ES2335861T3 - Grupos de proteinas repetitivas que comprenden modulos repetitivos. - Google Patents

Abstract

Grupo de moléculas de ácidos nucleicos codificantes de un grupo de proteínas repetitivas, comprendiendo cada proteína repetitiva un dominio repetitivo, que comprende un conjunto de módulos repetitivos consecutivos y un módulo de caperuza N-terminal y/o C-terminal que presenta una secuencia de aminoácidos diferente de cualquiera de dichos módulos repetitivos, en el que dichos módulos repetitivos presentan el mismo plegamiento y se apilan estrechamente para crear una estructura superhelicoidal que presenta un núcleo hidrofóbico común, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos se deriva de una o más unidades repetitivas de una familia de proteínas repetitivas naturales, en el que dichas unidades repetitivas comprende residuos esqueléticos y residuos de interacción diana, en el que dichas proteínas repetitivas difieren en por lo menos una posición aminoácida de un residuo de interacción diana de los módulos repetitivos, y en el que dicha derivación de cada uno de dichos módulos repetitivos se lleva a cabo mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes: (a) identificar dichas unidades repetitivas, (b) determinar un motivo de secuencia repetitiva mediante análisis estructural y de secuencias de dichas unidades repetitivas, en el que dicho motivo de secuencia repetitiva comprende posiciones de residuo esquelético y posiciones de residuo de interacción diana, que corresponden a las posiciones de los residuos esqueléticos y los residuos de interacción diana en dichas unidades repetitivas, y (c) construir el módulo repetitivo, de manera que comprende el motivo de secuencia repetitiva de (b).

Description

Grupos de proteínas repetitivas que comprenden módulos repetitivos.

La presente invención se refiere a grupos de proteínas repetitivas que comprenden módulos repetitivos que se derivan de una o más unidades repetitivas de una familia de proteínas repetitivas naturales, a grupos de moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas repetitivas, a métodos para la construcción y aplicación de dichos grupos y a miembros individuales de dichos grupos.

Se citan varios documentos en la presente memoria. El contenido de la exposición de estos documentos se incorpora en la presente memoria como referencia.

Las interacciones proteína-proteína, o más generalmente, las interacciones proteína-ligando, desempeñan un papel importante en todos los organismos, y la compresión de las características clave del reconocimiento y la unión es un tema principal de la investigación bioquímica actual. Hasta el momento, los anticuerpos y cualquiera de los derivados que se han preparado se utilizan principalmente en este campo de investigación. Sin embargo, la tecnología de los anticuerpos adolece de desventajas bien conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos difícilmente pueden aplicarse intracelularmente debido al ambiente reductor del citoplasma. De esta manera, existe una necesidad de moléculas ligantes de alta afinidad con características que superen la restricción de los anticuerpos. Este tipo de moléculas muy probablemente proporcionará nuevas soluciones en los campos de la medicina, biotecnología e investigación, en los que los ligantes intracelulares también crecerán en importancia en la genómica.

Se ha informado de diversos esfuerzos para construir nuevas proteínas ligantes (revisados en Nygren y Uhlen, 1997). La estrategia más prometedora aparentemente es una combinación de la generación limitada de una biblioteca y el cribado o selección para las propiedades deseadas. Habitualmente se reclutan andamiajes existentes para aleatorizar algunos residuos aminoácidos expuestos tras el análisis de la estructura cristalina. Sin embargo, a pesar de los avances conseguidos en términos de estabilidad y expresabilidad, las afinidades de las que se ha informado hasta el momento son considerablemente inferiores a las de los anticuerpos (Ku y Schultz, 1995). Una restricción podría ser la limitación a dianas para las que se conoce la estructura cristalina (Kirkham et al., 1999) o que son homólogas a la molécula diana original, de manera que hasta el momento no se ha identificado ningún andamiaje universal para la unión. Para incrementar la afinidad aparente de los ligantes tras el cribado, varios enfoques han utilizado la multimerización de ligantes individuales para aprovechar los efectos de avidez.

La patente WO nº 00/34784 describe proteínas que incluyen un dominio de fibronectina de tipo III que presenta por lo menos un bucle aleatorizado y la utilización de las mismas para desarrollar nuevas especies ligantes de
compuesto.

La patente WO nº 96/06166 propone bibliotecas de secuencia de ADN que codifican motivos ligantes dedos de zinc para la expresión en una partícula que puede utilizarse para diseñar polipéptidos ligantes de dedo de zinc específicos para una secuencia diana particular.

Arndt (J. Mol. Biol. 295:627-639, 2000) informan de la generación de un péptido heterodimérico helicoidal enrollado que se seleccionó de un ensamblaje diseñado de biblioteca-versus-biblioteca derivado de secuencias de cremallera de leucinas.

De esta manera, el problema técnico subyacente a la presente invención es identificar nuevos enfoques para la construcción de grupos de proteínas de unión.

La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. De acuerdo con lo anterior, la presente invención permite construir grupos de proteínas repetitivas que comprenden módulos repetitivos. El enfoque técnico de la presente invención, es decir, derivar dichos módulos a partir de unidades repetitivas de proteínas repetitivas naturales, no ha sido proporcionado ni sugerido por la técnica anterior.

De esta manera, la presente invención se refiere a grupos de moléculas de ácidos nucleicos codificantes de grupos de proteínas repetitivas, comprendiendo cada proteína repetitiva un dominio repetitivo, que comprende un conjunto de módulos repetitivos consecutivos y un módulo de caperuza N-terminal y/o C-terminal que presenta una secuencia de aminoácidos diferente de cualquiera de dichos módulos repetitivos, en la que dichos módulos repetitivos presentan el mismo plegamiento y se apilan estrechamente para crear una estructura superhelicoidal que presenta un núcleo hidrofóbico común, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos se deriva a partir de una o más unidades repetitivas de una familia de proteínas repetitivas naturales, en la que dichas unidades repetitivas comprenden residuos estructurales y residuos de interacción diana, en los que dichas proteínas repetitivas difieren en por lo menos una posición aminoácida de un residuo diana de interacción de los módulos repetitivos, y en los que dicha derivación de cada uno de dichos módulos repetitivos se lleva a cabo mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

(a)

identificar dichas unidades repetitivas,

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(b)

determinar un motivo de secuencia repetitiva mediante análisis estructural y de secuencia de dichas unidades repetitivas, en el que dicho motivo de secuencia repetitiva comprende posiciones de residuo esquelético y posiciones de residuo diana de interacción, que corresponden a las posiciones de los residuos esqueléticos y de los residuos de interacción diana en dichas unidades repetitivas, y

(c)

construir el módulo repetitivo de manera que comprenda el motivo de secuencia repetitiva de (b).

En el contexto de la presente invención, el término "grupo" se refiere a una población que comprende por lo menos dos entidades o miembros diferentes. Preferentemente, este grupo comprende por lo menos 10^{5}, más preferentemente más de 10^{7}, y todavía más preferentemente más de 10^{9} miembros diferentes. También puede hacerse referencia a "grupo" como "biblioteca" o "pluralidad".

La expresión "molécula de ácidos nucleicos" se refiere a una molécula polinucleótida, que es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) o de ácido desoxirribonucleico (ADN), de una cadena o de doble cadena. Una molécula de ácidos nucleicos puede encontrarse presente en forma aislada, o estar comprendida de moléculas o vectores de ácidos nucleicos recombinantes.

La expresión "proteína repetitiva" se refiere a un (poli)péptido/proteína que comprende uno o más dominios repetitivos (fig. 1). Preferentemente, cada una de dichas proteínas repetitivas comprende hasta cuatro dominios repetitivos. Más preferentemente, cada una de dichas proteínas repetitivas comprende hasta dos dominios repetitivos. Sin embargo, más preferentemente, cada una de las proteínas repetitivas comprende un dominio repetitivo. Además, dicha proteína repetitiva puede comprender dominios proteicos no repetitivos adicionales (figs. 2a y 2b), etiquetas (poli)péptido y/o secuencias (poli)peptídicas línker (fig. 1). La expresión "etiqueta (poli)péptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a un (poli)péptido/proteína, en la que dicha secuencia de aminoácidos es utilizable para la purificación, detección o reconocimiento de dicho (poli)péptido/proteína, o en la que dicha secuencia de aminoácidos mejora el comportamiento fisicoquímico de dicho (poli)péptido/proteína, o en el que dicha secuencia de aminoácidos presenta una función efectora. Dichas etiquetas (poli)péptido pueden ser secuencias polipeptídicas pequeñas, por ejemplo His_{n} (Hochuli et al., 1988; Lindner et al., 1992), myc, FLAG (Hopp et al., 1988; Knappik y Pluckthun, 1994) o Strep-tag (Schmidt y Skerra, 1993; Schmidt y Skerra, 1994; Schmidt et al., 1996). Estas etiquetas (poli)péptido son bien conocidas de la técnica y se encuentran totalmente disponibles para el experto en la materia. Otros dominios no repetitivos pueden ser grupos adicionales, tales como enzimas (por ejemplo enzimas como la fosfatasa alcalina), que permiten la detección de dichas proteínas repetitivas, o grupos que pueden utilizarse para el direccionamiento (tales como inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) y/o como moléculas efectoras. Las etiquetas (poli)péptido individuales, grupos y/o dominios de una proteína repetitiva pueden conectarse entre sí directamente o mediante línkers (poli)péptido. La expresión "línker (poli)péptido" se refiere una secuencia de aminoácidos que es capaz de unir, por ejemplo, dos dominios de proteína, una etiqueta (poli)péptido y un dominio proteico, o dos secuencias de etiqueta. Dichos línkers, por ejemplo línkers glicina-serina de longitud variable (por ejemplo Forrer y Jaussi, 1998), son conocidos para el experto en la materia relevante.

En el contexto de la presente invención, el término "(poli)péptido" se refiere a una molécula que consiste de una o más cadenas de múltiples, es decir dos o más, aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos.

El término "proteína" se refiere a un (poli)péptido, en el que por lo menos parte del (poli)péptido ha adquirido, o es capaz de adquirir, una organización tridimensional definida mediante la formación de estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias dentro y/o entre su cadena o cadenas (poli)peptídicas. En el caso de que una proteína comprenda dos o más (poli)péptidos, las cadenas (poli)peptídicas individuales pueden unirse no covalentemente o covalentemente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro entre dos (poli)péptidos. Una parte de una proteína, que individualmente ha adquirido, o es capaz de adquirir, una organización tridimensional definida mediante la formación de estructuras secundarias o terciarias se denomina "dominio proteico". Estos dominios de proteína son bien conocidos para el experto en la materia relevante.

La expresión "familia de proteínas repetitivas naturales" se refiere a un grupo de proteínas repetitivas naturales, en las que los miembros de dicho grupo comprenden unidades repetitivas similares. Las familias de proteínas son bien conocidas para el experto en la materia.

La expresión "dominio repetitivo" se refiere a un dominio proteico que comprende dos o más unidades repetitivas consecutivas (módulos) como unidades estructurales (fig. 1), en las que dichas unidades estructurales presentan el mismo plegamiento y se apilan estrechamente para crear una estructura superhelicoidal que presenta un núcleo hidrofóbico común (para una revisión ver Kobe y Kajava, 2000). La expresión "unidad estructural" se refiere a una parte localmente ordenada de un (poli)péptido, formada por interacciones tridimensionales entre dos o más segmentos de estructura secundaria próximos entre sí a lo largo de la cadena (poli)peptídica. Dicha unidad estructural comprende un motivo estructural. La expresión "motivo estructural" se refiere a una organización tridimensional de elementos de estructura secundaria presentes en por lo menos una unidad estructural. Por ejemplo, el motivo estructural presente repetitivamente en las proteínas LRR consiste de una cadena \beta y un segmento helicoidal antiparalelo opuesto conectado mediante un bucle (fig. 4a). Los motivos estructurales son bien conocidos por el experto en la materia relevante. Dichas unidades estructurales por sí solas no son capaces de adquirir una organización tridimensional definida; sin embargo, su disposición consecutiva en forma de módulos repetitivos en un dominio repetitivo conduce una estabilización mutua de las unidades vecinas, resultando en dicha estructura superhelicoidal.

La expresión "módulos repetitivos" se refiere a las secuencias de aminoácidos repetitivas de las proteína repetitivas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos del grupo de la presente invención, que se derivan de las unidades repetitivas (fig. 3) de proteínas naturales. Cada módulo repetitivo comprendido en un dominio repetitivo se derivad de una o más unidades repetitivas de una familia de proteínas repetitivas naturales.

Dichos "módulos repetitivos" pueden comprender posiciones con residuos aminoácidos presentes en todas las copias del módulo repetitivo ("posiciones fijas") y posiciones con residuos aminoácidos diferentes o "aleatorizados" ("posiciones aleatorizadas").

La expresión "conjunto de módulos repetitivos" se refiere al número total de módulos repetitivos presente en un dominio repetitivo. Este "conjunto de módulos repetitivos" presente en un dominio repetitivo comprende dos o más módulos repetitivos consecutivos, y puede comprender únicamente un tipo de módulo repetitivo en dos o más copias, o dos o más tipos diferentes de módulo, cada uno presente en una o más copias. El grupo de proteínas repetitivas según la presente invención puede comprender dominios repetitivos con un número igual de módulos repetitivos por cada dominio repetitivo correspondiente (es decir, un conjunto con un número fijo de módulos repetitivos) o puede comprender dominios repetitivos que difieren en el número de módulos repetitivos por cada dominio repetitivo correspondiente (es decir, dos o más conjuntos con diferentes números de módulos repetitivos).

Preferentemente, los módulos repetitivos comprendidos en un conjunto son módulos repetitivos homólogos. En el contexto de la presente invención, la expresión "módulos repetitivos homólogos" se refiere a módulos repetitivos, en los que más de 70% de los residuos esqueléticos de dichos módulos repetitivos son homólogos. Más preferentemente, más de 90% de los residuos esqueléticos de dichos módulos repetitivos son homólogos. Los programas informáticos para determinar el porcentaje de homología entre polipéptidos, tales como Fasta, Blasta o Gap, son conocidos para el experto en la materia relevante.

Preferentemente, un módulo repetitivo de la presente invención se deriva de una unidad repetitiva. Esto puede referirse a una situación en la que un grupo de moléculas de ácidos nucleicos, codificando cada molécula un dominio repetitivo de la invención, se obtiene mediante mutagénesis aleatoria de una molécula de ácidos nucleicos codificante de un dominio repetitivo natural. De esta manera, dicho dominio repetitivo de la presente invención comprende un conjunto de módulos repetitivos, en el que cada uno de dichos módulos se deriva de la unidad repetitiva correspondiente de dicho dominio repetitivo natural. Los métodos para la mutagénesis aleatoria de las moléculas de ácidos nucleicos, tales como la PCR propensa a errores (Wilson y Keefe, 2000) o el barajado de ADN (Volkov y Arnold, 2000) son bien conocidos para el experto en la materia relevante. En otra situación, puede utilizarse una única unidad repetitiva natural para derivar un motivo de secuencia repetitiva de la presente invención.

Más preferentemente, un módulo repetitivo de la presente invención se deriva de una o más unidades repetitivas. Esto puede referirse a una situación en la que dos o más moléculas de ácidos nucleicos homólogas, codificando cada una un dominio repetitivo natural, se someten a recombinación del ADN o a quimeragénesis aleatoria (Volkov y Arnold, 2000). De esta manera, dicho dominio repetitivo de la presente invención comprende un conjunto de módulos repetitivos, en el que cada uno de dichos módulos se deriva de una o más unidades repetitivas correspondientes de dichos dominios repetitivos naturales homólogos. Preferentemente, dichas moléculas de ácidos nucleicos homólogos presentan una identidad de secuencias de ASDN de por lo menos 75%. Más preferentemente, dicha identidad de secuencias es de por lo menos 85%.

Más preferentemente, un módulo repetitivo de la presente invención se deriva de dos o más unidades repetitivas, en el que dos o más unidades repetitivas homólogas se utilizan para derivar un motivo de secuencia repetitiva de la presente invención. Las descripciones de dicho procedimiento de derivación se presentan en los ejemplos.

La expresión "módulo repetitivo derivado de una o más unidades repetitivas" se refiere a:

(i) un procedimiento que comprende el análisis de una o más unidades repetitivas de proteínas repetitivas naturales y la deducción de un módulo repetitivo. Este procedimiento puede comprender las etapas siguientes:

(a) identificar unidades repetitivas naturales,

(b) determinar un motivo inicial de secuencia repetitiva mediante alineaciones de secuencias,

(c) refinar el motivo de secuencia repetitiva mediante análisis de secuencias y análisis estructural de dichas unidades repetitivas,

(d) construir un módulo repetitivo de acuerdo con el motivo de secuencia repetitiva de (c), o

(ii) un procedimiento que comprende el procedimiento de (i), seguido de la evolución posterior del módulo repetitivo mediante mutagénesis aleatoria o la quimeragénesis aleatoria.

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La expresión "unidad repetitiva" se refiere a secuencias de aminoácidos que comprenden motivos de secuencia de una o más proteínas naturales, en los que dichas "unidades repetitivas" se encuentran en múltiples copias, y que muestran una topología de plegamiento definida común a la totalidad de dichos motivos, determinando el plegamiento de la proteína. Dichas unidades repetitivas comprenden residuos esqueléticos (fig. 4d) y residuos de interacción (fig. 4e). Entre los ejemplos de dichas unidades repetitivas se incluyen unidades repetitivas ricas en leucinas, unidades repetitivas de anquirina, unidades repetitivas de armadillo, unidades repetitivas tetratricopéptido, unidades repetitivas HEAT y unidades repetitivas de variante rica en leucinas (revisadas en Kobe y Deisenhofer, 1994; Groves y Barford, 1999; Marino et al., 2000; Kobe, 1996). Las proteínas naturales que contienen dos o más de dichas unidades repetitivas se denominan "proteínas repetitivas naturales". Las secuencias de aminoácidos de las unidades repetitivas individuales de una proteína repetitiva pueden presentar un número significativo de mutaciones, sustituciones, adiciones y/o deleciones en la comparación de unas con otras, aunque conservando sustancialmente el patrón general, o motivo, de las unidades repetitivas. Preferentemente, las unidades repetitivas utilizadas para la deducción de un motivo de secuencia repetitiva son unidades repetitivas homólogas, en las que las unidades repetitivas comprenden el mismo motivo estructural y en las que más de 70% de los residuos esqueléticos de dichas unidades repetitivas son homólogos. Preferentemente más de 80% de los residuos esqueléticos de dichas unidades repetitivas son homólogos. Más preferentemente, más de 90% de los residuos esqueléticos de dichas unidades repetitivas son homólogos.

La expresión "motivo de secuencia repetitiva" se refiere a una secuencia de aminoácidos que se deduce a partir de una o más unidades repetitivas. Dichos motivos de secuencia repetitiva comprende posiciones de residuo esquelético y posiciones de residuo diana de interacción. Dichas posiciones de residuo esquelético corresponden a las posiciones de residuos esqueléticos de dichas unidades repetitivas. Dichas posiciones de residuo diana de interacción corresponden a las posiciones de los residuos de interacción diana de dichas unidades repetitivas. Dichos motivos de secuencia repetitiva comprenden posiciones fijas y posiciones aleatorizadas. La expresión "posición fija" se refiere a una posición aminoácida en un motivo de secuencia repetitiva, en la que dicha posición se fija en un aminoácido particular. Más frecuentemente, dichas posiciones fijas corresponden a las posiciones de los residuos esqueléticos. La expresión "posición aleatorizada" se refiere a una posición aminoácida en un motivo de secuencia repetitiva, en el que se permiten dos o más aminoácidos en dicha posición aminoácida. Más preferentemente, dichas posiciones aleatorizadas corresponden a las posiciones de residuos de interacción diana. Sin embargo, algunas posiciones de residuos esqueléticos también pueden aleatorizarse. Los motivos de secuencias de aminoácidos son bien conocidos para el experto en la materia relevante.

La expresión "topología de plegamiento" se refiere a la estructura terciaria de dichas unidades repetitivas. La topología de plegamiento estará determinada por tramos de aminoácidos que forman por lo menos partes de hélices \alpha o de láminas \beta, o tramos de aminoácidos que forman polipéptidos lineales o bucles, o cualquier combinación de hélices \alpha, láminas \beta y/o polipéptidos lineales/bucles. El término "consecutivo" se refiere a una configuración en la que dichos módulos se disponen en tándem.

En las proteínas repetitivas, hay por lo menos 2, habitualmente entre aproximadamente 2 y 6, más habitualmente por lo menos aproximadamente 6, frecuentemente 20 ó más, unidades repetitivas. Mayoritariamente las proteínas repetitivas son proteínas estructurales y/o proteínas adhesivas, encontrándose presentes en procariotas y en eucariotas, incluyendo vertebrados y no vertebrados. Se ha sugerido una analogía entre las proteínas anquirina y los anticuerpos (Jacobs y Harrison, 1998).

En la mayoría de casos, dichas unidades repetitivas mostrarán un grado elevado de identidad de secuencia (residuos aminoácidos iguales en posiciones correspondientes) o de similitud de secuencias (los residuos aminoácidos son diferentes pero presentan propiedades fisicoquímicas similares) y algunos residuos aminoácidos podrían ser residuos clave, encontrándose fuertemente conservados en las diferentes unidades repetitivas que se encuentran en las proteínas naturales.

Sin embargo, un grado elevado de variabilidad de las secuencias debida a inserciones y/o deleciones de aminoácidos, y/o a sustituciones entre las diferentes unidades repetitivas presentes en las proteínas naturales resultará posible con la condición de que se mantenga una topología de plegamiento común.

Los métodos para determinar directamente la topología de plegamiento de las proteínas repetitivas mediante medios fisicoquímicos tales como la cristalografía de rayos X, la RMN o la espectroscopía CD, son bien conocidos para el experto en la materia relevante. Los métodos para identificar y determinar las unidades repetitivas o los motivos de secuencias repetitivas, o para identificar familias de proteínas relacionadas que comprenden dichas unidades o motivos repetitivos, tales como búsquedas de homologías (BLAST, etc.), se encuentran bien establecidos en el campo de la bioinformática, y son bien conocidos para el experto en esta materia. La etapa de refinamiento del motivo inicial de secuencias repetitivas puede comprende un procedimiento iterativo.

Se ha informado de estructuras cristalinas para las repeticiones de tipo anquirina (Bork, 1993; Huxford et al., 1998, ver las figs. 2g y 2h), el inhibidor de ribonucleasa (IR) de la superfamilia de repeticiones ricas en leucinas (LRR) (Kobe y Deisenhofer, 1993; ver la fig. 2c) y otras proteínas LRR (ver las figs. 2d a 2f). La inspección de estas estructuras ha revelado una forma alargada en el caso de las repeticiones anquirina, o una forma de herradura en el caso de las repeticiones ricas en leucinas, dando lugar a una superficie extraordinariamente grande.

La expresión "residuos esqueléticos" se refiere a residuos aminoácidos de las unidades repetitivas, o a los residuos aminoácidos correspondientes de los módulos repetitivos, que contribuyen a la topología de plegamiento, es decir, que contribuyen al plegamiento de dicha unidad (o módulo) repetitiva, oque contribuyen a la interacción con una unidad (o módulo) vecina. Dicha contribución puede ser la interacción con otros residuos en la unidad (módulo)repetitiva (4d), o la influencia de la conformación del esqueleto polipeptídico según se encuentra en las hélices \alpha o en las láminas \beta, o tramos de aminoácidos que forman polipéptidos lineales o bucles. La expresión "residuos de interacción diana" se refiere a residuos aminoácidos de las unidades repetitivas, o los residuos aminoácidos correspondientes de los módulos repetitivos, que contribuyen a la interacción con sustancias diana. Dicha contribución puede ser la interacción directa con las sustancias diana (fig. 4e), o la influencia sobre otros residuos que interaccionan directamente, por ejemplo mediante el establecimiento de la conformación del (poli)péptido de dicha unidad (módulo) repetitiva para permitir o intensificar la interacción de dichos residuos que interaccionan directamente con dicha diana. Estos residuos esqueléticos o diana de interacción pueden identificarse mediante análisis de los datos estructurales obtenidos mediante los métodos fisicoquímicos indicados anteriormente, o mediante la comparación con información estructural conocida y relacionada bien conocida para el experto en biología estructural y/o bioinformática.

La expresión "interacción con dichas sustancias diana" puede ser, sin limitarse a ellos, la unión a una diana, la implicación en un cambio conformación o una reacción química de dicha diana, o la activación de dicha diana.

Una "diana" puede ser una molécula individual, tal como una molécula de ácidos nucleicos, una proteína (poli)péptido, un carbohidrato, o cualquier otra molécula natural, incluyendo cualquier parte de dicha molécula individual, o complejos de dos o más de dichas moléculas. La diana puede ser una célula completa o una muestra de tejido, o puede ser cualquier molécula o grupo no natural.

La expresión "difiere en por lo menos una posición" se refiere a un grupo de proteínas repetitivas, las cuales presentan por lo menos una posición en la que puede encontrarse más de un aminoácido. Preferentemente dichas posiciones se encuentran aleatorizadas. El término "aleatorizado" se refiere a las posiciones de los módulos repetitivos, que son variables dentro de un grupo y que se encuentran ocupados por más de un residuo aminoácido en el grupo. Preferentemente, las posiciones aleatorizadas varían adicionalmente entre módulos repetitivos dentro de un dominio repetitivo. Preferentemente, dichas posiciones pueden aleatorizarse completamente, es decir, pueden ser ocupadas por el conjunto completo de residuos aminoácidos proteinogénicos naturales. Más preferentemente, dichas posiciones pueden aleatorizarse parcialmente, es decir, pueden ser ocupadas por un subconjunto del conjunto completo de residuos aminoácidos naturales. Los subconjuntos de residuos aminoácidos pueden ser conjuntos de residuos aminoácidos con propiedades fisicoquímicas comunes, tales como conjuntos de aminoácidos hidrofóbicos, hidrofílicos, ácidos, básicos, aromáticos o alifáticos, subconjuntos que comprenden la totalidad excepto determinados residuos aminoácidos no deseados, tales como conjuntos que no comprenden cisteínas o prolinas, o subconjuntos que comprenden todos los residuos aminoácidos presentes en la posición correspondiente en las proteínas repetitivas naturales. La aleatorización puede aplicarse en algunos, preferentemente en la totalidad, de los residuos diana de interacción. Los métodos para preparar proteínas repetitivas "aleatorizadas", tales como mediante la utilización de mutagénesis dirigida por oligonucleótido de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas repetitivas (por ejemplo mediante la utilización de mezclas mononucleótidos o trinucleótidos (Vimekäs et al., 1994)) o mediante la utilización de PCR propensa a errores durante la síntesis de dichas secuencias de ácidos nucleicos, es bien conocida para el experto en la
materia.

En una realización preferente, cada uno de dichos módulos repetitivos presenta una secuencia de aminoácidos, en la que por lo menos 70% de los residuos aminoácidos corresponden a:

(i) residuos aminoácidos de consenso deducidos de los residuos aminoácidos que se encuentran en las posiciones correspondiente de por lo menos dos unidades repetitivas naturales, o

(ii) los residuos aminoácidos que se encuentran en las posiciones correspondientes en una unidad repetitiva natural.

Un "residuo aminoácido de consenso" puede encontrarse mediante la alineación de dos o más unidades repetitivas basándose en la homología estructural y/o de secuencias determinada tal como se ha indicado anteriormente, y mediante la identificación del residuo aminoácido más frecuente para cada posición en dichas unidades (se muestra un ejemplo en las figs. 5a y 5b). Dichas dos o más unidades repetitivas pueden obtenerse de las unidades repetitivas comprendidas en una única proteína repetitiva, o de dos o más proteínas repetitivas. En el caso de que se encuentren dos o más residuos aminoácidos con una probabilidad similar en dichas dos o más unidades repetitivas, el aminoácido de consenso puede ser uno de los aminoácidos más frecuentes o una combinación de dichos dos o más residuos aminoácidos.

Resulta más preferente un grupo en el que dicho conjunto consiste de entre dos y aproximadamente 30 módulos repetitivos. Más preferentemente, dicho conjunto consiste de entre 6 y aproximadamente 15 módulos repetitivos.

En una realización todavía más preferente de la presente invención, dichos módulos repetitivos se encuentran directamente conectados.

En el contexto de la presente invención, la expresión "directamente conectado" se refiere a módulos repetitivos, que se disponen en forma de repeticiones directas en una proteína repetitiva sin una secuencia de aminoácidos intermedia.

En una realización preferente adicional, dichos módulos repetitivos se encuentran conectados mediante un línker (poli)peptídico. De esta manera, los módulos repetitivos pueden unirse indirectamente mediante un línker (poli)péptido como secuencia intermedia que separe los módulos individuales. Una "secuencia intermedia" puede ser cualquier secuencia de aminoácidos, que permite conectar los módulos individuales sin interferir con la topología de plegamiento o el apilamiento de los módulos. Preferentemente, dichas secuencias intermedias son línkers (poli)péptidos cortos de menos de 10, y todavía más preferentemente de menos de 5 residuos aminoácidos.

En un grupo de la presente invención, cada una de dichas proteínas repetitivas comprende además un módulo de caperuza N-terminal y/o C-terminal (fig. 1) que presenta una secuencia de aminoácidos diferente de cualquiera de dichos módulos repetitivos.

La expresión "módulo de caperuza" se refiere a un polipéptido fusionado con el módulo repetitivo N-terminal o C-terminal de un dominio repetitivo, en el que dicho módulo de caperuza forma interacciones terciarias fuertes con dicho módulo repetitivo, proporcionando de esta manera una caperuza que protege el núcleo hidrofóbico de dicho módulo repetitivo en el lado que no se encuentra en contacto con el módulo repetitivo consecutivo frente al solvente (fig. 1).

Dicho módulo de caperuza N-terminal y/o C-terminal puede ser, o puede derivarse a partir de una unidad de caperuza (fig. 3) u otro dominio que se encuentre en una proteína repetitiva natural contigua a una unidad repetitiva. La expresión "unidad de caperuza" se refiere a un (poli)péptido plegado natural, en el que dicho (poli)péptido define una unidad estructural particular que se encuentra fusionada N-terminalmente o C-terminalmente a una unidad repetitiva, en la que dicho (poli)péptido forma interacciones terciarias fuertes con dicha unidad repetitiva, proporcionando de esta manera una caperuza que protege al núcleo hidrofóbico de dicha unidad repetitiva en un lado frente al solvente. Dichas unidades de caperuza pueden presentar similitudes de secuencia con dicho motivo de secuencia repetitivo.

En una realización preferente, la presente invención se refiere a un grupo de moléculas de ácidos nucleicos, en el que dichas unidades repetitivas son unidades repetitivas de anquirina.

Las características de las proteínas repetitivas anquirina han sido revisadas (Sedgwick y Smerdon, 1999) y se ha investigado una unidad de plegamiento mínima (Zhang y Peng, 2000). Las proteínas repetitivas anquirina han sido estudiadas en cierto detalle, y los datos pueden utilizarse para ejemplificar la construcción de proteínas repetitivas según la presente invención.

Las proteínas repetitivas anquirina se identificaron en 1987 mediante comparaciones de secuencias entre cuatro de dichas proteínas en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans. Breeden y Nasmyth informaron de múltiples copias de una unidad repetitiva de aproximadamente 33 residuos en las secuencias de swi6p, cdc10p, notch y lin-12 (Breeden y Nasmyth, 1987). El descubrimiento posterior de 24 copias de esta unidad repetitiva en la proteína anquirina condujo a la denominación de esta unidad repetitiva como "repetición anquirina" (Lux et al., 1990). Posteriormente, esta unidad repetitiva ha sido identificada en varios cientos de proteínas de diferentes organismos y virus (Bork, 1993; base de datos SMART, Schultz et al., 2000). Estas proteínas se encuentran localizadas en el núcleo, en el citoplasma o en el espacio extracelular. Lo anterior es consistente con el hecho de que el dominio repetitivo anquirina de estas proteínas es independiente de los puentes disulfuro y, de esta manera, es independiente del estado de oxidación del ambiente. El número de unidades repetitivas por proteína varía entre dos y más de veinte (base de datos SMART, Schultz et al., 2000). Aparentemente resulta necesario un número mínimo de unidades repetitivas para formar un dominio plegado establemente (Zhang y Peng, 2000). Por otra parte, también existen algunos datos que indican que existe un límite superior de seis unidades repetitivas por dominio plegado (Michaely y Bennet, 1993).

Todas las estructuras terciarias de las unidades repetitivas anquirina determinadas hasta el momento comparten un plegamiento característico (Sedgwick y Smerdon, 1999), compuesto de una horquilla \beta seguida de dos hélices \alpha antiparalelas y que finaliza en un bucle que conecta la unidad repetitiva con la siguiente (fig. 4c). Los dominios construidos de unidades repetitivas anquirina están formados mediante el apilamiento de las unidades repetitivas, formando una estructura extendida y curvada. Esto queda ilustrado por la estructura de la subunidad beta 1 de la proteína de ratón ligante de GA en la fig. 2h. La proteínas que contienen dominios repetitivos anquirina con frecuencia contienen dominios adicionales (base de datos SMART, Schultz et al., 2000). Aunque estos últimos dominios presentan funciones variables, la función del dominio repetitivo anquirina con frecuencia es la unión con otras proteínas, tal como muestran varios ejemplos (Batchelor et al., 1998; Gorina y Pavletich, 1996; Huxford et al., 1999; Jacobs y Harrisson, 1999, Jeffrey et al., 2000). Durante el análisis de estas proteínas, los residuos de interacción diana se encontraban principalmente en la horquilla \beta y en la parte expuesta de la primera hélice \alpha (fig. 4c). Estos residuos de interacción diana, por lo tanto, forman una gran superficie de contacto sobre el dominio repetitivo anquirina. Esta superficie de contacto se encuentra expuesta en un esqueleto formado por unidades apiladas de \alpha-hélice 1, \alpha-hélice 2 y el bucle (fig. 4c). Para una proteína repetitiva anquirina consistente de cinco unidades repetitivas, esta superficie de interacción en contacto con otras proteínas es de aproximadamente 1.200 \ring{A}^{2}. Esta gran superficie de interacción resulta ventajosa para conseguir afinidades elevadas para las moléculas diana. La afinidad de IkBa (que contiene un dominio de seis unidades repetitivas anquirina) para el heterodímero NF-kB, por ejemplo, es de K_{D}=3 nM (Malek et al., 1998), mientras que la constante de disociación de la proteína beta 1 humana ligante de GA con su unidad alfa es de K_{D}=0,78 nM (Suzuki et al., 1998). Una ventaja de la utilización de las proteínas repetitivas anquirina según la presente invención respecto a anticuerpos ampliamente utilizados es su potencial de expresarse de manera recombinante en grandes cantidades en forma de moléculas solubles, monoméricas y estables (Ejemplo 2).

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También resulta preferente un grupo en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende la secuencia repetitiva de consenso de anquirina:

DxxGxTPLHLAaxx\pm\pm\pm\pm\pm\pm\pm\pm\pm\pmGpxpaVpxLLpxGA\pm\pm\pm\pm\pmDVNAx,

en la que "x" se refiere a cualquier aminoácido, "\pm" se refiere a cualquier aminoácido o a una deleción, "a" se refiere a un aminoácido con una cadena lateral apolar, y "p" se refiere a un residuo con una cadena lateral polar. Resulta más preferente un grupo en el que una o más posiciones denominadas "x" se han aleatorizado.

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Resulta particularmente preferente un grupo en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende la secuencia repetitiva de consenso de anquirina:

DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx,

en la que "x" se refiere a cualquier aminoácido.

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Resulta todavía más preferente un grupo diverso en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende el motivo de secuencia repetitiva de anquirina:

DxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNAx,

en la que "x" se refiere a cualquier aminoácido.

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Resulta todavía más preferente un grupo diverso en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende el motivo de secuencia repetitiva de anquirina:

D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1,

en la que 1 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y,

en el que 2 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo: H, N e Y.

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En una realización preferente adicional, la presente invención se refiere a un grupo de moléculas de ácidos nucleicos, en el que dichas unidades repetitivas son repeticiones ricas en leucinas (LRR).

Las características y propiedades de la repetición LRR han sido revisadas (Kobe y Deisenhofer, 1994). Las proteínas LRR han sido estudiadas en cierto detalle, y los datos pueden utilizarse para ejemplificar el comportamiento de las proteínas repetitivas.

Las proteínas LRR han sido identificadas a partir de su consenso altamente conservado de residuos de leucina u otros residuos hidrofóbicos en las posiciones 2, 5, 7 y 12 (fig. 4b). Sin embargo, la significación de este patrón de distribución de aminoácidos sólo se comprendió al resolver la primera estructura de una LRR, la proteína inhibidora de ribonucleasa (fig. 2c). Recientemente, se han resuelto estructuras cristalinas de LRR adicionales (figs. 2d a 2f). Se muestra una estructura de una proteína de dominio repetitivo anquirina típica a título comparativo (fig. 2g). Se ha postulado una única LRR para corresponder en todo momento con una cadena \beta y una hélice \alpha antiparalela (un plegamiento \alpha/\beta único, fig. 4a) circundante a un núcleo de leucina o de otros residuos alifáticos únicamente (Kajava, 1998). La forma global del inhibidor de ribonucleasa (RI), una proteína LRR, podría describirse como una herradura (fig. 2c) formada de 15 repeticiones homólogas en tándem de LRR de tipo A (29 aminoácidos) y de tipo B (28 aminoácidos) estrictamente alternantes. La naturaleza alternante de la proteína ya fue reconocida al analizar la secuencia (fig. 5a, Lee et al., 1988).

Resulta interesante que las RI de mamífero se caracterizan por su afinidad extremada para sus proteínas diana. Para la unión de la ARNasa A a RI humana se ha informado de una K_{i}=5,9x10^{-14} M (Kobe y Deisenhofer, 1996), mientras que se ha observado que la angiogenina resulta inhibida con K_{i}=7,1x10^{-16} M por el RI de cerdo (Lee et al., 1989), convirtiéndose de esta manera en la interacción más fuerte conocida entre proteínas. Incluso los anticuerpos de unión más fuerte presentan afinidades de sólo 1,5x10^{-11} M (Yang et al., 1995). Para comprender mejor dicha extraordinaria afinidad, los dos RI se cocristalizaron con sus proteínas diana. El análisis posterior de las estructuras cristalinas mostró que las interacciones eran principalmente electrostáticas (Kobe y Deisenhofer, 1996) y que los aminoácidos implicados se encontraban predominantemente en la lámina \beta interna y en el bucle que conectaba cada unidad su hélice \alpha (fig. 4b, Kobe y Deisenhofer, 1995). Además, la anchura del pliegue similar a una herradura puede modificarse ligeramente para ajustarse a la proteína diana (Kobe y Deisenhofer, 1994). La interfaz entre diana e inhibidor consiste de una "red" de interacciones y la asociación fuerte se origina en el gran área superficial enterrada (aproximadamente 2.550 \ring{A}^{2}) cuando la proteína diana se encuentra unida en el interior de la herradura, y no por la complementariedad de formas (Kobe y Deisenhofer, 1996). En la comparación entre la unión detallada de la ARNasa A y la angiogenina (dos moléculas con una identidad de secuencia de sólo 30%) al RI, se pusieron de manifiesto diferencias significativas (Chen y Shapiro, 1997). Mientras que en gran parte se encontraban implicados los mismos residuos en el lado del RI, los residuos de la proteína diana no eran homólogos o utilizaban diferentes tipos de enlace (Papageorgiou et al., 1997). En otras palabras, RI ha evolucionado de una manera que permite que se una e inhiba diferentes moléculas diana basándose en un gran número de contactos presentados en la orientación geométrica correcta, y no en la complementariedad óptima de los residuos. Lo anterior es la base para un diseño de nuevas moléculas de unión que presentarán nuevas especificidades de unión. Aparentemente, la forma está predestinada para el reconocimiento de grandes superficies, permitiendo de esta manera que una diversidad mucho mayor de aminoácidos aleatorios genere una biblioteca, en comparación con los dominios "variables" relativamente pequeños de los anticuerpos. Sin embargo, los bucles de los anticuerpos aparentemente son superiores en el caso de que deban reconocerse haptenos pequeños o ranuras profundas. Además, no sólo pueden modificarse las repeticiones mismas, sino también su número, dependiendo de las moléculas diana.

Resulta adicionalmente preferente un grupo en el que cada uno de dichos módulos comprende la secuencia de consenso de LRR:

xLxxLxLxxN\pmxaxx\pma\pm\pm\pm\pma\pm\pma\pm\pmx\pm\pm,

en la que "x" se refiere a cualquier aminoácido, "a" se refiere a un aminoácido alifático y "\pm" se refiere a cualquier aminoácido o a una deleción. La expresión "aminoácido alifático" se refiere a un aminoácido obtenido de entre la lista siguiente: Ala, Gly, Ile, Leu y Val.

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Resulta particularmente preferente un grupo en el que por lo menos uno de dichos módulos comprende la secuencia de consenso de LRR:

xLExLxLxxCxLTxxxCxxLxxaLxxxx,

en la que "x" se refiere a cualquier aminoácido y "a" se refiere a un aminoácido alifático (LRR de tipo A).

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Además, resulta particularmente preferente un grupo en el que por lo menos uno de dichos módulos comprende la secuencia de consenso de LRR:

xLxELxLxxNxLGDxGaxxLxxxLxxPxx,

en la que "x" se refiere a cualquier aminoácido y "a" se refiere a un aminoácido alifático (LRR de tipo B).

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Resulta más preferente un grupo en el que una o más de las posiciones indicadas como "x" y/o "\pm" se han aleatorizado.

Resulta adicionalmente preferente un grupo en el que el residuo cisteína en la posición 10 en la secuencia de consenso de la LRR de tipo A se sustituye por un residuo aminoácido hidrofílico, y en el que el residuo cisteína en la posición 17 se sustituye por un residuo aminoácido hidrofóbico.

Puede obtenerse un residuo aminoácido hidrofílico de entre la lista siguiente: Ser, Thr, Tyr, Gln y Asn.

Puede obtenerse un residuo aminoácido hidrofóbico de entre la lista siguiente: Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp y Val.

En comparación con el Fv monocatenario o los anticuerpos convencionales, pueden mencionarse varias ventajas, mientras que los puentes disulfuro resultan cruciales para la estabilidad de la mayoría de anticuerpos (Proba et al., 1997), en las proteínas LRR no resultan necesarios los puentes disulfuro, lo que permite las aplicaciones intracelulares.

Por lo tanto, pueden generarse nuevas moléculas ligantes par ala aplicación en un ambiente reductor. Esto podría convertirse en una herramienta enormemente potente para aclarar la función de las numerosas proteínas identificadas por los proyectos de secuenciación genómica mediante la inhibición directa en el citosol. En muchas aplicaciones biotecnológicas resultan necesarias grandes cantidades de proteínas expresadas y correctamente plegadas, una producción en E. coli resulta preferible pero muy difícil para anticuerpos que han evolucionado en el ambiente extracelular oxidante. En contraste, el plegamiento o replegamiento de las variantes de RI resulta más eficiente, debido a que se encuentran naturalmente en el citosol (ver el Ejemplo 1).

En una realización preferente adicional de un grupo según la presente invención, se intercambia uno o más de los residuos aminoácidos en una anquirina o módulo repetitivo LRR tal como se ha descrito anteriormente, por un residuo aminoácido presente en la posición correspondiente en una unidad repetitiva natural correspondiente.

Preferentemente, se intercambian hasta 30% de los residuos aminoácidos, más preferentemente hasta 20%, y todavía más preferentemente hasta 10% de los residuos aminoácidos.

Resulta particularmente preferente un grupo en el que dicho conjunto consiste de un tipo de módulos repetitivos. La expresión "tipo de módulo repetitivo" se refiere a las características de un módulo determinadas por la longitud del módulo, el número y composición de sus "posiciones fijas", así como por sus "posiciones aleatorizadas". "Diferentes tipos de módulos" pueden diferir en una o más de dichas características.

Resulta adicionalmente preferente un grupo en el que dicho conjunto consiste de dos tipos diferentes de módulos repetitivos.

En una todavía otra realización preferente, la presente invención se refiere a un grupo en el que dicho conjunto comprende dos tipos diferentes de módulos repetitivos consecutivos como parejas en dichas proteínas repetitivas.

Resulta más preferente un grupo en el que dichos dos tipos diferentes de módulos se basan en dichas LRR de tipo A y de tipo B.

Resulta adicionalmente preferente un grupo en el que las secuencias de aminoácidos de los módulos repetitivos comprendidos en dicho conjunto son idénticos para cada uno de dichos tipos excepto para los residuos aleatorizados.

Resulta todavía adicionalmente un grupo en el que las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las copias de cada uno de dichos tipos son idénticas excepto para los codones codificantes de residuos aminoácidos en posiciones que se aleatorizan.

Resulta particularmente preferente un grupo en el que las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas repetitivas comprenden secuencias de ácidos nucleicos idénticas de por lo menos 9 nucleótidos entre dichos módulos repetitivos.

Dichas secuencias de ácidos nucleicos idénticas de por lo menos 9 nucleótidos pueden ser parte del extremo de únicamente un módulo repetitivo, o puede estar formados por los extremos de dos módulos repetitivos contiguos, o puede ser parte de un línker (poli)peptídico que conecta dos módulos repetitivos.

En un grupo preferente adicional según la presente invención, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas repetitivas comprenden secuencias de ácidos nucleicos idénticas de por lo menos 9 nucleótidos entre dichas parejas.

Dichas "secuencias de ácidos nucleicos idénticas de por lo menos 9 nucleótidos" pueden ser parte del extremo de únicamente una pareja de módulos repetitivos, o pueden estar formadas por los extremos de dos parejas contiguas de módulos repetitivos, o pueden ser parte de un línker (poli)peptídico que conecta dos parejas de módulos repetitivos.

Resulta más preferente un grupo en el que cada una de las secuencias de ácidos nucleicos entre dichos módulos, o dichas parejas, comprende una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción. La expresión "secuencia de reconocimiento de enzima de restricción" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que resulta reconocida y cortada por una endonucleasa de restricción. Dicha secuencia de reconocimiento de enzima de restricción puede dividirse simétricamente entre los extremos 3' y 5' (por ejemplo 3 nucleótidos de una secuencia de reconocimiento de 6 pares de bases en ambos extremos) o no simétricamente (por ejemplo 2 nucleótidos en un extremo, 4 en el extremo correspondiente).

Resulta particularmente preferente un grupo en el que cada una de las secuencias de ácidos nucleicos entre dichos módulos, o dichas parejas, comprende una secuencia de ácidos nucleicos formadas a partir de extremos cohesivos creados por dos enzimas de restricción compatibles. La expresión "enzimas de restricción compatibles" se refiere a enzimas de restricción que presentan diferentes secuencias de reconocimiento pero que forman extremos cohesivos compatibles al cortar ADN bicatenario. Tras la religación de fragmentos de ADN bicatenario de extremos cohesivos producidos con dos enzimas de restricción compatibles, el producto ADN ya no muestra las secuencias de reconocimiento de ambos enzimas de restricción.

En una realización más preferente adicional del grupo de la presente invención, dichas secuencias de ácidos nucleicos idénticas permiten un ensamblaje basado en PCR de las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas repetitivas.

En una realización más preferente del grupo según la presente invención, dichas proteínas repetitivas comprenden una o más parejas de módulos basados en dichos LRR de tipo A y de tipo B, en los que cada una de dichas parejas presenta la secuencia siguiente:

RLE1L1L112DLTEAG4KDLASVLRSNPSLREL3LS3NKLGDAGVRLLLQGLLDPGT,

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en la que 1 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

D, E, N, Q, S, R, K, W e Y,

en la que 2 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

N, S y T,

en la que 3 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

G, S, D, N, H y T, y

en la que 4 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

L, V y M.

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Más preferentemente, cada una de dichas parejas de módulos se encuentra codificada por la molécula de ácidos nucleicos siguiente:

1

en la que 111 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

D, E, N, Q, S, R, K, W e Y,

en la que 222 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

N, S y T,

en la que 333 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

G, S, D, N, H y T, y

en la que 444 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

L, V y M.

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En otra realización preferente, se intercambia uno o más de los residuos aminoácidos en por lo menos una pareja de módulos indicados anteriormente, por un residuo aminoácido presente en la posición correspondiente en una LRR natural.

En todavía otra realización preferente, se intercambia uno o más de los codones de aminoácido en por lo menos una pareja de módulos indicados anteriormente por un codón codificante de un residuo aminoácido presente en la posición correspondiente en una LRR natural. Preferentemente, se intercambian hasta 30% de los residuos aminoácidos, o codones de aminoácidos, respectivamente, preferentemente hasta 20%, y más preferentemente hasta 10%.

En todavía otra realización preferente, se intercambia uno o más de los codones de aminoácidos en por lo menos una pareja de módulos indicados anteriormente por un codón codificante de un residuo aminoácido presente en la posición correspondiente en una LRR natural.

En una realización preferente adicional, la presente invención se refiere a un grupo de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que comprende un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención.

En el contexto de la presente invención, la expresión "molécula de ácidos nucleicos recombinantes" se refiere a una molécula de ARN o ADN que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de dicha proteína repetitiva y secuencias de ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo secuencias no codificantes.

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En una realización preferente adicional, la presente invención se refiere a un grupo de vectores que comprende un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención, o un grupo de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes según la presente invención.

Un vector según la presente invención puede ser un plásmido, fagémido, cósmido o un vector basado en un virus o bacteriófago y puede ser un vector de clonación o de secuenciación, o preferentemente un vector de expresión, que comprende todos los elementos necesarios para la expresión de moléculas de ácidos nucleicos a partir de dicho vector, en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos. Los vectores para la clonación, secuenciación y expresión de moléculas de ácidos nucleicos son bien conocidas para el experto ordinario en la materia. Los vectores que contienen las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden transferirse al interior de la célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procarióticas, mientras que, por ejemplo, la transfección mediada por fosfato de calcio o por DEAE-dextrano o la electroporación pueden utilizarse para otros huéspedes celulares, ver Sambrook et al., 1989. Dichos vectores pueden comprender genes adicionales, tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y bajo condiciones adecuadas. Preferentemente, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se ligan operablemente a secuencias de control de la expresión permitiendo la expresión en células procarióticas o eucarióticas. La expresión de dichas moléculas de ácidos nucleicos comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión en las células eucarióticas, preferentemente en células de mamífero, son bien conocidas por el experto en la materia. Habitualmente comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripción y, opcionalmente, una señal poliA que garantiza la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito y/o un intrón que intensifica adicionalmente la expresión de dicha molécula de ácidos nucleicos. Entre los elementos reguladores adicionales pueden incluirse intensificadores transcripcionales así como traduccionales, y/o regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Los elementos reguladores posibles que permiten la expresión en células huésped procarióticas comprenden, por ejemplo, los promotores pL, lac, trp o tac en E. coli, y son ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en las células huésped eucarióticas los promotores AOX1 o GAL1 en levaduras o los promotores CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous), el intensificador de CMV, el intensificador de SV40 o un intrón globina en células de mamífero y en otras células animales. Aparte de elementos que son responsables del inicio de la transcripción, entre dichos elementos reguladores también pueden incluirse señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio SV40-poliA o el sitio tak-poliA cadena abajo de la molécula de ácidos nucleicos. Además, dependiendo del sistema de expresión utilizado pueden añadirse a la secuencia codificante de la molécula de ácidos nucleicos de la invención secuencias líder capaces de dirigir el (poli)péptido a un compartimiento celular o de dirigirlo hacia el medio y son bien conocidas de la técnica. La secuencia o secuencias líder se ensamblan en fase apropiada con las secuencias de inicio y terminación de traducción, y preferentemente una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de proteína traducida, o una parte de la misma, hacia el interior del espacio periplásmico o hacia el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación C-terminal o N-terminal que proporcione las características deseadas, por ejemplo la estabilización o la purificación simplificada de producto recombinante expresado. En este contexto, son conocidos de la técnica vectores de expresión adecuados, tales como ADNc de Okayama-Berg o pCI (Promega) o más preferentemente pTFT74 (Ge et al., 1995) o un miembro de la serie pQE (Qiagen). Además, la presente invención se refiere a vectores, particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos utilizados convencionalmente en ingeniería genética que comprenden el polinucleótido de la invención. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión. Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos por el experto en la materia para construir vectores víricos recombinantes; ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, N.Y., y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989.

Además, la invención se refiere a un grupo de células huésped que comprende un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención, un grupo de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes según la presente invención, o un grupo de vectores según la presente invención.

En el contexto de la presente invención, la expresión "célula huésped" puede ser una de entre cualquiera de las expresiones utilizadas comúnmente en la producción de proteínas heterólogas, incluyendo, aunque sin limitación, bacterias tales como Escherichia coli (Ge et al., 1995) o Bacillus subtilis (Wu et al., 1993a), hongos tales como levaduras (Horwitz et al., 1988; Ridder et al., 1995) u hongos filamentosos (Nyyssönen et al., 1993), células vegetales (Hiatt, 1990; Hiatt y Ma, 1993; Whitelam et al., 1994), células de insecto (Potter et al., 1993; Ward et al., 1995) o células de mamífero (Trill et al., 1995).

En otra realización, la presente invención se refiere a un grupo de proteínas repetitivas codificadas por un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención, por un grupo de vectores según la presente invención, o producidas por un grupo de células huésped según la presente invención.

Además, la presente invención se refiere a un método para la construcción de un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según la presente invención, que comprende las etapas siguientes:

(a)

identificar una unidad repetitiva de una familia de proteínas repetitivas,

(b)

identificar residuos esqueléticos y residuos de interacción diana en dicha unidad repetitiva,

(c)

deducir por lo menos un tipo de módulo repetitivo que comprende residuos esqueléticos y residuos de interacción diana aleatorizados a partir de por lo menos un miembro de dicha familia de proteínas repetitivas, y

(d)

construir moléculas de ácidos nucleicos, codificantes cada una de una proteína repetitiva que comprende dos o más copias de dicho tipo o tipos de módulo repetitivo deducido en la etapa (c).

Los modos en que dicho método se lleva a cabo se han explicado anteriormente en relación a la realización del grupo de moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención. Las descripciones de dos de dichos modos se ilustran en el ejemplo.

En una realización preferente de dicho método, dicho módulo o módulos repetitivos deducidos en la etapa (c) presentan una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos 70% de los residuos aminoácidos corresponden a:

(i)

residuos aminoácidos de consenso deducidos a partir de residuos aminoácidos presentes en las posiciones correspondientes de por lo menos dos unidades repetitivas naturales, o

(ii)

residuos aminoácidos presentes en las posiciones correspondientes en una unidad repetitiva natural.

Resulta adicionalmente preferente un método para la producción de un grupo de (poli)péptidos/proteínas según la presente invención, que comprende las etapas de (a) proporcionar un grupo de células huésped según la presente invención, y (b) expresar el grupo de moléculas de ácidos nucleicos comprendidas en dichas células huésped.

Resulta particularmente preferente un método para obtener una proteína repetitiva que presenta una propiedad predeterminada, que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar un grupo de proteínas repetitivas según la presente invención, y

(b)

cribar dicho grupo y/o seleccionar de dicho grupo para obtener por lo menos una proteína repetitiva que presenta dicha propiedad predeterminada.

El grupo diverso de proteínas repetitivas puede proporcionarse mediante varios métodos según el sistema de cribado y/o de selección que se utilice, y puede comprender la utilización de métodos tales como la expresión sobre la superficie de bacteriófagos (patente WO nº 90/02809; Smith, 1985; Kay et al., 1996; Dunn, 1996) o células bacterianas (patente WO nº 93/10214), la expresión ribosómica (patente WO nº 91/05058, patente WO nº 98/48008; Hanes et al., 1998), la expresión en plásmidos (patente WO nº 93/08278) o mediante la utilización de constructos híbridos covalentes de ARN-proteína repetitiva (patente WO nº 00/32823), la expresión intracelular y la selección/cribado, tal como mediante ensayo de complementación de proteínas (patente WO nº 98/341120; Pelletier et al., 1998). En todos dichos métodos, las proteínas repetitivas se proporcionan mediante la expresión de un grupo correspondiente de moléculas de ácidos nucleicos y el cribado posterior de las proteínas repetitivas, seguido de la identificación de una o más proteínas repetitivas que presentan la propiedad deseada, a partir de la información genética relacionada con las proteínas repetitivas.

En el contexto de la presente invención, la expresión "propiedad predeterminada" se refiere a una propiedad, que una de las proteínas repetitivas de entre el grupo de proteínas repetitivas debería presentar, y que forma la base para el cribado y/o selección del grupo. Dichas propiedades comprenden propiedades tales como la unión a una diana, el bloqueo de una diana, la activación de una reacción mediada por una diana, la actividad enzimática y propiedades adicionales, que son conocidas por un experto ordinario en la materia. Dependiendo del tipo de propiedad deseada, el experto ordinario en la materia será capaz de identificar el formato y etapas necesarias para llevar a cabo el cribado y/o la selección.

Más preferentemente, la presente invención se refiere a un método en el que dicha propiedad predeterminada es la unión a una diana.

En otra realización, la invención se refiere a una proteína repetitiva de un grupo según la presente invención, en el que dicha proteína repetitiva presenta una propiedad predeterminada. Preferentemente dicha proteína repetitiva se ha obtenido mediante el método anteriormente descrito y presenta una de las propiedades predeterminadas.

Además, la presente invención se refiere a una molécula de ácidos nucleicos codificante de la proteína repetitiva según la presente invención.

En todavía otra realización, la presente invención se refiere a un vector que contiene la molécula de ácidos nucleicos según la presente invención.

\newpage

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína repetitiva de un grupo de la presente invención o una molécula de ácidos nucleicos codificante de dicha proteína repetitiva, y opcionalmente un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Pueden formularse composiciones que comprenden dichos portadores mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse en el sujeto a una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede llevarse a cabo de maneras diferentes, por ejemplo mediante la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. El régimen de dosificación será determinado por el médico responsable y por factores clínicos. Tal como es bien conocido en las técnicas médicas, las dosis para cualquiera paciente dado depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial corporal, la edad, el compuesto particular que debe administrarse, el género, el tiempo y vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos que se administran concurrentemente. Una dosis típica puede encontrarse comprendida, por ejemplo, en el intervalo de entre 0,001 y 1.000 \mug (o de ácidos nucleicos para la expresión o para la inhibición de la expresión en dicho intervalo); sin embargo, las dosis inferiores o superiores a dicho intervalo ejemplar se encuentran contempladas, especialmente considerando los factores anteriormente indicados. Generalmente, el régimen como administración regular de la composición farmacéutica debería encontrarse comprendida en el intervalo de entre 1 \mug y 10 mg al día. En el caso de que el régimen sea una infusión continua, también debe encontrarse comprendida en el intervalo de entre 1 \mug y 10 mg por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. Puede realizarse un seguimiento del progreso mediante evaluaciones periódicas. Las dosis varían aunque una dosis preferente para la administración intravenosa de ADN se encuentra comprendida entre aproximadamente 10^{6} y 10^{12} copias de la molécula de ADN. Las composiciones de la invención pueden administrarse localmente o sistémicamente. La administración generalmente será parenteral, por ejemplo intravenosa; también puede administrarse el ADN directamente en el sitio diana, por ejemplo mediante administración de un bolo en un sitio diana interno o externo o mediante catéter en un sitio de una arteria. Entre las preparaciones para la administración parenteral se incluyen las soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos de solventes no acuosos: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Entre los portadores acuosos se incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Entre los vehículos parenterales se incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución lactato de Ringer o aceites fijos. Entre los vehículos intravenosos se incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrólitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden encontrarse presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales, tales como interleuquinas o interferones, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica.

Las proteínas repetitivas comprendidas en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender un dominio adicional, uniendo dicho dominio mediante enlaces covalentes o no covalentes. El enlace puede basarse en la fusión genética según los métodos conocidos de la técnica y descritos anteriormente o pueden llevarse a cabo mediante, por ejemplo, entrecruzamiento químico tal como se describe, por ejemplo, en la patente WO nº 94/04686. El dominio adicional presente en la proteína de fusión comprende el péptido, polipéptido o anticuerpo utilizado según la invención preferentemente puede unirse mediante un línker flexible, ventajosamente un línker polipéptido, en el que dicho línker polipéptido comprende una pluralidad de aminoácidos hidrofílicos unidos formando un péptido de longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal de dicho dominio adicional y el extremo N-terminal de la proteína repetitiva o viceversa. La proteína de fusión anteriormente indicada puede comprender además un línker cortable o un sitio de corte para proteinasas. Además, dicho dominio adicional puede presentar una especificidad o función predefinida. En este contexto, se entiende que las proteínas repetitivas presentes en la composición farmacéutica según la invención pueden modificarse adicionalmente mediante métodos convencionales conocidos de la técnica. Esto permite la construcción de proteínas de fusión que comprenden la proteína repetitiva de la invención y otras secuencias de aminoácidos funcionales, por ejemplo señales de localización nuclear, dominios de transactivación, dominios de unión al ADN, dominios de unión a hormona, proteínas etiqueta (GST, GFP, péptido h-myc, FLAG, péptido HA) que pueden derivarse a partir de proteínas heterólogas. De esta manera, la administración de la composición de la invención puede utilizarse no marcada, así como (poli)péptidos o anticuerpos marcados.

Resulta adicionalmente preferente una molécula de ácidos nucleicos codificante de una pareja de módulos repetitivos para la construcción de un grupo según la presente invención, en la que dicha molécula de ácidos nucleicos es:

2

en la que 111 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

D, E, N, Q, S, R, K, W e Y,

en la que 222 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

N, S y T,

en la que 333 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

G, S, D, N, H y T, y

en la que 444 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo:

L, V y M.

Estas realizaciones y otras se dan a conocer y se encuentran comprendidas por la descripción y ejemplos de la presente invención. Puede obtenerse de bibliotecas públicas literatura adicional referente a cualquiera de los métodos, usos y compuestos que deben utilizarse según la presente invención utilizando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos "PubMed" (Sequeira et al., 2001) puede utilizarse, que se encuentra disponible en internet.

Se proporciona en Berks (1994) una visión general de la información de patentes en el campo de la biotecnología y un estudio de las fuentes relevantes de información de patente útiles para la búsqueda retrospectiva y para los conocimientos actuales.

Figuras

Figura 1. Representación esquemática de las expresiones "proteína repetitiva", "dominios repetitivos", "dominios no repetitivos", "módulo repetitivo", "módulos de caperuza" y "línker".

Figura 2a. Ejemplos de proteínas repetitivas ricas en leucinas que presentan únicamente un dominio repetitivo (1A4Y) o tanto un dominio repetitivo y un dominio no repetitivo (1 D0B).

Figura 2b. Ejemplos de proteínas repetitivas anquirina que presentan únicamente un dominio repetitivo (1AWC) o tanto un dominio repetitivo como un dominio no repetitivo (1 DCQ).

Figura 2c. Estructura cristalina del inhibidor de ribonucleasa de hígado de cerdo (Kobe y Deisenhofer, 1993).

Figura 2d. Estructura cristalina de la proteína mal1p de levadura activadora de GTPasa (Hillig et al., 1999).

Figura 2e. Estructura cristalina de la proteína InIB de Listeria (Marino et al., 1999).

Figura 2f. Estructura cristalina de la proteína U2A' empalmosómica humana (Price et al., 1998).

Figura 2g. Estructura cristalina del inhibidor I\kappaB\alpha del factor transcripcional humano (Huxford et al., 1998).

Figura 2h. Estructura de difracción de rayos X del dominio repetitivo anquirina de la subunidad beta 1 de la proteína ligante de GA de ratón [pdb entry 1AWC (Batchelor et al., 1998)]. Los extremos N-terminal y C-terminal del dominio se encuentran marcados. Esta imagen se ha creado utilizando MOLMOL (Koradi et al., 1996).

Figura 3. Ejemplos de unidades repetitivas y unidades de caperuza naturales. Se muestra una proteína repetitiva rica en leucinas (1A4Y) y una proteína repetitiva anquirina (1AWC).

Figura 4a. Plegamiento \beta/\alpha de la unidad LRR del inhibidor de ribonucleasa de cerdo (residuos 423 a 450).

Figura 4b. Leucinas y posiciones de aminoácidos que surgen de la cadena \beta de una unidad LRR del inhibidor de ribonucleasa de cerdo (residuos 86 a 112).

Figura 4c. Descripción estructural de una unidad repetitiva anquirina. A: vista lateral. B: vista superior. Se ilustran los residuos que interaccionan como "bolas y palos". Estos dibujos se realizaron utilizando la tercera repetición de la proteína ligante de GA (pdb entry 1AWC; Batchelor et al., 1998) visualizada con MOLMOL (Koradi et al., 1996).

Figura 4d. Se muestra un subconjunto de los residuos esqueléticos de una unidad LRR como "bolas y palos". La numeración se refiere a las posiciones dentro de una unidad LRR.

Figura 4e. Se muestra un subconjunto de residuos de interacción diana de una unidad LRR como "bolas y palos". La numeración se refiere a las posiciones dentro de una unidad LRR.

Figura 4f. Se muestra un modelo de un módulo repetitivo LRR. La numeración se refiere a las posiciones dentro de la pareja derivada del motivo repetitivo LRR.

Figura 5a. Alineación de aminoácidos internos del inhibidor de ribonucleasa placentario humano.

Figura 6. Sitios de reconocimiento de enzima de restricción y aminoácidos codificados. El ADN reconocido por los códigos de BssHII para la alanina y la arginina (A y R) en el primer marco de lectura. De acuerdo con lo anterior, MluI codifica treonina y arginina (T y R) en el primer marco de lectura. La combinación de moléculas de ADN cortadas con BssHII y MluI proporciona un nuevo sitio combinado no reconocido por ninguno de los enzimas de restricción y codificante de alanina y arginina (A y R).

Figura 7a. a 7c. Clonación de la biblioteca de módulos repetitivos.

Figura 8. Secuencia de ADN y aminoácidos traducidos de la inserción NcoI-HindIII en el plásmido pTFT_1N1CL. La abreviatura pTFT se refiere a todos los plásmidos derivados de pTFT74 (Ge et al., 1995). La abreviatura N1CL se refiere a una inserción que contiene un módulo N-terminal, 1 módulo repetitivo, un módulo C-terminal y una secuencia línker.

Figura 9a. a 9c. Diagramas de los plásmidos pTFT_N, pQE_N1C y pQ3-pD_N2C. La nomenclatura es la descrita en el pie de la figura 8. El nombre de los plásmidos derivados de pQE30 (Qiagen) en todos los casos se inicia con pQE. La abreviatura pD se refiere a una proteína D del fago lambda (Forrer y Jaussi, 1998).

Figura 10. Secuencia de ADN de la inserción NcoI-HindIII del plásmido pQE_N4C clon D17.

Figura 11a. Expresión de nivel elevado de miembros seleccionados aleatoriamente de la biblioteca de pD_N2C (A2, A10, ...). Se cultivaron a 37ºC células XL1-Blue que contenían uno de los plásmidos pQE-pD_N2C de la biblioteca de expresión, hasta una DO_{600}=1 y se indujeron durante 1 hora con IPTG 1 mM. Las células recogidas se resuspendieron en TBS_{500}', se sonicaron y se centrifugaron. Las muestras correspondientes al sobrenadante (S) o pellet (P) de 40 microlitros de cultivo celular se separaron en un SDS-PAGE al 15% y se tiñeron con azul de Coomassie. Los clones se denominan A2, A10, etc. Ap1 y Ap2 son grupos de 10 clones individuales; Y: pD_N2C truncado (26 kDa), X: pD_N2C (33 kDa).

Figura 11b. Expresión de nivel elevado de miembros aleatoriamente seleccionados de las bibliotecas N2C (C1,
C2, ...) y pD_N4C (B9, B21) tal como se describe en la fig. 11a; *: N2C (22 kDa), #: pD_N4C (45 kDa).

Figura 11c. Expresión de nivel elevado de miembros seleccionados aleatoriamente de la biblioteca N4C (D11, D15, ...) tal como se describe en la fig. 11a; Z: N4C (34 kDa).

Figura 11d. Expresión de nivel elevado de miembros seleccionados aleatoriamente de la biblioteca N4C (D11, D15, ...) tal como se describe en la fig. 11a, aunque el cultivo se realizó a 25ºC; Z: N4C (34 kDa).

Figura 12a. Análisis de transferencia western de la expresión de nivel elevado de miembros de la biblioteca pD_N2C (A2, A10, A15) tras la expresión a 25ºC o a 30ºC. Se preparó la proteína según la fig. 11a, se utilizó anticuerpo anti-RGS-His a una dilución 1:5.000 siguiendo el protocolo del fabricante (Qiagen); Y: pD_N2C truncado (26 kDa), X: pD_N2C (33 kDa).

Figura 12b. Análisis de transferencia western de la expresión de nivel elevado de miembros seleccionados aleatoriamente de la biblioteca pD_N4C (B9, B21, BP, que es un grupo) tras la expresión a 37ºC o a 25ºC; #: pD_N4C (45 kDa).

Figura 12c. Análisis de transferencia western del nivel de expresión elevado de miembros seleccionados aleatoriamente de la biblioteca pD_N4C (C1, C3, C7) tras la expresión a 37ºC o a 25ºC. Se preparó la proteína según la fig. 11a. Se utilizó el anticuerpo anti-flag M2 a una dilución de 1:1.000 siguiendo el protocolo del fabricante (Sigma); *: N2C (22 kDa).

Figura 12d. Análisis de transferencia western del nivel de expresión elevada de algunos miembros de la biblioteca N4C (D17, D19, D22) tras la expresión a 37ºC o a 25ºC; Z: N4C (34 kDa).

Figura 13. Purificación de la etiqueta de His bajo condiciones nativas de una proteína repetitiva rica en leucinas seleccionada aleatoriamente según la presente invención. El carril M muestra el marcador de tamaño molecular (en kDa), el carril FT muestra la fracción no unida, y los carriles 0 a 6 muestran diferentes fracciones de elución. La flecha indica la posición de la proteína esperada.

Figura 14. Purificación de etiqueta de His bajo condiciones de desnaturalización, incluyendo el replegamiento de las proteínas repetitivas en la columna de purificación. Los carriles 1 a 6 muestran las fracciones no unidas de seis proteínas repetitivas ricas en leucinas según la presente invención. Los carriles 7 a 12 muestran las fracciones de elución de picos de las mismas seis proteínas. La flecha indica la posición de las proteínas esperadas.

Figura 15. Espectrometría de dicroísmo circular de una proteína repetitiva rica en leucinas seleccionada aleatoriamente según la presente invención.

Figura 16. Cromatografía de exclusión por tamaños de una proteína repetitiva rica en leucinas seleccionada aleatoriamente según la presente invención. La muestra se analizó en una columna Superose 12.

Figura 17. Secuencias de reconocimiento de ADN de los enzimas de restricción utilizados para la clonación de proteínas repetitivas anquirina según la presente invención. Los enzimas de restricción de tipo II cortan el ADN dentro de un sitio de reconocimiento palindrómico, mientras que los enzimas de restricción de tipo II cortan fuera de un sitio de reconocimiento no palindrómico. Se utilizaron dos enzimas de restricción de tipo II (BpiI y BsaI) para ligar los módulos repetitivos anquirina entre sí de una manera dirigida en virtud de sus extremos protuberantes compatibles (ver la fig. 18 y las Tablas 2 y 3), generando conexiones continuas de un módulo repetitivo anquirina con el siguiente. Estos enzimas de restricción de tipo II también se utilizaron para unir los módulos de caperuza anquirina N-terminal y C-terminal con los módulos repetitivos anquirina que los separaban. Se utilizó BamHI e HindIII para la clonación de las proteínas repetitivas anquirina construidas según la presente invención (que contenían un modulo de caperuza anquirina N-terminal, dos o más módulos repetitivos anquirina y un módulo de caperuza anquirina C-terminal) en el plásmido pQE30 (QIAgen, Alemania). El patrón de restricción se indica para cada enzima con líneas continuas.

Figura 18. Vista esquemática del alargamiento en etapas del módulo de caperuza anquirina N-terminal con módulos repetitivos anquirina al nivel del ADN. El módulo de caperuza anquirina N-terminal se alargó con módulos repetitivos anquirina hasta la longitud requerida, siguiendo y finalizando con la adición del módulo de caperuza anquirina C-terminal.

Figura 19. Consenso "A" (obtenido tras el análisis SMART), el consenso utilizado para la búsqueda de BLAST (consenso "A" circularmente permutado en donde se habían extraído residuos faltantes de un consenso de unidades repetitivas anquirina de proteínas repetitivas anquirina con estructura tridimensional conocida), consenso "B" (derivado tras la búsqueda de BLAST), así como el consenso "C" (obtenido finalmente considerando diversos parámetros mencionados en el Ejemplo 2) se listan para ilustrar la definición por etapas del consenso de unidades repetitivas anquirina. Para los consensos "A" y "B", se muestran los residuos que alcanzan una frecuencia de 20% en una posición dada. En el consenso "C", se muestran varios aminoácidos en posiciones en las que los últimos aminoácidos encajaban igualmente bien.

Figura 20. Se muestran la secuencia del motivo repetitivo anquirina (es decir, la base de todos los módulos repetitivos anquirina del Ejemplo 2) y los números de posición respectivos de los aminoácidos. Además, se indican las estructuras secundarias esperadas (\alpha se refiere a hélice \alpha, \beta se refiere a lámina \beta). Las seis posiciones denominadas "x" se definieron como residuos de interacción diana que se permitió que fuesen cualquiera de los aminoácidos A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y. Las posiciones restantes se definieron como residuos del esqueleto definido por el consenso "C" (ver la fig. 19). En la posición 26, se permitió cualquiera de los tres aminoácidos histidina, tirosina o asparagina. Por motivos de la clonación, el motivo repetitivo anquirina se basa en un consenso "C" circularmente permutado (ver la fig. 19). Para hacer corresponder el esquema de numeración de consenso en la fig. 19 y el utilizado por Sedgwick y Smerdon (1999), los números se permutaron circularmente en paralelo con la secuencia de consenso.

Figura 21. Alineación del clon "E3-5" aleatoriamente seleccionado y construido según la presente invención. La secuencia de aminoácidos de E3-5, una proteína que presenta 3 módulos repetitivos anquirina (fig. 20) entre los módulos de caperuza anquirina N-terminal y C-terminal, se alineó con la proteína beta 1 ligante de GA de ratón. Esta última es la proteína que muestra la homología más lata con E3-5 de entre las proteínas repetitivas anquirina conocidas. Las secuencias se alinearon utilizando el comando "gap" de GCG (Womble, D.D., 2000) con valores por defecto y la matriz de comparación de secuencias Blosum62. Globalmente, las dos moléculas mostraron una identidad de residuos de 67% y una homología de los residuos de 71%. Las posiciones correspondientes a las posiciones aleatorizadas en el motivo repetitivo (ver la fig. 20) se marcan con un asterisco en la parte superior. Los módulos de caperuza anquirina N-terminal y C-terminal se indican con subrayado superior, los tres módulos repetitivos anquirina se han subrayado.

Figura 22. Expresión de nivel elevado de proteínas repetitivas anquirina de diferente tamaño generadas según la presente invención [clonadas con BamHI/HindIII en el plásmido pQE30 (QIAgen); expresadas en E. coli XL1-Blue (Stratagene)]. De cada biblioteca de N2C, N3C y N4C, se sometieron a ensayo dos clones seleccionados aleatoriamente. La abreviatura N2C se refiere a un módulo de caperuza anquirina N-terminal, encontrándose conectados dos módulos repetitivos anquirina y un módulo de caperuza anquirina C-terminal utilizando la estrategia de clonación indicada en las figs. 17 y 18. N3C y N4C se denominan de acuerdo con su contenido de tres o cuatro módulos repetitivos anquirina entre sus módulos de caperuza anquirina N-terminal y C-terminal. La expresión se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 2. Las muestras correspondientes a 30 \mul de cultivo se obtuvieron en diversos tiempos y se separaron en SDS-PAGE al 15% (tinción de Coomassie). Carril 1: marcador molecular (tamaño indicado en kDa); carriles 2 a 7: dos clones N2C, dos N3C y dos N4C inmediatamente antes de la inducción; carriles 8 a 13: igual que los carriles 2 a 7 aunque tras 2,5 horas de inducción; carriles 14 a 19: igual que los carriles 2 a 7 aunque tras 4 horas de inducción.

Figura 23. Purificación de etiqueta de His de una proteína repetitiva anquirina seleccionada aleatoriamente generada según la presente invención. Se ilustra un SDS-PAGE al 15% que muestra las diferentes fracciones del procedimiento de purificación. E3-5, un clon N3C, se expresó y se purificó tal como se describe en el Ejemplo 2. El carril 1 representa 0,6 \mul del lisado celular recogido del eluido que no se había unido en las columnas de Ni-NTA. El carril 2 representa 0,6 \mul de la primera fracción de lavado de 800 \mul de la columna. El carril 3 representa 0,6 \mul de la última fracción de lavado de 800 \mul. Los carriles 4, 5, 6, 7, 8 y 9 representan 0,6 \mul de las etapas de elución posteriores (800 \mul cada una) de la proteína repetitiva anquirina. El carril 10 muestra el marcador molecular (tamaños en kDa).

Figura 24. Cromatografía de exclusión por tamaños de una proteína repetitiva anquirina seleccionada aleatoriamente generada según la presente invención (E3-5, una molécula N3C, ver la fig. 22). La muestra se analizó en una columna Superdex 75 (Amersham Pharmacia Biotech, USA) utilizando un sistema SMART de Pharmacia a un caudal de 60 \mul/minuto y TBS 150 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM) como tampón de desplazamiento. Los estándares eran: \beta-amilasa y las proteínas fágicas SHP del fago 21 y pD de - -. Se indican las masas aparentes de los estándares en la figura. La masa aparente de 200 kDa para la \beta-amilasa no está indicada, como proteína eluida en el volumen vacío.

Figura 25. Espectros de dicroísmo circular de una proteína repetitiva anquirina seleccionada aleatoriamente, generada según la presente invención (E3-5, una molécula N3C). Los espectros se registraron en tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 6,5 (nativo) o en tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 6,5, e hidrocloruro de guanidinio 6 M (desnaturalizado) utilizando un instrumento Jasco J-715 [Jasco, Japón; 10 nm/s, respuesta de 8 segundos, pitch de los datos: 0,2 nm, anchura de banda: 2 nm, 195 a 250 nm (nativo) o 212 a 250 nm (desnaturalizado), tres acumulaciones, mediciones por triplicado, cubeta de 1 mm]. La señal de CD se convirtió a elipticidad residual media utilizando la concentración de la muestra determinada espectrofotométricamente a 280 nm bajo condiciones desnaturalizantes. E3-5 muestra un espectro alfa-helicoidal bajo condiciones nativas con mínimos en 280 nm y en 222 nm. La estructura secundaria se perdió en hidrocloruro de guanidinio 6 M.

Figura 26. Comportamiento de desnaturalización de proteínas repetitivas anquirina seleccionadas aleatoriamente, generadas según la presente invención (ver la fig. 22). Los valores de CD a 220 nm se muestran frente a la concentración de hidrocloruro de guanidinio para las diferentes proteínas. Se incubaron las diferentes proteínas con diferentes concentraciones de hidrocloruro de guanidinio en NaPO_{4} 20 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM, durante la noche a temperatura ambiente. Se midió la señal de dicroísmo circular a 220 nm para cada muestra por triplicado (condiciones indicadas en el Ejemplo 2). La estructura secundaria se perdió únicamente a concentraciones elevadas de agente desnaturalizante, indicando una estabilidad elevada de las proteínas sometidas a ensayo.

Figura 27. Cristales de proteína repetitiva anquirina seleccionada aleatoriamente, generada según la presente invención (E3-5, un miembro de la biblioteca N3C de la fig. 22). El cristal se hizo crecer durante cinco días a 20ºC en PEG 6000 al 20%, MES 100 mM/NaOH, pH 6,0, microgotas colgantes (2 \mul de proteína y 2 \mul de tampón mezclado; 500 \mul de reservorio de tampón) de una solución de 9 mg de proteína por ml en TBS 50 (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM).

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplos

A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevaron a cabo según los protocolos descritos (Sambrook et al., 1989, o Ausubel et al., 1994). Las bases de datos utilizadas fueron:

Genbank, National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, USA

Swiss-Prot, Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva, Suiza

Protein Data Base, Center for Molecular Biophysics and Biophysical Chemistry at Rutgers, New Jersey, USA

Simple Modular Architecture Research Tool (SMART), EMBL, Heidelberg, Alemania.

1. Grupo de proteínas repetitivas que comprende módulos repetitivos derivados de unidades repetitivas de inhibidores de ribonucleasa de mamífero

El presente ejemplo describe la construcción de un grupo de proteínas repetitivas ricas en leucinas derivadas de inhibidores de ribonucleasa (RI) de mamífero. Este andamiaje se seleccionó debido a que se ha informado de interacciones extraordinariamente fuertes en el intervalo femtomolar para la unión de la angiogenina por los RI (Lee et al., 1989) y la ARNasa A por los RI (Kobe y Deisenhofer, 1996). Debido a que la secuencia de aminoácidos de los RI mostró un patrón característico de dos unidades repetitivas alternantes homólogas aunque diferentes, denominadas unidades repetitivas LRR de tipo A y de tipo B (Kobe y Deisenhofer, 1994), se derivaron dos motivos repetitivos correspondientes y se utilizaron para construir un dominio repetitivo. El ensamblaje de un motivo repetitivo LRR de tipo A con un motivo repetitivo LRR de tipo B en lo sucesivo se denomina pareja de motivos repetitivos RI. Un modelo de una pareja de módulos repetitivos que comprende una pareja de motivos repetitivos RI se muestra en la figura 4f. El presente ejemplo demuestra la utilización de más de un motivo repetitivo para construir un dominio repetitivo, lo que contrasta con el Ejemplo 2, en el que se utiliza únicamente un motivo repetitivo.

1) Derivación de motivos de secuencia repetitiva preliminares de RI de mamífero

Se utilizaron las secuencias de proteínas de los RI humanos (número de acceso P13489, Lee et al., 1988) y RI de cerdo (P10775, Hofsteenge et al., 1988) para la búsqueda de secuencias homólogas. Se encontraron las secuencias proteicas completas del RI de rata (P29315, Kawanomoto et al., 1992) y del RI de ratón (AAK68859, no publicado).

Las unidades repetitivas de las secuencias de proteína RI obtenidas se alinearon utilizando "FastA" implementado en el paquete GCG® Wisconsin Package^{TM} (Accelrys, USA). Se muestra la secuencia proteica del RI humano (fig. 5a) y se subraya el patrón de LRR caracterizado por leucinas u otros residuos alifáticos en las posiciones 2, 5, 7, 12, 20 y 24 (Kobe y Deisenhofer, 1994). El aminoácido más abundante para cada posición se calculó para la secuencias de RI humano, de ratón, de cerdo y de rata (figs. 5c y 5d). Se definió un primer motivo repetitivo de RI a partir de los aminoácidos presentes en 50% (ver las figs. 5c y 5d) o más de los casos en una posición dada.

3

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Para un umbral de 40% o más aminoácidos idénticos en una posición dada, se definió la pareja de motivos repetitivos RI con la secuencia de aminoácidos siguiente:

4

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De manera similar, para un umbral de 30% o más aminoácidos idénticos en una posición dada se definió la pareja de motivos repetitivos de RI con la secuencia de aminoácidos siguiente:

5

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Finalmente, para un umbral de 25% o más aminoácidos idénticos en una posición dada, la pareja de motivos repetitivos de RI se definió prácticamente por completo con únicamente un aminoácido por posición.

6

Lo anteriormente expuesto sirve para ilustrar cómo un motivo de secuencia puede derivarse únicamente a partir de la información de las secuencias y la alineación. Sin embargo, preferentemente debe considerarse la información estructural.

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2) Definición de las posiciones de los residuos de interacción diana y esqueléticos

El análisis de las unidades LRR tanto de tipo A como de tipo B reveló que las cadenas laterales de los aminoácidos en las posiciones 2, 5, 7, 10, 12, 17, 20 y 24 en todos los casos se encontraban orientados hacia el núcleo hidrofóbico (Kobe y Deisenhofer, 1994, y figs. 4b y 4d) y estos aminoácidos constituyen un subconjunto de los residuos esqueléticos. Otros residuos esqueléticos son la glicina en la posición 16 y las prolinas en la posición 28 en la unidad LRR de tipo A (abreviada A28) y en la posición 27 en la unidad LRR de tipo B (abreviada B27), debido a que inician y termina la hélice \alpha de cada unidad LRR. Además, las posiciones A1, A3, A13, A18, A19, A22, A25, A27 y B1, B3, B11, B14, B18, B22 y B26 con frecuencia alojan residuos aminoácidos hidrofílicos orientados hacia el solvente circundante y se trataron como posiciones esqueléticas. De manera similar, las posiciones A14, A15, A21, A23, A26 y B15, B19, B21, B25 y B29 habitualmente se encuentran ocupadas por residuos aminoácidos hidrofóbicos que estabilizan la interfaz de los módulos repetitivos y de esta manera también se tratan como posiciones esqueléticas. Además, las posiciones A11, B13, B23 y B28 presentan glicinas, que permitan más flexibilidad que otros aminoácidos y por lo tanto también resultan importantes para el esqueleto. Por el contrario, las posiciones 4, 6, 8 y 9 se definió que eran las posiciones de interacción diana en la pareja de motivos repetitivos de RI.

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3) Sustitución de los aminoácidos desfavorables

El consenso de RI también se caracteriza por cisteínas extremadamente bien conservadas en las posiciones A10 y A17 y en las posiciones B21 y B29. Sin embargo, debido a que las cisteínas libres pueden oxidarse y provocar complicaciones, resulta deseable diseñar módulos libres de cisteína. Por lo tanto, se buscó realizar sustituciones apropiadas. La inspección de la estructura tridimensional (MTS#1) reveló que la cisteína en la posición A10 formó un enlace H. Además, las alineaciones con moléculas LRR más distantes reveló la presencia de asparagina, serina o treonina en la mayoría de casos. De esta manera, la posición A10 en el módulo LRR se diseñó para que se encontrase ocupada por dichos tres aminoácidos. De manera similar, la posición A17 se encontró que formaba parte del núcleo hidrofóbico, motivo por el que en el módulo LRR se utilizaron metionina, leucina o valina. Simultáneamente, estas dos posiciones, A10 y A17, constituyen casos en los que las posiciones esqueléticas se encuentran aleatorizadas. En la posición B21, la cisteína de la primera y la última repetición en todas las secuencias analizadas de RI se encontraba constantemente ocupada por leucina (con la excepción de una posición, ocupada por valina) y de esta manera se definió como leucina en el módulo LRR final. De acuerdo con lo anterior, en el caso de la posición B29, la elección era entre serina y treonina, en la que se seleccionó la treonina para permitir un ensamblaje con los sitios de endonucleasa de restricción de BssHII y MluI (para una descripción detallada ver la fig. 6).

La última cisteína remanente, presente en 36% de los casos en la posición A21 analizada (fig. 5c) se fijó que fuese alanina debido a que éste es el segundo aminoácido más frecuente en la posición dada y aparentemente también se correspondía con el ambiente hidrofóbico. La decisión se vio facilitada porque en la mayoría de casos en los que se encontró leucina en la posición B21, la posición A21 se encontraba ocupada por alanina. En otras palabras, la leucina en la posición B21 aparentemente prefiere alanina en la posición A21. De esta manera, se consideró que el apilamiento resultaba mejor soportado por dicha elección en el módulo LRR. Se requería otra decisión para la posición A1. De entre los dos aminoácidos de carga positiva posibles, lisina y arginina, se seleccionó éste último para que se correspondiese con los sitios de endonucleasa de restricción anteriormente indicados.

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De esta manera, el motivo de secuencia repetitiva refinado puede describirse con la secuencia siguiente:

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4) Definición de los residuos de interacción diana

Para la definición de las posiciones de interacción diana, se analizaron tanto el complejo RI humano-angiogenina (Papageorgiou et al., 1997) como el RI de cerdo-ARNasa A (Kobe y Deisenhofer, 1995). Aparte de las extensivas interacciones en las unidades de caperuza tanto N-terminal como C-terminal, las interacciones de las unidades repetitivas implicaban más frecuentemente las posiciones 6, 8 y 9 de la unidad LRR de tipo A, mientras que en la unidad LRR de tipo B, se utilizaron más frecuentemente las posiciones 4, 6 y 9. Todas estas posiciones se caracterizan por cadenas laterales originadas en la cadena \beta de la unidad LRR (fig. 4e) y por lo tanto resultan adecuadas para las interacciones diana. Sin embargo, debido a que el glutamato en la posición 4 de la unidad LRR de tipo B se encontraba presente sin excepción y no podía descartarse una función estructural adicional, se decidió no aleatorizar esta posición. De esta manera, esta posición constituye un caso en el que no se aleatoriza una posición de interacción diana. Por el contrario, la posición A4 también se definió que debía aleatorizarse debido a que mostraba un nivel de conservación inferior a 30%. Por lo tanto, en el módulo LRR se aleatorizaron las posiciones A4, A6, A8 y A9, y las posiciones B6 y B9. El subconjunto seleccionado de aminoácidos en las posiciones aleatorizadas refleja en gran parte las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos naturales y por lo tanto se seleccionaron todos los aminoácidos cargados y algunos formadores de enlaces de H y aromáticos que es conocido que proporcionan soporte para la unión en muchos casos. Simultáneamente, se adoptó la decisión de permitir aminoácidos de mayor tamaño únicamente en posiciones de la unidad LRR de tipo A y aminoácidos más pequeños únicamente en posiciones de la unidad LRR de tipo B, minimizando impedimentos estéricos en un contexto alternante. De esta manera, el motivo de secuencia repetitiva obtenido en esta etapa puede describirse de la manera siguiente:

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De esta manera, la aleatorización en ocho posiciones resultó en 2,8x10^{5} parejas de módulos repetitivos de RI independientes. En otras palabras, la síntesis de moléculas que satisfacen el motivo de secuencia repetitiva anteriormente indicado crea aproximadamente 300.000 miembros independientes aunque altamente homólogos.

Otra posición analizada en detalle se encuentra en la región de bucle en la parte superior de ambas unidades repetitivas LRR, es decir la posición 11. Debido a que el consenso en las unidades LRR tanto de tipo A como de tipo B era de 36% y 25%, respectivamente, se comprobó la presencia de parejas de aminoácidos. En la unidad LRR de tipo B, los aminoácidos cargados eran ligeramente preferentes en la posición 11 y una lisina con frecuencia aparecía con un aspartato en la unidad LRR de tipo A. Este puente salino putativo se consideró que incrementaba la estabilidad y solubilidad del módulo LRR diseñado y por lo tanto se seleccionó. Se descartó otra posibilidad (glicina en A11 y glutamato en B11) para evitar una flexibilidad excesivamente elevada.

La elección en la posición A14 se adoptó entre alanina y glutamato, seleccionando nuevamente éste último para incrementar la solubilidad y la orientación correcta de la cáscara hidrofílica externa. De manera similar, la posición B22 sugería glutamato o glutamina, seleccionando ésta última debido a que aparentemente se correspondía mejor con la serina en A22 definida anteriormente.

Finalmente, se examinó la posición 26, en la que la elección se encontraba entre alanina en A26 conjuntamente con glutamina en B26 por otra parte, y serina en A26 conjuntamente con aspartato en B26. Se adoptó la última variante para nuevamente incrementar la solubilidad del módulo LRR.

De esta manera, a continuación se proporciona la pareja de motivos repetitivos de RI (las alteraciones se muestran en negrita):

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5) Diseño de un dominio repetitivo derivado de LRR del RI de mamífero

El ensamblaje de múltiples módulos repetitivos en un dominio es sencillo. En la presente invención se utilizó un enfoque que implicaba dos enzimas de restricción diferentes, creando extremos protuberantes compatibles (ver la fig. 6). De esta manera, la dirección de la ligación simplemente puede controlarse digiriendo nuevamente los productos de ligación donde sólo las moléculas correctamente ligadas no son cortadas.

Además, los presentes inventores decidieron complementar los módulos LRR ensamblados con módulos de caperuza N-terminal y C-terminal diseñados para proteger el núcleo hidrofóbico común putativo del dominio repetitivo frente al solvente circundante. El análisis de las proteínas RI de mamífero reveló que la primera y la última unidad LRR diferían significativamente del consenso indicado anteriormente (ver las figs. 5c y 5d). Por simplicidad, las unidades de caperuza correspondientes del RI humano se clonaron con ligeras modificaciones y por lo tanto se denominan módulos de caperuza. De esta manera, se utilizaron los aminoácidos 1 a 28 para el módulo de caperuza N-terminal y los aminoácidos 427 a 460 del RI humano para el módulo C-terminal, y se introdujo un línker corto codificante de los residuos aminoácidos PYAR entre el módulo de caperuza N-terminal y las parejas de módulos repetitivos RI para adaptarse a los requisitos de longitud.

Al traducir inversamente el consenso de aminoácidos diseñado para formar una secuencia de ADN, se consideraron los parámetros siguientes: no se permitieron secuencias de reconocimiento de enzima de restricción no deseadas dentro de la pareja de módulos repetitivos y se optimizó la utilización de codones para la expresión en E. coli.

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6) Preparación de los plásmidos de expresión

Para obtener el módulo N-terminal flanqueado por sitios de digestión de restricción apropiados, se amplificó el ADN de pTRP-PRI (Lee y Vallee, 1989) con los oligonucleótidos MTS2 y MTS4 (Tabla 1), proporcionando el fragmento N de PCR. De esta manera, en el extremo 5' se introdujo un sitio NcoI y un sitio BamHI, mientras que el extremo 3' presentaba un sitio BssHI y un sitio HindIII. Se muestra el fragmento de ADN resultante con aminoácidos traducidos en el marco correcto (en la parte superior de la parte con caja en la fig. 8).

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Se ligó el fragmento N de PCR en los sitios NcoI e HindIII de pTFT7 4 (Ge et al., 1995), rindiendo el plásmido pTFT_N (fig. 9a). Simultáneamente, se introdujo una etiqueta Flag N-terminal y una etiqueta de 6xHis. Se derivaron varios vectores de pTFT_N para la inserción de los módulos repetitivos anteriormente indicados. La inserción NcoI-HindIII de pTFT_N se clonó en pQE60 (QIAgen, Hilden, Alemania) preparado con los mismos enzimas de digestión de restricción (proporcionando el plásmido pQE_N). La inserción BamHI-HindIII de pTFT_N (es decir, sin la etiqueta Flag N-terminal y la etiqueta 6xHis) se clonó en un derivado de pQE60 cadena abajo de la inserción del gen de la proteína D del fago lambda en el mismo marco de lectura, rindiendo un dominio repetitivo fusionado C-terminalmente (proporcionando el plásmido pQE-pD_N).

Los derivados pTFT presentan un promotor de T7 polimerasa bajo un operador lac, mientras que los derivados de pQE proporcionan un promotor de T5 polimerasa bajo el mismo sistema de control. Se seleccionó la proteína D del fago lambda como pareja de fusión N-terminal para incrementar la solubilidad y la expresión (Forrer y Jaussi, 1998).

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7) Síntesis de bibliotecas de módulos repetitivos

Se ensamblaron parcialmente los oligonucléotidos MTS7 y MTS9 a partir de trinucleótidos (Vimekäs et al., 1994); el resto de oligonucleótidos se sintetizó utilizando técnicas estándares.

La estrategia proporcionada posteriormente describe una manera de obtener polímeros de fragmentos de ADN en una dirección definida utilizando enzimas de restricción palindrómica y ligación. Una de estas posibilidades es la utilización de los enzimas de restricción BssHII y MluI (fig. 6), que crean extremos protuberantes compatibles. En el caso de que se religuen fragmentos de ADN con el mismo extremo protuberante pero diferentes sitios de reconocimiento originales, se forma un nuevo sitio combinado (denominado * en la fig. 6 y en las figs. 7a a 7c) que no puede digerirse con ninguno de los enzimas originales (fig. 6). Sin embargo, la ligación de extremos idénticos conduce al sitio de reconocimiento original y por lo tanto estas moléculas pueden distinguirse mediante digestión de restricción. Otras pare-
jas de enzimas de restricción con extremos protuberantes compatibles son bien conocidas por el experto en la materia.

La numeración de las etapas siguientes se refiere a la utilizada en las figuras 7a a c.

(Etapa I)

Para obtener una primera biblioteca de módulos repetitivos, los oligonucleótidos parcialmente aleatorizados MTS7, MTS8, MTS9 y MTS10 se ensamblaron mediante PCR y se amplificaron con un exceso molar de 10 veces de MTS11b y MTS14b en una etapa (95 grados durante 2 minutos, después 20 ciclos de 95 grados durante 15 segundos; 55 grados durante 15 segundos y 72 grados durante 20 segundos, seguido de 72 grados durante 1 minuto). En el caso de la biblioteca LRR indicada en la presente memoria, la PCR inicial ensambla la pareja A/B anteriormente indicada en un módulo. Se muestra el fragmento de ADN resultante con aminoácidos traducidos en el marco correcto (parte con caja en la fig. 8; se muestran los oligonucléotidos como flechas).

(Etapa II)

Tras la digestión de restricción extensiva separada con BamHI o con MluI o BssHII se realizó una ligación con T4 ligasa (1 hora a temperatura ambiente e inactivación por calor del enzima). El producto de ligación resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión. Se aisló la banda correspondiente al módulo repetitivo dímero y se recuperó el ADN tras digestión con \beta-agarasa mediante precipitación con etanol.

(Etapa III)

Para amplificar el dímero de módulos repetitivos, se llevó a cabo una segunda reacción de PCR con los cebadores T7pro y srpTFT1 (95 grados durante 2 minutos, después 15 ciclos de 95 grados durante 15 segundos; 50 grados durante 15 segundos, 72 grados durante 40 segundos, seguido de 72 grados durante 1 minuto). En el caso de la biblioteca de LRR, esta etapa proporcionó dos parejas A/B, es decir cuatro repeticiones ricas en leucinas. Debido a que se utilizó 1 microgramo de molde, correspondiente a aproximadamente 10^{12} moléculas, para la biblioteca de LRR, la diversidad teórica total todavía se encontraba cubierta en esta etapa.

(Etapa IV)

Para el tetrámero, el ADN obtenido se digirió nuevamente con BamHI y MluI o BssHII. Para polímeros más largos, se prepararon mezclas de fragmentos de ADN digeridos una vez y doblemente.

(Etapa V)

La ligación, la digestión de restricción y la purificación pueden repetirse hasta obtener el número deseado de módulos repetitivos.

(Etapa VI)

Para obtener un fragmento de ADN con dos sitios de digestión de restricción no compatibles diferentes en ambos extremos para la clonación dirigida y eficiente en un plásmido, se diseñó la estrategia de "adición de caperuza" siguiente. La unidad repetitiva C-terminal del RI humano también se amplificó a partir del plásmido pTRP-PRI mediante PCR, introduciendo de esta manera un sitio de restricción BssHII en el extremo 5' y un sitio de restricción HindIII en el extremo 3'. El fragmento de ADN resultante se muestra con los aminoácidos traducidos en el marco correcto (en la parte inferior de la parte con caja en la fig. 8). Se utilizaron los cebadores MTS5a y MTS3 en dicha reacción de PCR (95 grados durante 2 minutos, después 20 ciclos de 95 grados durante 15 segundos, 45 grados durante 15 segundos y 72 grados durante 10 segundos, seguido de 72 grados durante 1 minuto) y el producto se purificó con QIAquick y se digirió por restricción con BssHII.

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(Etapa VII)

El módulo repetitivo C-terminal digerido con BssHII se ligó a un polímero digerido con MluI utilizando la T4 ligasa (1 hora a temperatura ambiente e inactivación por calor del enzima). La digestión de restricción extensiva posterior con BssHII, MluI e HindIII determinó la orientación correcta de los módulos. La mezcla se separó mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión y se recuperaron las bandas deseadas tal como se ha indicado anteriormente. Finalmente, los fragmentos recuperados se ligaron en cualquiera de los plásmidos digeridos con BssHII-HindIII siguientes: pTFT_N, pTFT-pD_N, pQE_N o pQE-pD_N. La mezcla de ligación resultante se purificó mediante QIAquick y se utilizó para la electroporación de células XL10Gold preparadas según Sidhu et al. (2000).

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El protocolo anteriormente descrito resulta en bibliotecas diferentes de plásmidos y se muestran dos diagramas representativos de dichos plásmidos (figs. 9b y 9c).

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8) Caracterización de las bibliotecas de proteínas de módulos repetitivos

Se utilizaron técnicas estándares de secuenciación del ADN para determinar la secuencia de ADN de los plásmidos de expresión. A modo de ejemplo se proporciona la secuencia de ADN del clon D17 (comparar la expresión en las figs. 11c, 11d y 12d) (figs. 10a y 10b). Se indican el módulo N-terminal y los cuatro módulos repetitivos, así como el módulo C-terminal. La expresión se llevó a cabo esencialmente tal como se ha descrito ("QIAexpressionist" de QIAgen) y las proteínas solubles e insolubles de clones individuales y/o de grupos de clones tras la sonicación se separaron mediante análisis de SDS-PAGE y se tiñeron con Coomassie (figs. 11a-d). Se llevó a cabo análisis de transferencia western según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se utilizó el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma) para los constructos sin proteína D N-terminal, mientras que se utilizó anti-RGS-His (Qiagen) para los constructos con proteína D N-terminal (figs. 12a-d).

Las purificaciones (figs. 13 y 14), la espectrometría CD (fig. 15) y la cromatografía de exclusión por tamaño (fig. 16) se llevaron a cabo tal como se describe en el Ejemplo 2.

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9) Selección de (poli)péptidos/proteínas que inhiben toxinas bacterianas

Es conocido que diversas toxinas bacterianas se encuentran junto a la antitoxina correspondiente, ya que incluso un nivel moderado de toxina sola no puede ser tolerado por las bacterias. Por lo tanto, se clonó el gen de CcdB (Jensen et al., 1995) en un plásmido de bajo número de copia de la serie pZ con un promotor tetraciclina fuertemente reprimido en una cepa con represor de tetraciclina tal como DH5\alphaZ1 (Lutz y Bujard, 1997), XL10Gold o XL1Blue. En paralelo, se clonaron bamasa de tipo salvaje (Hartley, 1988) y el mutante bamasaH102K con 0,1% de actividad (Jucovic y Hartley, 1996). Se prepararon células químicamente competentes con uno de dichos plásmidos de toxina tal como se ha descrito (Inoue et al., 1990) y se prepararon células competentes para la electroporación que alojaban uno de dichos plásmidos de toxina tal como se ha descrito (Sidhu et al., 2000). Para la selección de plásmidos codificantes de una toxina, se transformaron células inhibidoras con la biblioteca basada en LRR, se sembraron en placas selectivas (medio LB suministrado con 50 mg/l de ampicilina, 20 mg/l de canamicina, IPTG 40 micromolar y 30 microgramos/l de anhidrotetraciclina) y se cultivaron a 25ºC o a 37ºC. Para confirmar que las propiedades de inhibición se encontraban asociadas al plásmido, se aislaron y transformaron nuevamente derivados de pQE.

Cribado para constructos de plegamiento eficiente

Se ha utilizado con éxito GFP como informador de plegamiento al encontrarse fusionado al extremo C-terminal de la proteína diana (Waldo et al., 1999). Las dianas de agregación rápida no permiten el plegamiento de GFP fusionado C-terminalmente y pueden cribarse colonias bajo luz UV. La fluorescencia de GFP se correlacionaba con la cantidad de proteína correctamente plegada. En la estrategia de los presentes inventores, se clonó GFP en los sitios NheI y EcoRI diseñados en el extremo C-terminal obtenido mediante amplificación por PCR utilizando MTS5a y MTS6 y nuevamente pTRP-PRI como molde. De esta manera, se introdujo un línker de 12 aminoácidos: GSAGSAAGSGEF. El fragmento de ADN resultante se muestra con los aminoácidos traducidos en el marco correcto (en la parte inferior de la fig. 8).

Selección de constructos sin codones de parada

Para reducir el número de desplazamientos de marco y de codones de parada tras la construcción de la biblioteca, los constructos se clonaron cadena arriba de un línker conectado al gen de resistencia al cloranfenicol y se seleccionaron clones viables en placas.

Selección de dianas ligantes utilizando técnicas de expresión

Para identificar parejas de unión in vitro, se utilizó tanto expresión ribosómica (Hanes et al., 1998) como expresión fágica (Dunn, 1996). Las parejas de unión eran ARNasa y onconasa (Wu et al., 1993b) de la superfamilia de la ARNasa y la proteína D (Forrer y Jaussi, 1998), un polipéptido pequeño no relacionado.

Selección de dianas ligantes utilizando el ensayo de complementación de proteínas

Para identificar parejas de unión, se fusionó una biblioteca genómica de E. coli con el fragmento DHFR1 (Pelletier et al., 1998), mientras que la biblioteca basada en LRR se fusionó contiguamente a DHFR2. La selección en placas de M9 que contenían trimetoprim condujo a las moléculas de interacción.

Barajado de módulos de ADN para la mejora de los constructos obtenidos

Para obtener mejoras evolutivas adicionales, los constructos obtenidos se sometieron a barajado del ADN (Stemmer, 1994) y retrocruzamiento. De esta manera, pudieron obtenerse enriquecimientos en las mejoras y eliminarse las mutaciones sin efecto.

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Ejemplo 2 Grupo de (poli)péptidos/proteínas que comprenden módulos repetitivos derivados de unidades repetitivas anquirina

Se describe un método para la generación de proteínas repetitivas anquirina diseñadas según la presente invención. El método permite la construcción de proteínas repetitivas anquirina de diversas longitudes mediante la utilización de un módulo de caperuza anquirina N-terminal, dos o varios módulos repetitivos anquirina y un módulo de caperuza anquirina C-terminal.

La definición del motivo repetitivo anquirina que era la base para la generación de un grupo de módulos repetitivos anquirina en el Ejemplo 1 se proporciona a continuación. El análisis que condujo al motivo repetitivo anquirina incluía la búsqueda en bases de datos públicas para proteínas repetitivas anquirina naturalmente existentes, así como el análisis estructural de las proteínas repetitivas anquirina de estructura tridimensional conocida. Mediante este análisis, se derivó un motivo de secuencia para los módulos repetitivos anquirina y se derivaron módulos de caperuza anquirina. Además, se determinaron las posiciones de los residuos esqueléticos y de interacción diana para el motivo repetitivo anquirina. Para generar una biblioteca de módulos repetitivos anquirina, se permitieron 17 de 20 aminoácidos naturales en las posiciones de los residuos de interacción diana en el motivo repetitivo anquirina. Cada una de las posiciones de los residuos esqueléticos se especificaron a determinados aminoácidos. Las secuencias peptídicas resultantes se traducieron inversamente de manera que el uso de codones fuese óptimo en Escherichia coli pero no crease sitios de restricción no deseados. Se diseñaron oligonucleótidos para permitir el ensamblaje mediante PCR de los módulos repetitivos anquirina. Se utilizaron oligonucleótidos trinucleótido (Virnekäs et al., 1994), así como oligonucleótidos convencionales (Tablas 2 y 3). De manera similar, se generaron módulos de caperuza anquirina N-terminal y C-terminal mediante PCR de ensamblaje utilizando oligonucleótidos convencionales (Tabla 2). La totalidad de los productos de PCR resultantes contenía sitios de reconocimiento de enzima de restricción de tipo II (fig. 17) en aquellos extremos que posteriormente se conectarían al ADN del módulo repetitivo (o de caperuza) siguiente/anterior (fig. 18). Al cortar con los enzimas de restricción respectivos, pudieron ligarse los extremos compatibles generados de los módulos en el mismo marco de una manera unidireccional. Por lo tanto, pudo ligarse el modulo de caperuza anquirina N-terminal a uno o varios módulos repetitivos anquirina y los productos de ligación pudieron ligarse al módulo de caperuza anquirina C-terminal. Debido a que el ADN difería en las posiciones definidas, el método permitió el ensamblaje simultáneo de un conjunto diverso de moléculas de ADN codificantes de un grupo de proteínas repetitivas anquirina. Los miembros de los grupos resultantes de proteínas repetitivas anquirina se caracterizaron mediante expresión, purificación, dicroísmo circular, espectroscopía, experimentos de desnaturalización, cromatografía de exclusión por tamaño, así como cristalización. Los experimentos demostraron que pueden expresarse miembros no seleccionados de dicha biblioteca de proteínas repetitivas anquirina en el ambiente reductor del citoplasma a niveles elevados en una conformación soluble y plegada.

Definición de la secuencia del motivo repetitivo anquirina

Procedimiento y resultado: el motivo repetitivo anquirina utilizado a modo de ejemplo para la presente invención se derivó a partir del análisis de secuencias de proteínas repetitivas anquirina, así como a partir del análisis estructural de las proteínas repetitivas anquirina de estructura tridimensional conocida (fecha: agosto de 2000).

En primer lugar se realizó una búsqueda en la base de datos SMART (Schultz et al., 2000) para secuencias de aminoácidos de unidades repetitivas anquirina. Una alineación Clustal-W (Thompson et al., 194) de 229 unidades repetitivas anquirina sirvió como molde para la determinación de un consenso "A" de unidad repetitiva anquirina (fig. 19). El consenso "A" se determinó mediante el cálculo de las frecuencias de los residuos para cada posición de la alineación de unidades repetitivas anquirina. Las 229 unidades repetitivas anquirina consideradas no contenía inserciones o deleciones en comparación con la secuencia de consenso de unidad repetitiva anquirina general proporcionada anteriormente (Sedgwick y Smerdon, 1999). Sin embargo, el consenso "A" incluía únicamente los residuos 3 a 32 (fig. 19) de la secuencia de consenso de 33 aminoácidos de longitud de Sedgwick y Smerdon (1999). Para afinar adicionalmente el consenso y definir las posiciones que faltaban, se llevó a cabo una búsqueda BLAST (Altschul et al., 1990) en GenBank (Benson et al., 2000) utilizando parámetros por defecto. Para esta búsqueda, se introdujo el consenso "A" en forma circularmente permutada con la posición 20 como el primer aminoácido (fig. 19). Las posiciones faltantes o ambiguas se llenaron con residuos que presentaban la frecuencia más alta en un consenso de unidades repetitivas anquirina de proteínas repetitivas anquirina de estructura tridimensional conocida (alineadas manualmente; las estadísticas fueron las indicadas anteriormente). Los primeros 200 de los aciertos resultantes en BLAST se alinearon manualmente y el consenso "A" de la unidad repetitiva anquirina se afinó mediante análisis de las frecuencias de los residuos tal como se ha indicado anteriormente, proporcionando el consenso "B" (fig. 19). El consenso "B" se confirmó mediante un análisis idéntico de la base de datos pfam (Bateman et al., 1999; datos no mostrados).

El consenso final "C" de la unidad repetitiva anquirina (fig. 19) se obtuvo mediante la integración de los métodos indicados en el presente párrafo. Se examinaron visualmente las estructuras tridimensionales publicadas de proteínas repetitivas anquirina para decidir adicionalmente qué aminoácidos resultan óptimos en una posición determinada. La estructura tridimensional que mostraba la homología más alta respecto al consenso "B" de la unidad repetitiva anquirina, la subunidad beta 1 de la proteína ligante de GA de ratón (AC: 2981726, pdb: 1 AWC; Batchelor et al., 1998) fue la guía en la mayoría de casos, aunque también se consideraron otras estructuras, tales como la p18 humana (AC: 4139830, pdb: 1IHB; Venkatamarani et al., 1998). La dependencia mutua de parejas, tripletes y cuadrupletes de aminoácidos en las secuencias de unidades repetitivas anquirina naturales también se utilizó para desarrollar o confirmar adicionalmente el consenso "B". Además, se han utilizado enfoques de modelado (paqueta InsightII, Informax Inc., USA) que incluyen el modelado de homologías y minimizaciones de energías, y se desarrolló la secuencia de consenso hacia una evitación óptima de cavidades y la optimización del empaquetamiento. Además se aseguró que la propensión en la estructura secundaria (O'Neil y DeGrado, 1990; Chou y Fasman, 1978) de cada residuo del consenso se correspondiese a la estructura secundaria en la posición correspondiente en las unidades repetitivas anquirina naturales. Además, se analizó la estructura secundaria y se verificó utilizando la predicción PhD (Rost, B., 1996). A continuación, se analizó la estabilidad de la proteína y la resistencia a proteasas utilizando PEST (Rogers et al., 1986; Swiss Institute of Bioinformatics, Suiza) y peptidesort de GCG (Accelrys, USA; Womble, D.D., 2000) y se predijo que el consenso era suficientemente estable. Los residuos críticos durante la definición del consenso "B" de la unidad repetitiva anquirina (fig. 19) como consenso "C" (fig. 19) fueron las posiciones 16, 17, 18, 19, 21, 22, 25 y 26. Se determinó finalmente que la posición 16 era una histidina, debido a que forma enlaces H enterrados desde su posición hasta la repetición anterior. La leucina en la posición 17 finalmente resultó preferente respecto a otros aminoácidos debido a que estabiliza la interfaz entre los dos módulos repetitivos. Se seleccionó el glutamato en la posición 18 debido a que se encuentran presentes glutamatos y aspartatos repetitivos en la p18 humana en esta posición. De manera similar, el glutamato en la posición 21 se encuentra en múltiples copias sucesivas en la proteína ligante de GA de ratón. La lisina 25 resultó preferente frente a otros aminoácidos debido a que los residuos básicos arginina y lisina también se encuentran presentes repetidamente en la proteína ligante de GA de ratón. Para la posición 26, se adoptó el compromiso de introducir cualquiera de entre los tres aminoácidos histidina, tirosina o asparagina, debido a que los tres aminoácidos satisfacen los requisitos para esta posición. De acuerdo con lo anterior, se ocuparon las posiciones 19 y 22 con isoleucina o valina y valina o leucina, respectivamente, debido a que estos residuos encajaban igualmente bien.

El consenso "C" de la unidad repetitiva anquirina finalmente determinado (fig. 19) sirvió como base para los módulos repetitivos anquirina. La secuencia del motivo repetitivo anquirina se muestra en la fig. 20. Por motivos relacionados con la clonación, el motivo se basa en un consenso "C" permutado circularmente. Con el fin de hacer corresponder el esquema de numeración del consenso utilizado en la fig. 19 con el utilizado por Sedgwick y Smerdon (1999), los números de las posiciones en el motivo repetitivo anquirina se permutaron circularmente en paralelo a la secuencia de aminoácidos. El motivo repetitivo anquirina presenta una longitud de 33 aminoácidos, de los que 27 posiciones se definió que eran residuos esqueléticos y 6 se definieron como residuos de interacción diana. Las posiciones de los residuos esqueléticos se definieron utilizando el consenso "C" de la unidad repetitiva anquirina. Los análisis de las estructuras tridimensionales demostraron que las posiciones 2, 3, 5, 13, 14 y 33 de las unidades repetitivas anquirina con frecuencia se encuentran implicadas en interacciones proteína-proteína y por lo tanto constituyen los residuos de interacción diana. Lo anterior también lo sugería la elevada variabilidad manifestada por estas posiciones durante la definición del consenso de la unidad repetitiva anquirina. Para los módulos repetitivos anquirina, se definió que estos residuos eran cualquiera de los 17 aminoácidos siguientes: A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y.

De esta manera, el número de miembros independientes del grupo de módulos repetitivos anquirina puede calcularse que es 3x17^{6}=72.412.707.

Definición de los módulos de caperuza anquirina

Procedimiento y resultado: debido a que el motivo repetitivo anquirina derivado mostraba una homología elevada respecto a la subunidad beta 1 de la proteína ligante de GA de ratón (GABP beta 1; AC: 2981726; Batchelor et al., 1998), se seleccionaron las unidades de caperuza repetitivas anquirina N-terminal y C-terminal (repeticiones 1 y 5 según Batchelor et al., 1998) de esta última proteína como base para los módulos de caperuza N-terminal y C-terminal. Los módulos de caperuza anquirina tanto N-terminal como C-terminal necesitaron modificarse, en contraste con las unidades de caperuza de proteína beta 1 ligante de GA de ratón. Se modificó la proteína beta 1 ligante de GA C-terminal en varias posiciones. Partes del bucle de la repetición 4 y la horquilla beta que conectaba las repeticiones 4 y 5 de la proteína beta 1 ligante de GA (Batchelor et al., 1998) necesitaron incluirse en el módulo de caperuza C-terminal por motivos relacionados con la clonación. De esta manera, se modificaron el bucle y la horquilla beta para encajar estéricamente el diseño del motivo repetitivo anquirina. Las modificaciones pueden observarse en la fig. 21, en la que se ha alineado GABP beta 1 con E3-5, un miembro de una biblioteca de proteínas según la presente invención (ver posteriormente).

Procedimientos experimentales

Para todas las secciones siguientes del Ejemplo A, se llevaron a cabo técnicas según protocolos descritos en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989; Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Laboratory Press, New York) o en los volúmenes 1 a 4 de Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. y Struhl, K. (1994; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York) o en los volúmenes 1 y 2 de Coligan, J.E., Dunn, B.M., Ploegh, H.L., Speicher, D.W. y Wingfield, P.T. (1995; Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc., New York).

Síntesis de ADN codificante de proteínas repetitivas anquirina según la presente invención

Procedimiento y resultado: los oligonucleótidos INT1 e INT2 se ensamblaron parcialmente a partir de trinucleótidos (Virnekas et al., 1994) y se obtuvieron de MorphoSys (Alemania). Todos los demás oligonucleótidos se sintetizaron utilizando técnicas estándares y eran de Microsynth (Suiza, ver las Tablas 2 y 3). Los oligonucleótidos para la amplificación del ADN se utilizaron a una concentración de la solución madre de 100 \muM, mientras que los utilizados como moldes se utilizaron a una concentración de la solución madre de 10 \muM. Los enzimas y tampones eran de New England Biolabs (USA) o de Fermentas (Lituania). La cepa de clonación era E. coli XL1-Blue (Stratagene).

Los módulos repetitivos anquirina se generaron mediante PCR de ensamblaje utilizando los oligonucleótidos INT1, INT2, INT3, INT4, INT5 e INT6a (1 \mul cada uno) [5 minutos a 95ºC, 20\cdot(30 segundos a 95ºC, 1 minuto a 50ºC, 30 segundos a 72ºC), 5 minutos a 72ºC] y ADN polimerasa Vent en su tampón estándar suplementado con MgSO_{4} 3,5 mM adicional en un volumen final de 50 \mul.

Se preparó el módulo de caperuza anquirina N-terminal mediante PCR de ensamblaje utilizando los oligonucleótidos EWT1, EWT2, TEN3 e INT 6 (1 \mul cada uno) [5 minutos a 95ºC, 30 (30 segundos a 95ºC, 1 minuto a 40ºC, 30 segundos a 72ºC), 5 minutos a 72ºC] y ADN polimerasa Vent en su tampón estándar en 50 \mul volumen de reacción. El ADN resultante se clonó mediante BamHI/HindIII en pQE30 (QIAgen, Alemania). La secuencia de ADN se verificó utilizando técnicas estándares. El módulo de caperuza anquirina C-terminal se preparó de acuerdo con lo anteriormente expuesto, aunque mediante la utilización de los oligonucleótidos WTC1, WTC2, WTC3 e INT5.

La ligación del ADN codificante de una proteína repetitiva anquirina a partir de módulos repetitivos anquirina individuales y módulos de caperuza repetitivos anquirina se representa esquemáticamente en la fig. 18. Para ensamblar las proteínas repetitivas anquirina, el modulo de caperuza anquirina N-terminal clonado se amplificó por PCR utilizando los oligonucleótidos TEN3 e INT6a (condiciones indicadas anteriormente para el módulo de caperuza anquirina N-terminal). El ADN se purificó utilizando el kit de purificación de ADN QIAquick (QIAgen, Alemania), se cortó con BsaI y se purificó nuevamente utilizando el mismo kit. A continuación, el módulo de caperuza anquirina N-terminal se ligó en el módulo repetitivo anquirina cortado con BpiI y purificado. Esta clonación direccional resultó posible debido a que las secuencias de corte de BpiI y BsaI, dos enzimas de restricción de tipo II que reconocen una secuencia de ADN diferente de la secuencia de corte (fig. 17) se seleccionaron para ser asimétricas aunque compatibles entre sí. El producto de ligación, denominado N1, se purificó en gel (LMP-agarosa, \beta-agarasa, precipitación con acetato sódico/etanol) y se amplificó por PCR utilizando los oligonucleótidos EWT3 e INT6b (1 \mul cada uno) [5 minutos a 95ºC, 20-(30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 50ºC, 30 segundos a 72ºC), 5 minutos a 72ºC] y ADN polimerasa Vent en su tampón estándar en 50 \mul de volumen de reacción. El producto amplificado se purificó utilizando QIAquick, se cortó con BsaI y se purificó nuevamente. La ligación posterior a módulos repetitivos anquirina cortados con BplI inició un nuevo ciclo de alargamiento que se repitió hasta añadir el número deseado de módulos repetitivos anquirina al módulo de caperuza anquirina N-terminal (denominado N2, N3, N4, etc.). A continuación, los fragmentos de ADN correspondientes a N2, N3 y N4 amplificados por PCR se cortaron con BsaI y se ligaron a un producto de PCR previamente cortado con BpiI del módulo de caperuza anquirina C-terminal clonado. Esto proporcionó moléculas de ADN codificantes de bibliotecas de proteínas repetitivas anquirina N2C, N3C y N4C. Los productos finales se amplificaron por PCR utilizando 1 \mul de cada uno de EWT3 y WTC3 [5 minutos a 95ºC, 25 (30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 50ºC, 1 minuto a 72ºC), 5 minutos a 72ºC] y se clonaron mediante BamHI/HindIII en pQE30 (QIAgen).

Expresión y purificación de proteínas

Procedimiento: se utilizó E. coli XL1-Blue (Stratagene) para la expresión de proteínas repetitivas anquirina de diferente longitud. Se seleccionaron aleatoriamente dos clones correspondientes a N2C (denominados E2-5 y E2-17), dos clones correspondientes a N3C (E3-5 y E3-19) y dos clones correspondientes a N4C (E4-2 y E4-8) y se analizaron adicionalmente. Se utilizaron 25 ml de cultivos estacionarios incubados durante la noche (LB, 1% de glucosa, 100 mg/l de ampicilina, 37ºC) de estos clones para inocular cultivos de 1 litro (mismo medio que el precultivo). A DO_{600}=0, 7, se indujeron los cultivos con IPTG 300 \muM durante cuatro horas. Se obtuvieron muestras en diferentes puntos del tiempo y se analizaron mediante SDS-PAGE (ver la fig. 22). Los cultivos se centrifugaron y los pellets resultantes se introdujeron en 40 ml de TBS500 (TrisHCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM) y se sonicaron. A continuación, los lisados se suplementaron con glicerol al 10% e imidazol 20 mM y se centrifugaron nuevamente. El sobrenadante resultante se utilizó para la purificación en una columna de etiqueta His (volumen de columna: 2,5 cl) siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAgen, Alemania).

Resultados: los experimentos de fraccionamiento celular mostraron que todas las proteínas repetitivas anquirina eran solubles, expresándose con rendimientos de 200 mg/l de cultivo (fig. 22). La purificación de la etiqueta His condujo a proteína pura en una única etapa de purificación (fig. 23). La integridad de las proteínas se confirmó adicionalmente mediante espectrometría de masas (no mostrada). La expresión soluble indica el plegamiento correcto de las proteínas repetitivas diseñadas.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Procedimiento: se analizaron las seis muestras purificadas indicadas anteriormente, en una columna Superdex 75 (Amersham Pharmacia Biotech, USA) utilizando un sistema SMART de Pharmacia a un caudal de 60 \mul/minuto y TBS 150 (TrisHCl 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM) como tampón de desplazamiento. Los estándares eran \beta-amilasa (Sigma) y las proteínas fágicas pD y SHP (Yang et al., 2000). A título de ejemplo, se muestra en la fig. 24 el perfil de elución de un miembro de la biblioteca de N3C, E3-5.

Resultados: el perfil de elución mostró que las proteínas investigadas eran en la mayoría de los casos exclusivamente monoméricas, mientras que un número menor de muestras de proteínas (E2-17 y E4-8) mostraban especies multimerizadas, aunque solubles, además de los monómeros. La retención medida mediante filtración en gel indicaba que las proteínas investigadas se encontraban plegadas y que no eran enrollamientos aleatorios.

Espectroscopía CD

Procedimiento: se registraron los espectros de dicroísmo circular de una proteína repetitiva anquirina seleccionada aleatoriamente, generada según la presente invención (E3-5, una molécula N3C), en tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 6,5 (nativo) o en tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 6,5 e hidrocloruro de guanidinio 6 M (desnaturalizado) utilizando un instrumento Jasco J-715 (Jasco, Japón; 10 nm/s, respuesta de 8 segundos, pitch de los datos: 0,2 nm, ancho de banda: 2 nm, 195 a 250 nm (nativo o 212 a 250 nm (desnaturalizado), tres acumulaciones, mediciones por triplicado, cubeta de 1 mm]. La señal CD se convirtió en elipticidad residual media utilizando la concentración de la muestra determinada espectrofotométricamente a 280 nm bajo condiciones desnaturalizantes.

Resultados: E3-5 muestra un espectro alfa-helicoidal bajo condiciones nativas con mínimos en 208 nm y en 222 nm. La estructura secundaria se perdió en hidrocloruro de guanidinio 6 M (fig. 25). Esto indica la formación correcta de los elementos de estructura secundaria de E3-5.

Comportamiento desnaturalizante

Procedimiento: se midió el comportamiento de desnaturalización de proteínas repetitivas anquirina seleccionadas aleatoriamente, generadas según la presente invención (E2-5, E3-5 y E4-8, fig. 22), mediante espectroscopía de dicroísmo circular básicamente tal como se indica en la fig. 25 aunque utilizando diferentes tampones. Se midieron las curvas de desnaturalización en hidrocloruro de guanidinio mediante espectroscopía CD a 220 nm utilizando las diferentes proteínas incubadas bajo concentraciones diferentes de hidrocloruro de guanidinio en NaPO_{4} 20 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM, durante la noche a temperatura ambiente. Se midió la señal de dicroísmo circular a 220 nm para cada muestra por triplicado.

Resultados: se muestran en la fig. 26 las curvas de desnaturalización de E2-5, E3-5 y E4-8 frente a diferentes concentraciones de hidrocloruro de guanidino. El punto medio de desnaturalización se encuentra comprendido en el intervalo de hidrocloruro de guanidinio de entre 2,5 y 3,8 M. Por lo tanto, la estructura secundaria se pierde a concentraciones elevadas de agente desnaturalizante, indicando una estabilidad relativamente alta de las moléculas investigadas.

Cristalización

Procedimiento y resultado: la proteína repetitiva anquirina E3-5, un miembro de la biblioteca N3C según la presente invención, se cristalizó en PEG 6000 al 20%, MES/NaOH 100 mM, pH 6,0, durante cinco días a 20ºC, microgota colgante (2 \mul de proteína y 2 \mul de tampón mezclado; 500 \mul de reservorio de tampón) a partir de una solución de 9 mg de proteínas por ml en TBS 50 (TrisHCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, ver la fig. 27). El cristal refractaba a 3 A en experimentos preliminares de rayos X (no mostrados).

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Tablas

Tabla 1:

oligonucleótidos utilizados para la clonación de la biblioteca derivada de RI humano,

Tabla 2:

oligonucleótidos utilizados para la generación de módulos repetitivos anquirina según el Ejemplo 2,

Tabla 3:

oligonucleótidos utilizados para la generación de los módulos de caperuza anquirina N-terminal y C-terminal, así como para la clonación de proteínas repetitivas anquirina que contienen más de un módulo repetitivo anquirina según la presente invención.

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TABLA 2 Oligonucleótidos utilizados para la generación de módulos repetitivos anquirina según el Ejemplo 2

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TABLA 3 Oligonucleótidos utilizados para la generación de los módulos de caperuza anquirina N-terminal y C-terminal, así como para la clonación de proteínas repetitivas anquirina que contienen más de un módulo repetitivo anquirina

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Claims (49)

1. Grupo de moléculas de ácidos nucleicos codificantes de un grupo de proteínas repetitivas, comprendiendo cada proteína repetitiva un dominio repetitivo, que comprende un conjunto de módulos repetitivos consecutivos y un módulo de caperuza N-terminal y/o C-terminal que presenta una secuencia de aminoácidos diferente de cualquiera de dichos módulos repetitivos, en el que dichos módulos repetitivos presentan el mismo plegamiento y se apilan estrechamente para crear una estructura superhelicoidal que presenta un núcleo hidrofóbico común, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos se deriva de una o más unidades repetitivas de una familia de proteínas repetitivas naturales, en el que dichas unidades repetitivas comprende residuos esqueléticos y residuos de interacción diana, en el que dichas proteínas repetitivas difieren en por lo menos una posición aminoácida de un residuo de interacción diana de los módulos repetitivos, y en el que dicha derivación de cada uno de dichos módulos repetitivos se lleva a cabo mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

(a)

identificar dichas unidades repetitivas,

(b)

determinar un motivo de secuencia repetitiva mediante análisis estructural y de secuencias de dichas unidades repetitivas, en el que dicho motivo de secuencia repetitiva comprende posiciones de residuo esquelético y posiciones de residuo de interacción diana, que corresponden a las posiciones de los residuos esqueléticos y los residuos de interacción diana en dichas unidades repetitivas, y

(c)

construir el módulo repetitivo, de manera que comprende el motivo de secuencia repetitiva de (b).

2. Grupo según la reivindicación 1, en el que dicho motivo repetitivo de la etapa (b) contiene por lo menos una posición aleatorizada correspondiente a una posición de un residuo de interacción diana de dichas unidades
repetitivas.

3. Grupo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho análisis de secuencia de la etapa (b) implica la provisión de una secuencia de consenso mediante la alineación de las secuencias de aminoácidos de dichas unidades repeti-
tivas.

4. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos presenta una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos 70% de los residuos aminoácidos corresponden a:

(i) los residuos aminoácidos de consenso deducidos a partir de los residuos aminoácidos presentes en las posiciones correspondientes de por lo menos dos unidades repetitivas naturales, o

(ii) los residuos aminoácidos presentes en las posiciones correspondientes en una unidad repetitiva natural.

5. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho conjunto consiste de entre dos y aproximadamente 30 módulos repetitivos.

6. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichos módulos repetitivos se encuentran conectados directamente.

7. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos módulos repetitivos se encuentran conectados mediante un línker (poli)péptido.

8. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas unidades repetitivas son repeticiones anquirina.

9. Grupo según la reivindicación 8, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende el motivo de secuencia repetitiva anquirina DxxGxTPLHLAaxxtt\pm\pm\pm\pmt\pm\pm\pmGpxpaVpxLLpxGA\pmt\pm\pmtDVNAx, en la que "x" se refiere a cualquier aminoácido, "\pm" se refiere a cualquier aminoácido o a una deleción, "a" se refiere a un aminoácido con una cadena lateral apolar, y "p" se refiere a un residuo con una cadena lateral polar.

10. Grupo según la reivindicación 8, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende el motivo de secuencia repetitiva anquirina DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx, en el que "x" se refiere a cualquier aminoácido.

11. Grupo según la reivindicación 8, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende el motivo de secuencia repetitiva anquirina DxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNAx, en el que "x" se refiere a cualquier aminoácido.

12. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que una o más de las posiciones denominadas "x" se encuentra aleatorizada.

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13. Grupo según la reivindicación 8, en el que cada uno de dichos módulos repetitivos comprende el motivo de secuencia repetitiva anquirina siguiente: D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1, en la que 1 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y, en el que 2 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: H, N e Y.

14. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas unidades repetitivas son repeticiones ricas en leucinas (LRR).

15. Grupo según la reivindicación 14, en el que cada uno de dichos módulos comprende el motivo de secuencia LRR siguiente: xLxxLxLxxN+xaxx+a++++a++a\pm\pmx\pm\pm, en el que "x" se refiere a cualquier aminoácido, "a" se refiere a un aminoácido alifático y "\pm" se refiere a cualquier aminoácido o a una deleción.

16. Grupo según la reivindicación 14, en el que por lo menos uno de dichos módulos comprende el motivo de secuencia LRR siguiente: xLExLxLxxCxLTxxxCxxLxxaLxxxx, en el que "x" se refiere a cualquier aminoácido y "a" se refiere a un aminoácido alifático (LRR de tipo A).

17. Grupo según la reivindicación 14, en el que por lo menos uno de dichos módulos comprende el motivo de secuencia LRR siguiente: xLxELxLxxNxLGDxGaxxLxxxLxxPxx, en el que "x" se refiere a cualquier aminoácido y "a" se refiere a un aminoácido alifático (LRR de tipo B).

18. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que una o más de las posiciones denominadas "x" y/o "\pm" se ha aleatorizado.

19. Grupo según la reivindicación 16, en el que el residuo cisteína en la posición 10 en la secuencia de consenso LRR de tipo A se ha sustituido por un residuo aminoácido hidrofílico, y en el que el residuo cisteína en la posición 17 se ha sustituido por un residuo aminoácido hidrofóbico.

20. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 ó 15 a 19, en el que uno o más de los residuos aminoácidos en dichas secuencias de consenso se ha intercambiado por un residuo aminoácido presente en la posición correspondiente en una unidad repetitiva natural correspondiente.

21. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicho conjunto consiste de un tipo de módulo repetitivo.

22. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicho conjunto consiste de dos tipos diferentes de módulos repetitivos.

23. Grupo según la reivindicación 21, en el que dicho conjunto comprende dos tipos diferentes de módulos repetitivos consecutivos como parejas en dicho dominio repetitivo.

24. Grupo según la reivindicación 22 ó 23, en el que dichos dos tipos diferentes de módulos están basados en dichas LRR de tipo A y LRR de tipo B.

25. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que las secuencias de aminoácidos de los módulos repetitivos comprendidos en dicho conjunto son idénticas para cada uno de dichos tipos, excepto para los residuos aleatorizados.

26. Grupo según la reivindicación 25, en el que las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las copias de cada uno de dichos tipos son idénticas excepto para los codones codificantes de residuos aminoácidos en posiciones que se aleatorizan.

27. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos comprenden secuencias de ácidos nucleicos idénticas de por lo menos 9 nucleótidos entre dichos módulos repetitivos.

28. Grupo según la reivindicación 23 ó 24, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos comprenden secuencias de ácidos nucleicos idénticas de por lo menos 9 nucleótidos entre dichas parejas.

29. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que cada una de las secuencias de ácidos nucleicos entre dichos módulos, o dichas parejas, comprende una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción.

30. Grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que cada una de las secuencias de ácidos nucleicos entre dichos módulos, o dichas parejas, comprende una secuencia de ácidos nucleicos formada a partir de extremos cohesivos creados por dos enzimas de restricción compatibles.

31. Grupo según la reivindicación 27 ó 28, en el que dichas secuencias de ácidos nucleicos idénticas permiten un ensamblaje basado en PCR de dichas moléculas de ácidos nucleicos.

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32. Grupo según la reivindicación 25, en el que dicho dominio repetitivo comprende una o más parejas de módulos basadas en dichas LRR de tipo A y de tipo B, en las que cada una de dichas parejas presenta la secuencia siguiente:

15

en la que 1 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: D, E, N, Q, S, R, K, W e Y,

en la que 2 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: N, S y T,

en la que 3 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: G, S, D, N, H y T, y

en la que 4 representa un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: L, V y M.

\vskip1.000000\baselineskip

33. Grupo según la reivindicación 32, en el que cada una de dichas parejas de módulos está codificada por la molécula de ácidos nucleicos siguiente:

16

en la que 111 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: D, E, N, Q, S, R, K, W e Y,

en la que 222 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: N, S y T,

en la que 333 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: G, S, D, N, H y T, y

en la que 444 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: L, V y M.

\vskip1.000000\baselineskip

34. Grupo según la reivindicación 32, en el que uno o más de los residuos aminoácidos en por lo menos una de dichas parejas de módulos se ha intercambiado por un residuo aminoácido presente en la posición correspondiente en una LRR natural.

35. Grupo según la reivindicación 33, en el que uno o más de los codones de aminoácido en por lo menos una de dichas parejas de módulos se ha intercambiado por un codón codificante de un residuo aminoácido presente en la posición correspondiente en una LRR natural.

36. Grupo de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que comprende un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según cualquier de las reivindicaciones 1 a 35.

37. Grupo de vectores que comprende un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, o un grupo de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes según la reivindicación 36.

38. Grupo de células huésped que comprende un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, un grupo de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes según la reivindicación 36, o un grupo de vectores según la reivindicación 37.

39. Grupo de proteínas repetitivas codificadas por un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, por un grupo de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes según la reivindicación 36, por un grupo de vectores según la reivindicación 37, o producidas por un grupo de células huésped según la reivindicación 38.

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40. Método para la construcción de un grupo de moléculas de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, que comprende las etapas siguientes:

(a)

identificar una unidad repetitiva de una familia de proteínas repetitivas,

(b)

identificar residuos esqueléticos y residuos de interacción diana en dicha unidad repetitiva,

(c)

deducir por lo menos un tipo de módulo repetitivo que comprende residuos esqueléticos y residuos de interacción diana aleatorizados a partir de por lo menos un miembro de dichas familia de proteínas repetitivas, y

(d)

construir moléculas de ácidos nucleicos codificantes cada una de una proteína repetitiva que comprende dos o más copias de dicho tipo o tipos de módulos repetitivos deducidos en la etapa (c).

41. Método según la reivindicación 40, en el que dicho módulo o módulos repetitivos deducidos en la etapa (c) presenta una secuencia de aminoácidos, en la que por lo menos 70% de los residuos aminoácidos corresponden a:

(i)

residuos de aminoácidos de consenso deducidos a partir de los residuos aminoácidos presentes en las posiciones correspondientes de por lo menos dos unidades repetitivas naturales, o

(ii)

los residuos aminoácidos presentes en las posiciones correspondientes en una unidad repetitiva natural.

42. Método para la producción de un grupo de proteínas repetitivas según la reivindicación 39, que comprende las etapas siguientes:

(a)

proporcionar un grupo de células huésped según la reivindicación 38, y

(b)

expresar el grupo de moléculas de ácidos nucleicos comprendidas en dichas células huésped.

43. Método para la obtención de una proteína repetitiva que presenta una propiedad predeterminada, que comprende las etapas siguientes:

(a)

proporcionar un grupo de proteínas repetitivas según la reivindicación 39 ó 40 o producidas según la reivindicación 42, y

(b)

cribar dicho grupo y/o seleccionar de dicho grupo para obtener por lo menos una proteína repetitiva que presente dicha propiedad predeterminada.

44. Método según la reivindicación 43, en el que dicha propiedad predeterminada es la unión a una diana.

45. Proteína repetitiva de un grupo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en la que dicha proteína repetitiva presenta una propiedad predeterminada.

46. Molécula de ácidos nucleicos codificante de la proteína repetitiva según la reivindicación 45.

47. Vector que contiene la molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 46.

48. Composición farmacéutica que comprende la proteína repetitiva según la reivindicación 45 o la molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 46, y opcionalmente un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

49. Molécula de ácidos nucleicos codificante de una pareja de módulos repetitivos para la construcción de un grupo según la reivindicación 32 ó 33, en la que dicha molécula de ácidos nucleicos es:

17

en la que 111 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: D, E, N, Q, S, R, K, W e Y,

en la que 222 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: N, S y T,

en la que 333 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: G, S, D, N, H y T, y

en la que 444 representa un codón codificante de un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo siguiente: L, V y M.