JP5506670B2 - 単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化 - Google Patents
単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2007年6月25日に出願された"単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化"というタイトルの米国仮出願第60/937,112号に基づく優先権を主張する。本出願は、また、2008年5月12日に出願された"単鎖抗体の配列に基づくエンジニアリング及び最適化"というタイトルの米国仮出願第61/069,057号に基づく優先権を主張する。
抗体は、癌、自己免疫疾患及び他の疾病の処置における非常に有効かつ効果的な治療剤であることが実証されている。全長抗体は、一般に臨床的に使用されているが、一方で、抗体フラグメントの使用によりもたらされうる、高められた組織浸透性、Fc−エフェクター機能が存在しないことと他のエフェクター機能を付与する能力とを兼ね備えること、より短い生体内半減期に由来する全身性副作用の見込みが殆どないことなどの多くの利点がある。抗体フラグメントの薬物動力学的特性は、該フラグメントが、局所的な治療アプローチのために特に良好に適合されうることを示している。更に、抗体フラグメントは、ある一定の発現システムにおいては、全長抗体よりも生産が容易なことがある。
本発明は、安定性及び/又は可溶性について潜在的に問題のあるscFv配列内のアミノ酸残基の割り出しを、配列に基づく分析を使用して可能にする方法を提供する。更に、本発明の方法により割り出されたアミノ酸残基は、突然変異のために選択することができ、かつ突然変異されたエンジニアリングされたscFvを製造し、それを安定性及び/又は可溶性などの改善された機能特性についてスクリーニングすることができる。特に好ましい一実施態様において、本発明は、機能的に選択されたscFvのデータベースを使用して、生殖細胞系の及び/又は成熟の抗体免疫グロブリン配列における相応の位置よりも変動性に許容性が高いか低いかのいずれかのアミノ酸残基位置を割り出す方法を提供し、これにより、斯かる割り出された残基位置は、安定性及び/又は可溶性などのscFv機能性を改善するようにエンジニアリングするために適している可能性があることが示される。このように、本発明は、機能的に選択されたscFv配列のデータベースの使用の使用に基づいて、"機能的コンセンサス"アプローチの利点を提供し、かつ実証している。
a)scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列を、多数の抗体のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列を含むデータベースに入力して、該scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列とデータベースの該抗体のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列とをアラインメントさせることと、
b)scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置と、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸内の相応の位置とを比較することと、
c)該scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを調べることと、
d)該アミノ酸位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸内の相応の位置で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、該scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置を、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出すことと
を含む方法を提供する。
a)データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程;
b)アミノ酸位置の共変ペアと、scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程;
c)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程;及び
d)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、scFv内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む方法を提供する。
e)データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程;
f)アミノ酸位置の共変ペアと、scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程;
g)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程;及び
h)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、scFv内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含むことができる。
e)scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列を分子モデリングに供する工程;及び
f)突然変異のための、scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列内の少なくとも1つの付加的なアミノ酸位置を割り出す工程
を含んでよい。この方法は、更に、分子モデリングによって突然変異のために割り出されたscFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列内の少なくとも1つの付加的なアミノ酸位置を突然変異することを含む。
a)VH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列の第一のデータベースを提供すること;
b)少なくとも1つの所望の機能的特性を有するものとして選択されたscFv抗体のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること;
c)第一のデータベースの各フレームワーク位置と第二のデータベースの各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性を決定すること;
d)アミノ酸の変動性の度合いが第一のデータベースと第二のデータベースとの間で異なる1もしくはそれより多くのフレームワーク位置を割り出すことで、単鎖抗体(scFv)における突然変異のための1もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出すこと
を含む方法を提供する。
a)群分けされたVHもしくはVLのアミノ酸配列(例えばKabatファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び/又は成熟抗体の配列)の第一のデータベースを提供すること;
b)少なくとも1つの所望の機能特性を有するものとして(例えばQCアッセイにより)選択された群分けされたscFv抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること;
c)第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること;
d)該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより高い頻度で第二のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましいアミノ酸残基(すなわち、濃縮された残基)として割り出すこと
を含む方法を提供する。
a)群分けされたVHもしくはVLのアミノ酸配列(例えばKabatファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び/又は成熟抗体の配列)の第一のデータベースを提供すること;
b)少なくとも1つの所望の機能特性を有するものとして(例えばQCアッセイにより)選択された群分けされたscFv抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること;
c)第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること;
d)該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより低い頻度で第二のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましくないアミノ酸残基として割り出すこと(その際、前記のアミノ酸残基の種類は好ましくないアミノ酸残基(すなわち排除された残基)である)
を含む方法を提供する。ある特定の好ましい実施態様においては、好ましくないアミノ酸残基は、濃縮係数(EF)が1未満である場合に割り出される。
a)該イムノバインダー内で突然変異のための1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること;及び
b)突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、
突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が重鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、AHoナンバリングを使用した位置1、6、7、10、12、13、14、19、20、21、45、47、50、55、77、78、82、86、87、89、90、92、95、98、103及び107(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、7、9、11、12、13、18、19、20、38、40、43、48、66、67、71、75、76、78、79、81、82b、84、89及び93)からなる群から選択され、かつ
突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が軽鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、AHoナンバリングを使用した位置1、2、3、4、7、10、11、12、14、18、20、24、46、47、50、53、56、57、74、82、91、92、94、101及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、2、3、4、7、10、11、12、14、18、20、24、38、39、42、45、48、49、58、66、73、74、76、83及び85)からなる群から選択される前記方法を提供する。
a)突然変異のためにイムノバインダー内の1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること;及び
b)突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
(i)AHoナンバリングを使用したVH3のアミノ酸位置1、6、7、89及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、7、78及び89);
(ii)AHoナンバリングを使用したVH1aのアミノ酸位置1、6、12、13、14、19、21、90、92、95及び98(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、11、12、13、18、20、79、81、82b及び84);
(iii)AHoナンバリングを使用したVH1bのアミノ酸位置1、10、12、13、14、20、21、45、47、50、55、77、78、82、86、87及び107(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、9、11、12、13、19、20、38、40、43、48、66、67、71、75、76及び93);
(iv)AHoナンバリングを使用したVκ1のアミノ酸位置1、3、4、24、47、50、57、91及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、3、4、24、39、42、49、73及び85);
(v)AHoナンバリングを使用したVκ3のアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、56、74、94、101及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、48、58、76、83及び85);及び
(vi)AHoナンバリングを使用したVλ1のアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、46、53、82、92及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、38、45、66、74及び85)
からなる群から選択される前記方法を提供する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
イムノバインダーにおける特定の位置での置換のための1もしくはそれより多くのアミノ酸残基を割り出す方法であって:
a)サブタイプにより群分けされたV H 及び/又はV L のアミノ酸配列の第一のデータベースを提供する工程;
b)サブタイプにより群分けされ、かつ少なくとも1つの所望の機能特性を有するものとして選択されたV H 及び/又はV L のアミノ酸配列の第二のデータベースを提供する工程;
c)第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置でのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定する工程;
d)該アミノ酸残基を、(i)該アミノ酸が1より大きい濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のための好ましいアミノ酸残基として割り出し、又は(ii)該アミノ酸残基が1未満の濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置で排除されるべきアミノ酸残基として割り出す工程
を含む前記方法。
(項目2)
項目1に記載の方法において、工程d)のアミノ酸残基が4〜6の濃縮係数を有する前記方法。
(項目3)
項目1又は2に記載の方法において、第一のデータベースが、生殖細胞系のV H 、V L もしくはV H 及びV L のアミノ酸配列を含む前記方法。
(項目4)
項目1から3までのいずれか1項に記載の方法において、第一のデータベースが、生殖細胞系のV H 、V L もしくはV H 及びV L のアミノ酸配列からなる前記方法。
(項目5)
項目1から4までのいずれか1項に記載の方法において、第一のデータベースが、成熟のV H 、V L もしくはV H 及びV L のアミノ酸配列を含む前記方法。
(項目6)
項目1から5までのいずれか1項に記載の方法において、第一のデータベースが、成熟のV H 、V L もしくはV H 及びV L のアミノ酸配列からなる前記方法。
(項目7)
項目5又は6に記載の方法において、成熟のV H 、V L もしくはV H 及びV L のアミノ酸配列が、Kabatデータベース(KDB)からの配列である前記方法。
(項目8)
項目1から7までのいずれか1項に記載の方法において、第二のデータベースが、QCアッセイから選択されたscFv抗体のV H 、V L もしくはV H 及びV L のアミノ酸配列を含む前記方法。
(項目9)
項目1から7までのいずれか1項に記載の方法において、第二のデータベースが、QCアッセイから選択されたscFv抗体のV H 、V L もしくはV H 及びV L のアミノ酸配列からなる前記方法。
(項目10)
V H 及び/又はV L のアミノ酸配列を有するイムノバインダーを改善する方法であって:
a)突然変異のための1もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す工程;
b)工程a)で割り出されたそれぞれの特定のフレームワーク位置について、置換のために好ましいアミノ酸残基を割り出す工程;及び
c)それぞれの特定のフレームワーク位置のアミノ酸残基を、工程b)で割り出された好ましいアミノ酸残基へと突然変異させる工程
を含む前記方法。
(項目11)
項目10に記載の方法において、工程a)を、所定のフレームワーク位置での変動性の度合いを決定することによって実施する前記方法。
(項目12)
項目10又は11に記載の方法において、工程a)を、保存の度合いをシンプソンの指数を使用して各フレームワーク位置に割り当てることによって実施する前記方法。
(項目13)
項目10から12までのいずれか1項に記載の方法において、工程b)の好ましいアミノ酸残基を、項目1から9までのいずれか1項に記載の方法により割り出す前記方法。
(項目14)
重鎖可変領域もしくはそのフラグメント及び/又は軽鎖可変領域もしくはそのフラグメントを含むイムノバインダーの機能特性を改善するための方法であって:
a)該イムノバインダー内で突然変異のための1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること;及び
b)突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、
突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が重鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、AHoナンバリングを使用した位置1、6、7、10、12、13、14、19、20、21、45、47、50、55、77、78、82、86、87、89、90、92、95、98、103及び107(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、7、9、11、12、13、18、19、20、38、40、43、48、66、67、71、75、76、78、79、81、82b、84、89及び93)からなる群から選択され、かつ
突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が軽鎖アミノ酸位置である場合に、前記のアミノ酸位置は、AHoナンバリングを使用した位置1、2、3、4、7、10、11、12、14、18、20、24、46、47、50、53、56、57、74、82、91、92、94、101及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、2、3、4、7、10、11、12、14、18、20、24、38、39、42、45、48、49、58、66、73、74、76、83及び85)からなる群から選択される前記方法。
(項目15)
項目14に記載の方法において、イムノバインダーが、VH3重鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、AHoナンバリングを使用したVH3のアミノ酸位置1、6、7、89及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、7、78及び89)からなる群から選択される前記方法。
(項目16)
項目14に記載の方法において、イムノバインダーがVH1a重鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、AHoナンバリングを使用したVH1aのアミノ酸位置1、6、12、13、14、19、21、90、92、95及び98(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、11、12、13、18、20、79、81、82b及び84)からなる群から選択される前記方法。
(項目17)
項目14に記載の方法において、イムノバインダーがVH1b重鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、AHoナンバリングを使用したVH1bのアミノ酸位置1、10、12、13、14、20、21、45、47、50、55、77、78、82、86、87及び107(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、9、11、12、13、19、20、38、40、43、48、66、67、71、75、76及び93)からなる群から選択される前記方法。
(項目18)
項目14に記載の方法において、イムノバインダーがVκ1軽鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、AHoナンバリングを使用したVκ1のアミノ酸位置1、3、4、24、47、50、57、91及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、3、4、24、39、42、49、73及び85)からなる群から選択される前記方法。
(項目19)
項目14に記載の方法において、イムノバインダーがVκ3軽鎖可変領域を含み、かつ突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、AHoナンバリングを使用したVκ3のアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、56、74、94、101及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、48、58、76、83及び85)からなる群から選択される前記方法。
(項目20)
項目14に記載の方法において、突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置が、AHoナンバリングを使用したVλ1のアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、46、53、82、92及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、38、45、66、74及び85)からなる群から選択される前記方法。
(項目21)
項目14から20までのいずれか1項に記載の方法において、突然変異が、更に、AHoナンバリングを使用したアミノ酸位置12、13及び144(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置12、85及び103)からなる群から選択される重鎖アミノ酸位置の1もしくはそれより多くの(好ましくは全ての)鎖置換を含む前記方法。
(項目22)
項目14から21までのいずれか1項に記載の方法において、突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、QCアッセイから選択された抗体配列における相応のアミノ酸位置で見出されたアミノ酸残基へと突然変異させる前記方法。
(項目23)
項目14から22までのいずれか1項に記載の方法において、突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、項目1から9までのいずれか1項に記載の方法により割り出されるアミノ酸残基へと突然変異させる前記方法。
(項目24)
項目1から23までのいずれか1項に記載の方法において、イムノバインダーが、scFv抗体、全長免疫グロブリン、Fabフラグメント、Dabもしくはナノボディーである前記方法。
(項目25)
項目1から9又は項目14から24までのいずれか1項に記載の方法において、機能特性が、改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の改善、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の2もしくはそれより多くの組み合わせである前記方法。
(項目26)
項目25に記載の方法において、発現の改善が原核細胞において確認される前記方法。
(項目27)
項目1から9及び25から26までのいずれか1項に記載の方法において、機能特性が抗原結合親和性における改善ではないことを条件とする前記方法。
(項目28)
項目1から27までのいずれか1項に記載の方法により製造されたイムノバインダー。
(項目29)
項目28に記載のイムノバインダーと、製剤学的に認容性の担体とを含む組成物。
図1は、本発明の方法によるscFvの一般的な配列に基づく分析の概要を示すフローチャート図である。
本発明は、安定性、可溶性及び親和性を制限されることなく含む、イムノバインダーの特性、特にscFvの特性を、配列に基づきエンジニアリングして、最適化するための方法に関する。より具体的には、本発明は、突然変異させることで、scFvの1もしくはそれより多くの物理的特性が改善されるscFv内のアミノ酸位置を割り出す抗体配列分析を用いてscFv抗体を最適化するための方法を開示している。本発明は、また、本発明の方法により製造された、エンジニアリングされたイムノバインダー、例えばscFvに関する。
本発明は、突然変異について選択されるscFv配列内でのアミノ酸位置の割り出しを可能にするscFv配列の分析のための方法を提供する。突然変異について選択されたアミノ酸位置は、scFvの機能特性、例えば可溶性、安定性及び/又は抗原結合性に影響することが予測されるものであって、その際、斯かる位置での突然変異が、scFvの性能を改善すると予測されるものである。このように、本発明は、scFv配列内でアミノ酸位置を単純に無作為に突然変異するよりも焦点が絞られたscFvのエンジニアリングをして性能を最適化することができる。
a)scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列を、多数の抗体のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列を含むデータベースに入力して、該scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列とデータベースの該抗体のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列とをアラインメントさせることと、
b)scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置と、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸内の相応の位置とを比較することと、
c)該scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置で保存されているアミノ酸残基によって占められているかどうかを調べることと、
d)該アミノ酸位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸内の相応の位置で保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、該scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置を、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出すことと
を含む方法に関する。
・ Kabatデータベース(.immuno.bme.nwu.Edu(2007年10月現在);Johnson&Wu(2001年)Nucleic Acids Res.29:205−206;Johnson&Wu(2000年)Nucleic Acids Res.28:214−218)。2000年からの生データは、米国のFTPによって入手でき、かつ英国にミラーリングされている。
本発明は、また、データベース内の抗体の配列と比較した場合の、scFvの配列内での共分散を分析するための方法に関する。共変する残基は、例えば(i)フレームワーク領域(FR)中の残基及びCDR中の残基;(ii)あるCDR中の残基及び別のCDR中の残基;(iii)あるFR中の残基及び別のFR中の残基;又は(iv)VH中の残基及びVL中の残基であってよい。抗体の三次構造で互いに相互作用する残基は、好ましいアミノ酸残基が、共変ペアの両方の位置で保存されうるように共変することができ、一方の残基が変化したら他方の残基も抗体構造の位置のために同様に変化せねばならない。一組のアミノ酸配列における共分散分析の実施方法は当業者に公知である。例えば、Choulier,L他(2000年)Protein 41:475−484は、ヒト及びマウスの生殖細胞系のVL及びVHの配列アラインメントに共分散分析を適用することを記載している。
e)データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程;
f)アミノ酸位置の共変ペアと、scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程;
g)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程;及び
h)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、scFv内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む。
a)データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列に対して共分散分析を行って、アミノ酸位置の共変ペアを割り出す工程;
b)アミノ酸位置の共変ペアと、scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置とを比較する工程;
c)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されるアミノ酸残基によって占められているかどうかを決定する工程;及び
d)前記のscFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内の相応の位置の一方もしくは両方を、scFv内の相応の位置の一方もしくは両方が、データベースの抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列内のアミノ酸位置の共変ペアで保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合に、突然変異のためのアミノ酸位置として割り出す工程
を含む方法を提供する。
潜在的に問題のある残基についてscFvを分析するための本発明の配列に基づく方法は、抗体の構造/機能の関連性を分析するための当業者に公知の他の方法と組み合わせることができる。例えば、好ましい一実施態様においては、本発明の配列に基づく分析方法は、付加的な潜在的に問題のある残基を割り出すために分子モデリングと組み合わされる。scFvを含む抗体構造のコンピュータモデリングのための方法とソフトウェアは、当該技術分野で確立されており、かつ本発明の配列に基づく方法と組み合わせることができる。このように、もう一つの実施態様においては、工程a)〜d)で示される残基の配列に基づく方法は、更に、以下の工程:
e)scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列を分子モデリングに供する工程;及び
f)突然変異のための、scFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列内の少なくとも1つの付加的なアミノ酸位置を割り出す工程
を含む。該方法は、更に、分子モデリングによって突然変異のために割り出されたscFvのVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列内の少なくとも1つの付加的なアミノ酸位置を突然変異することを含む。
特に好ましい一実施態様において、1もしくはそれより多くのフレームワーク位置での変動性の度合いは、抗体の配列の第一のデータベース(例えば生殖細胞系データベース、例えばVbase及び/又はIMGT)もしくは成熟抗体データベース(例えばKBD)と、1もしくはそれより多くの所望の特性を有するものとして選択されたscFvの第二のデータベース、例えば酵母でのQCスクリーニングにより選択されたscFvのデータベース、すなわちQCデータベースとの間で比較される。図5で図説されるように、変動性値(例えばシンプソンの指数値)を、第一の(例えば生殖細胞系)データベース内のフレームワーク位置に割り当てることができ、それは図5では"G"値と呼ばれ、かつ変動性値(例えばシンプソンの指数値)を、第二のデータベース(例えばQCデータベース)内の相応のフレームワーク位置に割り当てることができ、それは図5では"Q"値として呼ばれる。G値が特定の位置でQ値よりも大きい場合に(すなわち、生殖細胞系配列においてその位置で選択されたscFvの配列におけるよりも変動性が高い場合に)、これは、その位置には制限された数の安定なscFvフレームワークアミノ酸残基が存在することを示しており、その安定なscFvフレームワークアミノ酸残基は、任意のCDRで使用するために好適なことがある。選択的に、G値が特定の位置でQ値よりも小さい場合に(すなわち、選択されたscFvの配列においてその位置で生殖細胞系配列におけるよりも変動性が高い場合に)、これは、その特定の位置がscFvにおいて変動性の許容性が高いことを示し、こうしてその位置は、アミノ酸置換によってscFvの安定性及び/又は可溶性が最適化されうる位置を表すことがある。表Aは、アミノ酸位置の番号と、高度に変動性のフレームワーク残基(hvFR)であってGがQより大きいかGがQより小さいかのいずれかである残基のまとめ表である。表Aに示されるように、アミノ酸の全番号(Aa#)における変動性と、高度に変動性のフレームワーク残基(hvFR)における変動性は、生殖細胞系とQC−FWとの間で大きく高まった。表Aの作製のために分析された配列は、QCアッセイ(WO03097697号に記載される;ここでは"Q"として呼称される)を使用して選択された約90のscFvの配列と、2007年10月にhttp://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/index.htmlから検索された全ての生殖細胞系のVH及びVLの配列であった。表Aの分析のためには、VH及びVLのドメインは、そのサブタイプによって群分けしなかった。
a)VH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列(例えば生殖細胞系及び/又は成熟の抗体の配列)の第一のデータベースを提供すること;
b)少なくとも1つの所望の機能的特性を有するものとして選択されたscFv抗体のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること;
c)第一のデータベースの各フレームワーク位置と第二のデータベースの各フレームワーク位置でのアミノ酸変動性を決定すること;
d)アミノ酸の変動性の度合いが第一のデータベースと第二のデータベースとの間で異なる1もしくはそれより多くのフレームワーク位置を割り出すことで、単鎖抗体(scFv)における突然変異のための1もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出すこと
を含む方法を提供する。
もう一つの態様においては、本発明は、(例えば安定性及び/又は可溶性などの機能特性を改善するために)イムノバインダー内の関連のフレームワーク位置で好ましいアミノ酸残基置換を選択するための(又は選択的に、特定のアミノ酸置換を排除するための)方法を提供する。本発明の方法は、抗体配列の第一のデータベース(例えばVbase及び/又はIMGTなどの生殖細胞系データベースもしくは、より好ましくはKabatデータベース(KBD)などの成熟抗体データベース)における関連のフレームワーク位置でのアミノ酸残基の頻度と、1もしくはそれより多くの所望の特性を有するものとして選択されたscFvの第二のデータベース、例えば酵母におけるQCスクリーニングによって選択されたscFvのデータベース、すなわちQCデータベースにおける相応のアミノ酸位置でのアミノ酸残基の頻度とを比較する。
a)群分けされたVH及び/又はVLのアミノ酸配列(例えばKabatファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び/又は成熟抗体の配列)の第一のデータベースを提供すること;
b)少なくとも1つの所望の機能特性を有するものとして(例えばQCアッセイにより)選択された群分けされたscFv抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること;
c)第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること;
d)該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより高い頻度で第二のデータベースに出現する場合に(すなわち、濃縮された残基)、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましいアミノ酸残基として割り出すこと
を含む方法を提供する。
a)群分けされたVH及び/又はVLのアミノ酸配列(例えばKabatファミリーサブタイプにより群分けされた生殖細胞系及び/又は成熟抗体の配列)の第一のデータベースを提供すること;
b)少なくとも1つの所望の機能特性を有するものとして(例えばQCアッセイにより)選択された群分けされたscFv抗体のVHもしくはVLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供すること;
c)第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置とでのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定すること;
d)該アミノ酸を、そのアミノ酸残基が第一のデータベースに対してより低い頻度で第二のデータベースに出現する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のために好ましくないアミノ酸残基として割り出すこと(その際、前記のアミノ酸残基の種類は好ましくないアミノ酸残基(すなわち排除された残基)である)
を含む方法を提供する。
a)突然変異のための1もしくはそれより多くのフレームワークアミノ酸位置を割り出す工程;
b)工程a)で割り出されたそれぞれの特定のフレームワーク位置について、置換のために好ましいアミノ酸残基を割り出す工程;及び
c)それぞれの特定のフレームワーク位置のアミノ酸残基を、工程b)で割り出された好ましいアミノ酸残基へと突然変異させる工程
を含む方法を提供する。好ましくは、工程a)は、所定のフレームワーク位置での変動性の度合いを、本願に開示される方法に従って決定することによって、すなわち保存の度合いをシンプソンの指数を使用してそれぞれのフレームワーク位置に割り当てることによって実施される。置換に適したアミノ酸は、好ましくは、前記に開示された方法に従って割り出される。それは、少なくとも1の濃縮係数、より好ましくは少なくとも4〜6の濃縮係数を有する。イムノバインダーの相応のアミノ酸残基を次いで、当該技術分野で公知の分子生物学的方法を使用して好ましいアミノ酸残基に突然変異させる。該イムノバインダーは、好ましくはscFv抗体、全長免疫グロブリン、Fabフラグメント、Dabもしくはナノボディーである。
本発明の方法において、scFv内の1もしくはそれより多くのアミノ酸位置がscFvの機能特性に関して潜在的に問題があるものと割り出された場合に、該方法は、更に、これらの1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を、scFvのVHもしくはVLのアミノ酸配列内で突然変異することを含むことができる。例えば、突然変異について割り出されたアミノ酸位置は、データベースの抗体のVHもしくはVL内の相応の位置で保存もしくは濃縮されているアミノ酸残基で置換することができる。
scFv抗体中の可溶性について潜在的に問題のある残基は、scFv中の溶媒曝露される疎水性アミノ酸を含むが、それは、全長抗体の場合には、可変ドメインと定常ドメインとの間のインターフェースで覆い隠されている。定常ドメインを欠くエンジニアリングされたscFvにおいては、可変ドメインと定常ドメインとの間の相互作用に関与する疎水性残基は、溶媒曝露されることとなる(例えばNieba他(1997年)Protein Eng.10:435−44を参照)。scFvの表面上のこれらの残基は、凝集を生ずるので、可溶性の問題を引き起こす傾向にある。
単鎖抗体フラグメントは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを共有結合で連結するペプチドリンカーを含む。斯かるリンカーは可変ドメインがばらばらになることを回避するのに効果的であり、それによりscFvはFvフラグメントより優れたものとなるが、scFvフラグメントは、依然として、Fabフラグメント又は全長抗体(その両者において、VH及びVLは、定常ドメインを介して間接的に結合されているにすぎない)と比較してよりアンフォールディング及び凝集の傾向にある。
本発明のもう一つの態様は、本発明の方法により製造されたscFv組成物に関する。このように、本発明は、エンジニアリングされたscFv組成物であって、関連の当初のscFvと比較して1もしくはそれより多くの突然変異が導入されている組成物を提供し、その際、前記突然変異は、1もしくはそれより多くの生物学的特性、例えば安定性もしくは可溶性に影響することが予測される位置、特に1もしくはそれより多くのフレームワーク位置に導入される。一実施態様においては、scFvは、1つの突然変異されたアミノ酸位置(例えば、1つのフレームワーク位置)を含むようにエンジニアリングされている。他の実施態様においては、scFvは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10つもしくは10つより多くの突然変異されたアミノ酸位置(例えば、フレームワーク位置)を含むようにエンジニアリングされている。
実施例2及び3で詳細に説明されるように、本願に記載される"機能的コンセンサス"アプローチは、改善された特性について選択されたscFv配列のデータベースを使用してフレームワーク位置の変動性を分析するものであるが、それは、生殖細胞系データベース及び/又は成熟抗体データベースにおける同じ位置での変動性と比較することで、変動性に許容性が高いか低いかのいずれかであるアミノ酸位置の割り出しを可能にする。実施例5及び6で詳細に説明されるように、サンプルのscFv内のある特定のアミノ酸位置を生殖細胞系のコンセンサス残基に逆突然変異させることで、中性のもしくは有害な作用が奏され、その一方で、"機能的コンセンサス"を含むscFv変異体は、野生型のscFv分子と比較して高められた熱安定性を示す。従って、ここで機能的コンセンサスアプローチを通じて割り出されたフレームワーク位置は、scFvの機能特性を変更する、好ましくは改善するための、scFv改変のための好ましい位置である。本願で使用される場合に、用語"機能特性"とは、例えば改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の改善、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の2もしくはそれより多くの組み合わせを指す。好ましくは、scFvの機能特性の改善は、抗原結合親和性の改善を含まない。
VH3:アミノ酸位置1、6、7、89及び103;
VH1a:アミノ酸位置1、6、12、13、14、19、21、90、92、95及び98;
VH1b:アミノ酸位置1、10、12、13、14、20、21、45、47、50、55、77、78、82、86、87及び107;
Vκ1:アミノ酸位置1、3、4、24、47、50、57、91及び103;
Vκ3:アミノ酸位置2、3、10、12、18、20、56、74、94、101及び103;並びに
Vλ1:アミノ酸位置1、2、4、7、11、14、46、53、82、92及び103。
a)突然変異のためにイムノバインダー内の1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること;及び
b)突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
(i)AHoナンバリングを使用したVH3のアミノ酸位置1、6、7、89及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、7、78及び89);
(ii)AHoナンバリングを使用したVH1aのアミノ酸位置1、6、12、13、14、19、21、90、92、95及び98(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、6、11、12、13、18、20、79、81、82b及び84);
(iii)AHoナンバリングを使用したVH1bのアミノ酸位置1、10、12、13、14、20、21、45、47、50、55、77、78、82、86、87及び107(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、9、11、12、13、19、20、38、40、43、48、66、67、71、75、76及び93);
(iv)AHoナンバリングを使用したVκ1のアミノ酸位置1、3、4、24、47、50、57、91及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、3、4、24、39、42、49、73及び85);
(v)AHoナンバリングを使用したVκ3のアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、56、74、94、101及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、48、58、76、83及び85);及び
(vi)AHoナンバリングを使用したVλ1のアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、46、53、82、92及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、38、45、66、74及び85)
からなる群から選択される前記方法を提供する。
a)突然変異のためにイムノバインダー内の1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること;及び
b)突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
(i)AHoナンバリングを使用したVH3のアミノ酸位置1、89及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、78及び89);
(ii)AHoナンバリングを使用したVH1aのアミノ酸位置1、12、13、14、19、21、90、92、95及び98(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、11、12、13、18、20、79、81、82b及び84);
(iii)AHoナンバリングを使用したVH1bのアミノ酸位置1、10、12、13、14、20、21、45、47、50、55、77、78、82、86、87及び107(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、9、11、12、13、19、20、38、40、43、48、66、67、71、75、76及び93);
(iv)AHoナンバリングを使用したVκ1のアミノ酸位置1、3、4、24、47、50、57及び91(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、3、4、24、39、42、49及び73);
(v)AHoナンバリングを使用したVκ3のアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、56、74、94及び101(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、48、58、76及び83);及び
(vi)AHoナンバリングを使用したVλ1のアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、46、53、82及び92(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、38、45、66及び74)
からなる群から選択される前記方法を提供する。
a)突然変異のためにイムノバインダー内の1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を選択すること;及び
b)突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置を突然変異させること
を含み、その際、前記突然変異のために選択された1もしくはそれより多くのアミノ酸位置は、
(i)AHoナンバリングを使用したVH3のアミノ酸位置1及び103(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1及び89);
(ii)AHoナンバリングを使用したVH1aのアミノ酸位置1、12、13、14、19、21、90、95及び98(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、11、12、13、18、20、79、82b及び84);
(iii)AHoナンバリングを使用したVH1bのアミノ酸位置1、10、12、13、14、20、21、45、47、50、55及び77(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、9、11、12、13、19、20、38、40、43、48及び66);
(iv)AHoナンバリングを使用したVκ1のアミノ酸位置1及び3(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1及び3);
(v)AHoナンバリングを使用したVκ3のアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、94及び101(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置2、3、10、12、18、20、76及び83);及び
(vi)AHoナンバリングを使用したVλ1のアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、82及び92(Kabatナンバリングを使用したアミノ酸位置1、2、4、7、11、14、66及び74)
からなる群から選択される前記方法を提供する。
本発明は、また、米国仮特許出願第60/905,365の添付(A−C)及び米国仮特許出願第60/937,112の添付(A−I)に示される方法論、参考資料及び/又は組成物のいずれをも含むが、それらに制限されないが、割り出されるデータベース、バイオインフォマティクス、インシリコデータ操作及び解釈方法、機能的アッセイ、好ましい配列、好ましい残基の位置/変更、フレームワークの割り出しと選択、フレームワークの変更、CDRアラインメント及び統合並びに好ましい変更/突然変異を含むと解される。
この例では、抗体重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基位置を特定するために使用される2つの異なるナンバリングシステムに関する変換表を提供する。Kabatナンバリングシステムは、更にKabat他(Kabat,E.A.他(1991年)Sequences of Proteins of lmmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242)に説明されている。AHoナンバリングシステムは、更にHonegger,A及びPlueckthun,A(2001年)J.Mol.Biol.309:657−670で更に説明されている。
この例においては、scFv配列の配列に基づく分析を詳細に説明する。分析方法をまとめたフローチャートを図1に示す。
ヒトの成熟抗体及び生殖細胞系の可変ドメインの配列を、種々のデータベースから収集し、カスタマイズされたデータベースに一文字コードのアミノ酸配列として入力した。抗体配列を、Needleman−Wunsch配列アラインメントアルゴリズム(Needleman他,J Mol Biol.,48(3):443−53(1970))のEXCEL実装を使用してアラインメントした。該データベースを、次いで、後続の分析と比較を容易にするために、以下のように、4つのアレイ(当初のデータソースにより)に細分した:
VBase: ヒト生殖細胞系配列
IMGT: ヒト生殖細胞系配列
KDBデータベース: 成熟抗体
QCデータベース: クオリティー・コントロールスクリーニングによって選択された選択scFvフレームワークを含むESBATechの内部データベース
QCスクリーニングシステムと、それから選択される望ましい機能特性を有するscFvフレームワーク配列は、更に、例えばPCT公報WO 2001/48017号;米国出願第20010024831号;US20030096306号;米国特許第7,258,985号及び同第7,258,986号;PCT公報WO2003/097697号及び米国出願第20060035320号に記載されている。
抗体配列を、別個のファミリーへと、配列ホモロジーに基づく分類法に従って抗体をクラスタ化することによって分類した(Tomlinson,I.M.他(1992年)J.Mol.Biol.227:776−798;Williams,S.C.及びWinter.G.(1993年)Eur.J.Immunol.23:1456−1461);Cox,J.P.他(1994年)Eur.J.Immunol.24:827−836)。ファミリーコンセンサスに対するホモロジーのパーセンテージを、70%の類似性に制約した。示された配列が2もしくはそれより多くの種々の生殖細胞系ファミリーの間で不一致であるか、もしくはホモロジーのパーセンテージが70%(任意のファミリーに対して)未満であった場合に、最も近い生殖細胞系のカウンターパートを決定し、CDR長さ、カノニカルなクラス及び定義しているサブタイプ残基を詳細に分析して、該ファミリーを正しく割り当てた。
ファミリークラスタが定義されたら、"クオリティー・コントロール("QC")スクリーニング"(斯かるQCスクリーニングはPCT公報WO2003/097697号に詳細に説明される)において割り出されたヒットについて統計的分析を実施した。分析は、該分析のために最小の数の配列が必要とされるので、最も代表的なファミリー(VH3、VH1a、VH1b、Vκ1、Vκ3及びVλ1)について可能であるに過ぎなかった。各位置iについての残基頻度fi(r)を、特定の残基型がデータセット内で確認された回数を配列の全数で除算することによって計算した。位置的エントロピーN(i)を、全ての位置の変動性の尺度として(Shenkin,P.S.他(1991年)Proteins 11:297−313;Larson,S.M.及びDavidson,A.R.(2000年)Protein Sci.9:2170−2180;Demarest,S.J.他(2004)J.Mol.Biol.335:41−48)、単純な豊富さよりもより多くのアミノ酸組成についての情報を提供するシステムにおける多様性の数学的尺度であるシンプソンの指数を用いて計算した。各位置iについての多様性の度合いを、存在する異なるアミノ酸の数と、各残基の相対存在度を考慮して計算した。
例2で上述した配列に基づくscFv分析アプローチを使用して、3種の重鎖可変領域ファミリー(VH3、VH1a及びVH1b)及び3種の軽鎖可変領域ファミリー(Vκ1、Vκ3及びVλ1)を分析して、変動許容性のアミノ酸位置を割り出した。特に、シンプソンの指数を使用して計算された多様性の度合いを、前記のVbase、IMGT、KDB及びQC(選択されたscFv)の4種のデータベース内の配列についての各アミノ酸位置について決定した。変動許容性のアミノ酸位置と普通でない残基のアミノ酸位置を、Vbase及びIMGTの生殖細胞系データベースについてのこれらの位置でのシンプソンの指数値における、QCの選択されたscFvデータベースと比較した差異に基づき割り出した。付加的に、関連の割り出された位置について、生殖細胞系コンセンサス残基を割り出し、そのコンセンサス残基のQC及びKDBのデータベースにおける頻度を決定した。
scFvの機能特性(例えば安定性及び/又は可溶性)を改善することが知られる特定のアミノ酸位置での好ましいアミノ酸残基を選択(又は選択的にアミノ酸残基を排除)するために、成熟抗体配列のKabat配列からのVH配列とVL配列とを、そのファミリーサブタイプ(例えばVH1b、VH3など)によって群分けした。配列の各サブファミリー内で、各アミノ酸位置での各アミノ酸残基の頻度を、1群のサブタイプの分析された全ての配列のパーセンテージとして決定した。いわゆるQCシステムによって増大された安定性及び/又は可溶性について予め選択された抗体からなるQCデータベースの配列全てについても同じことを行った。各サブタイプに関して、Kabat配列及びQC配列について得られた各アミノ酸残基について得られたパーセンテージ(相対頻度)を、それぞれの相応の位置で比較した。ある特定のアミノ酸残基の相対頻度がQCデータベースにおいてKabatデータベースと比較して高まった場合に、そのそれぞれの残基を、所定の位置でのscFvの安定性及び/又は可溶性を改善するために好ましい残基と見なした。その反対に、ある特定のアミノ酸残基の相対頻度が、QCデータベースにおいてKabatデータベースと比較して低下した場合に、そのそれぞれの残基を、その位置でのscFv形式の状況で好ましくないものと見なした。
この例では、2つの異なるアプローチによって製造されたscFv変異体の安定性を比較した。親のscFv抗体は、今までに記載されていた(例えばPCT公報WO2006/131013号及びWO2008/006235号を参照)ESBA105であった。1セットのESBA105変異体は、クオリティー・コントロール酵母スクリーニングシステムを用いて選択した("QC変異体")。その変異体も、今までに記載されていた(例えばPCT公報WO2006/131013号及びWO2008/006235号を参照)。他の変異体のセットは、ある特定のアミノ酸位置を、前記の例2及び3で記載された配列分析によって割り出された好ましい生殖細胞系コンセンサス配列へと逆突然変異させることによって製造した。その逆突然変異は、アミノ酸配列内で、生殖細胞系配列で保存されているが、選択されたscFvにおいて普通でないもしくは低い頻度のアミノ酸を含む位置について調査することによって選択した(生殖細胞系コンセンサスエンジニアリングアプローチと呼ぶ)。
この例では、ESBA105と異なる結合特異性を有するscFv抗体の生殖細胞系コンセンサス変異体(ESBA212)の安定性を比較した。全てのESBA212変異体は、ある特定のアミノ酸位置を、前記の例2及び3で記載された配列分析によって割り出された好ましい生殖細胞系コンセンサス配列へと逆突然変異させることによって製造した。その逆突然変異は、アミノ酸配列内で、生殖細胞系配列で保存されているが、選択されたscFvにおいて普通でないもしくは低い頻度のアミノ酸を含む位置について調査することによって選択した(生殖細胞系コンセンサスエンジニアリングアプローチと呼ぶ)。図5と同様に、全ての変異体を、安定性について、該分子を熱誘発ストレスにかけることによって試験した。
この例においては、構造モデリングと配列分析に基づくアプローチを使用して、改善された可溶性をもたらすscFvフレームワーク領域における突然変異を割り出した。
ESBA105 scFvの3D構造を、ExPASyウェブサーバを介してアクセス可能な、自動化されたタンパク質構造ホモロジーモデリングサーバを用いてモデリングした。その構造を、相対的な溶媒到達可能表面(rSAS)により分析し、残基を以下のように分類した:(1)rSAS≧50%を示す残基については曝露;及び(2)50≦rSAS≧25%を有する残基については部分曝露。rSAS≧25%を有する疎水性残基は、疎水性パッチとして見なされた。見出された各疎水性パッチの溶媒到達可能領域を確認するために、ESBA105に対する高いホモロジーと、2.7Åより高い解像度とを有する27のPDBファイルから計算を行った。その平均rSAS及び標準偏差を、それらの疎水性パッチについて計算し、そのそれぞれについて詳細に調査した(第13表を参照)。
122個のVL配列と137個のVH配列の全体は、Annemarie Honeggerの抗体ウェブページ(www.bioc.uzh.ch/antibody)から検索した。それらの配列は、本来、タンパク質データバンク(PDB)(www.rcsb.org/pdb/home/home.do)から抽出されたFvもしくはFabの形式の393個の抗体構造と一致していた。それらの配列は、分析のために、種もしくは亜群にもかかわらず、本来の残基よりも高い親水性を有する代替アミノ酸を見出す確率を高めるために使用した。データベース内の任意の他の配列と95%より高い同一性を有する配列は、偏りを減らすために排除した。それらの配列をアラインメントさせ、残基頻度について分析した。配列分析ツールとアルゴリズムを適用し、ESBA105における疎水性パッチを撹乱する親水性突然変異を割り出して選択した。それらの配列を、免疫グロブリン可変ドメイン(Honegger及びPlueckthun 2001年)に関してAHoナンバリングシステムに従ってアラインメントさせた。その分析は、フレームワーク領域に限定された。
可溶性突然変異を、単独で又は多重の組み合わせで導入し、そして再フォールディング率、発現、活性及び安定性並びに凝集パターンについて試験した。第16表は、可溶性への潜在的な寄与と、突然変異が抗原結合を変更する危険性のレベルとに基づいて最適化された各ESBA105変異体に導入される可溶性突然変異の様々な組合せを示している。
ESBA105及び変異体の最大可溶性を、遠心分離されたPEG−タンパク質混合物の上清中のタンパク質濃度を測定することによって決定した。20mg/mlの出発濃度を、30〜50%の飽和度の範囲のPEG溶液と1:1で混合した。これらの条件を、Log SのPeg濃度(%w/v)に対する線形依存性の実験的な測定後に野生型ESBA105について確認された可溶性プロフィールに基づき選択した。優れた可溶性を示した変異体ESBA105の幾つかの例の可溶性曲線を、図9に示す。可溶性値の完全なリストを、また第17表にも提供する。
親のESBA105についての熱安定性測定と可溶性の再調査を、FT−IR ATR分光分析法を用いて実施した。それらの分子を、広範な温度(25〜95℃)に熱負荷した。変性プロフィールは、インターフェログラム信号にフーリエ変換をかけることによって得られた(図10を参照)。該変性プロフィールを用いて、ボルツマンシグモイドモデルを適用することで、全てのESBA105変異体について熱的アンフォールディング転移の中心点(TM)を見積もった(第18表)。
ESBA105及びその可溶性変異体を、また時間依存性試験で分析して、分解挙動と凝集挙動を評価した。この目的のために、可溶性タンパク質(20mg/ml)を、高められた温度(40℃)でリン酸緩衝液中でpH6.5でインキュベートした。対照サンプルを、−80℃に保持した。それらのサンプルを、2週間のインキュベート期間の後に、分解(SDS−PAGE)及び凝集(SEC)について分析した。これにより、分解を受けやすい変異体(図11を参照)又は可溶性もしくは不溶性の凝集物を形成する傾向を示す変異体(第19表を参照)の破棄が可能となった。
それらの可溶性変異体を、また親のESBA105分子と比較して、発現及び再フォールディング率について試験した。これらの研究結果を、第20表に示す。
可溶性設計によって割り出されたESBA105変異体を、更に、クオリティー・コントロール(QC)アッセイによって割り出された安定化突然変異と置き換えることによって最適化した。前記の例7で割り出された可溶性突然変異の1〜3つを、QC7.1及び15.2で見出された全ての安定化突然変異(すなわちVLドメインにおけるD31N及びV83E並びにVHドメインにおけるV78A、K43及びF67L)と組み合わされて含む全部で4つの構築物を作製した。全ての最適化された構築物により、野生型scFvよりも高い可溶性を有するタンパク質が得られた(第20表を参照)。最良の構築物は、一貫して、野生型に対して可溶性について2倍より高い増大を示した。scFv分子の活性と安定性のいずれも、安定化突然変異と可溶性増強突然変異との組み合わせによって大きな影響を受けなかった。
当業者は、単に通常の実験を用いて、本願に記載される本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識し、又は確認することができる。斯かる等価物は、特許請求の範囲によって含まれると意図される。
Claims (10)
- イムノバインダーにおける特定の位置での置換のための1もしくはそれより多くのアミノ酸残基を割り出す方法であって:
a)サブタイプにより群分けされたVH及び/又はVLのアミノ酸配列の第一のデータベースを提供する工程であって、該V H 及び/又はV L のアミノ酸配列が生殖細胞系および/または成熟抗体のアミノ酸配列を含む、工程;
b)サブタイプにより群分けされ、かつ少なくとも1つの所望の機能特性を有するものとして選択された、QCアッセイから選択されたscFv VH及び/又はVLのアミノ酸配列の第二のデータベースを提供する工程;
c)第一のデータベースのフレームワーク位置と第二のデータベースの相応のフレームワーク位置でのアミノ酸残基についてのアミノ酸頻度を決定する工程であって、各アミノ酸位置での各アミノ酸残基のアミノ酸頻度は、該アミノ酸位置での各アミノ酸残基の、特定のサブタイプの全ての分析された配列のパーセンテージとして決定される、工程;
d)該アミノ酸残基を、(i)該アミノ酸が1より大きい濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置での置換のための好ましいアミノ酸残基として割り出し、又は(ii)該アミノ酸残基が1未満の濃縮係数を有する場合に、イムノバインダーの相応のアミノ酸位置で排除されるべきアミノ酸残基として割り出す工程であって、該濃縮係数が、該第二のデータベース内の残基の相対アミノ酸頻度の、該第一のデータベース内の相応の位置での残基の相対アミノ酸頻度に対する比率を決定することによって定量される、工程
を含む前記方法。 - 請求項1に記載の方法において、工程d)のアミノ酸残基が4〜6の濃縮係数を有する前記方法。
- 請求項1から2までのいずれか1項に記載の方法において、第一のデータベースが、生殖細胞系のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列からなる前記方法。
- 請求項1から2までのいずれか1項に記載の方法において、第一のデータベースが、成熟のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列からなる前記方法。
- 請求項1又は4に記載の方法において、成熟のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列が、Kabatデータベース(KDB)からの配列である前記方法。
- 請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法において、第二のデータベースが、QCアッセイから選択されたscFv抗体のVH、VLもしくはVH及びVLのアミノ酸配列からなる前記方法。
- 請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法において、イムノバインダーが、scFv抗体、全長免疫グロブリン、Fabフラグメント、Dabもしくはナノボディーである前記方法。
- 請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法において、機能特性が、改善された安定性、改善された可溶性、非凝集、発現の改善、封入体精製工程に引き続く再フォールディング率における改善又は前記の改善の2もしくはそれより多くの組み合わせである前記方法。
- 請求項8に記載の方法において、発現の改善が原核細胞において確認される前記方法。
- 請求項1から6及び8から9までのいずれか1項に記載の方法において、機能特性が抗原結合親和性における改善ではないことを条件とする前記方法。
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