RU2514658C2 - Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств - Google Patents
Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств Download PDFInfo
- Publication number
- RU2514658C2 RU2514658C2 RU2011102548/10A RU2011102548A RU2514658C2 RU 2514658 C2 RU2514658 C2 RU 2514658C2 RU 2011102548/10 A RU2011102548/10 A RU 2011102548/10A RU 2011102548 A RU2011102548 A RU 2011102548A RU 2514658 C2 RU2514658 C2 RU 2514658C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- heavy chain
- acid position
- solubility
- mutation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 173
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 78
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 66
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 29
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 11
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 11
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 11
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 10
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N D-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 6
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims description 4
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 3
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 claims description 3
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 108
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 67
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- -1 cetuximab (Erbitux® Chemical compound 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 3
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 3
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 3
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 2
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 101100421450 Drosophila melanogaster Shark gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004230 Fast Yellow AB Substances 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 2
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N (R)-alpha-Tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 159000000032 aromatic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010385 ascorbyl palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000001210 attenuated total reflectance infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 102220367300 c.201C>G Human genes 0.000 description 1
- 102220362974 c.37G>A Human genes 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002023 chloroprocaine Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229960002806 daclizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043237 diethanolamine Drugs 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 1
- 229960001776 edrecolomab Drugs 0.000 description 1
- 229960000284 efalizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 229940012017 ethylenediamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229960000578 gemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229960003297 gemtuzumab ozogamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940076783 lucentis Drugs 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 1
- 208000037916 non-allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 229940107685 reopro Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220120649 rs886042622 Human genes 0.000 description 1
- 102220133422 rs886054767 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940115586 simulect Drugs 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940100996 sodium bisulfate Drugs 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940001482 sodium sulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940055944 soliris Drugs 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N tocofersolan Chemical compound OCCOC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079023 tysabri Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229940099073 xolair Drugs 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ использования анализа последовательностей и рациональных стратегий улучшения растворимости иммуносвязывающих средств и, в частности, одноцепочечных антител (scFv). Способ предусматривает проведение нескольких замещений на гидрофильные остатки, выявленные путем анализа базы данных выбранных стабильных последовательностей scFv. Также описано одноцепочечное антитело, полученное таким способом, и композиция, его включающая. Изобретение может быть использовано в медицине. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 14 табл., 4 пр.
Description
Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США 61/075692, озаглавленной «Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств», поданной 25 июня 2008 г.
Предпосылки создания изобретения
Доказано, что антитела являются очень эффективными и успешными терапевтическими агентами при лечении рака, аутоиммунных заболеваний и других нарушений. Хотя клинически обычно используются полноразмерные антитела, применение фрагментов антитела может дать ряд преимуществ, таких как повышенная проникающая способность в ткани, отсутствие Fc-эффекторной функции в сочетании со способностью добавлять другие эффекторные функции и вероятностью меньшего системного побочного действия благодаря более короткому системному времени полужизни in vivo. Фармакокинетические свойства фрагментов антител показывают, что они могут быть особенно подходящими для локализованных терапевтических подходов. Кроме того, в некоторых системах экспрессии легче продуцировать фрагменты антител, чем полноразмерные антитела.
Одним типом фрагментов антител является одноцепочечное антитело (scFv), которое состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH), связанного с вариабельным доменом легкой цепи (VL) линкерной последовательностью. Таким образом, scFv не содержит всех доменов константных областей антитела, и аминокислотные остатки исходной границы раздела вариабельный/константный домен (остатки поверхности раздела) становятся открытыми для растворителя. scFv можно получать из полноразмерного антитела (например, молекула IgG) c помощью разработанных методов рекомбинантной инженерии. Однако трансформация полноразмерного антитела в scFv часто приводит к плохой стабильности и растворимости белка, низким выходам при получении и высокой тенденции к агрегации, что повышает риск иммуногенности.
Соответственно, предпринимались попытки для улучшения свойств scFv, таких как растворимость. Например, Nieba L. и др. (Prot. Eng. (1997) 10:435-444) выбрал три аминокислотных остатка, известных как остатки поверхности раздела, и осуществил их мутацию. Авторы наблюдали повышенную периплазматическую экспрессию мутированного scFv в бактериях, а также пониженную скорость термоиндуцированной агрегации, хотя термодинамическая стабильность и растворимость существенно не изменялись. Кроме того, в своей публикации авторы ясно указывают, что они не наблюдали каких-либо улучшений растворимости структуры нативного белка сконструированных scFv, как было определено методом ПЭГ-осаждения. Также сообщалось о других исследованиях, в которых был проведен сайт-направленный мутагенез определенных аминокислотных остатков в scFv (см., например, Tan, P.H. et al. (1988) Biophys. J. 75:1473-1482; Worn, A. and Pluckthun, A. (1998) Biochem. 37:13120-13127; Worn, A. and Pluckthun, A. (1999) Biochem. 38:8739-8750). В данных разнообразных исследованиях аминокислотные остатки, выбранные для мутагенеза, были выбраны на основании их известных положений в структуре scFv (например, по данным исследований молекулярного моделирования).
В другом подходе определяющие комплементарность области (CDR) очень плохо экспрессируемого scFv прививали на каркасные области scFv, для которого было продемонстрировано наличие подходящих свойств (Jung, S. and Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966). Полученный scFv показал повышенную экспрессию в растворе и термодинамическую стабильность.
Прогресс в инженерии scFv с целью улучшения их растворимости и других функциональных свойств систематизирован в виде обзора, например, Worn, A. and Pluckthun, A. (2001) J. MoI. Biol. 305:989-1010. Однако все еще сохраняется потребность в новых подходах, которые дают возможность рационального конструирования иммуносвязывающих средств, в частности scFv с превосходной растворимостью. Более того, все еще необходимы способы инженерии scFv и других типов антител для придания им повышенной растворимости - в особенности растворимости нативного белка.
Краткое изложение сущности изобретения
Данное изобретение относится к иммуносвязывающему средству, содержащему мотив повышенной растворимости в вариабельной области тяжелой цепи VH, а также к способам инженерии иммуносвязывающих средств, таких как антитела scFv, для придания им повышенной растворимости. В конкретных вариантах осуществления способы по изобретению включают замещение аминокислот в последовательности вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи иммуносвязывающего средства, которые являются потенциально проблематичными с точки зрения растворимости, на предпочтительные аминокислотные остатки, которые придают повышенную растворимость. Например, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный остаток заменяют на гидрофильный остаток.
Предпочтительно разработанное иммуносвязывающее средство, иммуносвязывающее средство, использованное или полученное с помощью способов инженерии по изобретению, представляет собой scFv, но другие иммуносвязывающие средства, такие как полноразмерные иммуноглобулины, Fab фрагменты, однодоменные антитела (например, Dab) и нанотела, также могут быть сконструированы в соответствии с данным способом. Изобретение также охватывает иммуносвязывающие средства, полученные в соответствии со способом конструирования, а также композиции, содержащие иммуносвязывающие средства и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном аспекте изобретение относится к иммуносвязывающему средству, содержащему один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация):
(а) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а1) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b1) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c1) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а2) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b2) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c2) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а3) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b3) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c3) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.
В другом аспекте изобретение относится к способу конструирования иммуносвязывающего средства, содержащего (i) вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, где вариабельная область тяжелой цепи содержит остатки каркасной области VH, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи или ее фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит остатки каркасной области VL, где указанный способ включает:
А) выбор по меньшей мере двух аминокислотных положений в пределах остатков каркасной области VH, остатков каркасной области VL или остатков каркасной области VH и VL для мутации; и
В) проведение мутации по меньшей мере двух аминокислотных положений, выбранных для мутации,
где если по меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, находятся в пределах остатков каркасной области VH, то замещение протекает в одном или нескольких аминокислотных положениях тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из положений 12, 103 и 144 (согласно правилам нумерации АНо), и/или
где если по меньшей мере одно или несколько аминокислотных положений, выбранных для мутации, находятся в пределах остатков каркасной области VL, то замещение протекает в аминокислотном положении легкой цепи, выбранном из группы, состоящей из положений 15, 52 и 147 (согласно правилам нумерации АНо; аминокислотного положения 15, 44 и 106 при использовании нумерации Кабата).
По меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, и аминокислотный(е) остаток(ки), вставленный(е) в выбранное(ые) положение(я), описаны далее более подробно. В нумерации аминокислотных положений, приведенной ниже, используется система нумерации АНо; соответствующие положения с использованием системы нумерации Кабата описаны далее в данном описании, и таблицы преобразования для систем нумераций АНо и Кабата приведены ниже в подробном описании. Аминокислотные остатки указаны с использованием стандартного однобуквенного обозначения.
Неожиданно было установлено, что присутствие указанных мутаций в указанных положениях повышает общую растворимость иммуносвязывающего средства, не оказывая отрицательного влияния на другие функциональные свойства белка. Например, в случае комбинации трех повышающих растворимость мутаций V12S, L144S и V103T в VH scFv было установлено, что указанные замещения отвечают за примерно 60% всей растворимости scFv. Это отличается от попыток, указанных в предшествующих результатах в данной области для повышения выхода экспрессии иммуносвязывающих средств. Например, в патенте США 6815540 описана модификация иммуносвязывающего средства за счет понижения гидрофобности во внутрицепочечной междоменной области раздела. Для этой цели было выявлено 16 положений вариабельного каркаса тяжелой цепи, которые могли быть индивидуально заменены одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из 10 аминокислот. Было установлено, что повышается выход экспрессии генерированных мутантов. Более того, та же группа исследователей опубликовала в 1999 г., т.е. тремя годами позднее даты приоритета указанного патента США, статью (см. Jung, S., Honegger, A. and Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966), указывающую, что в нескольких исследованиях сообщалось о том, что замена гидрофобных поверхностных остатков на более гидрофильные улучшает выход продуцирования. Согласно концепции данных авторов повышение продуктивности связано с улучшенным кинетическим порционированием между правильной укладкой и агрегированием неуложенного вещества, тогда как растворимость нативного белка существенным образом даже не затрагивается, так же как и термодинамическая стабильность. Таким образом квалифицированному специалисту ясно, что параметр растворимости Plückthun и др. относится только к экспрессии в растворе, а не к растворимости в целом нативного белка.
Краткое описание рисунков
Изобретение станет более понятно и задачи, отличающиеся от указанных выше, станут очевидными при рассмотрении следующего подробного описания. В данном описании приведены ссылки на прилагаемые рисунки.
На фиг.1 показаны кривые растворимости при ПЭГ-осаждении для ESBA105 дикого типа (Е105) и его растворимых вариантов.
На фиг.2 показаны профили термической денатурации для ESBA105 дикого типа (Е105) и его растворимых вариантов, измеренные в термоисследовании в широком диапазоне температур (25-96°С).
На фиг.3 показаны результаты исследования методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), которые показывают поведение при деградации различных растворимых мутантов ESBA105 после инкубации в условиях теплового стресса.
На фиг.4 показаны кривые термической денатурации EP43max и его оптимизированных вариантов, определенные анализом методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FRIR).
На фиг.5 показана термическая стабильность 578min-max и 578min-max_DHP в соответствии с измерениями методом FRIR.
Фиг.6а и 6b иллюстрируют растворимость 578min-max и 578min-max_DHP, определенную методом осаждения с помощью сульфата аммония.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к способам повышения растворимости иммуносвязывающих средств. Более конкретно, в настоящем изобретении раскрываются способы оптимизации иммуносвязывающих средств путем введения аминокислотных замещений в иммуносвязывающем средстве, которые улучшают растворимость иммуносвязывающего средства. Изобретение также относится к специализированным иммуносвязывающим средствам, например scFv, полученным в соответствии со способами по изобретению.
Для того чтобы изобретение можно было легче понять, первоначально будут определены некоторые термины. Если не определено другого, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют такие же значения, какие обычно понимаются обычным специалистом в данной области, к которой принадлежит изобретение. Хотя для практической реализации или проверки изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные приведенным в данном описании, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие отмеченные в описании ссылки включены в него путем ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Термин «антитело», как он использован в данном описании, является синонимом «иммуноглобулина». Антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой полноразмерные иммуноглобулины или их фрагменты, включающие по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина, такой как одноцепочечные вариабельные домены, Fv (Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 или другие фрагменты, хорошо известные специалисту в данной области.
Термин «каркасный участок антитела» или «каркасный участок», как он использован в данном описании, относится к части вариабельного домена, либо VL (вариабельная область легкой цепи), либо VH (вариабельная область тяжелой цепи), которая служит в качестве основы для антигенсвязывающих петлевых фрагментов данного вариабельного домена (Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242).
Термин «CDR антитела» или «CDR», как он использован в данном описании, относится к гипервариабельным участкам антитела, которые состоят из антигенсвязывающих петлевых фрагментов в соответствии с определением Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. Каждый из двух вариабельных доменов фрагмента Fv антитела содержит, например, три CDR.
Термин «одноцепочечное антитело» или «scFv» относится к молекуле, включающей вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельную область легкой цепи антитела (VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv могут иметь общие структуры: NH2-VL-линкер-VH-COOH или NH2-VH-линкер-VL-COOH.
В данном описании термин «идентичность» относится к сопоставлению последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает одно и то же основание или мономерную субъединицу аминокислоты (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занимает аденин, или положение в каждом из двух полипептидов занимает лизин), то соответствующие молекулы являются идентичными по данному положению. «Процент идентичности» для двух последовательностей представляет собой функцию числа совместимых положений, используемых совместно в двух последовательностях, деленную на число сравниваемых положений × 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются совместимыми, то две последовательности имеют 60% идентичность. В качестве примера ДНК-последовательности CTGACT и CAGGTT имеют 50% идентичность (3 из 6 общих положений являются совместимыми (равноценными)). Обычно сравнение проводят, когда две последовательности совмещены для получения максимальной идентичности. Такое совмещение можно обеспечить с использованием, например, метода Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, легко осуществимого с помощью компьютерных программ, таких как программа Align (DNAstar, Inc.).
«Подобными» последовательностями являются те, которые при сопоставлении используют совместно идентичные и аналогичные остатки аминокислот, где подобные остатки представляют собой консервативные замещения для соответствующих аминокислотных остатков в сопоставленной ссылочной последовательности. В этом отношении «консервативное замещение» остатка в ссылочной последовательности представляет собой замещение остатком, который физически или функционально подобен соответствующему ссылочному остатку, например имеет аналогичный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи и тому подобное. Таким образом, «консервативно замещенная модифицированная» последовательность представляет собой ту, которая отличается от ссылочной последовательности или последовательности дикого типа тем, что в ней присутствует одно или несколько консервативных замещений. «Процентом подобия» между двумя последовательностями является функция числа положений, которые содержат согласованные остатки или консервативные замещения, совместно занимаемые двумя последовательностями, деленного на число сравниваемых положений и умноженного на фактор 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях согласуются, и 2 из 10 положений содержат консервативные замещения, то две последовательности имеют 80%-е положительное подобие.
Термин «консенсусная аминокислотная последовательность», как он использован в данном описании, относится к аминокислотной последовательности, которая может быть генерирована с использованием матрицы из по меньшей мере двух и, предпочтительно, более согласованных аминокислотных последовательностей, давая пробелы в согласовании, такие что возможно определить наиболее часто встречающийся остаток аминокислоты в каждом положении. Консенсусная последовательность представляет собой такую последовательность, которая включает аминокислоты, которые наиболее часто представлены в каждом положении. В том случае когда две или более аминокислот равным образом представлены для одного положения, консенсусная последовательность включает обе или все из данных аминокислот.
Аминокислотная последовательность белка может быть проанализирована на разных уровнях. Например, консервативность или вариабельность может проявляться на уровне единственного остатка, уровне множества остатков, уровне множества остатков с промежутками и т.д. Остатки могут проявлять сохранение идентичного остатка или могут сохраняться на уровне классов. Примеры классов аминокислот включают класс аминокислот с полярными, но незаряженными боковыми цепями или группами R (серин, треонин, аспарагин и глутамин); с положительно заряженными группами R (лизин, аргинин и гистидин); с отрицательно заряженными группами (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота); с гидрофобными группами R (аланин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, валин и тирозин); и класс специальных аминокислот (цистеин, глицин и пролин). Другие классы известны специалисту в данной области и могут быть определены с использованием структурных тенденций или других данных для оценки замещаемости. В этом смысле выражение «способная к замещению аминокислота» может относиться к любой аминокислоте, которая может быть замещена и поддерживает функциональную сохранность в данном положении.
Однако будет понятно, что аминокислоты одного и того же класса могут изменяться в определенной степени по их биофизическим свойствам. Например, будет понятно, что некоторые гидрофобные группы R (например, аланин, серин или треонин) являются более гидрофильными (т.е. обладают более высокой гидрофильностью или более низкой гидрофобностью), чем другие гидрофобные группы R (например, валин или лейцин). Относительная гидрофильность или гидрофобность могут быть определены с использованием известных в данной области методов (см., например, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) и Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
В данном описании, когда одна аминокислотная последовательность (например, первая последовательность VH или VL) совмещена с одной или несколькими дополнительными аминокислотными последовательностями (например, одной или несколькими последовательностями VH или VL в базе данных), положение аминокислоты в одной последовательности (например, первой последовательности VH или VL) можно сравнить с «соответствующим положением» в одной или нескольких дополнительных аминокислотных последовательностях. В данном описании выражение «соответствующее положение» относится к эквивалентному положению в последовательности(ях) при сравнении, когда последовательности совмещены оптимальным образом, т.е. когда последовательности совмещены для достижения наиболее высокого процента идентичности или процента подобия.
В данном описании термин «база данных антител» относится к коллекции двух или более аминокислотных последовательностей антител («множество» последовательностей) и обычно относится к коллекции из десятков, сотен и даже тысяч аминокислотных последовательностей антител. База данных антител может хранить аминокислотные последовательности, например, состоящие из коллекции VH областей антител, VL областей антител или и тех, и других, или может хранить коллекцию последовательностей scFv, включающих области VH и VL. Предпочтительно, база данных хранится в доступной для поиска форме, фиксированной как, например, на компьютере с доступной для поиска компьютерной программой. В одном варианте осуществления база данных антител представляет собой базу данных, включающую или состоящую из последовательностей антител эмбрионального типа. В другом варианте осуществления база данных антител представляет собой базу данных, включающую или состоящую из последовательностей «созревших» антител (с полностью сформированной трехмерной структурой) (например, база данных Кабата последовательностей «созревших» антител, например база данных KBD). Еще в одном варианте осуществления база данных антител представляет собой базу данных, включающую или состоящую из функционально отобранных последовательностей (например, последовательностей, отобранных по QC анализу).
Термин «иммуносвязывающее средство» относится к молекуле, которая содержит весь или часть антиген-связывающего сайта антитела, например весь или часть вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, так что иммуносвязывающее средство специфически распознает антиген-мишень. Неограничивающие примеры иммуносвязывающих средств включают полноразмерные молекулы иммуноглобулина и scFv, а также фрагменты антител, включая, но не ограничиваясь указанным, (i) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab)' фрагмент, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух Fab фрагментов, связанных с помощью дисульфидного мостика в шарнирном участке; (iii) Fab' фрагмент, который по существу представляет собой Fab с частью шарнирной области (см. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3 дополненное издание. 1993)); (iv) Fd фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (v) Fv фрагмент, включающий домены VH и VL одной цепи антитела, (vi) однодоменное антитело, такое как фрагмент Dab (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из VH или VL домена, антитело верблюдовых (см. Hamers-Casterman, et al., Nature 363: 446-448 (1993), and Dumoulin, et al., Protein Science 11: 500-515 (2002)) или антитело акулы (например, Ig-NARs акулы, Nanobodies®); и (vii) нанотело, вариабельная область тяжелой цепи, содержащая один вариабельный домен и два константных домена.
В данном описании термин «функциональное свойство» относится к свойству полипептида (например, иммуносвязывающего средства), для которого улучшение (например, относительно обычного полипептида) является желательным и/или выигрышным для специалиста в данной области, например, для улучшения свойств при получении или терапевтической эффективности полипептида. В одном варианте осуществления функциональное свойство представляет собой стабильность (например, термическую стабильность). В другом варианте осуществления функциональное свойство представляет собой растворимость (например, в условиях клетки). Еще в одном варианте осуществления функциональное свойство представляет собой поведение при агрегации. Еще в одном следующем варианте осуществления функциональное свойство представляет собой экспрессию белка (например, в прокариотической клетке). Еще в одном другом варианте осуществления функциональное свойство представляет собой эффективность рефолдинга (пересворачивание белка) после солюбилизации включения в соответствующем процессе очистки. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания антигена не является функциональным свойством, которое желательно улучшить. Еще в одном варианте осуществления улучшение функционального свойства не включает существенного изменения в аффинности связывания антигена.
Термин «растворимость», как он использован в данном описании, относится к растворимости нативного белка, т.е. мономерного, неагрегированного и функционального иммуносвязывающего средства. Выражение «повышенная растворимость» означает улучшение растворимости нативного белка, которое предпочтительно определяют с помощью по меньшей мере одного из следующих методов: ПЭГ-осаждение, осаждение сульфатом аммония, выход рефолдинга или любой другой способ для определения растворимости, известный специалисту в данной области. Метод ПЭГ-осаждения представляет собой способ в соответствии с описанным Atha и др., в "Mechanism of Precipitation of Proteins by Polyethylene Glycols", JBC, 256: 12108-12117 (1981). Осаждение сульфатом аммония может быть осуществлено, например, следующим образом: готовят 10 мкл аликвоты растворов белка с концентрацией 20 мг/мл, к каждой из которых добавляют 10 мкл раствора (NH4)2SO4 разной степени насыщенности (например, 35%, 33%, 31%, 29%, 25%, 20% и 15%) с последующим интенсивным перемешиванием в течение 5 секунд и 30-минутным инкубированием при комнатной температуре. После центрифугирования при 6000 об/мин при 4оС в течение 30 мин определяют концентрацию белка в супернатанте. В таком способе предметом сравнения для различных белков является значение V50, которое представляет собой процент насыщенности раствора (NH4)2SO4, при котором осаждается 50% белка. V50 определяют из графика содержания растворенного белка, определенного в супернатанте, относительно использованного процента насыщенности раствора (NH4)2SO4. Выход рефолдинга соответствует проценту правильно сложенного белка, полученного в присутствии солюбилизированных веществ включения в соответствующем способе получения/очистки. Термин «растворимость», как он использован в данном описании, не относится к растворимой экспрессии.
Иммуносвязывающие средства с улучшенной растворимостью
В первом аспекте разработано иммуносвязывающее средство, включающее один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация):
(а) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а1) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b1) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c1) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а2) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b2) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c2) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а3) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b3) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c3) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.
Неожиданно было установлено, что присутствие указанных аминокислот в указанных положениях повышает общую растворимость всего иммуносвязывающего средства. Например, в случае комбинации трех повышающих растворимость мутаций V12S, L133S и V103T в VH scFv было найдено, что указанные замещения ответственны примерно на 60% за общую растворимость scFv. Поскольку гидрофобные участки сохраняются в вариабельных доменах всех иммуносвязывающих средств, одно или несколько замещений в указанных положениях можно использовать для улучшения растворимости любого иммуносвязывающего средства.
Иммуносвязывающее средство предпочтительно представляет собой антитело scFv, полноразмерный иммуноглобулин, фрагмент Fab, Dab или нанотело.
В предпочтительном варианте осуществления иммуносвязывающее средство дополнительно включает одну или несколько аминокислот из группы, состоящей из (а) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи. Присутствие одной или нескольких указанных аминокислот в соответствующих положениях придает иммуносвязывающему средству повышенную растворимость.
Указанные здесь аминокислоты могут присутствовать в природных иммуносвязывающих средствах или их производных, или иммуносвязывающее средство может быть сконструировано таким образом, чтобы оно включало одну или несколько вышеуказанных аминокислот.
В предпочтительном варианте осуществления раскрытое в данном описании иммуносвязывающее средство специфически связывается с TNFα человека или VEGF человека.
Инженерия иммуносвязывающих средств с повышенной растворимостью
Как подробно описано в деталях, описанный здесь подход на основании последовательностей был успешно использован для идентификации определенных замещений аминокислотных остатков, которые придают повышенную растворимость. Примеры перечисляют иллюстративные и предпочтительные замещения аминокислот в определенных аминокислотных положениях в пределах VH областей и необязательно в VL области иммуносвязывающего средства (например, scFv). Иллюстративные замещения включают замещения проблематичных остатков аминокислот (например, открытых для растворителя гидрофобных остатков) в аминокислотных положениях, которые являются более гидрофильными и которые существуют с большей частотой в базе данных (например, базе данных зрелого антитела (KDB)). Особенно предпочтительное замещение представляет собой наиболее часто встречающийся остаток, который является более гидрофильным, чем проблематичный остаток. В других вариантах осуществления более гидрофильную аминокислоту выбирают из группы, состоящей из аланина (А), серина (S) и треонина (Т).
Соответственно, изобретение относится к способам инженерии, в которых одно или несколько специфических замещений аминокислот проводят в иммуносвязывающем средстве, таком как антитело scFv. Такие замещения можно провести с использованием стандартных методов молекулярной биологии, таких как сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный мутагенез и тому подобные.
Как указано в примерах, следующие аминокислотные положения были идентифицированы как проблематичные аминокислоты (т.е. так называемые «гидрофобные участки») для модификации указанных последовательностей VH или VL:
V H: аминокислотные положения 2, 4, 5, 12, 103 и 144; и
V L: аминокислотные положения 15, 52 и 147.
Использованная нумерация представляет собой систему нумерации АНо; таблицы преобразования для перевода нумерации АНо в систему нумерации Кабата приведены в таблицах 1 и 2.
Неожиданно было установлено, что замещение в двух или более положениях 12, 103, 144 VH (в соответствии с системой нумерации) влияет на общую растворимость иммуносвязывающего средства целиком. Поскольку гидрофобные участки сохраняются в вариабельных доменах всех иммуносвязывающих средств, по меньшей мере два замещения в указанных положениях можно использовать для улучшения растворимости любого иммуносвязывающего средства.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу конструирования иммуносвязывающего средства, такого как антитело scFv, в котором проводят по меньшей мере два аминокислотных замещения в одном или нескольких выявленных аминокислотных положениях, см. выше, получая тем самым вариантные (т.е. мутированные) формы иммуносвязывающих средств.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу конструирования иммуносвязывающего средства, при этом способ включает:
А) выбор для мутации по меньшей мере двух аминокислотных положений в пределах области VH, области VL или областей VH и VL; и
В) проведение мутации по меньшей мере в двух аминокислотных положениях, выбранных для мутации,
где если по меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, находятся в пределах области VH, замещение проводят по меньшей мере в двух аминокислотных положениях тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из положений 12, 103 и 144 (в соответствии с правилом нумерации АНо; аминокислотных положений 11, 89 и 108 при использовании нумерации Кабата), и/или
где если по меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, находятся в пределах области VL, замещение проводят по меньшей мере в двух аминокислотных положениях легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из положений 15, 52 и 147 (в соответствии с правилом нумерации АНо; аминокислотных положений 15, 44 и 106 при использовании нумерации Кабата).
В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение занято гидрофобной аминокислотой (например, лейцин (L) или валин (V)). В одном варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи представляет собой валин (V). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи представляет собой валин (V). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи представляет собой лейцин (L). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 15 легкой цепи представляет собой валин (V). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 52 легкой цепи представляет собой фенилаланин (F). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 147 легкой цепи представляет собой валин (V).
Предпочтительно мутация представляет собой замещение аминокислоты в выбранном аминокислотном положении на более гидрофильную аминокислоту. В других вариантах осуществления более гидрофильную аминокислоту выбирают из серина (S) или треонина (Т).
В некоторых вариантах осуществления способ включает а) выбор для мутации по меньшей мере двух аминокислотных положений в пределах иммуносвязывающего средства; и b) проведение мутации по меньшей мере в двух аминокислотных положениях, выбранных для мутации, где мутация включает по меньшей мере два замещения, выбранных из группы, состоящей из:
(i) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи при использовании нумерации АНо (положение 11 при использовании нумерации Кабата);
(ii) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи при использовании нумерации АНо (положение 89 при использовании нумерации Кабата); и
(iii) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи при использовании нумерации АНо (положение 108 при использовании нумерации Кабата).
В более предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере в одном из аминокислотных положений 12, 103 и 144 тяжелой цепи находится треонин (Т).
В следующих вариантах осуществления мутация включает замещение на треонин (Т) в аминокислотном положении 15 легкой цепи при использовании нумерации АНо или нумерации Кабата и/или замещение на аланин (А) в аминокислотном положении 147 легкой цепи при использовании нумерации АНо (положение 106 по правилам нумерации Кабата).
В других вариантах осуществления мутация приводит по меньшей мере к 2-кратному увеличению растворимости (например, 2-кратному, 2,5-кратному, 3-кратному, 3,5-кратному, 4-кратному или большему увеличению растворимости).
В другом варианте осуществления мутация не оказывает неблагоприятного воздействия на термическую стабильность, рефолдинг, выход экспрессии, агрегацию и/или активность связывания иммуносвязывающего средства.
В некоторых вариантах осуществления мутация дополнительно включает одну или несколько стабилизирующих мутаций в аминокислотном положении (правило нумерации АНо), выбранном из группы, состоящей из (а) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи. Было доказано, что данные мутации оказывают влияние на стабильность иммуносвязывающего средства.
В другом аспекте данное изобретение относится к иммуносвязывающему средству, полученному в соответствии со способом по изобретению.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления иммуносвязывающее средство, сконструированное в соответствии со способом по данному изобретению, представляет собой известное в данной области иммуносвязывающее средство, которое связывает антиген-мишень, имеющий терапевтическое значение, или иммуносвязывающее средство, которое включает вариабельные области (области VL и/или VH) одну или несколько CDR (например, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 и/или CDRH3), полученные из иммуносвязывающего средства, имеющего терапевтическое значение. Например, иммуносвязывающие средства, одобренные в настоящее время Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) или другими регулирующими органами, могут быть сконструированы в соответствии со способом по изобретению. Более конкретно, данные иллюстративные иммуносвязывающие средства включают, но не ограничиваются указанным, антитела по отношению к CD3, такие как муромонаб (Orthoclone® OKT3; Johnson&Johnson, Brunswick, NJ; см. Arakawa et al. J. Biochem, (1996) 120:657-662; Kung and Goldstein et al., Science (1979), 206: 347-349), антитела по отношению к CD11, такие как эфализумаб (Raptiva®, Genentech, Южный Сан-Франциско, CA), антитела по отношению к CD20, такие как ритуксимаб (Rituxan®/Mabthera®, Genentech, Южный Сан-Франциско, CA), тозитумомаб (Bexxar®, GlaxoSmithKline, Лондон) или ибритумомаб (Zevalin®, Biogen Idec, Кэмбридж MA) (см. патенты США № 5736137; 6455043 и 6682734), антитела по отношению к CD25 (IL2Rα), такие как даклизумаб (Zenapax®, Roche, Базель, Швейцария) или базиликсимаб (Simulect®, Novartis, Базель, Швейцария), антитела по отношению к CD33, такие как гемтузумаб (Mylotarg®, Wyeth, Мэдисон, NJ - см. патенты США № 5714350 и 6350861), антитела по отношению к CD52, такие как алемтузумаб (Campath®, Millennium Pharmacueticals, Кэмбридж, MA), антитела по отношению к GpIIb/gIIa, такие как абциксимаб (ReoPro®, Centocor, Horsham, PA), антитела по отношению к TNFα, такие как инфликсимаб (Remicade®, Centocor, Хоршэм, PA) или адалимумаб (Humira®, Abbott, Abbott Park, IL - см. патент США № 6258562), антитела по отношению к IgE, такие как омализумаб (Xolair®, Genentech, Южный Сан-Франциско, CA), антитела по отношению к RSV, такие как паливизумаб (Synagis®, Medimmune, Гейтерсбург, MD - см. патент США № 5824307), антитела по отношению к EpCAM, такие как эдреколомаб (Panorex®, Centocor), антитела по отношению к EGFR, такие как цетуксимаб (Erbitux®, Imclone Systems, Нью-Йорк, NY) или панитумумаб (Vectibix®, Amgen, Thousand Oaks, CA), антитела по отношению к HER2/neu, такие как трастузумаб (Herceptin®, Genentech), антитела по отношению к α4 интегрину, такие как натализумаб (Tysabri®, BiogenIdec), антитела по отношению к C5, такие как экулизумаб (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals, Chesire, CT), и антитела по отношению к VEGF, такие как бевацизумаб (Avastin®, Genentech - см. патент США № 6884879) или ранибизумаб (Lucentis®, Genentech).
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления иммуносвязывающее средство, сконструированное в соответствии со способом по данному изобретению, представляет собой определенное вышеизвестное в данной области иммуносвязывающее средство. В предпочтительном варианте осуществления иммуносвязывающее средство представляет собой антитело scFv. В других вариантах осуществления иммуносвязывающее средство представляет собой, например, полноразмерный иммуноглобулин, Dab, нанотело или фрагмент Fab.
Несмотря на все вышесказанное в различных вариантах осуществления некоторые иммуносвязывающие средства исключены из использования в способах инженерии по изобретению и/или исключены из композиции иммуносвязывающего средства, полученной способами инженерии. Например, в различных вариантах осуществления имеется условие, что иммуносвязывающее средство не представляет собой любое антитело scFv или его вариант, как описано в публикациях РСТ WO 2006/131013 и WO 2008/006235, такое как ESBA105 или его варианты, которые описаны в публикациях РСТ WO 2006/131013 и WO 2008/006235, содержание каждой из которых специально включено в данное описание путем ссылки.
Предпочтительно раскрытое в данном описании иммуносвязывающее средство, использованное для раскрываемого здесь способа или полученное описанным здесь способом, соответственно, представляет собой антитело scFv, но также охватывает другие иммуносвязывающие средства, такие как полноразмерные иммуноглобулины, фрагменты Fab или любой описанный здесь другой тип иммуносвязывающего средства (например, Dab или нанотела).
В предпочтительном варианте осуществления иммуносвязывающее средство, как оно раскрывается в данном описании, использованное для раскрываемого здесь способа или полученное раскрываемым здесь способом, соответственно, специфически связывается с TNFα человека или VEGF человека.
Данное изобретение, кроме того, охватывает композиции, включающие описанные здесь иммуносвязывающие средства и фармацевтически приемлемый носитель.
Композиции и препараты scFv
Другой аспект изобретения относится к композиции scFv, полученного в соответствии со способами по изобретению. Таким образом, изобретение относится к композиции сконструированного scFv, в который были введены одна или несколько увеличивающих растворимость мутаций в аминокислотную последовательность по сравнению с оригинальным рассматриваемым scFv, где мутация(и) были введены в положения гидрофобных остатков аминокислот. В одном варианте осуществления scFv сконструирован таким образом, что он содержит одно мутированное аминокислотное положение (например, одно положение в каркасной области). В других вариантах осуществления scFv сконструирован таким образом, что он содержит два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти мутированных аминокислотных положений (например, положений в каркасной области).
В некоторых вариантах осуществления мутация дополнительно включает одну или несколько стабилизирующих мутаций, описанных в заявке РСТ № РСТ/СН2008/000285, озаглавленной «Способы модификации антител и модифицированные антитела с усовершенствованными функциональными свойствами», поданной 25 июня 2008 г., или в предварительной заявке на патент США сер. № 61/069056, озаглавленной «Способы модификации антител и модифицированные антитела с усовершенствованными функциональными свойствами», поданной 12 марта 2008 г., обе из которых включены в данное описание путем ссылки. Например, иммуносвязывающее средство может дополнительно включать замещение в аминокислотном положении (правила нумерации АНо), выбранном из группы, состоящей из (а) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи. Одна или несколько мутаций в указанных положениях воздействуют на общую стабильность всего иммуносвязывающего средства. В других вариантах осуществления мутация дополнительно включает следующие стабилизирующие мутации (правила нумерации АНо): (а) аспарагиновая кислота (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовая кислота (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинин (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцин (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланин (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.
Другой аспект изобретения относится к фармацевтическим препаратам композиций scFv по изобретению. Такие препараты обычно включают композицию scFv и фармацевтически приемлемый носитель. Как использовано в данном описании, «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие поглощение агенты и тому подобные, которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель является подходящим для, например, внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального, эпидермального (например, с помощью инъекции или вливания) или местного (например, в глаз или на кожу) введения. В зависимости от пути введения scFv может быть покрыт материалом для защиты соединения от действия кислот или других природных условий, которые могут дезактивировать соединение.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Выражение «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не оказывает каких-либо нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотно-аддитивные соли включают те, которые получены из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, ортофосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфорная и тому подобные, а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и тому подобные. Основно-аддитивные соли включают производные щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и тому подобные, а также нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобные.
Фармацевтическая композиция по изобретению также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и тому подобные; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобные, и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминотетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобные.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, многоатомные спирты (такие, как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобные) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или за счет использования поверхностно-активных веществ.
Данные композиции также могут содержать вспомогательные добавки, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Защиту от присутствия микроорганизмов можно гарантировать как с помощью методов стерилизации, см. выше, так и путем включения в состав различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенолсорбитановой кислоты и тому подобного. Также может оказаться желательным включение в состав композиций изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобных. Кроме того, пролонгированное поглощение фармацевтической инъекционной формы можно достичь путем включения агентов, которые замедляют поглощение, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для последующего применения. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением тех случаев когда какая-либо обычная среда или агент являются несовместимыми с активным соединением, подразумевается их применение в фармацевтических композициях по данному изобретению. В состав композиций также могут быть включены добавочные активные соединения.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть получена в виде раствора, микроэмульсии, липосомного препарата или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобные) и их подходящие смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии или за счет использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным будет включение в состав композиций изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированного поглощения инъекционных композиций можно достичь путем включения в композицию агентов, которые замедляют поглощение, например моностеаратные соли и желатин.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем введения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель вместе с одним из или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, как это требуется, с последующей стерилизацией путем микрофильтрования. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), с помощью которых получают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желательного ингредиента из предварительно стерилизованного фильтрованием их раствора.
Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения единичной препаративной лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, и конкретного пути введения. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения единичной препаративной лекарственной формы, обычно будет представлять собой количество композиции, которая вызывает терапевтическое действие. Обычно из расчета на сто процентов, данное количество будет колебаться от примерно 0,01 процента до примерно девяносто девяти процентов активного ингредиента, предпочтительно от примерно 0,1 процента до примерно 70 процентов, наиболее предпочтительно от примерно 1 процента до примерно 30 процентов активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Режимы дозировки регулируют для обеспечения оптимальной желаемой ответной реакции (например, терапевтической ответной реакции). Например, можно ввести один болюс, можно на протяжении времени вводить несколько раздельных доз или дозировка может быть пропорционально снижена или повышена в соответствии с показаниями по необходимости для терапевтической ситуации. Особенно выгодно получать парентеральные композиции в виде единичной дозированной лекарственной формы для легкости введения и равномерности дозирования. Термин «единичная дозированная лекарственная форма», как он использован в данном описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для субъектов, подвергаемых лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для оказания желаемого терапевтического действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Подробное описание единичных препаративных лекарственных форм по изобретению диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического действия, которое нужно достичь, и (b) ограничений, присущих в данной области компаундированию такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.
Системы нумерации положений в антителах
Таблицы перевода приведены для двух различных систем нумерации, использованных для идентификации положений остатков аминокислот в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела. Система нумерации Кабата описана дополнительно Kabat и др. (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Система нумерации AHo описана дополнительно в публикации Honegger, A. и Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670).
Нумерация вариабельной области тяжелой цепи
Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 2. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 4. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 3. Колонка 5. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 6. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 5. |
Нумерация вариабельной области легкой цепи
Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 2. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 4. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 3. Колонка 5. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 6. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 5. |
Другие варианты осуществления
Понятно, что изобретение также включает любые методологии, ссылки и/или композиции, указанные в приложениях (А-С) предварительной заявки на патент США сер. № 60/905365 (приоритет по заявке WO 08/110348) и приложениях (А-J) предварительной заявки на патент США сер. № 60/937112 (приоритет по заявке WO 09/000098), включая, но не ограничиваясь указанным, базы данных, данные по биоинформатике, данные манипулирования и способы интерпретации при компьютерном моделировании эксперимента, функциональные анализы, предпочтительные последовательности, предпочтительное(ые) положение(я) остатков/изменения, идентификацию и выбор каркасной области, изменения каркасной области, сравнительный анализ первичной структуры и интеграцию CDR и предпочтительные изменения/мутации.
Дополнительную информацию, касающуюся данных методологий и композиций, можно найти в заявках на патент США 60/819378 и 60/899907 и PCT публикации WO 2008/006235, озаглавленных "scFv Antibodies Which Pass Epithelial And/Or Endothelial Layers" и поданных в июле 2006 г. и 6 февраля 2007 г. соответственно; WO 06131013A2, озаглавленной "Stable And Soluble Antibodies Inhibiting TNFα", поданной 6 июня 2006 г.; EP 1506236A2, озаглавленной "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same", поданной 21 мая 2003 г.; EP 1479694A2, озаглавленной "Intrabodies ScFv with defined framework that is stable in a reducing environment" и поданной 18 декабря 2000 г.; EP 1242457B1, озаглавленной "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof", поданной 18 декабря 2000 г.; WO 03097697A2, озаглавленной "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same", поданной 21 мая 2003 г.; и WO 0148017A1, озаглавленной "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof", поданной 18 декабря 2000 г.; и публикации Honegger et al., J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001).
Кроме того, понятно, что изобретение также включает методологии и композиции, подходящие для открытия и/или усовершенствования других форматов антител, например полноразмерные антитела или их фрагменты, например Fab, Dab и тому подобные. Соответственно, принципы и остатки, выявленные в данном изобретении в качестве подходящих для выбора или изменения с целью достижения желаемых биофизических и/или терапевтических свойств, можно использовать для широкого круга иммуносвязывающих средств. В одном варианте осуществления терапевтически значимые антитела, например, одобренные Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA), усовершенствуют путем модификации одного или нескольких положений остатков, как раскрывается в данном описании.
Изобретение, однако, не ограничено инженерией иммуносвязывающих средств. Например, специалисту в данной области будет понятно, что способы по изобретению могут быть применены для инженерии других, неиммуноглобулиновых, связывающих молекул, включая, но не ограничиваясь указанным, связывающие молекулы фибронектина, такие как Аднектины (см. WO 01/64942 и патенты США № 6673901, 6703199, 7078490 и 7119171), Аффитела (см., например, патенты США № 6740734 и 6602977 и WO 00/63243), Антикалины (так же известные, как липокалины) (см. WO 99/16873 и WO 05/019254), доменные белки (см. WO 02/088171 и WO 04/044011) и анкирин-повторяющие белки, такие как Дарпины или лейцин-повторяющие белки (см. WO 02/20565 и WO 06/083275).
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируют следующие примеры, которые не следует рассматривать как дополнительно ограничивающие. Содержание всех фигур и всех ссылок, патентов, опубликованных и неопубликованных патентных заявок, процитированных в данном описании, специально включено в данное описание путем ссылки во всей своей полноте.
Пример 1. Образование scFv с улучшенной растворимостью
В данном примере структурное моделирование и подход на основании анализа последовательности были использованы для выявления мутаций в каркасной области scFv, которые приводят к улучшенной растворимости.
а) Структурный анализ
Трехмерную 3D структуру ESBA 105 scFv моделировали с использованием автоматического сервера гомология-моделирование структуры белка, доступного через вэб-сервер ExPASy. Структуру анализировали в соответствии с относительной поверхностью, доступной для растворителя, (оПДР) и остатки классифицировали следующим образом: (1) открытые для остатков, демонстрирующих оПДР≥50%, и (2) частично открытые для остатков с 50%≤оПДР≥25%. Гидрофобные остатки с оПДР≥25% рассматривались как гидрофобные участки. Для оценки площади, доступной для растворителя, для каждого из выявленных гидрофобных участков проводили расчеты для 27 PDB файлов с высокой гомологичностью по отношению к ESBA105 и разрешением выше 2,7Å. Средние оПДР и стандартные отклонения рассчитывали для гидрофобных участков и подробно изучали для каждого из них.
Таблица 3 | |
Оценка гидрофобных участков поверхности | |
Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации АНо. Колонка 2. Домен для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Средняя площадь, доступная для растворителя, рассчитанная из 27 PDB файлов. Колонка 4. Стандартные отклонения от колонки 3. Колонки 5-9. Структурная роль гидрофобных участков, выбранных из АНо. |
Большинство гидрофобных участков, выявленных в ESBA105, соответствуют области контакта вариабельных-константных доменов (VH/CH). Это коррелирует с предшествующими выявленными данными по открытым для растворителя гидрофобным участкам в формате scFv (Nieba et al., 1997). Два гидрофобных участка (VH2 и VH5) также вносят вклад во взаимодействие VL-VH и соответственно были исключены из последующего анализа.
b) Конструирование мутаций, способствующих растворимости
Была осуществлена выборка всего 122 VL и 137 VH последовательностей из вэб-страницы (www.bioc.uzh.ch/antibody) Анны-Марии Хонеггер (Annemarie Honegger). Последовательности первоначально соответствовали структурам 393 антител в Fv или Fab формате, извлеченных из банка данных белков (PDB) (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Последовательности использовали для анализа вне зависимости от вида или подгруппы для увеличения вероятности выявления альтернативных аминокислот с более высокой гидрофильностью, чем нативные остатки. Последовательности, имеющие более чем 95% идентичность с любой другой последовательностью в пределах базы данных, исключали для уменьшения отклонения. Последовательности совмещали и анализировали частоту появления остатков. Инструменты и алгоритмы анализа последовательности применяли для выявления и отбора гидрофильных мутаций для нарушения гидрофобных участков в ESBA105. Последовательности сопоставляли в соответствии с системой нумерации АНо для вариабельного домена иммуноглобулина (Honegger and Pluckthun 2001). Анализ ограничивали каркасными областями.
Частоту встречаемости остатка, f(r), для каждого положения, i, в созданной пользователем базе данных рассчитывали по числу раз, когда конкретный остаток наблюдается в пределах набора данных, деленному на общее число последовательностей. На первой стадии частоту появления различных аминокислот рассчитывали для каждого гидрофобного участка. Частоту появления остатка для каждого гидрофобного участка, выявленного в ESBA105, анализировали в рамках созданной пользователем базы данных, описанной выше. В таблице 4 приведена частота встречаемости остатков в гидрофобных участках, деленная на все количество остатков целиком, присутствующее в базе данных.
Таблица 4 | |
Частота появления остатка для 259 последовательностей зрелых антител в формате scFv или Fab для гидрофобных участков, выявленных в ESBA105 | |
На второй стадии частоту появления гидрофильных остатков в гидрофобных участках использовали для конструирования мутаций, ответственных за растворимость, путем выбора наиболее часто встречающегося гидрофильного остатка в каждом гидрофобном участке. В таблице 5 приведены растворимые мутанты, выявленные с использованием данного подхода. Гидрофобность исходных и мутантных остатков рассчитывали как среднюю гидрофобность для величин, опубликованных в нескольких статьях, и выражали как функцию уровня открытости боковой цепи для растворителя.
*Гидрофобный участок в положении 144 заменяли не на наиболее часто встречающийся гидрофильный остаток в базе данных, а на серин, поскольку он уже содержался в CDR донорах ESBA105. | |
Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации АНо. Колонка 2. Домен для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Средняя площадь, доступная для растворителя, рассчитанная из 27 PDB файлов. Колонка 4. Исходные остатки в ESBA105. Колонка 5. Средняя гидрофобность для колонки 4 по выборке из АНо. Колонка 6. Наиболее часто встречающийся гидрофильный остаток в положении, указанном в колонке 1. Средняя гидрофобность для колонки 6 по выборке из АНо/ |
с) Исследование растворимости вариантов ESBA105
Мутации, ответственные за растворимость, вводили по отдельности или во множестве комбинаций и исследовали выход рефолдинга, экспрессию, активность, стабильность и характер агрегации. В таблице 6 показаны различные комбинации мутаций, ответственных за растворимость, введенных в каждый из оптимизированных вариантов ESBA105 на основании потенциального вклада в растворимость и уровня риска, что мутация могла бы изменять связывание с антигеном.
Таблица 6 | |
Конструирование растворимых вариантов для ESBA105 | |
*Исследовано отдельно во втором круге. ** Черта внизу отделяет число мутаций, содержащихся в легкой и тяжелой цепях соответственно. |
|
Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации АНо. Колонка 2. Домен для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Исходный остаток в ESBA105 в различных гидрофобных участках. Колонка 4. Различные варианты, содержащие мутации, ответственные за растворимость, в указанных положениях. |
d) Измерения растворимости
Максимальную растворимость ESBA105 и его вариантов определяли методом ПЭГ-осаждения, как первоначально описано Atha et al. (JBC, 256: 12108-12117 (1981)). В данном способе измеряют концентрацию белка в супернатантах, полученных при центрифугировании смесей ПЭГ-белок, и строят график в логарифмических координатах относительно концентрации ПЭГ. Раствор белка с концентрацией 20 мг/мл смешивали в соотношении 1:1 с растворами ПЭГ, насыщенность которых колебалась от 30 до 50%. Данные условия были выбраны на основании профиля растворимости, наблюдаемого для ESBA105 дикого типа после эмпирического определения линейной зависимости LogS (S=растворимость) относительно концентрации ПЭГ (% вес/об.). Кривые растворимости нескольких примеров вариантов ESBA105, которые проявляли превосходную растворимость, представлены на фиг.1. Полный список значений растворимости также приведен в таблице 7.
Таблица 7 | |
Оцененная максимальная растворимость и активность мутантов по сравнению с исходным ESBA105 | |
е) Измерения термостабильности
Измерения термостабильности для исходного ESBA105 и последующих растворимых вариантов проводили с использованием Фурье-ИКС ATR спектроскопии. Молекулы исследовали термически в широком диапазоне температур (25-95°С). Профиль денатурации получали посредством использования преобразования Фурье для сигналов интерферограммы (см. фиг.2). Профили денатурации использовали для аппроксимации средних точек термических переходов разворачивания (ТМ) для каждого из вариантов ESBA105 с применением сигмоидальной модели Больцмана (таблица 8).
iii. Измерения агрегации
ESBA105 и его растворимые варианты также анализировали во времязависимом тесте для оценки деградации и особенностей агрегации. С этой целью растворимые белки (20 мг/мл) инкубировали при повышенной температуре (40°С) в фосфатном буфере при рН 6,5. Контрольные образцы выдерживали при -80°С. Образцы анализировали после периода инкубации в течение двух недель для оценки деградации (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)) и агрегации (SEC). Это давало возможность отбросить варианты, которые были склонны к деградации (см. фиг.3), или те из них, которые проявляли тенденцию к образованию растворимых или нерастворимых агрегатов (см. таблицу 9)
iv. Экспрессия и рефолдинг растворимых вариантов
Для растворимых мутантов также исследовали экспрессию и выход рефолдинга относительно исходной молекулы ESBA105. Результаты данных исследований представлены в таблице 10.
Хотя все гидрофильные мутанты, ответственные за растворимость, проявляли лучшую растворимость по сравнению с исходной молекулой ESBA105, только некоторые из этих молекул были подходящими с точки зрения других биофизических свойств. Например, многие варианты обладали сниженной термостабильностью и/или выходом рефолдинга относительно исходной молекулы ESBA105. В частности, гидрофильная замена в положении VL147 резко понижала стабильность. Мутации, ответственные за растворимость, которые существенно не влияли на термическую стабильность, соответственно были объединены и подвергнуты дополнительному термическому стрессу для подтверждения их свойств.
Три мутанта, содержащие комбинацию четырех различных мутаций, ответственных за растворимость (Opt1.0, Opt0.2 и VH:V103T), существенно улучшали растворимость ESBA105, не влияя на воспроизводимость методов, активность или термическую стабильность. Однако мутант, имеющий комбинированные мутации Opt1.0 и Opt0.2 в ESBA105 (Opt 1_2), содержал повышенное количество нерастворимых агрегатов после инкубации в течение 2 недель при 40оС (см. таблицу 9). Этот факт может быть объяснен ролью валина (Val) в положении VL15 во вращении бета-складчатой конформации, поскольку Val обладает наибольшей склонностью к бета-складчатой конформации из всех аминокислот. Этот результат показывает, что единственная мутация, ответственная за растворимость в положении VL15, является допустимой, но не в сочетании с растворимыми мутантами, которые разрывают другие гидрофобные участки. Соответственно, мутации, содержащиеся в Opt 0_2 и VH:V103T, были выбраны в качестве лучших исполнителей для улучшения свойств растворимости молекул scFv.
Пример 2. Генерирование scFv, обладающих повышенной растворимостью и стабильностью
Варианты ESBA105, выявленные при конструировании растворимости, были дополнительно оптимизированы путем замещения стабилизирующими мутациями, выявленными в анализе контроля качества (КК). Было создано всего 4 конструкции, которые содержали от 1 до 3 мутаций, ответственных за растворимость, которые были выявлены выше в примере 1, в сочетании со всеми стабилизирующими мутациями, выявленными при КК 7.1 и 15.2 (т.е. D13N и V83E в домене VL и V78A, K43 и F67L в домене VH). Все оптимизированные конструкты давали более растворимый белок, чем scFv дикого типа (см. таблицу 11). Комбинация стабилизирующих и усиливающих растворимость мутаций существенно не влияла ни на активность, ни на стабильность молекул scFv.
Значения растворимости для всех 4 вариантов использовали для деконволюционного анализа вклада каждой мутации в растворимость scFv. Очевидно, что все мутации вносили свой вклад в растворимость scFv аддитивным образом, даже хотя несколько из данных остатков расположены относительно близко друг к другу как в первичной последовательности, так и в трехмерной (3D) структуре. Анализ показал, что комбинация трех усиливающих растворимость мутаций в домене VH (V12S, L144S, V103T (или V103S)) отвечает за ~60% растворимости scFv. Поскольку гидрофобные участки сохраняются в вариабельных доменах всех иммуносвязывающих средств, такую оптимальную комбинацию мутаций можно использовать для улучшения растворимости виртуально любого scFv или молекулы другого иммуносвязывающего средства.
Пример 3. Вариант Epi43max, эффективного связывающего агента для TNFα с оптимизированной растворимостью
В таблице 12 указаны характеристические данные для трех оптимизированных вариантов Epi43max, эффективного связывающего агента для TNF. EP43_maxDHP представляет собой вариант EP43max с увеличенной растворимостью и включает в себя три вышеуказанные мутации, повышающие растворимость (V→S в положении 12 по AHo, V→T в положении 103 по AHo и L→T в положении 144 по AHo). Варианты EP43_maxmin и EP43_minmax были генерированы путем перемещения домена между "min" и "max" привитыми фрагментами. В частности, вариант "minmax" включает минимальную (только CDR-привитой фрагмент) привитую версию легкой цепи и максимальную привитую версию тяжелой цепи (т.е. привитой кроличий CDR плюс остатки кроличьей каркасной области антитела, вовлеченной в связывание с антигеном). Наоборот, вариант "maxmin" включал в себя максимальную привитую версию легкой цепи и минимальную привитую версию тяжелой цепи. Кривые термической денатурации EP43max и его оптимизированных вариантов сравнивали с использованием Фурье-ИКС анализа (см. фиг.4). Было установлено, что Epi43minmax имеет более низкую среднюю точку разворачивания трехмерной структуры, чем Epi43max. Более того, minmax вариант проявлял стадию перехода к разворачиванию, что указывает на то, что оба домена разворачиваются при очень близких температурах.
Таблица 12 | |
Биофизические характеристики для трех оптимизированных вариантов Epi43max, эффективного связывающего агента для TNF | |
Пример 4. Производные VEGF-иммуносвязывающих средств с повышенной растворимостью
Помимо описанных выше TNF-иммуносвязывающих средств (ESBA105 и Epi43max) был проведен инжиниринг нескольких растворимых производных VEGF-иммуносвязывающих средств в соответствии со способами по изобретению. В частности, данные варианты VEGF-иммуносвязывающих средств были сконструированы таким образом, чтобы они имели разорванный гидрофобный участок («DHP») путем выбора следующих остатков: (а) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; (b) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи и с) серин (S) или треонин (Т) в положении 144 последовательности аминокислот тяжелой цепи. Биофизические характеристики данных DHP-вариантов сравнивали с их прототипами дикого типа. Данные характеристики включали температуру плавления или т.пл. (определенную с помощью Bio-ATR), процент потери β-складчатой конформации при 60оС (определенный с помощью AquaSpec), процент потери белка после осаждения при 60°С, растворимость методом осаждения сульфатом аммония, выход рефолдинга при продуцировании и уровни экспрессии в E. coli.
Как указано ниже в таблице 14, растворимость одного из VEGF-иммуносвязывающих средств ((ESBA578minmax FWl.4 DHP) была существенно выше за счет введения DHP-мотива. Более того, другие биофизические свойства (например, термическая стабильность) либо не затрагивались неблагоприятным образом, либо улучшались при введении мотива. Кривые термической стабильности, использованные для определения температуры плавления для 578min-max и его варианта с оптимизированной растворимостью (578min-max_DHP), показаны на фиг.5 и в таблице 13, тогда как кривые осаждения сульфатом аммония, использованные для определения значений растворимости, показаны на фиг.6.
Эквиваленты
Специалистам в данной области будет понятно или они будут способны выяснить с использованием не более чем рутинных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления описанного здесь изобретения. Подразумевается, что следующая формула изобретения охватывает такие эквиваленты.
Claims (13)
1. Одноцепочечное антитело (scFv) для использования в качестве терапевтического средства, содержащее один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация):
(a) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а1) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b1) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(с1) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а2) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b2) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(с2) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.
(a) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а1) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b1) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(с1) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а2) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b2) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(с2) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.
2. Одноцепочечное антитело по п.1, дополнительно содержащее:
(a) аспарагиновую кислоту (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи;
(b) глутаминовую кислоту (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи;
(c) аргинин (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи;
(d) лейцин (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи;
и/или
(e) аланин (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.
(a) аспарагиновую кислоту (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи;
(b) глутаминовую кислоту (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи;
(c) аргинин (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи;
(d) лейцин (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи;
и/или
(e) аланин (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.
3. Способ повышения растворимости одноцепочечного антитела
в нативном состоянии, содержащего вариабельную область (VH) тяжелой цепи или ее фрагмент, включающий:
A) выбор для мутации по меньшей мере трех аминокислотных положений в пределах области VH, и
B) проведение мутации по меньшей мере в трех аминокислотных положениях, выбранных для мутации,
где по меньшей мере три аминокислотных положения выбраны из группы аминокислотных положений тяжелой цепи, состоящей из положений 12, 103 и 144 (в соответствии с правилом нумерации АНо), и проведение мутации включает замещение аминокислоты в выбранном аминокислотном положении на гидрофильную аминокислоту.
в нативном состоянии, содержащего вариабельную область (VH) тяжелой цепи или ее фрагмент, включающий:
A) выбор для мутации по меньшей мере трех аминокислотных положений в пределах области VH, и
B) проведение мутации по меньшей мере в трех аминокислотных положениях, выбранных для мутации,
где по меньшей мере три аминокислотных положения выбраны из группы аминокислотных положений тяжелой цепи, состоящей из положений 12, 103 и 144 (в соответствии с правилом нумерации АНо), и проведение мутации включает замещение аминокислоты в выбранном аминокислотном положении на гидрофильную аминокислоту.
4. Способ по п.3, где гидрофильная аминокислота представляет собой:
(a) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и/или
(c) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.
(a) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и/или
(c) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.
5. Способ по п.3 или 4, где аминокислота в выбранном для мутации аминокислотном положении представляет собой гидрофобную аминокислоту.
6. Способ по п.5, где гидрофобная аминокислота представляет собой лейцин (L) или валин (V).
7. Способ по п.3 или 4, где аминокислота, выбранная для мутации:
(a) аминокислоты в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи представляет собой валин (V);
(b) аминокислоты в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи представляет собой валин (V); и
(c) аминокислоты в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи представляет собой лейцин (L).
(a) аминокислоты в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи представляет собой валин (V);
(b) аминокислоты в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи представляет собой валин (V); и
(c) аминокислоты в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи представляет собой лейцин (L).
8. Способ по п.3 или 4, где мутация не оказывает неблагоприятного влияния на термическую стабильность, рефолдинг, выход экспрессии, агрегацию и/или активность связывания одноцепочечного антитела.
9. Способ по п.3 или 4, где мутация приводит к по меньшей мере 2-кратному увеличению растворимости.
10. Способ по п.3 или 4, где проведение мутации дополнительно включает стадию введения одной или нескольких мутаций в аминокислотном положении (правило нумерации АНо), выбранном из группы, состоящей из
(a) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи;
(b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи;
(c) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи;
(d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи; и
е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.
(a) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи;
(b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи;
(c) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи;
(d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи; и
е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.
11. Одноцепочечное антитело для использования в качестве терапевтического средства, полученное способом по любому из пп.3-10.
12. Одноцепочечное антитело по любому из пп.1, 2 или 11, где одноцепочечное антитело специфически связывается с TNFα человека или VEGF человека.
13. Композиция для использования в терапии, содержащая одноцепочечное антитело по любому из пп.1, 2, 11 или 12 и фармацевтически приемлемый носитель.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US7569208P | 2008-06-25 | 2008-06-25 | |
US61/075,692 | 2008-06-25 | ||
PCT/CH2009/000221 WO2009155725A1 (en) | 2008-06-25 | 2009-06-25 | Solubility optimization of immunobinders |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014104577A Division RU2653441C2 (ru) | 2008-06-25 | 2014-02-10 | Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011102548A RU2011102548A (ru) | 2012-07-27 |
RU2514658C2 true RU2514658C2 (ru) | 2014-04-27 |
Family
ID=41228195
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011102548/10A RU2514658C2 (ru) | 2008-06-25 | 2009-06-25 | Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств |
RU2014104577A RU2653441C2 (ru) | 2008-06-25 | 2014-02-10 | Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств |
RU2018112257A RU2018112257A (ru) | 2008-06-25 | 2018-04-05 | Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014104577A RU2653441C2 (ru) | 2008-06-25 | 2014-02-10 | Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств |
RU2018112257A RU2018112257A (ru) | 2008-06-25 | 2018-04-05 | Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9556265B2 (ru) |
EP (2) | EP3241843B1 (ru) |
JP (3) | JP5745720B2 (ru) |
KR (2) | KR101790567B1 (ru) |
CN (2) | CN102076715B (ru) |
AU (1) | AU2009264566B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0914666A2 (ru) |
CA (1) | CA2728829C (ru) |
CY (2) | CY1119626T1 (ru) |
DK (2) | DK3241843T3 (ru) |
ES (2) | ES2884117T3 (ru) |
HR (2) | HRP20171250T1 (ru) |
HU (2) | HUE034827T2 (ru) |
LT (2) | LT3241843T (ru) |
MX (2) | MX346024B (ru) |
PL (2) | PL3241843T3 (ru) |
PT (2) | PT3241843T (ru) |
RU (3) | RU2514658C2 (ru) |
SI (2) | SI2307455T1 (ru) |
WO (1) | WO2009155725A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201008595B (ru) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102007492B1 (ko) | 2008-06-25 | 2019-08-05 | 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 | 보편적 항체 프레임워크를 사용한 래빗 항체의 인간화 |
HUE039692T2 (hu) | 2008-06-25 | 2019-01-28 | Esbatech Alcon Biomed Res Unit | TNF-et gátló stabil és oldható ellenanyagok |
DK3241843T3 (da) | 2008-06-25 | 2021-09-06 | Novartis Ag | Opløselighedsoptimering af immunbindere |
PL3216803T3 (pl) | 2008-06-25 | 2020-10-19 | Novartis Ag | Stabilne i rozpuszczalne przeciwciała hamujące vegf |
US8399625B1 (en) | 2009-06-25 | 2013-03-19 | ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit, LLC | Acceptor framework for CDR grafting |
AU2014262201B2 (en) * | 2009-12-23 | 2016-09-15 | Novartis Ag | Method for decreasing immunogenicity |
CA2777527C (en) | 2009-12-23 | 2020-06-23 | Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc | Method for decreasing immunogenicity |
AR083495A1 (es) | 2010-10-22 | 2013-02-27 | Esbatech Alcon Biomed Res Unit | Anticuerpos estables y solubles |
JP2014505698A (ja) * | 2011-02-02 | 2014-03-06 | グラクソ グループ リミテッド | 新規抗原結合タンパク質 |
WO2014068132A1 (en) | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Delenex Therapeutics Ag | Binding members to il-1 beta |
EP4001307A1 (en) | 2012-12-17 | 2022-05-25 | Cell Medica Inc. | Antibodies against il-1 beta |
RU2015139095A (ru) * | 2013-02-15 | 2017-03-21 | ИЭсБиЭйТЕК - Э НОВАРТИС КОМПАНИ ЭлЭлСи | Акцепторный каркасный участок для пересадки cdr |
RU2015139890A (ru) * | 2013-02-20 | 2017-03-27 | ИЭсБиЭйТЕК - Э НОВАРТИС КОМПАНИ ЭлЭлСи | Акцепторный каркасный участок для пересадки cdr |
CN107318267B (zh) | 2013-08-12 | 2021-08-17 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于治疗补体相关的病症的组合物和方法 |
KR20160052562A (ko) * | 2013-09-06 | 2016-05-12 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항체 안정성의 개선 방법 |
EA201692109A1 (ru) | 2014-05-01 | 2017-03-31 | Дженентек, Инк. | Варианты антител к фактору d и их применение |
ES2685917T3 (es) * | 2015-10-21 | 2018-10-15 | Trinseo Europe Gmbh | Dienos funcionalizados con aminosilano para el uso en la funcionalización de polímeros elastoméricos |
CN108884164B (zh) | 2016-02-25 | 2022-12-27 | 细胞医学瑞士公司 | 用于免疫疗法的经修饰细胞 |
CN116848136A (zh) | 2021-02-12 | 2023-10-03 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 补体c3抗原结合蛋白 |
EP4304725A1 (en) | 2021-03-09 | 2024-01-17 | CDR-Life AG | Rabbit-derived antigen binding protein nucleic acid libraries |
AU2022233285A1 (en) | 2021-03-09 | 2023-10-19 | Cdr-Life Ag | Mage-a4 peptide-mhc antigen binding proteins |
CA3240046A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Cdr-Life Ag | Dual mhc-targeting t cell engager |
US20240091262A1 (en) | 2022-09-14 | 2024-03-21 | Cdr-Life Ag | Mage-a4 peptide dual t cell engagers |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2317999C2 (ru) * | 2000-02-25 | 2008-02-27 | Те Гавернмент Оф Те Юнайтед Стейтс, Эз Репризентед Бай Те Секретари Оф Те Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисез | SCFV ПРОТИВ EGFRvIII С УЛУЧШЕННОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ И ВЫХОДОМ, ИММУНОТОКСИНЫ НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5824307A (en) | 1991-12-23 | 1998-10-20 | Medimmune, Inc. | Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus |
US5714350A (en) | 1992-03-09 | 1998-02-03 | Protein Design Labs, Inc. | Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region |
EP0752248B1 (en) | 1992-11-13 | 2000-09-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US6740734B1 (en) | 1994-01-14 | 2004-05-25 | Biovitrum Ab | Bacterial receptor structures |
DK0929578T3 (da) | 1996-02-09 | 2003-08-25 | Abbott Lab Bermuda Ltd | Humane antistoffer, der binder human TNFalfa |
DE69726003T2 (de) * | 1996-07-16 | 2004-08-26 | Andreas Plückthun | Immunglobulin-superfamilie domainen und fragmente mit erhöhter löslichkeit |
US6884879B1 (en) | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
JP3614866B2 (ja) | 1997-06-12 | 2005-01-26 | リサーチ コーポレイション テクノロジーズ,インコーポレイティド | 人工抗体ポリペプチド |
DE19742706B4 (de) | 1997-09-26 | 2013-07-25 | Pieris Proteolab Ag | Lipocalinmuteine |
CN1689646A (zh) | 1998-08-11 | 2005-11-02 | 拜奥根Idec公司 | 包括施用抗-cd20抗体的b-细胞淋巴瘤联合疗法 |
US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
SE9901379D0 (sv) | 1999-04-19 | 1999-04-19 | Pharmacia & Upjohn Ab | Receptor structures |
US6602977B1 (en) | 1999-04-19 | 2003-08-05 | Biovitrum Ab | Receptor structures |
ATE273323T1 (de) | 1999-12-28 | 2004-08-15 | Esbatech Ag | INTRAKÖRPER MIT DEFINIERTER STRUKTUR (ßFRAMEWORKß), DIE IN EINER REDUZIERENDEN UMGEBUNG STABIL IST, UND IHRE VERWENDUNGEN |
CA2421447C (en) | 2000-09-08 | 2012-05-08 | Universitat Zurich | Collections of repeat proteins comprising repeat modules |
US20030157561A1 (en) | 2001-11-19 | 2003-08-21 | Kolkman Joost A. | Combinatorial libraries of monomer domains |
US20030082630A1 (en) | 2001-04-26 | 2003-05-01 | Maxygen, Inc. | Combinatorial libraries of monomer domains |
US6905608B2 (en) | 2002-01-22 | 2005-06-14 | Exergy Technologies Corporation | Advanced electrodeionization for fluid recycling |
AU2003238370B2 (en) | 2002-05-22 | 2010-04-29 | Novartis Ag | Immunoglobulin frameworks which demonstrate enhanced stability in the intracellular environment and methods of identifying same |
KR20180132969A (ko) * | 2003-05-30 | 2018-12-12 | 제넨테크, 인크. | 항-vegf 항체를 사용한 치료 |
AU2003264100A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target |
US8039588B2 (en) | 2004-05-21 | 2011-10-18 | The Uab Research Foundation | Variable lymphocyte receptors |
CN102924597A (zh) | 2005-06-07 | 2013-02-13 | 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 | 抑制TNFα的稳定和可溶的抗体 |
SI2046382T1 (sl) | 2006-07-10 | 2016-12-30 | ESBATech an Alcon Biomedical Research Unit LLC | Protitelesa scFv, ki prehajajo epitelijske in/ali endotelijske plasti |
NZ579594A (en) | 2007-03-12 | 2012-03-30 | Esbatech Alcon Biomed Res Unit | Sequence based engineering and optimization of single chain antibodies |
WO2009000099A2 (en) | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Esbatech Ag | Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties |
EP2164961B1 (en) | 2007-06-25 | 2015-01-07 | ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC | Sequence based engineering and optimization of single chain antibodies |
DK3241843T3 (da) | 2008-06-25 | 2021-09-06 | Novartis Ag | Opløselighedsoptimering af immunbindere |
-
2009
- 2009-06-25 DK DK17161990.1T patent/DK3241843T3/da active
- 2009-06-25 HU HUE09768694A patent/HUE034827T2/en unknown
- 2009-06-25 HU HUE17161990A patent/HUE056090T2/hu unknown
- 2009-06-25 DK DK09768694.3T patent/DK2307455T3/en active
- 2009-06-25 US US13/000,460 patent/US9556265B2/en active Active
- 2009-06-25 PL PL17161990T patent/PL3241843T3/pl unknown
- 2009-06-25 RU RU2011102548/10A patent/RU2514658C2/ru active
- 2009-06-25 CN CN200980123815.6A patent/CN102076715B/zh active Active
- 2009-06-25 KR KR1020167017202A patent/KR101790567B1/ko active IP Right Grant
- 2009-06-25 AU AU2009264566A patent/AU2009264566B2/en active Active
- 2009-06-25 JP JP2011515050A patent/JP5745720B2/ja active Active
- 2009-06-25 SI SI200931674A patent/SI2307455T1/sl unknown
- 2009-06-25 EP EP17161990.1A patent/EP3241843B1/en active Active
- 2009-06-25 EP EP09768694.3A patent/EP2307455B1/en not_active Revoked
- 2009-06-25 CA CA2728829A patent/CA2728829C/en active Active
- 2009-06-25 KR KR1020117001959A patent/KR101650165B1/ko active IP Right Grant
- 2009-06-25 ES ES17161990T patent/ES2884117T3/es active Active
- 2009-06-25 PT PT171619901T patent/PT3241843T/pt unknown
- 2009-06-25 CN CN201511018105.0A patent/CN105418763A/zh active Pending
- 2009-06-25 LT LTEP17161990.1T patent/LT3241843T/lt unknown
- 2009-06-25 ES ES09768694.3T patent/ES2629345T3/es active Active
- 2009-06-25 LT LTEP09768694.3T patent/LT2307455T/lt unknown
- 2009-06-25 PT PT97686943T patent/PT2307455T/pt unknown
- 2009-06-25 PL PL09768694T patent/PL2307455T3/pl unknown
- 2009-06-25 WO PCT/CH2009/000221 patent/WO2009155725A1/en active Application Filing
- 2009-06-25 BR BRPI0914666A patent/BRPI0914666A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-06-25 MX MX2013011865A patent/MX346024B/es unknown
- 2009-06-25 SI SI200932137T patent/SI3241843T1/sl unknown
- 2009-06-25 MX MX2011000074A patent/MX2011000074A/es active IP Right Grant
-
2010
- 2010-11-30 ZA ZA2010/08595A patent/ZA201008595B/en unknown
-
2014
- 2014-02-10 RU RU2014104577A patent/RU2653441C2/ru active
- 2014-03-18 JP JP2014054856A patent/JP2014111667A/ja active Pending
-
2016
- 2016-04-06 JP JP2016076318A patent/JP2016128517A/ja active Pending
- 2016-12-14 US US15/378,649 patent/US10221237B2/en active Active
-
2017
- 2017-06-22 CY CY20171100670T patent/CY1119626T1/el unknown
- 2017-08-16 HR HRP20171250TT patent/HRP20171250T1/hr unknown
-
2018
- 2018-04-05 RU RU2018112257A patent/RU2018112257A/ru not_active Application Discontinuation
-
2019
- 2019-02-05 US US16/267,460 patent/US11046757B2/en active Active
-
2021
- 2021-08-25 HR HRP20211356TT patent/HRP20211356T1/hr unknown
- 2021-09-22 CY CY20211100832T patent/CY1124644T1/el unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2317999C2 (ru) * | 2000-02-25 | 2008-02-27 | Те Гавернмент Оф Те Юнайтед Стейтс, Эз Репризентед Бай Те Секретари Оф Те Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисез | SCFV ПРОТИВ EGFRvIII С УЛУЧШЕННОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ И ВЫХОДОМ, ИММУНОТОКСИНЫ НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NIEBA L ET AL: "Disrupting the hydrophobic patches at the antibody variable/constant domain interface: Improved in vivo folding and physical characterization of an engineered scFv fragment" PROTEIN ENGINEERING, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 10, no. 4, 1 January 1997 (1997-01-01), pages 435-444. DAVIES J ET AL: "'Camelising' human antibody fragments: NMR studies on VH domains" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 339, no. 3, 21 February 1994 (1994-02-21), pages 285-290. JUNG S ET AL: "Selection for improved protein stability by phage display" JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 294, no. 1, 19 November 1999 (1999-11-19), pages 163-180. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2653441C2 (ru) | Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств | |
RU2540150C2 (ru) | Способы модификации антител и модифицированные антитела с улучшенными функциональными свойствами | |
JP5506670B2 (ja) | 単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化 | |
JP4845732B2 (ja) | 抗vegf抗体 | |
AU2013203477B2 (en) | Solubility optimization of immunobinders | |
AU2015202499A1 (en) | Solubility optimization of immunobinders |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20220323 |