ES2629345T3 - Optimización de la solubilidad de agentes de unión inmunológica - Google Patents

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Abstract

Agente de unión inmunológica que comprende uno de los siguientes motivos que potencian la solubilidad en las posiciones de aminoácido de cadena pesada 12, 103 y 144 (numeración de AHo): (a) serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 12; (b) serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103; y (c) treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 144; o (a1) serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 12; (b1) treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103; y (c1) serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 144; o (a2) serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 12; (b2) treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103; y (c2) treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 144.

Description

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DESCRIPCION
Optimizacion de la solubilidad de agentes de union inmunologica Antecedentes de la invencion
Los anticuerpos han demostrado ser agentes terapeuticos muy eficaces y satisfactorios en el tratamiento de cancer, enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos. Aunque normalmente se han usado cllnicamente anticuerpos de longitud completa, existen varias ventajas que puede proporcionar el uso de un fragmento de anticuerpo, tal como aumento de la penetracion en el tejido, ausencia de la funcion efectora de Fc combinada con la capacidad para anadir otras funciones efectoras y la probabilidad de menos efectos secundarios sistemicos que resultan de una semivida in vivo mas corta de manera sistemica. Las propiedades farmacocineticas de fragmentos de anticuerpo indican que pueden ser particularmente muy adecuados para enfoques terapeuticos locales. Ademas, los fragmentos de anticuerpo pueden ser mas faciles de producir que los anticuerpos de longitud completa en determinados sistemas de expresion.
Un tipo de fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que se compone de un dominio variable de cadena pesada (Vh) conjugado con un dominio variable de cadena ligera (Vl) mediante una secuencia de ligador. Por tanto, los scFv carecen de todos los dominios de region constante de anticuerpo y los residuos de aminoacido de la anterior superficie de contacto de dominio variable/constante (residuos de superficie de contacto) quedan expuestos al disolvente. Puede prepararse un scFv a partir de un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, molecula de IgG) a traves de tecnicas de modificacion mediante ingenierla genetica recombinante establecidas. Sin embargo, la transformacion de un anticuerpo de longitud completa para dar un scFv a menudo da como resultado estabilidad y solubilidad escasas de la protelna, bajos rendimientos de produccion y una alta tendencia a agregarse, lo que aumenta el riesgo de inmunogenicidad.
Por consiguiente, se han realizado intentos para mejorar propiedades tales como solubilidad y estabilidad de los scFv. Por ejemplo, Nieba, L. et al. (Prot. Eng. (1997) 10:435-444) seleccionaron tres residuos de aminoacido que se sabla que eran residuos de superficie de contacto y los mutaron. Observaron un aumento de la expresion periplasmica de los scFv mutados en bacterias, as! como una disminucion de la tasa de agregacion inducida termicamente, aunque la estabilidad termodinamica y la solubilidad no se vieron alteradas significativamente. Ademas, en su publication, declaran expresamente que no observaron ninguna mejora en la solubilidad del estado de la protelna nativa de los scFv modificados por ingenierla genetica tal como se determino mediante el metodo de precipitation de PEG. Davies y Riechmann (FEBS Letters (1994) 339: 285-290) describen fragmentos de anticuerpos humanos “camelizantes” sustituyendo residuos de aminoacido en la superficie de contacto de Vh/Vl. Jung et al. (J. Mol. Biol. (1999) 294: 163-180) describen el uso de una combination de mutagenesis directa y aleatoria para generar una biblioteca de mutantes basada en el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) 4D5Flu. Las posiciones de aminoacido aleatorizadas en la biblioteca de presentation de fagos de 4D5Flu para la optimizacion del plegamiento y la estabilidad in vivo incluyen las posiciones de residuo 11, 89 y 108 (numeration de Kabat). Tambien se han notificado otros estudios en los que se llevo a cabo mutagenesis dirigida al sitio en residuos de aminoacido particulares dentro del scFv (veanse por ejemplo, Tan, P.H. et al. (1988) Biophys. J. 75:1473-1482; Worn, A. y Pluckthun, A. (1998) Biochem. 37:13120-13127; Worn, A. y Pluckthun, A. (1999) Biochem. 38:8739-8750). En estos diversos estudios, se eligieron los residuos de aminoacido seleccionados para la mutagenesis basandose en sus posiciones conocidas dentro de la estructura de scFv (por ejemplo, a partir de estudios de modelado molecular).
En otro enfoque, se injertaron las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un scFv muy escasamente expresado en las regiones de marco de un scFv que habla demostrado tener propiedades favorables (Jung, S. y Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966). El scFv resultante mostro una expresion soluble y estabilidad termodinamica mejoradas.
El progreso en la modificacion mediante ingenierla genetica de scFv para mejorar la solubilidad y otras propiedades funcionales se revisa, por ejemplo, en Worn, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 305:989-1010. Sin embargo, todavla son necesarios nuevos enfoques que permitan el diseno racional de agentes de union inmunologica, en particular de scFv con solubilidad superior. Ademas, todavla son necesarios metodos de modificacion mediante ingenierla genetica de scFv, y otros tipos de anticuerpos, para conferir de ese modo solubilidad mejorada, especialmente solubilidad de la protelna nativa.
Sumario de la invencion
Esta invencion se refiere a un agente de union inmunologica que comprende un motivo que potencia la solubilidad en la region variable de cadena pesada Vh as! como a metodos para modificar mediante ingenierla genetica agentes de union inmunologica, tal como anticuerpos scFv, para conferir solubilidad mejorada. En realizaciones particulares, los metodos de la invencion comprenden la sustitucion de aminoacidos dentro de una secuencia de la region variable de cadena pesada y/o la region variable de cadena ligera de un agente de union inmunologica que son
potencialmente problematicos para la solubilidad con residuos de aminoacido preferidos que confieren solubilidad mejorada. Por ejemplo, en determinadas realizaciones preferidas, un residuo hidrofobo se sustituye con un residuo hidrofilo.
Preferiblemente, el agente de union inmunologica proporcionado, el agente de union inmunologica usado en, o 5 producido mediante, los metodos de modificacion mediante ingenierla genetica de la invencion es un scFv, pero tambien pueden modificarse mediante ingenierla genetica otros agentes de union inmunologica, tales como inmunoglobulinas de longitud completa, fragmentos Fab, anticuerpos de un solo dominio (por ejemplo, los Dab) y Nanobodies segun el metodo. La invencion tambien abarca agentes de union inmunologica preparados segun el metodo de modificacion mediante ingenierla genetica, as! como composiciones que comprenden los agentes de 10 union inmunologica y un portador farmaceuticamente aceptable. La invencion se define mediante las reivindicaciones.
En un aspecto, la invencion se refiere a un agente de union inmunologica que comprende uno de los siguientes motivos que potencian la solubilidad en las posiciones de aminoacido de cadena pesada 12, 103 y 144 (numeracion de AHo):
15 (a) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
(b) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y
(c) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144; o (a1) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
(b1) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y
20 (c1) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144; o
(a2) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
(b2) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y (c2) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144; o (a3) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
25 (b3) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y
(c3) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo un metodo de modificacion mediante ingenierla genetica de un agente de union inmunologica, comprendiendo el agente de union inmunologica (i) una region variable de cadena pesada, o fragmento de la misma, comprendiendo la region variable de cadena pesada residuos de region de marco 30 de Vh y/o (ii) una region variable de cadena ligera, o fragmento de la misma, comprendiendo la region variable de cadena ligera residuos de region de marco de Vl, comprendiendo el metodo:
A) seleccionar al menos dos posiciones de aminoacido dentro de los residuos de region de marco de Vh, los residuos de region de marco de Vl o los residuos de region de marco de Vh y de Vl para la mutacion; y
B) mutar las al menos dos posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion,
35 en el que si las al menos dos posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion estan dentro de los residuos de region de marco de Vh, la sustitucion tiene lugar en una o mas posiciones de aminoacido de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en 12, 103 y 144 (segun el convenio de numeracion de AHo) y/o
en el que si la una o mas posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion estan dentro de los residuos de region de marco de Vl, la sustitucion tiene lugar en una posicion de aminoacido de cadena ligera seleccionada del 40 grupo que consiste en 15, 52 y 147 (segun el convenio de numeracion de AHo; posiciones de aminoacido 15, 44 y 106 usando la numeracion de Kabat).
Las al menos dos posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion, y el/los residuo(s) de aminoacido insertado en la(s) posicion/posiciones seleccionada(s) se describen en mas detalle a continuacion. La numeracion
de las posiciones de aminoacido expuesta a continuacion usa el sistema de numeracion de AHo; las posiciones correspondientes usando el sistema de numeracion de Kabat se describen ademas en el presente documento y las tablas de conversion para los sistemas de numeracion de AHo y de Kabat se exponen a continuacion en la descripcion detallada. Los residuos de aminoacido se exponen usando el codigo de abreviatura de una letra 5 convencional.
Se ha encontrado sorprendentemente que la presencia de las mutaciones indicadas en las posiciones indicadas aumenta la solubilidad global del agente de union inmunologica sin tener un impacto negativo en otras propiedades funcionales de la protelna. Por ejemplo, en el caso de la combinacion de las tres mutaciones que potencian la solubilidad V12S, L144S y V103T en la Vh de un scFv, se encontro que dichas sustituciones representan 10 aproximadamente el 60% de toda la solubilidad de scFv. Esto difiere de los intentos notificados en la tecnica anterior para aumentar el rendimiento de expresion de agentes de union inmunologica. Por ejemplo, el documento US 6.815.540 describe la modificacion de un agente de union inmunologica disminuyendo la hidrofobia en una region de la superficie de contacto entre dominios en la cadena. Para dicho fin, se identificaron 16 posiciones en la region de marco variable de cadena pesada que pueden sustituirse individualmente por uno o mas aminoacidos seleccionados 15 de un grupo de 10 aminoacidos. Se encontro que se aumento el rendimiento de expresion de los mutantes generados. Ademas, el mismo grupo de investigacion publico en 1999, es decir, tres anos antes de la fecha prioritaria de la patente estadounidense mencionada, un artlculo (vease Jung, S., Honegger, A. y Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966) declarando que el reemplazo de residuos de superficie hidrofoba por otros mas hidrofilos se han notificado en varios estudios para mejorar el rendimiento de production. Segun los autores, el 20 aumento en el rendimiento de produccion se debe un reparto cinetico mejorado entre el plegamiento correcto y la agregacion de material mal plegado, mientras que la solubilidad de la protelna nativa no resulta siquiera afectada, ni su estabilidad termodinamica de manera significativa. Por tanto, le resulta claro a un experto en la tecnica que el parametro de solubilidad al que Pluckthun et al se refieren, atane solamente a la expresion soluble y no a la solubilidad global de la protelna nativa.
25 Breve descripcion de las figuras
La invention se entendera mejor y los objetivos distintos a los expuestos anteriormente resultaran evidentes cuando se de consideration a la siguiente descripcion detallada de los mismos. Tal descripcion se refiere a los dibujos anexos, en los que:
La figura 1 representa las curvas de solubilidad de precipitation de PEG de ESBA105 silvestre (E105) y variantes de 30 solubilidad del mismo.
La figura 2 representa los perfiles de desnaturalizacion termica para ESBA105 silvestre (E105) y variantes de solubilidad del mismo tal como se miden tras exposition termica en un amplio intervalo de temperaturas (25-96°C).
La figura 3 representa un gel de SDS-PAGE que muestra el comportamiento de degradation de diversos mutantes de solubilidad de ESBA105 despues de dos semanas de incubation en condiciones de estres termico.
35 La figura 4 representa las curvas de desnaturalizacion termica de EP43max y sus variantes optimizadas tal como se determina mediante analisis de FTIR.
La figura 5 representa la estabilidad termica de 578mln-max y 578mln-max_DHP tal como se mide mediante FT-IR.
Las figuras 6a y 6b ilustran la solubilidad de 578mln-max y 578mln-max_DHP tal como se determina mediante precipitacion de sulfato de amonio.
40 Descripcion detallada de la invencion
La invencion se refiere a metodos para potenciar la solubilidad de agentes de union inmunologica. Mas especlficamente, la presente invencion da a conocer metodos para optimizar agentes de union inmunologica introduciendo sustituciones de aminoacido dentro del agente de union inmunologica que mejoran la solubilidad del agente de union inmunologica. La invencion tambien se refiere a agentes de union inmunologica modificados 45 mediante ingenierla genetica, por ejemplo, scFv, producidos segun los metodos de la invencion.
Para que la invencion pueda entenderse mas facilmente, en primer lugar se definen ciertos terminos. A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque pueden usarse materiales y metodos similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la 50 practica o las pruebas de la invencion, a continuacion se describen materiales y metodos adecuados. En caso de conflicto, prevalece la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
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El termino “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento es un sinonimo de “inmunoglobulina”. Los anticuerpos segun la presente invencion pueden ser inmunoglobulinas completas o fragmentos de las mismas, que comprenden al menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tal como dominios variables individuales, Fv (Skerra A. y Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al (1988; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 u otros fragmentos que conoce bien un experto en la tecnica.
El termino “region de marco de anticuerpo” o “region de marco” tal como se usa en el presente documento se refiere a la parte del dominio variable, o bien VL o bien VH, que sirve como armazon para los bucles de union a antlgeno de este dominio variable (Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Publicacion del NIH 91-3242).
El termino “CDR de anticuerpo” o “CDR” tal como se usa en el presente documento se refiere a las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo que consisten en los bucles de union a antlgeno tal como se definieron por Kabat E.A. et al., (1991) (Sequences of proteins of immunological interest. Publicacion del NIH 913242). Cada uno de los dos dominios variables de un fragmento Fv de anticuerpo contiene, por ejemplo, tres CDR.
El termino “anticuerpo de cadena sencilla” o “scFv” se refiere a una molecula que comprende una region variable de cadena pesada (Vh) de anticuerpo y una region variable de cadena ligera (Vl) de anticuerpo conectadas por un ligador. Tales moleculas de scFv pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-ligador-VH-COOH o NH2-Vh- ligador-VL-COOH.
Tal como se usa en el presente documento, “identidad” se refiere a la coincidencia de secuencia entre dos polipeptidos, moleculas o entre dos acidos nucleicos. Cuando una posicion en ambas de las dos secuencias comparadas esta ocupada por la mima subunidad monomerica de aminoacido o base (por ejemplo, si una posicion en cada una de las dos moleculas de ADN esta ocupada por adenina, o una posicion en cada uno de dos polipeptidos esta ocupada por una lisina), entonces las moleculas respectivas son identicas en esa posicion. El “porcentaje de identidad” entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido entre el numero de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si coinciden 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias, entonces las dos secuencias tienen una identidad del 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten una identidad del 50% (coinciden 3 de las 6 posiciones totales). Generalmente, se realiza una comparacion cuando se alinean dos secuencias para dar una maxima identidad. Tal alineacion puede proporcionarse usando, por ejemplo, el metodo de Needleman et al. (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453, implementado de manera conveniente mediante programas informaticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.).
Secuencias “similares” son aquellas que, cuando se alinean, comparten residuos de aminoacido identicos y similares, en los que residuos similares son sustituciones conservativas por residuos de aminoacido correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una “sustitucion conservativa” de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitucion por un residuo que es flsica o funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene un tamano, forma, carga electrica, propiedades qulmicas similares, incluyendo la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrogeno, o similares. Por tanto, una secuencia “modificada con una sustitucion conservativa” es una que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia silvestre en la que estan presentes una o mas sustituciones conservativas. El “porcentaje de similitud” entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones que contienen residuos coincidentes o sustituciones conservativas compartidas por las dos secuencias dividido entre el numero de posiciones comparadas y multiplicadas por un factor 100. Por ejemplo, si coinciden 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservativas, entonces las dos secuencias tienen una similitud positiva del 80%.
“Secuencia consenso de aminoacidos” tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de aminoacidos que puede generarse usando una matriz de al menos dos, y preferiblemente mas, secuencias de aminoacidos alineadas, y permitiendo huecos en la alineacion, de manera que es posible determinar el residuo de aminoacido mas frecuente en cada posicion. La secuencia consenso es aquella secuencia que comprende los aminoacidos que estan representados mas frecuentemente en cada posicion. En el caso de que dos o mas aminoacidos esten igualmente representados en una unica posicion, la secuencia consenso incluye ambos o todos de esos aminoacidos.
La secuencia de aminoacidos de una protelna puede analizarse a diversos niveles. Por ejemplo, puede presentarse conservacion o variabilidad a nivel de un solo residuo, a nivel de multiples residuos, multiples residuos con huecos, etc. Los residuos pueden presentar conservacion del residuo identico o pueden conservarse a nivel de clase. Los ejemplos de clases de aminoacido incluyen la clase de aminoacido con grupos R o cadenas laterales polares pero no cargados (serina, treonina, asparagina y glutamina); con grupos R cargados positivamente (lisina, arginina e histidina); con grupos R cargados negativamente (acido glutamico y acido aspartico); con grupos R hidrofobos (alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, valina y tirosina); y la clase de aminoacidos especiales (cistelna, glicina y prolina). Un experto en la tecnica conoce otras clases y pueden definirse usando
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determinaciones estructurales u otros datos para evaluar la capacidad de sustitucion. En ese sentido, un aminoacido sustituible puede referirse a cualquier aminoacido que puede sustituirse y mantener la conservacion funcional en esa posicion.
Se reconocera, sin embargo, que aminoacidos de la misma clase pueden variar en grado por sus propiedades bioflsicas. Por ejemplo, se reconocera que determinados grupos R hidrofobos (por ejemplo, alanina, serina o treonina) son mas hidrofilos (es decir, de hidrofilia superior o hidrofobia inferior) que otros grupos R hidrofobos (por ejemplo, valina o leucina). La hidrofilia o hidrofobia relativas pueden determinarse usando metodos reconocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) y Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
Tal como se usa en el presente documento, cuando una secuencia de aminoacidos (por ejemplo, una primera secuencia de Vh o Vl) se alinea con una o mas secuencias de aminoacidos adicionales (por ejemplo, una o mas secuencias de VH o VL en una base de datos), puede compararse una posicion de aminoacido en una secuencia (por ejemplo, la primera secuencia de Vh o Vl) con una “posicion correspondiente” en la una o mas secuencias de aminoacidos adicionales. Tal como se usa en el presente documento, la “posicion correspondiente” representa la posicion equivalente en la(s) secuencia(s) que esta(n) comparandose cuando las secuencias estan optimamente alineadas, es decir, cuando las secuencias estan alineadas para lograr el mayor porcentaje de identidad o porcentaje de similitud.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “base de datos de anticuerpos” se refiere a una coleccion de dos o mas secuencias de aminoacidos de anticuerpos (una “multiplicidad” de secuencias), y normalmente se refiere a una coleccion de decenas, cientos o incluso miles de secuencias de aminoacidos de anticuerpos. Una base de datos de anticuerpos puede almacenar secuencias de aminoacidos de, por ejemplo, una coleccion de regiones Vh de anticuerpo, regiones Vl de anticuerpo o ambas, o puede almacenar una coleccion de secuencias de scFv que se compone de regiones Vh y Vl. Preferiblemente, la base de datos se almacena en un medio fijo, en el que pueden realizarse busquedas, tal como en un ordenador dentro de un programa informatico en el que pueden realizarse busquedas. La base de datos de anticuerpos puede ser una base de datos que comprende o que consiste en secuencias de anticuerpos de llneas germinales. Ademas, la base de datos de anticuerpos puede ser una base de datos que comprende o que consiste en secuencias de anticuerpos maduros (es decir, expresados) (por ejemplo, una base de datos Kabat de secuencias de anticuerpos maduros, por ejemplo, una base de datos KBD). Aun adicionalmente, la base de datos de anticuerpos puede comprender o consistir en secuencias seleccionadas funcionalmente (por ejemplo, secuencias seleccionadas a partir de un ensayo QC).
El termino “agente de union inmunologica” se refiere a una molecula que contiene la totalidad o una parte del sitio de union a antlgeno de un anticuerpo, por ejemplo, la totalidad o parte del dominio variable de cadena pesada y/o ligera, de manera que el agente de union inmunologica reconoce especlficamente un antlgeno diana. Los ejemplos no limitativos de agentes de union inmunologica incluyen moleculas de inmunoglobulina de longitud completa y scFv, as! como fragmentos de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra (vease, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3a ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que comprende los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo de un solo dominio tal como un fragmento Dab (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh o Vl, un anticuerpo de camelido (veanse Hamers- Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993) y Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)) o de tiburon (por ejemplo, Nanobodies® de Ig-NAR de tiburon; y (vii) un Nanobody, una region variable de cadena pesada que contiene un solo dominio variable y dos dominios constantes.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “propiedad funcional” es una propiedad de un polipeptido (por ejemplo, un agente de union inmunologica) para el que se desea una mejora (por ejemplo, con relacion a un polipeptido convencional) y/o resulta ventajoso para un experto en la tecnica, por ejemplo, para mejorar las propiedades de fabricacion o la eficacia terapeutica del polipeptido. En una realizacion, la propiedad funcional es estabilidad (por ejemplo, estabilidad termica). En otra realizacion, la propiedad funcional es solubilidad (por ejemplo, en condiciones celulares). En aun otra realizacion, la propiedad funcional es el comportamiento de agregacion. En todavla otra realizacion, la propiedad funcional es la expresion de protelnas (por ejemplo, en una celula procariota). En aun otra realizacion, la propiedad funcional es el rendimiento de replegamiento tras la solubilizacion de cuerpos de inclusion en un correspondiente proceso de purificacion. En determinadas realizaciones, la afinidad de union a antlgeno no es una propiedad funcional deseada para la mejora. En aun otra realizacion, la mejora de la propiedad funcional no implica un cambio sustancial en la afinidad de union a antlgeno.
El termino “solubilidad” tal como se usa en el presente documento se refiere a la solubilidad de la protelna nativa, es decir del agente de union inmunologica monomerico, sin agregar y funcional. “Solubilidad potenciada” significa una mejora de la solubilidad de la protelna nativa que se determina preferiblemente mediante al menos uno de los siguientes metodos: precipitacion PEG, precipitacion de sulfato de amonio, rendimiento de replegamiento o cualquier
otro metodo para determinar la solubilidad que lo conoce un experto en la tecnica. El metodo de precipitacion de PEG es un metodo en el sentido que se describe por Atha et al. en “Mechanism of Precipitation of Proteins by Polietilene Glycols”, JBC, 256: 12108-12117 (1981). La precipitacion de sulfato de amonio puede, por ejemplo, llevarse a cabo tal como sigue a continuation: se preparan allcuotas de 10 ml de disoluciones de protelna 20 mg/ml a 5 cada una de las cuales se le anaden 10 ml de disolucion de (NH4)2SO4 de un grado de saturation distinto (por ejemplo, el 35%, el 33%, el 31%, el 29%, el 25%, el 20% y el 15%), seguido por agitation en vortex durante 5 segundos y 30 minutos de incubation a temperatura ambiente. Despues de la centrifugation a 6000 rpm a 4°C durante 30 minutos, se determina la concentration de protelnas en el sobrenadante. En este metodo, el comparador para protelnas diferentes es el valor V50, que es el porcentaje de saturacion de (NH4)2SO4 al que el 50% de la 10 protelna se precipita. El V50 se determina se determina a partir de un grafico de protelna soluble determinada en el sobrenadante frente al porcentaje aplicado de saturacion de (NH4)2SO4. El rendimiento de replegamiento corresponde al porcentaje de protelna correctamente plegada obtenido de cuerpos de inclusion solubilizados en un correspondiente proceso de fabricacion/purificacion. El termino solubilidad tal como se usa en el presente documento no se refiere a la expresion soluble.
15 Agentes de union inmunologica con solubilidad mejorada
En un primer aspecto, se proporciona un agente de union inmunologica que comprende uno de los siguientes motivos que potencian la solubilidad en las posiciones de aminoacido de cadena pesada 12, 103 y 144 (numeration de AHo):
(a) serina (S) en la position de aminoacido de cadena pesada 12;
20 (b) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y
(c) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144; o (a1) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
(b1) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y (c1) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144; o
25 (a2) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
(b2) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y (c2) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144.
Se ha encontrado sorprendentemente que la presencia de los aminoacidos indicados en las posiciones indicadas aumenta la solubilidad global de todo el agente de union inmunologica. Por ejemplo, en el caso de la combination de 30 las tres mutaciones que potencian la solubilidad V12S, L144S y V103T en la Vh de un scFv, se encontro que dichas sustituciones representan aproximadamente el 60% de toda la solubilidad de scFv. Puesto que se conservan parches hidrofobos en los dominios variables de todos los agentes de union inmunologica, pueden usarse una o mas sustituciones en las posiciones indicadas para mejorar la solubilidad de cualquier agente de union inmunologica.
El agente de union inmunologica es preferiblemente un anticuerpo scFv, una inmunoglobulina de longitud completa, 35 un fragmento Fab, un Dab o un Nanobody.
En una realization preferida, el agente de union inmunologica comprende ademas uno o mas aminoacidos del grupo que consiste en (a) acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 31, (b) acido glutamico (E) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 83, (c) arginina (R) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 43,
(d) leucina (L) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 67 y (e) alanina (A) en la posicion de aminoacido de 40 cadena pesada 78. La presencia de uno o mas de los aminoacidos indicados en las correspondientes posiciones
confiere al agente de union inmunologica estabilidad potenciada.
Los aminoacidos indicados en el presente documento pueden estar presentes en el agente de union inmunologica que se produce de manera natural o derivado del mismo, o el agente de union inmunologica puede modificarse mediante ingenierla genetica para incorporar uno o mas de los aminoacidos mencionados anteriormente.
45 En una realizacion preferida, el agente de union inmunologica dado a conocer en el presente documento se une especlficamente a TNFa humano o a VEGF humano.
Modificacion mediante inaenieria genetica de agentes de union inmunologica con solubilidad mejorada
Tal como se describe en detalle en los ejemplos, se ha usado con exito un enfoque basado en secuencias descrito en el presente documento para identificar sustituciones de residuo de aminoacido particulares que confieren solubilidad mejorada. Los ejemplos indican sustituciones de aminoacido a modo de ejemplo y preferidas en las 5 posiciones definidas de aminoacido dentro de las regiones de VH y opcionalmente en la region de VL de un agente de union inmunologica (por ejemplo, un scFv). Las sustituciones a modo de ejemplo incluyen sustitucion de residuos de aminoacido problematicos (por ejemplo, residuos hidrofobos, expuestos a disolvente) en las posiciones de aminoacido que son mas hidrofilas y que se producen con mayor frecuencia en la base de datos (por ejemplo, una base de datos de anticuerpos maduros (KDB)). Una sustitucion particularmente preferida es el residuo que se 10 produce con la mayor frecuencia que es mas hidrofilo que el residuo problematico. En otras realizaciones, el aminoacido mas hidrofilo se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), y treonina (T).
Por consiguiente, la invencion se refiere a metodos de modificacion mediante ingenierla genetica en los que una o mas sustituciones de aminoacido especificadas se introducen en un agente de union inmunologica, tal como un anticuerpo scFv. Tales sustituciones pueden llevarse a cabo usando metodos de biologla molecular convencionales, 15 tales como mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis mediada por PCR y similares.
Tal como se expone en los ejemplos, se han identificado las siguientes posiciones de aminoacido como aminoacidos problematicos (es decir, denominados “parches hidrofobos”) para la modificacion en las secuencias Vh o Vl indicadas:
Vh: posiciones de aminoacido 2, 4, 5, 12, 103 y 144; y 20 Vl: posiciones de aminoacido 15, 52 y 147.
La numeracion usada es el sistema de numeration de AHo; las tablas de conversion para convertir la numeration de AHo a la numeracion del sistema de Kabat se exponen como las tablas 1 y 2.
Se ha encontrado sorprendentemente que sustituciones en dos o mas de las posiciones de Vh 12, 103, 144 (segun el sistema de numeracion de AHo) afectan a la solubilidad global de todo el agente de union inmunologica. Puesto 25 que se conservan parches hidrofobos en los dominios variables de todos los agentes de union inmunologica, pueden usarse al menos dos sustituciones en las posiciones indicadas para mejorar la solubilidad de cualquier agente de union inmunologica.
La invencion se refiere a un metodo para modificar mediante ingenierla genetica un agente de union inmunologica, tal como un anticuerpo scFv, en el que al menos se realizan dos sustituciones de aminoacido en una o mas 30 posiciones de aminoacido identificadas anteriormente para producir as! formas variantes (es decir, mutadas) de los agentes de union inmunologica.
Por tanto, en otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para modificar mediante ingenierla genetica un agente de union inmunologica, comprendiendo el metodo:
A) seleccionar al menos tres posiciones de aminoacido dentro de la region de Vh, la region de Vl o las regiones de
35 Vh y Vl para la mutation; y
B) mutar las al menos tres posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion,
en el que las al menos tres posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion estan dentro de la region de Vh, y la sustitucion se encuentra en las al menos tres posiciones de aminoacido de cadena pesada12, 103 y 144 (segun el convenio de numeracion de AHo; posiciones de aminoacido 11, 89 y 108 usando la numeracion de Kabat). 40 Si una o mas posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion estan dentro de la region de Vl, la sustitucion tiene lugar en una position de aminoacido de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en 15, 52 y 147 (segun el convenio de numeracion de AHo; posiciones de aminoacido 15, 44 y 106 usando la numeracion de Kabat).
En determinadas realizaciones, la posicion de aminoacido esta ocupada por un aminoacido hidrofobo (por ejemplo, 45 leucina (L) o valina (V)). En una realization, el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12 es valina (V). En otra realizacion, el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103 es valina (V). En otra realizacion, el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144 es leucina (L). En otra realizacion, el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena ligera 15 es valina (V). En otra realizacion, el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena ligera 52 es fenilalanina (F). En otra realizacion, el aminoacido 50 en la posicion de aminoacido de cadena ligera 147 es valina (V).
Preferiblemente, la mutacion es una sustitucion del aminoacido en la posicion de aminoacido seleccionada con un aminoacido mas hidrofilo. En otras realizaciones, el aminoacido mas hidrofilo se selecciona de serina (S) o treonina (T).
En determinadas realizaciones, el metodo comprende: a) seleccionar al menos dos posiciones de aminoacido dentro 5 del agente de union inmunologica para la mutacion; y b) mutar las al menos dos posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion, en el que la mutacion comprende al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
(i) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12 usando la numeracion de AHo (posicion 11 usando la numeracion de Kabat);
10 (ii) serina (S) o treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103 usando la numeracion de AHo (posicion 89 usando la numeracion de Kabat); y
(iii) serina (S) o treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144 usando la numeracion de AHo (posicion 108 usando la numeracion de Kabat).
En una realizacion mucho mas preferida, al menos una de las posiciones de aminoacido de cadena pesada 12, 103 15 y 144 es treonina (T).
En aun otras realizaciones, la mutacion comprende sustitucion con treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 15 usando la numeracion de AHo o de Kabat y/o sustitucion con alanina (A) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 147 usando la numeracion de AHo (posicion 106 usando la numeracion de Kabat convencion).
20 En otras realizaciones, la mutacion da como resultado al menos un aumento de 2 veces en la solubilidad (por ejemplo, un aumento de 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces o superior en la solubilidad).
En otra realizacion, la estabilidad termica, el replegamiento, el rendimiento de expresion, la agregacion y/o la actividad de union del agente de union inmunologica no resultan afectados adversamente por la mutacion.
En determinadas realizaciones, la mutacion comprende ademas una o mas mutaciones estabilizantes en una 25 posicion de aminoacido (convenio de numeracion de AHo) seleccionada del grupo que consiste en: (a) acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 31; (b) acido glutamico (E) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 83; (c) arginina (R) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 43; (d) leucina (L) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 67; y (e) alanina (A) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 78. Estas mutaciones han demostrado tener un efecto sobre la estabilidad del agente de union inmunologica.
30 En otro aspecto, la invencion proporciona un agente de union inmunologica preparado segun el metodo de la invencion.
En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, un agente de union inmunologica modificado mediante ingenierla genetica segun el metodo de la invencion es un agente de union inmunologica reconocido en la tecnica que se une a un antlgeno diana de importancia terapeutica o un agente de union inmunologica que comprende regiones variables 35 (regiones VL y/o VL) o una o mas CDR (por ejemplo, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 y/o CDRH3) derivadas del agente de union inmunologica de importancia terapeutica. Por ejemplo, agentes de union inmunologica aprobados actualmente por la FDA u otras autoridades reguladoras pueden modificarse mediante ingenierla genetica segun los metodos de la invencion. Mas especlficamente, estos agentes de union inmunologica a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-CD3 tales como muromonab (Orthoclone® OKT3; 40 Johnson&Johnson, Brunswick, NJ; vease Arakawa et al. J. Biochem, (1996) 120:657-662; Kung y Goldstein et al., Science (1979), 206: 347- 349), anticuerpos anti-CD 11 tales como efalizumab (Raptiva®, Genentech, South San Francisco, CA), anticuerpos anti-CD20 tales como rituximab (Rituxan®/Mabthera®, Genentech, South San Francisco, CA), tositumomab (Bexxar®, GlaxoSmithKline, Londres) o ibritumomab (Zevalin®, Biogen Idec, Cambridge MA) (veanse las patentes estadounidenses n.os 5.736.137; 6.455.043; y 6.682.734), anticuerpos anti- 45 CD25 (IL2Ra) tales como daclizumab (Zenapax®, Roche, Basilea, Suiza) o basiliximab (Simulect®, Novartis, Basilea, Suiza), anticuerpos anti-CD33 tales como gemtuzumab (Mylotarg®, Wyeth, Madison, NJ, veanse las patentes estadounidenses n.os 5.714.350 y 6.350.861), anticuerpos anti-CD52 tales como alemtuzumab (Campath®, Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA), anticuerpos anti-GplIb/glla tales como abciximab (ReoPro®, Centocor, Horsham, PA), anticuerpos anti-TNFa tales como infliximab (Remicade®, Centocor, Horsham, PA) o 50 adalimumab (Humira®, Abbott, Abbott Park, IL, vease la patente estadounidenses n.° 6.258.562), anticuerpos anti- IgE tales como omalizumab (Xolair®, Genentech, South San Francisco, CA), anticuerpos anti-VSR tales como palivizumab (Synagis®, Medimmune, Gaithersburg, M, vease la patente estadounidenses n.° 5.824.307),
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anticuerpos anti-EpCAM tales como edrecolomab (Panorex®, Centocor), anticuerpos anti-EGFR tales como cetuximab (Erbitux®, Imclone Systems, Nueva York, NY) o panitumumab (Vectibix®, Amgen, Thousand Oaks, CA), anticuerpos anti-HER2/neu tales como trastuzumab (Herceptin®, Genentech), anticuerpos anti-integrina a4 tales como natalizumab (Tysabri®, Biogenldec), anticuerpos anti-C5 tales como eculizumab (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals, Chesire, CT) y anticuerpos anti-VEGF tales como bevacizumab (Avastin®, Genentech, vease la patente estadounidense n.° 6.884.879) o ranibizumab (Lucentis®, Genentech).
En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, un agente de union inmunologica modificado mediante ingenierla genetica segun el metodo de la invencion es un agente de union inmunologica reconocido en la tecnica descrito anteriormente. En una realizacion preferida, el agente de union inmunologica es un anticuerpo scFv. En otras realizaciones, el agente de union inmunologica es, por ejemplo, una inmunoglobulina de longitud completa, Dab, Nanobody o un fragmento Fab.
A pesar de lo anterior, en diversas realizaciones, se excluyen determinados agentes de union inmunologica de ser usados en los metodos de modificacion mediante ingenierla genetica de la invencion y/o se excluyen de ser la composition de agente de union inmunologica producida por los metodos de modificacion mediante ingenierla genetica. Por ejemplo, en diversas realizaciones, existe la condition de que el agente de union inmunologica no sea ninguno de los anticuerpos scFv, o variantes de los mismos, tal como se da a conocer en las publicaciones PCT WO 2006/131013 y WO 2008/006235, tal como ESBA105 o variantes del mismo que se dan a conocer en las publicaciones PCT WO 2006/131013 y WO 2008/006235.
Preferiblemente, el agente de union inmunologica dado a conocer en el presente documento, usado para el metodo dado a conocer en el presente documento o generado por el metodo dado a conocer en el presente documento, respectivamente, es un anticuerpo scFv, pero tambien se abarcan otros agentes de union inmunologica, tal como inmunoglobulinas de longitud completa, fragmentos Fab o cualquier otro tipo de agente de union inmunologica descrito en el presente documento (por ejemplo, los Dab o Nanobodies).
En una realizacion preferida, el agente de union inmunologica tal como se da a conocer en el presente documento, usado para el metodo dado a conocer en el presente documento o generado por el metodo dado a conocer en el presente documento, respectivamente, se une especlficamente a TNFa humano o a VEGF humano.
La invencion abarca ademas composiciones que comprenden los agentes de union inmunologica dados a conocer en el presente documento y un portador farmaceuticamente aceptable.
Composiciones y formulaciones de scFv
Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion de scFv preparada segun los metodos de la invencion. Por tanto, la invencion proporciona composiciones de scFv modificado mediante ingenierla genetica en las que se han introducido una o mas mutaciones que potencian la solubilidad, en comparacion con un scFv original de interes, en las que la(s) mutacion/mutaciones se ha(n) introducido en la position de un residuo de aminoacido hidrofobo. En una realizacion, el scFv se ha modificado mediante ingenierla genetica para que contenga una posicion de aminoacido mutada (por ejemplo, una posicion de region de marco). En otras realizaciones, el scFv se ha modificado mediante ingenierla genetica para que contenga dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o mas de diez posiciones de aminoacido mutadas (por ejemplo, posiciones de region de marco).
En determinadas realizaciones, la mutation comprende ademas una o mas mutaciones estabilizantes descritas en la solicitud de PCT n.° PCT/CH2008/000285, titulada “Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties”, presentada el 25 de junio de 2008 o la solicitud estadounidense provisional con n°. de serie n.° 61/069,056, titulada “Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties”, presentada el 12 de marzo 2008. Por ejemplo, el agente de union inmunologica puede comprender ademas una sustitucion en una posicion de aminoacido (convenio de numeration de AHo) seleccionada del grupo que consiste en: (a) acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 31; (b) acido glutamico (E) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 83; (c) arginina (R) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 43;
(d) leucina (L) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 67; y (e) alanina (A) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 78. Une o mas mutaciones en las posiciones indicadas tienen un efecto sobre la estabilidad global de todo el agente de union inmunologica. En otras realizaciones, la mutacion comprende ademas las siguientes mutaciones estabilizantes (convenio de numeracion de AHo): (a) acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 31; (b) acido glutamico (E) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 83; (c) arginina (R) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 43; (d) leucina (L) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 67; y
(e) alanina (A) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 78.
Otro aspecto de la invencion se refiere a formulaciones farmaceuticas de las composiciones de scFv de la invencion. Tales formulaciones comprenden normalmente la composicion de scFv y un portador farmaceuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, “portador farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los
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disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares que son fisiologicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para, por ejemplo, administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal, epidermica (por ejemplo, mediante inyeccion o infusion) o topica (por ejemplo, al ojo o a la piel). Segun la via de administracion, el scFv puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la accion de acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los compuestos farmaceuticos de la invencion pueden incluir una o mas sales farmaceuticamente aceptables. Una “sal farmaceuticamente aceptable” se refiere a una sal que conserve la actividad biologica deseada del compuesto original y no confiere ningun efecto toxicologico indeseado (vease, por ejemplo, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adicion de acido y sales de adicion de base. Las sales de adicion de acido incluyen las derivadas de acidos inorganicos no toxicos, tales como acido clorhldrico, nltrico, fosforico, sulfurico, bromhldrico, yodhldrico, fosforoso y similares, as! como de acidos organicos no toxicos tales como acidos mono y dicarboxllicos alifaticos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos y similares. Las sales de adicion de base incluyen las derivadas de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, as! como de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocalna, colina, dietanolamina, etilendiamina, procalna y similares.
Una composicion farmaceutica de la invencion tambien puede incluir un antioxidante farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistelna, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como acido cltrico, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico, y similares.
Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Puede garantizarse que se impide la presencia de microorganismos tanto mediante procedimientos de esterilizacion, citados anteriormente, como mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico, y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Ademas, puede provocarse la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable mediante la inclusion de agentes que retardan la absorcion tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. En la tecnica se conoce el uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tambien pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
Normalmente, las composiciones terapeuticas deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion puede formularse como una disolucion, microemulsion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol llquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de una dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composicion. Puede provocarse la absorcion prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusion en la composicion de un agente que retarda la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Pueden prepararse disoluciones inyectables esteriles mediante la incorporacion del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combination de componentes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido por esterilizacion por microfiltracion. Generalmente, se preparan dispersiones mediante la incorporacion del compuesto activo en un vehlculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los demas componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos son secado a vaclo y secado por
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congelacion (liofilizacion) que producen un polvo del principio activo mas cualquier componente deseado adicional a partir de una disolucion esterilizada previamente por filtracion de los mismos.
La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion individual dependera del sujeto que este tratandose, y del modo de administracion particular. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion individual sera generalmente aquella cantidad de la composition que produce un efecto terapeutico. Generalmente, con respecto al cien por ciento, esta cantidad oscilara entre aproximadamente el 0,01 por ciento y aproximadamente el noventa y nueve por ciento de principio activo, preferiblemente entre aproximadamente el 0,1 por ciento y aproximadamente el 70 por ciento, lo mas preferiblemente entre aproximadamente el 1 por ciento y aproximadamente el 30 por ciento de principio activo en combination con un portador farmaceuticamente aceptable.
Se ajustan reglmenes de dosificacion para proporcionar la respuesta optima deseada (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un unico bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse de manera proporcional la dosis segun se indique por las exigencias de la situation terapeutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. Forma unitaria de dosificacion tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades diferenciadas flsicamente adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion para las formas unitarias de dosificacion de la invention esta dictada por y depende directamente de (a) las caracterlsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular que ha de lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de la combinacion de un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Sistemas de numeration de la position del anticuerpo
Se proporcionan tablas de conversion para dos sistemas de numeracion diferentes usados para identificar posiciones de residuo de aminoacido en regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo. El sistema de numeracion de Kabat se describe adicionalmente en Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edition, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., n.° de publication de NIH 91-3242). El sistema de numeracion de AHo se describe adicionalmente en Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670).
Numeracion de region variable de cadena pesada
Tabla 1: Tabla de conversion para las posiciones de residuo en el dominio variable de cadena pesada
Kabat
AHo Kabat AHo Kabat AHo
1
1
44 51 87 101
2
2
45 52 88 102
3
3
46 53 89 103
4
4
47 54 90 104
5
5
48 55 91 105
6
6
49 56 92 106
7
7
50 57 93 107
*
8 51 58 94 108
8
9 52 59 95 109
9
10 52a 60 96 110
10
11 52b 61 97 111
11
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*
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30
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34
35
35a
35b
*
AHo
Kabat
AHo
Kabat
12
52c 62 98
13
* 63 99
14
53 64 100
15
54 65 100a
16
55 66 100b
17
56 67 100c
18
57 68 100d
19
58 69 100e
20
59 70 100f
21
60 71 100g
22
61 72 100h
23
62 73 100i
24
63 74 *
25
64 75 *
26
65 76 *
27
66 77 *
28
67 78 *
29
68 79 *
30
69 80 *
31
70 81 *
32
71 82 *
33
72 83 *
34
73 84 *
35
74 85 *
36
75 86 *
37
76 87 101
38
77 88 102
39
78 89 103
40
79 90 104
Kabat
AHo Kabat AHo Kabat AHo
*
41 80 91 105 141
*
42 81 92 106 142
36
43 82 93 107 143
37
44 82a 94 108 144
38
45 82b 95 109 145
39
46 82b 96 110 146
40
47 83 97 111 147
41
48 84 98 112 148
42
49 85 99 113 149
43
50 86 100
Columna 1, posicion de residuo en el sistema de numeracion de Kabat. Columna 2, numero correspondiente en el sistema de numeracion de AHo para la posicion indicada en la columna 1. Columna 3, posicion de residuo en el sistema de numeracion de Kabat. Columna 4, numero correspondiente en el sistema de numeracion de AHo para la posicion indicada en la columna 3. Columna 5, posicion de residuo en el sistema de numeracion de Kabat. Columna 6, numero correspondiente en el sistema de numeracion de AHo para la posicion indicada en la columna 5
Numeracion de region variable de cadena ligera
Tabla 2: Tabla de conversion para las posiciones de residuo en el dominio variable de cadena ligera Kabat
Kabat
AHo Kabat AHo Kabat AHo
1
1
43 51 83 101
2
2
44 52 84 102
3
3
45 53 85 103
4
4
46 54 86 104
5
5
47 55 87 105
6
6
48 56 88 106
7
7
49 57 89 107
8
8
50 58 90 108
9
9
* 59 91 109
10
10
* 60 92 110
11
11
* 61 93 111
12
12
* 62 94 112
Kabat
AHo Kabat AHo Kabat AHo
13
13
* 63 95 113
14
14
* 64 95a 114
15
15
* 65 95b 115
16
16
* 66 95c 116
17
17
51 67 95d 117
18
18
52 68 95e 118
19
19
53 69 CD cn 119
20
20
54 70 * 120
21
21
55 71 * 121
22
22
56 72 * 122
23
23
57 73 * 123
24
24
58 74 * 124
25
25
59 75 * 125
26
26
60 76 * 126
27
27
61 77 * 127
*
28 62 78 * 128
27a
29 63 79 * 129
27b
30 64 80 * 130
27c
31 65 81 * 131
27d
32 66 82 * 132
27e
33 67 83 * 133
27f
34 68 84 * 134
*
35 * 85 * 135
28
36 * 86 * 136
29
37 69 87 96 137
30
38 70 88 97 138
31
39 71 89 98 139
32
40 72 90 99 140
33
41 73 91 100 141
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Kabat
AHo Kabat AHo Kabat AHo
34
42 74 92 101 142
35
43 75 93 102 143
36
44 76 94 103 144
37
45 77 95 104 145
38
46 78 96 105 146
39
47 79 97 106 147
40
48 80 98 107 148
41
49 81 99 108 149
42
50 82 100
Columna 1, posicion de residuo en el sistema de numeration de Kabat. Columna 2, numero correspondiente en el sistema de numeracion de AHo para la posicion indicada en la columna 1. Columna 3, posicion de residuo en el sistema de numeracion de Kabat. Columna 4, numero correspondiente en el sistema de numeracion de AHo para la posicion indicada en la columna 3. Columna 5, posicion de residuo en el sistema de numeracion de Kabat. Columna 6, numero correspondiente en el sistema de numeracion de AHo para la posicion indicada en la columna 5
Otras realizaciones
Se entiende que la divulgacion tambien incluye cualquiera de las metodologlas, referencias y/o composiciones expuestas en los apendices (A-C) de la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 60/905.365 (solicitud que da prioridad del documento WO 08/110348) y los apendices (A-I) de la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 60/937,112 (solicitud que da prioridad del documento W009/000098), incluyendo, pero sin limitarse a, bases de datos identificadas, bioinformatica, metodos de manipulacion e interpretacion de datos in silico, ensayos funcionales, secuencias preferidas, posiciones/alteraciones de residuo(s) preferidas, identificacion y seleccion de region de marco, alteraciones de region de marco, alineacion e integracion de CDR y alteraciones/mutaciones preferidas.
Puede hallarse informacion adicional referente a estas metodologlas y composiciones en los documentos U.S.S.N. 60/819.378; y 60/899.907, y la publicacion PCT W02008/006235, titulada “scFv Antibodies Which Pass Epithelial And/Or Endothelial Layers” presentada en julio de 2006 y el 6 de febrero de 2007 respectivamente; el documento W006131013A2 titulado “Stable And Soluble Antibodies Inhibiting TNFa” presentado el 6 de junio de 2006; el documento EP1506236A2 titulado “Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods of Identifying Same” presentado el 21 de mayo de 2003; el documento EP1479694A2 titulado “Intrabodies ScFv with defined framework that is stable in a reducing environment” presentado el 18 de diciembre de 2000; el documento EP1242457B1 titulado “Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof” presentado el 18 de diciembre de 2000; el documento W003097697A2 titulado “Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods of Identifying Same” presentado el 21 de mayo de 2003; y el documento W00148017A1 titulado “Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof” presentado el 18 de diciembre de 2000; y Honegger et al., J. MoI. Biol. 309:657-670 (2001).
Ademas, se entiende que la divulgacion tambien incluye metodologlas y composiciones adecuadas para el descubrimiento y/o la mejora de otros formatos de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o fragmentos de los mismos, por ejemplo Fab, Dab, y similares. Por consiguiente, los principios y residuos identificados en el presente documento como adecuados para la seleccion o alteracion para lograr propiedades bioflsicas y/o terapeuticas deseadas que pueden aplicarse a una amplia gama de agentes de union inmunologica. En una realizacion, anticuerpos terapeuticamente relevantes, por ejemplo, anticuerpos aprobados por la FDA, se mejoran mediante la modificacion de una o mas posiciones de residuo tal como se da a conocer en el presente documento.
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Sin embargo, la invencion no se limita a la modification mediante ingenierla genetica de agentes de union inmunologica. Por ejemplo, un experto en la tecnica reconocera que los metodos de la invencion pueden aplicarse a la modificacion mediante ingenierla genetica de otras moleculas de union, distintas de inmunoglobulina, incluyendo, pero sin limitarse a, moleculas de union a fibronectina tales como adnectinas (vease el documento WO01/64942 y las patentes estadounidenses n.os 6.673.901, 6.703.199, 7.078.490 y 7.119.171), Affibodies (veanse por ejemplo, las patentes estadounidenses 6.740.734 y 6.602.977 y en el documento WO00/63243), anticalinas (tambien conocidas como lipocalinas) (veanse los documentos WO99/16873 y WO05/019254), protelnas de dominio A (veanse los documentos WO02/088171 y WO04/044011) y protelnas con repeticiones de anquirina tales como darpinas o protelnas con repeticiones de leucina (veanse los documentos WO02/20565 y WO06/083275).
La presente divulgation se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben considerarse como limitativos adicionalmente.
EJEMPLO 1: Generacion de scFv con solubilidad mejorada
En este ejemplo se uso un enfoque basado en modelado estructural y analisis de secuencia para identificar mutaciones en regiones de marco de scFv que dan como resultado solubilidad mejorada.
a) Analisis estructural
Se modelo la estructura 3D del scFv ESBA105 usando el servidor automatizado de modelado de homologla estructural de protelnas, accesible mediante el servidor web ExPASy. Se analizo la estructura segun la superficie relativa accesible al disolvente (rSAS) y se clasificaron los residuos tal como sigue: (1) expuestos para residuos que muestran una rSAS > 50%; y (2) parcialmente expuestos para residuos con 50% < rSAS > 25%. Los residuos hidrofobos con una rSAS > 25% se consideraron parches hidrofobos. Para validar el area accesible al disolvente de cada parche hidrofobo encontrado, se realizaron calculos a partir de 27 archivos de PDB con alta homologla con ESBA105 y una resolution mayor de 2,7 A. Se calcularon la rSAS promedio y la desviacion estandar para los parches hidrofobos y se examinaron en detalle para cada uno de ellos (vease la tabla 3).
Tabla 3: Evaluation de los parches hidrofobos.
Residuo
Dominio % de superficie expuesta al disolvente % de STDE rSAS Variabilidad de secuencia Superficie de contacto VH/antlgeno Superficie de contacto VH/VL Superficie de contacto VH/CH
2
VH 23,06 19,26 10 25% 10-25% > 0-20% > 0-20% 0
4
VH 0,66 1,26 0 10% 0-10% 0 0
5
VH 61,85 12,96 50 75% 10-25% 0 > 0-20% 0
12
VH 70,27 9,17 50 75% 10-25% 0 0 60-80%
103
VH 35,85 5,85 25 50% 10-25% 0 > 0-2% > 0-2%
144
VH 62,17 7,82 50 75% 10-25% 0 0 > 0-2%
15
VL 49,59 9,77 25 50% 10-25% 0 0 0
147
VL 31,19 23,32 25 50% 10-25% 0 0 60-80%
5
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15
20
25
% de superficie Superficie Superficie
expuesta Variabilidad Superficie de de
al % de de de contacto contacto contacto
Residuo
Dominio disolvente STDE rSAS secuencia VH/antlgeno VH/VL VH/CH
Columna 1: posicion de residuo en el sistema de numeracion de AHo. Columna 2, dominio para la posicion indicada en la columna 1. Columna 3, calculos de area accesible al disolvente promedio a partir de 27 archivos de PDB. Columna 4, desviaciones estandar de la columna 3. Columnas 5 a 9, papel estructural de los parches hidrofobos recuperados de AHo.
La mayor parte de los parches hidrofobos identificados en ESBA105 correspondlan a la superficie de contacto dominio variable-constante (VH/CH). Esto se correlaciono con hallazgos previos de residuos hidrofobos expuestos al disolvente en un formato de scFv (Nieba et al., 1997). Dos de los parches hidrofobos (VH 2 y VH 5) tambien contribulan a la interaccion VL-VH y, por tanto, se excluyeron del analisis posterior.
b) Diseno de mutaciones de solubilidad
Se recuperaron un total de 122 secuencias de VL y 137 de VH de la pagina web sobre anticuerpos de Annemarie Honegger (
www.bioc.uzh.ch/antibody). Las secuencias correspondlan originariamente a 393 estructuras de anticuerpo en formato de Fv o Fab extraldas del Banco de Datos de Protelnas (PDB) (
www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Se usaron las secuencias para el analisis independientemente de la especie o el subgrupo para aumentar la probabilidad de encontrar aminoacidos alternativos con mayor hidrofilicidad que el residuo nativo. Se excluyeron las secuencias que tenlan mas del 95% de identidad con cualquier otra secuencia dentro de la base de datos para reducir el sesgo. Se alinearon las secuencias y se analizaron para determinar la frecuencia de residuos. Se aplicaron algoritmos y herramientas de analisis de secuencia para identificar y seleccionar mutaciones hidrofilas para perturbar los parches hidrofobos en ESBA105. Se alinearon las secuencias siguiendo el sistema de numeracion de AHo para dominio variable de inmunoglobulina (Honegger y Pluckthun 2001). Se restringio el analisis a las regiones de marco.
Se calculo la frecuencia de residuos, f(r), para cada posicion, i, en la base de datos personalizada mediante el numero de veces que se observa un residuo particular dentro del conjunto de datos dividido entre el numero total de secuencias. En una primera etapa, se calculo la frecuencia de aparicion de los diferentes aminoacidos para cada parche hidrofobo. Se analizo la frecuencia de residuos para cada parche hidrofobo identificado en ESBA105 a partir de la base de datos personalizada descrita anteriormente. La tabla 4 notifica la frecuencia de residuos en los parches hidrofobos dividida entre la totalidad de los residuos presentes en la base de datos.
Tabla 4. Frecuencia de residuos de 259 secuencias de anticuerpos maduros en un formato de scFv o Fab para los
parches hidrofobos identificados en ESBA105
frecuencia relativa en VH frecuencia relativa en VL
Residuo
VH 4 VH 12 VH 103 VH 144 VL 15 VL 147
A
0,23046215 0 0 0 3,8647343 0,176821923
C
0 0 0 0 0 0
D
0 0 0 0 0 0
E
0 0 0 0 0 0
F
0,483091787 0 0,483091787 0 0 0
G
0 0 0 0 0 0
H
0 0 0 0 0 0
frecuencia relativa en VH frecuencia relativa en VL
Residuo
VH 4 VH 12 VH 103 VH 144 VL 15 VL 147
I
0 2,415458937 9,661835749 0 5,314009662 70,38834951
K
0 0 0 0 0 0
L
96,61835749 89,85507246 7,246376812 27,0531401 45,89371981 15,53398058
M
0 0 10,62801932 1,93236715 0 0,970873786
N
0 0 0 0 0 0
P
0,966183575 0 0 0,966183575 21,73913043 0,485436893
Q
0 0 0 0,483091787 0 0
R
0 0 7,246376812 0 0 0
S
0 0,966183575 0 18,84057971 0 0
T
0 0 15,4589372 50,72463768 0,966183575 0
V
1,93236715 6,763285024 49,27536232 0 22,22222222 12,62135922
W
0 0 0 0 0 0
Y
0 0 0 0 0 0
En la segunda etapa, se uso la frecuencia de residuos hidrofilos en los parches hidrofobos para disenar las mutaciones de solubilidad mediante la seleccion del residuo hidrofilo mas abundante en cada parche hidrofobo. La tabla 5 notifica los mutantes de solubilidad identificados usando este enfoque. Se calculo la hidrofobicidad de los 5 residuos parentales y mutantes como hidrofobicidad promedio de valores publicados en varios artlculos y expresados en funcion del nivel de exposition de la cadena lateral al disolvente.
Tabla 5. Diferentes mutaciones de solubilidad introducidas en ESBA105 para perturbar los parches hidrofobos
Residuo
Dominio % de superficie expuesta al disolvente Residuo parental Hidrofobicidad del residuo parental Mutation de solubilidad Hidrofobicidad de mutaciones
4
VH 0,66 L 85,2 A 42,7
12
VH 70,27 V 73,2 S 28
103
VH 35,85 V 73,2 T 32,8
144*
VH 62,17 V 73,2 S 28
15
VL 49,59 V 73,2 T 32,8
147
VL 31,19 L 85,2 A 42,7
% de superficie Hidrofobicidad
expuesta al Residuo del residuo Mutacion de Hidrofobicidad
Residuo
Dominio disolvente parental parental solubilidad de mutaciones
*El parche hidrofobo en la posicion 144 se intercambio no por el residuo hidrofilo mas abundante en la base de datos sino por Ser puesto que esta ya estaba contenida en el donador de CDR de ESBA105.
Columna 1, posicion de residuo en el sistema de numeracion de AHo. Columna 2, dominio para la posicion indicada en la columna 1. Columna 3, calculos de area accesible al disolvente promedio a partir de 27 archivos de PDB. Columna 4, residuos parentales en ESBA105. Columna 5, hidrofobicidades promedio de la columna 4, recuperadas de AHo. Columnas 6, residuo hidrofilo mas abundante en la posicion indicada en la columna 1. Hidrofobicidad promedio de la columna 6 recuperada de AHo.
c) Pruebas de variantes de ESBA105 de solubilidad
Se introdujeron las mutaciones de solubilidad solas o en multiples combinaciones y se sometieron a prueba para 5 determinar los patrones de rendimiento de replegamiento, expresion, actividad y estabilidad y agregacion. La tabla 6 muestra las diversas combinaciones de mutaciones de solubilidad introducidas en cada variante optimizada de ESBA105 basandose en la posible contribucion a la solubilidad y el nivel de riesgo de que la mutacion altere la union a antlgeno.
Tabla 6: Diseno de variantes de solubilidad para ESBA105.
Residuo de superficie
Dominio Residuo parental Mutantes**
hidrofobo
Opt 1_0 Opt 0_2 Opt 1_2 Opt 2_4
15
VL V X X X
147*
VL V X
4*
VH L X
12
VH V X X X
103*
VH V V
144
VH L X X X
*Sometido a prueba por separado en una segunda tanda **El guion bajo separa el numero de mutaciones contenidas en la cadena ligera y en la pesada, respectivamente. Columna 1, posicion de residuo en el sistema de numeracion de AHo. Columna 2, dominio para la posicion indicada en la columna 1. Columna 3, residuo parental en ESBA105 en los diferentes parches hidrofobos. Columna 4, diferentes variantes que contienen mutaciones de solubilidad en las posiciones indicadas
10
d) Mediciones de solubilidad
Se determinaron las solubilidades maximas de ESBA105 y variantes mediante el metodo de precipitacion de PEG tal como se describio adicionalmente por Atha et al. (JBC, 256: 12108-12117 (1981)). En este metodo, la concentracion de protelnas en los sobrenadantes de mezclas de PEG-protelna centrifugadas se mide y representa graficamente de 15 manera logarltmica frente la concentracion de PEG. Se mezclo 1:1 una disolucion de protelnas de 20 mg/ml con disoluciones de PEG que oscilaban entre el 30 y el 50% de saturacion. Se eligieron estas condiciones basandose en el perfil de solubilidad observado para el ESBA105 silvestre despues la determinacion emplrica de la dependencia
lineal de Log S frente a la concentracion de Peg (% p/v). En la figura 1 se representan curvas de solubilidad de varios ejemplos de ESBA105 variante que presentaban una solubilidad superior. En la tabla 7 tambien se proporciona una lista completa de valores de solubilidad.
Tabla 7. Actividad y solubilidad maxima estimada de los mutantes en comparacion con el ESBA105 parental.
Molecula
E105 E105 Opt 1_0 E105 Opt 0_2 E105 Opt 1_2 E105 VH V103T E105 VL V147A
Ordenada en el origen
1,956 2,228 2,179 2,163 2,223 2,047
Solubilidad maxima
90,36 169,04 151,01 145,55 167,11 111,43
Actividad con relacion a ESBA105
1 1,4 1,5 1,5 1,2 2
5
e) Mediciones de estabilidad termica
Se realizaron mediciones de estabilidad termica para el ESBA105 parental y seguimientos de la solubilidad usando espectroscopla ATR-FTIR. Se sometieron las moleculas a una exposicion termica a un amplio intervalo de temperaturas (de 25 a 95°C). Se obtuvo el perfil de desnaturalizacion mediante la aplicacion de una transformada de 10 Fourier a las senales de interferograma (vease la figura 2). Se usaron los perfiles de desnaturalizacion para aproximar los puntos medios de las transiciones de desplegamiento termico (TM) para cada variante de ESBA105 aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann (tabla 8).
Tabla 8: Puntos medios de las transiciones de desplegamiento termico (TM) para cada variante de solubilidad.
ESBA105 E105 Opt 1.0 E105 Opt 1.2 E105 Opt 0.2 E105 VH V103T E105 VL V147A
Boltzmann sigmoidal Valores de ajuste optimo INFERIOR
0,3604 -0,405 0,7032 0,4516 0,4691 -0,6873
SUPERIOR
100,4 99,3 98,84 99,04 99,2 99,16
V50
61,53 59,91 59,39 60,86 62,08 55,89
PENDIENTE
2,935 2,886 3,117 2,667 2,682 3,551
Desviacion estandar INFERIOR
0,5206 0,3471 0,6652 0,4953 0,3938 0,4754
SUPERIOR
0,5361 0,3266 0,6116 0,4891 0,4167 0,3714
V50
0,1047 0,06658 0,1328 0,0949 0,07811 0,0919
PENDIENTE
0,09039 0,05744 0,1146 0,08199 0,06751 0,08235
Intervalos de confianza del 95%
ESBA105 E105 Opt 1.0 E105 Opt 1.2 E105 Opt 0.2 E105 VH V103T E105 VL V147A
INFERIOR
de -0,7432 a de -1,141 a de -0,7071 a de -0,5984 a de -0,3658 a de -1,695 a
1,464
0,3309 2,114 1,502 1,304 0,3206
SUPERIOR
de 99,25 a de 98,61 a de 97,54 a de 98,01 a de 98,32 a de 98,38 a
101,5
99,99 100,1 100,1 100,1 99,95
V50
de 61,31 a de 59,77 a de 59,11 a de 60,66 a de 61,91 a de 55,70 a
61,75
60,06 59,67 61,06 62,24 56,09
PENDIENTE
de 2,743 a de 2,764 a de 2,874 a de 2,494 a de 2,539 a de 3,376 a
3,127
3,007 3,360 2,841 2,825 3,725
Bondad del
ajuste
Grados de libertad
16 16 16 16 16 16
R2
0,9993 0,9997 0,999 0,9994 0,9996 0,9996
Suma absoluta de cuadrados
26,18 10,8 37,2 24 16,14 15,11
Sy.x
1,279 0,8217 1,525 1,225 1,004 0,9719
iii. Mediciones de agregacion
Tambien se analizaron ESBA105 y sus variantes de solubilidad en una prueba con dependencia temporal para 5 evaluar el comportamiento de degradacion y agregacion. Para este fin, se incubaron proteinas solubles (20 mg/ml) a una temperatura elevada (40°C) en tampones fosfato a pH 6,5. Se mantuvieron muestras de control a -80°C. Se analizaron las muestras despues de un periodo de incubacion de dos semanas para determinar la degradacion (SDS-PAGE) y agregacion (SEC). Esto permitio descartar variantes que eran propensas a degradacion (vease la figura 3) o que presentaban una tendencia a formar agregados solubles o insolubles (vease la tabla 9).
10 Tabla 9: Mediciones de agregacion insoluble.
Proteina
Perdida de proteina (agregados insolubles)
ESBA105
0-10%
ESBA105 Opt 1_0
0-10%
ESBA105 Opt 0_2
0-10%
ESBA105 Opt 1_2
45-50%
ESBA105 VH V103T
0-10%
iv. Expresion y replegamiento de variantes de solubilidad
Tambien se sometieron a prueba los mutantes de solubilidad para determinar la expresion y el rendimiento de replegamiento con relacion a la molecula de ESBA105 parental. En la tabla 10 se muestran los resultados de estos
estudios.
Tabla 10. Expresion y replegamiento de variantes de solubilidad.
Residuo de superficie hidrofobo Expresion con relacion a ESBA105 Rendimiento de replegamiento, mg/l
VH VL
ESBA105
L4 V12 V103 L144 V15 F52 V147 1,0 34
Opt 1_0
T 1,15 12,5
Opt 0_2
S S 1,10 35
Opt 1_2
S S T 0,96 44
Opt 2_4
A S T S T A 1,20 no puede producirse
VH L4A
1,0 no puede producirse
VH V103T
T 1,1 55
VL V147A
A 1,2 20
Aunque todos los mutantes de solubilidad hidrofilos presentaban una solubilidad mejorada en comparacion con la 5 molecula de ESBA105 parental, solo algunas de estas moleculas se presentaron como adecuadas para otras propiedades bioflsicas. Por ejemplo, muchas variantes tenlan una estabilidad termica y/o rendimiento de replegamiento reducidos con relacion a la molecula de ESBA105 parental. En particular, el reemplazo hidrofilo en la posicion VL147 disminuyo gravemente la estabilidad. Por tanto, se combinaron mutaciones de solubilidad que no afectaron significativamente a la estabilidad termica y se sometieron a estres termico adicional para confirmar sus 10 propiedades.
Tres mutantes que contenlan una combinacion de cuatro mutaciones de solubilidad diferentes (Opt1.0, Opt0.2 y VH:V103T) mejoraron significativamente la solubilidad de ESBA105 sin afectar a la reproducibilidad, actividad o estabilidad termica. Sin embargo, un mutante que tenia las mutaciones combinadas de Opt1.0 y Opt0.2 en ESBA105 (Opt 1_2) presentaba un aumento de la cantidad de agregados insolubles despues de la incubacion durante 15 2 semanas a 40°C (vease la tabla 9). Esto podrla explicarse por el papel de Val en la posicion VL 15 en un giro de
lamina beta, puesto que Val tiene la mayor propension a formar laminas beta de todos los aminoacidos. Este resultado demostro que se tolera una mutacion de solubilidad individual en la posicion VL 15, pero no en combinacion con mutantes de solubilidad que perturban otros parches hidrofobos. Por tanto, se seleccionaron las mutaciones contenidas en Opt0_2 y VH:V103t como las de mejor desempeno para mejorar propiedades de 20 solubilidad de moleculas de scFv.
EJEMPLO 2: Generacion de scFv con solubilidad y estabilidad potenciadas
Se optimizaron adicionalmente las variantes de ESBA105 identificadas mediante diseno de solubilidad, mediante sustitucion con mutaciones estabilizantes identificadas mediante el ensayo de control de calidad (QC). Se crearon un total de 4 constructos que contenlan entre 1 y 3 de las mutaciones de solubilidad identificadas en el ejemplo 1 25 anteriormente, en combinacion con todas las mutaciones estabilizantes encontradas en QC 7.1 y 15.2 (es decir, D31N y V83E en el dominio VL y V78A, K43 y F67L en el dominio VH). Todos los constructos optimizados produjeron mas protelna soluble que un scFv silvestre (vease la tabla 11). El mejor constructo presentaba de manera sistematica un aumento de mas de 2 veces de la solubilidad con respecto al silvestre. No se vieron afectadas significativamente ni la actividad ni la estabilidad de las moleculas de scFv por la combinacion de 30 mutaciones estabilizantes y potenciadoras de la solubilidad.
Tabla 11: ScFv con una solubilidad y estabilidad optimizadas
Proteina
Mutaciones de VL/VH Tm de FTIR (°C) Solubilidad de PEG (mg/ml) Actividad con relacion a E105 kD
QC7.1D-N-15.2
VL: D31N; V83E VH: V78A; K43R; F67L 69,0 90 1,7 9,06 x 10-10
QC7.1D-N-15.2 VH V103T
VL: D31N; V83E VH: V78A; K43R; F67L; V103T 68,9 106 1,5 8,79 x 10-10
QC7.1D-N-15.2 Opt 0_2
VL: D31N; V83E VH: V12S; V78A; K43R; F67L; L144S 66,6 121 1,2 8,12 x 10-10
QC7.1D-N-15.2 VH V103T Opt 0 2
VL: D31N; V83E VH: V12S; V78A; K43R; F67L; V103T; L144S 67,3 186 1,5 1,34 x 10-9
Se usaron los valores de solubilidad para las 4 variantes para deconvolucionar la contribucion de cada mutacion a la solubilidad del scFv. Todas las mutaciones parecieron contribuir a la solubilidad del scFv de manera aditiva aunque 5 varios de estos residuos esten relativamente proximos entre si tanto en la secuencia primaria como dentro de la estructura 3D. El analisis indico que una combinacion de tres mutaciones potenciadoras de la solubilidad en el dominio VH (V12S, L144S, V103T (o V103S)) representaba ~60% de la solubilidad de scFv. Puesto que los parches hidrofobos estan conservados en los dominios variables de todos los agentes de union inmunologica, esta combinacion optima de mutaciones puede usarse para mejorar la solubilidad de practicamente cualquier scFv u otra 10 molecula de agente de union inmunologica.
Ejemplo 3: Variante de solubilidad optimizada de Epi43max, un potente agente de union de TNFa
La tabla 12 representa datos de caracterizacion para tres variantes optimizadas de Epi43max, un potente agente de union de TNF. EP43_maxDHP es una variante potenciada de solubilidad de EP43max y comprende las tres mutaciones que potencian la solubilidad anterior (V^S en la posicion de AHo 12, V^T en la posicion de AHo 103, y 15 L^T en la posicion de AHo 144). Se generaron las variantes EP43_maxmln y EP43_mlnmax mediante seleccion
aleatoria de dominios entre injertos “min” y “max”. En particular, la variante “mlnmax” comprende la version de injerto mlnimo (injerto de CDR unicamente) de la cadena ligera y la version de injerto maximo de la cadena pesada (es decir, CDR de conejo injertados mas residuos de region de marco de conejo implicados en la union a antlgeno). En cambio, la variante “maxmln” comprendla la version de injerto maximo de la cadena ligera y la version de injerto 20 mlnimo de la cadena pesada. Las curvas de desnaturalizacion termica de EP43max y sus variantes optimizadas se compararon mediante analisis de FTIR (vease la figura 4). Se encontro que Epi43mlnmax tenia un punto medio de desplegamiento inferior que Epi43max. Ademas, la variante mlnmax presento una etapa que desplegaba la transicion, indicando que ambos dominios se despliegan a temperaturas muy similares.
Tabla 12: Datos de caracterizacion bioflsica para tres variantes optimizadas de Epi43max, un potente agente de
union de TNF.
FW L929* Kon Kaff KD Estabi- lidad de FT-IR tm°C Rendimiento de RF Expre- sion Detection de replega miento Purifica- cion
EP43_max
1,4 6,4 2,28E+05 5,68E- 05 2,49E- 10 74,32 21,73 +++ Ok Ok
EP43_maxDHP
1,4 6,7 2,35E+05 2,73E- 05 1, 16E- 10 60,15 17 +++ Ok Ok
EP43_maxmln
1,4 Inactivo 1,46E+05 LU CO ^co LO O LU CD ^ CO CO O 51,76 11 +++ Ok Ok
EP43_mlnmax
1,4 1,6 2,28E+05 1,98E- 04 8,68E- 10 65,81 46 +++ Ok ok
*L929 [EC50-E105/EC50-X], comparado en unidades de masa [ng/ml]
Ejemplo 4: Derivados con solubilidad potenciada de agentes de union inmunologica de VEGF
5 Ademas de los agentes de union inmunologica de TNF descritos anteriormente (ESBA105 y Epi43max), se modificaron mediante ingenierla genetica varios derivados de solubilidad de agentes de union inmunologica de VEGF segun los metodos de la invention. En particular, estas variantes de agente de union inmunologica de VEGF se modificaron mediante ingenierla genetica para tener un parche hidrofobo alterado (“DHP”) seleccionado los siguientes residuos: (a) serina (S) en la position de aminoacido de cadena pesada 12; (b) serina (S) o treonina (T) 10 en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y (c) serina (S) o treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144. Las caracterlsticas bioflsicas de estas variantes de DHP se compararon con sus equivalentes silvestres. Estas caracterlsticas inclulan temperatura de fusion o Tm (tal como se determina mediante Bio-ATR), el porcentaje de perdida de laminas b a 60°C (tal como se determina mediante AquaSpec), el porcentaje de perdida de protelnas tras precipitation a 60°C, solubilidad mediante precipitation de sulfato de amonio, rendimiento de 15 replegamiento en production y niveles de expresion en E. coli.
Tal como se representa en la tabla 14 a continuation, la solubilidad de uno de los agentes de union inmunologica de VEGF (ESBA578mlnmax FW1.4 DHP) se potencio significativamente mediante la introduction del motivo de DHP. Ademas, otras propiedades bioflsicas (por ejemplo, estabilidad termica) o bien no resultaron afectadas de manera adversa o bien mejoraron por la introduccion del motivo. Las curvas de estabilidad termica usadas para determinar la 20 temperatura de fusion para 578mln-max y su variante de solubilidad optimizada (578mln-max_DHP) se representan en la figura 5 y la tabla 13, mientras que las curvas de precipitacion de sulfato de amonio usadas para determinar los valores de solubilidad se representan en la figura 6.
Tabla 13
Epi43maxDHP(941) Epi43maxmin (959) Epi43max (676) Epi43mlnmax (958)
V50
60,15 65,81 77,78 51,76
PENDIENTE
2,618 2,908 10,43 4,297
R2
0,9974 0,9969 0,9855 0,9936
Tabla 14: Caracterizacion bioflsica de agentes de union inmunologica de VEGF
Agente de union inmunologica
TM [°C] % de perdida de laminas b % de perdida de protelnas Solubilidad [CE50 en % de saturacion de NH4(SO4)2] Rendimiento de replegamiento (mg/L) Nivel de expresion (unidades arbitrarias)
578-max
70.36 -1.93% 16.20% 27.24 12.5 +
578-max FEW1.4_DHP
ND ND ND ND 11.6 +
578-mln-max
71.12 -0.52% 10.99% 28.13 23.93 + + +
578-mln-max FW1.4_DHP
70.18 -0.15% 14.82% 32.36 50.5 + + +

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Agente de union inmunologica que comprende uno de los siguientes motivos que potencian la solubilidad en las posiciones de aminoacido de cadena pesada 12, 103 y 144 (numeracion de AHo):
    (a) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
    (b) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y
    (c) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144; o (a1) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
    (b1) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y (c1) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144; o (a2) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
    (b2) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y (c2) treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144.
  2. 2. Agente de union inmunologica segun la reivindicacion 1, que comprende ademas
    (a) acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 31;
    (b) acido glutamico (E) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 83;
    (c) arginina (R) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 43;
    (d) leucina (L) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 67; y/o
    (e) alanina (A) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 78.
  3. 3. Metodo para potenciar la solubilidad de un agente de union inmunologica, comprendiendo el agente de union inmunologica una region variable de cadena pesada (Vh), o fragmento de la misma, comprendiendo el metodo:
    A) seleccionar al menos tres posiciones de aminoacido dentro de la region de Vh para la mutacion; y
    B) mutar las al menos tres posiciones de aminoacido seleccionadas para la mutacion,
    en el que las al menos tres posiciones de aminoacido son las posiciones de aminoacido de cadena pesada 12, 103 y 144 (segun el convenio de numeracion de AHo) y la mutacion comprende la sustitucion del aminoacido en las posiciones de aminoacido seleccionadas frente a un aminoacido hidrofilo.
  4. 4. Metodo segun la reivindicacion 3, en el que el aminoacido hidrofilo es
    (a) serina (S) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12;
    (b) serina (S) o treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103; y/o
    (c) serina (S) o treonina (T) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 3 o 4, en el que el aminoacido en la posicion de aminoacido seleccionada para la mutacion es un aminoacido hidrofobo.
  6. 6. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que el aminoacido hidrofobo es leucina (L) o valina (V).
  7. 7. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el aminoacido seleccionado para la mutacion de
    (a) el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena pesada 12 es valina (V);
    (b) el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena pesada 103 es valina (V); y
    (c) el aminoacido en la posicion de aminoacido de cadena pesada 144 es leucina (L).
  8. 8. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que la estabilidad termica, el replegamiento, el 5 rendimiento de expresion, la agregacion y/o la actividad de union del agente de union inmunologica no resultan
    adversamente afectados por la mutacion.
  9. 9. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que la mutacion da como resultado al menos un aumento de 2 veces en la solubilidad.
  10. 10. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que la mutacion comprende ademas la etapa 10 de introducir una o mas mutaciones en una posicion de aminoacido (convenio de numeracion de AHo) seleccionada
    del grupo que consiste en:
    (a) acido aspartico (D) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 31;
    (b) acido glutamico (E) en la posicion de aminoacido de cadena ligera 83;
    (c) arginina (R) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 43;
    15 (d) leucina (L) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 67; y
    (e) alanina (A) en la posicion de aminoacido de cadena pesada 78.
  11. 11. Agente de union inmunologica preparado segun el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10.
  12. 12. Agente de union inmunologica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 11, que es un anticuerpo scFv, una inmunoglobulina de longitud completa, un fragmento Fab, un Dab o un Nanobody.
    20 13. Agente de union inmunologica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 11 o 12 en el que el agente de
    union inmunologica se une especlficamente a TNFa humano o a VEGF humano.
  13. 14. Composicion que comprende el agente de union inmunologica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 11, 12 o 13 y un portador farmaceuticamente aceptable.
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