ES2884117T3 - Optimización de la solubilidad de inmunoaglutinantes - Google Patents

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Abstract

Un inmunoaglutinante que comprende el siguiente motivo potenciador de la solubilidad en las posiciones 12, 103 y 144 de los aminoácidos (numeración AHo) de la cadena pesada: (a1) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada; (b1) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y (c1) serina (S) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o (a2) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada; (b2) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y (c2) treonina (T) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada, en donde el inmunoaglutinante es un anticuerpo scFv, una inmunoglobulina de longitud completa o un nanocuerpo.

Description

DESCRIPCIÓN
Optimización de la solubilidad de inmunoaglutinantes
Antecedentes de la invención
Se ha mostrado que los anticuerpos son agentes terapéuticos muy eficaces y exitosos en el tratamiento del cáncer, enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos. Aunque normalmente se han usado de forma clínica anticuerpos de longitud completa, existen varias ventajas que puede proporcionar el uso de un fragmento de anticuerpo, tal como una mayor penetración tisular, ausencia de la función efectora de Fc combinada con la capacidad de añadir otras funciones efectoras y la probabilidad de efectos secundarios menos sistémicos resultantes de una semivida in vivo sistémica más corta. Las propiedades farmacocinéticas de los fragmentos de anticuerpos indican que pueden ser particularmente adecuados para enfoques terapéuticos locales. Asimismo, los fragmentos de anticuerpos pueden ser más fáciles de producir que los anticuerpos de longitud completa en determinados sistemas de expresión.
Un tipo de fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monocatenario (scFv), que se compone de un dominio variable de cadena pesada (Vh) conjugado con un dominio variable de cadena ligera (Vl) a través de una secuencia conectora. Por tanto, los scFv carecen de todos los dominios de región constante del anticuerpo y los restos de aminoácidos de la interfaz anterior del dominio variable/constante (restos interfaciales) quedan expuestos al disolvente. Se puede preparar un scFv a partir de un anticuerpo de longitud completa (p. ej., molécula de IgG) mediante técnicas de ingeniería recombinante establecidas. La transformación de un anticuerpo de longitud completa en un scFv, sin embargo, da lugar, con frecuencia, a una mala estabilidad y solubilidad de la proteína, bajos rendimientos de producción y alta tendencia a la agregación, lo que aumenta el riesgo de inmunogenicidad.
Por consiguiente, se han hecho intentos para mejorar propiedades tales como la solubilidad de scFv. Por ejemplo, Nieba, L. et al. (Prot. Ing. (1997) 10: 435-444) seleccionaron tres restos de aminoácidos que se sabe que son restos interfaciales y los mutaron. Observaron un aumento de la expresión periplásmica del scFv mutado en bacterias, así como una menor tasa de agregación inducida térmicamente, aunque la estabilidad termodinámica y la solubilidad no se alteraron significativamente. Por otra parte, en su publicación, declaran expresamente que no observaron ninguna mejora de la solubilidad del estado de la proteína nativa de los scFv modificados genéticamente según lo determinado por el método de precipitación con PEG. Jung et al. (J. Mol. Biol. (1999) 294: 163-180) describen el uso de una combinación de mutagénesis directa y aleatoria para generar una biblioteca de mutantes basada en el fragmento Fv monocatenario (scFv) 4D5Flu. Las posiciones de aminoácidos aleatorizadas en la biblioteca de presentación de fagos 4D5Flu para la optimización del plegamiento y la estabilidad in vivo incluyen las posiciones de restos 11, 89 y 108 (numeración de Kabat). También se ha informado de otros estudios en los que se llevó a cabo mutagénesis dirigida en restos de aminoácidos particulares dentro del scFv (véase p. ej., Tan, P. H. et al. (1988) Biophys. J. 75: 1473-1482; Worn, A. y Pluckthun, A. (1998) Biochem. 37: 13120-13127; Worn, A. y Pluckthun, A. (1999) Biochem. 38: 8739-8750). En estos diversos estudios, los restos de aminoácidos seleccionados para la mutagénesis se eligieron basándose en sus posiciones conocidas dentro de la estructura de scFv (p. ej., a partir de estudios de modelado molecular).
En otro enfoque, las regiones determinantes de complementariedad (Complementarity Determining Regions, CDR) de un scFv muy poco expresado se injertaron en las regiones marco conservadas de un scFv que se había demostrado que tenía propiedades favorables (Jung, S. y Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10: 959-966). El scFv resultante mostró mejor expresión soluble y estabilidad termodinámica.
El progreso en la ingeniería de scFv para mejorar la solubilidad y otras propiedades funcionales se revisa en, por ejemplo, Worn, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 305: 989-1010. Sin embargo, aún son necesarios nuevos enfoques que permitan el diseño racional de inmunoaglutinantes, en particular de scFv con solubilidad superior. Por otra parte, aún son necesarios métodos de ingeniería de scFv y otros tipos de anticuerpos, para transmitir de este modo mejor solubilidad, especialmente la solubilidad de la proteína nativa.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un inmunoaglutinante (en inglés “immunobinder’) que comprende un motivo potenciador de la solubilidad en la región de cadena pesada variable VH, así como los métodos de ingeniería de inmunoaglutinantes, tales como anticuerpos scFv, para conferir una mejor solubilidad. Los métodos de la divulgación comprenden la sustitución de aminoácidos en una secuencia de la región de cadena pesada variable y/o la región de cadena ligera variable de un inmunoaglutinante que son potencialmente problemáticos para la solubilidad por restos de aminoácidos preferidos que confieren mejor solubilidad. Por ejemplo, en determinados aspectos, un resto hidrófobo se sustituye por un resto hidrófilo.
El inmunoaglutinante proporcionado, el inmunoaglutinante usado en, o producido por, los métodos de ingeniería de la divulgación pueden ser un scFv, pero también se pueden diseñar otros inmunoaglutinantes, tales como inmunoglobulinas de longitud completa, fragmentos Fab, anticuerpos de dominio único (p. ej., Dabs) y nanocuerpos según el método. La invención también abarca inmunoaglutinantes preparados según el método de ingeniería, así como composiciones que comprenden los inmunoaglutinantes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención está definida por las reivindicaciones.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un inmunoaglutinante que comprende uno de los siguientes motivos potenciadores de la solubilidad en las posiciones 12, 103 y 144 de los aminoácidos de cadena pesada (numeración AHo):
(a) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b) serina (S) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c) treonina (T) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o
(a1) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b1) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c1) serina (S) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o
(a2) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b2) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c2) treonina (T) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o
(a3) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b3) serina (S) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c3) serina (S) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método de diseño de un inmunoaglutinante, comprendiendo el inmunoaglutinante (i) una región variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma, la región variable de cadena pesada que comprende restos de marco conservado Vh y/o (ii) una región variable de cadena ligera, o un fragmento de la misma, la región variable de cadena ligera que comprende restos de marco conservado de Vl, comprendiendo el método:
A) seleccionar al menos dos posiciones de aminoácidos dentro de los restos de marco conservado de V h, los restos de marco conservado de Vl o los restos de marco conservado de Vh y Vl para mutación; y
B) mutar las al menos dos posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación, en donde si las al menos dos posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación están dentro de los restos de marco conservado de Vh, la sustitución está en una o más posiciones de aminoácidos de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en 12, 103 y 144 (según la convención de numeración AHo) y/o
en donde, si la o las posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación están dentro de los restos de marco conservado de Vl, la sustitución está en una posición de aminoácido de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en 15, 52 y 147 (según la convención de numeración AHo; posiciones de aminoácidos 15, 44 y 106 usando numeración de Kabat).
Las al menos dos posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación y el resto o los restos de aminoácidos insertados en la posición o posiciones seleccionadas se describen con más detalle a continuación. La numeración de la posición de aminoácidos expuesta a continuación usa el sistema de numeración AHo; las posiciones correspondientes usando el sistema de numeración de Kabat se describen adicionalmente en el presente documento y las tablas de conversión para los sistemas de numeración AHo y Kabat se exponen a continuación en la descripción detallada. Los restos de aminoácidos se exponen usando un código de abreviatura convencional de una letra.
Sorprendentemente, se ha descubierto que la presencia de las mutaciones indicadas en las posiciones indicadas aumenta la solubilidad global del inmunoaglutinante sin tener una influencia negativa sobre otras propiedades funcionales de la proteína. Por ejemplo, en el caso de la combinación de las tres mutaciones potenciadoras de la solubilidad V12S, L144S y V103T en el VH de un scFv, se descubrió que dichas sustituciones representan aproximadamente el 60 % de la solubilidad total del scFv. Esto difiere de los intentos establecidos en la técnica anterior para aumentar el rendimiento de expresión de los inmunoaglutinantes. Por ejemplo, el documento US6815540 describe la modificación de un inmunoaglutinante mediante la disminución de la hidrofobicidad en una región de interfaz entre dominios intracatenarios. Para dicho fin, se identificaron 16 posiciones en el marco conservado de cadena pesada variable que pueden estar sustituidas individualmente por uno o más aminoácidos seleccionados de un grupo de 10 aminoácidos. Se ha descubierto que se aumentó el rendimiento de expresión de los mutantes generados. Por otra parte, el mismo grupo de investigación publicó en 1999, es decir, tres años después de la fecha de prioridad de la patente estadounidense mencionada, un artículo (véase Jung, S., Honegger, A. y Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10: 959-966) que indica que en varios estudios se ha informado de que la sustitución de restos superficiales hidrófobos por otros más hidrófilos mejora el rendimiento de la producción. Según los autores, el aumento del rendimiento de la producción se debe a una mejor distribución cinética entre el plegamiento correcto y la agregación de material plegado erróneamente, mientras que la solubilidad de la proteína nativa ni siquiera se ve afectada, ni su estabilidad termodinámica de manera significativa. Por lo tanto, resulta evidente para el experto en la materia que el parámetro de solubilidad al que hacen referencia Plückthun et al. se refiere únicamente a la expresión soluble y no a la solubilidad global de la proteína nativa.
Breve descripción de las figuras
La invención se entenderá mejor y resultarán evidentes objetos distintos de los expuestos anteriormente cuando se considere la siguiente descripción detallada de la misma. Dicha descripción hace referencia a los dibujos anexos, en donde:
La figura 1 representa las curvas de solubilidad de precipitación con PEG de ESBA105 de tipo silvestre (E105) y variantes de solubilidad del mismo.
La figura 2 representa los perfiles de desnaturalización térmica para ESBA105 de tipo silvestre (E105) y variantes de solubilidad del mismo, medidos después de la termoexposición a una amplia gama de temperaturas (25-96 °C).
La figura 3 representa un gel SDS-PAGE que muestra el comportamiento de degradación de diversos mutantes de solubilidad de ESBA105 después de dos semanas de incubación en condiciones de tensión térmica.
La figura 4 representa las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y sus variantes optimizadas determinadas por análisis de FTIR.
La figura 5 muestra la estabilidad térmica de 578min-max y 578min-max_DHP medida por FT-IR.
Las Figuras 6a y 6b ilustran la solubilidad de 578min-max y 578min-max_DHP determinada por precipitación con sulfato de amonio.
Descripción detallada de la invención
La divulgación se refiere a métodos para mejorar la solubilidad de los inmunoaglutinantes. De manera más específica, en el presente documento se desvelan métodos para optimizar los inmunoaglutinantes mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos dentro del inmunoaglutinante que mejoran la solubilidad del inmunoaglutinante. La divulgación también se refiere a inmunoaglutinantes modificados, p. ej., scFv, producidos según los métodos descritos en el presente documento.
Para que la invención se entienda más fácilmente, en primer lugar, se definen determinados términos. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque en la práctica o ensayo de la invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, es sinónimo de "inmunoglobulina". Los anticuerpos según la presente divulgación pueden ser inmunoglobulinas completas o fragmentos de las mismas, que comprenden al menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tal como dominios variables individuales, Fv (Skerra A. y Pluckthun, A. (1988) Science 240: 1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242: 423-26: Huston, J. S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83), Fab, (Fab')2 u otros fragmentos bien conocidos por un experto en la materia.
La expresión "marco conservado de anticuerpo" o "marco conservado" como se usa en el presente documento se refiere a la parte del dominio variable, ya sea VL o VH, que actúa como armazón para los bucles de unión a antígeno de este dominio variable (Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Publicación del NIH 91-3242).
La expresión "CDR de anticuerpo" o "CDR" como se usa en el presente documento se refiere a las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo que consisten en los bucles de unión a antígeno como se definen en Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Publicación del NIH 91-3242). Cada uno de los dos dominios variables de un fragmento Fv de anticuerpo contiene, por ejemplo, tres CDR.
La expresión "anticuerpo de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a una molécula que comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo (Vh) y una región variable de cadena ligera de anticuerpo (Vl) conectado por un conector. Dichas moléculas de scFv pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-conector-VH-COOH o NH2-Vhconector-VL-COOH.
Como se usa en el presente documento, "identidad" se refiere a la coincidencia de secuencias entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina o una posición en cada uno de dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las moléculas respectivas son idénticas en dicha posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si coinciden 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias, entonces las dos secuencias tienen una identidad del 60 %. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten el 50 % de identidad (3 de las 6 posiciones totales coinciden). En general, se realiza una comparación cuando se alinean dos secuencias para proporcionar la máxima identidad. Dicha alineación se puede proporcionar usando, por ejemplo, el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, implementado convenientemente por programas informáticos, tales como el programa Align (DNAstar, Inc.).
Las secuencias "similares" son aquellas que, cuando se alinean, comparten restos de aminoácidos idénticos y similares, donde los restos similares son sustituciones conservadoras de restos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. En este sentido, una "sustitución conservativa" de un resto en una secuencia de referencia es una sustitución que es física o funcionalmente similar al resto de referencia correspondiente, p. ej., que tiene un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares semejantes. Por tanto, una secuencia "modificada por sustitución conservadora" es una que se diferencia de una secuencia de referencia o una secuencia de tipo silvestre por que están presentes una o más sustituciones conservadoras. El "porcentaje de similitud" entre dos secuencias es una función del número de posiciones que contienen restos coincidentes o sustituciones conservadoras compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas y multiplicado por un factor 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservadoras, entonces las dos secuencias tienen 80 % de similitud positiva.
"Secuencia consenso de aminoácidos", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos que se puede generar usando una matriz de al menos dos, y preferentemente más, secuencias de aminoácidos alineadas y permitiendo huecos en la alineación, de modo que sea posible determinar el resto de aminoácido más frecuente en cada posición. La secuencia consenso es la secuencia que comprende los aminoácidos que se representan con mayor frecuencia en cada posición. En el caso de que dos o más aminoácidos estén igualmente representados en una sola posición, la secuencia consenso incluye ambos o todos esos aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de una proteína se puede analizar a diversos niveles. Por ejemplo, la conservación o la variabilidad pueden presentarse al nivel de resto individual, múltiples restos, múltiples restos con huecos, etc. Los restos pueden presentar conservación del resto idéntico o pueden estar conservados al nivel de clase. Los ejemplos de clases de aminoácidos incluyen la clase de aminoácidos con cadenas laterales polares pero sin carga o grupos R (serina, treonina, asparagina y glutamina); con grupos R con carga positiva (lisina, arginina e histidina); con grupos R con carga negativa (ácido glutámico y ácido aspártico); con grupos R hidrófobos (alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina); y la clase de aminoácidos especiales (cisteína, glicina y prolina). Los expertos en la técnica conocen otras clases y estas pueden definirse usando determinaciones estructurales u otros datos para evaluar la sustituibilidad. En ese sentido, un aminoácido sustituible puede referirse a cualquier aminoácido que pueda sustituirse y mantener la conservación funcional en esa posición.
Se reconocerá, sin embargo, que los aminoácidos de la misma clase pueden variar en grado según sus propiedades biofísicas. Por ejemplo, se reconocerá que determinados grupos R hidrófobos (p. ej., alanina, serina o treonina) son más hidrófilos (es decir, de mayor hidrofilia o menor hidrofobicidad) que otros grupos R hidrófobos (p. ej., valina o leucina). La hidrofilia o hidrofobicidad relativa se pueden determinar usando métodos reconocidos en la técnica (véase, p. ej., Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) y Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
Como se usa en el presente documento, cuando una secuencia de aminoácidos (p. ej., una primera secuencia Vh o Vl) está alineada con una o más secuencias de aminoácidos adicionales (p. ej., una o más secuencias de VH o VL en una base de datos), una posición de aminoácido en una secuencia (p. ej., la primera secuencia de V h o Vl) se puede comparar con una "posición correspondiente" en una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Como se usa en el presente documento, la "posición correspondiente" representa la posición equivalente en la secuencia o secuencias que se comparan cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, es decir, cuando las secuencias se alinean para lograr el mayor porcentaje de identidad o porcentaje de similitud.
Como se usa en el presente documento, la expresión "base de datos de anticuerpos" se refiere a una colección de dos o más secuencias de aminoácidos de anticuerpos (una "multiplicidad" de secuencias) y normalmente se refiere a una colección de decenas, cientos o incluso miles de secuencias de aminoácidos de anticuerpos. Una base de datos de anticuerpos puede almacenar secuencias de aminoácidos de, por ejemplo, una colección de regiones V H de anticuerpo, regiones Vl de anticuerpo o ambas o puede almacenar una colección de secuencias de scFv compuestas por regiones Vh y Vl. Preferentemente, la base de datos se almacena en un medio fijo consultable, tal como en un ordenador dentro de un programa informático consultable. La base de datos de anticuerpos puede ser una base de datos que comprende o consiste en secuencias de anticuerpos de la línea germinal. Además, la base de datos de anticuerpos puede ser una base de datos que comprende o consiste en secuencias de anticuerpos maduras (es decir, expresadas) (p. ej., una base de datos de Kabat de secuencias de anticuerpos maduras, p. ej., una base de datos KBD). Adicionalmente, la base de datos de anticuerpos puede comprender o consistir en secuencias seleccionadas funcionalmente (p. ej., secuencias seleccionadas de un ensayo de QC).
La expresión "inmunoaglutinante" se refiere a una molécula que contiene todo o parte del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, p. ej., todo o parte del dominio variable de cadena pesada y/o ligera, de modo que el inmunoaglutinante reconozca específicamente un antígeno diana. Los ejemplos no limitantes de inmunoaglutinantes incluyen moléculas de inmunoglobulina de longitud completa y scFv, así como fragmentos de anticuerpos, incluyendo, pero sin limitación, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra (véase, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3a ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que comprende los dominios Vl y Vh de una sola rama de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo de un único dominio, tal como un fragmento de Dab (Ward et al., (1989) Nature 341: 544- 546), que consiste en un dominio Vh o Vl, un camélido (véase Hamers-Casterman, et al., Nature 363: 446-448 (1993) y Dumoulin, et al., Protein Science 11: 500­ 515 (2002)) o un anticuerpo de tiburón (p. ej., Nanobodies® Ig-NAR de tiburón; y (vii) un nanocuerpo, una región variable de cadena pesada que contiene un único dominio variable y dos dominios constantes.
Como se usa en el presente documento, la expresión "propiedad funcional" es una propiedad de un polipéptido (p. ej., un inmunoaglutinante) para el que una mejora (p. ej., en relación con un polipéptido convencional) es deseable y/o ventajosa para un experto en la materia, p. ej., para mejorar las propiedades de fabricación o la eficacia terapéutica del polipéptido. En una realización, la propiedad funcional es la estabilidad (p. ej., estabilidad térmica). En otra realización, la propiedad funcional es la solubilidad (p. ej., en condiciones celulares). En otra realización más, la propiedad funcional es el comportamiento de agregación. En otra realización más, la propiedad funcional es la expresión de proteínas (p. ej., en una célula procariota). En otra realización más, la propiedad funcional es la eficacia de replegamiento después de la solubilización de cuerpos de inclusión en un proceso de purificación correspondiente. En determinadas realizaciones, la afinidad de unión a antígeno no es una propiedad funcional que se desee mejorar. En otra realización más, la mejora de la propiedad funcional no implica un cambio sustancial de la afinidad de unión a antígeno.
El término "solubilidad" como se usa en el presente documento se refiere a la solubilidad de la proteína nativa, es decir, del inmunoaglutinante monomérico, no agregado y funcional. "Solubilidad mejorada" significa una mejora de la solubilidad de la proteína nativa que se determina preferentemente mediante al menos uno de los siguientes métodos: precipitación con PEG, precipitación con sulfato de amonio, rendimiento de replegamiento o cualquier otro método para determinar la solubilidad que sea conocido por un experto en la materia. El método de precipitación con PEG es un método en el sentido descrito por Atha et al. en "Mechanism of Precipitation of Proteins by Polyethylene Glycols", JBC, 256: 12108-12117 (1981). La precipitación con sulfato de amonio se puede realizar, p. ej., de la siguiente manera: se preparan alícuotas de 10 pl de soluciones de proteína de 20 mg/ml a cada una de las cuales se añaden 10 pl de solución de (NH4)2SO4 de un grado de saturación diferente (p. ej., 35 %, 33 %, 31 %, 29 %, 25 %, 20 % y 15 %), seguido de agitación con vórtex durante 5 segundos y 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 6000 rpm a 4 °C durante 30 minutos, se determina la concentración de proteína en el sobrenadante. En este método, el comparador para diferentes proteínas es el valor V50, que es el porcentaje de saturación de (NH4)2SO4 a la que se precipita el 50 % de la proteína. El V50 se determina a partir de una gráfica de proteína soluble determinada en el sobrenadante frente al porcentaje aplicado de saturación de (NH4)2SO4. El rendimiento de replegamiento corresponde al porcentaje de proteína correctamente plegada obtenida a partir de cuerpos de inclusión solubilizados en un proceso de fabricación/purificación correspondiente. El término solubilidad como se usa en el presente documento no se refiere a expresión soluble.
Inmunoaglutinantes con mejor solubilidad
En un primer aspecto, se describe un inmunoaglutinante que comprende uno de los siguientes motivos potenciadores de la solubilidad en las posiciones 12, 103 y 144 de los aminoácidos de cadena pesada (numeración AHo):
(a) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de aminoácido de cadena pesada;
(b) serina (S) en la posición 103 de los aminoácidos de aminoácido de cadena pesada; y
(c) treonina (T) en la posición 144 de los aminoácidos de aminoácido de cadena pesada; o
(a1) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b1) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c1) serina (S) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o
(a2) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b2) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c2) treonina (T) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o
(a3) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b3) serina (S) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c3) serina (S) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o
Sorprendentemente, se ha descubierto que la presencia de los aminoácidos indicados en las posiciones indicadas aumenta la solubilidad global del inmunoaglutinante completo. Por ejemplo, en el caso de la combinación de las tres mutaciones potenciadoras de la solubilidad V12S, L144S y V103T en el VH de un scFv, se descubrió que dichas sustituciones representan aproximadamente el 60 % de la solubilidad total del scFv. Ya que los tramos hidrófobos se conservan en los dominios variables de todos los inmunoaglutinantes, se pueden usar una o más sustituciones en las posiciones indicadas para mejorar la solubilidad de cualquier inmunoaglutinante.
El inmunoaglutinante puede ser un anticuerpo scFv, una inmunoglobulina de longitud completa, un fragmento Fab, un Dab o un nanocuerpo.
El inmunoaglutinante puede comprender además uno o más aminoácidos del grupo que consiste en (a) ácido aspártico (D) en la posición 31 de aminoácido de cadena ligera, (b) ácido glutámico (E) en la posición 83 de aminoácido de cadena ligera, (c) arginina (R) en la posición 43 de aminoácido de cadena pesada, (d) leucina (L) en la posición 67 de aminoácido de cadena pesada y (e) alanina (A) en la posición 78 de aminoácido de cadena pesada. La presencia de uno o más de los aminoácidos indicados en las posiciones correspondientes confiere al inmunoaglutinante una mejor estabilidad.
Los aminoácidos indicados en el presente documento pueden estar presentes en el inmunoaglutinante de origen natural o derivado del mismo, o el inmunoaglutinante puede diseñarse para incorporar uno o más de los aminoácidos mencionados anteriormente.
En una realización preferida, el inmunoaglutinante desvelado en el presente documento se une específicamente a TNFa humano o a VEGF humano.
Diseño de inmunoaglutinantes con solubilidad mejorada
Como se describe en detalle en los ejemplos, se ha usado con éxito un enfoque basado en secuencias descrito en el presente documento para identificar sustituciones particulares de restos de aminoácidos que confieren mejor solubilidad. Los ejemplos enumeran sustituciones de aminoácidos ilustrativas y preferidas en posiciones definidas de aminoácidos dentro de las regiones VH y opcionalmente en la región VL de un inmunoaglutinante (p. ej., un scFv). Las sustituciones ilustrativas incluyen la sustitución de restos de aminoácidos problemáticos (p. ej., restos hidrófobos expuestos al disolvente) en posiciones de aminoácidos que son más hidrófilas y que aparecen con mayor frecuencia en la base de datos (p. ej., una base de datos de anticuerpos maduros ( k D b ) ) . Una sustitución particularmente preferida es el resto que aparece con más frecuencia y que es más hidrófilo que el resto problemático. En otros aspectos, el aminoácido más hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S) y treonina (T).
Por consiguiente, la divulgación se refiere a métodos de ingeniería genética en los que se introducen una o más sustituciones de aminoácidos específicas en un inmunoaglutinante, tal como un anticuerpo scFv. Dichas sustituciones se pueden llevar a cabo usando métodos convencionales de biología molecular, tales como mutagénesis dirigida, mutagénesis mediada por PCR y similares.
Como se expone en los ejemplos, las siguientes posiciones de aminoácidos se han identificado como aminoácidos problemáticos (es decir, los denominados "tramos hidrófobos") para la modificación en las secuencias indicadas de V h o V l :
V h: posiciones de aminoácidos 2, 4, 5, 12, 103 y 144; y
V l : posiciones de aminoácidos 15, 52 y 147.
La numeración usada es el sistema de numeración AHo; se exponen tablas de conversión para convertir la numeración AHo a la numeración del sistema de Kabat como las tablas 1 y 2.
Se ha descubierto sorprendentemente que las sustituciones en dos o más de las posiciones 12, 103, 144 de VH (según el sistema de numeración AHo) afectan a la solubilidad global del inmunoaglutinante completo. Ya que los tramos hidrófobos se conservan en los dominios variables de todos los inmunoaglutinantes, se pueden usar al menos dos sustituciones en las posiciones indicadas para mejorar la solubilidad de cualquier inmunoaglutinante.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método de diseño de un inmunoaglutinante, tal como un anticuerpo scFv, en el que se realizan al menos dos sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos identificadas anteriormente para producir de este modo formas variantes (es decir, mutantes) de los inmunoaglutinantes.
Por tanto, en otro aspecto, la divulgación proporciona un método de diseño de un inmunoaglutinante, comprendiendo el método:
A) seleccionar al menos dos posiciones de aminoácidos dentro de la región VH, la región VL o las regiones VH y VL para mutación; y
B) mutar al menos dos posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación,
en donde si las al menos dos posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación están dentro de la región V h, la sustitución es de al menos dos posiciones de aminoácidos de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en 12, 103 y 144 (según la convención de numeración AHo; posiciones de aminoácidos 11, 89 y 108 usando la numeración de Kabat) y/o
en donde, si la o las posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación están dentro de la región VL, la sustitución está en una posición de aminoácido de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en 15, 52 y 147 (según la convención de numeración AHo; posiciones de aminoácidos 15, 44 y 106 usando numeración de Kabat).
En determinados aspectos, la posición de aminoácido está ocupada por un aminoácido hidrófobo (p. ej., leucina (L) o valina (V)). En un aspecto, el aminoácido en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada es valina (V). En otro aspecto, el aminoácido en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada es valina (V). En otro aspecto, el aminoácido en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada es leucina (L). En otro aspecto, el aminoácido en la posición 15 de los aminoácidos de la cadena ligera es valina (V). En otro aspecto, el aminoácido en la posición 52 de los aminoácidos de la cadena ligera es fenilalanina (F). En otro aspecto, el aminoácido en la posición 147 de los aminoácidos de la cadena ligera es valina (V).
La mutación puede ser una sustitución del aminoácido en la posición de aminoácido seleccionada por un aminoácido más hidrófilo. En otros aspectos, el aminoácido más hidrófilo se selecciona de serina (S) o treonina (T).
En determinados aspectos, el método comprende: a) seleccionar al menos dos posiciones de aminoácidos dentro del inmunoaglutinante para la mutación; y b) mutar las al menos dos posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación, en donde la mutación comprende al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(i) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada usando numeración AHo (posición 11 usando numeración de Kabat);
(ii) serina (S) o treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada usando numeración AHo (posición 89 usando numeración de Kabat); y
(iii) serina (S) o treonina (T) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada usando numeración AHo (posición 108 usando numeración de Kabat).
En una realización muy preferida, al menos una de las posiciones 12, 103 y 144 de los aminoácidos de la cadena pesada es treonina (T).
En otros aspectos más, la mutación comprende la sustitución por treonina (T), una posición 15 de aminoácido de cadena ligera usando numeración AHo o de Kabat y/o sustitución por alanina (A) en la posición 147 de aminoácido de cadena ligera usando numeración AHo (posición 106 usando la convención de numeración de Kabat).
En otros aspectos, la mutación da lugar a un aumento de al menos 2 veces en la solubilidad (p. ej., un aumento de 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces o más en la solubilidad).
En otro aspecto, la estabilidad térmica, el replegamiento, el rendimiento de expresión, la agregación y/o la actividad de unión del inmunoaglutinante no se ven afectados negativamente por la mutación.
En determinados aspectos, la mutación comprende además una o más mutaciones estabilizadoras en una posición de aminoácido (convención de numeración AHo) seleccionada del grupo que consiste en: (a) ácido aspártico (D) en la posición aminoacídica 31 de la cadena ligera; (b) ácido glutámico (E) en la posición aminoacídica 83 de la cadena ligera; (c) arginina (R) en la posición aminoacídica 43 de la cadena pesada; (d) leucina (L) en la posición aminoacídica 67 de la cadena pesada; y (e) alanina (A) en la posición aminoacídica 78 de la cadena pesada. Se ha demostrado que estas mutaciones tienen un efecto sobre la estabilidad del inmunoaglutinante.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un inmunoaglutinante preparado según el método descrito en el presente documento.
En determinados aspectos ilustrativos, un inmunoaglutinante diseñado según el método de la divulgación es un inmunoaglutinante reconocido en la técnica que se une a un antígeno diana de importancia terapéutica o un inmunoaglutinante que comprende regiones variables (regiones VL y/o VH) o una o más CDR (p. ej., CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 y/o CDRH3) derivado del inmunoaglutinante de importancia terapéutica. Por ejemplo, los inmunoaglutinantes actualmente aprobados por la FDA u otras autoridades reguladoras pueden diseñarse según los métodos de la divulgación. De manera más específica, estos inmunoaglutinantes ilustrativos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos anti-CD3 tales como muromonab (Orthoclone® OKT3; Johnson&Johnson, Brunswick, NJ; véase Arakawa et al. J. Biochem, (1996) 120: 657-662; Kung y Goldstein et al., Science (1979), 206: 347-349), anticuerpos anti-CD11 tales como efalizumab (Raptiva®, Genentech, South San Francisco, CA), anticuerpos anti-CD20 tales como rituximab (Rituxan®/Mabthera®, Genentech, South San Francisco, CA), tositumomab (Bexxar®, GlaxoSmithKline, Londres) o ibritumomab (Zevalin®, Biogen Idec, Cambridge MA) (véanse las patentes de los Estados Unidos n.° 5736 137; 6455043; y 6682734), anticuerpos anti-CD25 (IL2Ra) tales como daclizumab (Zenapax®, Roche, Basilea, Suiza) o basiliximab (Simulect®, Novartis, Basilea, Suiza), anticuerpos anti-CD33 tales como gemtuzumab (Mylotarg®, Wyeth, Madison, NJ, véanse las patentes de los Estados Unidos n.° 5714350 y 6350861), anticuerpos anti-CD52 tales como alemtuzumab (Campath®, Millennium Pharmacueticals, Cambridge, MA), anticuerpos anti-GplIb/glIa tales como abciximab (ReoPro®, Centocor, Horsham, PA), anticuerpos anti-TNFa tales como infliximab (Remicade®, Centocor, Horsham, PA) o adalimumab (Humira®, Abbott, Abbott Park, IL, véase patente de los Estados Unidos n.° 6258562), anticuerpos anti-IgE tales como omalizumab (Xolair®, Genentech, South San Francisco, CA), anticuerpos anti-VSR tales como palivizumab (Synagis®, Medimmune, Gaithersburg, MD, véase patente de los Estados Unidos n.° 5824307), anticuerpos anti-EpCAM tales como edrecolomab (Panorex®, Centocor), anticuerpos anti-EGFR tales como cetuximab (Erbitux®, Imclone Systems, Nueva York, NY) o panitumumab (Vectibix®, Amgen, Thousand Oaks, CA), anticuerpos anti-HER2/neu tales como trastuzumab (Herceptin®, Genentech), anticuerpos anti-integrina a4 tales como natalizumab (Tysabri®, BiogenIdec), anticuerpos anti-C5 tales como eculizumab (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals, Chesire, CT) y anticuerpos anti-VEGF tales como bevacizumab (Avastin®, Genentech, véase patente de los Estados Unidos n.° 6884879) o ranibizumab (Lucentis®, Genentech).
En determinados aspectos ilustrativos, un inmunoaglutinante diseñado según el método de la divulgación es un inmunoaglutinante reconocido en la técnica descrito anteriormente. El inmunoaglutinante puede ser un anticuerpo scFv. En otros aspectos, el inmunoaglutinante puede ser, por ejemplo, una inmunoglobulina de longitud completa, Dab, nanocuerpo o un fragmento Fab.
No obstante lo anterior, en diversos aspectos, determinados inmunoaglutinantes están excluidos de su uso en los métodos de diseño de la divulgación y/o están excluidos de ser la composición de inmunoaglutinante producida por los métodos de diseño. Por ejemplo, en diversos aspectos, existe la condición de que el inmunoaglutinante no sea ninguno de los anticuerpos scFv, o variantes de los mismos, como se desvela en las publicaciones PCT WO 2006/131013 y WO 2008/006235, tales como ESBA105 o variantes del mismo que se describen en las publicaciones PCT WO 2006/131013 y WO 2008/006235.
Preferentemente, el inmunoaglutinante desvelado en el presente documento, usado para el método desvelado en el presente documento o generado por el método desvelado en el presente documento, respectivamente, es un anticuerpo scFv, pero otros inmunoaglutinantes, tales como inmunoglobulinas de longitud completa, fragmentos Fab o cualquier otro tipo de inmunoaglutinante descrito en el presente documento (p. ej., Dabs o nanocuerpos) también están incluidos.
En una realización preferida, el inmunoaglutinante como se desvela en el presente documento, usado para el método desvelado en el presente documento o generado por el método desvelado en el presente documento, respectivamente, se une específicamente al TNFa humano o al VEGF humano.
La divulgación abarca además composiciones que comprenden los inmunoaglutinantes desvelados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Composiciones y formulaciones de ScFv
Otro aspecto de la divulgación se refiere a composiciones de scFv preparadas según los métodos de la divulgación. Por tanto, la divulgación proporciona composiciones scFv obtenidas por ingeniería genética en las que se han introducido una o más mutaciones potenciadoras de la solubilidad en la secuencia de aminoácidos, en comparación con un scFv original de interés, en donde la mutación o mutaciones se han introducido en la posición de un resto de aminoácido hidrófobo. En un aspecto, el scFv se ha obtenido por ingeniería genética para contener una posición de aminoácido mutada (p. ej., una posición de marco conservado). En otros aspectos, el scFv se ha obtenido por ingeniería genética para contener dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez posiciones de aminoácidos mutados (p. ej., posiciones de marco conservado).
En determinados aspectos, la mutación comprende además una o más mutaciones estabilizadoras descritas en la solicitud PCT n.° p Ct /CH2008/000285, titulada "Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties", presentada el 25 de junio de 2008 o la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° de serie 61/069 056, titulada "Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties", presentada el 12 de marzo de 2008. Por ejemplo, el inmunoaglutinante puede comprender además una sustitución en una posición de aminoácido (convención de numeración AHo) seleccionada del grupo que consiste en: (a) ácido aspártico (D) en la posición aminoacídica 31 de la cadena ligera; (b) ácido glutámico (E) en la posición aminoacídica 83 de la cadena ligera; (c) arginina (R) en la posición aminoacídica 43 de la cadena pesada; (d) leucina (L) en la posición aminoacídica 67 de la cadena pesada; y (e) alanina (A) en la posición aminoacídica 78 la cadena pesada. Una o más mutaciones en las posiciones indicadas tienen un efecto sobre la estabilidad general de todo el inmunoaglutinante. En otros aspectos, la mutación comprende además las siguientes mutaciones estabilizadoras (convención de numeración AHo): (a) ácido aspártico (D) en la posición aminoacídica 31 de la cadena ligera; (b) ácido glutámico (E) en la posición aminoacídica 83 de la cadena ligera; (c) arginina (R) en la posición aminoacídica 43 de la cadena pesada; (d) leucina (L) en la posición aminoacídica 67 de la cadena pesada; y (e) alanina (A) en la posición aminoacídica 78 de la cadena pesada.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a formulaciones farmacéuticas de las composiciones de scFv de la invención. Dichas formulaciones comprenden normalmente la composición de scFv y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para, por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, raquídea, epidérmica (p. ej., por inyección o infusión) o tópica (p. ej., en el ojo o la piel). Dependiendo de la vía de administración, el scFv puede estar recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Los compuestos farmacéuticos de la divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no transmite ningún efecto toxicológico indeseado (véase, p. ej., Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci.
66:1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen las procedentes de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.
Una composición farmacéutica de la divulgación también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización, mencionados anteriormente, y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede llevar a cabo mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.
Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Se puede lograr absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por microfiltración. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la criodesecación (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.
La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se va a tratar y del modo particular de administración. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una sola forma de dosificación, en general, será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En general, del cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento del principio activo, preferentemente de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferentemente de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar una única embolada, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la preparación de compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Sistemas de numeración de posiciones de anticuerpos
Se proporcionan tablas de conversión para dos sistemas de numeración diferentes usados para identificar las posiciones de restos de aminoácidos en las regiones variables de cadena ligera y pesada de anticuerpos. El sistema de numeración de Kabat se describe con más detalle en Kabat. et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación de NIH n.° 91­ 3242). El sistema de numeración AHo se describe con más detalle en Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol.
309: 657-670).
Numeración de regiones variables de cadena pesada
Tabla 1: Tabla de conversión para las posiciones de restos en el dominio variable de cadena pesada
Figure imgf000011_0001
continuación
Figure imgf000012_0001
Columna 1, posición del resto en el sistema de numeración de Kabat. Columna 2, número correspondiente en el sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, posición del resto en el sistema de numeración de Kabat. Columna 4, número correspondiente en el sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 3. Columna 5, posición del resto en el sistema de numeración de Kabat. Columna 6, número correspondiente en el sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 5_____________________________________
Numeración de regiones variables de cadena ligera
Tabl 2: T l nv ri n r l i i n r n l mini v ri l n li r
Figure imgf000012_0002
continuación
Figure imgf000013_0001
Columna 1, posición del resto en el sistema de numeración de Kabat. Columna 2, número correspondiente en el sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, posición del resto en el sistema de numeración de Kabat. Columna 4, número correspondiente en el sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 3. Columna 5, posición del resto en el sistema de numeración de Kabat. Columna 6, número correspondiente en el sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 5_______________________________________
Otras realizaciones
Se puede encontrar información adicional acerca de metodologías y composiciones en la publicación PCT WO 2008/006235, titulada "scFv Antibodies Which Pass Epithelial And/Or Endothelial Layers" presentada en julio de 2006 y el 6 de febrero de 2007 respectivamente; el documento WO06131013A2 titulado "Stable And Soluble Antibodies Inhibiting TNFa" presentado el 6 de junio de 2006; el documento EP1506236A2 titulado "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same" presentado el 21 de mayo de 2003; el documento EP1479694A2 titulado "Intrabodies ScFv with defined framework that is stable in a reducing environment" presentado el 18 de diciembre de 2000; el documento EP1242457B1 titulado "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof' presentado el 18 de diciembre de 2000; el documento WO03097697A2 titulado "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same" presentado el 21 de mayo de 2003; y el documento WO0148017A1 titulado "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof" presentado el 18 de diciembre de 2000; y Honegger et al. "J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001).
Además, se entiende que la divulgación también incluye metodologías y composiciones adecuadas para el descubrimiento y/o mejora de otros formatos de anticuerpos, p. ej., anticuerpos de longitud completa o fragmentos de los mismos, por ejemplo, Fab, Dab y similares. Por consiguiente, los principios y restos identificados en el presente documento como adecuados para la selección o alteración para lograr las propiedades biofísicas y/o terapéuticas deseadas que se pueden aplicar a una amplia gama de inmunoaglutinantes. En una realización, los anticuerpos terapéuticamente relevantes, por ejemplo, anticuerpos aprobados por la FDA, se mejoran modificando una o más posiciones de restos como se desvela en el presente documento.
Sin embargo, la divulgación no se limita a la modificación por ingeniería genética de inmunoaglutinantes. Por ejemplo, un experto en la materia reconocerá que los métodos de la divulgación se pueden aplicar a la modificación por ingeniería genética de otras moléculas de unión, distintas de inmunoglobulina, incluyendo, pero sin limitación, moléculas de unión a fibronectina tales como adnectinas (véanse documento WO 01/64942 y patentes de los Estados Unidos n.° 6673901, 6703 199, 7078490 y 7119171), Affibodies (véanse p. ej., patentes de los Estados Unidos 6 740734 y 6602977 y en el documento WO 00/63243), anticalinas (también conocidas como lipocalinas) (véanse documentos WO99/16873 y WO 05/019254), proteínas de dominio A (véanse documentos WO 02/088171 y WO 04/044011) y proteínas de repetición de anquirina tales como darpinas o proteínas de repetición de leucina (véanse documentos WO 02/20565 y WO 06/083275).
La presente divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes adicionales.
EJEMPLO 1: Generación de scFv con mejor solubilidad
En este ejemplo, se usó un enfoque basado en el análisis de secuencia y modelado estructural para identificar mutaciones en las regiones marco conservadas de scFv que dan lugar a una mejor solubilidad.
a) Análisis estructural
La estructura tridimensional del scFv ESBA105 se modeló usando el servidor de modelado de homología de estructura de proteínas automático, accesible a través del servidor web ExPASy. La estructura se analizó según la superficie relativa accesible al disolvente (rSAS) y los restos se clasificaron de la siguiente manera: (1) Expuestos para restos que muestran una rSAS > 50 %; y (2) parcialmente expuestos para restos con un 50 % < rSAS > 25 %. Los restos hidrófobos con una rSAS >25 % se consideraron tramos hidrófobos. Para validar el área accesible al disolvente de cada tramo hidrófobo hallado, se realizaron cálculos a partir de 27 archivos PDB con alta homología con ESBA105 y una resolución superior a 2,7 A. Se calcularon el rSAS promedio y la desviación típica para los tramos hidrófobos y se examinaron en detalle para cada uno de ellos (véase tabla 3).
Tabla 3: Evaluación de los tramos hidrófobos.
Figure imgf000014_0001
Columna 1, posición del resto en el sistema de numeración AHo. Columna 2, dominio para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, cálculos del promedio de área accesible al disolvente de 27 archivos PDB. Columna 4, desviaciones típicas de la columna 3. Columnas 5 a 9, función estructural de los tramos hidrófobos recuperados de AHo.____________________________________________________
La mayoría de los tramos hidrófobos identificados en ESBA105 correspondían a la interfaz de dominio variableconstante (VH/CH). Esto se correlacionó con hallazgos previos de restos hidrófobos expuestos al disolvente en un formato scFv (Nieba et al., 1997). Dos de los tramos hidrófobos (VH 2 y VH 5) también contribuyeron a la interacción VL-VH y, por lo tanto, se excluyeron del análisis posterior.
b) Diseño de mutaciones de solubilidad
Se recuperaron un total de 122 secuencias VL y 137 VH de la página web de anticuerpos de Annemarie Honegger (www.bioc.uzh.ch/antibody). Las secuencias correspondían originalmente a 393 estructuras de anticuerpos en formato Fv o Fab extraídas del banco de datos de proteínas (PDB) (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Las secuencias se usaron para el análisis independientemente de la especie o el subgrupo con el fin de aumentar la probabilidad de encontrar aminoácidos alternativos con mayor hidrofilia que el resto nativo. Las secuencias que tienen más del 95 % de identidad con cualquier otra secuencia dentro de la base de datos se excluyeron para reducir el sesgo. Las secuencias se alinearon y analizaron para determinar la frecuencia de los restos. Se aplicaron herramientas y algoritmos de análisis de secuencias para identificar y seleccionar mutaciones hidrófilas para alterar los tramos hidrófobos en ESBA105. Las secuencias se alinearon siguiendo el sistema de numeración de AHo para el dominio variable de inmunoglobulina (Honegger y Pluckthun 2001). El análisis se limitó a las regiones marco conservadas.
La frecuencia de los restos, f(r), para cada posición, i, en la base de datos personalizada se calculó a partir del número de veces que se observa ese resto particular dentro del conjunto de datos dividido por el número total de secuencias. En una primera etapa, se calculó la frecuencia de aparición de los diferentes aminoácidos para cada tramo hidrófobo. La frecuencia de restos para cada tramo hidrófobo identificado en ESBA105 se analizó a partir de la base de datos personalizada descrita anteriormente. La tabla 4 informa de la frecuencia de los restos en los tramos hidrófobos dividida por la totalidad de los restos presentes en la base de datos.
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0001
En la segunda etapa, se usó la frecuencia de restos hidrófilos en los tramos hidrófobos para diseñar las mutaciones de solubilidad seleccionando el resto hidrófilo más abundante en cada tramo hidrófobo. La tabla 5 informa de los mutantes de solubilidad identificados usando este enfoque. La hidrofobicidad de los restos precursores y mutantes se calculó como la hidrofobicidad promedio de los valores publicados en varios artículos y expresados en función del nivel de exposición de la cadena lateral al disolvente.
Tabla . Dif r n ^ m i n ^ l ili in r i n E BA1 r r m r l r m hi r f
Figure imgf000017_0001
*El tramo hidrófobo en la posición 144 no se cambió por el resto hidrófilo más abundante en la base de datos, sino Ser, ya que este ya estaba contenido en el donante de ESBA105 de la CDR.
___________________________________________________________________________________________
Columna 1, posición del resto en el sistema de numeración AHo. Columna 2, dominio para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, cálculos del promedio de área accesible al disolvente de 27 archivos PDB. Columna 4, restos precursores en ESBA105. Columna 5, hidrofobicidades promedio de la columna 4, recuperada de AHo. Columnas 6, resto hidrófilo más abundante en la posición indicada en la columna 1. Hidrofobicidad promedio de la columna 6 recuperada de AHo.____________________________
c) Prueba de variantes de solubilidad de ESBA105
Las mutaciones de solubilidad se introdujeron solas o en múltiples combinaciones y se probaron para determinar el rendimiento de replegamiento, expresión, actividad y patrones de estabilidad y agregación. La tabla 6 muestra las diversas combinaciones de mutaciones de solubilidad introducidas en cada variante optimizada de ESBA105 en función de la contribución potencial a la solubilidad y el nivel de riesgo de que la mutación altere la unión a antígeno.
Tabla 6: Diseño de var
Figure imgf000017_0002
*Probado por separado en un segundo ciclo
**El subrayado separa el número de mutaciones contenidas en la cadena ligera y pesada, respectivamente.
Columna 1, posición del resto en el sistema de numeración AHo. Columna 2, dominio para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, resto precursor en ESBA105 en los diferentes tramos hidrófobos. Columna 4, diferentes variantes que contienen mutaciones de solubilidad en las posiciones indicadas,_______________________________
Medidas de solubilidad
Las solubilidades máximas de ESBA105 y variantes se determinaron mediante el método de precipitación con PEG como describieron inicialmente Atha et al. (JBC, 256: 12108-12117 (1981)). En este método, se mide la concentración de proteína en los sobrenadantes de mezclas de PEG-proteína centrifugadas y se representa logarítmicamente frente a la concentración de PEG. Se mezcló una solución de proteína de 20 mg/ml 1:1 con soluciones de PEG que varían del 30 al 50 % de saturación. Estas condiciones se eligieron basándose en el perfil de solubilidad observado para el ESBA105 de tipo silvestre después de la determinación empírica de la dependencia lineal de Log S frente a la concentración de Peg (% p/v). Las curvas de solubilidad de varios ejemplos de la variante ESBA105 que presentaron una solubilidad superior se representan en la figura 1. También se proporciona una lista completa de los valores de solubilidad en la tabla 7.
Tabl 7. l ili ivi m xim im l m n n m r i n n l E BA1 r r r.
Figure imgf000018_0001
e) Medidas de termoestabilidad
Las medidas de termoestabilidad para el ESBA105 precursor y los seguimientos de solubilidad se realizaron usando espectroscopia FT-IR ATR. Las moléculas se expusieron a una amplia gama de temperaturas (25 a 95 °C). El perfil de desnaturalización se obtuvo aplicando una transformada de Fourier a las señales del interferograma (véase figura 2). Los perfiles de desnaturalización se usaron para aproximar los puntos medios de las transiciones de despliegue térmico (TM) para cada variante de ESBA105 aplicando el modelo sigmoide de Boltzmann (tabla 8).
Figure imgf000019_0001
iii. Medidas de agregación
ESBA105 y sus variantes de solubilidad también se analizaron en una prueba dependiente del tiempo para evaluar el comportamiento de degradación y agregación. Con este fin, se incubaron proteínas solubles (20 mg/ml) a una temperatura elevada (40 °C) en tampones de fosfato a pH 6,5. Las muestras de control se mantuvieron a -80 °C. Las muestras se analizaron después de un periodo de incubación de dos semanas para determinar su degradación (SDS-PAGE) y agregación (SEC). Esto permitió descartar variantes que eran propensas a la degradación (véase figura 3) o que presentaban una tendencia a formar agregados solubles o insolubles (véase tabla 9).
Tabla 9: Medidas de a re ación insoluble.
Figure imgf000020_0002
iv. Expresión y replegamiento de variantes de solubilidad
Los mutantes de solubilidad también se probaron para determinar la expresión y el rendimiento de replegamiento en relación con la molécula de ESBA105 precursora. Los resultados de estos estudios se muestran en la tabla 10.
Tabla 10. Ex resión re le amiento de variantes de solubilidad.
Figure imgf000020_0001
Aunque todos los mutantes de solubilidad hidrófilos presentaron una solubilidad mejorada en comparación con la molécula de ESBA105 precursora, solo algunas de estas moléculas presentaron otras propiedades biofísicas adecuadas. Por ejemplo, muchas variantes tenían una menor termoestabilidad y/o rendimiento de replegamiento en relación con la molécula de ESBA105 precursora. En particular, el reemplazo hidrófilo en la posición VL147 disminuyó gravemente la estabilidad. Por lo tanto, se combinaron mutaciones de solubilidad que no afectaron significativamente a la estabilidad térmica y se sometieron a tensión térmica adicional para confirmar sus propiedades.
Tres mutantes que contenían una combinación de cuatro mutaciones de solubilidad diferentes (Opt1.0, Opt0.2 y VH:V103T) mejoraron significativamente la solubilidad de ESBA105 sin afectar a la reproducibilidad, actividad o estabilidad térmica. Sin embargo, un mutante que tenía las mutaciones combinadas de Opt1.0 y Opt0.2 en ESBA105 (Opt 1_2) presentó una mayor cantidad de agregados insolubles después de la incubación durante 2 semanas a 40 °C (véase tabla 9). Esto podría explicarse por la función de la Val en la posición VL 15 en un giro de lámina beta, ya que Val tiene la mayor propensión a lámina beta de todos los aminoácidos. Este resultado demostró que se tolera una sola mutación de solubilidad en la posición VL 15, pero no en combinación con mutantes de solubilidad que alteran otros tramos hidrófobos.
Por lo tanto, las mutaciones contenidas en Opt0_2 y VH:V103T se seleccionaron como las de mejor rendimiento para mejorar las propiedades de solubilidad de las moléculas de scFv.
EJEMPLO 2: Generación de scFv con mayor solubilidad y estabilidad
Las variantes de ESBA105 identificadas mediante un diseño de solubilidad se optimizaron adicionalmente mediante la sustitución con mutaciones estabilizadoras identificadas mediante ensayo de control de calidad (QC). Se crearon un total de 4 construcciones que contenían entre 1 y 3 de las mutaciones de solubilidad identificadas en el ejemplo 1 anterior, en combinación con todas las mutaciones estabilizadoras halladas en QC 7.1 y 15.2 (es decir, D31N y V83E en el dominio VL y V78A, K43 y F67L en el dominio VH). Todas las construcciones optimizadas produjeron más proteína soluble que un scFv de tipo silvestre (véase tabla 11). La mejor construcción presentó de manera uniforme un aumento de más de 2 veces en la solubilidad con respecto al tipo silvestre. Ni la actividad ni la estabilidad de las moléculas de scFv se vieron afectadas significativamente por la combinación de mutaciones estabilizadoras y potenciadoras de la solubilidad.
Tabla 11: ScFv con solubilidad estabilidad o timizadas
Figure imgf000021_0001
Los valores de solubilidad para las 4 variantes se usaron para desconvolucionar la contribución de cada mutación a la solubilidad del scFv. Todas las mutaciones parecían contribuir a la solubilidad del scFv de manera aditiva, aunque varios de estos restos están relativamente cerca entre sí tanto en la secuencia primaria como dentro de la estructura tridimensional. El análisis indicó que una combinación de tres mutaciones potenciadoras de la solubilidad en el dominio VH (V12S, L144S, V103T (o V103S)) representa el ~60 % de la solubilidad de scFv. Ya que los tramos hidrófobos se conservan en los dominios variables de todos los inmunoaglutinantes, esta combinación óptima de mutaciones se puede usar para mejorar la solubilidad de prácticamente cualquier scFv u otra molécula inmunoaglutinante.
Ejemplo 3: Variante con solubilidad optimizada de Epi43max, un potente agente de unión de TNFa
La tabla 12 representa los datos de caracterización para tres variantes optimizadas de Epi43max, un potente agente de unión de TNF. EP43_maxDHP es una variante de solubilidad mejorada de EP43max y comprende las tres mutaciones potenciadoras de la solubilidad anteriores (V^ -S en la posición 12 de AHo, V ^ T en la posición AHo 103 y L ^ T en la posición AHo 144). Se generaron variantes de EP43_maxmin y Ep43_minmax mediante la mezcla de dominios entre injertos de "min" y "max". En particular, la variante "minmax" comprende la versión de injerto mínimo (injerto de CDR solamente) de la cadena ligera y la versión de injerto máximo de la cadena pesada (es decir, CDR de conejo injertadas más restos de marco conservado de conejo implicados en la unión a antígeno). Por el contrario, la variante "maxmin" comprendía la versión de injerto máximo de la cadena ligera y la versión de injerto mínimo de la cadena pesada. Las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y sus variantes optimizadas se compararon mediante análisis de FTIR (véase figura 4). Se descubrió que Epi43minmax tiene un punto medio más bajo de despliegue que Epi43max. Por otra parte, la variante mimax presentó una transición de despliegue escalonado, lo que indica que ambos dominios se despliegan a temperaturas muy similares.
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 4: Derivados de solubilidad mejorada de inmunoaglutinantes de VEGF
Además de los inmunoaglutinantes de TNF descritos anteriormente (ESBA105 y Epi43max), se diseñaron varios derivados de solubilidad de los inmunoaglutinantes de VEGF según los métodos de la invención. En particular, estas variantes de inmunoaglutinantes de VEGF se modificaron por ingeniería genética para tener un tramo hidrófobo alterado ("DHP") mediante la selección de los siguientes restos: (a) serina (S) en la posición 12 de aminoácido de cadena pesada; (b) serina (S) o treonina (T) en la posición 103 de aminoácido de cadena pesada; y (c) serina (S) o treonina (T) en la posición 144 de aminoácido de cadena pesada. Las características biofísicas de estas variantes de DHP se compararon con sus homólogos de tipo silvestre. Estas características incluyen la temperatura de fusión o Tm (según lo determinado por Bio-ATR), el porcentaje de pérdida de lámina p a 60 °C (según lo determinado por AquaSpec), el porcentaje de pérdida de proteínas tras la precipitación a 60 °C, solubilidad por precipitación con sulfato de amonio, rendimiento de replegamiento en niveles de producción y expresión en E. coli.
Como se representa en la tabla 14 a continuación, la solubilidad de uno de los inmunoaglutinantes de VEGF (ESBA578minmax FW1.4 DHP) se mejoró significativamente mediante la introducción del motivo DHP. Por otra parte, otras propiedades biofísicas (p. ej., estabilidad térmica) no se vieron afectadas negativamente o mejoraron por la introducción del motivo. Las curvas de estabilidad térmica usadas para determinar la temperatura de fusión para 578min-max y su variante de solubilidad optimizada (578min-max_DHP) se representan en la figura 5 y la tabla 13, mientras que las curvas de precipitación con sulfato de amonio usadas para determinar los valores de solubilidad se representan en la figura 6.
Tabla 13
Epi43maxDHP(941) Epi43maxmin Epi43max (676) Epi43minmax (958)
Figure imgf000023_0002
V50 60,15 65,81 77,78 51,76
PENDIENTE 2.618 2.908 10,43 4.297
R2 0,9974 0,9969 0,9855 0,9936
Tabla 14: Caracterización biofísica de los inmunoaglutinantes de VEGF
Figure imgf000023_0001

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoaglutinante que comprende el siguiente motivo potenciador de la solubilidad en las posiciones 12, 103 y 144 de los aminoácidos (numeración AHo) de la cadena pesada:
(a1) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b1) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c1) serina (S) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada; o
(a2) serina (S) en la posición 12 de los aminoácidos de la cadena pesada;
(b2) treonina (T) en la posición 103 de los aminoácidos de la cadena pesada; y
(c2) treonina (T) en la posición 144 de los aminoácidos de la cadena pesada,
en donde el inmunoaglutinante es un anticuerpo scFv, una inmunoglobulina de longitud completa o un nanocuerpo.
2. El inmunoaglutinante de la reivindicación 1, en donde el inmunoaglutinante se une específicamente a TNFa humano o a VEGF humano.
3. Una composición que comprende el inmunoaglutinante de la reivindicación 1 o 2 y un portador farmacéuticamente aceptable.
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