CN102164958A

CN102164958A - 使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化

Info

Publication number: CN102164958A
Application number: CN2009801243120A
Authority: CN
Inventors: L·波拉斯; D·厄里什
Original assignee: Esbatech An Alcon Biomedical Research Unit LLC
Current assignee: Esbatech a Novartis Co LLC
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2011-08-24
Also published as: RU2635186C2; KR101882352B1; KR20110022715A; PL2752428T3; TR201808591T4; DK2307458T3; EP2307458B1; JP5856480B2; EP2752428B1; DK2752428T3; EP3628686A1; PL2307458T3; US11858981B2; AU2009264567B2; AU2009264567A1; WO2009155726A2; BRPI0914663A2; CN104004094B; EP3628686B1; CN104004094A

Abstract

本发明涉及通用抗体受体构架以及使用通用抗体受体构架移植非人抗体，例如兔抗体的方法。通过本发明的方法产生的抗体可用于多种诊断和治疗应用。

Description

使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化

相关信息

本申请要求2008年6月25日提交的US 61/075,697、2009年2月24日提交的US 61/155,041和2009年2月24日提交的US61/155,105的优先权。

发明背景

单克隆抗体、其缀合物和衍生物作为治疗性和诊断性试剂具有巨大的商业重要性。非人抗体通常在单次低剂量注射后在患者中引发强免疫应答(Schroff，1985 Cancer Res 45：879-85，Shawler.J Immunol1985 135：1530-5；Dillman，Cancer Biother 19949：17-28)。因此，开发了减弱鼠和其他啮齿类动物抗体的免疫原性的几个方法以及使用例如转基因小鼠或噬菌体展示产生完全人抗体的技术。改造嵌合抗体，所述嵌合抗体将啮齿类动物可变区与人恒定区组合(例如，BoulianneNature 1984 312：643-6)，显著地减少了免疫原性问题(例如，LoBuglio，Proc Natl Acad Sci 1989 86：4220-4；Clark，Immunol Today 2000 21：397-402)。还对人源化的抗体进行改造，其中改造可变区本身的啮齿类动物序列以尽可能接近人序列同时保持至少原始CDR，或其中将来自啮齿类动物抗体的CDR移植入人抗体的构架(例如，Riechmann，Nature 1988 332：323-7；US5,693,761)。兔多克隆抗体被广泛地用于生物测定例如ELISA或Western印迹。多克隆兔抗体由于其通常高得多的亲和力而通常比多克隆啮齿类动物抗体更有利。此外，兔通常能够引发良好的对抗原的抗体应答，所述抗原在小鼠中具有较弱的免疫原性和/或当用于噬菌体展示时不产生良好的结合剂。由于兔抗体的这些熟知的有利方面，因而它们被理想地用于治疗性抗体的发现和开发。未普遍进行该应用的原因主要是由于单克隆兔抗体的产生的技术挑战。因为骨髓瘤样肿瘤在兔中是未知的，因此产生单克隆抗体的常规杂交瘤技术不适用于兔抗体。为表达兔抗体的细胞提供融合细胞系伴侣的开拓工作已由Knight和colleagues (Spieker-Polet等人，PNAS 1995，92：9348-52)进行并且改善的融合伴侣细胞系已由Pytela等人在2005年(参见例如美国专利7429487)进行了描述。然而，该技术未得到广泛地推广，因为相应的专门技术基本上由单个研究小组控制。用于产生单克隆抗体的可选择的方法(其包括通过RT-PCR从选择的表达抗体的细胞克隆抗体)描述于文献中，但对于兔抗体从未有成功的报导。

如果用于人治疗，预期兔抗体(与鼠抗体一样)引发强免疫应答，因此，兔抗体需要先进行人源化，然后才可将其用于临床。然而，用于产生人源化的啮齿类动物抗体的方法由于分别地兔与小鼠抗体之间以及兔与人抗体之间的结构差异而不能容易地推广至兔抗体。例如，轻链CDR3(CDRL3)通常比之前已知的来自人或小鼠抗体的CDRL3长得多。

然而，存在少数几个现有技术中描述的兔抗体人源化的方法，然而所述方法无其中将非人供体的CDR移植在人受体抗体上的经典移植方法。WO 04/016740描述了所谓的“表面再建(resurfacing)”策略。“表面再建”策略的目的是改造非人构架的溶剂可及的残基以便它们变得更象人的残基。WO 04/016740中所述的用于兔抗体的相似人源化技术在本领域内是已知的。WO08/144757和WO05/016950公开了用于人源化兔单克隆抗体的方法，其包括将亲本兔抗体的氨基酸序列与相似人抗体的氨基酸序列相比较。然后，改变亲本兔抗体的氨基酸序列以便其构架区在序列上与相似人抗体的等同构架区更相似。为了获得良好的结合能力，对于每一种免疫结合剂，需要单独地进行繁重的开发努力。

上述方法的潜在问题是，不使用人构架而是改造兔构架以便其看起来更象人的。此类方法具有风险：包埋在蛋白质核心中的氨基酸区段仍可能包含免疫原性T细胞表位。

迄今为止，本申请者仍未鉴定到通过应用现有技术移植方法而人源化的兔抗体。这可由兔CDR可能与人或啮齿类动物CDR显著不同的事实来解释。如本领域中已知的，许多兔VH链相对于鼠和人对应物具有额外配对的半胱氨酸。除了cys22与cys92之间形成的保守二硫桥外，在一些兔链中还存在cys21-cys79桥以及在CDR H1的最后一个残基与CDR H2的第一个残基之间形成的CDR间S-S桥。除此以外，半胱氨酸残基对通常见于CDR-L3中。此外，许多兔抗体CDR不属于任何之前已知的经典结构。特别地，CDR-L3通常比人或鼠对应物的CDR-L3长得多。

因此，非人CDR抗体至人构架的移植是主要的蛋白质改造任务。必须将来自天然进化的构架的抗原结合环转移至不同的人工选择的人构架，以使天然环构象得到保持以进行抗原结合。通常抗原结合亲和力在环移植后大大降低或消除。仔细选择的人构架在移植抗原结合环中的使用使得在人源化分子中保持结合亲和力的概率最大化(Roguzka等人1996)。虽然可在文献中获得的许多移植实验提供了CDR移植的大致指导，但不可能使模式普遍化。典型的问题在于，在移植CDR环后丧失了特异性、稳定性或可生产性。

因此，存在对用于可靠且快速地人源化用作治疗剂和诊断剂的兔抗体的改进的方法的迫切需要。此外，还存在对用于可靠地人源化兔抗体、提供具有药物样生物物理性质的功能性抗体和/或抗体片段的人受体构架的需要。

发明概述

已令人惊讶地发现，通过质量控制(QC)测定(如WO 0148017中和Auf der Maur等人(2001)，FEBS Lett 508，p.407-412中公开的)鉴定的高度可溶的和稳定的人抗体构架特别适合于容纳来自其他非人动物物种的CDR例如兔CDR。因此，在第一方面，本发明提供了特定人抗体(所谓的“FW1.4”抗体)的轻链和重链可变区，其特别适合作为来自具有不同结合特异性的多种抗体的CDR，特别是来自兔抗体的CDR的通用受体，无论二硫桥是否存在于CDR中。此外，本发明提供了所述特定人抗体构架的两个突变序列，即rFW1.4和rFW1.4(V2)，两者都是特别适合作为用于兔CDR的移植的通用受体构架的构架。在另一个方面，本发明提供了使人构架适合于容纳来自其他非人动物物种的CDR特别是兔CDR的构架残基的基序。

通过将兔CDR移植入此类高度相容的可变轻链和重链构架产生的人源化免疫结合剂一致且可靠地保持供体CDR所来源的兔抗体的空间定位。因此，不必将供体免疫结合剂的结构相关位置引入受体构架。由于这些有利方面，可实现兔抗体的高通量人源化，无需进行或几乎无需进行结合能力的优化。

因此，在另一个方面，本发明提供了将兔CDR和其他非人CDR移植入本文中公开的可溶和稳定的轻链和/或重链人抗体构架序列，从而产生具有优良生物物理性质的人源化抗体的方法。特别地，通过本发明的方法产生的免疫结合剂展示优良的功能性质例如溶解性和稳定性。

附图概述

图1描述了本文中用于将抗原结合部位从兔单克隆抗体移植入高度可溶和稳定的人抗体构架的CDR H1的界定。

图2示意性显示了用荧光抗体2标记的B细胞1与用细胞内染料4染色的表达靶的细胞3相互作用。靶的选择：5；BCR：6。

图3：结合ESBA903可溶性靶的兔B细胞的FACS选择方法。图3A：根据前向和侧向散射门控淋巴细胞。图3B：其中，选择IgG+IgM-细胞(可能地记忆B细胞)(红色门控)。图3C：用ESBA903-PE和ESBA903-PerCP双染色的细胞(绿色门控)预期编码高亲和力的抗ESBA903的IgG。在96孔板中分选显示最亮的荧光的细胞(粉红色门控)。

图4.用抗TNFα抗体(PE标记的)包被的珠粒结合TNFα转染的CHO细胞(上图)。抗CD 19抗体(APC标记的)包被的对照珠粒不结合TNFα转染的CHO细胞(中图)。用抗TNFα抗体(PE标记的)包被的珠粒不结合野生型(wt)CHO细胞(下图)。左边的散点图(dot plot)显示前向散射和侧向散射，其分别表示事件的大小和粒度。单个珠粒(～3um)的群体被门控在P2中。最终结合至珠粒的CHO细胞(～30um)被门控在P1中。中间的散点图显示就其PE或APC染色而言的P1事件(CHO细胞)。因此，如果细胞与抗TNFα珠粒相互作用，那么它们将示于P3门控中，如果它们与抗CD 19珠粒相互作用，那么它们将出现在P4门控中。在右边，详述了各样品的统计数据。

图5.将用抗TNFα-PE包被的珠粒和用抗CD19-APC包被的珠粒与TNFα转染的CHO细胞混合在一起。CHO细胞被门控(P1)，并且其中结合抗TNFα-PE包被的珠粒或抗CD 19-APC包被的珠粒的细胞分别示于门控P3和P4中。未结合的珠粒可在门控P2中看到。

图6.获自Kabat数据库的兔抗体序列的分析确认，可变重链的CDR3通常比其鼠对应物长3个氨基酸。

发明详述

定义

为了可更容易地理解本发明，将如下定义某些术语。另外的定义示于本说明书的上下文中。

术语“抗体”是指完整抗体和任何抗原结合片段。术语“抗原结合多肽”和“免疫结合剂”在本文中同时使用。“抗体”是指包含通过二硫键链间连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的蛋白质(任选地被糖基化)或其抗原结合部分。各重链包含重链可变区(在本文中缩写为V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域C_L。V_H和V_L区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，以及散布于其间的称为构架区(FR)的更保守的区域。各V_H和V_L由以下列顺序从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，TNF)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_H和V_L结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由V_H结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中V_L和V_H区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语“免疫结合剂”是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置，例如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，这样免疫结合剂能够特异性识别靶抗原。免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括但不限于(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)Fab′片段，其基本上是具有铰链区的一部分的Fab(参见，FundamentalImmunology(Paul编辑，3.sup.rd ed.1993)；(iv)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(vi)单结构域抗体例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由V_H或V_L结构域组成，Camelid(参见Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)和Dumoulin等人，Protein Science11：500-515(2002))或Shark抗体(例如，shark Ig-NARs)；和(vii)纳米抗体(Nanobody)，包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。

术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；V_H)和抗体轻链可变结构域(或区域；V_L)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-V_L-接头-V_H-COOH或NH₂-V_H-接头-V_L-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。在本发明的优选实施方案中，使用具有SEQ ID No：8中所示的氨基酸序列的(GGGGS)₄接头，但也可使用1-3个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

如本文中所使用的，术语“功能性质”是例如为了提高多肽的生产性质或治疗功效，其提高(例如相对于常规多肽)对于本领域技术人员来说是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫结合剂)的性质。在一个实施方案中，功能性质是稳定性(例如，热稳定性)。在另一个实施方案中，功能性质是溶解性(例如，在细胞条件下)。在另一个实施方案中，功能性质是聚集行为。在另一个实施方案中，功能性质是蛋白质表达(例如，在原核细胞中)。在另一个实施方案中，功能性质是在制造方法中内含体溶解后的重折叠行为。在某些实施方案中，功能性质不是抗原结合亲和力的提高。在另一个优选实施方案中，一个或多个功能性质的改善对免疫结合剂的结合亲和力没有显著影响。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIHPublication 91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDRL3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。然而，如本文中使用的，根据下列残基位置(Kabat编号)定义重链可变结构域的CDR1(CDR H1或H1)：其始于位置26并且终止于位置36之前。这基本上是由Kabat和Chotia分别定义的CDR H1的融合物(关于示例说明，也参见图1)。

本文中使用的术语“抗体构架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，TNF分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合。

术语″K_D″或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(K_D)结合TNF，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。

本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞包括细菌、微生物、植物或动物细胞，优选大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

术语″兔类动物″是指分类学兔形目(Lagomorpha)的成员，包括兔科(Leporidae)(例如野兔和兔)和鼠兔科(Ochotonidae)(鼠兔)。在最优选实施方案中，兔类动物是兔。本文中使用的术语“兔”是指属于兔科的动物。

如本文中所使用的，“同一性”是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如果两个多肽的每一个中的位置都被赖氨酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是，在考虑为了进行两个序列的最佳比对而必需引入的缺口的数目和各缺口的长度的情况下，由这两个序列共有的同一的位置的数目的函数。通常，在将两个序列进行比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，已整合入GCG软件包中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法的方法，利用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16，14，12，10，8，6或4的缺口权重和1，2，3，4，5或6的长度权重来提供。

除非另外指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下面描述了适当的方法和材料。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。

在下列部分更详细地描述本发明的多个方面。应理解，可随意组合不同实施方案、参数和范围。此外，取决于具体的实施方案，可不使用选择的定义、实施方案或范围。

如果没有另外指出，那么按照AHo编号方案标示氨基酸位置。AHo编号系统进一步描述于Honegger，A.和Pluckthun，A.(2001)J Mol.Biol.309：657-670)中。可选择地，可使用如在Kabat等人(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)中进一步描述的Kabat编号系统。用于确定抗体重链和轻链可变区中氨基酸残基位置的两个不同编号系统的换算表提供于A.Honegger，J.Mol.Biol.309(2001)657-670中。

在第一方面，本发明提供了用于从其他动物物种例如兔移植CDR的通用受体构架。之前已描述，包含在所谓的“质量控制”筛选(WO0148017)中鉴定的人构架的抗体或抗体衍生物的特征在于普遍较高的稳定性和/或溶解性。虽然人单链构架FW1.4(SEQ ID NO：1(在WO03/097697中称为a43)和SEQ ID NO：2(在WO03/097697中称为KI27)的组合)在质量控制测定中明显表现不佳，但令人惊讶地发现，其具有固有的高热力学稳定性并且可良好地产生(即便与多种不同CDR的组合)。该分子的稳定性主要归因于其构架区。还已显示FW1.4本质上可与兔抗体的抗原结合部位高度相容。因此，FW1.4代表了用于构建从兔环的移植衍生的稳定的人源化scFv抗体片段的适当支架。因此，在一个方面，本发明提供了免疫结合剂受体构架，其包含与SEQID No.1具有至少90％的同一性的VH序列和/或与SEQ ID No.2具有至少85％的同一性的VL序列，更优选包含用于兔CDR的移植的FW1.4的序列(SEQ ID NO：3)，或与SEQ ID NO：3具有至少60％，更优选至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％的同一性的序列。

此外，已发现可通过置换FW1.4的重链中的几个残基位置和/或通过置换FW1.4的轻链中的一个位置来优化FW1.4。从而，令人惊讶地发现，VH中许多种兔CDR的环构象可得到完全保持，且很大程度上不依赖于供体构架的序列。FW1.4的重链中的所述残基以及轻链的所述一个位置中的所述残基在兔抗体中是保守的。从兔库集推导出重链中的位置以及轻链中的所述一个位置处的共有残基并且将其引入人受体构架的序列。

因此，改进的构架1.4(在下文中称为rFW1.4)与几乎任何兔CDR相容。此外，包含不同兔CDR的rFW1.4与兔野生型单链相反，可良好地表达和良好地产生，并且仍然几乎完全保持原始供体兔抗体的亲和力。

因此，本发明提供了SEQ ID No.1的可变重链构架，其还包含通常支持来源于兔免疫结合剂的CDR的构象的一个或多个氨基酸残基。特别地，所述残基存在于选自24H，25H，56H，82H，84H，89H和108H(AHo编号)的一个或多个氨基酸位置上。已证明这些位置影响CDR的构象，从而预期用于突变以容纳供体CDR。优选，所述一个或多个残基选自：位置24处的苏氨酸(T)、位置25处的缬氨酸(V)、位置56处的甘氨酸或丙氨酸(G或A)、位置82处的赖氨酸(K)、位置84处的苏氨酸(T)、位置89处的缬氨酸(V)和位置108处的精氨酸(R)(AHo编号)。优选，存在至少3个，更优选4、5、6和最优选所有7个残基。令人惊讶地，已发现所述残基的存在改善了免疫结合剂的稳定性。

在优选实施方案中，本发明提供了免疫结合剂受体构架，其包含与SEQ ID No.4具有至少50％，更优选至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％和更优选100％的同一性的VH，前提是存在由位置24处的苏氨酸(T)、位置25处的缬氨酸(V)、位置56处的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置84处的苏氨酸(T)、位置82处的赖氨酸(K)、位置89处的缬氨酸(V)和位置108处的精氨酸(R)(AHo编号)组成的组中的至少1个，更优选至少3个，更优选至少4、5、6和最优选7个残基。在优选实施方案中，免疫结合剂受体构架是兔CDR的免疫结合剂受体构架。

在优选实施方案中，所述可变重链构架是或包含SEQ ID No.4或SEQ ID No.6。可将两个所述可变重链构架例如与任何适当的轻链构架组合。

因此，本发明提供了免疫结合剂受体构架，其包含：

(i)与SEQ ID No.4具有至少70％的同一性，优选至少75％，80％，85％，90％，更优选至少95％的同一性的可变重链构架；和/或

(ii)与SEQ ID No.2具有至少70％的同一性，优选至少75％，80％，85％，90％，更优选至少95％的同一性的可变轻链构架。

在非常优选的实施方案中，可变重链构架包含位置24处的苏氨酸(T)、位置56处的甘氨酸(G)、位置84处的苏氨酸(T)、位置89处的缬氨酸(V)和位置108处的精氨酸(R)(AHo编号)。

在优选实施方案中，可变轻链包含位置87处的苏氨酸(T)(AHo编号)。

在优选实施方案中，所述免疫结合剂受体构架包含

(i)选自SEQ ID No.1，SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的可变重链构架；和/或

(ii)SEQ ID No.2或SEQ ID No.9的可变轻链构架。

在优选实施方案中，通过接头将可变重链构架连接至可变轻链构架。接头可以是任何适当的接头，例如包含1至4个重复的序列GGGGS的接头，优选(GGGGS)4肽(SEQ ID No.8)，或Alfthan等人(1995)Protein Eng.8：725-731中公开的接头。

在另一个优选实施方案中，免疫结合剂受体构架是与SEQ ID No.5具有至少70％，75％，80％，85％，90％，更优选至少95％的同一性的序列，然而所述序列优选不是SEQ ID No.3。更优选，免疫结合剂受体构架包含或是SEQ ID No.5。

在另一个优选实施方案中，免疫结合剂受体构架是与SEQ ID No.7具有至少70％，75％，80％，85％，90％，更优选至少95％的同一性的序列，然而所述序列优选不是SEQ ID No.3。更优选，免疫结合剂受体构架包含或是SEQ ID No.7。

此外，令人惊讶地发现，上述氨基酸基序的存在使得构架，优选人构架特别适合于容纳来自其他非人动物物种的CDR特别是兔CDR。所述基序对免疫结合剂的稳定性不具有负面影响。CDR以与其在兔免疫结合剂中的天然空间定位相似的构象存在；从而，不必将结构相关位置移植至受体构架上。因此，人或人源化的免疫结合剂受体构架包含由位置24处的苏氨酸(T)、位置25处的缬氨酸(V)、位置56处的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置82处的赖氨酸(K)、位置84处的苏氨酸(T)、位置89处的缬氨酸(V)和位置108处的精氨酸(R)(AHo编号)组成的组中的至少3个氨基酸、优选4、5、6和更优选7个氨基酸。

本文中所述的免疫结合剂受体构架可在重链构架，优选在位置12、103和144(AHo编号)处包含增强溶解性的置换。优选，可用更亲水的氨基酸置换疏水性氨基酸。亲水性氨基酸是例如精氨酸(R)，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)，甘氨酸(G)，组氨酸(H)，赖氨酸(K)，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。更优选，重链构架包含(a)位置12处的丝氨酸(S)、(b)位置103处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)和/或(c)位置144处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

此外，增强稳定性的氨基酸可存在于可变轻链构架的位置1，3，4，10，47，57，91和103(AHo编号)中的一个或多个位置上。更优选，可变轻链构架包含位置1处的谷氨酸(E)、位置3处的缬氨酸(V)、位置4处的亮氨酸(L)、位置10处的丝氨酸(S)、位置47处的精氨酸(R)、位置57处的丝氨酸(S)、位置91处的苯丙氨酸(F)和/或位置103处的缬氨酸(V)。

由于谷氨酰胺(Q)易于脱氨，因此在另一个优选实施方案中，VH在位置141处包含甘氨酸(G)。该置换可改善蛋白质的长期贮存。

例如，本文中公开的受体构架可用于产生人或人源化抗体，所述抗体保持非人CDR所源自的非人抗体的结合性质。因此，在优选实施方案中，本发明包括本文中公开的免疫结合剂受体构架，所述免疫结合剂受体构架还包括来自供体免疫结合剂，优选来自哺乳动物免疫结合剂，更优选来自兔类动物免疫结合剂和最优选来自兔免疫结合剂的重链CDR1，CDR2和CDR3和/或轻链CDR1，CDR2和CDR3。因此，在一个实施方案中，本发明提供了特异于期望的抗原的免疫结合剂，其包含：

(i)兔类动物的可变轻链CDR；和

(ii)与SEQ ID NO.4具有至少50％，更优选至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％和最优选100％的同一性的人可变重链构架。

在一个优选实施方案中，存在前提条件：由位置24处的苏氨酸(T)、位置25处的缬氨酸(V)、位置56处的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置84处的苏氨酸(T)、位置82处的赖氨酸(K)、位置89处的缬氨酸(V)和位置108处的精氨酸(R)(AHo编号)组成的组中的至少一个氨基酸存在于所述人可变重链构架序列中。

优选，兔类动物是兔。更优选，免疫结合剂包含来自供体免疫结合剂的重链CDR1，CDR2和CDR3以及轻链CDR1，CDR2和CDR3。

如本领域中已知的，许多兔VH链具有相对于鼠和人对应物的额外配对的半胱氨酸。除了cys22与cys92之间形成的保守二硫桥外，在一些兔链中还存在cys21-cys79桥以及在CDR H1的最后一个残基与CDR H2的第一个残基之间形成的CDR间S-S桥。除此以外，半胱氨酸残基对通常见于CDR-L3中。此外，许多兔抗体CDR不属于任何之前已知的经典结构。特别地，CDR-L3通常比人或鼠对应物的CDR-L3长得多。

如之前所述，非人CDR至本文中描述的构架的移植产生了其中以恰当的构象展示CDR的分子。需要时，可通过移植非人供体免疫结合剂的抗原相互作用构架残基来提高免疫结合剂的亲和力。此类位置可以例如通过下列方法来鉴定：

(i)鉴定各自的种系祖先序列，或可选择地，在高度同源的构架序列的情况下通过使用共有序列；

(ii)产生供体可变结构域序列与步骤(i)的种系祖先序列或共有序列的序列比对；和

(iii)鉴定相异的残基。

在许多情况下在体内亲和力产生过程中，分子表面上的相异残基被突变，从而可能产生对抗原的亲和力。

在另一个方面，本发明提供了包含本文中所述的免疫结合剂受体构架的免疫结合剂。所述免疫结合剂可以是例如scFv抗体、全长免疫球蛋白、Fab片段、Dab或纳米抗体。

在优选实施方案中，将免疫结合剂连接至一个或多个分子，例如治疗剂例如细胞毒性剂、趋化因子、生长因子或其他信号转导分子，成像剂或第二蛋白质例如转录激活因子或DNA结合结构域。

本文中公开的免疫结合剂可以例如用于诊断应用、治疗应用、靶标确认或基因治疗。

本发明还提供了编码本文中公开的免疫结合剂受体构架或本文中公开的免疫结合剂的分离的核酸。

在另一个实施方案中，提供了包含本文中公开的核酸的载体。

可例如将本文中公开的核酸或载体用于基因治疗。

本发明还包括包含本文中公开的载体和/或核酸的宿主细胞。

此外，提供了包含本文中公开的免疫结合剂受体构架、本文中公开的免疫结合剂、本文中公开的分离的核酸或本文中公开的载体的组合物。

本文中公开的序列如下(X残基是CDR插入位置)：

SEQ ID NO.1：FW1.4的可变重链构架(a43)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(X)_n＝1-50WVRQAPGKGLEWVS(X)_n＝1-50RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(X)_n＝1-50WGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.2：FW1.4的可变轻链构架(KI27)

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)_n＝1-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)_n＝1-50

GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)_n＝1-50FGQGTKLT VLG

SEQ ID NO.3：FW1.4的构架

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)_n＝1-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)_n＝1-50

GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)_n＝1-50FGQGTKLTVLG

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(X)_n＝1-50

WVRQAPGKGLEWVS(X)_n＝1-50RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCAK(X)_n＝1-50WGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.4：rFW1.4的可变重链构架

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)_n＝1-50

WVRQAPGKGLEWVG(X)_n＝1-50

RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)_n＝1-50WGQGTLV TVSS

SEQ ID NO.5：rFW1.4的构架

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)_n＝1-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)_n＝1-50

GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)_n＝1-50FGQGTKLTVLG

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)_n＝1-50

WVRQAPGKGLEWVG(X)_n＝1-50RFTISRDTSKNTVYLQMNS

LRAEDTAVYYCAR(X)_n＝1-50WGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.6：rFW1.4(V2)的可变重链构架

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)_n＝1-50WVRQAPGKGLEWVG(X)_n＝1-50

RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)_n＝1-50WGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.7：rFW1.4(V2)的构架

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)_n＝1-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)_n＝1-50

GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)_n＝1-50FGQGTKLTVLG

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)_n＝1-50

WVRQAPGKGLEWVG(X)_n＝1-50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLR

AEDTAVYYCAR(X)_n＝1-50WGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.8：接头

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO.9：FW1.4的经置换的可变轻链构架

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)_n＝1-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)_n＝1-50

GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)_n＝1-50FGQGTKLTVLG

在另一个方面，本发明提供了通过将非人供体抗体的CDR移植至稳定和可溶的抗体构架来人源化非人抗体的方法。在特别优选的实施方案中，来自兔抗体的CDR和所述构架是上述CDR和构架。

用于将CDR移植入人受体构架的一般方法已由Winter在美国专利5,225,539中和由Queen等人在WO9007861 A1(其以其全文通过引用合并入本文)中公开。用于将来自兔单克隆抗体的CDR移植入选择的构架的一般策略与Winter等人和Queen等人的策略相关，但在某些关键方面有分歧。特别地，本发明的方法与本领域内已知的典型的Winter和Queen的方法相异在于，本文中公开的人抗体构架特别适合作为人或非人供体抗体的通用受体。因此，与Winter和Queen的一般方法不同，用于本发明的人源化方法的构架序列不必是展示与供体CDR所源自的非人(例如，兔)抗体的序列的最大序列相似性的构架序列。此外，不需要从供体序列移植构架残基来支持CDR构象。至多，可引入位于构架中的抗原结合氨基酸或在体细胞高突变期间产生的其他突变。

下面描述产生具有高溶解性和稳定性的人源化兔源抗体的移植方法的具体内容。

因此，本发明提供了人源化兔CDR供体免疫结合剂的方法，所述免疫结合剂包含重链CDR1，CDR2和CDR3序列和/或轻链CDR1，CDR2和CDR3序列。所述方法包括步骤：

(i)将由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组中的至少1个，优选2个，更优选3个CDR移植入重链上的人重链受体构架，所述受体构架与SEQ ID NO：1具有至少50％，优选至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，更优选至少95％的同一性；和/或

(ii)将由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组中的至少1个，优选2个，更优选3个CDR移植入轻链上的人轻链受体构架，所述人轻链构架与SEQ ID NO：2具有至少50％，优选至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，更优选至少95％的同一性。

在优选实施方案中，可变链受体构架包含：(i)包含选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的构架氨基酸序列的人重链构架和(ii)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9的构架氨基酸序列的人轻链构架。

在非常优选的实施方案中，所述方法包括步骤：(i)将重链CDR1、CDR2和CDR3序列移植入免疫结合剂重链和(ii)将轻链CDR1、CDR2和CDR3序列移植入免疫结合剂轻链，所述免疫结合剂与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7具有至少75％，80％，85％，90％，更优选至少95％的同一性。更优选，免疫结合剂是或包含SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7。

在另一个实施方案中，为了改善抗原结合，所述方法还可包括用参与抗原结合的供体残基置换受体构架残基的步骤。

在本发明的方法的示例性实施方案中，首先鉴定CDR供体抗体的氨基酸序列，然后使用常规序列比对工具(例如，Needleman-Wunsch算法和Blossum矩阵)比对序列。可使用常规抗体编号系统进行缺口的引入和残基位置的命名。例如，可使用用于免疫球蛋白可变结构域的AHo编号系统。还可使用Kabat编号系统，因为其是用于编号抗体中的残基的最广泛采用的标准。可例如使用SUBIM程序分配Kabat编号。该程序分析抗体序列的可变区且按照由Kabat和同事(Deret等人1995)建立的系统给序列编号。通常按照基于序列的变异性的最常用的Kabat定义来进行构架和CDR区的界定。然而，对于CDR-H1，命名优选是Kabat定义，通过分析一组3D复合物结构的抗体与抗原之间的接触而产生的平均接触数据(MacCallum等人，1996)和基于结构环区域的位置的Chotia′s定义的组合(也参见图1)。用于确定抗体重链和轻链可变区中的氨基酸残基位置的两个不同编号系统的换算表提供于A.Honegger，J.Mol.Biol.309(2001)657-670中。Kabat编号系统进一步描述于Kabat等人(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)中。AHo编号系统进一步描述于Honegger，A.和Pluckthun，A.(2001)JMol.Biol.309：657-670)中。

可使用例如序列分析算法和分类方法的EXCEL工具，基于人抗体库的分析(Knappik等人，2000，J Mol Biol.Feb 11；296(1)：57-86)将兔单克隆抗体的可变结构域例如分类至相应的人亚组。

可将CDR构象分配至供体抗原结合区，然后还可鉴定维持不同经典结构所需的残基位置。使用Chothia′s(1989)定义确定兔抗体的6个抗体高变区中的5个(L1、L2、L3、H1和H2)的CDR经典结构。

在优选实施方案中，按照下列方法产生、鉴定和分离CDR：将B细胞，优选兔B细胞(i)与靶抗原(优选纯化的)或(ii)与在其表面上表达靶抗原的细胞一起温育。

在(ii)的情况下，表达靶抗原的所述细胞可以例如是天然表达选择的靶或经转化在它们的表面上表达靶蛋白的哺乳动物细胞，优选CHO或HEK293细胞，酵母细胞，优选酵母球芽(spheroblast)或细菌细胞。当表达时，靶抗原可以以整合入或连接至细胞膜的形式在细胞表面上表达。可以例如以分离的株系在细胞培养物中培养细胞，或可从其天然环境例如组织、器官或生物体分离所述细胞。

靶抗原在细胞的表面上表达，即情况(ii)，对于跨膜蛋白是特别优选的，对于多次跨膜蛋白例如GPCR(G蛋白偶联受体)或离子通道或其天然构象在重组表达和纯化后难以维持的任何其他蛋白是更优选的。使用重组蛋白的常规免疫在这些情况下由于在纯化过程中丢失完整膜蛋白/复合物的天然构象或由于纯蛋白的量不足而不适宜或不可能。在本发明的优选实施方案中，用DNA而非重组蛋白，例如通过WO/2004/087216中公开的DNA接种方案免疫哺乳动物，更优选兔。DNA接种诱导快速的抗天然抗原的免疫应答。因为不需要重组蛋白，因此该技术一方面非常节约成本，另一方面，更重要地，该方法允许完整膜复合物和/或多次跨膜的膜蛋白的天然表达。可从所述已免疫的动物，优选所述兔分离B细胞，或可选择地B细胞是稚B细胞(naiveB-cell)。

在所述方法的随后步骤中，从已免疫的动物(优选已免疫的兔)的淋巴器官(例如脾或淋巴结)分离B细胞，优选记忆B细胞。将B细胞与在其表面上表达抗原的细胞或与荧光标记的可溶性抗原混合温育。分离在其表面上表达靶特异性抗体并且因此结合靶抗原或在细胞表面上表达的靶抗原的B细胞。在非常优选的实施方案中，对B细胞和/或靶细胞进行染色以允许通过基于流式细胞术的分选术分离B细胞/靶细胞或B细胞/抗原复合物。流式细胞术通常测量由单个细胞(当其穿过激光束时)发射的荧光。然而，一些研究者已使用细胞计数器来研究细胞-细胞相互作用，例如，由钙粘蛋白(Panorchan等人，2006，J.Cell Science，119，66-74；Leong et Hibma，2005，J.Immunol.Methods，302，116-124)或整联蛋白(Gawaz等人，1991，J.Clin.Invest，88，1128-1134)介导的粘着。因此，在(ii)的情况下，用胞内荧光染料(例如钙黄绿素)染色表达选择的靶的细胞。用结合细胞表面特异性标志物的荧光抗体染色B细胞。因此，可选择包含通过B细胞受体-靶相互作用彼此粘着的两个细胞的双色“事件”(参见图2)。

由于IgG通常具有比IgM更高的亲和力，因此优选选择在其表面上表达IgG而非IgM(这是记忆B细胞的特征)的阳性B细胞。为了所述目的，优选使用多色染色，其中例如分别用APC和FITC差异标记特异于IgG和IgM的抗体。

在一个特定的实施方案中，B细胞分选的读出还可选择该相互作用功能性阻断/激活受体信号转导的能力。例如，可将B细胞与功能性表达GPCR(G蛋白偶联受体)的细胞一起温育。可向混合物中加入通过GPCR发出信号的激动剂以诱导GPCR介导的Ca2+从内质网流出。如果存在于B细胞上的抗体功能性阻断激动剂的信号转导，那么Ca2+流出也将被该细胞间相互作用阻断。可使用流式细胞术定量测量Ca2+流出。因此，只有显示Ca2+流出的增加或减少的B细胞/靶细胞聚集物可被分选。

在选择步骤之后，在适当的条件下培养B细胞以使抗体能够分泌入培养基。产生的抗体是单克隆抗体。培养可包括使用辅助细胞系例如胸腺瘤辅助细胞系(例如EL4-B5，参见Zubler等人，1985，J.Immunol.，134(6)：3662-3668)。优选，进行验证步骤以就对靶的特异性结合测试产生的抗体，例如以排除抗除靶蛋白外的在细胞表面上表达的蛋白质的抗体。例如，其中使用完整细胞进行包被步骤的CELISA(即改进的酶联免疫吸附测定(ELISA))适合用于所述目的。所述方法允许估量抗体与配体竞争的能力和选择性。

然后分析上述步骤中产生的抗体以鉴定所述抗体的CDR。这可包括步骤例如纯化抗体、阐明其氨基酸序列和/或核酸序列。

最后，可以例如通过使用寡核苷酸延伸法的基因合成将CDR移植入受体构架，优选上述受体构架。在一个实施方案中，本领域公认的CDR移植方法可用于将供体CDR移植入受体构架。在大多数情况下，将来自重链的所有3个CDR从供体抗体移植至单个受体构架和将来自轻链的所有3个CDR移植至不同受体构架。预期不应当总是必需移植所有CDR，因为一些CDR可能不参与对抗原的结合，并且具有不同序列(和相同长度)的CDR可具有相同的折叠(从而尽管序列不同，抗原接触至主链接触可得到保持)。事实上单个结构域(Ward等人，1989，Nature 341，pp.544-546)或甚至单个CDR(R.Taub等人，1989，J.BiolChem 264，pp.259-265)单独可具有抗原结合活性。然而，无论是移植所有CDR还是只移植一些CDR，CDR移植的意图是将相同或更确切地相同的抗原结合部位从动物移植至人抗体(参见，例如，美国专利5,225,539(Winter))。

在另一个实施方案中，可在它们整合入受体构架之前或之后改变供体抗体的CDR。

可选择地，只在其终免疫结合剂形式中进行抗体的表征。为了进行该方法，可通过RT-PCR从培养的分选的B细胞或直接从单个分选的B细胞得到在分选的B细胞上表达的抗体的CDR序列。为了所述目的，B细胞的增殖和/或上述验证步骤和/或上述分析步骤可能不是必须的。其中一个寡核苷酸库编码CDR并且第二库编码适当的免疫结合剂支架的构架区的部分重叠的寡核苷酸的两个库的组合允许在一步PCR中产生人源化免疫结合剂。高通量测序、克隆和生产允许基于纯化的人源化免疫结合剂的性能进行克隆选择，而不表征细胞培养上清液中分泌的IgG。因此在优选实施方案中，免疫结合剂是scFv。

然而，CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的免疫结合剂对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人免疫结合剂的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查兔单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的兔序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。

还可进一步优化本发明的抗体以显示增强的功能性质例如增强的溶解性和/或稳定性。在某些实施方案中，按照2008年3月12日提交的PCT申请系列号PCT/EP2008/001958(名称为″Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies″，其通过引用合并入本文)中公开的“功能共有序列”方法优化本发明的抗体。

例如，可将本发明的免疫结合剂与功能性选择的scFv的数据库进行比较以鉴定比免疫结合剂中的相应位置更耐受变异性或更不耐受变异性的氨基酸残基位置，从而表明此类鉴定的残基位置可适合用于改造以改善功能性例如稳定性和/或溶解性。

用于置换的示例性构架残基位置和示例性构架置换描述于2008年6月25日提交的PCT申请PCT/CH2008/000285(名称为″Methods of Modifying Antibodies，and Modified Antibodies with Improved Functional Properties″)和2008年6月25日提交的PCT申请PCT/CH2008/000284(名称为″Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies″)中。例如，可在本发明的免疫结合剂的重链可变区中在氨基酸位置(对于下文列出的每一个氨基酸位置参照AHo编号)上引入一个或多个下列置换：

(a)氨基酸位置1处的Q或E；

(b)氨基酸位置6处的Q或E；

(c)氨基酸位置7处的T、S或A，更优选T或A，更优选T；

(d)氨基酸位置10处的A、T、P、V或D，更优选T、P、V或D，

(e)氨基酸位置12处的L或V，更优选L，

(f)氨基酸位置13处的V、R、Q、M或K，更优选V、R、Q或M，

(g)氨基酸位置14处的R，M，E，Q或K，更优选R，M，E或Q，更优选R或E；

(h)氨基酸位置19处的L或V，更优选L；

(i)氨基酸位置20处的R，T，K或N，更优选R，T或N，更优选N；

(j)氨基酸位置21处的I，F，L或V，更优选I，F或L，更优选I或L；

(k)氨基酸位置45处的R或K，更优选K；

(l)氨基酸位置47处的T，P，V，A或R，更优选T，P、V或R，更优选R；

(m)氨基酸位置50处的K，Q、H或E，更优选K、H或E，更优选K；

(n)氨基酸位置55处的M或I，更优选I；

(o)氨基酸位置77处的K或R，更优选K；

(p)氨基酸位置78处的A、V、L或I，更优选A、L或I，更优选A；

(q)氨基酸位置82处的E，R，T或A，更优选E，T或A，更优选E；

(r)氨基酸位置86处的T，S，I或L，更优选T，S或L，更优选T；

(s)氨基酸位置87处的D，S，N或G，更优选D，N或G，更优选N；

(t)氨基酸位置89处的A，V，L或F，更优选A，V或F，更优选V；

(u)氨基酸位置90处的F，S，H，D或Y，更优选F，S，H或D；

(v)氨基酸位置92处的D，Q或E，更优选D或Q，更优选D；

(w)氨基酸位置95处的G，N，T或S，更优选G，N或T，更优选G；

(x)氨基酸位置98处的T，A，P，F或S，更优选T，A，P或F，更优选F；

(y)氨基酸位置103处的R，Q，V，I、M，F或L，更优选R，Q，I，M，F或L，更优选Y，更优选L；和

(z)氨基酸位置107处的N，S或A，更优选N或S，更优选N。

另外地或可选择地，可将一个或多个下列置换引入本发明的免疫结合剂的轻链可变区：

(aa)氨基酸位置1处的Q，D，L，E，S或I，更优选L，E，S或I，更优选L或E；

(bb)氨基酸位置2处的S，A，Y，I，P或T，更优选A，Y，I，P或T，更优选P或T；

(cc)氨基酸位置3处的Q，V，T或I，更优选V，T或I，更优选V或T；

(dd)氨基酸位置4处的V，L，I或M，更优选V或L；

(ee)氨基酸位置7处的S，E或P，更优选S或E，更优选S；

(ff)氨基酸位置10处的T或I，更优选I；

(gg)氨基酸位置11处的A或V，更优选A；

(hh)氨基酸位置12处的S或Y，更优选Y；

(ii)氨基酸位置14处的T，S或A，更优选T或S，更优选T；

(jj)氨基酸位置18处的S或R，更优选S；

(kk)氨基酸位置20处的T或R，更优选R；

(ll)氨基酸位置24处的R或Q，更优选Q；

(mm)氨基酸位置46处的H或Q，更优选H；

(nn)氨基酸位置47处的K，R或I，更优选R或I，更优选R；

(oo)氨基酸位置50处的R，Q，K，E，T或M，更优选Q，K，E，T或M；

(pp)氨基酸位置53处的K，T，S，N，Q或P，更优选T，S，N，Q或P；

(qq)氨基酸位置56处的I或M，更优选M；

(rr)氨基酸位置57处的H，S，F或Y，更优选H，S或F；

(ss)氨基酸位置74处的I，V或T，更优选V或T，R，更优选T；

(tt)氨基酸位置82处的R，Q或K，更优选R或Q，更优选R；

(uu)氨基酸位置91处的L或F，更优选F；

(vv)氨基酸位置92处的G，D，T或A，更优选G，D或T，更优选T；

(xx)氨基酸位置94处的S或N，更优选N；

(yy)氨基酸位置101处的F，Y或S，更优选Y或S，更优选S；和

(zz)氨基酸位置103处的D，F，H，E，L，A，T，V、S，G或I，更优选H，E，L，A，T，V，S，G或I，更优选A或V。

在其他实施方案中，本发明的免疫结合剂包含一个或多个2008年6月25日提交的美国临时申请系列号61/075,692(名称为“Solubility Optimization of Immunobinders”)中描述的稳定性增强突变。在某些优选实施方案中，免疫结合剂在选自由12、103和144(AHo编号约定)组成的重链氨基酸位置的氨基酸位置处包含溶解性增强突变。在一个优选实施方案中，免疫结合剂包含一个或多个选自下列的置换：(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；和(c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。在另一个实施方案中，免疫结合剂包含下列置换：(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；和(c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

在某些优选实施方案中，免疫结合剂在根据AHo编号系统的轻链可变区的位置1，3，4，10，47，57，91和103中的至少一个位置处的轻链受体构架的构架残基上包含稳定性增强突变。在优选实施方案中，轻链受体构架包含一个或多个置换，所述置换选自：(a)位置1处的谷氨酸(E)、(b)位置3处的缬氨酸(V)、(c)位置4处的亮氨酸(L)、(d)位置10处的丝氨酸(S)、(e)位置47处的精氨酸(R)、(e)位置57处的丝氨酸(S)、(f)位置91处的苯丙氨酸(F)和(g)位置103处的缬氨酸(V)。

可使用许多可获得的方法中的任何方法产生包含上述突变的人源化抗体。

因此，本发明的提供了按照本文中描述的方法人源化的免疫结合剂。

在某些优实施方案中，所述免疫结合剂的靶抗原是VEGF或TNFα。

本发明中描述的或通过本发明的方法产生的多肽可以例如使用本领域内已知的技术合成。可选择地，可通过重组方法来合成编码期望的可变区的核酸分子和产生多肽。

例如，一旦已确定人源化的可变区的序列，可通过分子生物学领域内熟知的技术制备包含其的可变区或多肽。更具体地，可使用重组DNA技术，通过用核酸序列(例如，编码期望的可变区(例如，改进的重链或轻链；其可变结构域或其的其他抗原结合片段)的DNA序列)转化宿主细胞来产生多种多肽。

在一个实施方案中，可制备包含与编码至少V_H或V_L的DNA序列有效连接的启动子的表达载体。必要时或需要时，可制备第二表达载体，所述载体包含与编码互补可变结构域的DNA序列有效连接的启动子(即，其中亲本表达载体编码V_H，第二表达载体编码V_L，反之亦然)。然后可用一个或两个表达载体转化细胞系(例如，永生化的哺乳动物细胞系)，并在允许嵌合可变结构域或嵌合抗体表达的条件下培养所述细胞(参见，例如，Neuberger等人的国际专利申请PCT/GB85/00392)。

在一个实施方案中，可制备包含供体CDR和受体FR氨基酸序列的可变区，然后可将变化引入核酸分子以进行CDR氨基酸置换。

用于制备编码多肽的的氨基酸序列变体的核酸分子的示例性本领域公认的方法包括但不限于，通过早期制备的编码多肽的DNA的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变进行的制备。

定点诱变是用于制备置换变体的优选方法。该技术在本领域内是熟知的(参见，例如，Carter等人Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)和Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1987))。简而言之，在进行DNA的定点诱变时，通过首先将编码期望的突变的寡核苷酸与这样的亲本DNA的单链杂交来改变亲本DNA。杂交后，使用杂交的寡核苷酸作为引物并且使用亲本DNA的单链作为模板，将DNA聚合酶用于合成完整第二链。从而，将编码期望的突变的寡核苷酸整合入所得的双链DNA。

PCR诱变也适合用于制备多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi，in PCR Protocols，pp.177-183(Academic Press，1990)；和Vallette等人，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。简而言之，当将少量模板DNA在PCR中用作起始材料时，可将在序列上与模板DNA中的相应区域略微不同的引物用于产生相对大量的特定DNA片段，所述DNA片段只在其中引物与模板不同的位置处与模板序列不同。

用于制备变体的另一个方法盒式诱变基于由Wells等人，Gene34：315-323(1985)描述的技术。起始材料是包含待突变的DNA的质粒(或其他载体)。确定待突变的亲本DNA中的密码子。在鉴定的突变位置的每一侧都必须存在独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在这样的限制性位点，那么可通过使用上述寡核苷酸介导的诱变法将其引入编码多肽的DNA中的适当位置处来产生它们。在这些位置切割质粒DNA以使之线性化。使用标准方法合成编码位于限制性位点之间但包含期望的突变的DNA序列的双链寡核苷酸，其中分开合成寡核苷酸的两条链，然后使用标准技术将其杂交在一起。该双链寡核苷酸称为盒。该盒经设计具有与线性化的质粒的末端相容的5′和3′末端，以便其可直接连接至质粒。该质粒现包含突变的DNA序列。

可改造并且进一步改变通过本发明的方法产生的可变区以进一步增加抗原结合。因此，可进行上述步骤或然后进行另外的步骤，包括亲和力成熟。此外，可将经验结合数据用于进一步优化。

本领域技术人员将理解，可进一步改造本发明的多肽以便其在氨基酸序列上但不在期望的活性上产生变化。例如，可对蛋白质进行导致在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换的另外的核苷酸置换。例如，可用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基置换免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基。在另一个实施方案，可用结构相似的、在侧链家族成员的组成和/或顺序上不同的串(string)替代氨基酸的串，即可产生其中用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的保守置换。

已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

除了氨基酸置换以外，本发明还涉及其他修饰，例如对Fc区氨基酸序列的修饰以产生具有改变的效应子功能的Fc区变体。可以例如缺失Fc区的一个或多个氨基酸残基以削弱或增强对FcR的结合。在一个实施方案，可修饰一个或多个Fc区残基以产生这样的Fc区变体。通常，按照本发明的该实施方案，缺失不超过1至大约10个Fc区残基。本文中包含一个或多个氨基酸缺失的Fc区将优选保持至少大约80％，优选至少大约90％和最优选至少大约95％的起始Fc区或天然序列人Fc区。

还可制备氨基酸插入Fc区变体，所述变体具有改变的效应子功能。例如，可在与本文中鉴定为影响FcR结合的一个或多个Fc区位置相邻的位置处引入至少一个氨基酸残基(例如1至2个氨基酸残基和通常不超过10个残基)。“相邻”意指在本文中鉴定的Fc区残基的1至2个氨基酸残基内。此类Fc区变体可展示增强的或减弱的FcRn结合。

此类Fc区域变体通常将在Fc区域包含至少一个氨基酸修饰。在一个实施方案中，可组合氨基酸修饰。例如，变异的Fc区可包括2、3、4、5个等本文中的置换，例如本文中鉴定的特定Fc区位置的置换。在另一个实施方案中，多肽可具有改变的对FcRn或对另一个Fc受体的结合。

在一个实施方案中，本发明中描述的或通过本发明的方法产生的多肽例如人源化Ig可变区和/或包含人源化Ig可变区的多肽可通过重组方法产生。例如，可将编码多肽的多核苷酸序列插入适当的表达载体中以进行重组表达。在多肽是抗体的情况下，可将编码另外的轻链和重链可变区(任选地连接至恒定区)的多核苷酸插入相同或不同的表达载体。可任选地将亲和标签序列(例如His(6)标签)连接至多肽序列或包含在所述序列中以帮助下游纯化。将编码免疫球蛋白链的DNA区段有效地连接至表达载体的控制序列，所述控制序列确保免疫球蛋白多肽的表达。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然结合的或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。在已将载体整合入适当的宿主后，在适合于高水平表达核苷酸序列的条件下维持宿主，然后收集和纯化多肽。

此类表达载体通常可在宿主生物中复制(作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分)。通常，表达载体包含选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测用期望的DNA序列转化的那些细胞(参见，例如，美国专利4,704,362)。

大肠杆菌(E.coli)是对于克隆本发明的多核苷酸(例如，DNA序列)特别有用的一种原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌(bacilli)例如枯草芽孢杆菌和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)的种。

其他微生物例如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)是示例性酵母宿主，且需要时，适当的载体具有表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。常见启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括，特别地，来自醇脱氢酶、异细胞色素c和负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在本发明的范围内，大肠杆菌和酿酒酵母是优选宿主。

除了微生物外，哺乳动物组织培养物还可用于表达和产生本发明的多肽(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。真核细胞实际上是优选的，因为本领域内已开发了能够分泌异源蛋白质(例如，完整免疫球蛋白)的许多适当的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。用于此类细胞的表达载体可包括表达控制序列例如复制起点、启动子和增强子(Queen等人，Immunol.Rev.89：49(1986))以及必需的加工信息位点例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列是来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等人，J.Immunol.148：1149(1992)。

可通过熟知的方法(所述方法视细胞宿主类型的变化而变化)将包含目的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转移入宿主细胞。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染(lipofection)、基因枪(biolistics)或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(通常参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第2版，1989)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见，Sambrook等人，同上)。为了产生转基因动物，可将转基因显微注射入受精的卵母细胞，或可将其整合入胚胎干细胞的基因组，并且将此类细胞的细胞核转移入去核卵母细胞。

还可将受试多肽整合在转基因中以引入转基因动物的基因组和随后在例如转基因动物的奶中进行表达(参见，例如，Deboer等人5,741,957；Rosen 5,304,489；和Meade 5,849,992)。适当的转基因包括与来自乳腺特异性基因例如酪蛋白或β-乳球蛋白的启动子和增强子有效连接的轻链和/或重链的编码序列。

可使用单个载体或两个载体表达多肽。例如，可将抗体重链和轻链克隆在分开的表达载体上并且共转染入细胞。

在一个实施方案中，可使用信号序列促进本发明的多肽表达。

在表达后，可按照本领域内的标准方法包括硫酸铵沉淀法、亲和柱(例如，蛋白A或蛋白G)、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(通常参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))来纯化多肽。

可通过培养的宿主细胞或细胞系来表达人源化的Ig可变区或包含其的多肽。还可在体内在细胞中表达它们。被转化(例如，转染)以产生改变的抗体的细胞系可以是永生化的哺乳动物细胞系，例如，淋巴来源的细胞系(例如，骨髓瘤、杂交瘤、三源杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)细胞系)。细胞系还可包括已通过用病毒(例如，EB病毒)转化而被永生化的正常淋巴细胞例如B细胞。

虽然通常用于产生多肽的细胞系是哺乳动物细胞系，但还可使用来自其他来源(例如细菌和酵母)的细胞系。特别地，可使用大肠杆菌来源的细菌菌株，尤其是例如噬菌体展示。

一些永生化的淋巴细胞系例如骨髓瘤细胞系在其正常状态下分泌分离的Ig轻链或重链。如果用表达在本发明的方法中制备的改变的抗体的载体转化这样的细胞系，则将不必进行所述方法的剩余步骤，只要正常分泌的链与由更早制备的载体编码的Ig链的可变结构域互补。

如果永生化的细胞系不分泌或不分泌互补链，则必需将编码适当的互补链或其片段的载体引入细胞。

在其中永生化细胞系分泌互补轻链或重链的情况下，可以例如通过用载体转化适当的细菌细胞，然后将细菌细胞与永生化细胞系(例如，通过质体融合)融合来产生转化的细胞系。可选择地，可通过电穿孔将DNA直接引入永生化细胞系。

在一个实施方案中，本发明中描述的或通过本发明的方法产生的人源化的Ig可变区可存在于任何抗体的抗原结合片段中。可重组产生片段，改造片段、合成片段或可通过用蛋白水解酶降解抗体来产生片段。例如，片段可以是Fab片段；使用木瓜蛋白酶的降解在连接两个重链的链间(即，V_H-V_H)二硫键之前的区域断裂抗体。这导致形成包含轻链和重链的V_H和C_H1结构域的两个相同片段。可选择地，片段可以是F(ab′)₂片段。可通过用在链间二硫键之后断裂重链从而产生包含两个抗原结合部位的片段的胃蛋白酶降解抗体来产生此类片段。另一个可选择的方案是使用“单链”抗体。可以以多种方式构建单链Fv(scFv)片段。例如，可将V_H的C端连接至V_L的N端。通常，将接头(例如，(GGGGS)₄)置于V_H与V_L之间。然而，链连接的顺序可以是相反的，并且可包括帮助检测或纯化的标签(例如Myc-、His-或FLAG-标签)(标签例如可连接至本发明的任何抗体或抗体片段的标签；其用途不限于scFv)。因此，并且如下文中指出的，标记的抗体在本发明的范围内。在可选择的实施方案中，本文中描述的或通过本文中所述的方法产生的抗体可以是重链二聚体或轻链二聚体。此外，可使用抗体轻链或重链或其部分，例如，单结构域抗体(DAb)。

在另一个实施方案中，本发明中描述的或通过本发明的方法产生的人源化Ig可变区存在于单链抗体(ScFv)或微小抗体(minibody)(参见例如，美国专利5,837,821或WO94/09817A1)中。微小抗体是由两条多肽链构成的二聚体分子，所述多肽各自包含ScFv分子(包含一个或多个抗原结合部位的单个多肽，例如，通过柔性接头连接的V_L结构域和V_H结构域(通过连接肽融合至CH3结构域))。可以以V_H-接头-V_L方向或V_L-接头-V_H方向构建ScFv分子。连接组成抗原结合部位的V_L和V_H结构域的柔性铰链优选包含大约10至大约50个氨基酸残基。用于该目的的示例性连接肽是(Gly₄Ser)₃(Huston等人(1988).PNAS，85：5879)。其他连接肽在本领域内是已知的。

制备单链抗体的方法在本领域内是熟知的，例如，Ho等人(1989)，Gene，77：51；Bird等人(1988)，Science 242：423；Pantoliano等人(1991)，Biochemistry 30：10117；Milenic等人(1991)，CancerResearch，51：6363；Takkinen等人(1991)，Protein Engineering4：837。可通过使用本领域中描述的方法(参见，例如，美国专利5,837,821或WO 94/09817A1)构建ScFv组分和连接肽-CH₃组分来制造微小抗体。可以以限制性片段的形式从分开的质粒分离此类组分，然后将其连接并且再克隆入适当的载体。可通过限制性降解和DNA序列分析来验证适当的装配。在一个实施方案中，本发明的微小抗体包含连接肽。在一个实施方案中，连接肽包含Gly/Ser接头例如GGGSSGGGSGG。

在另一个实施方案中，可构建四价微小抗体。除了使用柔性接头(其例如具有氨基酸序列(G₄S)₄G₃AS)连接两个ScFv分子外，可以以与微小抗体相同的方式构建四价微小抗体。

在另一个实施方案中，本发明中描述的或通过本发明的方法产生的人源化可变区可存在于双抗体(Diabody)中。双抗体与scFv分子相似，但通常具有连接两个可变结构域的短的(少于10个，优选1至5个)氨基酸残基接头，以便相同多肽链上的V_L和V_H结构域不能相互作用。相反，一个多肽链的V_L和V_H结构域与第二多肽链上的V_H和V_L结构域(分别地)相互作用(WO 02/02781)。

在另一个实施方案中，本发明的人源化可变区存在于有效地连接至FcR结合部分的抗体的免疫反应性片段或部分(例如，scFv分子、微小抗体、四价微小抗体或双抗体)中。在示例性实施方案中，FcR结合部分是完全Fc区域。

优选，本文中描述的人源化方法产生其中对于抗原的亲和力与供体抗体相比较基本上未改变的Ig可变区。

在一个实施方案中，包含本发明的可变区的多肽以大于(或等于)大约10⁵M^-1、10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1或10¹²M^-1(包括介于这些值之间的亲和力)的结合常数Ka的结合亲和力结合抗原。

可以以多种方法测量亲和力、亲合力和/或特异性。通常，无论其中确定和测量亲和力的确切方法如何，本发明的方法，当它们产生在其临床应用的任何方面优于其所源自的抗体的抗体时，提高了抗体的亲和力(例如，当修饰的抗体可以以比其所源自的抗体更低的剂量或更低的频率或通过更方便的施用途径施用时，本发明的方法被认为是有效或成功的)。

更特别地，抗体与其结合的抗原之间的亲和力可通过各种测定(包括例如ELISA测定、BiaCore测定或KinExA^TM3000测定(可从SapidyneInstruments(Boise，ID)获得))来测量。简而言之，通过共价连接用抗原(用于本发明的方法的抗原可以是任何目的抗原(例如，癌症抗原；细胞表面蛋白或分泌蛋白；病原体的抗原(例如细菌或病毒抗原(例如，HIV抗原、流感抗原或肝炎抗原))或变应原))包被sepharose珠粒。制备待测试的抗体的稀释物，并且将各稀释物加至板上指定的孔中。然后向各孔中加入检测抗体(例如，山羊抗人IgG-HRP缀合物)，然后加入生色底物(例如HRP)。然后在450nM处在ELISA酶标仪中读取板，并且计算EC50值。(然而，应理解，此处描述的方法是可普遍应用的；它们不限于产生结合任何特定抗原或抗原种类的抗体)。

本领域技术人员理解，测定亲和力并非总是如看单个图那样简单。因为抗体具有两个臂，因此它们的表观亲和力通常比可变区与抗原之间的固有亲和力高得多(这据信归因于亲合力)。可使用scFv或Fab片段测量固有亲和力。

在另一个方面，本发明表征了包含本发明的人源化兔抗体或其片段的双特异性分子。可将本发明的抗体或其抗原结合部分衍生或连接至另一种功能性分子例如另一种肽或蛋白质(例如，受体的另一种抗体或配体)以产生结合至少两个不同的结合位点或靶分子的双特异性分子。可将本发明的抗体衍生或连接至超过一个的其他功能性分子以产生结合超过两个不同的结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也意欲包括在本文中使用的术语“双特异性分子”中。为了产生本发明的双特异性分子，可将本发明的抗体功能性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方法)至一个或多个其他结合分子例如另一个抗体、抗体片段、肿瘤特异性或病原体特异性抗原、肽或结合模拟物，以便产生双特异性分子。因此，本发明包括包含至少一个对于第一靶具有特异性的第一结合分子和对于一个或多个另外的靶表位具有特异性的第二结合分子的双特异性分子。

在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab′F(ab′)₂、Fv或单链Fv)作为结合特异性。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段例如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利4,946,778(其内容通过引用合并入本文)中所描述的。

虽然人单克隆抗体是优选的，但可用于本发明的双特异性分子的其他抗体是鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体。

本发明的双特异性分子可通过使用本领域已知的方法缀合组分结合特异性来制备。例如，可分开地产生双特异性分子的各结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可将多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83)，和Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中描述的方法。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。

当结合特异性是抗体时，可通过两个重链的C端铰链区的巯基键合来缀合它们。在特别优选的实施方案中，修饰铰链区以在缀合前包含奇数个(优选1个)巯基残基。

可选择地，可在相同的载体中编码两个结合特异性，并且在相同的宿主细胞中进行表达和装配。该方法在双特异性是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab′)2或配体x Fab融合蛋白的情况下特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利5,260,203；美国专利5,455,030；美国专利4,881,175；美国专利5,132,405；美国专利5,091,513；美国专利5,476,786；美国专利5,013,653；美国专利5,258,498和美国专利5,482,858。

双特异性分子对它们的特异性靶的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、基于流式细胞术的单细胞分选(例如FACS分析)、生物测定(例如，生长抑制)或通过Western印迹测定来确认。每一种此类测定通常通过利用特异于目的复合物的标记试剂(例如，抗体)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可使用例如识别并且特异性结合抗体-VEGF复合物的酶联抗体或抗体片段检测抗体复合物。可选择地，可使用多种其他的免疫测定的任一种检测复合物。例如，可放射性标记抗体并且将其用于放射免疫测定(RIA)(参见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，March，1986，其通过引用合并入本文)。可通过这样的方法如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影检测放射性同位素。

在另一个方面，本发明表征了缀合至治疗性部分例如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素的人源化兔抗体或其片段。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂(cytotoxicagent)包括对细胞有害(例如，杀死细胞)的任意试剂。实例包括泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

可缀合至本发明的抗体的治疗性细胞毒素的其他优选的实例包括多卡米星、卡奇霉素(calicheamicin)、美坦辛和auristatin及其衍生物。卡奇霉素抗体缀合物的实例是可商购获得的(Mylotarg^TM；Wyeth-Ayerst)。

可使用可在本领域内获得的接头技术将细胞毒素缀合至本发明的抗体。已用于将细胞毒素缀合至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙类、硫醚、酯类、二硫化物类和包含肽的接头。可选择例如对溶酶体区室中的低pH导致的切割易感或对蛋白酶例如肿瘤组织中优先表达的蛋白酶例如组织蛋白酶类(例如，组织蛋白酶B、C、D)导致的切割易感的接头。

关于细胞毒素的类型、将治疗剂缀合至抗体的接头和方法的论述，也参见Saito，G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。

还可将本发明的抗体缀合至放射性同位素以产生也称为放射免疫缀合物的细胞毒性放射性药物。可被缀合至用于诊断或治疗的抗体的放射性同位素的实例包括但不限于碘¹³¹、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。本领域已建立了用于制备免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的实例是可商购获得的，包括Zevalin^TM(IDEC Pharmaceuticals)和Bexxar^TM(Corixa Pharmaceuticals)，并且可使用相似的方法，使用本发明的抗体来制备放射免疫缀合物。

本发明的抗体缀合物可用于改变给定的生物学应答，并且药物部分不被解释为限定于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物应答调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(″IL-1″)、白细胞介素-2(″IL-2″)、白细胞介素-6(″IL-6″)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其他生长因子。

用于将此类治疗性部分缀合至抗体的技术是熟知的，参见，例如，Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

在一个方面，本发明提供了含有用于治疗疾病的人源化兔抗体的药物制剂。术语″药物制剂″是指以这样的形式存在的制剂，所述形式允许抗体或抗体衍生物的生物学活性明确有效，并且所述制剂不包含对将给其施用所述制剂的受试者有毒的另外的成分。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可适当地给受试哺乳动物施用以提供有效剂量的使用的活性成分的那些。

“稳定的”制剂是其中的抗体或抗体衍生物在贮存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域内是可获得的并且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中。可在选择的温度下测量稳定性，并进行选择的时间。优选，制剂在室温(大约30℃)或在40℃下稳定至少1个月和/或在大约2-8℃下稳定至少1年，至少2年。此外，制剂优选在制剂的冷冻(至例如，-70℃)和解冻后稳定。

如果抗体或抗体衍生物在颜色和/或澄清度的目测检查时或如通过UV光散射或通过尺寸排阻层析所测量的，没有显示聚集、沉淀和/或变性的迹象，那么其在药物制剂中“保持其物理稳定性”。

如果在给定的时间上化学稳定性是使蛋白质被认为仍然保持其生物学活性(如下文中所定义的)的化学稳定性，那么抗体或抗体衍生物在药物制剂中“保持其化学稳定性”。可通过检测和定量蛋白质的化学改变的形式来估量化学稳定性。化学变化可包括大小改变(例如，剪切(clipping))，其可使用例如尺寸排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸附电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来评估。其他类型的化学变化包括可通过例如离子交换层析来评估的电荷变化(例如，由于脱酰胺作用而发生的)。

如果在给定的时间上抗体的生物学活性在制备药物制剂时所展示的生物学活性的大约10％内(在测定的误差内)(如在例如抗原结合测定中所测定的)，那么抗体或抗体衍生物在药物制剂中“保持其生物学活性”。在下文中详尽地阐述抗体的其他“生物学活性”测定。

“等渗的”意指目的制剂具有与人血液大体上相同的渗透压。等渗制剂通常具有大约250至350mOsm的渗透压。可使用例如蒸汽压或冰冷冻型渗透计(ice-freezing type osmometer)测量等渗性。

“多元醇”是具有多个羟基的物质，其包括糖(还原性和非还原性糖)、糖醇和糖酸。本文中优选的多元醇具有小于大约600kD(例如，在大约120至大约400kD的范围内)的分子量。“还原性糖”是包含可还原金属离子或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基共价反应的半缩醛基团的糖，“非还原性糖”是不具有还原性糖的此类性质的糖。还原性糖的实例是果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原性糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、苏糖醇、山梨糖醇和甘油是糖醇的实例。至于糖酸，其包括L-葡糖酸和其金属盐。在期望制剂是冷冻-融化稳定的情况下，多元醇优选是在冷冻温度(例如-20℃)下不结晶(结晶使得制剂中的抗体不稳定)的多元醇。非还原性糖例如蔗糖和海藻糖是本文中优选的多元醇，并且由于海藻糖的优良的溶液稳定性，海藻糖优于蔗糖。

如本文中使用的，“缓冲液”是指通过其酸碱共轭成分的作用抗pH变化的经缓冲的溶液。本发明的缓冲液具有范围在大约4.5至大约6.0、优选大约4.8至大约5.5内的pH；和最优选具有大约5.0的pH。可控制pH在该范围内的缓冲液的实例包括乙酸盐(例如，乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。在期望冷冻-融化稳定的制剂的情况下，缓冲液优选不是磷酸盐。

在药理学意义上，在本发明的背景中，抗体或抗体衍生物的“治疗有效量”是指在预防或治疗病症(所述抗体或抗体衍生物对于其的治疗是有效的)中有效的量。“疾病/病症”是可受益于使用抗体或抗体衍生物的治疗的任何病况。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述病症的那些病理学状况。

“防腐剂”是可包含在制剂中以显著减弱其中的细菌作用，从而有助于例如多用途制剂的产生的化合物。可能的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵(其中烷基是长链化合物的烷基苄基二甲基氯化铵的混合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇例如酚、丁基和苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间-甲酚。本文中最优选的防腐剂是苯甲醇。

本发明还提供了包含一种或多种抗体或抗体衍生物化合物以及至少一种生理上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。药物组合物可包含例如水、缓冲液(例如，中性缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、乙醇、矿物油、植物油、二甲基亚砜、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白质、佐剂、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽和/或防腐剂中的一种或多种。如上文中所指出的，其他活性成分可以(但不是必须)包含在本文提供的药物组合物中。

载体是可在施用给患者前与抗体或抗体衍生物结合的物质(通常用于控制化合物的稳定性或生物利用度)。用于此类制剂中的载体通常是生物相容性的，并且还可以是生物可降解的。载体包括例如单价或多价分子例如血清白蛋白(例如，人或牛)、卵白蛋白、肽、多聚赖氨酸和多糖例如氨基葡聚糖和聚酰胺胺(polyamidoamine)。载体还可包括固体支持材料例如包含例如聚乳酸聚乙醇酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素或葡聚糖的珠粒和微粒。载体可以以多种方式(包括共价结合(直接地或经由接头基团)、非共价相互作用或混合)携带化合物。

可配制药物组合物以用于任何适当的施用方式，包括例如局部、口服、经鼻、直肠或胃肠外施用。在某些实施方案中，以适合于口服使用的形式存在的组合物是优选的。此类形式包括例如丸剂、片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮剂、可分散粉剂或粒剂、乳剂、硬或软胶囊或糖浆剂或酏剂。在其他实施方案中，可将本文提供的组合物配制为冻干剂(lyophilizate)。本文中使用的术语胃肠外包括皮下、皮内、血管内(例如，静脉内)、肌内、经脊柱、颅内、鞘内和腹膜内注射以及任何相似的注射或输注技术。

可按照本领域内已知的用于制造药物组合物的任何方法制备意欲用于口服施用的组合物，其可包含一种或多种试剂例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂以提供吸引人且可口的制剂。片剂包含与生理上可接受的适合用于制造片剂的赋形剂混合的活性成分。此类赋形剂包括例如惰性稀释剂(例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、粒化剂和崩解剂(例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合剂(例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶)和润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石)。片剂可以是无包被的，或它们可利用在胃肠道中延迟崩解和吸收从而在更长的时期内提供持续作用的已知技术进行包被。例如，可使用时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于口服施用的制剂还可以以硬明胶胶囊(其中将活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合)的形式或以软明胶胶囊(其中将活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合)的形式提供。水性悬浮剂包含与适合用于制造水性悬浮剂的赋形剂混合的抗体或抗体衍生物。此类赋形剂包括混悬剂(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶(gum tragacanth)和阿拉伯胶)；和分散剂或湿润剂(例如，天然存在的磷脂例如卵磷脂、烯烃氧化物与脂肪酸的缩合物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合物例如十七乙烯基氧鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的缩合物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的缩合物例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。水性悬浮剂还可包含一种或多种防腐剂例如乙基或正丙基对羟基苯甲酸、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。可用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制糖浆剂和酏剂。此类制剂还可包含一种或多种缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂和/或着色剂。

可通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油例如液体石蜡中来配制油性悬浮剂。油性悬浮剂可包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂例如上述甜味剂和/或调味剂以提供可口的口服制剂。可通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存此类悬浮剂。

适合于通过加入水来制备水性悬浮剂的可分散粉剂和粒剂提供了与分散剂或湿润剂、混悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂和混悬剂是例如上文提及的试剂。还可存在另外的赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂。

药物组合物还可以以水包油乳剂的形式存在。油相可以是植物油(例如橄榄油或花生油)、矿物油(例如，液体石蜡)或其混合物。适当的乳化剂包括天然存在的胶(例如，阿拉伯胶和黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如，大豆、卵磷脂和从脂肪酸和己糖醇衍生的酯或部分酯)、酐类(例如，去水山梨糖醇单油酸酯)以及从脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯与环氧乙烷的缩合物(例如，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。乳剂还可包含一种或多种甜味剂和/或调味剂。

可将药物组合物配制为无菌注射水性或油性悬浮液，其中取决于所用的媒介物和浓度，将调节剂悬浮或溶解在媒介物中。还可按照现有技术，使用适当的分散剂、湿润剂和/或混悬剂例如上文提及的那些来配制这样的组合物。其中可使用的可接受的媒介物和溶剂是水、1，3-丁二醇、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油可用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何非刺激性的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，可将脂肪酸例如油酸用于制备可注射的组合物，并且可将佐剂例如局部麻醉药、防腐剂和/或缓冲剂溶解于媒介物中。

还可将药物组合物配制为持续释放制剂(即，在施用后进行调节剂的缓慢释放的制剂例如胶囊)。通常可使用熟知的技术制备此类制剂，并且可通过例如口服、直肠或皮下植入，或通过在期望的靶位置植入来施用所述制剂。用于此类制剂中的载体是生物相容性的，并且还可以是生物可降解的；优选地制剂提供相对恒定水平的调节剂释放。持续释放制剂中包含的抗体或抗体衍生物的量取决于例如植入的位置、释放的速率和预期的持续时间以及待治疗或预防的疾病/病症的性质。

通常以在体液(例如，血液、血浆、血清、CSF、滑液、淋巴、细胞间隙液、眼泪或尿)中获得足以可检测地结合靶例如VEGF以及预防或抑制此类靶介导的疾病/病症例如VEGF介导的疾病/病症的浓度的量施用本文中提供的抗体或抗体衍生物。如果剂量导致如本文中描述的可辨别的患者益处，则其被认为是有效的。优选全身性剂量的范围是大约0.1mg至大约140mg/千克体重/天(大约0.5mg至大约7g/患者/天)，且口服剂量通常为静脉内剂量的约5至20倍。可与载体材料组合以产生单个剂型的抗体或抗体衍生物的量将随治疗的宿主和具体的施用模式的变化而变化。剂量单位形式通常可包含大约1mg至大约500mg的活性成分。

可包装药物组合物以治疗响应抗例如VEGF的抗体或抗体衍生物的病症。包装的药物组合物可包括容器(其装有有效量的至少一种本文中所述的抗体或抗体衍生物)和说明书(例如，标签)(其说明包含的组合物将用于治疗响应一种抗体或抗体衍生物(在施用给患者后)的疾病/病症)。

还可化学修饰本发明的抗体或抗体衍生物。优选的修饰基团是聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚烯烃、polyalkenylene或聚氧烯烃聚合物或分支或不分支的多糖。此类效应物基团可增加抗体的体内半衰期。合成的聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物。特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。需要时可改变聚合物的大小，但其平均分子量通常在500Da至50000Da的范围内。对于其中抗体设计用于渗透组织的局部应用，聚合物的优选分子量是约5000Da。可将聚合物分子连接至抗体，特别是经由WO0194585中所述的共价连接的铰链肽连接至Fab片段重链的C末端。关于PEG部分的连接，参见“Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnological and Biomedical Applications”，1992，J.MiltonHarris(ed)，Plenum Press，New York和“Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”，1998，M.Aslam 和A.Dent，Grove Publishers，New York。

在如上所述制备目的抗体或抗体衍生物后，制备包含其的药物制剂。待配制的抗体未经历在前的冷冻干燥并且本文中的目的制剂是水性制剂。优选制剂中的抗体或抗体衍生物是抗体片段，例如scFv。通过考虑例如期望的剂量容积和施用模式来确定存在于制剂中的抗体的治疗有效量。大约0.1mg/ml至大约50mg/ml，优选大约0.5mg/ml至大约25mg/ml和最优选大约2mg/ml至大约10mg/ml是制剂中的示例性抗体浓度。

在pH缓冲剂中制备包含抗体或抗体衍生物的水性制剂。本发明的缓冲剂具有大约4.5至大约6.0，优选大约4.8至大约5.5的pH，最优选具有大约5.0的pH。可控制pH在该范围内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如，乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。缓冲剂的浓度可以是大约1mM至大约50mM，优选大约5mM至大约30mM，取决于例如缓冲剂和制剂的期望的等渗性。优选的缓冲剂是乙酸钠(大约10mM)，pH 5.0。

将可用作张力剂(tonicifier)和可稳定抗体的多元醇包含在制剂中。在优选实施方案中，制剂不包含紧张(tonicifying)量的盐例如氯化钠，因为这可引起抗体或抗体衍生物沉淀和/或可导致在低pH下的氧化作用。在优选实施方案中，多元醇是非还原性糖例如蔗糖或海藻糖。以可根据制剂的期望的等渗性而变化的量向制剂中加入多元醇。优选水性制剂是等渗的，在该情况下制剂中适当的多元醇浓度在例如大约1％至大约15％w/v的范围内，优选在大约2％至大约10％whv的范围内。然而，高渗或低渗制剂也可以是合适的。加入的多元醇的量还根据多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比较，可加入更低量的单糖(例如，甘露醇)。

还可向抗体或抗体衍生物制剂中加入表面活性剂。示例性表面活性剂包括非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。加入的表面活性剂的量是使其减少配制的抗体/抗体衍生物的聚集和/或使制剂中颗粒的形成降至最低和/或减少吸附的量。例如，表面活性剂可以以大约0.001％至大约0.5％，优选大约0.005％至大约0.2％和最优选大约0.01％至大约0.1％的量存在于制剂中。

在一个实施方案中，制剂包含上文中鉴定的试剂(即，抗体或抗体衍生物、缓冲剂、多元醇和表面活性剂)并且基本上不含一种或多种防腐剂，例如苯甲醇、苯酚、间-甲酚、氯丁醇和苄索氯铵。在另一个实施方案中，可在制剂中包含防腐剂，特别是在制剂为多剂量制剂的情况下。防腐剂的浓度可在大约0.1％至大约2％，最优选大约0.5％至大约1％的范围内。可在制剂中包含一种或多种其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂例如Remington′s Pharmaceutical Sciences第21版，Osol，A.Ed.(2006)中描述的试剂，只要其不会不利地影响期望的制剂特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度上对接受者无毒，并且包括：另外的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂例如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或形成盐的抗衡离子例如钠。

用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可通过在配制制剂之前或之后利用无菌滤膜进行过滤来容易地实现。

按照已知的方法，例如以推注的形式静脉内施用或通过在一段时间内的持续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径给需要使用所述抗体的治疗的哺乳动物优选人施用制剂。在优选实施方案中，通过静脉内施用给哺乳动物施用制剂。为此，可使用例如注射器或通过IV线注射制剂。

抗体的适当剂量(“治疗有效量”)将取决于例如待治疗的病症、疾病的严重度和进程、是为了预防目的还是为了治疗目的而施用抗体、以前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、使用的抗体类型以及主治医生的判断。适当地在一次或在一系列治疗中给患者施用抗体或抗体衍生物，并且可在诊断后任何时间给患者施用抗体或抗体衍生物。抗体或抗体衍生物还可作为单一治疗或与用于治疗所述病症的其他药物或治疗剂结合进行施用。

作为一般建议，施用的抗体或抗体衍生物的治疗有效量可在大约0.1至大约50mg/kg患者体重的范围内(无论通过一次还是多次施用)，且使用的抗体的常见范围为例如大约0.3至大约20mg/kg，更优选大约0.3至大约15mg/kg(每天施用一次)。然而，可以使用其他给药方案。可通过常规技术容易地监控该治疗的进展。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含容器的制品，所述容器装有本发明的药物制剂，优选水性制剂，并且任选地提供关于其使用的说明书。适当的容器包括例如瓶子、小瓶和注射器。容器可由多种材料例如塑料或玻璃制成。示例性容器是3-20cc的一次性玻璃小瓶。可选择地，对于多剂量制剂，容器可以是3-100cc的玻璃小瓶。容器装有制剂，并且在其上或与其结合的标签可标明使用指导。制品还可包括从商业和用户立场来看期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针、注射器和具有使用说明的产品说明书。

在某些优选实施方案中，制品包括本文中描述的或通过本文中描述的方法产生的冻干的免疫结合剂。

实施例

本公开内容还通过下列实施例来举例说明，所述实施例不应当解释为进一步限定。本申请中提及的所有图和所有参考资料、专利和公开的专利申请的内容以它们的全文通过引用明确地合并入本文。

材料和方法

一般而言，除非另外指出，否则本发明的实施使用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其是例如抗体技术)的常规技术和多肽制备的标准技术。参见，例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：APractical Approach(Practical Approach Series，169)，McCafferty，Ed.，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等人，John Wiley & Sons(1992)。用于将来自兔和其他非人单克隆抗体的CDR移植入选择的人抗体构架的方法在上文中进行了详细描述。此类移植实验的实例示于下文中。

为了更好地理解，命名为″min″的移植物是其中CDR被移植至构架1.4或其可变结构域的移植物，而称为″max″的移植物是其中CDR被移植至构架1.4或其可变结构域并且其中所述构架还包含与抗原相互作用的供体构架残基的移植物。

实施例1：rFW1.4的设计

1.1.一级序列分析和数据搜索

1.1.1.兔免疫球蛋白序列的收集

从不同的开源数据库(例如Kabat数据库和IMGT)收集兔成熟抗体和种系的可变结构域序列并且将其以单字母代码氨基酸序列的形式输入定制的数据库。为了进行完整的分析，我们只使用相应于V(可变)区的氨基酸部分。弃去KDB数据库中低于70％完整性或在构架区中包含多个未确定的残基的序列。也排除与数据库内的任何其他序列具有超过95％同一性的序列以在分析中避免随机嗓音。

1.1.2.兔序列的比对和编号

使用基于Needleman-Wunsch算法和Blossum矩阵的常规序列比对工具比对兔抗体序列。按照免疫球蛋白的可变结构域的AHo编号系统进行缺口的引入和残基位置的命名(Honegger和Pluckthun，2001)。还平行地使用Kabat编号方案，因为其是最广泛采用的用于编号抗体中的残基的标准。使用SUBIM程序分配Kabat编号。该程序分析抗体序列的可变区并且按照由Kabat和同事(Deret等人1995)建立的系统给序列编号。

按照基于序列可变性的最常用的Kabat定义进行构架和CDR区的界定。然而，CDR-H1命名是不同定义(包括AbM′s、kabat′s、通过分析一组3D复合物结构的抗体与抗原之间接触而产生的平均接触数据(MacCallum等人，1996)和基于结构环区域的定位的Chotia′s)之间的妥协(上述的和图1中显示的)。

1.1.3.残基位置的频率和保守性

使用一组423个兔序列(来自kabat数据库)分析氨基酸序列多样性。通过将在数据组中观察到的特定残基的次数除以序列的总数来计算成熟兔序列中每一个位置i的残基频率f(r)。使用辛普森指数(其考虑了不同氨基酸存在的数目以及各残基的相对丰度)计算各位置i的保守程度。

D = \frac{Σ_{i = 1}^{r} n (n - 1)}{N (N - 1)}

其中：N表示氨基酸的总数，r是存在于各位置处的不同氨基酸的数目以及n是特定氨基酸种类的残基的数目。

1.1.4.兔V区的谱系分析

使用系统发生分析工具研究兔库集(repertoire)。使用聚类和拓扑学算法对V区的氨基酸序列进行聚类。计算整个阵列的距离矩阵并且将其用作种系使用(germline usage)的指标。计算各聚类的共有序列并且鉴定最接近的兔种系序列对应物。还推算整个序列组的总体共有序列。

1.1.5.人亚组的分配

对于不同聚类的各兔代表性序列，使用序列分析算法和分类方法的EXCEL工具(Knappik等人，2000)基于人抗体库集的分析鉴定最同源的人亚组。

1.2.人受体构架的设计

利用来自上述序列分析的兔库集的蓝图，鉴定构架中通常参与兔CDR的定位的残基。在相对于兔库集和各个聚类具有较高的同源性的构架中，具有良好生物物理性质的一个构架选自完全人序列的库。用作受体构架的所选择的构架属于可变轻链亚组κ1和可变重链亚组III(相应地具有ESBATech′s ID KI 27，a43)。已使用称为“质量控制”系统的基于酵母的筛选方法(Auf der Maur等人，2004)通过筛选人脾scFv文库，鉴定了该稳定且可溶的抗体构架，并且将其命名为“FW1.4”。虽然稳定且可溶的构架序列FW1.4展示高同源性，但其不是可获得的最同源的序列。将鉴定的残基整合入所述受体构架以产生rFW1.4。

利用关于兔抗体的氨基酸序列多样性、种系使用和结构特征的信息，我们就在新型人构架中保持CDR构象所需的残基位置的相容性分析了FW1.4。我们就下列特征的相容性检查了FW1.4的可变区：

i.作为环结构的经典序列的一部分的残基。

ii.位于VL/VH界面的构架残基

iii.在CDR正下方的残基的平台

iv.上核心残基和下核心残基

v.确定亚型的构架残基。

1.3.兔CDR的移植

通过简单地将来自一个抗体的CDR序列(按照上述定义)与FW1.4或rFW1.4的构架序列组合来产生移植物。鉴定潜在地参与结合的残基。对于每一个兔可变结构域序列，鉴定最接近的兔种系对应物。如果不能确定最接近的种系，那么将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的兔序列的共有序列相比较。罕见构架残基被认为可能是体细胞高突变的结果，从而在结合中起作用。因此，将此类残基移植至受体构架上。

1.4结果

通过在结构、氨基酸序列多样性和种系使用方面分析兔抗体库集，在FW1.4的轻链中发现了5个经改造维持兔CDR的环构象的残基位置。这些位置在兔抗体中是高度保守的。根据兔库集推导出这5个位置的共有残基并且将其引入人受体构架1.4。通过改造这些保守位置，所述构架实际上变得与任何兔CDR的所有6个互补决定区(CDR)相容。包含不同兔CDR的rFW1.4，与野生型单链相反，良好地表达和良好地产生。产生通过组合该构架与兔CDR而衍生的16个成员，并进行详细地表征，其显示功能性。

实施例2：B细胞筛选系统

为了选择通过其B细胞受体(BCR)结合目的靶的B细胞，在ESBATech建立了基于FACS(基于流式细胞术的单细胞分选)的筛选系统。一个靶是例如可溶性蛋白质，即用荧光染料(PE和PerCP)标记的单链抗体(ESBA903)。从用重组靶免疫的兔的脾制备淋巴细胞悬浮液。然后将细胞与PE和PerCP标记的ESBA903以及与特异于IgG(APC-标记的)或IgM(FITC标记的)的抗体一起温育。在96孔板中分选在其表面上表达IgG而非IgM的ESBA903阳性B细胞(图3；表2)。通过胸腺瘤辅助细胞系(EL4-B5：参见Zubler等人，1985，J.Immunol，134(6)：3662-3668)，选择的B细胞增殖、分化成浆细胞并且分泌抗体。通过ELISA和Biacore测量确认此类IgG对于靶的亲和力。7个选择的克隆的动力学参数描述于表1中。来自大约200个分选的细胞的混合物的这些克隆显示低纳摩尔至皮摩尔范围内的结合亲和力。最后，从6个目的克隆分离mRNA，并且将CDR移植在单链构架FW1.4上。

表1：7个B细胞培养物上清液的动力学值。

实施例3：用抗TNFα抗体包被的珠粒与表达膜结合TNFα的CHO细胞之间的相互作用的检测。

为了评估流式细胞仪液流的高压是否破坏两个细胞之间的非共价结合，进行下列实验。将用膜结合TNFα稳定转染的CHO细胞(B-220细胞)与用PE-标记的抗TNFα抗体包被的珠粒一起温育。在该设置中，珠粒模拟记忆B细胞(它们具有大致相同的大小)。作为阴性对照，使用未转染的CHO细胞，以及用APC标记的不相关抗体(抗-CD19)包被的珠粒。在搅拌的条件下在4℃下温育2小时后，通过FACS(使用130um喷嘴)分析细胞-珠粒悬浮液。图4显示，抗TNFα珠粒与TNFα转染的CHO细胞之间的特异性结合是可使用FACS明确地检测到的。事实上，在该样品(上图)中，大约三分之二的珠粒结合至细胞(585个结合的对267个未结合的)。相反，在对照样品(中图和下图)中，几乎没有珠粒结合CHO细胞。此外，将两个珠粒群体(抗TNFα-PE和抗CD19-APC)与TNFα转染的CHO细胞混合在一起。图5和表4显示，大约一半的抗TNFα珠粒结合CHO细胞，然而，绝大部分抗CD 19珠粒仍未结合。各样品中结合细胞的珠粒的百分数详细地示于表5中。因此，证明了，可使用流式细胞术特异性地选择通过其B细胞受体结合完整膜靶蛋白的单个B细胞。

表3a：分选统计数据(也参见图4a)

群体	#事件	％亲本	％总数
				所有事件	10.000	###	100,0
P1	9.692	96,9	96,9
				P3	585	6,0	5,9
P4	1	0,0	0,0
				P2	267	2,7	2,7

表3b：分选统计数据(也参见图4b)

群体	#事件	％亲本	％总数
				所有事件	10.000	###	100,0
P1	9.399	94,0	94,0
				P3	3	0,0	0,0
P4	6	0,1	0,1
				P2	550	5,6	5,6

表3c：分选统计数据(也参见图4c)

群体	#事件	％亲本	％总数
				所有事件	10.000	###	100,0
P1	9.001	90,0	90,0
				P3	13	0,1	0,1
P4	7	0,1	0,1
				P2	811	8,1	8,1

表4：分选统计数据(也参见图5)

群体	#事件	％亲本	％总数
				所有事件	10.000	###	100,0
P1	9.096	91,0	91,0
				P3	401	4,4	4,0
P4	2	0,0	0,0
				P2	856	8,6	8,6

表5：各样品中结合CHO细胞的珠粒的百分数

实施例4：抗TNFα兔供体抗体的CDR移植和功能性人源化

选择4个抗TNFα兔抗体″Rabmab″(EPI-1、EPI-15、EP-34、EP-35和EP-42)用于CDR移植。如说明书部分所概述的进行用于人源化兔供体抗体的CDR移植、人源化和初步表征的一般实验方案。与使用与非人供体抗体共有最大序列同源性的人抗体受体构架的常规人源化方法不同，将兔CDR移植入使用质量控制测定(WO0148017)就期望的功能性质(溶解性和稳定性)预先选择的人构架FW1.4。这些稳定和可溶的构架序列展示与RabMab的高同源性。

使用本文中描述的方法针对每一个RabMab产生CDR移植物。在″Min″移植物中，只将兔CDR从兔供体抗体的VL和VH结构域移植至人受体构架FW1.4。″Max″移植物是指将兔CDR移植至rFW1.4。

如下产生本文中描述和表征的scFv。通过SEQ ID NO.8的接头将人源化的VL序列连接至人源化的VH序列以产生下列方向的scFv：NH2-VL-接头-VH-COOH。在许多情况下，由服务提供商Entelechon GmbH(www.entelechon.com)从头合成编码各个scFv的DNA序列。通过分别在scFv DNA序列的5′和3′末端上引入的NcoI和HindIII限制性位点将所得的DNA插入物克隆入细菌表达载体pGMP002。BamHI限制性位点位于VL结构域与VH结构域的DNA序列之间。在一些情况下，不从头合成编码scFv的DNA，而通过结构域改组来克隆表达scFv的构建体。因此，切取VL结构域并且通过NcoI和BamHI限制性位点将其引入新构建体，通过BamHI和HindIII限制性位点将VH结构域引入新构建体。在其他情况下，使用现有技术组装PCR法将点突变引入VH和/或VL结构域。GMP002的克隆描述于WO2008006235的实施例1中。与WO2008006235的实施例1中对于ESBA105的描述类似，产生scFv。

表3描述了4个兔单克隆(EP6，EP19，EP34，EP35和EP43)和其CDR移植的变体的详细表征数据的概述。虽然CDR移植物在BIACore结合测定和L929，TNFα介导的细胞毒性测定中展示了广泛的活性，但4个最大(″max″)移植物中的3个展示了治疗相关活性。EP43max在细胞毒性测定中展示了最有利的结合亲和力(0.25nM的Kd)和优良的EC50。该数据显示FW1.4(SEQ ID No：1和2)是用于移植兔CDR的示例性可溶且稳定的人受体构架区。

潜能测定

在L929TNFα介导的细胞毒性测定中估量抗TNFα结合剂的中和活性。用重组人TNF(hTNF)诱导用放线菌素处理的小鼠L929成纤维细胞的毒性。在1000pg/ml的TNF浓度上检测到90％的最大hTNF诱导的细胞毒性。将所有L929细胞培养在具有酚红，具有L-谷氨酰胺培养基、补充有胎牛血清(10％v/v)的RPMI 1640中。在不含酚红的RPMI 1640和5％胎牛血清中估量抗TNFa结合剂的中和活性。在1000pg/ml hTNF存在的情况下，向L929细胞中加入不同浓度(0-374ng/mL)的抗TNF结合剂以测定拮抗作用达到半最大抑制(EC50％)时所处的浓度。用具有可变斜率的非线性S形回归拟合剂量响应曲线并且计算EC50。

抗TNF scFv的Biacore结合分析

为了测量结合亲和力，使用NTA传感器芯片和带His标签的TNF(在ESBATech产生的)来应用使用BIAcore^TM-T100的表面等离子体共振测量。NTA传感器芯片的表面由预先固定有次氮基三乙酸(NTA)(其经由Ni2+NTA螯合作用捕获组氨酸标记的分子)的羧甲基化的葡聚糖基质组成。人TNFa N-his三聚体(5nM)通过其N末端的his-标签被镍捕获，以范围在30nM至0.014nM之间的几个浓度(3倍系列稀释梯度)注射ESBA105(分析物)。在再生步骤中，洗除由镍、配体和分析物形成的复合物。对于不同样品，允许使用相同的再生条件。通过表面等离子体共振(SPR)技术产生响应信号并且将其测量为共振单位(RU)。所有测量在25℃下进行。在进行内联(in-line)参照室修正，然后扣除缓冲液样品后产生每一个抗TNF scFv样品的传感图。使用一对一Langmuir结合模型利用BIAcore T100评估软件版本1.1计算表观解离速率常数(k_d)、表观结合速率常数(k_a)和表观解离平衡常数(K_D)。

表3：TNFα的第二代结合剂

实施例5：抗VEGF兔供体抗体的CDR移植和功能性人源化

选择8个抗VEGF Rabmab(375，435，509，511，534，567，578和610)用于CDR移植。与使用与非人供体抗体共有最大序列同源性的人抗体受体构架的常规人源化方法不同，将兔CDR移植入使用质量控制测定(WO0148017)就期望的功能性质(溶解性和稳定性)预先选择的人受体构架FW1.4(SEQ ID No：1和2)。

使用本文中描述的方法(参见实施例4)针对每一个RabMab(兔抗体)产生许多CDR移植物。″Min″移植物包含最小移植物，其中只将兔CDR从兔供体抗体的VL和VH结构域移植至人受体构架FW1.4(SEQID No：1)。″Max″移植物不仅包含VL和VH的兔CDR而且还包含来自兔供体的经预测对于抗原结合非常重要的一些另外的构架残基。在578max的情况下，FW1.4的重链可变结构域构架区在Kabat位置23H，49H，73H，78H和94H处具有另外的氨基酸改变。

表4显示关于″Min″和″Max″CDR移植的变体的详细表征数据的概述。描述了使用VEGFR竞争性ELISA和/或HUVEC测定测量的它们作为VEGF抑制剂的潜能。数据显示，FW1.4(SEQ ID No：1和2)是用于移植兔CDR的示例性可溶且稳定的人受体构架区。

抗VEGF scFv的Biacore结合分析

测定scFv的Biacore结合能力，利用BIAcore^TM-T100使用示例性表面等离子体共振法测量结合亲和力。在本实施例和后面的实施例中，就此类scFv候选物的结合而进行测试的VEGF蛋白包括纯化的大肠杆菌表达的重组人VEGF₁₆₅(PeproTech EC Ltd.)、重组人VEGF₁₂₁(PeproTech EC Ltd.)、重组人VEGF₁₁₀(ESBATech AG)、重组小鼠VEGF₁₆₄(PeproTech EC Ltd.)、重组大鼠VEGF₁₆₄(Biovision)、重组兔VEGF₁₁₀(ESBATech AG)和重组人PLGF(PeproTech EC Ltd.)。关于表面等离子体共振实验，按照制造商的说明书用盐酸N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM4，GE Healthcare)。使用标准胺-偶联方法，将上文中举例说明的6个不同的VEGF形式的每一个形式偶联至CM4传感器芯片上的4个不同的流动池之一。在偶联和封闭后，使用这些固定的VEGF分子获得的响应的范围是大约250-500响应单位(RU)(对于hVEGF₁₆₅)、大约200RU(对于hVEGF₁₁₀、hVEGF₁₂₁、鼠VEGF₁₆₄、大鼠VEGF₁₆₄和兔VEGF₁₁₀)和大约400RU(对于PLGF)。除了在封闭之前不固定蛋白质外，类似地处理各芯片的第4流动池，并且将该流动池用作内联参照。将不同浓度的在HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)中的抗VEGF scFv(例如90nM，30nM，10nM，3.33nM，1.11nM，0.37nM，0.12nM和0.04nM)以30μl/分钟的流速注射入流动池，进行5分钟。让抗VEGF scFv与CM4芯片上的VEGF在25℃下解离10分钟。在进行内联参照池修正，然后扣除缓冲液样品后，产生各抗VEGF scFv样品的传感图。使用一对一Langmuir结合模型(one-to-one Langmuir binding model)利用BIAcore T100评估软件版本1.1计算表观解离速率常数(k_d)、表观结合速率常数(k_a)和表观解离平衡常数(K_D)。

VEGF抑制的HUVEC测定

HUVEC测定是测量公开的抗VEGF scFv候选物作为VEGF抑制剂的潜能的方法。

使用从几个供体汇集的第2代至第14代的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(Promocell)。将细胞以1000个细胞/孔接种于50μl完全内皮细胞生长培养基(ECGM)(Promocell)，该培养基含有0.4％ECGS/H，2％胎牛血清，0.1ng/ml表皮生长因子，1μg/ml氢化可的松，1ng/ml碱性成纤维细胞因子和1％青霉素/链霉素(Gibco)。7至8小时后，向细胞中加入50μl饥饿培养基(不含含有0.5％热灭活的FCS和1％青霉素/链霉素的补充物的ECGM)，将细胞饥饿15至16小时。在饥饿培养基中制备抗VEGF scFv的3倍系列稀释物(0.023-150nM)和下列之一：重组人VEGF₁₆₅(0.08nM)、重组小鼠VEGF₁₆₄(0.08nM)或重组大鼠VEGF₁₆₄(0.3nM)，并且在室温下预温育30-60分钟。不同浓度的VEGF用于补偿它们的不同的相对生物学活性。使用刺激次最大VEGF诱导的增殖的浓度(EC₉₀)。向含有HUVEC悬浮液的96孔组织培养板中加入100μl混合物，并于37℃/5％CO₂潮湿的培养箱中温育4天。在加入20μl/孔的WST-1细胞增殖试剂(Roche)后，使用Sunrise酶标仪(Tecan)通过测量450nm处的吸光度(620nm用作参照波长)来估量HUVEC的增殖。使用4参数逻辑曲线拟合来分析数据，根据抑制曲线推算出抑制50％的HUVEC增殖所需的抗VEGF scFv的浓度(EC₅₀)。

表4

等同物

根据前述说明，本发明的许多变化和备选实施方案对于本领域技术人员来说是显然的。因此，本说明书被解释为仅示例性的并且是用于教导本领域技术人员的用于进行本发明的最佳模式。结构的细节可显著改变而不背离本发明的精神，并且保留落在所附权利要求的范围内的所有变化的排他性使用。本发明意欲只限定至所附权利要求和适用的法律法规要求的程度。

本说明书中引用的所有文献和类似材料包括专利、专利申请、文章、书籍、论文、学术论文、网页、图和/或附件，无论此类文献和类似材料的形式如何，都以其全文通过引用明确地合并入本文。如果一个或多个合并的文献和类似材料与本申请不同或相矛盾，包括定义的术语、术语的用法、描述的技术等，那么以本申请为准。

Claims

1.特异于期望的抗原的免疫结合剂，其包含

(i)兔类动物的可变轻链CDR；和

(ii)与SEQ ID NO.4具有至少50％的同一性的人可变重链构架。

2.权利要求1的免疫结合剂受体构架，其中所述可变重链构架选自SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6。

3.前述权利要求的任一项的免疫结合剂受体构架，其还包含与SEQ ID NO.2具有至少85％的同一性的可变轻链构架。

4.权利要求3的免疫结合剂受体构架，其在轻链可变构架的位置87处(AHo编号)包含苏氨酸(T)。

5.前述权利要求的任一项的免疫结合剂受体构架，其包含通过接头特别是SEQ ID NO.8的接头连接的可变重链构架和可变轻链构架。

6.前述权利要求的任一项的免疫结合剂受体构架，其包含与SEQID NO.3，SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7具有至少70％的同一性的构架，特别是包含或为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7的构架。

7.人或人源化的免疫结合剂可变重链受体构架，其包含选自位置24处的苏氨酸(T)、位置25处的缬氨酸(V)、位置56处的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置82处的赖氨酸(K)、位置84处的苏氨酸(T)、位置89处的缬氨酸(V)和位置108处的精氨酸(R)(AHo编号)的至少3个氨基酸。

8.前述权利要求的任一项的免疫结合剂受体构架，其中用亲水性氨基酸置换位置12，103和/或144(AHo编号)处的氨基酸。

9.权利要求8的免疫结合剂受体构架，其在重链构架中具有(AHo编号)

(a)位置12处的丝氨酸(S)，

(b)位置103处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)和/或

(c)位置144处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。

10.前述权利要求的任一项的免疫结合剂受体构架，其在可变轻链构架(AHo编号)中具有位置1处的谷氨酸(E)、位置3处的缬氨酸(V)、位置4处的亮氨酸(L)、位置10处的丝氨酸(S)、位置47处的精氨酸(R)、位置57处的丝氨酸(S)、位置91处的苯丙氨酸(F)和/或位置103处的缬氨酸(V)。

11.前述权利要求的任一项的免疫结合剂受体构架，其还包含来自供体免疫结合剂，特别是哺乳动物免疫结合剂，优选兔免疫结合剂的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。

12.权利要求11的免疫结合剂受体构架，其还包含参与抗原结合的供体构架残基。

13.前述权利要求的任一项的免疫结合剂受体构架，其还包含可变重链的位置141处(AHo编号)的甘氨酸(G)。

14.权利要求1至13的任一项的免疫结合剂受体构架用于兔CDR的移植的用途。

15.包含权利要求1至13的任一项的免疫结合剂受体构架的免疫结合剂。

16.权利要求15的免疫结合剂，其为scFv抗体。

17.权利要求15至16的任一项的免疫结合剂，其还包含一个或多个连接的分子，特别是治疗剂例如细胞毒性剂、细胞因子、趋化因子、生长因子或其他信号转导分子，成像剂或第二蛋白质，特别是转录激活因子或DNA结合结构域。

18.权利要求15至17的任一项的免疫结合剂在诊断应用、治疗应用、靶标确认或基因治疗中的用途。

19.编码权利要求1至13的任一项的免疫结合剂受体构架或权利要求15至17的任一项的免疫结合剂的核酸，特别是分离的核酸。

20.包含权利要求19的核酸的载体。

21.包含权利要求20的载体的宿主细胞。

22.权利要求19的核酸或权利要求20的载体在基因治疗中的用途。

23.包含权利要求1至13的任一项的免疫结合剂受体构架、权利要求15至17的任一项的免疫结合剂、权利要求19的核酸或权利要求20的载体的组合物。

24.人源化兔免疫结合剂的方法，所述兔免疫结合剂包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，所述方法包括：

(i)将由CDR H1、CDR H2和CDR H3序列组成的组中的至少一个重链CDR移植入与SEQ ID NO：1具有至少50％的同一性的人重链受体构架，和/或

(ii)将由CDR L1、CDR L2和CDR L3序列组成的组中的至少一个轻链CDR移植入与SEQ ID NO：2具有至少50％的同一性的人轻链受体构架。

25.权利要求24的方法，其中

(i)人重链构架包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的构架氨基酸序列；和

(ii)人轻链构架包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9的构架氨基酸序列。

26.权利要求24或25的方法，其还包括用参与抗原结合的兔免疫结合剂的构架残基置换构架残基。

27.权利要求24至26的任一项的方法，其还包括用在重链氨基酸位置12，103和144(AHo编号)中的至少一个位置处的置换来置换重链受体构架的构架残基的步骤，特别是用亲水性氨基酸进行置换，优选置换选自：(a)位置12处的丝氨酸(S)；(b)位置103处的苏氨酸(T)和(c)位置144处的苏氨酸(T)。

28.权利要求24至27的任一项的方法，其还包括用在根据AHo编号系统的轻链可变区的位置1，3，4，10，47，57，91和103中的至少一个位置处的增强稳定性的置换，特别是用选自下列的置换来置换轻链受体构架的构架残基的步骤：(a)位置1处的谷氨酸(E)、(b)位置3处的缬氨酸(V)、(c)位置4处的亮氨酸(L)、(d)位置10处的丝氨酸(S)、(e)位置47处的精氨酸(R)、(e)位置57处的丝氨酸(S)、(f)位置91处的苯丙氨酸(F)和(g)位置103处的缬氨酸(V)。

29.根据权利要求24至28的任一项的方法人源化的免疫结合剂。

30.权利要求29的免疫结合剂，其中靶抗原是VEGF或TNF 。

31.权利要求24至28的任一项的方法，其中所述方法还包括按照下列步骤鉴定通过B细胞产生的抗体可变结构域的供体CDR：

a)将兔B细胞与靶抗原一起温育；

b)选择结合靶抗原的那些B细胞；和

c)鉴定由B细胞产生的抗体可变结构域的CDR。

32.权利要求31的方法，其中所述B细胞分离自用所述靶抗原免疫的兔，优选通过DNA疫苗接种进行免疫。

33.权利要求31或32的任一项的方法，其中对所述B细胞和靶抗原进行差异染色，然后通过基于流式细胞术的单细胞分选来阳性选择两种染色的共发生。

34.权利要求31至33的任一项的方法，其中所述靶抗原是可溶性蛋白质。

35.权利要求31至33的任一项的方法，其中所述靶抗原在细胞的表面上表达，特别地其中所述靶抗原是跨膜蛋白，特别是多次跨膜蛋白。

36.权利要求35的方法，其中通过用细胞内荧光染料染色表达靶抗原的细胞来间接染色靶抗原。

37.权利要求31至36的任一项的方法，其中用一种或多种特异于B细胞表面标志物的经标记的抗体染色B细胞。

38.权利要求31至37的任一项的方法，其中用标记的抗IgG抗体染色B细胞。

39.权利要求38的方法，其中用标记的抗IgG抗体和用差异标记的抗IgM抗体染色B细胞。

40.权利要求39的方法，其中阴性地选择用标记的抗IgM抗体染色的所述B细胞。

41.权利要求31至40的任一项的方法，其还包括培养权利要求31的步骤b)中选择的所述B细胞的步骤，以便所产生的抗体分泌入培养基中，特别是在辅助细胞系存在的情况下。

42.权利要求41的任一项的方法，其还包括就对靶抗原的特异性结合测试所述分泌的抗体的步骤。

43.权利要求42的方法，其中扩增，特别地通过RT-PCR扩增所述抗体的CDR，然后将其移植入受体构架以产生随后就对靶抗原的特异性结合进行测试的免疫结合剂。

44.包含与Seq.ID NO.1具有至少90％的同一性的序列和/或与SEQ ID NO.2具有至少85％的同一性的序列的免疫结合剂受体构架用于兔CDR的移植的用途。

45.权利要求44的用途，其中所述构架包含通过接头，特别地通过具有SEQ ID NO.8的接头连接的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。