CN102076715A

CN102076715A - 免疫结合剂的溶解性优化

Info

Publication number: CN102076715A
Application number: CN2009801238156A
Authority: CN
Inventors: L·波拉斯; D·厄里什
Original assignee: Esbatech An Alcon Biomedical Research Unit LLC
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: DK3241843T3; AU2009264566A1; US10221237B2; JP2011525496A; BRPI0914666A2; JP5745720B2; RU2514658C2; US20190169284A1; HUE034827T2; ES2629345T3; LT3241843T; LT2307455T; SI2307455T1; HRP20171250T1; PT2307455T; AU2009264566B2; ZA201008595B; KR20110022714A; SI3241843T1; CA2728829C

Abstract

本发明提供了使用基于序列的分析和合理的策略来提高免疫结合剂，特别是单链抗体(scFv)的溶解性的方法。本发明提供了改造免疫结合剂，特别是scFv的方法，其中用通过分析选择的稳定scFv序列的数据库而鉴定的亲水性残基进行一个或多个置换。本发明还提供了根据本发明的改造方法制备的具有优化的溶解性的免疫结合剂。

Description

免疫结合剂的溶解性优化

相关申请

本申请要求于2008年6月25日提交的、名称为“SolubilityOptimization of Immunobinders”的US 61/075,692的优先权。

发明背景

已证明抗体在癌症、自身免疫疾病和其他病症的治疗中是非常有效和成功的治疗剂。尽管一般已在临床上使用全长抗体，但存在使用抗体片段可以提供的许多优点，例如增加组织穿透力、与增加其他效应子功能的能力结合的Fc效应子功能的不存在、和由较短的全身体内半衰期导致的较少全身性副作用的可能性。抗体片段的药代动力学性质表明，它们可能特别良好地适合于局部治疗方法。此外，抗体片段在特定表达系统中可以比全长抗体更容易产生。

一个类型的抗体片段是单链抗体(scFv)，其由经由接头序列缀合的轻链可变结构域(V_L)与重链可变结构域(V_H)组成。因此，scFv缺乏所有抗体恒定区结构域，并且先前的可变/恒定结构域界面的氨基酸残基(界面残基)变成溶剂暴露的。scFv可以通过已建立的重组改造技术由全长抗体(例如IgG分子)制备。然而，全长抗体转变成scFv通常导致蛋白质的弱稳定性和溶解性、低产量和高聚集趋势，这增加免疫原性危险。

因此，已尝试改善scFv的性质例如溶解性。例如，Nieba，L.等人(Prot.Eng.(1997)10：435-444)选择已知为界面残基的3个氨基酸残基且使其突变。他们观察到突变的scFv在细菌中周质表达增加，以及热诱导聚集速率减小，尽管热力学稳定性和溶解性未显著改变。此外，在他们的公开物中，他们明确地陈述，他们未观察到改造的scFv的天然蛋白质状态的任何溶解性的提高，如通过PEG沉淀法所测定的。其中对scFv内的特定氨基酸残基进行定点诱变的其他研究也已得到报告(参见例如，Tan，P.H.等人(1988)Biophys.J.75：1473-1482；Worn，A.和Pluckthun，A.(1998)Biochem.37：13120-13127；Worn，A.和Pluckthun，A.(1999)Biochem.38：8739-8750)。在这些各种研究中，选择用于诱变的氨基酸残基基于其在scFv结构内的已知位置(例如，来自分子建模研究)进行选择。

在另一种方法中，将来自表达极弱的scFv的互补决定区(CDR)移植到已证实具有有利性质的scFv的构架区内(Jung，S.和Pluckthun，A.(1997)Prot.Eng.10：959-966)。所得到的scFv显示改善的可溶性表达和热力学稳定性。

改造scFv以改善溶解性和其他功能性质中的进展在例如Worn，A.和Pluckthun，A.(2001)J.Mol.Biol.305：989-1010中综述。然而，仍需要允许合理设计免疫结合剂(immunobinder)，特别是具有优良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他类型的抗体从而赋予改善的溶解性--尤其是天然蛋白质的溶解性的方法。

发明概述

本发明提供了在可变重链区VH中包含溶解性增强基序的免疫结合剂以及改造免疫结合剂例如scFv抗体以赋予改善的溶解性的方法。在特定的实施方案中，本发明的方法包括用赋予改善的溶解性的优选氨基酸残基置换免疫结合剂的重链可变区和/或轻链可变区的序列内的对于溶解性潜在有问题的氨基酸。例如，在某些优选实施方案中，用亲水性残基置换疏水性残基。

优选地，提供的免疫结合剂，在本发明的改造方法中使用的或由本发明的改造方法产生的免疫结合剂是scFv，但其他免疫结合剂例如全长免疫球蛋白、Fab片段、单结构域抗体(例如Dab)和纳米抗体(Nanobody)也可以根据所述方法进行改造。本发明还包括根据改造方法制备的免疫结合剂，以及包含所述免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。

在一个方面，本发明提供了免疫结合剂，所述免疫结合剂在重链氨基酸位置12、103和144(AHo编号)中包含下列溶解性增强基序之一：

(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和

(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或

(a1)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b1)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和

(c1)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)；或

(a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和

(c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或

(a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和

(c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)。

在另一个方面，本发明提供了改造免疫结合剂的方法，免疫结合剂包含(i)重链可变区或其片段，其中重链可变区包含V_H构架残基和/或(ii)轻链可变区或其片段，其中轻链可变区包含V_L构架残基，所述方法包括：

A)选择V_H构架残基、V_L构架残基或V_H和V_L构架残基中的至少两个氨基酸位置以用于突变；和

B)突变选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置，

其中，如果选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置在V_H构架残基中，那么置换在选自12、103和144(根据AHo编号约定)的一个或多个重链氨基酸位置上，和/或

其中，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在V_L构架残基中，那么置换在选自15、52和147(根据AHo编号约定；在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置15、44和106)的轻链氨基酸位置上。

在下文中进一步详细描述选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置以及在选择的位置处插入的氨基酸残基。下文中所示的氨基酸位置编号使用AHo编号系统；使用Kabat编号系统的相应位置在本文中进一步描述，并且AHo和Kabat编号系统的转换表在下文的发明详述中阐述。使用标准单字母缩写代码阐述氨基酸残基。

令人惊讶地发现，在指定的位置上指定的突变的存在增加了免疫结合剂的总体溶解性而不对蛋白质的其他功能性质产生负面影响。例如，在scFv的VH中3个增强溶解性的突变V12S、L144S和V103T组合的情况下，发现所述置换占整个scFv的溶解性的约60％。这与现有技术中陈述的增加免疫结合剂的表达产量的尝试不同。例如，US 6,815,540描述通过减少链内结构域间界面区域中的疏水性对免疫结合剂进行改进。为了所述目的，鉴定了重链可变构架中的16个位置，所述位置可单独地用选自10个氨基酸的一个或多个氨基酸置换。发现产生的突变体的表达产量增加。此外，相同的研究组于1999年，即所提及的美国专利的优先权日期后3年，发表了论文(参见Jung，S.，Honegger，A.和Pluckthun，A.(1997)Prot.Eng.10：959-966)，该论文陈述，已在几个研究中报导用更加亲水的残基置换疏水性表面残基提高了产量。根据该作者，产量的增加归因于正确折叠与错误折叠材料的聚集之间的改善的动力学分配，同时天然蛋白质的溶解性不受影响，其热力学稳定性也未受到显著影响。因此，对于本领域技术人员来说很显然的是，Plückthun等人所提及的溶解性参数只涉及可溶性表达而非天然蛋白质的总体溶解性。

附图概述

当考虑本文的下列详细描述时，本发明将得到更好的理解，并且除上文所述的那些外的目的将变得显然。此类描述参考附图，其中：

图1描述了野生型ESBA105(E105)和其溶解性变体的PEG沉淀溶解性曲线。

图2描述了野生型ESBA105(E105)及其溶解性变体的热变性曲线图，如在广泛温度范围(25-96℃)下的热攻击后测量的。

图3描述了SDS-PAGE凝胶，其显示了在热胁迫条件下温育2周后各种ESBA105溶解性突变体的降解行为。

图4描述了EP43max和其优化的变体的热变性曲线，如通过FTIR分析测定的。

图5描述了578min-max和578min-max_DHP的热稳定性，如通过FT-IR测量的。

图6a和6b说明了通过硫酸铵沉淀测量的578min-max和578min-max_DHP的溶解性。

发明详述

本发明涉及用于增加免疫结合剂的溶解性的方法。更具体地，本发明公开了通过在免疫结合剂中引入改善免疫结合剂的溶解性的氨基酸置换来优化免疫结合剂的方法。本发明还涉及根据本发明的方法产生的经改造的免疫结合剂例如scFv。

为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。除非另外指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下面描述了适当的方法和材料。本文中提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考资料以它们的全文通过引用合并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。

本文中使用的术语“抗体”是免疫球蛋白的同义词。根据本发明的抗体可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结构域，Fv(Skerra A.和Pluckthun，A.(1988)Science 240：1038-41)、scFv(Bird，R.E.等人(1988)Science 242：423-26；Huston，J.S.等人(1988；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83)，Fab、(Fab′)2、或本领域技术人员熟知的其他片段。

本文中使用的术语“抗体构架(antibody framework)”或“构架”是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环的支架(Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication 91-3242)。

本文中使用的“抗体CDR”或“CDR”是指抗体的互补决定区，其如Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest.NIH Publication 91-3242)定义的由抗原结合环组成。抗体Fv片段的两个可变结构域中的每一个包含例如3个CDR。

术语“单链抗体”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-V_L-接头-V_H-COOH或NH₂-V_H-接头-V_L-COOH。

如本文中所使用的，“同一性”是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置都被赖氨酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置的数目除以进行比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，通过计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地进行的Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来提供。

“相似的”序列是当比对时共有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似的残基是进行比对的参照序列中的相应氨基酸残基的保守置换。在这点上，参照序列中的残基的“保守置换”是用在物理或功能上与相应的参照残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。因此，“经保守置换修饰的”序列是与参照序列或野生型序列相异在于存在一个或多个保守置换的序列。两个序列之间的“百分数相似性”是包含由两个序列共有的匹配残基或保守置换的位置的数目除以进行比较的位置的数目再乘以因子100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配以及10个位置中有2个包含保守置换，那么这两个序列具有80％的正相似性。

本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少两个，优选更多的进行比对的氨基酸序列的矩阵产生的氨基酸序列(允许在比对中出现缺口)，其使得可能确定各位置上出现频率最高的氨基酸残基。共有序列是包含在各位置上出现频率最高的氨基酸的序列。如果两个或更多个氨基酸等同地出现在单个位置上，那么共有序列包括两个或所有此类氨基酸。

可在不同水平上分析蛋白质的氨基酸序列。例如，可在单个残基水平、多个残基水平、具有缺口的多个残基水平等上展示保守性或变异性。残基可展示相同残基的保守性或可在种类水平上保守。氨基酸种类的实例包括具有下列的氨基酸种类：极性的但不带电荷的侧链或R基团(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的R基团(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；带负电荷的R基团(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R基团(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸种类(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他种类对于本领域技术人员来说是已知的并且可使用结构测定法或其他数据来定义以估量可置换性。在该意义上，可置换的氨基酸可以指可在该位置上进行置换并且保持功能保守性的任何氨基酸。

然而，将认识到，相同种类的氨基酸在它们的生物物理性质上可具有一定程度的不同。例如，将认识到，某些疏水性R基团(例如，丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸)比其他疏水性R基团(例如，缬氨酸或亮氨酸)更加亲水(即，具有更高的亲水性或更低的疏水性)。相对亲水性或疏水性可使用本领域公知的方法(参见，例如，Rose等人，Science，229：834-838(1985)和Cornette等人，J Mol.Biol，195：659-685(1987))来测定。

如本文中所使用的，当一个氨基酸序列(例如，第一V_H或V_L序列)与一个或多个另外的氨基酸序列(例如，数据库中的一个或多个VH或VL序列)比对时，可将一个序列(例如，第一V_H或V_L序列)中的氨基酸位置与一个或多个另外的氨基酸序列中的“相应位置”相比较。如本文中所使用的，“相应位置”表示当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性或百分数相似性时进行比较的序列中的等同位置。

如本文中所使用的，术语“抗体数据库”是指两个或更多个抗体氨基酸序列(“多个”序列)的集合，通常是指数十个、数百个或甚至数千个抗体氨基酸序列的集合。抗体数据库可存储例如抗体V_H区、抗体V_L区或两者的集合的氨基酸序列，或可存储由V_H和V_L区域组成的scFv序列的集合。优选，可将数据库存储在可检索的、固定的介质中，例如计算机上可检索的计算机程序中。在一个实施方案中，抗体数据库是包含或由种系抗体序列组成的数据库。在另一个实施方案中，抗体数据库是包含或由成熟(即，表达的)抗体序列组成的数据库(例如，成熟抗体序列的Kabat数据库，例如KBD数据库)。在另一个实施方案中，抗体数据库包含或由功能性选择的序列(例如，根据QC测定选择的序列)组成。

术语“免疫结合剂”是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置，例如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，这样免疫结合剂能够特异性识别靶抗原。免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括但不限于(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)Fab′片段，其基本上是具有铰链区的一部分的Fab(参见，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul编辑，3.sup.rd ed.1993)；(iv)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(v)包含抗体的单臂的V_L和V_H结构域的Fv片段；(vi)单结构域抗体例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由V_H或V_L结构域组成，Camelid(参见Hamers-Casterman，等人，Nature 363：446-448(1993)和Dumoulin等人，Protein Science11：500-515(2002))或Shark抗体(例如，shark Ig-NARs

)；和(vii)纳米抗体(Nanobody)，包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。

如本文中所使用的，术语“功能性质”是例如为了提高多肽的生产性质或治疗功效，其提高(例如相对于常规多肽)对于本领域技术人员来说是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫结合剂)的性质。在一个实施方案中，功能性质是稳定性(例如，热稳定性)。在另一个实施方案中，功能性质是溶解性(例如，在细胞条件下)。在另一个实施方案中，功能性质是聚集行为。在另一个实施方案中，功能性质是蛋白质表达(例如，在原核细胞中)。在另一个实施方案中，功能性质是在相应的纯化方法中内含体溶解后的重折叠效率。在某些实施方案中，抗原结合亲和力不是期望提高的功能性质。在另一个实施方案中，功能性质的提高或改善不牵涉抗原结合亲和力的显著改变。

术语“溶解性”，如本文中所使用的，是指天然蛋白质，即单体、非聚集的和功能性免疫结合剂的溶解性。“增加的溶解性”意指天然蛋白质的溶解性的提高，其优选通过下列方法中的至少一个方法测定：PEG沉淀法、硫酸铵沉淀法、重折叠得率或本领域技术人员已知的任何其他测定溶解性的方法。PEG沉淀法是如Atha等人在″Mechanism ofPrecipitation of Proteins by Polyethylene Glycols″，JBC，256：12108-12117(1981)中描述的方法。可以例如如下进行硫酸铵沉淀法：制备20mg/ml蛋白质溶液的10μl等分，向每一个所述等分中加入10μl不同饱和度(例如35％、33％、31％、29％、25％、20％和15％)的(NH₄)₂SO₄溶液，然后涡旋5秒并在室温下温育30分钟。在以6000rpm于4℃离心30分钟后，测定上清液中的蛋白质浓度。在该方法中，不同蛋白质的比较物(comparator)是V50值，其是50％的蛋白质沉淀时所处的(NH₄)₂SO₄饱和度的百分数。根据上清液中测定的可溶性蛋白质对应用的(NH₄)₂SO₄饱和度的百分数的曲线测定V50。重折叠得率相应于在相应制造/纯化方法中从溶解的内含体获得的正确折叠的蛋白质的百分数。本文中使用的术语溶解性不是指可溶性表达。

具有提高的溶解性的免疫结合剂

在第一方面，提供免疫结合剂，其在重链氨基酸位置12、103和144(AHo编号)中包含下列溶解性增强基序之一：

(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和

(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或

(a1)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b1)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和

(c1)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)；或

(a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和

(c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或

(a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和

(c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)；或

令人惊讶地发现，在指定位置上指定的氨基酸的存在增加了完整免疫结合剂的总体溶解性。例如，在scFv的VH中3个溶解性增强突变V12S、L144S和V103T组合的情况下，发现所述置换占完整scFv的溶解性的大约60％。因为疏水斑块在所有免疫结合剂的可变结构域中是保守的，因此一个或多个指定位置上的置换可用于提高任何免疫结合剂的溶解性。

免疫结合剂优选是scFv抗体、全长免疫球蛋白、Fab片段、Dab或纳米抗体。

在优选实施方案中，免疫结合剂还包含选自下列的一个或多个氨基酸：(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)、(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)、(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)、(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)和(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。一个或多个指定的氨基酸在相应位置上的存在赋予免疫结合剂增强的稳定性。

本文中指定的氨基酸可存在于天然发生的免疫结合剂或其衍生物中，或免疫结合剂可被改造而掺入一个或多个上述氨基酸。

在优选实施方案中，本文中公开的免疫结合剂特异性结合人TNFα或人VEGF。

具有提高的溶解性的免疫结合剂的改造

如实施例中详细描述的，本文中描述的基于序列的方法已成功用于鉴定赋予提高的溶解性的特定氨基酸残基置换。实施例列出了在免疫结合剂(例如，scFv)的VH区内和任选地VL区中在确定的氨基酸位置处的示例性和优选氨基酸置换。示例性置换包括氨基酸位置处有问题的氨基酸残基(例如，暴露于溶剂的疏水性残基)的置换(更亲水并且在数据库(例如，成熟抗体(KDB)数据库)中以更高的频率发生)。特别优选的置换是比有问题的残基更亲水的最频繁发生的残基。在其他实施方案中，更加亲水的氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。

因此，本发明提供了其中将一个或多个特定氨基酸置换引入免疫结合剂例如scFv抗体内的改造方法。此种置换可以使用标准分子生物学方法例如定点诱变、PCR介导的诱变等来进行。

如实施例中所示，下列氨基酸位置已被鉴定为有问题的氨基酸(即，所谓的“疏水斑块”)以用于在指定的V_H或V_L序列中进行改造：

V_H：氨基酸位置2、4、5、12、103和144；和

V_L：氨基酸位置15、52和147。

使用的编号是AHo编号系统；将AHo编号转换成Kabat系统编号的转换表示于表1和2中。

令人惊讶地发现，VH位置12、103、144(根据AHo编号系统)中的两个或更多个位置处的置换影响整个免疫结合剂的总体溶解性。因为疏水斑块在所有免疫结合剂的可变结构域中是保守的，因此至少两个在指定的位置处的置换可用于提高任何免疫结合剂的溶解性。

在一个实施方案中，本发明提供了改造免疫结合剂例如scFv抗体的方法，其中在一个或多个上述鉴定的氨基酸位置处产生至少两个氨基酸置换，从而产生免疫结合剂的变异(即，突变)形式。

因此，在另一个方面，本发明提供了改造免疫结合剂的方法，所述方法包括：

A)在V_H区、V_L区或V_H和V_L区内选择至少两个氨基酸位置用于突变；和

B)突变选择用于突变的至少两个氨基酸位置，

其中如果选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置位于V_H区中，那么置换是选自12、103和144(根据AHo编号约定；在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置11、89和108)的至少两个重链氨基酸位置，和/或

其中如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在V_L区中，那么置换在选自15、52和147(根据AHo编号约定；在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置15、44和106)的轻链氨基酸位置处。

在某些实施方案中，氨基酸位置被疏水性氨基酸(例如，亮氨酸(L)或缬氨酸(V))占据。在一个实施方案中，重链氨基酸位置12处的氨基酸是缬氨酸(V)。在另一个实施方案中，重链氨基酸位置103处的氨基酸是缬氨酸(V)。在另一个实施方案中，重链氨基酸位置144处的氨基酸是亮氨酸(L)。在另一个实施方案中，轻链氨基酸位置15处的氨基酸是缬氨酸(V)。在另一个实施方案中，轻链氨基酸位置52处的氨基酸是苯丙氨酸(F)。在另一个实施方案中，轻链氨基酸位置147处的氨基酸是缬氨酸(V)。

优选，突变是用更亲水的氨基酸置换选择的氨基酸位置处的氨基酸。在其他实施方案中，更亲水的氨基酸选自丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

在某些实施方案中，所述方法包括：a)在免疫结合剂中选择至少两个氨基酸位置用于突变；和b)突变选择用于突变的至少两个氨基酸位置，其中突变包括选自下列的至少两个置换：

(i)重链氨基酸位置12(使用AHo编号)(在使用Kabat编号的情况下，位置11)处的丝氨酸(S)；

(ii)重链氨基酸位置103(使用AHo编号)(在使用Kabat编号的情况下，位置89)处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；和

(iii)重链氨基酸位置144(使用AHo编号)(在使用Kabat编号的情况下，位置108)处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

在非常优选的实施方案中，重链氨基酸位置12、103和144中的至少一个是苏氨酸(T)。

在其他实施方案中，突变包括在轻链氨基酸位置15(使用AHo或Kabat编号)处使用苏氨酸(T)的置换和/或在轻链氨基酸位置147(使用AHo编号)(在使用Kabat编号约定的情况下，位置106)处使用丙氨酸(A)的置换。

在其他实施方案中，突变导致溶解性增加至少2倍(例如，溶解性增加2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍或更多倍)。

在另一个实施方案中，免疫结合剂的热稳定性、重折叠、表达产量、聚集和/或结合活性未受到突变的不利影响。

在某些实施方案中，突变还包括一个或多个选自下列的在氨基酸位置(AHo编号约定)处的稳定性突变：(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)；(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)；(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)；(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。已证明此类突变对免疫结合剂的稳定性具有影响。

在另一个方面，本发明提供了根据本发明的方法制备的免疫结合剂。

在某些示例性实施方案中，根据本发明的方法改造的免疫结合剂是本领域公认的免疫结合剂(其结合具有治疗重要性的靶抗原)或包含来源于具有治疗重要性的免疫结合剂的可变区(VL和/或VH区)或一个或多个CDR(例如，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3)的免疫结合剂。例如，目前由FDA或其他管理机构批准的免疫结合剂可以根据本发明的方法进行改造。更具体而言，这些示例性免疫结合剂包括但不限于，抗CD3抗体例如莫罗单抗(

OKT3；Johnson&Johnson，Brunswick，NJ；参见Arakawa等人J.Biochem，(1996)120：657-662；Kung和Goldstein等人，Science(1979)，206：347-349)、抗CD11抗体例如依法珠单抗(Genentech，South San Francisco，CA)、抗CD20抗体例如利妥昔单抗(

Genentech，South San Francisco，CA)、托西莫单抗(

GlaxoSmithKline，London)或替伊莫单抗(

Biogen Idec，Cambridge MA)(参见美国专利5,736,137；6,455,043；和6,682,734)、抗CD25(IL2Rα)抗体例如达克珠单抗(

Roche，Basel，Switzerland)或巴利昔单抗(

Novartis，Basel，Switzerland)、抗CD33抗体例如吉妥珠单抗(Wyeth，Madison，NJ-参见美国专利5,714,350和6,350,861)、抗CD52抗体例如阿仑珠单抗(

Millennium Pharmacueticals，Cambridge，MA)、抗GpIIb/gIIa抗体例如阿昔单抗(

Centocor，Horsham，PA)、抗TNFα抗体例如英利昔单抗(Centocor，Horsham，PA)或阿达木单抗(

Abbott，AbbottPark，IL-参见美国专利6,258,562)、抗IgE抗体例如奥马珠单抗(Genentech，South San Francisco，CA)、抗RSV抗体例如帕利珠单抗(Medimmune，Gaithersburg，MD-参见美国专利5,824,307)、抗EpCAM抗体例如依决洛单抗(

Centocor)、抗EGFR抗体例如西妥昔单抗(ImcloneSystems，New York，NY)或帕木单抗(

Amgen，ThousandOaks，CA)、抗HER2/neu抗体例如曲妥珠单抗(

Genentech)、抗α4整联蛋白抗体例如那他珠单抗(

BiogenIdec)、抗C5抗体例如依库珠单抗(

AlexionPharmaceuticals，Chesire，CT)和抗VEGF抗体例如贝伐珠单抗(Genentech-参见美国专利6,884,879)或雷珠单抗(Genentech)。

在某些示例性实施方案中，根据本发明的方法改造的免疫结合剂是上述本领域公认的免疫结合剂。在优选实施方案中，免疫结合剂是scFv抗体。在其他实施方案中，免疫结合剂是例如全长免疫球蛋白、Dab、纳米抗体或Fab片段。

尽管描述了前述内容，但在多种实施方案中，某些免疫结合剂被排除用于本发明的改造方法和/或被排除成为通过改造方法产生的免疫结合剂组合物。例如，在多种实施方案中，存在附带条件，即免疫结合剂不是PCT公开号WO 2006/131013和WO 2008/006235中公开的任何scFv抗体或其变体，例如，PCT公开号WO 2006/131013和WO2008/006235中公开的ESBA105或其变体，所述专利各自的内容明确地通过引用合并入本文。

优选，本文中公开的、用于本文中公开的方法的或通过本文中公开的方法产生的免疫结合剂分别是scFv抗体，但也包括其他免疫结合剂，例如全长免疫球蛋白、Fab片段或本文中描述的任何其他类型的免疫结合剂(例如Dab或纳米抗体)。

在优选实施方案中，本文中公开的、用于本文中公开的方法的或通过本文中公开的方法产生的免疫结合剂分别特异性结合人TNFα或人VEGF。

本发明还包括包含本文中公开的免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。

scFv组合物和制剂

本发明的另一个方面涉及按照本发明的方法制备的scFv组合物。因此，本发明提供了经改造的scFv组合物，其中与原始的目的scFv相比，已将一个或多个溶解性增强突变导入氨基酸序列，其中突变已被导入疏水氨基酸残基的位置。在一个实施方案中，scFv已进行了改造，从而包含一个突变的氨基酸位置(例如，一个构架位置)。在其他实施方案中，scFv已进行了改造，从而包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个突变的氨基酸位置(例如，构架位置)。

在某些实施方案中，突变还包括于2008年6月25日提交的、名称为“Methods of Modifying Antibodies，and Modified Antibodieswith Improved Functional Properties”的PCT申请PCT/CH2008/000285或2008年3月12日提交的、名称为“Methods ofModifying Antibodies，and Modified Antibodies with ImprovedFunctional Properties”的美国临时申请号系列号61/069,056(两者通过引用合并入本文)中所述的一个或多个稳定性突变。例如，免疫结合剂还可包含选自下列的在氨基酸位置(AHo编号约定)处的置换：(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)；(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)；(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)；(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。一个或多个在指定位置处的突变对整个免疫结合剂的总体溶解性具有影响。在其他实施方案中，突变还包括下列稳定性突变(AHo编号约定)：(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)；(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)；(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)；(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。

本发明的另一个方面涉及本发明的scFv组合物的药物制剂。此类制剂通常包含scFv组合物和药学上可接受的载体。如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选，载体适合于例如静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱、表皮施用(例如，通过注射或输注)、或局部施用(例如，至眼或皮肤)。取决于施用途径，可将scFv包被在材料中以保护化合物免受酸的作用和可使化合物失活的其他天然条件的损害。

本发明的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持亲本化合物期望的生物学活性并且不提供任何不想要的毒理学效应的盐(参见例如，Berge，S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括从无毒无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸(phosphoric)、硫酸(sulfuric)、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸(phosphorous)等衍生的盐，以及从无毒有机酸例如脂肪族一羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等衍生的盐。碱加成盐包括从碱土金属例如钠、钾、镁、钙等衍生的盐，以及从无毒有机胺例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等衍生的盐。

本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠(sodium metabisulfite)、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明的药物组合物的适当的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)和其适当的混合物，植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂维持恰当的流动性。

此类组合物还可包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌方法(同上)和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的存在。也可期望将等渗剂例如糖、氯化钠等包含入组合物。此外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来获得可注射药物形式的延长吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域内是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则预期其在本发明的药物组合物中的用途。还可将补充的活性化合物掺入组合物。

治疗性组合物通常必须是无菌的并且在生产和贮存的条件下是稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适当的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来获得可注射组合物的延长的吸收。

无菌注射液可通过将活性化合物以需要的量与上面例举的成分的一种或组合一起掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微过滤(如果需要的话)来制备。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和需要的来自上面列举的成分的其他成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，制备的优选方法是从之前无菌过滤的溶液产生包含活性成分和任何额外的期望的成分的粉剂的真空干燥和冷冻干燥(冻干法(lyophilization))。

可与载体材料组合从而产生单个剂型的活性成分的量将随正在治疗的受试者以及施用的特定模式的变化而变化。可与载体材料组合从而产生单个剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。一般地，除百分之百外，该量将在大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分的范围内(与药学上可接受的载体组合)。

调整给药方案以提供最佳的期望的应答(例如，治疗应答)。例如，可施用单个大丸剂，可在一段时间内施用几份分开的剂量或可根据治疗状况的紧急性的需要，按比例减少或增加剂量。特别有利地以单位剂型(dosage unit form)配制胃肠外组合物以便施用和保持剂量均一。本文中使用的单位剂型是指适合用作用于待治疗的受试者的单份剂量的物理上分开的单位；各单位包含经计算与需要的药物载体一起产生期望的治疗效果的预先确定量的活性化合物。本发明的单位剂型的规格(specification)受制于和直接取决于(a)活性化合物的独特特征和要获得的具体治疗效果，和(b)配制用于治疗个体的敏感性的此类活性化合物的领域中固有的限制。

抗体位置编号系统

提供了用于鉴定抗体重链和轻链可变区中的氨基酸残基位置的两个不同编号系统的换算表。Kabat编号系统进一步描述于Kabat等人(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。AHo编号系统进一步描述于Honegger，A.和Pluck thun，A.(2001)J.Mol.Biol.309：657-670)。

重链可变区编号

表1：重链可变结构域中残基位置的换算表

轻链可变区编号

表2：轻链可变结构域中残基位置的换算表

其他实施方案

应理解，本发明还包括美国临时专利申请系列号60/905,365(WO08/110348的优先权给予申请)的附录(A-C)和美国临时专利申请系列号60/937,112(WO 09/000098的优先权给予申请)的附录(A-I)中所示的任何方法、参考文献和/或组合物，包括但不限于，已鉴定的数据库、生物信息学、计算机中(in silico)的数据操作和解释方法、功能测定法、优选序列、优选残基位置/改变、构架鉴定和选择、构架改变、CDR比对和整合以及优选改变/突变。

关于此类方法和组合物的另外的信息可见于U.S.S.N.s60/819,378；和分别于2006年7月和2007年2月6日提交的标题为“scFv Antibodies Which Pass Epithelial And/Or EndothelialLayers”的U.S.S.N.s 60/899,907和PCT公开号WO 2008/006235；2006年6月6日提交的标题为“Stable And Soluble AntibodiesInhibiting TNFα”的WO 06131013A2；2003年5月21日提交的标题为“Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate EnhancedStability In The Intracellular Environment And Methods OfIdentifying Same”的EP1506236A2；2000年12月18日提交的标题为“Intrabodies ScFv with defined framework that is stable ina reducing environment”的EP1479694A2；2000年12月18日提交的标题为“Intrabodies With Defined Framework That Is Stable InA Reducing Environment And Applications Thereof”的EP1242457B1；2003年5月21日提交的标题为“Immunoglobulin Frameworks WhichDemonstrate Enhanced StabilityIn The IntracellularEnvironment And Methods Of Identifying Same”的WO03097697A2；和2000年12月18日提交的标题为“Intrabodies With DefinedFramework That Is Stable In A Reducing Environment AndApplications Thereof”的WO 0148017A1；和Honegger等人，J.Mol.Biol.309：657-670(2001)。

此外，应理解，本发明还包括适合于其他抗体形式例如全长抗体或其片段(例如，Fab、Dab等)的开发和/或改进的方法和组合物。因此，本文中的原理和残基(其鉴定为适合于选择或改变以获得期望的生物物理学和/或治疗性质)可用于广泛的免疫结合剂。在一个实施方案中，通过修饰本文中公开的一个或多个残基位置来改进治疗相关抗体例如FDA批准的抗体。

然而，本发明并不限于免疫结合剂的改造。例如，本领域技术人员将认识到，本发明的方法可以用于改造其他、非免疫球蛋白、结合分子，包括但不限于，纤连蛋白结合分子例如Adnectins(参见WO01/64942以及美国专利号6,673,901、6,703,199、7,078,490和7,119,171)、亲和体(Affibody)(参见例如，美国专利6,740,734和6,602,977以及WO 00/63243)、Anticalins(也称为脂质运载蛋白)(参见WO99/16873和WO 05/019254)、A结构域蛋白质(参见WO 02/088171和WO 04/044011)和锚蛋白重复蛋白质例如Darpins或亮氨酸重复蛋白质(参见WO 02/20565和WO 06/083275)。

通过下列不应当被解释为进一步限定的实施例来进一步举例说明本公开内容。整个本申请中引用的所有图和所有参考文献、专利、公开的和未公开的专利申请的内容明确地以它们的全文通过引用合并入本文。

实施例1：具有改善的溶解性的scFv的产生

在这个实施例中，基于结构建模和序列分析的方法用于鉴定在scFv构架区中导致改善的溶解性的突变。

a)结构分析

使用可经由ExPASy网络服务器访问的自动化蛋白质结构同源性建模服务器，对ESBA105 scFv的3D结构进行建模。根据溶剂可达的相对面积(rSAS)分析结构，并且残基如下进行分类：(1)显示rSAS≥50％的残基为暴露的；和(2)50％≤rSAS≥25％的残基为部分暴露的。rSAS≥25％的疏水性残基视为疏水斑块(hydrophobicpatch)。为了验证发现的每个疏水斑块的溶剂可达面积，利用与ESBA105具有高同源性的27个PDB文件和高于

的分辨率完成计算。计算疏水斑块的平均rSAS和标准差，并且对其中的每一个进行详细检查(参见表3)。

表3：疏水斑块的评估。

在ESBA105中鉴定的大多数疏水斑块对应于可变-恒定结构域(VH/CH)界面。这与scFv形式中的暴露于溶剂的疏水性残基的先前发现(Nieba等人，1997)相关。2个疏水斑块(VH 2和VH 5)也促成VL-VH相互作用，并且因此从序列分析中排除。

b)可溶性突变的设计

从Annemarie Honegger的抗体网页(www.bioc.uzh.ch/antibody)检索到总共122个VL和137个VH序列。序列最初对应于从Protein Data Bank(PDB)(www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中提取的Fv或Fab形式的393个抗体结构。不考虑物种或亚组，将序列用于分析，以便增加发现具有比天然残基更高的亲水性的备选氨基酸的概率。排除与数据库内的任何其他序列具有超过95％的同一性的序列，以减少偏差。序列进行比对且就残基频率进行分析。应用序列分析工具和算法，以鉴定和选择亲水突变，从而破坏ESBA105中的疏水斑块。序列根据免疫球蛋白可变结构域的AHo编号系统(Honegger和Pluckthun 2001)进行比对。将分析限制于构架区。

各位置i在定制的数据库中的残基频率f(r)通过将在数据集内观察到的特定残基的次数除以序列总数来计算。在第一个步骤中，计算每个疏水斑块的不同氨基酸的出现频率。利用上文描述的定制的数据库分析ESBA105中鉴定的每个疏水斑块的残基频率。表4报告了在疏水斑块处的残基频率(除以数据库中存在的残基的总数)。

在第二个步骤中，通过选择在各个疏水斑块处最丰富的亲水残基，将在疏水斑块处的亲水残基的频率用于设计可溶性突变。表5报告了使用这种方法鉴定的可溶性突变体。根据在数篇文章中公开的平均疏水性值计算亲本和突变体残基的疏水性，并且将其表示为侧链暴露于溶剂的水平的函数。

表5.在ESBA105中引入以破坏疏水斑块的不同溶解性突变

*在位置144处的疏水斑块不改变成数据库中最丰富的亲水残基，而改变成Ser，因为这已包含在ESBA105的CDR供体中。

c)可溶性ESBA105变体的测试

单独或以多重组合引入可溶性突变，并且就重折叠得率、表达、活性和稳定性以及聚集模式对其进行测试。表6显示基于对溶解性的潜在贡献和突变将改变抗原结合的风险水平，在每种ESBA105优化变体中引入的可溶性突变的各种组合。

表6：ESBA105的可溶性变体的设计。

*在第二轮中分开测试

**下划线将分别包含于轻链和重链中的突变的数目分开。

d)溶解性的测量

通过最初由Atha等人(JBC，256：12108-12117(1981))描述的PEG沉淀法测定ESBA105和变体的最大溶解性。在该方法中，测量离心的PEG-蛋白质混合物的上清液中的蛋白质浓度，并针对PEG浓度进行对数作图。将20mg/ml的蛋白质溶液与30-50％饱和度的PEG溶液1∶1混合。在凭经验确定Log S对Peg浓度(％w/v)的线性依赖后，基于观察到的野生型ESBA105的溶解性曲线图选择这些条件。显示优良溶解性的变体ESBA105的几个例子的溶解性曲线示于图1中。溶解性值的完整列表也在表7中提供。

表7.与亲本ESBA105相比，突变体的估计的最大溶解性和活性。

e)热稳定性的测量

使用FT-IR ATR光谱法进行亲本ESBA105的热稳定性测量和溶解性跟踪。对分子实施广泛温度范围(25-95℃)的热攻击。通过对干涉图信号应用傅里叶变换获得变性曲线图(参见图2)。通过应用玻尔兹曼S形模型，将变性曲线图用于估计每种ESBA105变体的热去折叠转变的中点(TM)(表8)。

iii.聚集性的测量

ESBA105及其可溶性变体也在时间依赖性测试上进行分析，以评估降解和聚集行为。为此，在升高的温度下(40℃)在磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中温育可溶性蛋白质(20mg/ml)。对照样品维持于-80℃下。在2周的温育期后就降解(SDS-PAGE)和聚集(SEC)分析样品。这允许弃去易于降解(参见图3)或显示形成可溶性或不溶性聚集物的倾向(参见表9)的变体。

表9：不溶性聚集的测量

蛋白质	蛋白质丧失(不溶性聚集物)
		ESBA105	0-10％
ESBA105Opt 1_0	0-10％
		ESBA105Opt 0_2	0-10％
ESBA105Opt 1_2	45-50％
		ESBA105VH V103T	0-10％

iv.可溶性变体的表达和重折叠

也就表达和重折叠得率(相对于亲本ESBA105分子)测试可溶性突变体。这些研究的结果显示于表10中。

表10.可溶性变体的表达和重折叠。

尽管与亲本ESBA105分子相比，所有亲水性可溶性突变体显示出改善的溶解性，但这些分子中仅少数显示适合于其他生物物理学性质。例如，相对于亲本ESBA105分子，许多变体具有减少的热稳定性和/或重折叠得率。特别地，在位置VL147处的亲水置换严重减少稳定性。因此，使不显著影响热稳定性的可溶性突变组合，并且对其实施进一步的热胁迫以证实其性质。

包含4个不同可溶性突变的组合的3个突变体(Opt 1.0、Opt 0.2和VH：V103T)显著改善ESBA105的溶解性，而不影响重现性、活性或热稳定性。然而，在40℃下温育2周后，在ESBA105中具有Opt1.0和Opt0.2的组合突变的突变体(Opt 1_2)显示增加量的不溶性聚集物(参见表9)。这可以通过位置VL 15处的Val在β折叠转角中的作用加以解释，因为Val在所有氨基酸中具有最大的β折叠倾向。这个结果证实在位置VL 15处的单个可溶性突变是耐受的，但在与破坏其他疏水斑块的可溶性突变体的组合中则不耐受。因此，包含于Opt0_2和VH：V103T中的突变选择为改善scFv分子的溶解性性质的最佳执行者。

实施例2：具有增强的溶解性和稳定性的scFv的产生

通过用经由质量控制(QC)测定法鉴定的稳定性突变置换，进一步优化通过溶解性设计鉴定的ESBA105变体。总共产生了4种构建体，其包含1-3个的上文实施例1中鉴定的可溶性突变(与QC 7.1和15.2中发现的所有稳定性突变(即，VL结构域中的D31N和V83E，以及VH结构域中的V78A、K43和F67L)组合)。所有优化的构建体产生比野生型scFv更可溶的蛋白质(参见表11)。最佳构建体在溶解性方面一致地显示超过2倍的增加(相对于野生型)。scFv分子的活性和稳定性都不受稳定性和溶解性增强突变的组合的显著影响。

表11：具有优化的溶解性和稳定性的scFv

所有4种变体的溶解性值用于解卷积各个突变对scFv溶解性的贡献。所有突变看起来都以累积方式促成scFv的溶解性，尽管这些残基中的几个在基本序列中和在3D结构内彼此关系密切。分析表明，VH结构域中的3个溶解性增强突变(V12S、L144S、V103T(或V103S))的组合占～60％的scFv溶解性。因为疏水斑块在所有免疫结合剂的可变结构域中是保守的，所以这个最佳突变组合可以用于改善几乎任何scFv或其他免疫结合剂分子的溶解性。

实施例3：Epi43max(有效的TNFα结合剂)的溶解性优化的变体

表12描述了Epi43max(有效的TNF结合剂)的3个优化的变体的表征数据。EP43_maxDHP是EP43max的溶解性增强变体并且包括3个上述溶解性增强突变(AHo位置12处的V→S、AHo位置103处的V→T和AHo位置144处的L→T)。通过″min″与″max″移植物之间的结构域混编产生EP43_maxmin和EP43_minmax变体。具体地，″minmax″变体包含轻链的最小移植物(仅CDR-移植物)形式和重链的最大移植物形式(即，移植的兔CDR加上参与抗原结合的兔构架残基)。相反，″maxmin″变体包含轻链的最大移植物形式和重链的最小移植物形式。通过FTIR分析比较EP43max和其优化的变体的热变性曲线(参见图4)。发现Epi43minmax具有比Epi43max更低的去折叠中点。此外，mimax变体展示一步去折叠转换，这表明这两个结构域在非常相似的温度下去折叠。

实施例4：VEGF免疫结合剂的溶解性增强的衍生物

除了上述TNF免疫结合剂(ESBA 105和Epi43max)外，根据本发明的方法改造VEGF免疫结合剂的几个可溶性衍生物。具体地，通过选择下列残基，改造这些VEGF免疫结合剂变体以使其具有被破坏的疏水斑块(″DHP″)：(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；和(c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。将这些DHP变体的生物物理特征与它们的野生型对应物相比较。此类特征包括熔解温度或T_m(如通过Bio-ATR测定的)，β-折叠片在60℃丧失的百分比(如通过AquaSpec测定的)，在于60℃下沉淀后蛋白质丧失的百分比，通过硫酸铵沉淀法测定的溶解性，产物中的重折叠得率，和大肠杆菌中的表达水平。

如下面表14中所描述的，通过引入DHP基序，显著增加了VEGF免疫结合剂之一(ESBA578minmax FW1.4DHP)的溶解性。此外，其他生物物理性质(例如，热稳定性)未受到基序的引入的不利影响或改善。用于测定578min-max和其溶解性优化的变体(578min-max_DHP)的熔解温度的热稳定性曲线描述于图5和表13中，而用于测定溶解性值的硫酸铵沉淀曲线描述于图6中。

表12

表14：VEGF免疫结合剂的生物物理表征

等同物

本领域技术人员将认识到或能够确定(通过只使用常规实验)本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物意欲包括于下列权利要求中。

Claims

1.一种免疫结合剂，其包含重链氨基酸位置12、103和144(AHo编号)中的下列溶解性增强基序之一：

(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和

(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或

(a1)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b1)重链氨基酸位置103的苏氨酸(T)；和

(c1)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)；或

(a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和

(c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或

(a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和

(c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)。

2.权利要求1的免疫结合剂，其还包含：

(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)；

(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)；

(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)；

(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和/或

(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。

3.增强免疫结合剂的溶解性的方法，所述免疫结合剂包含重链可变(V_H)区或其片段，所述方法包括：

A)在V_H区中选择至少两个氨基酸位置用于突变；和

B)突变选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置，

其中所述至少两个氨基酸位置选自由12、103和144(根据AHo编号约定)组成的重链氨基酸位置，并且突变包括用亲水性氨基酸置换所选择的氨基酸位置处的氨基酸。

4.权利要求3的方法，其中所述亲水性氨基酸是：

(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；和/或

(c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

5.权利要求3或4的方法，其中选择用于突变的氨基酸位置处的氨基酸是疏水性氨基酸。

6.权利要求5的方法，其中所述疏水性氨基酸是亮氨酸(L)或缬氨酸(V)。

7.权利要求3至6的任一项的方法，其中

(a)重链氨基酸位置12处的选择用于突变的氨基酸是缬氨酸(V)；

(b)重链氨基酸位置103处的选择用于突变的氨基酸是缬氨酸(V)；和

(c)重链氨基酸位置144处的选择用于突变的氨基酸是亮氨酸(L)。

8.权利要求3至7的任一项的方法，其中免疫结合剂的热稳定性、重折叠、表达产量、聚集和/或结合活性未受到突变的不利影响。

9.权利要求3至8的任一项的方法，其中所述突变导致溶解性增加至少2倍。

10.权利要求3至9的任一项的方法，其中所述突变还包括在选自下列的氨基酸位置(AHo编号约定)处引入一个或多个突变的步骤：

(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)；

(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)；

(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)；

(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和

(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。

11.根据权利要求3至10的任一项的方法制备的免疫结合剂。

12.权利要求1、2或11的任一项的免疫结合剂，其为scFv抗体、全长免疫球蛋白、Fab片段、Dab或纳米抗体。

13.权利要求1、2、11或12的任一项的免疫结合剂，其中所述免疫结合剂特异性结合人TNFα或人VEGF。

14.包含权利要求1、2、11、12或14的任一项的免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。