된다. 이런 이유로, 새로운 기능성 및 잠재적인 감소된 면역원성의 다른 실례는 이러한 영역의 돌연변이로부터, 예를 들면, 인간 IgG1 "ELLG"의 아미노산 233-236을 IgG2 "PVA" (1개의 아미노산 결실 보유)로부터 상응하는 서열로 대체함으로써 발생할 수 있다. 다양한 효과기 기능을 매개하는 FcγRI, FcγRII, 그리고 FcγRIII은 이런 돌연변이가 도입될 때 IgG1에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 및 Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
한 구체예에서, FcRn 결합 상대는 서열 PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 12)을 포함하고, 그리고 HQSLGTQ (SEQ ID NO: 13), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 14), HQNISDGK (SEQ ID NO: 24), 또는 VISSHLGQ (SEQ ID NO: 25) (U.S. 특허 번호 5,739,277)에서 선택되는 서열을 선택적으로 더욱 포함하는 폴리펩티드이다.
2개의 FcRn 수용체가 단일 Fc 분자에 결합할 수 있다. 결정학 데이터는 각 FcRn 분자가 Fc 동종이합체의 단일 폴리펩티드에 결합한다는 것을 암시한다. 한 구체예에서, FcRn 결합 상대, 예를 들면, IgG의 Fc 단편을 생물학적 활성 분자에 연결하는 것은 경구, 볼, 혀밑, 직장, 질, 코 또는 폐 루트를 통해 투여된 에어로졸로서, 또는 눈 루트를 통해 생물학적 활성 분자를 전달하는 수단을 제공한다. 다른 구체예에서, 키메라 단백질은 침습성으로, 예를 들면, 피하, 정맥내 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 Fc 모이어티를 구성하는 불변 영역 도메인 또는 이들의 일부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드는 IgG1 분자로부터 유래된 CH2 도메인 또는 이의 일부분, 그리고 IgG3 분자로부터 유래된 CH3 영역 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 폴리펩티드는 IgG1 분자로부터 부분적으로 유래되고 IgG3 분자로부터 부분적으로 유래된 힌지 도메인을 포함하는 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, Fc 모이어티는 자연적으로 발생하는 항체 분자와 아미노산 서열에서 달라지도록 변경될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 Fc 영역에 Fc 수용체 (FcR) 결합 성질을 공여할 만큼 충분한 하나 이상의 절두된 Fc 모이어티를 포함하는 scFc 영역을 포함한다. 가령, FcRn에 결합하는 Fc 도메인의 부분 (즉, FcRn 결합 부분)은 IgG1, EU 넘버링의 대략 아미노산 282-438을 포함하고, 일차 접촉 부위가 CH2 도메인의 아미노산 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, 그리고 314, 그리고 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428, 그리고 433-436이다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드의 Fc 모이어티는 FcRn 결합 부분을 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3과 IgG4를 비롯한 임의의 아이소타입의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 인간 아이소타입 IgG1의 항체로부터 FcRn 결합 부분이 이용된다. 다른 구체예에서, 인간 아이소타입 IgG4의 항체로부터 FcRn 결합 부분이 이용된다.
한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 완전한 Fc 영역의 하나 이상의 불변 영역 도메인이 없다, 다시 말하면, 이들은 부분적으로 또는 완전하게 결실된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 전체 CH2 도메인이 없을 것이다 (△CH2 구조체). 당업자는 이런 구조체가 항체의 이화작용 비율 (catabolic rate)에 대한 CH2 도메인의 조절 성질로 인하여 선호될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 IgG1 인간 불변 영역 도메인을 인코딩하는 벡터 (가령, IDEC Pharmaceuticals, San Diego)로부터 유래된 CH2 도메인-결실된 Fc 영역을 포함한다 (예로써, WO 02/060955A2와 WO02/096948A2를 참조한다). 이러한 예시적인 벡터는 CH2 도메인이 결실되고 도메인-결실된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터가 제공되도록 조작된다. 주목할 점은 이들 예시적인 구조체가 가급적, 결합 CH3 도메인이 개별 Fc 도메인의 힌지 영역에 직접적으로 융합되도록 조작된다는 것이다.
다른 구조체에서, 하나 이상의 구조성 Fc 모이어티 사이에 스페이서 모이어티를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 가령, 스페이서 모이어티는 힌지 영역과 CH2 도메인 사이에 및/또는 CH2와 CH3 도메인 사이에 놓일 수 있다. 가령, 조화성 구조체가 발현될 수 있는데, 여기서 CH2 도메인이 결실되고 나머지 CH3 도메인 (합성 또는 비합성)이 5 - 20개 아미노산 스페이서 모이어티로 힌지 영역에 연결된다. 이런 스페이서 모이어티는 예로써, 불변 영역 도메인의 조절 요소가 자유롭고 접근가능한 상태로 남아있거나, 또는 힌지 영역이 유연한 상태로 남아있도록 담보하기 위해 부가될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명과 조화성인 임의의 링커 펩티드는 상대적으로 비-면역원성이고 scFc 영역의 적절한 접힘을 방해하지 않을 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 동일한 또는 실질적으로 동일한 서열 조성의 Fc 모이어티를 포함하는 이합성 Fc 영역 (본 명세서에서, "동종이합성 Fc 영역"으로 명명됨)을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 상이한 서열 조성을 갖는 적어도 2개의 Fc 모이어티를 포함하는 이합성 Fc 영역 (즉, 본 명세서에서 "헤테로이합성 Fc 영역"으로 명명됨)을 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 헤테로이합성 Fc 영역은 첫 번째 Fc 모이어티에서 아미노산 치환 (가령, EU 위치 297에서 아스파라긴의 아미노산 치환)을 포함하지만, 두 번째 Fc 모이어티에서 아미노산 치환을 포함하지 않는다.
일정한 구체예에서, Fc 영역은 반-당화된다. 가령, 헤테로성 scFc 영역은 첫 번째 당화된 Fc 모이어티 (가령, 당화된 CH2 영역) 및 두 번째 비당화된 Fc 모이어티 (가령, 비당화된 CH2 영역)를 포함할 수 있고, 여기서 당화된 Fc 모이어티와 비당화된 Fc 모이어티 사이에 링커가 넣어진다. 다른 구체예에서, Fc 영역은 완전히 당화된다, 다시 말하면, Fc 모이어티 전체가 당화된다. 또 다른 구체예에서, Fc 영역은 비당화될 수 있다, 다시 말하면, Fc 모이어티 중에서 어느 것도 당화되지 않는다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 이용된 Fc 모이어티는 예로써, 아미노산 돌연변이 (가령, 부가, 결실, 또는 치환)에 의해 변경된다. 가령, 한 구체예에서, Fc 모이어티는 이러한 Fc 모이어티가 유래되는 야생형 Fc와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 가령, Fc 모이어티가 인간 IgG1 항체로부터 유래되는 경우에, 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역의 상응하는 위치에서 야생형 아미노산과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이 (가령, 치환)를 포함한다.
Fc 변이체의 아미노산 치환(들)은 항체 내에 Fc 영역에서 잔기에 제공된 위치 번호 (EU 넘버링 협약을 이용하여 설명됨)에 상응하는 것으로 지칭되는 Fc 모이어티 내에 위치에서 위치될 수 있다. 당업자는 Fc 모이어티 내에 위치에 상응하는 EU 번호가 무엇인지를 결정하기 위한 정렬을 용이하게 산출할 수 있다.
한 구체예에서, Fc 변이체는 힌지 도메인 또는 이의 일부분 내에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 변이체는 CH2 도메인 또는 이의 일부분 내에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 변이체는 CH3 도메인 또는 이의 일부분 내에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 변이체는 CH4 도메인 또는 이의 일부분 내에 위치된 아미노산 위치에서 치환을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 예로써, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 적어도 1개 아미노산 위치 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 위치 또는 그 이상의 간격에 의해 서로로부터 공간적으로 이격되어 배치될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 조작된 아미노산은 적어도 5, 10, 15, 20, 또는 25개 아미노산 위치 또는 그 이상의 간격에 의해 서로로부터 공간적으로 이격되어 배치된다.
일정한 구체예에서, Fc 변이체는 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역에 의해 부여된 적어도 하나의 효과기 기능에서 변화 (가령, Fc 수용체 (가령, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질 (가령, C1q)에 결합하거나, 또는 항체-의존성 세포독성 (ADCC), 식작용, 또는 보체-의존성 세포독성 (CDCC)을 유인하는 Fc 영역의 능력에서 향상 또는 감소)를 공여한다. 다른 구체예에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 효과기 기능 및/또는 FcR 또는 FcRn 결합에서 변화 (가령, 증강 또는 감소)를 부여하는 것으로 공지된 당분야에 공인된 Fc 변이체를 이용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합 분자는 예로써, 국제 PCT 공개 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 그리고 WO06/085967A2; US 특허 공개 번호 US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; 또는 US 특허 번호 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 그리고 7,317,091에서 개시된 아미노산 위치 중에서 하나 이상에서 변화 (가령, 치환)를 포함할 수 있고, 이들 각각은 본 발명에 참조로서 편입된다. 한 구체예에서, 특정한 변화 (가령, 당분야에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정한 치환)가 개시된 아미노산 위치 중에서 하나 이상에서 만들어질 수 있다. 다른 구체예에서, 개시된 아미노산 위치 중에서 하나 이상에서 상이한 변화 (가령, 당분야에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 만들어질 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체의 항원-독립성 효과기 기능, 특히 항체의 순환 반감기를 변화시키는 Fc 모이어티에 대한 아미노산 치환을 포함한다.
이런 폴리펩티드는 이들 치환이 없는 폴리펩티드와 비교하여 FcRn에 대한 증가된 또는 감소된 결합을 나타내고, 이런 이유로 혈청에서 각각, 증가된 또는 감소된 반감기를 갖는다. FcRn에 대한 향상된 친화성을 갖는 Fc 변이체는 더욱 긴 혈청 반감기를 가질 것으로 기대되고, 그리고 이런 분자는 투여된 폴리펩티드의 긴 반감기가 예로써, 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 요망되는 포유동물을 치료하는 방법에 유용한 적용성을 갖는다 (예로써, US 특허 번호 7,348,004, 7,404,956, 그리고 7,862,820을 참조한다). 대조적으로, 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 더욱 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되고, 그리고 이런 분자는 예로써, 단축된 순환 시간이 예로써, 생체내 진단적 영상을 위해, 또는 출발 폴리펩티드가 연장된 기간 동안 순환 상태로 존재할 때 독성 부작용을 나타내는 상황에서 유리할 수 있는 포유동물에 투여하는데 유용하다. 감소된 FcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변이체는 또한, 태반을 교차할 가능성이 더욱 낮고, 따라서 임신 여성에서 질환 또는 장애의 치료에도 유용하다. 이에 더하여, 감소된 FcRn 결합 친화성이 바람직할 수 있는 다른 적용에는 뇌, 신장, 및/또는 간에서 국지화 (localization)가 요망되는 적용이 포함된다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 맥관구조로부터 신장 사구체의 상피를 교차하여 감소된 수송을 나타낸다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 뇌로부터 뇌 혈관 장벽 (BBB)을 교차하여 혈관 공간 (vascular space) 내로 감소된 수송을 나타낸다. 한 구체예에서, 변경된 FcRn 결합을 갖는 폴리펩티드는 Fc 모이어티의 "FcRn 결합 루프" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티 (가령, 1개 또는 2개의 Fc 모이어티)를 포함한다. FcRn 결합 루프는 야생형, 전장, Fc 모이어티의 아미노산 잔기 280-299 (EU 넘버링에 따름)로 이루어진다. 다른 구체예에서, 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 15 Å FcRn "접촉 구역 (contact zone)" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티 (가령, 1개 또는 2개 Fc 모이어티)를 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 15 Å FcRn "접촉 구역"은 야생형, 전장 Fc 모이어티의 하기 위치에서 잔기를 포함한다: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (EU 넘버링). 바람직한 구체예에서, 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 하기 EU 위치 중에서 임의의 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티 (가령, 1개 또는 2개 Fc 모이어티)를 포함한다: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (가령, N434A 또는 N434K), 그리고 438. 변경된 FcRn 결합 활성을 갖는 예시적인 아미노산 치환은 국제 PCT 공개 번호 WO05/047327에서 개시되고, 이것은 본 발명에 참조로서 편입된다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 폴리펩티드의 당화를 변화시키는 당분야에 공인된 아미노산 치환을 포함한다. 가령, 결합 폴리펩티드의 scFc 영역은 감소된 당화로 귀결되는 돌연변이 (가령, N- 또는 O-연결된 당화)를 갖는 Fc 모이어티를 포함하거나, 또는 야생형 Fc 모이어티의 변경된 당형 (glycoform) (가령, 적은 푸코오스 또는 푸코오스-없는 글리칸)을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 용매-노출된 표면에 위치하는 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 이의 유사체를 갖는 적어도 하나의 Fc 모이어티를 포함한다. 바람직하게는, 조작된 시스테인 잔기 또는 이의 유사체는 scFc 영역에 의해 공여된 효과기 기능을 간섭하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 이러한 변경은 Fc 수용체 (가령, FcγRI, FcγRII, 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질 (가령, C1q)에 결합하거나, 또는 면역 효과기 기능 (가령, 항체-의존성 세포독성 (ADCC), 식작용, 또는 보체-의존성 세포독성 (CDCC))을 유인하는 scFc 영역의 능력을 간섭하지 않는다.
한 구체예에서, 가공되지 않은 본 발명의 폴리펩티드는 본 명세서에서 기술된 Fc 모이어티에서 독립적으로 선택되는 구조성 Fc 모이어티 중에서 2개 이상을 갖는 유전적으로 융합된 Fc 영역 (즉, scFc 영역)을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 이합성 Fc 영역의 Fc 모이어티는 동일하다. 다른 구체예에서, Fc 모이어티 중에서 적어도 2개는 상이하다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드의 Fc 모이어티는 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 이들은 하나 이상의 아미노산 잔기 (가령, 약 5개 아미노산 잔기 (가령, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 잔기), 약 10개 잔기, 약 15개 잔기, 약 20개 잔기, 약 30개 잔기, 약 40개 잔기, 또는 약 50개 잔기)에 의해 길이에서 상이할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 Fc 모이어티는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열이 상이할 수 있다. 가령, Fc 모이어티 중에서 적어도 2개는 약 5개 아미노산 위치 (가령, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 위치), 약 10개의 위치, 약 15개의 위치, 약 20개의 위치, 약 30개의 위치, 약 40개의 위치, 또는 약 50개의 위치)에서 상이할 수 있다.
VI. 폴리펩티드 링커
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 링커"는 폴리펩티드 사슬의 선형 아미노산 서열에서 2개의 도메인을 연결하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 (가령, 합성 펩티드 또는 폴리펩티드 서열)을 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드는 구조체를 구성하는 2개의 Fc 모이어티를 직접적으로 또는 간접적으로 연결하는 폴리펩티드 링커를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 이들 링커는 본 명세서에서, "scFc 링커"로 지칭된다. scFc 링커가 선형 폴리펩티드 서열 내에서 2개의 Fc 모이어티를 인접하게 연결하면, 이것은 "직접적인" 연쇄이다. 대조적으로, scFc 링커가 첫 번째 Fc 모이어티를 결합 모이어티에 연결할 수 있고, 이것은 차례로, 두 번째 Fc 모이어티에 연결되고, 따라서 간접적인 연쇄가 형성된다. 이들 scFc 링커 (L)는 단일 사슬 유전자 구조체의 형성을 유발한다. 하지만, 한 구체예에서, scFc 폴리펩티드는 개열가능한 scFc 링커 (cscFc 링커)를 산출하는 효소적 개열 부위 역시 포함하고, 그리고 한 구체예에서, 실질적으로 제거된다 (가령, 세포에 의한 가공 동안). 따라서 가공된 분자는 적어도 2개의 아미노산 사슬을 포함하고 외부 링커 아미노산 서열이 실질적으로 없는 이합성 분자이다. 일부 구체예에서, 링커의 전체 또는 실질적으로 전체가 제거되고, 반면 일부 구체예에서, 개열 부위의 일부분, 예를 들면, RRRR 개열 부위의 4개 아르기닌이 남아있을 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 "스페이서"로 지칭되는 다른 유형의 폴리펩티드 링커가 상이한 모이어티, 예를 들면, 응고 인자 또는 표적화 모이어티를 Fc 모이어티에 연결하는데 이용될 수 있다. 이러한 유형의 폴리펩티드 링커는 폴리펩티드 분자에 유연성을 제공할 수 있다. 스페이서는 전형적으로 개열되지 않지만, 이런 개열이 바람직할 수도 있다. 스페이서의 예시적인 위치는 첨부된 도면에서 도시된다. 스페이서는 응고 인자, 표적화 모이어티, 및/또는 스카폴드 사이에, 예를 들면, 이들 모이어티의 N 또는 C 말단에 위치될 수 있다. 한 구체예에서, 이들 링커는 가공 동안 제거되지 않는다.
본 발명의 키메라 응고 인자 내에 존재할 수 있는 세 번째 유형의 링커는 개열 부위 (가령, 인자 XIa, Xa, 또는 트롬빈 개열 부위)를 포함하고, 그리고 개열 부위의 N 말단 또는 C 말단 중에서 어느 한쪽 또는 양쪽에서 추가의 스페이서 링커를 포함할 수 있는 개열가능 링커이다. 이들 개열가능 링커는 응고 인자 내로 통합될 때, 이종성 개열 부위를 갖는 키메라 분자를 산출한다. 이런 부위에 대한 예시적인 위치는 첨부된 도면에 도시되고 표적화 모이어티를 포함한다, 예를 들면, 표적화 모이어티에 인접한다. 다른 구체예에서, 이런 링커는 응고 인자 또는 이의 일부분에 인접할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 개열가능 링커는 응고 인자의 활성화가능 형태를 만들기 위해 응고 인자의 중쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 이런 경우에, 개열가능 링커는 개열 부위의 N 말단에서 추가의 스페이서 링커를 포함할 수 있지만, 응고 인자의 중쇄의 아미노 말단에 개열 부위의 C-말단의 직접적인 융합을 필요로 한다.
한 구체예에서, 본 발명의 가공되지 않은 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 사슬에 포함되는 Fc 영역을 형성하기 위해 cscFc 링커를 거쳐 연결된 2개 이상의 Fc 도메인 또는 모이어티를 포함한다. cscFc 링커는 적어도 하나의 효소적 개열 부위, 예를 들면, 세포내 효소에 의한 가공을 위한 부위에 접한다. 적어도 하나의 효소적 개열 부위에서 폴리펩티드의 개열은 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 산출한다. 한 구체예에서, cscFc 링커는 선택적으로 개열 부위를 거쳐, F1 또는 F2를 예로써, 응고 인자에 연결한다.
앞서 설명된 바와 같이, 예로써 응고 인자 또는 표적화 모이어티를 Fc 모이어티에 연결하기 위해 다른 폴리펩티드 링커가 본 발명의 구조체에 선택적으로 이용될 수 있다. 한 가지 유형의 폴리펩티드 링커가 본 명세서에서 스페이서로 지칭된다. 본 발명과 관련하여 이용될 수 있는 스페이서의 일부 예시적인 소재에는 예로써, GlySer 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 첨부된 도면에서 도시되고 하기에 더욱 상세하게 기술된 것들이 포함된다. 한 구체예에서, 스페이서는 응고 인자, 스카폴드 모이어티, 예를 들면, Fc, 개열 부위, 그리고 표적화 모이어티에서 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 모이어티에 인접할 수 있다.
한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 합성이다, 다시 말하면, 비-자연적으로 발생한다. 한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 아미노산의 첫 번째 선형 서열을 이 서열이 자연적으로 연결되지 않거나 자연에서 유전적으로 융합되지 않는 아미노산의 두 번째 선형 서열에 연결하거나 유전적으로 융합하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 (또는 폴리펩티드) (이것은 자연적으로 발생하거나 발생하지 않을 수 있다)를 포함한다. 가령, 한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드의 변형된 형태인 비-자연적으로 발생하는 폴리펩티드 (가령, 돌연변이, 예를 들면, 부가, 치환 또는 결실을 포함)를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 비-자연적으로 발생하는 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 자연에서 발생하지 않는 선형 서열에서 발생하는 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
가령, 일정한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 동일한 Fc 모이어티를 융합하여 동종성 scFc 영역을 형성하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 상이한 Fc 모이어티 (가령, 야생형 Fc 모이어티 및 Fc 모이어티 변이체)를 융합하여 헤테로성 scFc 영역을 형성하는데 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 gly-ser 링커를 포함하거나 이것으로 구성된다. 한 구체예에서, scFc 또는 cscFc 링커는 면역글로불린 힌지의 적어도 일부분 및 gly-ser 링커를 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "gly-ser 링커"는 글리신과 세린 잔기로 구성되는 펩티드를 지칭한다. 예시적인 gly/ser 링커는 화학식 (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 4)의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 n은 양의 정수 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)이다. 바람직한 gly/ser 링커는 (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO:29), (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:6), 또는 (Gly4Ser)6 (SEQ ID NO: 5)이다. 다른 예시적인 gly-ser 링커는 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 30)이다. 일정한 구체예에서, 상기 gly-ser 링커는 폴리펩티드 링커의 2개의 다른 서열 (가령, 본 명세서에서 기술된 임의의 폴리펩티드 링커 서열) 사이에 삽입될 수 있다. 다른 구체예에서, gly-ser 링커는 폴리펩티드 링커의 다른 서열 (가령, 본 명세서에서 기술된 임의의 폴리펩티드 링커 서열)의 한쪽 또는 양쪽 단부에 부착된다. 또 다른 구체예에서, 2개 이상의 gly-ser 링커가 폴리펩티드 링커 내에 연속적으로 통합된다. 한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 링커는 상부 힌지 영역의 적어도 일부분 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유래됨), 중간 힌지 영역의 적어도 일부분 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유래됨) 및 일련의 gly/ser 아미노산 잔기 (가령, gly/ser 링커, 예를 들면, (Gly4Ser)n) (SEQ ID NO:4))를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 링커는 적어도 하나의 아미노산 길이를 갖고 길이가 변할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 링커는 약 1 내지 약 50개 아미노산 길이를 갖는다. 본 문맥에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 +/- 2개 아미노산 잔기를 표시한다. 링커 길이가 양성 정수이어야 하기 때문에, 약 1 내지 약 50개 아미노산 길이는 1-3 내지 48-52개 아미노산 길이를 의미한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 링커는 약 10-20개 아미노산 길이를 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 링커는 약 15 내지 약 50개 아미노산 길이를 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 링커는 약 20 내지 약 45개 아미노산 길이를 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 링커는 약 15 내지 약 35개 또는 약 20 내지 약 30개 아미노산 길이를 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 또는 60개 아미노산 길이를 갖는다. 한 구체예에서, 본 발명의 펩티드 링커는 20 또는 30개 아미노산 길이를 갖는다.
폴리펩티드 링커는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 폴리펩티드 서열 내로 도입될 수 있다. 변형은 DNA 서열 분석에 의해 확인될 수 있다. 생산된 폴리펩티드의 안정된 생산을 위한 호스트 세포를 형절전환하기 위해 플라스미드 DNA가 이용될 수 있다.
VIII. 효소적 개열 부위
한 구체예에서, 하나 이상의 효소적 개열 부위(들)가 본 발명의 가공되지 않은 폴리펩티드의 cscFc 링커 (L)에 연결된다, 예를 들면, 접하거나 인접한다. 이런 개열 부위는 cscFc 라이너 (liner)의 상류 또는 하류, 또는 둘 모두에 있을 수 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 구조체의 한 구체예에서, 개열 부위는 cscFc 링커 (L)의 한쪽 또는 양쪽 단부에 연결된다 (가령, 직접적으로 또는 간접적으로).
가령, 한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 하기 화학식으로 표시되는 폴리펩티드를 명시한다:
A-F1-P1-L-P2-B-F2 (I)
아미노에서부터 카르복시 말단까지의 선형 서열에서, A는 존재하면, 응고 인자 또는 이의 일부분이고, F1은 첫 번째 Fc 모이어티 또는 도메인이고, P1은 효소적 개열 부위이고, L은 cscFc 링커이고, P2는 효소적 개열 부위이고, B는 존재하면, 응고 인자 또는 이의 일부분이고, F2는 두 번째 Fc 모이어티 또는 도메인이고, 그리고 "-"는 펩티드 결합이다. 화학식 (I)은 적어도 A 또는 B 및 선택적으로 둘 모두를 포함한다. A와 B는 둘 모두 존재하면, 응고 인자의 상응하는 중쇄와 경쇄일 수 있다. 화학식 (I)은 적어도 P1 또는 P2 및 선택적으로 둘 모두를 포함한다. P1과 P2는 둘 모두 존재하면, 동일하거나 상이할 수 있다. 화학식 (I)은 적어도 F1과 F2를 포함한다. F1과 F2는 둘 모두 존재하면, 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 구체예에서, 인자 XIa 또는 Xa 개열 부위는 본 발명의 구조체 내로, 예를 들면, 개열가능 링커 내에 통합될 수 있다. 예시적인 FXIa 개열 부위에는 예로써, TQSFNDFTR 및 SVSQTSKLTR이 포함된다. 예시적인 트롬빈 개열 부위에는 예로써, DFLAEGGGVR, TTKIKPR, LVPRG (SEQ ID NO:35) 및 ALRPRVVGGA가 포함된다. 다른 유용한 개열 부위는 당분야에 공지되어 있다.
한 구체예에서, 링커의 일부는 개열후 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 남아있을 수 있다. 외부 아미노산 서열의 존재를 최소화하기 위해, 2개의 개열 부위가 본 발명의 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 링커의 전체 또는 실질적으로 전체가 제거되고, 반면 일부 구체예에서, 개열 부위의 일부분, 예를 들면, RRRR 개열 부위의 4개 아르기닌이 남아있을 수 있다.
폴리펩티드의 제조
본 발명의 키메라 응고 인자를 재조합 방식으로 생산하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체에 관계한다. 코드의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여, 다양한 핵산 서열이 폴리펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 것으로 이해될 것이다. 원하는 폴리뉴클레오티드는 초기에 제조된 폴리뉴클레오티드의 de novo 고형-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이유발은 아미노산 치환을 인코딩하는 코돈을 도입 (가령, Fc 변이체 모이어티 내로)하기 위한 치환, 프레임내 삽입, 또는 변형 (가령, 변형된 코돈)을 만들어내기 위한 한 가지 방법이다. 가령, 출발 폴리펩티드 DNA는 원하는 돌연변이를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드 단일-가닥 DNA 주형으로 혼성화함으로써 변형된다. 혼성화후, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함입하는 주형의 전체 두 번째 상보성 가닥을 합성하기 위해 DNA 중합효소가 이용된다. 한 구체예에서, 유전자 조작, 예를 들면, 프라이머-기초된 PCR 돌연변이유발은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위한, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 변형을 통합하는데 충분하다.
재조합 생산을 위해, 키메라 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 운반체, 다시 말하면, 삽입된 코딩 서열의 전사와 번역을 위한 필요 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에, 복제와 번역을 위한 필요 요소를 내포하는 벡터 내로 삽입된다.
키메라 단백질을 인코딩하는 핵산은 적절한 해독 틀에서 벡터 내로 삽입된다. 발현 벡터는 이후, 폴리펩티드를 발현하는 적절한 표적 세포 내로 형질감염된다. 당분야에 공지된 형질감염 기술에는 인산칼슘 침전 (Wigler et al. 1978, Cell 14 : 725) 및 전기천공 (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1 : 841)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다양한 호스트-발현 벡터 시스템이 진핵 세포에서 본 명세서에서 기술된 키메라 단백질을 발현하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 진핵 세포는 포유동물 세포 (가령, 293 세포, PerC6, CHO, BHK, Cos, HeLa 세포)를 비롯한 동물 세포이다. 키메라 단백질이 진핵 세포에서 발현될 때, 키메라 단백질을 인코딩하는 DNA는 또한, 키메라 단백질이 분비될 수 있도록 하는 신호 서열을 코딩할 수 있다. 당업자는 단백질이 번역되는 동안, 신호 서열이 세포에 의해 개열되어 성숙 키메라 단백질을 형성한다는 것을 이해할 것이다. 다양한 신호 서열, 예를 들면, 고유 인자 Vll 신호 서열, 고유 인자 IX 신호 서열 및 생쥐 IgK 경쇄 신호 서열은 당분야에 공지되어 있다. 대안으로, 신호 서열이 포함되지 않는 경우에, 키메라 단백질은 세포를 용해시킴으로써 회수될 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 유전자도입 동물, 예를 들면, 설치류, 염소, 양, 돼지, 또는 소에서 합성될 수 있다. 용어 "유전자도입 동물"은 외래 유전자를 그들의 게놈 내로 함입하는 비-인간 동물을 지칭한다. 이러한 유전자가 생식계열 조직 내에 존재하기 때문에, 이것은 부모로부터 자손으로 계승된다. 외인성 유전자는 단일-세포 배아 내로 도입된다 (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82 : 4438). 면역글로불린 분자를 생산하는 유전자도입체를 비롯하여, 유전자도입 동물을 생산하는 방법은 당분야에 공지되어 있다 (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al. 1983, Cell 34 : 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59 : 831 ; Robl et al. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).
발현 벡터는 재조합 방식으로 생산된 단백질의 쉬운 정제 또는 확인을 가능하게 하는 태그 (tag)를 인코딩할 수 있다. 실례에는 벡터 pUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791)이 포함되지만 이에 국한되지 않고, 여기서 본 명세서에서 기술된 키메라 단백질 코딩 서열은 lac z 코딩 영역과의 프레임 내에서 벡터 내로 결찰될 수 있고, 따라서 하이브리드 단백질이 생산된다; pGEX 벡터는 글루타티온S-전이효소 (GST) 태그를 갖는 단백질을 발현하는데 이용될 수 있다. 이들 단백질은 통상적으로 가용성이고, 그리고 글루타티온-아가로즈 구슬에 흡착, 그 이후에 유리 글루타티온의 존재에서 용리에 의해 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. 이들 벡터는 정제후 태그의 용이한 제거를 위한 개열 부위 (가령, PreCission 프로테아제 (Pharmacia, Peapack, N. J.))를 포함한다.
본 발명을 위하여, 다수의 발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 이들 발현 벡터는 전형적으로 호스트 생물체 내에서 에피솜 (episome) 또는 호스트 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 발현 벡터는 프로모터 (가령, 자연적으로-연관된 또는 이종성 프로모터), 인핸서, 신호 서열, 스플라이스 신호, 인핸서 요소, 그리고 전사 종결 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵 호스트 세포를 형질전환하거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내에 진핵 프로모터 시스템이다. 발현 벡터는 또한, 동물 바이러스, 예를 들면, 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 우두 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 또는 SV40 바이러스로부터 유래되는 DNA 요소를 이용한다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론성 시스템의 이용을 수반한다.
통상적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 하는 선별 마커 (가령, 암피실린-내성, 히그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성)를 내포한다 (예로써, Itakura et al., US 특허 4,704,362를 참조한다). DNA를 그들의 염색체 내로 통합하는 세포는 형질감염된 호스트 세포의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는 영양요구성 호스트에 자가 영양, 살생물제 (가령, 항생제)에 대한 내성, 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 발현되는 DNA 서열에 직접적으로 연결되거나, 또는 공동-형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다.
바람직한 발현 벡터는 NEOSPLA (U.S. 특허 번호 6,159,730)이다. 이러한 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 생쥐 베타 글로빈 주요 프로모터, SV40 복제 기점, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 엑손 1과 엑손 2, 디히드로엽산환원효소 유전자 및 리더 서열을 내포한다. 이러한 벡터는 가변과 불변 영역 유전자의 함입 시에 항체의 매우 높은 수준 발현, 세포에서 형질감염, 그 이후에 G418 내포 배지에서 선별 및 메토트렉사트 증폭을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 벡터 시스템은 또한, U.S. 특허 번호 5,736,137과 5,658,570에서 교시되고, 이들 각각은 본 발명에 전체적으로 참조로서 편입된다. 이러한 시스템은 높은 발현 수준, 예를 들면, > 30 pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은 예로써, U.S. 특허 번호 6,413,777에서 개시된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리시스트론성 구조체를 이용하여 발현될 수 있다. 이들 발현 시스템에서, 목적되는 복수의 유전자 산물, 예를 들면, 다합체 결합 단백질의 복수의 폴리펩티드는 단일 폴리시스트론성 구조체로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는, 진핵 호스트 세포에서 상대적으로 높은 수준의 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위해 내부 리보솜 유입점 (internal ribosome entry site, IRES)을 이용한다. 조화성 IRES 서열은 본 발명에 편입되는 U.S. 특허 번호 6,193,980에서 개시된다. 당업자는 이런 발현 시스템이 본 출원에서 개시된 전체 범위의 폴리펩티드를 효과적으로 생산하는데 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
더욱 일반적으로, 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 일단 제조되면, 발현 벡터는 적절한 호스트 세포 내로 도입될 수 있다. 다시 말하면, 호스트 세포는 형질전환될 수 있다. 호스트 세포 내로 플라스미드의 도입은 당업자에게 충분히 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 이들에는 형질감염 (전기영동과 전기천공 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 피복 DNA와 세포 융합, 미세주입, 그리고 본래 바이러스로 감염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)를 참조한다. 가장 바람직하게는, 호스트 내로 플라스미드 도입은 전기천공을 통해 달성된다. 형질전환된 세포는 경쇄와 중쇄의 생산에 적합한 조건 하에 성장되고, 그리고 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 검정된다. 예시적인 검정 기술에는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 또는 형광-활성화된 세포 분류기 분석 (FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "형질전환"은 유전형을 변화시키고, 결과적으로 수용자 세포에서 변화를 유발하는 수용자 호스트 세포 내로 DNA의 도입을 지칭하는 넓은 의미로서 이용될 것이다.
이들 동일한 라인에 따라서, "호스트 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 인코딩하는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 지칭한다. 재조합 호스트로부터 폴리펩티드의 단리를 위한 과정의 설명에서, 용어 "세포"와 "세포 배양물"은 명확하게 달리 특정되지 않으면, 폴리펩티드의 공급원을 의미하기 위해 교체가능하게 이용된다. 다시 말하면, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 스핀다운된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 모두를 내포하는 세포 배양물로부터 회수를 의미할 수 있다.
단백질 발현에 이용되는 호스트 세포주는 가장 바람직하게는, 포유동물 기원의 세포주이다; 당업자는 원하는 유전자 산물이 그 내부에서 발현되는데 가장 적합한 특정의 호스트 세포주를 우선적으로 결정하는 능력을 갖는 것으로 믿어진다. 예시적인 호스트 세포주에는 DG44 및 DUXB11 (중국 햄스터 (Chinese Hamster) 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA (인간 자궁경부 암종), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610 (중국 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3 (생쥐 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/O (생쥐 골수종), P3x63-Ag3.653 (생쥐 골수종), BFA-1c1BPT (소 내피세포), RAJI (인간 림프구), PerC6 세포, 그리고 293 (인간 신장)이 포함되나, 이들에 국한되지 않는다. 호스트 세포주는 전형적으로, 상업적 서비스, American Tissue Culture Collection으로부터, 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능하다.
한 구체예에서, 호스트 세포는 성숙 폴리펩티드를 형성하기 위해 가공 동안 scFc 링커 (가령, 이런 링커가 존재하고 세포내 가공 부위(들)을 내포하면)를 개열하는데 필요한 효소 (또는 효소들)을 내인성으로 발현한다. 이러한 가공 동안, scFc 링커는 외부 아미노산의 존재를 감소시키기 위해 실질적으로 제거될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 호스트 세포는 scFc 링커의 가공이 발생하거나 향상되도록 세포에 외인성인 하나 이상의 효소를 발현하도록 형질전환된다.
한 구체예에서, 세포에 의해 내인성으로 또는 외인성으로 발현될 수 있는 효소는 효소의 푸린 집단의 구성원이다. 인간 푸린 (즉, PACE)의 완전한 cDNA와 아미노산 서열은 1990. Van den Ouweland A M et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:664; Erratum in: Nucleic Acids Res. 18:1332 (1990)에서 공개되었다. U.S. 특허 번호 5,460,950 (Barr et al.)에서는 재조합 PACE, 그리고 활성, 성숙 이종성 단백질의 발현을 향상시키기 위한 이종성 단백질의 기질 전구체 폴리펩티드와 PACE의 공동발현을 기술한다.
U.S. 특허 번호 5,935,815 (van de Ven et al.)에서는 유사하게, 재조합 인간 푸린 (즉, PACE), 그리고 활성, 성숙 이종성 단백질의 발현을 향상시키기 위한 이종성 단백질의 기질 전구체 폴리펩티드와 푸린의 공동발현을 기술한다. 상기 특허에서 개시된 가능한 기질 전구체는 인자 IX의 전구체를 포함한다. PACE 이외에 포유동물 푸린에서 다른 집단 구성원 / 서브틸리신/Kex2p-유사 프로단백질 전환효소 (PC) 집단은 PC1/PC3, PC2, PC4, PC5/6 (이후, PC5로 지칭됨), PACE4, 그리고 LPC/PC7/PC8/SPC7을 포함하는 것으로 보고된다. 이들 다양한 구성원이 일정한 보존된 전체적 구조 특징을 공유하긴 하지만, 이들은 조직 분포, 세포 이하 국지화, 개열 특이성, 그리고 선호되는 기질에서 상이하다. 검토를 위하여, Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35를 참조한다. PACE와 유사하게, 이들 프로단백질 전환효소는 일반적으로, 아미노 말단에서부터 시작하여, 신호 펩티드, 프로펩티드 (이것은 자동적으로 개열될 수 있다), Asp, His, Ser과 Asn/Asp 잔기로 특징되는 서브틸리신-유사 촉매 도메인, 그리고 촉매 활성에 필수적이고 Arg-Gly-Asp (RGD) 서열로 특징되는 호모 B 도메인을 포함한다. PACE, PACE4, 그리고 PC5는 또한, Cys-풍부한 도메인을 포함하는데, 이의 기능은 알려져 있지 않다. 이에 더하여, PC5는 막통과 도메인이 있거나 없는 아이소폼을 갖는다; 이들 상이한 아이소폼은 각각, PC5B와 PC5A로 알려져 있다. PACE의 촉매 도메인의 아미노산 서열 및 프로단백질 전환효소의 이러한 집단의 다른 구성원의 촉매 도메인의 아미노산 서열 사이에 비교는 하기의 동일성 정도를 드러낸다: PC4에 대해 70 퍼센트; PACE4와 PC5에 대해 65 퍼센트; PC1/PC3에 대해 61 퍼센트; PC2에 대해 54 퍼센트; 그리고 LPC/PC7/PC8/SPC7에 대해 51 퍼센트. Nakayama K (1997) Biochem J. 327:625-35.
PACE와 PACE4는 부분적으로 중복되지만 상이한 기질을 갖는 것으로 보고되었다. 특히, PACE4는 PACE와 현저하게 대조적으로, FIX의 전구체 폴리펩티드를 가공할 수 없는 것으로 보고되었다. Wasley L C et al. (1993) J Biol Chem. 268:8458-65; Rehemtulla A et al. (1993) Biochemistry. 32:11586-90.
U.S. 특허 번호 5,840,529 (Seidah et al.)에서는 인간 PC7에 대한 뉴클레오티드와 아미노산 서열, 그리고 다른 PC 집단 구성원과 비교하여 HIV gp160을 gp120과 gp41로 개열하는 PC7의 주목할 만한 능력을 개시한다.
설치류 PC5의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 Lusson J et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6691-5에 의해 PC5로서, 그리고 Nakagawa T et al. (1993) J Biochem (Tokyo) 113:132-5에 의해 PC6으로 최초 기술되었다. U.S. 특허 번호 6,380,171 (Day et al.)에서는 막통과 도메인이 없는 아이소폼, 인간 PC5A에 대한 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 개시한다. 이들 효소의 서열 및 이들을 클로닝하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 또한, 세균 또는 효모와 같은 비-포유동물 세포 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 세균과 같은 다양한 단세포성 비-포유동물 미생물, 즉 배양 또는 발효 시에 성장할 수 있는 것들 역시 형질전환될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 형질전환이 가능한 세균에는 대장균(Escherichia coli) 또는 살모넬라 (Salmonella)의 균주와 같은 엔테로박테리아세 (enterobacteriaceae); 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실라세 (Bacillaceae); 뉴모코커스 (Pneumococcus); 스트렙토코커스 (Streptococcus), 그리고 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)의 구성원이 포함된다. 또한, 세균 내에서 발현되는 경우에, 폴리펩티드는 전형적으로 봉입체 (inclusion body)의 일부가 되는 것으로 이해될 것이다. 폴리펩티드는 단리되고, 정제되고, 이후 기능적 분자로 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에, 진핵성 미생물 역시 이용될 수 있다. 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 빵 효모 (baker's yeast)가 진핵성 미생물 중에서 가장 통상적으로 이용되지만, 다수의 다른 균주가 통상적으로 이용가능하다.
사카로미세스에서 발현을 위해서, 예로써 플라스미드 YRp7 (Stinchcomb et al., (1979), Nature, 282:39; Kingsman et al., (1979), Gene, 7:141; Tschemper et al., (1980), Gene, 10:157)이 통상적으로 사용된다. 이 플라스미드는 이미, 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 내포하며, 예로써 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1이다 (Jones, (1977), Genetics, 85:12). 효모 호스트 세포 게놈의 특징으로서 trpl 병소의 존재는 트립토판 부재 하에 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
피치아 (Pichia)와 같은 다른 효모 호스트 역시 이용될 수 있다. 효모 발현 벡터는 원하는 대로, 발현 제어 서열 (가령, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터에는 3-포스포글리세리트 키나아제 및 기타 당분해 효소가 포함된다. 유도성 효모 프로모터에는 그 중에서도 특히, 알코올 탈수소효소, 이소시토크롬 C, 그리고 메탄올, 말토오스와 갈락토오스 활용을 담당하는 효소로부터 프로모터가 포함된다.
대안으로, 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열은 유전자도입 동물의 게놈 내로 도입 및 유전자도입 동물의 모유에서 차후 발현을 위해 이식유전자 (transgene) 내에 함입될 수 있다 (예로써, Deboer et al., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489, 그리고 Meade et al., US 5,849,992를 참조한다). 적절한 이식유전자는 유선 특이적 유전자로부터 프로모터와 인핸서와 작동가능하게 연결된 폴리펩티드, 예를 들면, 카제인 또는 베타 락토글로불린에 대한 코딩 서열을 포함한다.
시험관내 생산은 원하는 폴리펩티드를 대량으로 제공하기 위한 정률증가 (scale-up)를 가능하게 한다. 조직 배양 조건 하에서 포유동물 세포를 배양하기 위한 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 예로써 에어리프트 (airlift) 반응기 또는 연속 교반 반응기 내에서 균질한 현탁 배양, 또는 예로써, 중공 섬유, 마이크로캡슐 내에서, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서 고정화 또는 포획 세포 배양을 포함한다. 필요하고 및/또는 원하는 경우에, 폴리펩티드의 용액은 예로써, 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선적 생합성 이후, 또는 본 명세서에서 기술된 HIC 크로마토그래피 단계 이전 또는 이후, 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스 위에서 크로마토그래피 또는 (면역)친화성 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다. 하류 정제를 용이하게 하기 위해, 친화성 태그 서열 (가령, His(6) 태그)이 선택적으로 부착되거나, 또는 폴리펩티드 서열 내에 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 호스트 세포는 scFc 스카폴드 및 cscFc 링커를 가공할 수 있는 하나 이상의 효소를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 구조체를 포함한다. 상기 구조체와 효소(들)는 단일 벡터 또는 2개의 벡터를 이용하여 발현될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관계한다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 FVII, FIX와 FX로 구성된 군에서 선택되는 키메라 응고 인자를 인코딩하고, 그리고 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티 및 선택적으로, 응고 인자와 표적화 모이어티 사이에 스페이서 모이어티를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 FVII를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관계하고, FVII는 응고 캐스케이드의 성분에 의해 활성화가능한 이종성 효소적 개열 부위를 포함한다.
일단 발현되면, 키메라 응고 인자는 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 비롯한 당분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다 (전반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)를 참조하고, 그리고 구체적으로, 본 명세서의 실시예에서 이용된 방법을 참조한다). 제약학적 이용을 위해, 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 단백질이 바람직하고, 그리고 98 내지 99% 또는 그 이상의 균질성이 가장 바람직하다.
IX. 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 방법
다른 구체예에서, 본 발명은 지혈 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 본 발명의 증강된 응고 인자의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 개체에 투여를 위한 조성물은 본 발명의 키메라 응고 인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 (유전자 요법 적용의 경우에)뿐만 아니라 폴리펩티드 분자를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 증강된 응고 인자 조성물은 지혈을 촉진하는 적어도 하나의 다른 작용제와 공동으로 투여된다. 지혈을 촉진하는 상기 다른 작용제는 응고 활성을 나타내는 치료제이다. 실례로서, 하지만 제한 없이, 지혈제 (hemostatic agent)는 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈, 또는 섬유소원 또는 전술한 것들 중에서 임의의 한 가지의 활성화된 형태를 포함할 수 있다. 지혈제의 응고 인자는 또한, 항-섬유소용해 약물, 예를 들면, 엡실론-아미노-카프로산, 트라넥삼산 (tranexamic acid)을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 조성물 (가령, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자)은 개체에 투여될 때 응고 인자가 활성 형태로 존재하는 조성물이다. 이런 활성화된 분자는 세포에 의해 활성 형태로 발현되거나, 또는 개체에 투여에 앞서 시험관내에서 활성화될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 응고 인자가 활성화가능 형태로 존재하고, 그리고 응고 인자가 개체에 투여후 생체내에서 응고 부위에서 활성화되는 조성물이다.
본 발명의 키메라 응고 인자는 정맥내, 피하, 근육내, 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들면, 경구, 혀밑, 볼, 혀밑, 코, 직장, 질 또는 폐 루트를 통해 투여될 수 있다. 키메라 단백질은 원하는 부위로 키메라 단백질의 느린 방출을 가능하게 하는 생물중합성 고형 서포트 (biopolymer solid support) 내에 이식되거나, 또는 여기에 연결될 수 있다.
경구 투여를 위해, 제약학적 조성물은 전통적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 또한, 액체, 예를 들면 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제 (가령, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소첨가된 식용 지방), 유화제 (레시틴 또는 아카시아), 비-수성 운반제 (가령, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분별된 식물성 오일), 그리고 보존제 (가령, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 포함할 수 있다. 이들 제조물은 또한, 풍미제, 착색제 및 감미료를 포함할 수 있다. 대안으로, 조성물은 물 또는 다른 적절한 운반제로 구성을 위한 건조 산물로서 제공될 수 있다.
볼과 혀밑 투여를 위해, 조성물은 전통적인 프로토콜에 따른 정제, 마름모꼴정제 또는 신속 용해 필름의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따른 용도를 위한 화합물은 적절한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로플로오르메탄, 디클로로테트라플루오르메탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스에 의해, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 (가령, PBS에서)의 형태로 편의하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투약 단위 (dosage unit)는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예로써, 흡입기 또는 취입기에서 이용을 위한 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 화합물 및 적절한 분말 기부, 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 믹스를 내포하도록 조제될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 투여 경로는 비경구이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내 형태가 바람직하다. 이들 투여 형태 모두 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되긴 하지만, 투여 형태는 주사를 위한 용액, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 드립을 위한 용액일 것이다. 통상적으로, 주사를 위한 적절한 제약학적 조성물은 완충액 (가령, 아세트산염, 인산염 또는 구연산염 완충액), 계면활성제 (가령, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정제 (가령, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 하지만, 본 명세서에서 교시와 조화성인 다른 방법에서, 폴리펩티드는 유해한 세포 개체군의 부위에 직접적으로 전달되고, 따라서 치료제에 대한 병든 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 제조물은 무균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 그리고 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 실례는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브 오일, 그리고 주사가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올리에이트이다. 수성 담체에는 염수 및 완충된 매체를 비롯하여, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 본 발명에서, 제약학적으로 허용되는 담체에는 0.01-0.1M, 바람직하게는 0.05M 인산염 완충액 또는 0.8% 염수가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 통상의 비경구 운반제에는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 유산화 링거, 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 운반제에는 유체와 영양소 보충물, 전해질 보충물, 예를 들면, 링거 덱스트로스에 기초된 것들 등이 포함된다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 비활성 가스, 기타 같은 종류의 것 역시 존재할 수 있다.
더욱 구체적으로, 주사 이용에 적합한 제약학적 조성물에는 무균 수성 용액 (여기서 물 용해성) 또는 분산액, 그리고 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말이 포함된다. 이런 경우에, 조성물은 무균이어야 하고, 그리고 쉬운 주사가능성 (syringability)이 존재할 만큼 유체이어야 한다. 이것은 제조와 보관의 조건 하에 안정되어야 하고, 그리고 바람직하게는, 세균과 균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호될 것이다. 담체는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 내포하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성은 예로써, 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.
미생물의 작용의 예방은 다양한 항생제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 치메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성제 (isotonic agent), 예를 들면, 당, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴에 의해 달성될 수 있다.
어떤 경우든, 무균 주사가능 용액은 적절한 용매에서 필요한 양의 활성 화합물 (가령, 폴리펩티드 그 자체 또는 다른 활성 작용제와 공동으로)을 본 명세서에서 열거된 한 가지 성분 또는 성분의 조합과 통합하고, 그 이후에 필요에 따라 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매체 및 앞서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 활성 화합물을 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조와 동결 건조인데, 이것은 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 원하는 임의의 추가 성분의 분말을 산출한다. 주사용 제조물은 당분야에 공지된 방법에 따라 처리되고, 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이알과 같은 용기 내로 채워지고, 그리고 무균 조건하에 밀봉된다. 게다가, 이들 제조물은 키트의 형태로 포장되고 판매될 수 있다. 이런 제조 물품은 바람직하게는, 연관된 조성물이 응고 장애를 앓거나, 또는 응고 장애의 소인이 있는 개체를 치료하는데 유용하다는 것을 지시하는 라벨 또는 포장 삽입물을 가질 것이다.
제약학적 조성물은 또한, 예로써 전통적인 좌약 기부, 예를 들면, 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 내포하는 좌약 또는 보류 관장 (retention enema)으로서 직장 투여용으로 조제될 수 있다.
질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 효과량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간 또는 동물인자의 여부, 투여된 다른 약제, 그리고 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부를 비롯한 많은 상이한 인자에 따라 변할 것이다. 통상적으로, 환자는 인간이지만, 유전자도입 포유동물을 비롯한 비-인간 포유동물 역시 치료될 수 있다. 치료 용량 (treatment dosage)은 안정성과 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 일과적인 방법을 이용하여 적정될 수 있다.
한 구체예에서, 생물학적 활성 모이어티 (가령, FIX를 포함)의 용량은 약 25 내지 100 IU/kg, 예를 들면, 0.417 mg/kg 내지 1.67 mg/kg 범위에서 변할 수 있다. 다른 구체예에서, 생물학적 활성 모이어티 (가령, FVIII를 포함)의 용량은 약 25 내지 65 IU/kg, 예를 들면, 0.003125 mg/kg 내지 0.008125 mg/kg 범위에서 변할 수 있다. 다른 구체예에서, 생물학적 활성 모이어티 (가령, FVII를 포함)의 용량은 약 90 내지 270 ug/kg 또는 0.090 내지 0.270 mg/kg 범위에서 변할 수 있다.
용량은 1000 ug/kg 내지 0.1 ng/kg 체중 범위에서 변할 수 있다. 한 구체예에서, 용량 범위는 1 ug/kg 내지 100 ug/kg이다. 단백질은 연속적으로 또는 특정한 시간 간격에서 투여될 수 있다. 시험관내 검정은 투여를 위한 최적 용량 범위 및/또는 일정을 결정하는데 이용될 수 있다. 응고 인자 활성을 측정하는 시험관내 검정, 예를 들면, STA-덩어리 Vlla-rTF 응고 검정은 당분야에 공지되어 있다. 부가적으로, 효과량은 동물 모델, 예를 들면, 혈우병 개로부터 획득된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수도 있다 (Mount et al. 2002, Blood 99 (8): 2670).
상기 범위에서 용량 중간값 역시 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 개체는 이런 용량이 매일, 격일, 매주 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 연장된 기간, 예를 들면, 적어도 6개월에 걸쳐 복수 용량으로 투여를 수반한다. 일부 방법에서, 2가지 이상의 폴리펩티드가 동시에 투여될 수 있는데, 이러한 경우에 투여된 각 폴리펩티드의 용량은 지시된 범위 내에 속한다.
본 발명의 폴리펩티드는 복수의 기회에 투여될 수 있다. 단일 투약 간에 간격은 매일, 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 변형된 폴리펩티드 또는 항원의 혈액 수준을 측정함으로써 지시된 바와 같이 부정기적일 수 있다. 대안으로, 폴리펩티드는 지속된 방출 제제로서 투여될 수 있는데, 이러한 경우에 더욱 적은 빈도의 투여가 요구된다. 용량과 빈도는 환자에서 폴리펩티드의 반감기에 따라 변할 수 있다.
투여의 용량과 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부에 따라 변할 수 있다. 예방적 적용에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 칵테일을 내포하는 조성물은 환자의 저항성을 증강시키거나, 또는 질환의 효과를 최소화하기 위해, 아직 질환 상태에 있지 않은 환자에 투여된다. 이런 양은 "예방적 효과량"인 것으로 정의된다. 상대적으로 적은 용량이 긴 기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 나머지 생애 동안 치료를 계속해서 받는다.
본 발명의 폴리펩티드는 선택적으로, 치료 (가령, 예방적 또는 치료적)가 필요한 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 다른 작용제와 공동으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 보조 요법 (adjunct therapy)과 함께 또는 공동으로 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 상기 요법 및 개시된 폴리펩티드의 순차적, 동시적, 동연적, 동존적, 공존적 또는 공동적 투여 또는 적용을 의미한다. 당업자는 복합 치료 섭생 (combined therapeutic regimen)의 다양한 성분의 투여 또는 적용이 치료의 전체적인 유효성을 증강시키기 위해 시간 맞춤될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 당업자 (가령, 의사)는 선택된 보조 요법 및 본 명세서의 교시에 기초하여 과도한 실험없이, 효과적인 복합 치료 섭생을 용이하게 식별할 수 있을 것이다.
게다가, 본 발명의 폴리펩티드는 작용제 또는 작용제들과 함께 또는 공동으로 이용 (가령, 복합 치료 섭생을 제공하기 위해)될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 본 발명의 폴리펩티드가 복합될 수 있는 예시적인 작용제에는 치료되는 특정 질환에 대한 현재의 표준 관리를 대표하는 작용제가 포함된다. 이런 작용제는 성질에서 화학적 또는 생물학적일 수 있다. 용어 "생물학적" 또는 "생물학적 작용제"는 치료제로서 이용에 의도되는, 살아있는 생물체 및/또는 그들의 산물로부터 만들어진 임의의 제약학적으로 활성제를 지칭한다.
본 발명의 폴리펩티드와 공동으로 이용되는 작용제의 양은 개체별로 달라지거나, 또는 당분야에 공지된 것에 따라 투여될 수 있다. 예로써, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents , in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)을 참조한다. 다른 구체예에서, 표준 관리와 일치하는 이런 작용제의 양이 투여된다.
앞서 논의된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 응고 장애의 생체내 치료를 위한 제약학적 효과량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 폴리펩티드는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 조제될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는, 비-독성, 무균 담체, 예를 들면, 생리학적 염수, 비-독성 완충액, 보존제 등을 포함한다. 당연히, 본 발명의 제약학적 조성물은 폴리펩티드의 제약학적 효과량을 제공하기 위해 단일 또는 복수 분량으로 투여될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 핵산 분자로서 투여될 수 있다. 핵산 분자는 벡터, 플라스미드, 리포좀, DNA 주입, 전기천공, 유전자 총, 정맥내 주사 또는 간 동맥 주입을 비롯한 당분야에 공지된 기술을 이용하여 투여될 수 있다. 유전자 요법 구체예에서 이용을 위한 벡터는 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 범위에 따라서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 치료적 또는 예방적 효과를 발생시키는데 충분한 양으로 전술한 치료 방법에 따라서 인간 또는 기타 동물에 투여될 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 당업자에 의해 인정되는 많은 용도를 갖는다. 이러한 질환 또는 장애에는 지혈 장애가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 지혈 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 키메라 응고 인자의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 키메라 응고 인자는 섬유소 덩어리의 형성을 촉진함으로써 지혈 장애를 치료하거나 예방한다. 본 발명의 키메라 응고 인자는 응고 캐스케이드의 임의의 구성원을 활성화시킬 수 있다. 응고 인자는 외부 경로, 내재성 경로 또는 둘 모두에서 참가자일 수 있다.
본 발명의 키메라 응고 인자는 지혈 장애, 예를 들면, 키메라 응고 인자 내에 존재하는 특정 응고 인자로 치료가능한 것으로 알려져 있는 것들을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질의 투여에 의해 치료될 수 있는 지혈 장애에는 혈우병 A, 혈우병 B, 폰빌레브란트병, 인자 XI 결핍 (PTA 결핍), 인자 XII 결핍, 그리고 섬유소원, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X, 또는 인자 XIII에서 결핍 또는 구조적 비정상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 지혈 장애는 유전적 장애이다. 한 구체예에서, 개체는 혈우병 A를 앓고, 그리고 키메라 단백질은 인자 VII 또는 인자 VIIIa를 포함한다. 다른 구체예에서, 개체는 혈우병 A를 앓고, 그리고 키메라 응고 인자는 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함한다. 다른 구체예에서, 개체는 혈우병 B를 앓고, 그리고 키메라 응고 인자는 인자 IX 또는 인자 IXa를 포함한다. 다른 구체예에서, 개체는 혈우병 B를 앓고, 그리고 키메라 단백질은 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함한다. 다른 구체예에서, 개체는 인자 VII 또는 인자 VIIIa에 대한 저해 항체를 갖고, 그리고 키메라 응고 인자는 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 개체는 인자 IX 또는 인자 IXa에 대한 저해 항체를 갖고, 그리고 키메라 단백질은 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함한다.
본 발명의 키메라 응고 인자는 지혈 장애를 앓는 개체를 예방적으로 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 키메라 응고 인자는 지혈 장애를 앓는 개체에서 급성 출혈 에피소드를 치료하는데 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 지혈 장애는 응고 인자, 예를 들면, 인자 IX, 인자 VIII에서 결핍의 결과이다. 다른 구체예에서, 지혈 장애는 결함성 응고 인자의 결과일 수 있다.
다른 구체예에서, 지혈 장애는 후천적 장애 (acquired disorder)일 수 있다. 후천적 장애는 근원적인 이차적 질환 또는 장애로부터 발생할 수 있다. 무관한 질환은 실례로써, 암, 자가면역 질환, 또는 임신일 수 있지만 이들에 국한되지 않는다. 후천적 장애는 노령으로부터, 또는 근원적인 이차적 질환을 치료하기 위한 약물 치료 (가령, 암 화학요법)로부터 발생할 수 있다.
또한, 본 발명은 지혈 장애, 또는 지혈 장애의 획득을 유발하는 이차적 질환 또는 장애가 없는 개체를 치료하는 방법에 관계한다. 따라서 본 발명은 포괄적 지혈제를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 키메라 응고 인자의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 가령, 한 구체예에서, 포괄적 지혈제를 필요로 하는 개체는 수술을 받고 있거나, 또는 수술을 받을 예정이다. 본 발명의 키메라 응고 인자는 예방제로서 수술 이전에 또는 수술 이후에 투여될 수 있다. 본 발명의 키메라 응고 인자는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 동안 또는 수술 이후에 투여될 수 있다. 수술에는 간 이식, 간 절제, 또는 줄기 세포 이식이 포함될 수 있지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 응고 인자는 지혈 장애 없이 급성 출혈 에피소드를 앓는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 급성 출혈 에피소드는 심각한 외상, 예를 들면, 수술, 자동차 사고, 상처, 열상성 총상, 또는 통제되지 않은 출혈을 유발하는 임의의 다른 외상성 사건으로부터 발생할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 예증되고, 이들 실시예는 한정하는 것으로 간주되지 않는다. 본 출원 전반에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 표적화 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시한다. 이들 예시적인 구조체는 Fc 영역을 포함한다.
도 2는 표적화 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시한다. 이들 예시적인 구조체는 개열가능 단일 사슬 Fc (cscFc)를 포함하고, 여기서 scFc 링커는 이 링커가 발현되어 2개의 사슬 Fc 영역을 형성하는 세포에 의해 가공된다.
도 3은 표적화 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시하고, 여기서 응고 인자 모이어티는 Gla 도메인이 없다. 이들 예시적인 구조체는 Fc 영역을 포함한다.
도 4는 표적화 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시하고, 여기서 응고 인자 모이어티는 Gla 도메인이 없다. 이들 예시적인 구조체는 개열가능 단일 사슬 Fc (cscFc)를 포함하고, 여기서 scFc 링커는 이 링커가 발현되어 2개의 사슬 Fc 영역을 형성하는 세포에 의해 가공된다.
도 5는 활성화되거나 (가령, 시험관내에서 활성화후 또는 응고 인자의 경쇄와 중쇄의 별개의 발현에 의해), 또는 활성화가능한, 다시 말하면, 생체내에서 덩어리의 부위에서 개열가능한 모이어티를 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시한다 (패널 D와 E 참조). 이들 예시적인 구조체는 Fc 영역을 포함한다. 구조체 A, B, 그리고 C는 초기 실험에서 충분히 발현되지 않았다.
도 6은 활성화되거나 (가령, 시험관내에서 활성화후 또는 응고 인자의 경쇄와 중쇄의 별개의 발현에 의해), 또는 활성화가능한, 다시 말하면, 생체내에서 덩어리의 부위에서 개열가능한 모이어티를 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시한다. 이들 예시적인 구조체는 개열가능 단일 사슬 Fc (cscFc)을 포함하고, 여기서 scFc 링커는 이 링커가 발현되어 2개의 사슬 Fc 영역을 형성하는 세포에 의해 가공된다.
도 7은 표적화 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시한다.
도 8은 표적화 도메인을 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시하고, 여기서 응고 인자 모이어티는 Gla 도메인이 없다.
도 9는 활성화되거나 (가령, 시험관내에서 활성화후 또는 응고 인자의 경쇄와 중쇄의 별개의 발현에 의해), 또는 활성화가능한, 다시 말하면, 생체내에서 덩어리의 부위에서 개열가능한 모이어티를 포함하는 예시적인 키메라 응고 인자 구조체를 도시한다.
도 10은 FVII-011의 정제와 활성화를 위한 SDS PAGE를 도시한다.
도 11은 활성 FVII-053의 정제를 위한 SDS PAGE를 도시한다.
도 12는 FVII-011과 FVII-102의 개요를 도시하고, 그리고 FACS에 의해 결정된 활성화된 혈소판에 대한 FVIII-011과 FVII-027의 결합을 도시한다.
도 13은 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-027, FVII-011과 Novoseven의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정을 도시한다.
도 14는 PAC-1이 혈소판에 대한 증가된 결합 및 FVII-027과 연관된 트롬빈 산출의 증가된 비율을 소멸시킨다는 것을 도시한다.
도 15는 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-037과 Novoseven의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정에 이용된 구조체를 도시한다.
도 16은 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-037과 Novoseven의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정을 도시한다.
도 17은 도 18에 도시된 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-044, FVII-045, FVII-046, FVII-011과 Novoseven의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정에 이용된 구조체를 도시한다.
도 18은 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-044, FVII-045, FVII-046, FVII-011과 Novoseven의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정을 도시한다.
도 19는 도 20에 도시된 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-047, FVII-048, FVII-049, FVII-011과 Novoseven의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정에 이용된 구조체를 도시한다.
도 20은 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-047, FVII-048, FVII-049, FVII-011과 Novoseven의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정을 도시한다.
도 21은 도 22에 도시된 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-053과 FVII-011의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정에 이용된 구조체를 도시한다.
도 22는 활성화된 혈소판의 존재에서 FVII-053과 FVII-011의 활성을 측정하기 위한 트롬빈 산출 검정을 도시한다.
도 23은 PAC-1이 FVII-053과 연관된 트롬빈 산출의 증가된 비율을 소멸시킨다는 것을 도시한다.
도 24는 도 25에 도시된, HEK 293 세포의 일시적 형질감염 및 단백질 A 풀다운 이후에 FVIIFc 종류의 웨스턴 블롯 분석에 이용된 구조체를 도시한다.
도 25는 HEK 293 세포의 일시적 형질감염 및 단백질 A 풀다운 이후에 FVIIFc 종류의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 26은 pSYN-PC5-003과 함께 또는 pSYN-PC5-003 없이, pSYN-FVII-024의 일시적 형질감염 이후에 단백질 A 면역침강의 웨스턴 블롯을 도시한다. 레인 1, pSYN-FVII-024, 비-환원; 레인 2, pSYN-FVII-024, 비-환원; 레인 3, pSYN-FVII-024, 환원; 레인 4, pSYN-FVII-024, 환원.
도 27은 HEK 293 세포의 일시적 형질감염 및 단백질 A 풀다운 이후에 FVIIFc 종류의 웨스턴 블롯 분석 (Fc 웨스턴)을 도시한다.
도 28은 FXIa에 의한 FVII-039와 FVII-040 처리를 도시한다.
도 29는 GPIIbIIIa의 활성 형태에 표적화된 FVIIaFc 변이체가 트롬빈 산출의 증가된 비율을 보인다는 것을 도시한다.
도 30은 혈우병 A 인간 혈액에서 FVII-088과 야생형 재조합 FVIIaFc의 활성을 측정하기 위한 회전 혈전탄성묘사법 (rotation thromboelastometry) (ROTEM) 검정을 도시한다. 응고 시간, 덩어리 형성 시간 및 알파 각도 파라미터가 도시된다.
도 31은 예시적인 개열 부위 및 활성화가능 응고 인자 구조체 내에 이런 개열 부위의 실례적인 위치를 도시한다. 본 도면에서, FVII가 실례로서 이용된다.
도 32는 도 31에 예시된 구조체의 개열을 도시한다.
도 33은 추가의 활성화가능 구조체 및 그들의 개열을 설명하는 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 34는 FVII-062와 -090 구조체를 이용한 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. FVII-062는 트롬빈 개열 부위가 없는 음성 대조이고, 따라서 상기 구조체는 활성화될 수 없다. FVII-090은 ALRPR 개열 부위를 내포하고, 따라서 트롬빈에 의해 활성화가능하다.
도 35는 높은 특이적 활성 FVII 변이체의 개열을 도시한다. FVII 중쇄-Fc와 경쇄 Fc는 1개의 띠에서 붕괴하는데, 그 이유는 상기 중쇄가 트립신 170 루프의 삽입후 당화 부위를 상실하고 더욱 작아지기 때문이다.
도 36은 FVII-090과 FVII-100을 이용한 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다.
도 37은 FVII-090과 FVII-115를 이용한 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다.
도 38은 트롬빈으로 활성화된 활성화가능 FVIIFc의 아미드용해 활성을 도시한다. 활성화가능 변이체의 아미드용해 활성은 트롬빈 활성화 이후에 측정될 수 있고, 그리고 FVII-090과 비교하여 높은 특이적 활성 변이체에 대한 증가된 아미드용해 활성이 나타난다. 이들 검정에서, 트롬빈에 의한 활성화가능 분자의 활성화후, 발색성 기질의 트롬빈 개열을 저해하기 위해 히루딘이 첨가된다. 이러한 방식으로, 트롬빈은 FVIIa 활성을 검출하는 능력을 간섭하지 않는다.
도 39는 FVIIa에 의해 개열되지 않는 기질 S2765을 이용한, FVIIa에 의한 FX의 활성화를 측정하는 검정의 결과를 도시한다. 이러한 검정에서, 10 uM의 FX가 37℃에서 15분 동안 FVIIaFc와 함께 배양되었다. 반응은 EDTA로 진정되고 기질이 첨가되었다. 도 39는 FVIIaFc에 의한 FX 활성화가 검출될 수 있음을 증명하는 대조 실험의 결과를 도시한다.
도 40은 "활성화가능 FVIIFc"에 의한 FXa 산출 활성을 도시한다. 도 40에 도시된 실험은 높은 특이적 활성 변이체에 대한 FX 활성화 활성이 증가한다는 것을 증명한다. 이러한 실험에서, FVIIFc (100 nM)는 트롬빈 (100 nM)으로 활성화되고, 그리고 트롬빈을 저해하기 위해 히루딘이 첨가되었다. FX (10uM)가 첨가되고, 그 이후에 반응을 저해하기 위해 EDTA가 첨가되었다. FX의 활성은 FXa 기질을 검출함으로써 측정되었다.
도 41은 FVII-118, FVII-119, 그리고 FVII-127에 이용된 활성화가능 단위체 구조를 비롯한 예시적인 활성화가능 구조체 형식을 도시한다.
도 42는 헤테로이합성 구조체 (FVII-090)와 비교하여 활성화가능 구조체, 특히 단위성 구조체 (FVII-118과 -119)의 트롬빈 개열의 효율을 도시한다.
도 43은 야생형 활성화가능 FVIIFc (FVII-118)를 높은 특이적 활성 변이체 (FVII-127)에 비교하기 위한 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다.
도 44A는 몇몇 표적화된 구조체를 도시한다. 본 발명의 경우에, GPIIbIIIa의 활성 입체형태에 결합하는 SCE5 scFv가 구조체 내에 다양한 부위에 포함되었다. 도 44B는 이들 구조체를 이용한, 혈소판-풍부한 FVIII-결함성 혈장에서 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. N7은 Novoseven 대조이다. 도 44C는 FACs에 의한, 혈소판에 재조합 FVIIaFc 변이체의 결합을 도시한다.
도 45A는 휴지 혈소판과 활성화된 혈소판 상에 존재하는 GPIIbIIIa에 반하는 scFv, AP3을 포함하는 몇몇 표적화된 FVIIa 구조체를 도시한다. 도 45B는 혈소판-풍부한 FVIII-결함성 혈장에서 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. 도 45C는 FACS에 의한 혈소판에 rFVIIaFc 변이체의 결합의 결과를 도시한다.
도 46A는 GPIb-알파 분자에 결합하는 펩티드, 특히 PS4, OS1, 그리고 OS2 펩티드를 이용하여 GPIb-알파를 표적으로 하는 몇몇 표적화된 FVIIa 구조체를 도시한다. 도 46B는 도 46A에 도시된 C 말단 펩티드 구조체를 이용한, 혈소판-풍부한 FVIII-결함성 혈장에서 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다.
도 47A는 도 46A에 도시된 N 말단 펩티드 구조체를 이용한, 혈소판-풍부한 FVIII-결함성 혈장에서 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. 도 47B는 FVII-045와 FVII-048의 직접적인 비교를 도시한다.
도 48은 FACS에 의한 측정에서 혈소판에 대한 FVII-045와 FVII-048 및 야생형 FVIIaFc의 결합을 도시한다. 상기 도면에서는 또한, Bernard et al. Biochemistry 2008, 47:4674-4682에서 보고된 바와 같이, 표적화 펩티드에 대한 친화성을 도시한다.
도 49A는 예시적인 표적화된 FVIII 구조체를 도시한다. 도 49B는 FVIII 결함성 혈소판-풍부한 혈장에서 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. 이러한 실험에서, 검정은 조직 인자 (위쪽 패널)로, 또는 혈소판 활성화 (아래쪽 패널)에 의해 활성화되었다.
도 50은 gla 도메인을 포함하는 표적화된 FVII 구조체 (FVII-011) 및 gla 도메인이 없는 표적화된 FVII 구조체 (FVII-028)의 반감기를 측정하는 실험의 결과를 도시한다.
도 51A는 표적화 모이어티, 본 발명의 경우에 SCE5 scFv를 포함하는 몇몇 FIX 구조체를 도시한다. 도 51B는 도 51A의 구조체를 이용한, 혈소판-풍부한 FIX-결함성 혈장에서 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. 도 51C는 FIX-068과 FIX-088 둘 모두 트롬빈 산출에 의한 측정에서, FIX-042보다 적어도 4배 높은 활성을 갖는다는 것을 도시한다.
도 52A는 FIX-090과 Benefix를 비교하는 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. 도 52B는 FIX-090의 활성이 Benefix의 활성의 거의 4배라는 것을 도시한다.
도 53A는 휴지 혈소판과 활성화된 혈소판 상에 존재하는 GPIb에 결합하는 펩티드를 포함하는 표적화된 FIX 구조체를 도시한다. 도 53B는 혈소판-풍부한 FIX 결함성 혈장에서 트롬빈 산출 검정의 결과를 도시한다. 도 53C는 FIX-089가 트롬빈 산출에 의한 측정에서 FIX-042보다 거의 4배 강하지만, 더욱 낮은 특이적 활성을 갖는다는 것을 증명한다.
실시예
이들 실시예 전반에서, 달리 지시되지 않으면 하기 재료와 방법이 이용된다.
전반적인 재료와 방법
일반적으로, 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않으면, 화학, 생물물리학, 분자생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학 (특히, 예로써 항체 기술)의 전통적인 기술, 그리고 전기영동에서 표준 기술을 이용한다. 예로써, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); 그리고 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)를 참조한다.
실시예 1. 두 번째 Fc 사슬의 아미노 말단에서 FVII-Fc와 MB9-Fc를 포함하는 헤테로이합성 구조체
pSYN-FVII-027의 클로닝
FVII-027 구조체는 세포 내에서 제조 동안 가공될 때 개열을 위한 cscFc를 포함한다. 상기 구조체는 표적화 모이어티, GPIIbIIIa에 결합하는 scFv 모이어티, MB9를 포함한다.
발현 FVII-Fc와 MB9-Fc 헤테로이합체를 위한 플라스미드 (pSYN-FVII-027)가 산출되었고, 여기서 MB9는 활성화된 혈소판 상에서 수용체 GPIIb/IIIa에 결합하는 것으로 이전에 밝혀진 scFv이다. pSYN-FVII-027로부터 단백질은 세포 내에서 단일 폴리펩티드로서 발현되고, 여기서 FVII-Fc 아단위의 C-말단은 (GGGGS)6x 폴리펩티드 링커에 의해 MB9-Fc 아단위의 N-말단에 연결된다. 게다가, 각 서열에서 마지막 Arg 이후에 프로단백질 전환효소에 의한 세포내 개열을 위해, RRRRS와 RKRRKR 서열이 상기 폴리펩티드 링커의 5'와 3' 단부에서 각각 삽입되었다. 결과적으로, 세포는 2 사슬 FVII-Fc/MB9-Fc 헤테로이합체를 발현할 것이고, 여기서 FVII-Fc 사슬은 C-말단에서 RRRRS 서열을 갖지만, 상기 링커의 나머지 및 RKRRKR 서열은 만약 그렇지 않으면, 제거된다.
첫 번째 단계로서, 하기 프라이머를 이용하여 일련의 중간 플라스미드가 산출되었다:
HindIII-SalI-BpsEI-Fc-F
AGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACC
BamHI-링커-Fc-R
CATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGG
BclI-Fc-F
CAGTCTTGATCAGACAAAACTCACACATGCCCACC
scFc-EcoRI-R
ACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG
HindIII-Kozak-FVII-F:
CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG
FVII-HC-BspEI-R:
AGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG
50 ㎕ PCR 반응은 하기 사이클을 이용하여, 25 pmol의 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F와 BamHI-링커-Fc-R 및 주형 pSYN-Fc-001로 수행되었다: 95℃ 2분; 30 사이클의 (95℃ 30초, 54℃ 30초, 72℃ 1분). 예측된 크기의 띠 (~700개 bp)는 겔 추출 키트 (Qiagen, Valencia, Calif.)로 겔 정제되고, 그리고 pBUDCE4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)의 HindIII와 BamHI 제한 부위 내로 클로닝되어 중간물질 pSYN-FVII-007이 산출되었다. 프라이머 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F와 BamHI-링커-Fc-R은 아미노산 221 (EU 넘버링)에서 시작하여 Fc 영역을 증폭하고, 그리고 부위 Fc 영역의 직상류에 HindIII와 SalI 제한 효소 부위뿐만 아니라, Fc 코딩 영역의 직하류에 (GGGGS)4x 링커, 그 이후에 BamHI 부위를 인코딩하는 DNA 단편을 부가한다. 그 다음, 50 ㎕ 반응이 상기에서와 동일한 사이클을 이용하여, 25 pmol의 BclI-Fc-F와 scFc-EcoRI-R, 그리고 주형 pSYN-Fc-011로 수행되었다. 예측된 크기의 띠 (~700개 bp)는 상기에서와 같이 겔 정제되고, 제한 효소 BamHI와 EcoRI로 절단되고, 그리고 pSYN-FVII-007의 BclI/EcoRI 제한 부위에서 클로닝되어 중간 플라스미드 pSYN-FVII-008이 산출되었다. 프라이머 쌍 BclI-Fc-F와 scFc-EcoRI-R은 Fc 코딩 영역의 직상류와 직하류에서 각각, BclI와 EcoRI 제한 부위를 부가하면서 Fc 영역을 증폭한다. 마지막 중간 플라스미드를 산출하기 위하여, 50 ㎕ PCR 반응은 하기 사이클을 이용하여, 25 pmol의 HindIII-Kozak-FVII-F와 FVII-HC-BspEI-R 및 주형 pSYN-FVII-001로 수행되었다: 95℃ 2분; 30 사이클의 (95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 90초). 이러한 프라이머 쌍은 (GGGGS)6x 폴리펩티드 링커, 그 이후에 아미노산 221 (EU 넘버링)에서 종결하는 Fc 영역의 단편을 인코딩하는 분자의 3' 단부에서 DNA 단편을 부가하면서 FVII 코딩 영역을 증폭한다. 프라이머 HindIII-Kozak-FVII-F는 상기 분자의 5'에서 HindIII 제한 부위, 그 이후에 FVII 코딩 영역의 직상류에 Kozak 서열을 발생시킨다. FVII-HC-BspEI-R 프라이머는 폴리펩티드 링커뿐만 아니라 Fc 부분을 인코딩하는 DNA를 도입한다. 예측된 크기의 띠 (~1500개 bp)는 상기에서와 같이 겔 정제되고, 그리고 pSYN-FVII-008의 HindIII/BspEI 부위 내로 클로닝되어 pSYN-FVII-011이 산출되었다.
그 다음, 2개의 DNA 단편이 합성되었다: Genescript-FVII-027-1 및 Genscript-FVII-026-2. Genescript-FVII-027-1은 Fc 영역의 부분 (뉴클레오티드 1306에서 시작, EU 넘버링), 그 이후에 서열 RRRRS-(GGGGS)6x-RKRRKR, 그 이후에 MB9 scFv의 부분 (잔기 1-142)을 인코딩하는 DNA 단편으로 구성된다. EcoRI 부위는 적절한 아미노산 서열을 보존하고 Genescript-FVII-027-1의 마지막 6개 염기와 겹치도록 하기 위해, 유전자 코드의 축퇴성 (degeneracy)을 이용하여 MB9의 코딩 서열 내에 도입되었다. 이에 더하여, 5'에서 첫 6개 염기는 Fc 영역 내에서 발견되는 SapI 부위를 포함한다. Genscript-FVII-026-2는 MB9의 부분 (잔기 143-273), 그 이후에 (GGGGS)6x 폴리펩티드 링커, 그 이후에 Fc 영역과 EcoRI 부위를 인코딩하는 DNA 단편으로 구성된다. EcoRI 부위는 적절한 아미노산 서열을 보존하고 Genescript-FVII-026-2의 첫 6개 염기와 겹치도록 하기 위해, 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)을 이용하여 MB9의 코딩 서열 내에 도입되었다.
Genescript-FVII-027-1은 pSYN-FVII-011의 SapI와 EcoRI 부위 내로 클로닝되어 pSYN-FVII-036이 산출되었다. 그 다음, Genscript-FVII-026-2는 pSYN-FVII-036의 EcoRI 부위 내로 클로닝되어 pSYN-FVII-027가 산출되었다. 최종 클로닝 단계의 정확한 배향 (orientation)은 제한 효소 분석 및 DNA 서열화에 의해 확증되었다.
실시예 2. 두 번째 Fc 사슬의 카르복시 말단에서 FVII-Fc와 MB9-Fc, MB9를 포함하는 헤테로이합성 구조체
FVII-037의 클로닝
FVII-037 구조체는 가공 동안 개열되지 않는 scFc 스카폴드를 이용하여 만들어진다. 이러한 구조체에서 표적화 모이어티, 다시 한 번 GPIIbIIIa에 결합하는 MB9 scFv는 두 번째 Fc 모이어티의 c-말단에 부착된다.
DNA 단편 Genscript-FVII-037의 합성은 아웃소싱 (Genscript)되었다. 이러한 단편은 Fc 영역의 부분 (잔기 434 내지 447, EU 넘버링), 그 이후에 (GGGGS)4x 폴리펩티드 링커 및 MB9 scFv를 포함한다. Genscript-FVII-037의 SapI/EcoRI 단편은 pSYN-FVII-011 (P0830을 참조한다)의 SapI/EcoRI 내로 서브클로닝되어 중간물질 구조체가 산출되었다. pSYN-FVII-011로부터 SapI 단편은 중간물질 구조체의 SapI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYNFVII-037이 산출되었다.
실시예 3. 두 번째 Fc 사슬의 카르복시 말단에서 FVII-Fc 및 GPIb에 반하는 펩티드를 포함하는 헤테로이합성 구조체
pSYN-FVII-041 중간물질 구조체의 클로닝.
이러한 구조체를 만들기 위하여, FVII-041 구조체가 먼저, 중간물질로서 만들어졌다. DNA 분자 Genscript-FVII-041의 합성은 아웃소싱 (Genscript)되었다. 이러한 단편은 SapI로 절단되고 pSYN-FVII-011의 SapI 부위 내로 클로닝되어 pSYN-FVII-041이 산출되었다. 이러한 과정은 두 번째 Fc 내에 유일한 SalI 부위 (잔기 412-413 EU 넘버링, GTG GAC 내지 GTC GAC)를 도입한다.
pSYN-FVII-044-, -045와 -046의 클로닝.
FVII-041 구조체가 GPIb에 결합하는 펩티드인 표적화 모이어티를 포함하는 여러 구조체를 산출하기 위한 출발 물질로서 이용되었다. PS4 펩티드는 -044 구조체에 이용되고, OS1 펩티드는 -045 구조체에 이용되고, 그리고 OS2 펩티드는 -046 구조체에 이용된다. 이들 구조체에서, scFc 스카폴드가 이용되고, 그리고 이들 펩티드는 링커를 거쳐, 두 번째 Fc 모이어티의 C-말단에 부착된다.
Genscript-FVII-044, -045와 -046의 합성은 아웃소싱 (Genscript)되었다. 이들 DNA 단편은 SalI/EcoRI로 개열되고 pSYN-FVII-041의 SalI/EcoRI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-044, -045와 -046이 산출되었다.
실시예 4. 두 번째 Fc 사슬의 아미노 말단에서 FVII-Fc 및 GPIb에 반하는 펩티드를 포함하는 헤테로이합성 구조체
pSYN-FVII-043 중간물질의 클로닝.
이러한 구조체를 만들기 위하여, FVII-043 구조체가 먼저, 중간물질로서 만들어졌다. DNA 단편 Genscript-FVII-043의 합성은 아웃소싱 (Genscript)되었다. 이러한 단편은 Fc 영역의 부분 (잔기 232 내지 447, EU 넘버링), 그 이후에 (GGGGS)4x 폴리펩티드 링커 및 Fc 영역의 다른 부분 (잔기 221 내지 238, EU 넘버링)을 인코딩하는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 DNA 단편은 BspEI와 RsrII로 절단되고 pSYN-FVII-042의 BspEI/RsrII 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-050가 산출되었다. 이러한 과정은 첫 번째 Fc 내에 유일한 SalI 부위 (잔기 412-413 EU 넘버링, GTG GAC 내지 GTC GAC)를 도입한다. pSYNFVII-050의 HindIII/EcoRI 단편은 pSYN-FVII-011의 HindIII/EcoRI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-043이 산출되었다.
pSYN-FVII-047, -048과 -049의 클로닝.
FVII-043 구조체가 GPIb에 결합하는 펩티드인 표적화 모이어티를 포함하는 여러 구조체를 산출하기 위한 출발 물질로서 이용되었다. PS4 펩티드가 -047 구조체에 이용되고, OS1 펩티드가 -048 구조체에 이용되고, 그리고 OS2 펩티드가 -049 구조체에 이용된다. 이들 구조체에서 scFc 스카폴드가 이용되고, 그리고 이들 펩티드는 scFc 링커 및 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착되는 링커 사이에 넣어진다.
DNA 분자 Genscript-FVII-047, -048과 -049의 합성은 아웃소싱 (Genscript)되었다. Genscript-FVII-047, -048과 -049로부터 Sal/RsrII 단편은 pSYN-FVII-043의 SalI/RsrII 부위 내로 서브클로닝되어 각각, pSYN-FVII-047, -048과 049가 산출되었다.
실시예 5. Gla-결실된 FVII-Fc 및 표적화 분자를 포함하는 헤테로이합성 구조체
FVII-028 중간물질의 클로닝
이러한 구조체를 만들기 위하여, FVII-028 구조체가 먼저, 중간물질로서 만들어졌다. DNA 단편 Genscript-FVII-028의 합성은 아웃소싱 (Genscript)되었다. 이러한 단편은 HindIII/XbaI로 절단되고 pSYN-FVII-011 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-028이 산출되었다.
FVII-053의 클로닝
FVII-028 구조체가 표적화 모이어티를 포함하고 Gla 도메인이 없는 응고 인자를 이용하는 구조체를 산출하기 위한 출발 물질로서 이용되었다. 이러한 구조체의 경우에, 세포내 활성화를 조장하기 위해 아미노산 1-35가 FVII로부터 제거되고, 그리고 RKRRKR 삽입이 잔기 R152 (WT FVII 넘버링) 뒤에 부가되었다. MB9 scFv는 표적화 모이어티로서 역할하였다.
DNA 분자 Genscript-FVII-025는 아웃소싱되고, 그리고 이러한 분자로부터 XbaI/BsiWI 단편이 pSYN-FVII-028의 XbaI/BsiWI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-053이 산출되었다.
실시예 6. 2개의 별개의 폴리펩티드로서 인자 VII 중쇄와 경쇄를 포함하는 헤테로이합성 구조체.
pSYN-FVII-024 중간물질 구조체의 클로닝
FVII-024 구조체는 인자 FVII의 중쇄와 경쇄가 단일 사슬 분자 내에서 인접하지 않는 구조체이다. 상기 구조체는 cscFc 링커가 트랜스-골지 네트워크 (trans-Golgi network) 내에 프로테아제에 의해 개열되도록 cscFc를 이용한다. 이러한 개열은 링커 제거뿐만 아니라 FVII의 활성화를 유발하여, 활성화된 FVIIaFc의 발현을 결과한다.
FVII의 코딩 서열은 하기 프라이머를 이용하여, 인간 간 mRNA 라이브러리 (Ambion, Austin, Texas)로부터 중합효소 연쇄 반응에 커플링된 역전사에 의해 획득되었다:
FVII-F1
GGGAATGTCAACAGGCAGGG
FVII-R1
CTTGGCTTTCTCTCCACAGGC
50 ㎕ 반응은 MJ 유전자증폭기에서 제조업체의 표준 프로토콜에 따라, Platinum Taq 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)과 함께 Superscript One-step RT-PCR을 이용하여 10 pmol의 각 프라이머로 수행되었다. 이용된 사이클은 50℃에서 30분 동안 역전사, 그 이후에 94℃에서 2분, 30 사이클의 (94℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 90초), 그 이후에 72℃에서 10분 동안 변성이었다. 예측된 크기의 띠 (~1400개 bp)는 겔 추출 키트 (Qiagen, Valencia, Calif.)로 겔-정제되고, 그리고 TOPO TA 클로닝 키트 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)를 이용하여 pCR2.1 TOPO 내에 클로닝되어 중간 플라스미드 pSYN-FVII-001이 산출되었다. 2-사슬 FVII-Fc와 Fc 헤테로이합체의 발현을 위한 플라스미드를 작제하기 위해, FVII 코딩 서열은 하기 프라이머를 이용하여 PCR-증폭되었다:
HindIII-Kozak-FVII-F
CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG
BspeI-Fc-FVII-R
CGACTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGGAAATGGGGCTCGCAGG
전방 프라이머 HindIII-Kozak-FVII-F는 FVII 코딩 영역의 직상류에 HindIII 제한 부위, 그 이후에 Kozak 서열을 부가한다. 역방 프라이머 BspeI-Fc-FVII-R은 아미노산 221-233 (EU 넘버링)을 포함하는 IgG1의 불변 영역 (Fc 영역)의 단편을 부가한다. 이러한 과정은 또한, 정확한 아미노산 서열 (EU 넘버링)을 보존하기 위해 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여 아미노산 231-233에서 BspEI 제한 부위를 통합한다. 50 ㎕ 반응은 MJ 유전자증폭기에서 하기 사이클을 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 Platinum Pfx DNA 중합효소 시스템을 이용하여 15 pmol의 각 프라이머와 주형 pSYN-FVII-001로 수행되었다: 95℃ 2분; 30 사이클의 (95℃ 15초, 49℃ 30초, 68℃ 90초); 68℃ 10분. 플라스미드 pSYN-FIX-027 (pBUD FIXFc/Fc)은 HindIII과 BspEI로 절단되고, 그리고 상기 벡터에 대한 예측된 크기의 띠 (대략 5800개 bp)는 겔 추출 키트 (Qiagen, Valencia, Calif.)로, FIX 삽입물 (대략 1480 bp의 예측된 크기의 띠)을 피하여 정제되었다. 그 다음, PCR-증폭된 FVII 서열은 FIX 삽입물을 제거한 후, pSYN-FIX-027로부터 유래된 벡터의 HindIII과 EcoRI 부위 내로 서브클로닝되었다. 이것은 pSYN-FVII-002 (pBUD FVIIFc/Fc)를 산출하였다. 그 다음, (GGGGS)6x 폴리펩티드 링커가 하기 프라이머를 이용하여 pSYN-FVII-002 내에 FVII과 Fc 영역 코딩 서열 사이에 부가되었다:
FVII-링커-F:
CATCCCCAGCACGTACGTCC
FVII-링커-R:
GGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG
Fc-링커-F:
GACAAAACTCACACATGCCCACC
Fc-링커-R:
GCAGAATTCTCATTTACCCGGAG
2개의 12 ㎕ PCR 반응은 MJ 유전자증폭기에서 제조업체의 표준 프로토콜에 따라 Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)을 이용하여 12 pmol의 FVII-링커-F와 FVII-링커-R (반응 1) 또는 Fc-링커-F와 Fc-링커-R (반응 2)로 수행되었다. 첫 번째와 두 번째 반응은 하기 사이클을 이용하여 주형으로서 1 ㎍의 pSYN-FVII-002로 수행되었다: 94℃ 2분; 14 사이클의 (94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분); 72℃ 10분. 예측된 크기의 띠 (반응 1의 경우에 532개 bp 및 반응 2의 경우에 670개 bp)는 겔 추출 키트 (Qiagen, Valencia, Calif.)로 겔 정제되고, 이후 30회 라운드의 증폭을 제외하고 상기에서와 같이 PCR 반응 동안 25 pmol의 FVII-링커-F와 Fc-링커-R과 합동되었다. 예측된 크기의 띠 (1200개 bp)는 겔 추출 키트 (Qiagen, Valencia, Calif.)로 겔 정제되고 제한 효소 KpnI와 EcoRI로 절단되었다. 예측된 크기의 띠 (920개 bp)는 상기에서와 같이 겔 정제되고 pSYN-FVII-002의 KpnI/EcoRI 부위내로 클로닝되어 pSYN-FVII-003 (pBUD FVIIFc/6x(GGGGS)/Fc)이 산출되었다.
2-사슬 헤테로이합체를 발현하기 위한 pSYN-FVII-024의 클로닝
플라스미드 (pSYN-FVII-024)는 2-사슬 헤테로이합체의 발현을 위해 산출되었는데, 여기서 한 사슬은 FVII 경쇄 (잔기 1-152), 그 이후에 (GGGGS)6x 링커, 그 이후에 Fc 영역으로 구성되는 반면, 다른 사슬은 FVII 중쇄 (잔기 153 내지 406), 그 이후에 (GGGGS)6x 링커, 그 이후에 Fc 영역을 내포한다. 상기 플라스미드는 상기 헤테로이합체를 단일 폴리펩티드로서 발현하도록 설계되고, 여기서 FVII 중쇄-링커-Fc 사슬의 C-말단은 하기 폴리펩티드 서열에 의해 중쇄-링커-Fc 사슬의 N-말단에 연결된다: RRRRS-(GGGGS) 6x-RKRRKR, 여기서 RRRRS와 RKRRKR 서열은 프로단백질 전환효소 개열 부위이다. 각 개열 부위에서 마지막 Arg 이후에 프로단백질 전환효소에 의한 세포내 개열은 폴리펩티드 링커의 제거를 유발할 수 있다. 결과적으로, 세포는 2개 사슬 헤테로이합체를 발현할 것이고, 여기서 FVII 경쇄-링커-Fc 사슬은 C-말단에서 RRRRS 서열을 갖지만, 상기 링커의 나머지 및 RKRRKR 서열은 불연하면, 제거된다. pSYN-FVII-024 및 여러 중간 플라스미드의 작제는 하기 프라이머의 이용을 필요로 하였다:
HindIII-SalI-BpEI-Fc-F
AGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACC
BamHI-링커(PACE1)-Fc-R
CATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGCTCCGGCGGCGCCGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGG
HindIII-Kozak-FVII-F
CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG
BspEI-Fc-링커-FVIILC-R
GAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGG
BamHI-2xlink-pace-HC-F
CAGTCTGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGATCAAGGAAGAGGAGGAAGAGGATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCC
Fc-EcoRI-R
ATGTCTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG
첫 번째 중간 플라스미드를 산출하기 위해, PCR 반응은 MJ 유전자증폭기에서 제조업체의 표준 프로토콜에 따라 Expand High Fidelity System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)을 이용하여 25 pmol의 프라이머 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F와 BamHI-링커(PACE1)-Fc-R 및 주형 pSYN-Fc-001로 수행되었다. 하기 사이클이 이용되었다: 95℃ 2분; 30 사이클의 (95℃ 30초, 58℃ 30초, 그리고 72℃ 1분); 72℃ 10분. 정확한 크기의 띠 (대략 730개 bp)는 상기에서와 같이 겔 정제되고 pBUDCE4 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)의 HindIII/BamHI 부위 내로 클로닝되어, pSYN-FVII-014가 산출되었다. 프라이머 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F와 BamHI-링커(PACE1)-Fc-R로 PCR 증폭은 Fc 영역의 부분 (아미노 A X-Y), 그 이후에 RRRRS 서열 및 (GGGGS)2x 폴리펩티드 링커를 인코딩하는 DNA 단편을 산출하였다. 프라이머 HindIII-SalI-BpEI-Fc-F는 상기 분자의 5' 단부에서 HindIII와 SalI 제한 부위를 도입하는 반면, 프라이머 BamHI-링커(PACE1)-Fc-R은 3' 단부에서, GGGGS 링커의 마지막 2개의 잔기 (코돈 GGA TCC를 갖는 잔기 GS)를 인코딩하는 코돈과 겹치는 BamHI를 도입한다. 그 다음, 다른 PCR 반응이 57℃의 어닐링 온도 (annealing temperature)를 제외하고 pSYN-FVII-014의 클로닝에 대해 기술된 동일한 조건을 이용하여 프라이머 HindIII-Kozak-FVII-F와 BspEI-Fc-링커-FVIILC-R 및 주형 pSYN-FVII-002로 상기에서와 같이 수행되었다. 예측된 크기의 띠 (대략 700개 bp)는 겔 정제되고 pSYN-FVII-014의 HindIII와 BspEI 부위 내로 클로닝되어 pSYN-FVII-023이 산출되었다. 프라이머 HindIII-Kozak-FVII-F와 BspEI-Fc-링커-FVIILC-R은 FVII 경쇄, 그 이후에 (GGGGS)6x 폴리펩티드 링커 및 아미노산 232 (EU 넘버링)까지 Fc 영역의 부분을 인코딩하는 DNA 단편을 증폭하였다. 프라이머 HindIII-Kozak-FVII-F는 상기 분자의 5' 단부에서 HindIII 제한 부위, 그 이후에 Kozak 서열을 도입하는 반면, 프라이머 BspEI-Fc-링커-FVIILC-R은 상기 분자의 3' 단부에서 BspeI 부위를 부가한다.
최종 단계에서, PCR 반응은 하기 사이클에서 프라이머 BamHI-2xlink-pace-HC-F와 Fc-EcoRI-R 및 주형 pSYN-FVII-003으로 상기에서와 같이 수행되었다: 95℃ 2분; 30 사이클의 (95℃ 30초, 55℃ 30초, 그리고 72℃ 2분); 72 ℃ 7분. 이러한 PCR 반응은 (GGGGS)2x 폴리펩티드 링커, 그 이후에 RKRRKR 서열, 그 이후에 FVII 중쇄를 인코딩하는 DNA 분자를 산출하였다. 프라이머 BamHI-2xlink-pace-HC-F와 Fc-EcoRI-R은 상기 분자의 5'와 3' 단부에서 각각, BamHI 부위와 EcoRI 부위를 도입한다. 예측된 크기의 띠 (대략 1600개 bp)는 pSYN-FVII-023의 BamHI와 EcoRI 부위 내로 클로닝되어 pSYN-FVII-024가 산출되었다.
중간물질 pSYN-FVII-073의 클로닝
PCR-기초된 특정 부위 돌연변이유발 방법에 의해 FVII-024의 첫 번째 Fc 모이어티 내에 침묵 돌연변이 (silent mutation)가 도입되어, 위치 412와 413 (EU 넘버링)에서 아미노산을 인코딩하는 DNA 영역에서 SalI 부위가 발생되었다. 이것은 중간물질 구조체 FVII-073을 산출하였다.
pSYN-FVII-057의 클로닝
pSYN-FVII-057의 SalI에서부터 BsiWI 부위까지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 DNA는 pSYN-FVII-073의 SalI/BsiWI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-057이 산출되었다.
pSYN-FVII-058, pSYN-FVII-059, pSYN-FVII-060, pSYN-FVII-061과 pSYN-FVII-062의 클로닝
이들 구조체는 pSYN-FVII-057에 대해 기술된 바와 같이 클로닝되었다 (SalI에서부터 BsiWI까지 DNA의 아웃소싱된 합성 및 pSYN-FVII-073 내로 서브클로닝)
pSYN-FVII-066의 클로닝
pSYN-FVII-066의 SalI에서부터 RsrII 부위까지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 DNA는 pSYN-FVII-043의 SalI/RsrII 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-066이 산출되었다.
pSYN-FVII-067의 클로닝
pSYN-FVII-067의 SalI에서부터 EcoRI 부위까지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 DNA는 pSYN-FVII-041의 SalI/EcoRI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-067이 산출되었다.
pSYN-FVII-090의 클로닝
pSYN-FVII-090의 BamHI에서부터 BsiWI 부위까지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 DNA는 3-원 결찰 (여기서 아웃소싱된 DNA는 BamHI/BsiWI로 절단되고, 그리고 pSYN-FVII-061은 BamHI/BsiWI/NotI로 절단되었다)에 의해 pSYN-FVII-061 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-090가 산출되었다.
pSYN-FVII-100의 클로닝
FVII의 170 루프의 부분 (FVII 성숙 서열의 아미노산 311 내지 322)은 트립신의 170 루프 (아미노산 EASYPGK)로 대체되었다. 이러한 돌연변이는 pSYN-FVII-090을 주형과 주쇄 구조로서 이용한 표준 겹침 PCR 방법에 의해 도입되어 pSYN-FVII-100이 산출되었다.
pSYN-FVII-115의 클로닝
삼중 점 돌연변이 (V158D, E296V와 M298Q; 성숙 FVII 서열 넘버링)은 PCR-기초된 특정 부위 돌연변이유발에 의해 pSYN-FVII-090의 FVII 코딩 영역 내로 도입되어 pSYN-FVII-115가 산출되었다.
pSYN-FVII-118의 클로닝
pSYN-FVII-118의 XbaI에서부터 BsiWI 부위까지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 DNA는 pSYN-FVII-011의 XbaI/BsiWI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-118이 산출되었다.
pSYN-FVII-119의 클로닝
pSYN-FVII-119의 XbaI에서부터 BsiWI 부위까지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 DNA는 pSYN-FVII-011의 XbaI/BsiWI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-119가 산출되었다,
pSYN-FVII-127의 클로닝
트립신의 170 루프를 포함하는 DNA 단편은 pSYN-FVII-100을 주형으로서 이용한 PCR에 의해 산출되었다. 이러한 PCR 반응은 5'와 3'에서 각각, BsiWI와 BspEI 제한 부위를 발생시켰다. DNA 단편은 pSYN-FVII-118의 BsiWI/BspEI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-127가 산출되었다.
pSYN-FIX-042의 클로닝
pSYN-FIX-030으로부터 HindIII/BspEI 단편 (US Patent 7566565에서 기술된 바와 같음)은 pSYN-FVII-011의 HindIII/BspEI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FIX-042가 산출되었다.
pSYN-FIX-068의 클로닝
pSYN-FIX-030으로부터 HindIII/BspEI 단편 (US7566565에서 전부 기술된 플라스미드)은 pSYN-FVII-066의 HindIII/BspEI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FIX-068이 산출되었다.
pSYN-FIX-088의 클로닝
pSYN-FIX-067로부터 BspEI-EcoRI 단편은 pSYN-FIX-053의 BspEI-EcoRI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FIX-088이 산출되었다.
pSYN-FIX-089의 클로닝
pSYN-FIX-048로부터 BspEI-EcoRI 단편은 pSYN-FIX-053의 BspEI-EcoRI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FIX-089가 산출되었다.
pSYN-FIX-090의 클로닝
상기 단백질의 XbaI 부위에서부터 C-말단까지의 FIX 코딩 영역, 그 이후에 6x(GGGGGS) 링커, SCE5 코딩 서열 및 EcoRI 부위를 포함하는 DNA 단편은 합성을 위해 아웃소싱되고 pSYN-FIX-053의 XbaI/EcoRI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FIX-090가 산출되었다. SCE5 서열은 하기에 진술된다:
AQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMFSRYAMSWVRQAPGKGPEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGATYTSRSDVPDQTSFDYWGQGTLVTVSSGSASAPKLEEGEFSEARVSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRNFYASWYQQKPGQAPTLVIYGLSKRPSGIPDRFSASSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCLLYYGGGQQGVFGGGTKLTVLRQPKAAPSVTLFPPSSAA
pSYN-FVII-094의 클로닝
6x(GGGGS) 링커, 그 이후에 SCE5 코딩 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 DNA 단편은 합성되고 (아웃소싱되고), 그리고 FVII 코딩 영역의 C-말단에서 EcoRV 부위를 산출하기 위해 사전에 변형된 pSYN-FVII-011 변이체의 EcoRV/EcoRI 부위 내로 클로닝되었다.
pSYN-FVII-088의 클로닝
pSYN-FVII-088의 SalI에서부터 RsrII 부위까지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 DNA는 pSYN-FVII-066의 SalI/RsrII 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-088이 산출되었다.
pSYN-FVII-125의 클로닝
DNA 단편은 pSYN-FVII-088로 PCR 증폭되고, AP3 영역 및 링커의 일부를 포함하였다. 이러한 PCR 반응은 상기 DNA 단편의 5'와 3'에서 각각, BamHI와 EcoRI 부위를 발생시켰다. 이러한 DNA 단편은 pSYN-FVII-011의 BamHI/EcoRI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVII-125가 산출되었다.
pSYN-FVIII-041의 클로닝
인간 재조합 B-도메인 결실된 FVIII의 코딩 서열은 FVIII-특이적 프라이머를 이용하여 인간 간 폴리 A RNA (Clontech)로부터 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 획득되었다. FVIII 서열은 FVIII에 대한 고유 신호 서열을 포함하였다. B-도메인 결실은 2682 bp (SQ 이형)의 완전한 결실을 위해, 세린 743 (S743; 2287개 bp) 뒤에서 시작하고 글루타민 1638 (Q1638; 4969개 bp) 앞에서 종결한다.
인간 재조합 Fc에 대한 코딩 서열은 Fc 특이적 프라이머를 이용하여 인간 백혈구 cDNA 라이브러리 (Clontech)로부터 RT-PCR에 의해 획득되었다. 프라이머는 B-도메인 결실된 FVIII 서열이 개입 링커 없이 Fc 서열의 N-말단에 직접적으로 융합되도록 설계되었다. FVIIIFc DNA 서열은 CMV 프로모터의 제어 하에 포유동물 이중 발현 벡터 pBUDCE4.1 (Invitrogen) 내로 클로닝되었다.
생쥐 Igk 신호 서열을 포함하는 두 번째 동일한 Fc 서열은 RT-PCR에 의해 획득되고, 그리고 발현 벡터 pBUDCE4.1 내에 두 번째 프로모터, EF1α의 하류에 클로닝되었다. 이러한 최종 구조체는 pSYN-FVIII-013으로 명명된다.
두 번째 플라스미드는 rFVIIIBDDFc 코딩 서열이 (GGGGS)4 링커로 두 번째 Fc 서열에 융합되어, 일시적인 형질감염에서 rFVIIIBDD-Fc 단위체-이합체 하이브리드만 생산될 수 있도록 하는 rFVIIIBDD-Fc-Fc를 발현하기 위해 PCR과 표준 분자생물학 기술을 이용하여 유사한 구조체로부터 산출되었다. 이러한 구조체는 pSYN-FVIII-041로 명명되었다.
pSYN-FVIII-049의 클로닝
pBUD-CE4.1로부터 NheI/XhoI 단편으로부터 pSYN-FVIII-013 내로 클로닝에 의해 산출된 중간물질 pSYN-FVIII-048. pSYN-FVIII-049의 RsrII에서부터 XbaI 부위까지의 영역을 포함하는 DNA 단편의 합성은 아웃소싱되었다. 이러한 단편은 pSYN-FVIII-048의 RsrII/XbaI 부위 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVIII-049가 산출되었다.
pSYN-FVIII-108의 클로닝
pSYN-FVII-066으로부터 SalI/RsrII 단편은 pSYN-FVIII-049 내로 서브클로닝되어 pSYN-FVIII-108이 산출되었다.
실시예 7. 활성화된 구조체의 발현에서 추가적인 시도
활성화된 FVII를 발현하는 목적으로 여러 다른 구조체가 만들어졌다. 하지만, 이들 구조체는 활성화된 분자를 성공적으로 발현하지 못하였다. 웨스턴 블롯에 의해, FVII 중쇄는 중쇄의 N-말단에 이종성 신호 펩티드를 융합하는 통상의 방법을 이용하여 유리 N 말단을 갖도록 발현될 수 없는 것으로 증명되었다.
pSYN-FVII-010의 클로닝
FVII-010 구조체는 인자 VII의 중쇄가 scFc 스카폴드의 배경에서 발현되고, 그리고 경쇄가 별개로 발현되는 구조체이다.
pSYN-FVII-001 (상기 참조)을 이용하여, 프라이머 쌍 FVII-HC-Hind3-IggKss -F/FVII-HC-BspEI-R로 PCR-증폭한다. pSYN-FVII-008 (상기 참조)의 BspEI/HindIII 부위에서 클로닝하여 pSYN-FVII-009를 산출한다.
pSYN-FVII-003 (P0830을 참조)으로부터 FVII 경쇄를 프라이머 FVII-LC-NotI-F/ FVII-LC-XhoI-R로 PCR 증폭하고 pSYN-FVII-009 내에 클로닝하여 pSYN-FVII-010을 산출한다.
프라이머
FVII-HC-BspEI-R
AGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG
FVII-HC-Hind3-IggKss-f
ACTGACAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTATTGTGGGGGGCAAGGTGTGC
FVII-LC-NotI-F
ACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCTCCCAGG
FVII-LC-XhoI-R
ACTGACCTCGAGTTATCGGCCTTGGGGTTTGCTGG
pSYN-FVII-013의 클로닝
FVII-013 구조체는 경쇄가 scFc 스카폴드의 배경에서 발현되고, 그리고 중쇄가 별개로 발현되는 구조체이다.
pSYN-FVII-001 (P0830을 참조)로부터 프라이머 쌍 FVII-LC-링커-BamHI-R/ HindIII-Kozak-FVII-F로 PCR-증폭하고 pSYN-FVII-011의 BamHI/HindIII 부위 내에 클로닝하여, pSYN-FVII-012를 산출한다. pSYN-FVII-009로부터 FVII-HC를 프라이머 쌍 FVII-HC-NotI-F/FVII-HC-XhoI-R을 이용하여 PCR-증폭하고 pSYN-FVII-012 내에 서브클로닝하여 pSYN-FVII-013을 산출한다.
프라이머
FVII-LC-6x링커-BamHI-
RACTGACGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGC
HindIII-Kozak-FVII-F
CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG
FVII-HC-NotI-F
ACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGAGACAGAC
FVII-HC-XhoI-R
ACTGACCTCGAGTTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAG
pSYN-FVII-018의 클로닝
FVII-018 구조체의 경우에, FVII의 중쇄는 Fc 융합 단백질로서 발현되고, 그리고 FVII의 경쇄는 별개의 Fc 융합 단백질로서 별개로 발현되었다.
프라이머 FVII-HC-Hind3-IggKss-F/scFc-EcoRI-R은 pSYN-FVII-010을 주형으로 하여, HCFVII-링커-Fc를 PCR 증폭하는데 이용되었다. pBUDCE4의 HindIII/EcoRI 부위 내에 서브클로닝한다. 이것은 pSYN-FVII-017을 만든다. 그 다음, 프라이머 FVII-LC-NotI-F/FC-XHOI-R로 pSYN-FVII-013으로부터 PCR-증폭하고 FVII-017의 XhoI/NotI 부위 내에 서브클로닝한다. 이것은 PSYN-FVII-018을 만든다.
프라이머
scFc-EcoRI-R
ACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG
Fc-XhoI-R
AGCTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGG
실시예 8. 활성화가능 구조체의 발현에서 시도
FVII-039, -040의 클로닝
인자 VII가 적절한 개열 부위, 본 발명의 경우에 DFTR 인자 XIa 개열 부위를 이용하여 생체내 응고 부위에서 활성화될 수 있는 구조체를 산출하기 위한 시도에서 여러 구조체가 만들어졌다.
039 구조체는 scFc 스카폴드의 배경에서 만들어졌다. 상기 구조체는 FVII 경쇄, FXIa 개열 부위, 그리고 첫 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착된 선형 서열에서 I153V 돌연변이를 갖는 FVII 중쇄를 포함하였다.
040 구조체 역시 scFc 스카폴드의 배경에서 만들어졌다. 상기 구조체는 R152 결실을 갖는 FVII 경쇄, FXIa 개열 부위, 그리고 첫 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착된 선형 서열에서 I153V 돌연변이를 갖는 FVII 중쇄를 포함하였다. DFTR 개열 서열은 FIX에서 발견되는 자연 FXIa 서열이다. FIX 내에서, DFTR 서열은 발린이 뒤따르고, 따라서 I152V 돌연변이가 pSYN-FVII-039, -040 내에 도입되어 FXIa 개열 효율이 증가되었다.
DNA 분자 Genscript-FVII-039과 -040의 합성은 아웃소싱 (Genscript)되었다. Genscript-FVII-039과 -040으로부터 XbaI/BsiWI 단편은 pSYN-FVII-011의 XbaI/BsiWI 부위 내로 서브클로닝되어 각각, pSYN-FVII-039와 -040이 산출되었다.
실시예 9. 구조체의 일시적인 형질감염
구조체의 발현을 위하여, HEK-293-F 세포는 37℃/10% CO2에서 현탁 세포로서 2 ㎍/리터 (성장 배지)까지 비타민 K3 (FVII와 FIX 형질감염 단독의 경우) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)으로 보충된 Freestyle 배지 (Invitrogen)에서 현탁 상태에서 성장되었다. 세포는 5x105 세포/ml의 세포 밀도로 접종함으로써 3일 내지 4일마다 계대배양되었다.
형질감염에 앞서 24시간 시점에, 세포는 20 ㎍/리터까지 LONGTMR3IGF-1 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 보충된 성장 배지 (형질감염 배지)에서 7x105 세포/ml의 밀도로 접종되었다. 형질감염의 당일에, 형질감염 용액은 형질감염되는 세포 배양액의 전체 부피의 5%에 동등한 부피로 만들어졌다. 형질감염 용액에서, DNA는 형질감염 배지에서 PEI의 새로 만들어진 용액 (60 mg/L)에 첨가되었다 (최종 농도 20 mg/L). 상기 용액은 30초 동안 와동되고, 그리고 세포 배양액에 직접적으로 첨가하기에 앞서 실온에서 5분 동안 배양되었다. 4시간후, 비타민 K3, LONGTMR3IGF-1 및 200 mM L-글루타민으로 보충된 OptiCHO (Invitrogen)의 세포 배양액 부피에 동등한 부피가 이들 세포에 첨가되었다. 세포 배양액은 앞서 제시된 바와 같이 성장되고, 그리고 단백질 발현을 평가하기 위해 일일 배지 샘플이 채취되었다. 수확 당일에, 이들 세포는 스핀다운되고, 그리고 배지는 단백질 A 풀다운 (pulldown)/웨스턴 블롯에 의해 단백질 정제 또는 단백질 분석에 대비하여 여과된다.
실시예 10. FVIIFc 분자 (FVII-028과 FVII-053 제외)와 FIXFc 분자의 단백질 정제
FVIIFc 분자는 하기 칼럼을 이용하여 조건 배지로부터 정제되었다: 1) 가성-친화성 용리 (가령, Q 세파로오스 4FF (GE Healthcare), 그 이후에 최대 활성 종을 선별적으로 용리하기 위한 다양한 수준의 CaCl2로 용리를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, 그 이후 2) shFcRn (가용성 인간 FcRn) 친화성 (세파로오스 4FF 구슬과 함께 NHS-커플링된 shFcRn) 크로마토그래피, 낮은 pH (가령, pH 6.2)에서 Fc-내포 단백질에 결합, 그리고 중성 pH (가령, pH 8.0)에서 용리. 일부 경우에, NaCl 용리를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 추가 단계가 포함되었다. 이들 정제 단계는 SEC 분석 및 SDS-PAGE에 의해 >95% 순도의 정제된 단백질을 산출하기 위해 당분야에 공지된 표준 방법을 이용하였다. FIXFc 단백질은 US Patent 7,566,565에서 기술된 바와 같이 정제되었다.
실시예 11. FVII-028과 FVII-053의 단백질 정제
FVII-028과 -053은 하기 칼럼을 이용하여 조건 배지로부터 정제되었다: 1) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (가령, 페닐 FF (high sub) (GE Healthcare)), 그 이후 2) 염 용리를 이용한 음이온/양이온 교환 크로마토그래피. 이들 정제 단계는 SEC 분석 및 SDS-PAGE에 의해 >95% 순도의 정제된 단백질을 산출하기 위해 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하였다.
실시예 12. FIX-090의 정제
FIX-090은 2-단계 크로마토그래피 과정을 통해 정제되었는데, 먼저 항-GLA 도메인 항체로 면역친화성 크로마토그래피 단계, 그 이후에 앞서 기술된 FIXFc 단백질과 유사한 가성친화성 용리를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피가 이용되었다. 이들 정제 단계는 SEC 분석 및 SDS-PAGE에 의해 >95% 순도의 정제된 단백질을 산출하기 위해 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하였다.
실시예 13: FVIIIFc 단백질의 정제
FVIIIFc 단백질은 FVIII-특이적 친화성 정제 단계 (McCue 2009), 그 이후에 음이온 교환과 표준 NaCl 용리 및/또는 shFcRn (가용성 인간 FcRn) 친화성 (세파로오스 4FF 구슬과 함께 NHS-커플링된 shFcRn) 크로마토그래피, 낮은 pH (가령, pH 6.2)에서 Fc-내포 단백질에 결합 및 중성 pH (가령, pH 8.0)에서 용리의 조합을 비롯한 2가지 또는 3가지 칼럼 정제 과정을 이용하여 정화되고 화학적으로 정의된 수확 배지로부터 정제되었다. 이들 정제 단계는 SEC 분석 및 SDS-PAGE에 의해 >95% 순도의 정제된 단백질을 산출하기 위해 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하였다.
실시예 14. FVII 구조체의 활성화
FVIIFc를 내포하는 FcRn 칼럼으로부터 용리된 분획물(fraction)은 모아지고, 그리고 전체 단백질은 4 mg/ml로 농축되었다. CaCl2 농도는 5 mM로 상승되고, 그리고 시료는 FVIIFc 중에서 적어도 80%가 활성화될 때까지 4℃에서 24 내지 48시간 동안 배양되었다. 활성화의 정도는 SDS PAGE에 의해 평가되었다 (도 10).
실시예 15. FVIIa 활성 검정, 가용성 조직 인자 방법
FVIIaFc 변이체의 특이적 활성은 가용성 조직 인자 방법에 의해 결정되었다. 지질화된 전장 조직 인자와 달리, 가용성 조직 인자 (조직 인자의 세포외 부분)는 FVII를 FVIIa로 활성화시킬 수 없지만, FVIIa에 의한 인자 X의 인자 Xa로의 전환의 활성자로서 작용한다. FVIIaFc 변이체의 특이적 활성을 결정하기 위해, STACLOT® FVII-rTF 키트 (Diagnostica Stago, Asnieres, France)가 제조업체의 권고에 따라 이용되었다. 표 1에서는 획득된 데이터를 요약하고 모든 변이체에 대한 비교되는 특이적 활성을 보여준다.
Figure pct00001
실시예 18. FVIIaFc와 혈소판의 결합을 조사하기 위한 FACs 검정
본 실시예에서, 하기 반응물과 방법이 이용되었다:
반응물
ADP: Sigma Aldrich, cat# A2754, 스톡 1 mM, 작업 농도 10 uM
SFLLRN 펩티드: 사내 합성, 스톡 농도 5 mg/ml (6.7 mM), 작업 농도 50 ug/ml (67 uM)
FVII 항체-FITC-표지됨: Affinity Biologicals SAFVII-APFTC
혈소판 완충액: 15 mM HEPES, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 5.5 mM 덱스트로스 및 mg/ml BSA, pH 7.4
방법
- 혈소판을 계산한다.
- 20 ㎕의 ~2-4x108 세포/ml 겔-정제된 혈소판을 1 ml의 혈소판 완충액에 첨가한다.
- 각 시료에 대한 100 ㎕ 분취량을 만든다.
- 작동약과 FVIIaFc (원하는 농도로)를 첨가하고, 필요에 따라 37℃에서 15분 동안 배양한다.
- 동등한 부피의 HBS/5 mM CaCl2/1.5% 포름알데히드를 첨가하고, RT에서 20'동안 배양한다.
- 3000g에서 15'동안 회전시킨다.
- HBS/5mM CaCl2/1 mg/ml BSA에서 세척하고, 다시 한 번 회전시키고, 그리고 100 ㎕의 혈소판 완충액에서 재현탁시킨다.
- 2.5 ㎕의 FVII 항체-FITC-표지됨을 첨가하고 실온에서 30' 동안 배양한다.
- FACs로 분석한다.
실시예 17. 트롬빈 산출 검정
본 실시예에서, 하기 반응물과 방법이 이용되었다:
반응물
FV: HTI, cat#HCV-0100, lot#Z0413, 5.1 mg/ml
프로트롬빈: HTI, cat#HCP-0010, lot# Z0128, 4.8 mg/ml
FX: HTI, cat# HCX-0050, lot#X0401, 5.4 mg/ml
ATIII: HTI, cat# HCATIII-0120, lot#Y0401, 8.2 mg/ml
TFPI: American Diagnostica, cat# 4900PC, lot# 081031, 100 ug/ml
판독기: Fluorskan, Thermo Electron Fluorometer
트롬빈 눈금측정기: Thrombinoscope, cat# TS20.00
Fluca: Thrombinoscope, cat# TS50.00
혈소판 완충액: 15 mM Hepes pH 7.4, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5.5 mM 덱스트로스, 사용에 앞서 1 mg/ml BSA로 보충됨
ADP: Sigma Aldrich, cat# A2754, 스톡 1 mM, 작업 농도 10 uM
SFLLRN 펩티드: 사내 합성, 스톡 농도 5 mg/ml (6.7 mM), 작업 농도 50 ug/ml (67 uM)
작업 스톡 (mg/ml) 작업 용액 (ug/ml) [최종] ug/ml
FV 5.1 105.6 4.4
FII 4.8 1200 54
FX 5.4 120 5
ATIII 8.2 1800 75
TFPI 0.1 1.44 0.06
혈소판 2-10E8 1.74E8 0.6E8
FVIIaFc 1 mg/ml (10 uM) 1200 nM 200 nM
FVIIaFc 1 mg/ml (10 uM) 200 nM 62.5 nM
FVIIaFc 1 mg/ml (10 uM) 62.5 nM 12.5 nM
방법
- 제조업체의 권고에 따라 소프트웨어를 설정한다.
- 물과 Fluca 완충액을 미리 데운다.
- 응고 인자 믹스를 만든다. FV, FII, FX, ATIII와 TFPI의 스톡 농도를 희석하여 작업 용액을 만든다. 5 ㎕/웰을 필요로 하고, 따라서 30 웰 검정의 경우에 각각 180 ㎕를 제조하고 모든 응고 인자 용액을 단일 벌크 용액에서 혼합한다.
- FVIIaFc 희석액을 미리 만든다.
- 100 ㎕에서 1200 nM 용액 (12 ㎕에서 88 ㎕의 완충액으로)을 만들고 4-배씩 2회 (25 ㎕에서 75 ㎕의 완충액으로) 희석하여 200 nM과 62.5 nM 용액을 획득한다.
- 눈금측정기 용액 (눈금측정기 바이알에서 1 ml의 온수)을 만든다.
- 20 ㎕의 완충액 또는 눈금측정기를 웰에 첨가한다.
- 25 ㎕의 응고 인자 믹스를 웰에 첨가한다 (또는 25 ㎕의 완충액을 눈금측정기 웰에 첨가한다).
- 20 ㎕의 FVIIaFc를 웰에 첨가한다 (또는 완충액을 눈금측정기 웰에 첨가한다).
- 35 ㎕의 혈소판을 첨가한다 (ADP와 SFLLRN을 미리 첨가한다). 혈소판을 눈금측정기 웰에 첨가한다.
- 플레이트를 기구 내에 집어넣고, Fluca 완충액을 제조하고, 그리고 플레이트를 기구 내로 집어넣고 5분후 반응을 시작한다 (20 ㎕ Fluca/웰을 첨가한다).
실시예 18. 일시적 형질감염으로부터 산출된 단백질의 분석
일시적 형질감염으로부터 단백질의 분석을 위하여, pSYN-FVII-010, 011, -013, -018, -003, -019 -020과 -024의 형질감염으로부터 조건 배지는 단백질 A 면역침강에 종속되었다. 간단히 말하면, 세포 배양 상층액은 대략 50 ㎕의 단백질 A-세파로오스 50% 슬러리와 혼합되고, 흔들면서 4℃에서 1시간 동안 배양되고, 이후 단백질 A 구슬을 작은 덩어리로 뭉치기 위해 원심분리되었다. 구슬은 1 ml의 PBS에서 재현탁하고, 회전시키고, 흡인함으로써 2회 세척되었다. 이들 구슬은 환원 또는 비환원 조건 하에 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 재현탁되고, 100℃에서 5분 동안 가열되고, 스핀다운(spin down)되고, 그리고 표준 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 겔에 적하되고 이동되었다. 겔이 니트로셀룰로오스 막으로 이전되고, 그리고 Fc 영역 또는 FVII 경쇄를 검출하기 위한 웨스턴 블롯이 수행되었다. Fc 검출의 경우에, 이용된 항체는 염소 항-인간 IgG (Fc 특이적)-양고추냉이 과산화효소 접합체 (Pierce ImmunoPure 항체, 카탈로그 #31413)이었다. FVII 경쇄 검출의 경우에, 항 경쇄 단일클론 항체 (Green Mountain, 클론 6MA-219)가 이용되었다. 이들 항체는 PBST (0.1% Tween-20을 포함하는 PBS)에서 5% 탈지 분유로 1:15,000 (Fc 검출의 경우) 또는 1:200 (경쇄 검출의 경우) 희석되고 막과 함께 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 막은 이후, PBST에서 10분 동안 3회 세척되고, 그리고 신호는 Fc 검출의 경우에 화학발광 방법에 의해 검출되었다. FVII 경쇄 검출의 경우에, 막은 PBST에서 1:5000 희석된 HRP-표지된 염소 항-생쥐 항체 (Southern Biotech, # 1010-05)를 내포하는 용액에서 1시간 동안 더욱 배양되었다. 막은 또한, PBST에서 10분 동안 3회 세척되고, 그리고 신호는 화학발광 방법에 의해 검출되었다. 화학발광 검출은 제조업체의 프로토콜에 따라 ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences 카탈로그 #RPN2132)을 이용하여 수행되었다. 신호는 Storm 840 Phosphorimager (Molecular Devices)에서 명시화되었다.
FVII-024 링커 내에 프로단백질 전환효소 개열 부위의 가공에 대한 PC5의 효과는 도 26에 도시된 바와 같이 조사되었다. 비환원 조건 하에, 개열 부위 가공에 대한 PC5의 효과는 검출될 수 없는데, 그 이유는 FVII 경쇄-Fc와 FVII 중쇄-Fc 아단위가 Fc 영역 내에 2개의 이황화 결합을 통해 연결된 상태로 남아있기 때문이다 (레인 2와 3). 환원 조건 하에, PC5로 공동-형질감염되지 않은 세포로부터 산출된 FVII-024의 부분 가공 (레인 4), 하지만 이들 세포가 PC5로 공동-형질감염될 때 완전한 가공 (레인 5)이 관찰되었다. 링커의 완전한 가공은 활성화된 FVII (FVIIa)의 분비를 유발하는데, 그 이유는 중쇄의 유리 N-말단이 상기 단백질을 활성화시키는데 필요 충분하기 때문이다.
실시예 19. FXIa에 의한 FVII-039와 FVII-040의 개열
FVII-039와 FVII-040 단백질에서 FVII 경쇄의 직상류에 삽입된 FXIa 개열 부위의 결과로서, FXIa에 의한 FVII-039와 FVII-040의 활성화는 시험관내에서 특성화되었다. 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4에서 15 nM FXIa를 내포하는 FVII-039, FVII-040 또는 FVII-011 (비 활성화됨)의 1.5 μM 용액은 5 또는 20분 동안 배양되고, 그리고 FVIIFc의 개열은 환원 조건 하에 SDS PAGE, 그 이후에 SYPRO Ruby 염색 (Invitrogen)에 의해 결정되었다. FXIa는 도 28에 도시된 바와 같이, FVII-039, FVII-040 및 비활성화된 FVII-011을 개열하는데 실패하였다.
실시예 20. 대안적 활성화가능 FVIIFc 구조체
FVII-039과 FVII-040의 개열에서 FXIa의 실패는 입체 장해 (steric hindrance)에 의한 개열 부위에 프로테아제의 접근하기 어려움 (inaccessibility)에 의해 유발되었을 지도 모른다. FXIa 또는 트롬빈 개열 부위 접근성을 향상시키기 위해, 이들 부위는 구조 내에 중쇄의 상류에 위치될 것이고, 여기서 중쇄는 경쇄가 선행하지 않는다 (경쇄-링커-Fc-scFc링커-FXIa/트롬빈 개열 부위-중쇄-링커-Fc). 일부 구체예에서, 중쇄는 I152V 돌연변이를 포함할 것이다. 일단 최적 개열 부위가 결정되면, 세포가 두 번째 사슬: FXIa/트롬빈 개열 부위-중쇄-링커 Fc에 이황화 결합되는 하기 구조: 경쇄-링커-Fc를 갖는 헤테로이합성 단백질을 분비하도록 cscFc가 도입될 것이다.
도 28에 도시된 구조체에서 관찰된 활성화의 수준을 향상시키기 위해, 도 31에 예시된 활성화가능 변이체의 두 번째 세대 (도 6E에 도시된 것들과 구조에서 유사)가 개열 부위의 접근성을 증가시키는데 이용되었다. 본 실시예에서, FXIa와 트롬빈 개열 부위가 이들 구조체에 이용되었다 (도 31 참조). 구조체는 앞서 기술된 바와 같이 일시적으로 형질감염되었다. FVIIFc는 단백질 A로 배지로부터 포획되었다. 구슬에 결합된 FVIIFc는 완충액에 넣어지고, 그리고 FXIa 또는 트롬빈이 첨가되고 배양되었다. FVIIFc는 100℃에서 5분 동안 SDS PAGE 적하 완충액으로 구슬로부터 용리되었다. 겔이 적하되고, 앞서 기술된 바와 같이 Fc를 검출하기 위한 웨스턴 블롯이 수행되고, 그리고 획득된 결과는 도 32에 도시된다. 도 32에 도시된 바와 같이, 트롬빈과 인자 XIa 개열 부위 둘 모두 적절한 효소의 존재에서 개열되어 FVII 중쇄와 경쇄 분자가 산출될 수 있었다. 최적 개열은 구조체 FVII-060과 FVII-061에서 관찰되는 반면, 개열 없음은 트롬빈의 존재에서 음성 대조 (negative control) (FVII-062)에서 관찰되었다.
실시예 21. 인자 VII 활성화가능 구조체
도 33에 도시된 구조체 (FVII-090, FVII-089 및 FVII-062)는 앞서 기술된 바와 같이 클로닝되고, 발현되고, 그리고 정제되었다 (이들 단백질은 활성화를 요구하지 않는다). 클로닝 오류로 인하여, "VVGGA" 서열이 FVII-060과 FVII-061의 ALRPR 트롬빈 개열 서열 뒤에 삽입되고, 비록 이러한 삽입이 활성에 영향을 줄 것으로 예측되긴 하지만, SDS-PAGE 기초된 검정에서 트롬빈에 의한 개열의 평가에 영향을 줄 것으로 예측되지 않을 것이다. 이러한 서열은 FVII-089 및 FVII-090에서 제거되었다. 125 nM의 FVII-090, FVII-089, FVII-062, 또는 혈장-유래된 FVII (FVII)에 증가하는 농도의 트롬빈이 추가되고 37℃에서 10분 동안 배양되었다. 혼합물은 트롬빈에 의한 개열을 결정하기 위해 SDS-PAGE 겔에서 이동되었다 (도 33). FVII 경쇄-Fc와 FVII 중쇄-Fc의 산출이 트롬빈과 함께 배양후 FVII-089와 FVII-090에서 관찰되었다. 트롬빈에 의한 혈장-유래된 FVII 또는 FVII-062 음성 대조의 개열이 없다는 사실은 특이성을 증명한다. 개열 효율에서 유의미한 차이 없음이 FVII-089과 FVII-090에서 관찰되었다.
트롬빈 산출 검정은 활성화가능 변이체 FVII-090의 활성을 측정하는데 이용되었다. FVIII-결함성 혈소판-풍부한 혈장에서 트롬빈 산출 검정은 응고 인자와 혈소판을 FVIII-결함성 혈소판-풍부한 혈장으로 대체하는 점을 제외하고 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 도 34에 도시된 결과는 트롬빈 산출이 50 nM의 FVIIaFc로 활성화되는 검정으로부터 획득된다. 도 34에 도시된 바와 같이, 트롬빈은 50 nM의 FVIIaFc에 의해 산출된다. 50 nM의 FVIIaFc에 200 nM FVII-090 (FVII-062 아님, 음성 대조)의 첨가는 트롬빈 산출에서 유의미한 증가를 유발하는데, 이것은 FVI-090이 FVIIaFc에 의해 산출된 트롬빈에 의해 활성화된다는 것을 암시한다. 임의의 FVIIaFc 활성화의 부재에서 FVII-090은 또한, 활성화의 부재에서 FVII-062에 비하여 증가된 트롬빈 산출을 보인다. 이것은 잔여 수준의 조직 인자 또는 접촉 경로 활성화에 의해 산출된 소량의 트롬빈으로부터 FVII-090의 활성화에 의해 유발될 수 있다.
실시예 22. 높은 특이적 활성 인자 VII 활성화가능 구조체
인자 VII의 높은 특이적 활성 이형, FVII-100을 만들기 위하여, FVII-090으로부터 FVII 성숙 서열의 아미노산 311 내지 322 (LQQSRKVGDSPN, 170-루프에 상응)가 트립신의 170-루프로부터 아미노산 EASYPGK로 대체되었다. 이러한 치환은 높은 특이적 활성을 공여하는 것으로 밝혀졌다.
인자 VII의 추가의 높은 특이적 활성 이형, FVII-115가 작제되었다. 이러한 이형에서, 170 루프는 야생형이지만, FVII, V158D, E296V와 M298Q의 중쇄에서 3개의 점 돌연변이가 존재한다. FVII-100과 FVII-115는 도 41에 도시된다.
가용성 조직 인자 검정에서, FVII-011 (야생형 FVIIaFc)의 특이적 활성은 10,000 IU/mg이었다. FVII-090은 0.32 IU/mg의 특이적 활성을 갖고, FVII-100은 0.25 IU/mg의 특이적 활성을 갖고, 그리고 FVII-115는 14 IU/mg의 특이적 활성을 가진다. 따라서 각각의 활성화가능 형태 (적절한 효소에 의한 활성화에 앞서)는 이러한 검정에서 본질적으로 비활성이다.
활성화된 FVII의 배경에서, 이런 높은 특이적 활성 변이체는 더욱 효과적이지만, 또한 단백질, 예를 들면, 항트롬빈에 의한 저해에 더욱 민감한 잠재력을 갖는다. 이러한 저해는 활동성인 FVIIa에 의존한다; 이런 이유로, 활성화가능한 (불활성 단백질로서 투약된) 높은 특이적 활성 변이체는 손상의 부위에서 활성화되면 높은 특이적 활성을 갖는 잠재력을 가지면서 항트롬빈 저해에 더욱 저항한다.
트롬빈에 의한 정제된 FVII-090 및 FVII-100과 115 (높은 특이적 활성 변이체들)의 개열은 앞서 기술된 바와 같이 조사되었다. 획득된 결과는 도 35에 도시된다. SDS PAGE 분석은 이들 3개의 단백질이 어떻게 필적하는 효율로 트롬빈에 의해 개열되는 지를 증명하였다. FVII-100의 경우에, FVII 중쇄-Fc와 경쇄 Fc가 1개의 띠에서 붕괴하는데, 그 이유는 당화 부위가 트립신 170 루프의 삽입후 중쇄로부터 제거되어 FVII HC-Fc 띠의 질량이 감소하고, 따라서 상기 띠가 겔에서 더욱 빠르게 이동하고 FVII LC-Fc 띠와 함께 이동하기 때문이다. 트롬빈 산출 검정은 활성화가능 변이체 FVII-090 및 높은 특이적 활성 변이체 FVII-100의 활성을 측정하는데 이용되었다. 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같이, 트롬빈 산출은 인간 혈소판, 인자 X, 인자 V, 프로트롬빈, 항트롬빈 및 조직-인자 경로 저해제를 이용한 재구성된 시스템에서 조사되었다. 활성은 5 nM 트롬빈 활성화와 함께 또는 이러한 활성화 없이 측정되었다.
도 36에 도시된 바와 같이, FVII-090의 활성은 트롬빈의 존재에서 증강되는데, 이것은 트롬빈에 의한 FVII-090의 활성화를 암시한다. 하지만, 활성은 높은 특이적 활성 변이체 FVII-100의 배경에서 트롬빈 활성화로 유의미하게 증가된다. 트롬빈의 부재에서 FVII-100에 대한 더욱 긴 개시 시간 (initiation time)과 함께 높은 활성은 잔여 수준의 조직 인자, 트롬빈 또는 접촉 경로 활성화가 트롬빈의 외부적 첨가 없이 FVII-100을 활성화시키는데 충분한 트롬빈을 산출할 수 있다는 것을 암시한다. 도 37에서는 유사한 결과가 다른 높은 특이적 활성 변이체, FVII-115에서 획득된다는 것을 보여준다.
실시예 23. 다양한 검정을 이용한 활성화가능 변이체의 활성의 확증
본 실시예에서, FVII 활성을 측정하기 위해 발색체 검정이 이용되었다. 이용된 검정 중에서 한 가지는 FVIIa에 의한 발색성 기질의 개열을 측정함으로써 FVIIaFc의 아미드용해 (amidolytic) 활성을 측정한다. 이들 검정 중에서 다른 것은 활성화된 FX (FXa)에 의해 개열되는 발색성 기질의 수준을 측정함에 의한 결정에서, FX를 활성화시키는 FVIIa의 능력을 측정함으로써 FX 활성화 활성을 측정한다.
아미드용해 검정에서, 발색성 기질 Chromozyme t-PA가 이용되었다. FVIIa는 용량 의존성 방식으로 이러한 기질을 개열한다. 상기 기질은 또한, 트롬빈에 의해 개열되지만, 트롬빈에 의한 개열은 히루딘에 의해 저해될 수 있다 (데이터 제시되지 않음).
도 38에 도시된 바와 같이, 활성화가능 변이체의 아미드용해 활성은 트롬빈 활성화 이후에 측정될 수 있고, 그리고 FVII-090과 비교하여 높은 특이적 활성 변이체에 대한 증가된 아미드용해 활성이 존재한다. 이들 검정에서, 트롬빈에 의한 활성화가능 분자의 활성화 이후, 발색성 기질의 트롬빈 개열을 저해하기 위해 히루딘이 첨가된다. 이러한 방식으로, 트롬빈은 FVIIa 활성을 검출하는 능력을 간섭하지 않는다.
FVIIa에 의한 FX의 활성화 역시 높은 특이적 활성 FVII 활성화가능 변이체에서 증강된다. FVIIa에 의한 FX의 활성화를 측정하기 위해, 기질 S2765이 이용되었다. 이러한 발색성 기질은 또한, FX에 의해 인식된다. 본 검정에서, 10 uM의 FX가 FVIIaFc와 함께 15분 동안 배양되고, 그리고 반응이 EDTA로 진정되었다. 도 39에서는 FVIIaFc에 의한 FX 활성화가 검출될 수 있음을 증명하는 대조 실험의 결과를 도시한다.
도 40에 도시된 실험은 높은 특이적 활성 활성화가능 변이체 FVII-100에서 FX 활성화 활성의 증가가 나타난다는 것을 증명한다. 이러한 실험에서, FVIIFc (100 nM)는 37℃에서 20분 동안 트롬빈 (100 nM)으로 활성화되었다. 트롬빈을 저해하기 위해 히루딘이 첨가되었다. FX (10uM)가 첨가되고, 37℃에서 15분 동안 배양되고, 그 이후에 반응을 저해하기 위해 EDTA가 첨가되었다. S2765 기질이 첨가되고, 그리고 기질 개열을 모니터링함으로써 FXa 산출이 검출되었다.
실시예 24. 단위성 Fc 분자 역시 활성화가능 형태로 합성될 수 있다
3가지 단위성 구조체는 도 41에 도시된 바와 같이 만들어졌다. FVII-118에서, ALRPR 개열 부위가 경쇄와 중쇄 사이에 삽입되었다. FVII-119에서, 서열 GGGGS-ALRPR이 경쇄와 중쇄 사이에 삽입되었다. FVII-127의 경우에, 이 구조체는 FVII-100에서 이용된 동일한 높은 특이적 활성 돌연변이를 제외하고, FVII-118과 유사하게 만들어졌다. 이들 구조체의 비-활성화되고 정제된 형태의 특이적 활성은 가용성 조직 인자 검정에서 조사되고 FVII-011 (10,000 IU/mg의 활성을 갖는 야생형 FVIIaFc)과 비교되었다. FVII-118은 4.5 IU/mg의 활성을 갖고, 그리고 FVII-127은 1.8 IU/mg의 활성을 가졌는데, 이것은 이들 분자가 그들의 활성화가능 형태에서 본질적으로 활성이 없음을 증명하였다.
FVII-118, FVII-119과 FVII-090의 트롬빈 개열 반응, 그 이후에 SDS PAGE 분석이 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다. 도 42에 도시된 바와 같이, 활성화가능 구조체 내에 개열 부위는 단위체와 헤테로이합체 Fc 분자 둘 모두의 배경에서 개열될 수 있다. 상기 도면에서, 증가하는 트롬빈 농도에서 비활성화된 FVIIFc 띠의 강도에서 증가는 FVII-118, FVII-119, 그리고 FVII-090 구조체에서 유사하다.
다른 활성화가능 단위성 구조체, FVII-127이 만들어지고 조사되었다. FVII-127은 높은 특이적 활성을 공여하는 FVII-100에서 이용된 동일한 170 루프 치환을 제외하고, FVII-118의 주쇄를 가졌다. 도 43에 도시된 바와 같이, FVII-127의 활성은 높은 특이적 활성 아미노산 치환이 없는 FVII-118과 비교하여 유의미하게 증가된다. 트롬빈의 부재에서 FVII-127에 대한 더욱 긴 개시 시간과 함께 높은 활성은 잔여 수준의 조직 인자, 트롬빈 또는 접촉 경로 활성화가 트롬빈의 외부적 첨가 없이 FVII-127을 활성화시키는데 충분한 트롬빈을 산출할 수 있다는 것을 암시한다. FVII-127 활성은 트롬빈에 의해 촉진된다.
실시예 25. GPIIbIIIa의 활성 형태에 표적화된 FVIIaFc 변이체
본 실시예에서, 도 44A에 도시된 구조체는 앞서 기술된 바와 같이, 클로닝되고, 일시적으로 발현되고, 정제되고, 활성화되었다. FVII-066은 첫 번째 Fc 모이어티를 혈소판 표적화 모이어티에 연결하는, 단백질 서열에서 기술된 cscFc 링커를 완전하게 가공하기 위해 PC5로 공동-형질감염되었다. 이들 구조체는 GPIIbIIIa의 활성 입체형태 (active conformation)에 대한 scFv, 표적화 모이어티 SCE5를 이용하였다. SCE5는 생쥐와 인간 수용체와 교차반응하는 것으로 밝혀졌다. SCE5 표적화 모이어티가 FVIIaFc의 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단 (FVII-066) 또는 C 말단 (FVII-067)에서 배치되었다. 이에 더하여, SCE5가 FVIIa (FVII-094)의 C-말단에 배치되었다. FVIIaFc (FVII-011) 및 Novoseven이 대조로서 이용되었다. 도 44B에 도시된 바와 같이, 이들 단백질은 앞서 기술된 바와 같이, FVIII-결함성 인간 혈장에서 트롬빈 산출 검정에 의해 조사되었다. 이들 실험은 대조에 비하여, SCE5 표적화 모이어티를 내포하는 모든 단백질에서 트롬빈 산출의 증가된 비율을 노출시켰다. 트롬빈 산출의 최대 비율은 FVII-066, 뒤이어 FVII-094와 FVII-067에서 관찰되었는데, 이것은 SCE5 표적화 모이어티의 배치가 단백질의 활성에 대한 유의미한 효과를 나타낼 수 있다는 것을 암시하였다. 활성화된 인간 혈소판에 이들 단백질의 결합은 앞서 기술된 바와 같이, FACS 검정에 의해 결정되었다 (도 44C). SCE5 표적화 모이어티를 내포하는 모든 FVIIa 단백질은 FVIIaFc 대조에 비하여, 혈소판에 대한 증가된 결합을 보였다. 이것은 FVIIa에 SCE5 표적화 모이어티의 부착이 혈소판으로부터 친화성을 증가시킬 수 있다는 것을 증명한다. SCE5 표적화 모이어티가 생쥐 GPIIbIII수용체와 상호작용하는 것으로 밝혀졌기 때문에, FVII-066이 앞서 기술된 바와 같이, 생쥐 FVIII-결함성 혈소판 풍부한 혈장을 이용한 트롬빈 산출 검정, 그리고 인간 정제된 성분과 혈소판을 이용한 재구성된 시스템에서 조사되었다 (도 29). 양쪽 시스템에서 대조에 비하여 FVII-066에서 트롬빈 산출의 증가된 비율이 관찰되었다.
실시예 26. GPIIbIIIa의 활성 형태에 표적화된 추가의 FVIIaFc 변이체
본 실시예에서, 도 12A에 예시된 구조체 FVII-027은 앞서 기술된 바와 같이, 클로닝되고, 발현되고 (첫 번째 Fc 모이어티를 혈소판 표적화 모이어티에 연결하는, 단백질 서열에서 기술된 cscFc 링커를 완전하게 가공하기 위한 PC5 공동형질감염으로), 정제되고, 활성화되었다. 이러한 구조체는 GPIIbIIIa의 활성 입체형태에 결합하는 것으로 밝혀진 scFv, 표적화 모이어티 MB9를 이용한다. FACS 검정은 활성화된 혈소판에 대한 결합을 평가하기 위해 앞서 기술된 바와 같이 수행되고, 그리고 FVII-027은 FVII-011 대조보다 높은 친화성으로 활성화된 혈소판에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 12B). 트롬빈 산출 검정은 앞서 기술된 바와 같이, 재구성되고 정제된 인간 단백질과 혈소판으로 수행되었다 (도 13A, 13B와 13C). FVII-027은 대조에 비하여 트롬빈 산출의 증가된 비율을 보였다. 도 13D는 FVII-027가 트롬빈 산출 검정에 기초하여, FVII-011 또는 Novoseven보다 4배 많은 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 도 14는 FVII-027의 증강된 혈소판 결합과 트롬빈 산출 활성이 GPIIbIIIa의 활성화된 형태에 결합에 대해 MB9와 경쟁하는 항체, PAC1에 의해 무효화된다는 것을 보여주고, 이것은 이들 효과가 GPIIbIIIa의 활성화된 형태와 MB9의 상호작용에 의해 매개된다는 것을 증명한다. MB9 표적화 모이어티는 또한, 도 15에 예시된 FVII-037을 산출하기 위해 FVIIaFc의 두 번째 Fc 모이어티의 C-말단에 배치되었다. 혈소판을 이용한 FVIII-결함성 재구성된 시스템에서 트롬빈 산출 검정은 Novoseven 대조에 비하여 FVII-037에서 트롬빈 산출의 증가된 비율을 드러냈다 (도 16).
실시예 27. 활성화된 혈소판과 비활성화된 혈소판 둘 모두에 표적화된 인자 VII 구조체
본 실시예에서, 도 45A에서 예시된 구조체는 앞서 기술된 바와 같이, 클로닝되고, 발현되고, 정제되고, 활성화되었다. FVII-088은 첫 번째 Fc 모이어티를 혈소판 표적화 모이어티에 연결하는, 단백질 서열에서 기술된 cscFc 링커를 완전하게 가공하기 위해 PC5로 공동-형질감염되었다. FVII-088과 FVII-125는 인간 GPIIbIIIa의 활성과 비활성 입체형태 둘 모두에 결합하는 scFv, AP3 표적화 모이어티를 이용하였다. 도 45B에서 결과는 FVIII-결함성 혈소판-풍부한 혈장에서 트롬빈 산출 검정을 증명하고, 그리고 FVII-088과 FVII-125 둘 모두 대조에 비하여 트롬빈 산출의 증가된 비율을 보이고, 이것은 GPIIbIIIa의 활성과 비활성 입체형태에 FVIIaFc 또는 FVIIa를 표적화시키는 것이 증가된 활성을 유발한다는 것을 증명하였다. 활성화된 인간 혈소판에 FVII-088과 FVIIaFc의 결합은 FACS에 의해 조사되었다 (도 45C). 이들 데이터는 FVII-088이 FVIIaFc (FVII-011)보다 높은 친화성으로 혈소판에 결합한다는 것을 노출시키고, AP3 표적화 모이어티가 혈소판에 대한 FVIIaFc의 친화성을 증가시킬 수 있다는 것을 증명한다.
회전 혈전탄성묘사법 (rotation thromboelastometry) (ROTEM®, Pentapharm GmbH, Munich, Germany)은 혈소판-표적화된 FVIIa 구조체를 평가하는 다른 방법인데, 그 이유는 이것이 전혈에서 여러 응고 파라미터의 특성화를 가능하게 하기 때문이다 (혈소판의 존재에서). 단단하고 안정된 덩어리를 형성하는 FVII-088과 야생형 재조합 FVIIaFc (rFVIIaFc)의 능력은 제조업체의 권고에 따라 염화칼슘을 활성자 (NATEM)로서 이용한 ROTEM에 의해 평가되었다. 인간 공여자로부터 혈우병 A 혈액은 100, 30 또는 10 nM의 최종 농도로 FVIIFc로 스파이킹 (spiking)되었다. NATEM 반응은 CaCl2의 첨가에 의해 시작되었다. 응고 시간 (응고 시작 시간에 관련됨), 덩어리 형성 시간 (응고의 속도에 관련됨) 및 알파 각도 (alpha angle) (응고의 속도에 관련됨)를 비롯한 응고 파라미터는 도 30에 도시된 바와 같이 평가되었다. FVII-088은 FVII-088에 대한 증강된 응고 동역학과 일관되게, 응고 시간 및 덩어리 형성 시간에서 유의미한 감소, 그리고 야생형 rFVIIaFc에 비하여 알파 각도에서 증가를 보였다. 이들 데이터는 FVII-088이 야생형 FVIIaFc에 비하여 증강된 활성을 갖는다는 것을 증명하고, 이것은 트롬빈 산출 검정 데이터와 일치한다.
실시예 28. 혈소판에 FVIIa 를 표적화시키기 위한 펩티드의 이용
도 46A에 예시된 구조체는 앞서 기술된 바와 같이, 클로닝되고, 발현되고, 정제되고, 활성화되었다. 이들 단백질은 혈소판 수용체 GPIb-알파 (활성화된 혈소판과 비활성화된 혈소판 둘 모두에서 관찰됨)에 결합하는 펩티드, 특히 PS4, OS1, 그리고 OS2를 혈소판 표적화 모이어티로서 이용하여 만들어졌다. 이들 분자를 만들 때, 상기 펩티드는 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 N 또는 C 말단 중에서 어느 한쪽에 부착되었다. FVII-044 구조체는 상기 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 C 말단에 부착된 PS4 펩티드를 이용하였다; FVII-045는 상기 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 C 말단에 부착된 OS1 펩티드를 이용하였다; 그리고 FVII-046 구조체는 상기 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 C 말단에 부착된 OS2 분자를 이용하였다. 대조적으로, FVII-047 구조체는 상기 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 N 말단에 부착된 PS4 펩티드를 이용하였다; FVII-048 분자는 상기 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착된 OS1 펩티드를 이용하였다; 그리고 FVII-049 분자는 상기 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착된 OS2 펩티드를 이용하였다. 트롬빈 산출 검정은 앞서 기술된 바와 같이, FVIII-결함성 혈소판 풍부한 혈장을 이용하여 수행되었다. 도 46B에 도시된 바와 같이, 검정이 제한 농도의 FVIIa로 수행될 때, FVII-044, FVII-045, 그리고 FVII-046 C-말단 융합 구조체 각각은 Novoseven 대조와 비교하여 증강된 트롬빈 산출을 보였다. 유사한 결과는 N-말단 융합 구조체에 대해 도 47A에서 도시된다. 도 47B에서는 FVII-045 구조체가 이러한 검정에서 FVII-048 구조체보다 아주 조금 나을 수도 있지만, 다시 한 번 N과 C 말단 융합 둘 모두 Novoseven 대조보다 낫다는 것을 보여준다. 이에 더하여, 각 펩티드에 대한 공개된 GPIb-알파 친화성 (도 48) 및 FVIIaFc에 재조합 방식으로 융합될 때 상기 펩티드와 연관된 활성에서 증가 사이에 상관관계가 존재한다. 도 48에서는 FACS에 의해 측정된, 활성화된 혈소판에 FVII-049, FVII-048과 야생형 FVIIaFc (FVII-011 대조)의 결합, 그리고 Bernard et al. Biochemistry 2008. 47:4674-4682에서 보고된 표적화 펩티드에 대한 친화성을 보여준다. FACS 데이터는 FVII-011 대조에 비하여 혈소판에 대한 FVII-045와 FVII-048의 증가된 친화성을 노출시켰다.
실시예 29. GPIIbIIIa 의 활성 형태에 표적화된 FVIIIFc 변이체
도 49A에 예시된 구조체는 앞서 기술된 바와 같이 만들어졌다. FVIII-041은 야생형 FVIIIFc인 반면, FVIII-108은 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에서 SCE5 혈소판 표적화 모이어티를 갖는다. 발현을 위하여, FVIII-108은 첫 번째 Fc 모이어티를 혈소판 표적화 모이어티에 연결하는, 단백질 서열에서 기술된 cscFc 링커를 완전하게 가공하기 위해 PC5로 공동-형질감염되었다. 이들 단백질은 앞서 기술된 바와 같이, FVIII 결함성 혈소판 풍부한 혈장을 이용한 트롬빈 산출 검정에서 조사되었지만, 추가적으로 상기 트롬빈 산출 검정은 조직 인자로 또한 활성화되었다. 도 49B에 도시된 바와 같이, FVIIIFc의 표적화된 이형을 이용하여 유의미한 향상은 관찰되지 않았다. 주목할 만한 점은 본 명세서에서 기술된 트롬빈 산출 검정은 혈소판의 표면에서 트롬빈 산출을 측정하고, 이런 이유로 활성의 정확한 적도 (measure)라는 것이다.
실시예 30. Gla 도메인이 없는 혈소판에 표적화된 FVII 의 이형의 제조와 조사
본 실시예에서, 도 21에 도시된 FVIIaFc의 이형이 산출되었다. 이러한 단백질은 N-말단에서 MB9 scFv 및 Gla 도메인을 제거하는 결실을 갖는다. FVII-053은 세포내 활성화를 위해 경쇄와 중쇄 사이에 삽입된 RKRRKR 서열을 내포한다. FVII-053은 앞서 기술된 바와 같이, 일시적으로 발현되고 (상기 단백질의 활성화를 유발하는 RKRRKR 서열의 가공을 위해 PC5로 공동-형질감염) 정제되었다. 정제된 성분과 혈소판으로 트롬빈 산출 검정은 FVII-053이 다소간 활성 (도 22)을 갖는다는 것을 노출시키긴 했지만, 이러한 활성은 FVII-011 대조에 비하여 약화된다 (도 22D). 도 23에서 데이터는 GPIIbIIIa 결합에 대해 MB9와 경쟁하는 PAC1 항체가 FVII-053과 연관된 트롬빈 산출 활성을 어떻게 저해한다는 것을 증명하고, 이것은 혈소판 표적화가 활성을 위해 중요하다는 것을 암시한다. FVII-053과 동일하지만, RKRRKR 삽입이 없는 다른 구조체 (FVII-028)가 산출되고 비활성화된 FVII-011과 함께 비활성화된 형태로 Pk 연구에서 조사되었다. 도 50에 도시된 바와 같이, 표적화된, Gla-없는 FVII-028 분자의 말기 반감기 (20.3시간)는 FVII-011 대조의 말기 반감기 (7.1시간)보다 거의 3배 길었는데, 이것은 Gla 도메인의 제거가 FVIIFc의 말기 반감기를 증가시킨다는 것을 암시하였다.
실시예 31. 혈소판 표적화된 FIX 분자
본 실시예에서, 도 51A에 도시된 FIX 구조체가 만들어지고 조사되었다. FIX-068은 첫 번째 Fc 모이어티를 혈소판 표적화 모이어티에 연결하는, 단백질 서열에서 기술된 cscFc 링커를 완전하게 가공하기 위해 PC5로 공동-형질감염되었다. FIX-068은 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에서 SCE5 혈소판 표적화 모이어티를 갖는 반면, FIX-088은 두 번째 Fc 모이어티의 C-말단에서 SCE5를 갖는다. FIX-090은 Fc 도메인이 없고, 그리고 FIX 단백질의 C-말단에 SCE5 모이어티가 부착된 FIX 구조체이다. FIX-042는 표적화 모이어티가 없는 단일 사슬 Fc로서 FIXFc이고 대조로서 만들어졌다. BeneFIX (Pfizer) 역시 대조로서 이용되었다. 트롬빈 산출 검정에서 오해 결과를 유발하는, BeneFIX 시료로부터 미량의 활성화된 FIX (FIXa)를 제거하기 위해, BeneFIX 시료는 비가역성 활성 부위 저해제 글루타밀-글리실-아르기닐-클로로메틸케톤 (Hematologic Technologies)으로 처리되었다. BeneFIX는 실온에서 180분 동안 과량의 저해제와 함께 배양되었다. 상기 시료는 이후, 결합되지 않은 저해제를 제거하기 위해 투석되었다. 처리된 BeneFIX는 이후, BeneFIX로 지칭된다. 만들어진 분자의 특이적 활성은 FIX-042, 6 IU/nmol; FIX068, 5.1 IU/nmol; FIX-088, 3.5 IU/nmol; FIX-090, 13.8 IU/nmol, 그리고 BeneFIX, 12 IU/nmol이었다. 이들 구조체 (FIX-068, FIX-088과 FIX-042)가 도 51B에 도시된 바와 같이, 혈소판-풍부한 FIX-결함성 혈장에서 트롬빈 산출 검정에 의해 조사될 때, 각각의 표적화된 분자는 FIX-042 대조보다 더욱 높은 활성을 가졌다. 도 51C는 FIX-068과 FIX-088 둘 모두 트롬빈 산출에 의한 측정에서, FIX-042보다 적어도 4배 높은 활성을 갖는다는 것을 보여준다. FIX-042의 특이적 활성이 FIX-068과 FIX-088보다 높기 때문에, 트롬빈 산출 검정에서 관찰된 증가된 활성은 과소평가될 수 있고, 이런 이유로 혈소판 표적화에 의한 증가된 활성은 4-배 이상일지도 모른다.
도 52A에 도시된 바와 같이, FIX-090 (Fc가 없음) 역시 BeneFIX에 비하여 증가된 활성을 보이고, 이것은 Fc의 부재에서 혈소판에 FIX의 표적화 역시 활성을 증가시킨다는 것을 암시한다. 도 52B는 FIX-090의 활성이 BeneFIX의 활성의 적어도 4배라는 것을 보여준다. FIX-090과 BeneFIX 둘 모두 유사한 특이적 활성을 갖기 때문에, 트롬빈 산출 검정에서 활성의 4-배 증가는 혈소판 표적화 효과에 의해 유발된 것임에 틀림없다.
실시예 32. 혈소판에 FIX를 표적화시키기 위한 펩티드의 용도
본 실시예에서, 도 53A에 도시된 FIX-089 구조체는 앞서 기술된 바와 같이, 클로닝되고, 일시적으로 발현되고, 정제되었다. 상기 분자는 OS1 펩티드를 포함하고, 이것은 GPIb-알파 수용체에 결합하고, 상기 구조체의 두 번째 Fc 모이어티의 N-말단에 부착된다. FIX-089 구조체의 특이적 활성은 대조 FIX-042 분자에 대한 6 IU/nmol과 비교하여 2.4 IU/nmol이었다.
도 53B에 도시된 바와 같이, FIX-089 분자는 FIX-혈소판 풍부한 혈장을 이용한 트롬빈 산출 검정에서 FIX-042 대조보다 더욱 활성이다; 이것은 특히, 제한 농도의 FIX에서 분명하다. 도 53C에서는 FIX-089이 트롬빈 산출에 의한 측정에서 FIX-042보다 거의 4-배 강하지만, 더욱 낮은 특이적 활성을 갖는다는 것을 증명한다. 이것은 GPIb에 표적화가 FIXFc의 활성을 증가시킨다는 것을 더욱 암시한다.
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ggtgcataat 1620 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1680 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1740 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1800 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1860 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1920 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc 1980 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 2040 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 2100 aaaggtggcg gcggatcagg tgggggtgga tcaggcggtg gaggttccgg tggcggggga 2160 tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg aggaccgtca 2220 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 2280 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 2340 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 2400 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg 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agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1680 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1740 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1800 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1860 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1920 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc 1980 tacagcaagc tcaccgtcga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 2040 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 2100 aaaggcggtg gcggttcagg tggaggaggg tcaggcggtg gtggatccgg cgggggcgga 2160 tccggtggcg gagggtcagg cggtggcgga tcagcctgca ccgagcggtg ggccctgcac 2220 aacctgtgcg gtggcggtgg ctccggcgga ggtgggtccg gtggcggcgg atcaggtggg 2280 ggtggatcag gcggtggagg ttccggtggc gggggatccg acaaaactca cacatgccca 2340 ccgtgcccag caccggaact cctgggcgga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 2400 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 2460 cacgaagacc 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agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340 cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400 gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460 cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520 catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580 caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640 ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700 agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760 cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820 ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940 ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000 tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060 gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120 tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180 caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240 attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300 tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360 tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480 cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540 tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600 ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660 ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720 cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780 aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840 tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900 atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960 tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020 agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080 aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200 cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260 tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320 cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact 4380 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctgggag gaccgtcagt cttcctcttc 4440 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgcgatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc 4920 ttcttcctct acagcaagct caccgtcgac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 4980 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 5040 tctccgggta aacggcgccg ccggagcggt ggcggcggat caggtggggg tggatcaggc 5100 ggtggaggtt ccggtggcgg gggatccggc ggtggaggtt ccggtggggg tggatcaagg 5160 aagaggagga agagggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagctcc agaactcctg 5220 ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 5280 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 5340 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 5400 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 5460 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 5520 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 5580 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 5640 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 5700 cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 5760 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 5820 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 5859 <210> 159 <211> 1952 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 159 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu 755 760 765 Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln 770 775 780 Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu 785 790 795 800 Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe 805 810 815 Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp 820 825 830 Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln 835 840 845 Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr 850 855 860 Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His 865 870 875 880 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile 885 890 895 Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser 900 905 910 Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 915 920 925 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val 930 935 940 Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp 945 950 955 960 Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 965 970 975 Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990 Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe 995 1000 1005 Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020 Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1025 1030 1035 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr 1040 1045 1050 Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe 1070 1075 1080 Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met 1100 1105 1110 Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly 1115 1120 1125 Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser 1130 1135 1140 Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp 1445 1450 1455 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1460 1465 1470 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 1475 1480 1485 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 1490 1495 1500 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 1505 1510 1515 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 1520 1525 1530 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 1535 1540 1545 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 1550 1555 1560 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 1565 1570 1575 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1580 1585 1590 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 1595 1600 1605 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 1610 1615 1620 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 1625 1630 1635 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 1640 1645 1650 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 1655 1660 1665 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1670 1675 1680 Lys Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1685 1690 1695 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1700 1705 1710 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Asp Lys Thr 1715 1720 1725 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1730 1735 1740 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 1745 1750 1755 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 1760 1765 1770 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 1775 1780 1785 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 1790 1795 1800 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 1805 1810 1815 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 1820 1825 1830 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 1835 1840 1845 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 1850 1855 1860 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 1865 1870 1875 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 1880 1885 1890 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 1895 1900 1905 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 1910 1915 1920 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 1925 1930 1935 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1940 1945 1950

Claims (82)

  1. i) FVII, FIX와 FX로 구성된 군에서 선택되는 응고 인자, ii) 혈소판에 결합하는 표적화 모이어티, 그리고 선택적으로, iii) 응고 인자와 표적화 모이어티 사이에 스페이서 모이어티를 포함하는 키메라 응고 인자.
  2. 청구항 1에 있어서, 화학식 A B C로 표시되는 구조를 포함하고, 여기서 A는 응고 인자이고; B는 스페이서 모이어티이고; 그리고 C는 혈소판에 결합하는 적어도 하나의 표적화 모이어티인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  3. 청구항 2에 있어서, A B C; C B A로 구성된 군에서 선택되는 화학식으로 표시되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 키메라 응고 인자는 적어도 하나의 표적화 모이어티가 없는 적절한 대조와 비교하여, 혈소판의 존재에서 트롬빈의 증가된 생산을 나타내는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  5. 청구항 1에 있어서, 스카폴드 모이어티, 그리고 선택적으로, 두 번째 스페이서 모이어티를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  6. 청구항 5에 있어서, D와 E를 더욱 포함하고, 여기서 D는 스페이서 모이어티이고; 그리고 E는 스카폴드 모이어티이고, 그리고 여기서 키메라 응고 인자는 A B C D E; A D E B C; E D A B C; C B A D E; E D C B A; 그리고 C B E D A로 구성된 군에서 선택되는 화학식으로 표시되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  7. 청구항 6에 있어서, E는 첫 번째 Fc 모이어티, F1 및 두 번째 Fc 모이어티, F2를 포함하는 이합성 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  8. 청구항 7에 있어서, 응고 인자는 2개의 Fc 모이어티 사이에 넣어진 개열가능 scFc (cscFc) 링커를 포함하는 폴리펩티드로서 발현되고, 여기서 cscFc 링커는 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 인접하고, 이것은 cscFc 폴리펩티드 링커의 개열을 유발하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  9. 청구항 8에 있어서, cscFc 링커는 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 인접하고, 이것은 cscFc 링커의 개열을 유발하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  10. 청구항 9에 있어서, 적어도 하나의 효소적 개열 부위는 세포내 가공 부위인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  11. 청구항 9에 있어서, 폴리펩티드 링커는 2개의 효소적 개열 부위에 접하고, 이들은 동일한 또는 상이한 효소에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  12. 청구항 9에 있어서, 폴리펩티드 링커는 약 10 내지 약 50개 아미노산의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  13. 청구항 9에 있어서, 폴리펩티드 링커는 약 20 내지 약 30개 아미노산의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  14. 청구항 9에 있어서, 폴리펩티드 링커는 gly/ser 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  15. 청구항 14에 있어서, gly/ser 펩티드는 화학식 (Gly4Ser)n, 또는 Ser(Gly4Ser)n을 갖고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9와 10으로 구성된 군에서 선택되는 양의 정수인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  16. 청구항 15에 있어서, (Gly4 Ser)n 링커는 (Gly4 Ser)6, Ser(Gly4 Ser)6, (Gly4 Ser)4 및 Ser(Gly4 Ser)4로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  17. 청구항 8에 있어서, 응고 인자는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  18. 청구항 7에 있어서, 키메라 응고 인자는 스페이서 모이어티를 거쳐 F1에 연결된 A 및 F2에 연결된 C; 스페이서 모이어티를 거쳐 F1에 연결된 A 및 스페이서 모이어티를 거쳐 F2에 연결된 C; F1에 연결된 A 및 스페이서 모이어티를 거쳐 F2에 연결된 C; 스페이서 모이어티를 거쳐 F1에 연결된 A 및 스페이서 모이어티를 거쳐 F2에 연결된 C로 구성된 군에서 선택되는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  19. 청구항 18에 있어서, 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 모이어티 A B F1; A B F1; A B F1; 또는 A B F1 D C를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 모이어티 C F2; C D F2; F2 D C; 또는 F2 D C를 포함하고, 여기서 이들 2개의 폴리펩티드 사슬 Fc 영역을 형성하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  20. 청구항 7에 있어서, 표적화 모이어티는 Fc 영역의 폴리펩티드 사슬 중에서 적어도 하나에 융합되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  21. 청구항 7에 있어서, 표적화 모이어티는 F1과 F2 중에서 적어도 하나에 직접적으로 융합되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  22. 청구항 7에 있어서, 표적화 모이어티는 스페이서 모이어티를 거쳐 F1과 F2 중에서 적어도 하나에 융합되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  23. 청구항 7에 있어서, 표적화 모이어티는 개열가능 링커를 거쳐 F1과 F2 중에서 적어도 하나에 융합되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  24. 청구항 1에 있어서, 표적화 모이어티는 항체 분자, 항체 분자의 항원 결합 단편, scFv 분자, 수용체의 수용체 결합 부분, 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  25. 청구항 1, 2, 5 또는 7중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티는 휴지 혈소판에 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  26. 1, 2, 5 또는 7중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티는 활성화된 혈소판에 선별적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  27. 청구항 25에 있어서, 표적화 모이어티는 GPIba, GPVI, 그리고 GPIIb/IIIa의 비활성 형태로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  28. 청구항 26에 있어서, 표적화 모이어티는 GPIIb/IIIa의 활성 형태, P 셀렉틴, GMP-33, LAMP-1, LAMP-2, CD40L, 그리고 LOX-1로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  29. 청구항 25에 있어서, 표적화 모이어티는 GPIb 복합체에 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자
  30. 청구항 25에 있어서, 표적화 모이어티는 PS4, OS1, 그리고 OS2로 구성된 군에서 선택되는 펩티드인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  31. 청구항 25에 있어서, 표적화 모이어티는 SCE5, MB9, 그리고 AP3으로 구성된 군에서 선택되는 항체로부터 항체 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  32. 청구항 1, 2, 5, 또는 7중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 VII인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  33. 청구항 1, 2, 5, 또는 7중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 VII의 높은 특이적 활성 변이체인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  34. 청구항 1, 2, 5, 또는 7중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 IX인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  35. 청구항 1, 2, 5, 또는 7중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 IX의 높은 특이적 활성 변이체인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  36. 청구항 1, 2, 5, 또는 7중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 X인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  37. 청구항 1, 3, 4, 또는 5중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 인자 X의 높은 특이적 활성 변이체인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  38. 청구항 8에 있어서, 응고 인자는 세포에 의해 활성 형태로 분비되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  39. 청구항 1에 있어서, 응고 인자는 생체내에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  40. 청구항 39에 있어서, 키메라 응고 인자는 응고 인자 내에 자연적으로 존재하지 않는 이종성 효소적 개열 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  41. 청구항 40에 있어서, 효소적 개열 부위는 응고 인자의 중쇄 모이어티의 아미노 말단에 유전적으로 융합되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  42. 청구항 5에 있어서, 스카폴드 모이어티는 키메라 응고 인자의 수력학적 반지름을 증가시키는 단백질 분자인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  43. 청구항 42에 있어서, 스카폴드 모이어티는 존재하면, 알부민 및 XTEN®로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  44. FVII를 포함하는 폴리펩티드에 있어서, FVII는 응고 캐스케이드의 성분에 의해 활성화가능한 이종성 효소적 개열 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  45. 청구항 44에 있어서, 폴리펩티드는 스카폴드 모이어티, 그리고 선택적으로, 스페이서 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  46. 청구항 45에 있어서, 스카폴드 모이어티는 첫 번째 Fc 모이어티, F1 및 두 번째 Fc 모이어티, F2를 포함하는 이합성 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  47. 청구항 44에 있어서, 응고 인자는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  48. 청구항 44에 있어서, 키메라 응고 인자는 스페이서 모이어티를 거쳐 첫 번째 Fc 모이어티에 연결된 응고 인자; 스페이서 모이어티를 거쳐 두 번째 Fc 모이어티에 연결된 응고 인자; F1에 직접적으로 연결된 응고 인자; 그리고 F2에 직접적으로 연결된 응고 인자로 구성된 군에서 선택되는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  49. 청구항 47에 있어서, 표적화 모이어티, C를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  50. 청구항 47에 있어서, 키메라 응고 인자는 cscFc 링커를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  51. 청구항 49에 있어서, cscFc 링커는 적어도 하나의 효소적 개열 부위에 인접하고, 이것은 링커의 개열을 유발하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  52. 청구항 50에 있어서, 적어도 하나의 효소적 개열 부위는 세포내 가공 부위인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  53. 청구항 50에 있어서, cscFc 링커는 2개의 효소적 개열 부위에 접하고, 이들은 동일한 또는 상이한 효소에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  54. 청구항 49에 있어서, cscFc 링커는 약 10 내지 약 50개 아미노산의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  55. 청구항 49에 있어서, cscFc 링커는 약 20 내지 약 30개 아미노산의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  56. 청구항 49에 있어서, cscFc 링커는 gly/ser 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  57. 청구항 56에 있어서, gly/ser 펩티드는 화학식 (Gly4Ser)n, 또는 Ser(Gly4Ser)n을 갖고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9와 10으로 구성된 군에서 선택되는 양의 정수인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  58. 청구항 56에 있어서, (Gly4 Ser)n 링커는 (Gly4 Ser)6, Ser(Gly4 Ser)6, (Gly4 Ser)4 및 Ser(Gly4 Ser)4로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  59. 청구항 45에 있어서, 응고 인자는 인자 VII의 높은 특이적 활성 변이체인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  60. 청구항 44에 있어서, 응고 인자 내에 자연적으로 존재하지 않는 이종성 효소적 개열 부위는 덩어리 형성의 부위에서 개열되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  61. 청구항 44에 있어서, 개열 부위는 인자 XIa 개열 부위, 인자 Xa 개열 부위, 그리고 트롬빈 개열 부위로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  62. 청구항 59에 있어서, 효소적 개열 부위는 응고 인자의 중쇄 모이어티의 아미노 말단에 유전적으로 융합되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  63. 청구항 48에 있어서, 표적화 모이어티는 휴지 혈소판에 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  64. 청구항 48에 있어서, 표적화 모이어티는 활성화된 혈소판에 선별적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  65. 청구항 63에 있어서, 표적화 모이어티는 GPIba, GPVI, 그리고 GPIIb/IIIa의 비활성 형태로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  66. 청구항 64에 있어서, 표적화 모이어티는 GPIIb/IIIa의 활성 형태, P 셀렉틴, GMP-33, LAMP-1, LAMP-2, CD40L, 그리고 LOX-1로 구성된 군에서 선택되는 표적에 선별적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  67. 청구항 64에 있어서, 스카폴드 모이어티는 키메라 응고 인자의 수력학적 반지름을 증가시키는 단백질 분자인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  68. 청구항 67에 있어서, 스카폴드 모이어티는 존재하면, 알부민 및 XTEN®로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  69. 청구항 44에 있어서, A B C; C B A; A B C D E; A D E B C, E D A B C, C B A D E, E D C B A, C B E D A로 구성된 군에서 선택되는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지의 모이어티의 선형 서열을 포함하고, 여기서 A는 활성화가능 응고 인자이고, B는 부재하거나, 또는 링커이고, C는 표적화 모이어티이고, D는 부재하거나, 또는 링커이고, 그리고 E는 스카폴드 모이어티인 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  70. 청구항 44에 있어서, 응고 인자는 응고 인자의 경쇄와 중쇄를 포함하고, 그리고 경쇄와 중쇄 각각은 별개의 폴리펩티드 사슬로서 발현되는 것을 특징으로 하는 키메라 응고 인자.
  71. 청구항 1, 2, 5, 7, 44, 45, 45와 58 중에서 어느 한 항의 키메라 응고 인자를 인코딩하는 핵산 분자.
  72. 청구항 71에 있어서, 핵산 분자는 벡터 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  73. 청구항 72의 벡터에 있어서, 벡터는 효소적 개열 부위 중에서 적어도 하나를 개열하는 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  74. 청구항 72의 발현 벡터를 포함하는 호스트 세포.
  75. 청구항 72의 발현 벡터를 포함하는 호스트 세포에 있어서, 호스트 세포는 세포내 가공(intracellular processing)을 수행할 수 있는 효소를 발현하는 것을 특징으로 하는 호스트 세포.
  76. 청구항 75에 있어서, 효소는 세포에 내인성인 것을 특징으로 하는 호스트 세포.
  77. 청구항 75에 있어서, 효소는 세포에 이종성인 것을 특징으로 하는 호스트 세포.
  78. 키메라 응고 인자를 생산하기 위한 방법에 있어서, 배양 동안 청구항 76 또는 77의 호스트 세포를 배양하는 단계, 그리고 배지로부터 키메라 응고 인자를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 가공된 헤테로이합성 폴리펩티드에 있어서, 상기 가공된 헤테로이합성 폴리펩티드는 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서 청구항 78의 벡터를 발현하고, 그리고 배양 배지로부터 성숙 헤테로이합성 폴리펩티드를 분리함에 의해 만들어지는 것을 특징으로 하는 가공된 헤테로이합성 폴리펩티드.
  80. 청구항 1, 2, 5, 7, 44, 45, 48과 58중 어느 한 항에 따른 키메라 응고 인자 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  81. 청구항 71의 핵산 분자 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  82. 개체에서 지혈 (hemostasis)을 개선하기 위한 방법에 있어서, 청구항 80 또는 81의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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