RU2460540C2 - Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk) - Google Patents
Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460540C2 RU2460540C2 RU2008146922/10A RU2008146922A RU2460540C2 RU 2460540 C2 RU2460540 C2 RU 2460540C2 RU 2008146922/10 A RU2008146922/10 A RU 2008146922/10A RU 2008146922 A RU2008146922 A RU 2008146922A RU 2460540 C2 RU2460540 C2 RU 2460540C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- alk
- seq
- sequence
- variable region
- Prior art date
Links
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 title description 3
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 title 1
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 claims abstract description 177
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 73
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 72
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 55
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000051965 human ALK Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 47
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 13
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 8
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 6
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims 5
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims 1
- 206010024612 Lipoma Diseases 0.000 claims 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 claims 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims 1
- 101710168331 ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 abstract description 175
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 51
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 51
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 51
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 51
- 102000005162 pleiotrophin Human genes 0.000 description 51
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 14
- 108010025568 Nucleophosmin Proteins 0.000 description 12
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 102100022678 Nucleophosmin Human genes 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 101000956807 Homo sapiens Leukocyte tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 208000032004 Large-Cell Anaplastic Lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 102100038420 Leukocyte tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 5
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- 101150023956 ALK gene Proteins 0.000 description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N Amitrole Chemical compound NC1=NC=NN1 KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 3
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 3
- 102100035108 High affinity nerve growth factor receptor Human genes 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 3
- -1 PDGF Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 3
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 102000006452 Class 5 Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108010044213 Class 5 Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 2
- NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N Meprobamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(N)=O NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030335 Midkine Human genes 0.000 description 2
- 108010092801 Midkine Proteins 0.000 description 2
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000772 Neuropilin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000003698 Syndecan-3 Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 108091007169 meprins Proteins 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 108010002164 tyrosine receptor Proteins 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229940122531 Anaplastic lymphoma kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000852815 Homo sapiens Insulin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000621344 Homo sapiens Protein Wnt-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000799194 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase receptor R3 Proteins 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 101100323015 Mus musculus Alk gene Proteins 0.000 description 1
- 101100021974 Mus musculus Ltk gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 206010034719 Personality change Diseases 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100022805 Protein Wnt-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 102100034090 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase mu Human genes 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004584 Somatomedin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017622 Somatomedin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108090000068 Syndecan-3 Proteins 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000005068 bladder tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 102000047644 human ACVRL1 Human genes 0.000 description 1
- 102000047882 human INSR Human genes 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 208000013433 lightheadedness Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
- C12Y207/10001—Receptor protein-tyrosine kinase (2.7.10.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии и представляет собой варианты антител, связывающих белок киназы анапластической лимфомы (ALK) человека. Также представлены: варианты антител с радиоактивной меткой или токсином; последовательность ДНК, кодирующая антитело; экспрессионный вектор, содержащий ДНК-последовательность; клетка-хозяин, трансформированная вектором; способ получения антитела посредством культивирования клетки, а также применение антитела для производства лекарственного средства для лечения рака или опухолей. Изобретение можно эффективно использовать для лечения опухоли или рака. 6 н. и 26 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Заявка заявляет приоритет предварительной заявки US №60/795831, зарегистрированной 28 апреля 2006 г., все содержание которой включено сюда посредством ссылки.
Содержание всех патентов, патентных заявок и ссылок, процитированных по ходу настоящей заявки, включено сюда полностью посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителу, специфичному к ALK человека (киназе анапластической лимфомы), в частности к scFv, к кодирующей его последовательности нуклеиновой кислоты, его получению и применению в качестве медикамента или с диагностическими целями. Упомянутое антитело применимо для местного лечения опухолей или рака, в частности глиобластомы.
Уровень техники
ALK (киназа анапластической лимфомы, CD246) является членом семейства рецепторов тирозинкиназы (RTK). Как типичный представитель этого семейства она является трансмембранным белком типа I, в основном состоящим из трех доменов: внеклеточного домена, связывающего лиганд (аминокислотные остатки 19-1038), который содержит домен LDL-рецептора класса А и два домена МАМ (МАМ: меприн, А5 антиген протеиновая тирозинфосфатаза µ), трансмембранного домена (аминокислотные остатки 1039-1059) и цитоплазматического домена (аминокислотные остатки 1060-1620), содержащего домен тирозинкиназы. На N-конце образующегося белка присутствует сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-18), который отщепляется при секреции.
Полноцепочечные ALK мыши и человека были клонированы в 1997 г. двумя независимыми группами (Iwahara 1997; Morris 1997). ALK обладает высоким сходством с RTK, называемым лейкоцитарной тирозинкиназой (LTK) и принадлежит сверхсемейству рецепторов инсулина. ALK проявляет 57% идентичности аминокислотной последовательности и 71% сходства аминокислотной последовательности с LTK в районах их перекрывания (Morris 2001). ALK обладает высокой степенью N-гликозилирования и содержит 21 предполагаемый участок N-гликозилирования. Аминокислотные остатки от 687 до 1034 обладают значительным сходством (50% идентичности) с LTK. Однако проксимальная N-концу последовательность из 686 аминокислот не демонстрирует никакой гомологии ни с одним известным белком за исключением очень короткой последовательности, обнаруженной также в рецепторе LDL (Duyster 2001/SWISSPROT). Дополнительно, она содержит два домена МАМ в виде аминокислотных последовательностей 264-427 и 478-636 (меприн, А5 антиген протеиновая тирозинфосфатаза µ). Считается, что эти домены обладают функцией адгезии, поскольку они широко распространены среди различных белков адгезии, задействованных в межклеточном взаимодействии (De Juan 2002). Дополнительно, имеется участок связывания предполагаемых лигандов ALK, соответствующий аминокислотной последовательности 396-406 (Stoica 2001; см. ниже). Аминокислотная последовательность киназного домена мышиной ALK демонстрирует 98% идентичность аминокислотной последовательности человеческой ALK, 78% идентичность аминокислотной последовательности мышиной LTK, 52% идентичность аминокислотной последовательности мышиной ros, 47% идентичность аминокислотной последовательности рецептору инсулиноподобного ростового фактора человека и 46% идентичность аминокислотной последовательности инсулинового рецептора человека (Iwahara 1997; Ladanyi 2000). Никакие сплайсинг-варианты ALK не были описаны до сих пор. Однако ALK часто связывают с хромосомными транслокациями (см. ниже).
Ген ALK занимает около 315 кб и включает 16 экзонов. Большая часть гена состоит из двух больших интронов, охватывающих около 170 кб. Транскрипт ALK составляет 6,5 кб в длину (Kutok 2002). Согласно Morris кДНК составляет 6226 пар оснований (Morris 2001).
Экспрессия ALK у мышей начинается во время эмбриогенеза примерно на стадии развития Е11, сохраняется в неонатальном периоде развития, где он экспрессируется в нервной системе. У взрослых его физиологическая экспрессия ограничена определенными нейрональными районами ЦНС (нервными и глиальными клетками и, вероятно, эндотелиальными клетками) на низком уровне (Morris 1997; Duyster 2001; Stoica 2001). Действительно, распространенность ALK в постнатальном периоде падает (Morris 2001). На основе образца (распределения) его экспрессии сделано предположение о роли рецептора в развитии головного мозга (Duyster 2001). Ограниченная нервной системой экспрессия ALK предполагает, что он служит рецептором нейротрофных факторов (см. далее). В согласии с этим образец его экспрессии перекрывается с генами, кодирующими семейство нейротрофиновых рецепторов TRK (Morris 2001). Однако мыши, несущие нокаут ALK, не проявляют какого-либо определенного фенотипа (неопубликованные данные), что может быть обусловлено некоторой функциональной избыточностью членов семейства TRK или других нейротрофиновых рецепторов. Следует отметить, что гематопоэтические ткани не показывают никакого различимого уровня экспрессии ALK (см. ниже) (Morris 2001).
Недавно описаны два потенциальных лиганда ALK «плейотрофин» (PTN) и «мидкин» (МК) (Stoica 2001; Duyster 2001; Stoica 2002). Взаимодействие между PTN и ALK идентифицировано с помощью очищенного белка плейотрофина человека для скрининга пептидной библиотеки фагового дисплея. С помощью такого способа была идентифицирована последовательность, присутствующая во внеклеточном домене ALK (аминокислотные остатки 396-406). Важно, что эта последовательность не является общей с LTK, являющейся RTK наиболее близкородственной ALK. Этот район связывания лиганда также является консервативным у потенциального гомолога ALK у Drosophila (Loren 2001). ALK быстро фосфорилируется при связывании PTN (Bowden 2002). Дополнительно, показано, что ALK стимулируется плейотрофином в культуре клеток. Это делает взаимодействие плейотрофина с ALK особенно интересным в свете участия плейотрофина в патологических процессах (Stoica 2001). Клеточные линии, лишенные экспрессии ALK, неспособны проявлять ростовой ответ на плейотрофин и vice versa (Stoica 2001). In vivo повышенные уровни плейотрофина показаны в сыворотке крови больных, страдающих различными солидными опухолями, и исследования на животных указывают на вклад плейотрофина в рост опухолей (Stoica 2002). Роль PTN в качестве лимитирующего скорость ангиогенного фактора при росте опухолей хорошо установлена на животных моделях (Choudhuri 1997). В 1996 г. Czubayko et al. (Czubayko 1996) показали важность PTN в ангиогенезе опухолей при предотвращении апоптоза и при метастазах путем модуляции уровней PTN с помощью направленного применения рибозимов. Уровни PTN в сыворотке крови мышей показали четкую корреляцию с размером опухолей. PTN играет значительную роль в ряде наиболее агрессивных типов рака человека, таких как меланома и рак поджелудочной железы, предоставляя таким образом интересные перспективы для возможных дальнейших применений ингибитора ALK (Weber 2000; Stoica 2001). Среди больных людей повышенные уровни плейотрофина в сыворотке крови обнаружены у больных раком поджелудочной железы (n=41; Р<0,0001) и раком кишечника (n=65; Р=0,0079). У здоровых индивидуумов PTN экспрессируется строго регулируемым образом во время перинатального развития органов и в выборочных популяциях нейронов и глии у взрослых.
Наличие совместной экспрессии PTN и ALK, как обнаружено у некоторых раковых клеточных линий, указывает на то, что они могут образовывать аутокринную петлю ростовой стимуляции (Stoica 2001). Несмотря на все эти данные из литературы следует, что неясно, является ли действие PTN опосредованным одним ALK и/или другими неидентифицированными рецепторами PTN (Duyster 2001). Предложены, по меньшей мере, два других потенциальных рецептора PTN: рецептор тирозинфосфатазы RPTPβ и гепаринсульфат протеогликан N-синдекан. Однако RPTPβ может действовать как модулятор сигнала в PTN/ALK пути передачи сигнала и N-синдекан может действовать в качестве шаперона лиганда (Bowden 2002).
Недавно в качестве второго лиганда ALK был идентифицирован другой секретируемый ростовой фактор, родственный плейотрофину, называемый мидкином (МК). Сходным с PTN способом связывающую и активирующую функции МК (например, индукцию колониеобразования на мягком агаре в культуре клеток) можно блокировать тем же антителом, выработанным против ALK-ECD (Stoica 2001). Подобно плейотрофину, мидкин регулируется на повышение во многих опухолях, хотя его физиологическая экспрессия в нормальных тканях взрослых очень ограничена (Stoica 2002). Анализ 47 образцов опухоли мочевого пузыря выявил, что экспрессия МК значительно повышена (примерно в четыре раза) по сравнению с нормальной тканью мочевого пузыря. Дополнительно, заметная сверхэкспрессия коррелирует с плохой выживаемостью больных (O'Brien 1996).
Однако сродство МК к ALK примерно в пять раз ниже, чем сродство плейотрофина (Stoica 2002). Интересно, что, как и в случае плейотрофина, ингибирование ALK рибозимами также ингибирует воздействия МК на клеточную культуру (Stoica 2002). Авторы этих исследований также пришли к заключению, что ингибирование пути PTK/MK/ALK открывает очень привлекательные возможности для лечения различных заболеваний, у некоторых из которых пока что возможности лечения очень ограничены, например глиобластомы и рака поджелудочной железы (Stoica 2002).
У здоровых индивидуумов экспрессия мРНК ALK достигает пика во время неонатального периода и сохраняется у взрослых в нескольких избранных разделах нервной системы. Недавно экспрессию белка ALK обнаружили также в эндотелиальных клетках, связанных с нейрональными и глиальными клетками. Доказательство того, что, по крайней мере, часть злокачественных активностей, описанных для плейотрофина, опосредована ALK, получено в опытах, в которых экспрессию ALK сводят на нет с помощью направленного применения рибозима.
Такое истощение ALK предотвращало стимулированное плейотрофином фосфорилирование противоапоптозного белка Akt и приводило к продлению жизни мышей, получивших ксенотрансплантаты. Действительно, количество апоптозных клеток в трансплантатах опухоли значительно повышено при подавлении экспрессии ALK (Powers 2002).
Доказательство того, что злокачественные активности, описанные для МК, опосредованы ALK, получено в экспериментах с моноклональными антителами против ALK ECD. Добавление супернатанта клеток гибридомы с двумя антителами против ALK ECD при разведении 1:25 приводит к значительному уменьшению колониеобразования клетками SW-13 в мягком агаре (Stoica 2002). Анализ десяти различных клеточных линий выявил, что способность к ростовому ответу на PTN отлично коррелирует с экспрессией мРНК ALK (обнаружено, что следующие клеточные линии, отвечавшие на PTN, экспрессируют мРНК ALK: HUVEC, NTH3T3, SW-13, Colo357, МЕ-180, U87, MD-MB 231; Stoica 2001). Интересно, что у некоторых раковых клеточных линий (Colo357 рак поджелудочной железы, Hs578T рак груди и U87 глиобластома) PTN и ALK экспрессируются совместно, указывая на то, что PTN и ALK образуют аутокринную петлю стимуляции роста (Stoica 2001).
Интересно то, что показано, что оба PTN и МК вызывают транскрипционную регуляцию на повышение противоапоптозного белка bcl-2 (Stoica 2002). Дополнительно, активированный Akt (который является важной нижерасположенной мишенью аберрантной передачи сигнала ALK) фосфорилирует проапоптозный фактор, называемый bad, приводя, таким образом, к диссоциации bcl-xl, который, будучи свободным от bad, может подавлять апоптоз путем блокирования высвобождения цитохрома с (см. ссылки в Bowden 2002).
Аберрантная экспрессия ALK может быть вовлечена в развитие нескольких типов рака. Однако первоначально ее связывали с подгруппой высокозлокачественных неходжкинских лимфом (NHL), так называемых анапластических крупноклеточных лимфом (ALCL). Неходжкинские лимфомы представляют клональные неоплазии, развивающиеся из различных клеток лимфатического происхождения.
У большинства больных с первичным системным клиническим подтипом ALCL имеется транслокация t2,5, приводящая к экспрессии составного белка, соединяющего N-конец нуклеофосмина (NPM) с С-концом ALK. Составной белок состоит из аминокислотных остатков 1-117 NPM, присоединенных к аминокислотным остаткам 1058-1620 ALK, и хромосомный разрыв находится в интроне, расположенном между экзонами, кодирующими ТМ и околомембранный домен ALK (Duyster 2001). NPM-ALK является продуктом транскрипции, содержащим открытую рамку считывания из 2040 пар оснований, кодирующих белок из 680 аминокислотных остатков (Morris 2001). Это соответствует разрыву в интроне 4 NPM, который охватывает 911 пар оснований, и в интроне 16 ALK, который охватывает 2094 пар оснований (Kutok 2002). Скорее всего, последовательность ALK в этом составном белке является минимальной последовательностью, необходимой, чтобы белок приводил к ALCL (Duyster 2001). Инверсированный составной белок (ALK-NPM) не экспрессируется, по крайней мере, в лимфоидных клетках (Kutok 2002). Белок NPM дикого типа характеризуется повсеместной экспрессией и функционирует в качестве переносчика белков из цитоплазмы в ядро. Фактически NPM является ядерным белком размером 38 кДа, кодируемым хромосомой 5, который содержит NLS, связывает ядерные белки и участвует в передвижении цитоплазма/ядро (Duyster 2001). NPM является одним из наиболее распространенных ядерных белков и обычно присутствует в виде гексамера (Morris 2001). Наиболее важно то, что NPM обычно претерпевает самоолигогмеризацию (гексамеры), а также гетерогенную олигомеризацию с NPM-ALK (Duyster 2001). Транслокация 2;5 помещает часть гена ALK, кодирующую тирозинкиназу на хромосоме 2 под контроль сильного промотора NPM на хромосоме 5, что приводит к постоянной экспрессии химерного белка NPM-ALK (p80) (Duyster 2001). Поэтому ALK киназа является нерегулируемой и эктопической как в плане клеточного цикла (лимфоидного), так и клеточного компартмента (ядро/ядрышко и цитоплазма) (Ladanyi 2000). Локализация NPM (питоплазматическая или ядерная), по всей видимости, не влияет на его действие на генез лимфом (Duyster 2001). Возникающая аберрантная тирозинкиназная активность запускает злокачественное перерождение через конститутивное фосфорилирование внутриклеточных мишеней. Разные другие менее распространенные составные белки с ALK также связаны с ALCL. Все варианты показывают связь тирозинкиназного домена ALK с альтернативным промотором, регулирующим его экспрессию.
Показано, что полноцепочечная ALK также экспрессируется примерно в 92% клеток первичной нейробластомы и в некоторых рабдомиосаркомах (Lamant 2000). Однако до сих пор не было показано какой-либо корреляции между экспрессией ALK и биологией опухоли. Этот факт, взятый вместе с отсутствием доказательства в отношении значительных уровней эндогенно фосфорилированной ALK в этих опухолях, предполагает, что экспрессия ALK в нейробластоме отражает ее обычную экспрессию в незрелых нейрональных клетках, а не первичную онкогенную роль, и ALK в этих опухолях не является фосфорилированным конститутивно, таким образом ставя под вопрос важность роли ALK в этих опухолях (Duyster 2001; PuIford 2001). Тем не менее, передача сигнала ALK может быть важной, по меньшей мере, в некоторых нейробластомах, как предполагают Miyake et al., которые обнаружили сверхэкспрессию и конститутивное фосфорилирование ALK благодаря генной амплификации в клеточных линиях, выведенных из нейробластомы (Miyake 2002). Однако другие клеточные линии, выведенные из нейробластомы, не показывают конститутивной активации ALK, выступая, таким образом, против основного участия ALK в патологии (Dirks 2002; PuIford 2004).
Интереснее всего, что ALK кажется важным для роста глиобластомы многоформной, очень злокачественной опухоли мозга, предоставляющей очень ограниченные возможности для терапии (Powers 2002). Показано, что в этих разрушительных опухолях происходят множественные генетические изменения, включая утрату или мутации PTEN, р53 и INK4a-ARF. Дополнительно, передача сигнала RTK играет особенно важную роль в росте и развитии этих опухолей, которые сверхэкспрессируют различные ростовые факторы, например PDGF, HGF, NGF и VBGF, что указывает на наличие аутокринных петель сигнала RTK. Powers и соавторы показали экспрессию мРНК и белков ALK в образцах опухоли больных глиобластомой, тогда как такие сигналы не детектировались в нормальных смежных тканях головного мозга (Powers 2002). Дополнительно, клетки глиобластомы человека U87MG (полученные от больного и представляющие хорошо охарактеризованную модельную систему для исследования генезиса опухолей и передачи сигнала в глиобластоме) демонстрируют ALK-зависимое противоалоптозное поведение в исследовании с применением ксенотрансплантата. Когда ALK подавлен в этих раковых клетках с помощью рибозимов, мыши, которым инъецировали такие опухолевые клетки, выживают, по меньшей мере, в два раза дольше, чем мыши, которым инъецировали опухолевые клетки дикого типа, и такие опухолевые клетки демонстрируют значительно повышенный апоптоз. Таким образом, ALK и его лиганды предоставляют важный сигнал выживания, который является лимитирующим скорость роста опухолевых клеток U87MG in vivo (Powers 2002). Эти данные указывают, что ингибирование передачи сигнала ALK может быть многообещающим подходом для улучшения прогноза продолжительности жизни больных глиобластомой.
Глиобластома многоформная с большим отрывом является наиболее распространенной и злокачественной первичной глиальной опухолью с количеством случаев примерно 2/100000 в год (примерно 15000 случаев в US и Западной Европе в год). Она преимущественно поражает полушария головного мозга, но может также поразить ствол мозга (в основном у детей) или спинной мозг. Опухоли могут появляться de novo (первичная глиобластома) или могут развиваться из астроцитом более низкой степени (вторичная глиобластома). Первичные и вторичные глиобластомы демонстрируют небольшое молекулярное перекрывание и на молекулярном уровне представляют собой различные заболевания. Они обе содержат много генетических отклонений, включая изменения р53, EGFR, MDM2, PDGF, PTEN, p16, RB.
Никаких значительных достижений терапии не достигнуто за последние 25 лет. Терапии являются только паллиативными и могут продлевать прогноз жизни от 3 месяцев до одного года. Больные обычно проявляют медленно прогрессирующий неврологический дефицит, например слабость моторики, симптомы внутричерепного давления, например головная боль, головокружение, дурнота, рвота, когнитивные нарушения или припадки. Изменения личности также могут быть ранними симптомами. Этиология глиобластомы неизвестна, семейные случаи представляют менее 1%. Единственным реальным идентифицированным фактором риска является контакт с бензиновыми соединениями. Диагноз обычно ставят с помощью исследования изображений мозга (СТ, ЯМР) и биопсии. Полное определение стадии большинства глиобластом не является ни практическим, ни возможным, поскольку у этих опухолей нет ясно определенных границ. Скорее они проявляют хорошо известные тенденции к местной инвазии и распространению по путям плотного белого вещества. Первичной причиной того, почему невозможно лечение до исцеления больного, является то, что опухоль находится за пределами местного контроля при диагностике. Первичными химиотерапевтическими агентами являются кармустин (алкилирующий агент) и цисплатина, но только 40% больных до некоторой степени реагируют на лечение.
Хотя имеются известные неопределенности относительно роли ALK в глиобластомах, это заболевание предлагает различные подходы для направленных на ALK лекарств. Фактически для этой разрушительной болезни даже небольшое улучшение возможностей имеющейся на настоящее время терапии сослужит огромную службу потребностям медицины. Важно заметить, что, поскольку клетки глиобластомы экспрессируют полноцепочечный ALK, для лечения этого рака можно считать ALK мишенью не только для небольших молекул ингибиторов киназы, но также для антител и/или фрагментов антител, например scFv, т.е. для индукции апоптоза в клетках опухоли. Строго ограниченная локализация глиобластомы в ЦНС способствует применению scFv, поскольку их можно эффективно доставлять в ЦНС (быстрый клиренс отсутствует из-за компартментализации, но имеется лучшее проникновение в опухоль по сравнению с IgG из-за их меньшего размера). Антитела и/или фрагменты антител можно направлять против связывающей лиганд последовательности ALK (аминокислотные остатки 396-406) или против других областей внеклеточной части рецептора.
Очень ограниченная экспрессия ALK в здоровых тканях при физиологических условиях указывает, что опухоли, экспрессирующие ALK, могут быть превосходными мишенями при лечении болезни с применением радиоактивных или связанных с токсином антител и/или фрагментов антител независимо от того, является ли ALK вовлеченным в патогенез этих опухолей или нет. В дополнение к клеткам глиобластомы экспрессия ALK с высокой значимостью обнаружена в клеточных линиях меланомы и клеточных линиях карциномы груди (где она не является конститутивно фосфорилированной) (Dirks 2002). Тот факт, что большая часть внеклеточного домена ALK представляется довольно уникальной в протеоме человека, должно сделать этот подход высокоспецифичным.
WO 9515331/US 5529925 раскрывает клонирование и секвенирование последовательностей нуклеиновых кислот человека, которые подвергаются перегруппировке при хромосомной перестановке t(2;5) (p23;q35), происходящей в лимфоме человека. Обнаружено, что перестановка перемещает последовательность гена ядерного фосфопротеина (гена NPM) на хромосоме 5q35 к последовательности ранее не идентифицированного гена тирозинкиназы (здесь и далее гена ALK) на хромосоме 2р23. Последовательность составного гена и составного белка (составного гена и белка NPM/ALK соответственно) также раскрыты.
Полная последовательность ALK запатентована в US 5770421, названном "Human ALK Protein Tyrosine Kinase." Дополнительно, патент US 6174674 В1 "Method of detecting a chromosomal rearrangement involving a breakpoint in the ALK or WPM gene" раскрывает праймеры для детектирования слитой (составной) последовательности NPM-ALK в образцах, полученных от больных. В другой патентной заявке US 6696548 "ALK protein tyrosine kinase/receptor and ligands thereof" раскрыто применение ALK для детектирования лигандов ALK и связывание антител со специфическими последовательностями ALK. Раскрыт также способ идентификации агента, способного связываться с выделенным полипептидом ALK.
WO 0196394/US 20020034768 раскрывают роль ALK в качестве рецептора плейотрофина. US 20040234519 раскрывает антитела против плейотрофина, и WO 2006020684 описывает определение плейотрофина.
Раскрытие изобретения
Основным объектом изобретения является предоставление стабильного и растворимого антитела или производного антитела, которое связывается с человеческим белком ALK in vitro и in vivo. Наиболее предпочтительно антитело является специфически направленным против связывающего лиганд домена ALK (аминокислотные остатки 396-406) и в этой связи блокирует как биологическое действие МК, имеющие KD для ALK приблизительно 170 пМ, так и биологическое действие PTN, имеющего KD для ALK примерно 20-30 пМ (Stoica 2002; Stoica 2001). В предпочтительном осуществлении упомянутое антитело или фрагмент антитела является scFv антителом или Fab фрагментом. Далее термин антитело включает полноцепочечные антитела, а также производные антитела.
Теперь, для того чтобы выполнить эти и дополнительные объекты изобретения, которые прояснятся при прочтении описания, упомянутое антитело характеризуется тем, что оно включает CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности SEQ. ID. NO:2. Предпочтительно идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 60%, 65%, 75%, 85% или более, предпочтительно, по меньшей мере, 92%. Наиболее предпочтительно упомянутое антитело имеет CDR3 VH с последовательностью SEQ. ID. NO:2.
В одном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть согласно изобретению специфически связывается с конкретным эпитопом белка ALK. Такие аминокислотные остатки эпитопа находятся, например, среди аминокислотных последовательностей 1-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500 или 1500-1620 белка ALK или их любых интервалов, частей или отрезков. В одном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, включающим, в основном состоящим, или фрагментом района, охватывающего аминокислотные остатки 391±3 и 406±3 (SEQ. ID No:91 показывает аминокислотные остатки от 388 до 409 человеческого белка ALK), предпочтительно аминокислотные остатки 391-406 (SEQ. ID. No:1) белка ALK (SEQ ID NO:1). Понятно, что указанные отрезки не следует рассматривать как отрезки, имеющие резкие границы, но что антитело или его связывающая антиген часть может связываться или частично связываться с районом, расположенным близко или находящимся внутри связывающего лиганд домена ALK. Предпочтительно антитела или производные антител связываются с эпитопом белка ALK из 10-20 аминокислотных остатков в длину.
В другом осуществлении антитело или его связывающая антиген часть может характеризоваться как специфически связывающаяся с белком ALK с KD менее примерно 10×10-6 М. В конкретном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связываются с белком ALK (иди его фрагментом) с KD, по меньшей мере, примерно 10×10-7 М, по меньшей мере, примерно 10×10-8 М, по меньшей мере, примерно 10×10-9 М, по меньшей мере, примерно 10×10-10 М, по меньшей мере, примерно 10×10-11 М, по меньшей мере, примерно 10×10-12 М или с еще более благоприятной KD.
В других различных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает вариабельный район тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района тяжелой цепи согласно SEQ ID NO:4.
В других осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает вариабельный район легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района легкой цепи согласно SEQ ID NO:5.
В других дополнительных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает как вариабельный район тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района тяжелой цепи согласно SEQ ID NO:4, так и вариабельный район легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района легкой цепи согласно SEQ ID NO:5.
В других конкретных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, связывающимся с антителом или производным антитела ESBA521 (SEQ. ID. NO:19) и/или конкурирует за связывание белка ALK или его части с антителом или производным антитела ESBA521. В родственном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, включающим остатки 391-406 (SEQ ID NO:1) белка ALK или его частью.
Вариабельные районы тяжелой и легкой цепей антител или их связывающие антиген части обычно включает один или более район, определяющий комплементарность (CDR). Такие районы включают CDR1, CDR2 и CDR3. В конкретных осуществлениях CDR вариабельных районов тяжелой цепи имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR антитела ESBA521. В других конкретных осуществлениях CDR вариабельных районов легкой цепи имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.
Соответственно, конкретное антитело или фрагмент согласно изобретению включает вариабельный район тяжелой цепи, включающий один или более район, определяющий комплементарность (CDR), представляющий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района тяжелой цепи ESBA521 и вариабельный район легкой цепи, включающий один или более район, определяющий комплементарность (CDR), представляющий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.
Вариабельный район тяжелой цепи антитела или его связывающая антиген часть может также включать все три CDR, представляющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района тяжелой цепи ESBA521 и/или все три CDR, представляющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.
В другом осуществлении изобретения антитела или их связывающие антиген части (а) включают вариабельный район тяжелой цепи, кодируемый или полученный из (т.е. являющийся продуктом) человеческого гена VH (например, Н3 типа), и/или (б) включает вариабельный район легкой цепи, кодируемый или полученный из человеческого гена V κ или λ (например, λ1 типа).
Антитела согласно настоящему изобретению включают полноцепочечные антитела, например моноклональные антитела, включающие эффекторный домен (например, Fc домен), а также части или фрагменты антител, например одноцепочечные антитела и Fab фрагменты. Антитела также могут быть связаны с различными терапевтическими агентами (например, противораковыми агентами, химиотерапевтическими агентами или токсинами) и/или с меткой (например, радиоактивной меткой).
В другом аспекте изобретение представляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие последовательность, кодирующую вариабельный район тяжелой цепи антитела, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности SEQ ID NO:22. Изобретение также представляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие последовательность, кодирующую вариабельный район легкой цепи антитела, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности SEQ ID NO:21.
Изобретение также представляет экспрессирующие векторы, включающие любую из вышеупомянутых нуклеиновых кислот саму по себе или в комбинации (например, экспрессируемую с помощью одного или более векторов), а также клетки хозяина, включающие такие экспрессирующие векторы.
Подходящие клетки хозяина для экспрессии антител согласно изобретению включают разнообразные эукариотические клетки, например клетки дрожжей, клетки млекопитающих, например клетки яичника китайского хомяка (СНО), NSO клетки, клетки миеломы или растительные клетки. Молекулы согласно изобретению могут также экспрессироваться в клетках прокариотов, например Е.coli.
Изобретение также представляет способы получения антител или их связывающих антиген частей путем экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, в клетках хозяина (например, нуклеиновые кислоты, кодирующие связывающий антиген район антитела). В дополнительном аспекте изобретение представляет гибридому или трансфектому, включающую вышеупомянутые нуклеиновые кислоты.
В другом осуществлении изобретение предоставляет антиген, включающий эпитоп белка ALK, предпочтительно домен связывания лиганда PTN, более предпочтительно фрагмент, включающий, в основном состоящий, или фрагмент района, охватывающий аминокислотные остатки 391±3 и 406±3 (see SEQ. ID No:91, которая показывает аминокислотные остатки от 388 до 409 человеческого белка ALK), наиболее предпочтительно аминокислотные остатки 391-406 (SEQ. ID. No:1). Антиген можно применять для выработки, скрининга или детектирования присутствия антитела против ALK или можно применять в качестве агента для активной иммунотерапии, например вакцины.
В качестве вакцины антиген может применяться сам по себе или в комбинации с подходящим вспомогательным средством или гаптеном, например в смеси или в химическом или генетическом конъюгате. Антиген, применяемый для активной иммунотерапии, можно также применять в комбинации с пассивной иммунотерапией, например с любым из антител против ALK, раскрытых здесь, или в комбинации с моноклональным или поликлональным препаратом антител против ALK, например гаммаглобулином серопозитивного донора.
В другом осуществлении молекулы антитела (или связывающие районы VL и VH) являются целиком человеческими. Лечение человека человеческими антителами дает ряд преимуществ. Например, антитела с большой вероятностью являются менее иммуногенными для людей, чем антитела, не относящиеся к человеку. Терапия также является быстрой, потому что инактивация ALK может произойти, как только антитело достигает области рака (где экспрессируется ALK). Поэтому в родственном осуществлении антитело является scFv, например ESBA521 или антителом, включающим VL и/или VH районы (или их CDR, например CDR3 VL (SEQ ID NO:3) и/или CDR3 VH (SEQ ID NO:2)) ESBA521.
Человеческие антитела также локализуются на нужных участках организма человека более эффективно, чем антитела нечеловеческого происхождения. Дополнительно, лечение является специфическим для ALK, антитело является рекомбинантным и высокоочищенным, и в отличие от традиционных терапий данный подход свободен от возможного загрязнения случайными агентами. Альтернативно, антитела и производные антител согласно настоящему изобретению можно получать путем химического синтеза.
В другом осуществлении изобретение представляет композиции для лечения рака (или получения соответствующих медикаментов), которые могут предотвращать неоплазию у субъекта путем конкурирования с лигандами ALK, например мидкином (МК) и/или плейотрофином (PTN), и таким образом блокирования передачи сигнала ALK, опосредованного такими лигандами. Такую композиции можно вводить саму по себе или в комбинации с известными в данной области техники противораковыми агентами, например метотриксатом и т.п.
Антитело согласно изобретению и/или вакцину ALK можно применять сами по себе или в сочетании с известными терапевтическими, например, противораковыми агентами, например метотриксатом и т.п.
Другие свойства и преимущества изобретения будут ясны из нижеследующего детального описания, а также из формулы изобретения.
Краткое описание фигур
Изобретение станет более понятным и дополнительные его объекты, отличные от вышеописанных, будут очевидны при рассмотрении нижеследующего детального описания. Это описание обращается к приложенным фигурам, где:
Фигура 1 показывает схему применяемого белка ALK человека. Пептид из 16 аминокислотных остатков участка связывания PTN (пунктирная линия) применяют в качестве эпитопа в двухгибридном скрининге связывателей scFv.
Фигура 2 показывает ступенчатую рандомизацию частей CDR3 VH, CDR3 VL и CDR2 VH для получения ESBA521 в качестве вторичного связывателя и набора scFv в качестве третичных связывателей (см. табл.1). Х означает любой аминокислотный остаток.
Фигура 3 показывает эксперимент с применением ELISA, где характеристики связывания улучшенных scFv сравнивают с таковыми окружения (каркаса), из которого они происходят.
Фигура 4 показывает иммуноокрашивание клеток HeLa, подвергнутых переходной трансфекции ESBA521 (левая панель) и поликлональными антителами, специфичными к ALK (правая панель). Средняя панель: те же клетки в световом микроскопе.
Фигура 5 показывает эксперимент с применением ELISA для проведения сравнения ESBA521 с улучшенными третичными связывателями.
Осуществление изобретения
Для облегчения понимания изобретения следует вначале пояснить конкретные термины.
Определения
Термин «ALK» и «AIk-I»включает белок ALK человека, кодируемый геном ALK (киназа анапластической лимфомы), который является мембранным белком тирозинкиназы/рецептора.
Термин «антитело» относится к целым антителам и любому фрагменту, связывающему антиген (например, «связывающей антиген части», «связывающему антиген полипептиду» или «иммуносвязывателю»), или его одиночной цепи. «Антитело» относится к гликопротеину, включающему, по меньшей мере, две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), взаимосвязанные дисульфидными мостиками, или их связывающую антиген часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного района тяжелой цепи (сокращенно VH) и константного района тяжелой цепи. Константный район тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного района легкой цепи (сокращенно VL) и константного района легкой цепи. Константный район легкой цепи состоит из одного домена CL. Районы VH и VL можно дополнительно подразделять на районы гипервариабельности, называемые районами, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся более консервативными районами, называемыми каркасными районами (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные районы тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который реагирует с антигеном. Константные районы антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (CIq) классической системы комплемента.
Термин «связывающая антиген часть» антитела (или просто «часть антитела») относится к одному или более фрагменту антитела, который сохраняет способность специфически связываться с антигеном (например, ALK). Показано, что функция связывания антигена антителом может осуществляться фрагментами полноцепочечного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином «связывающая антиген часть» антитела, включают: 1) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов; 2) F(ab')2 фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в районе связки (шарнира); 3) Fd фрагмент, состоящий из VH и СН1 доменов; 4) Fv фрагмент, состоящий из VH и VL доменов одной ветви антитела; 5) одиночный домен или dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящий из VH домена, и 6) изолированный район, определяющий комплементарность (CDR), или 7) комбинация двух или более изолированных CDR, которые при необходимости могут быть соединены синтетическим линкером. Дополнительно, хотя два домена Fv фрагмента, VH и VL, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с помощью рекомбинантных способов, с помощью синтетического линкера, что позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой VH и VL районы объединены с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включены в термин «связывающая антиген часть» антитела. Эти фрагменты антител получают с помощью общепринятых способов, известных специалисту в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на применимость по тому же способу, как интактные антитела. Связывающие антиген части можно получать с помощью рекомбинантных техник или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут принадлежать разным изотипам, например IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подтип), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.
Термин «каркасный» относится к известным в данной области техники частям вариабельных районов антитела, которые находятся между более разнообразными CDR районами. Такие каркасные районы обычно называются каркасными районами от 1 до 4 (FR1, FR2, FR3 и FR4), и они предоставляют конструкцию (каркас) для поддержки в трехмерном пространстве трех CDR районов, находящихся в тяжелой или легкой цепи антитела, так что CDR могут образовывать связывающую антиген поверхность. Такой каркас может также называться несущей конструкцией, поскольку он обеспечивает поддержку для презентации более разнообразных CDR. Другие CDR и каркасные районы семейства иммуноглобулинов, например повторы анкирина и фибронектин, могут применяться в качестве связывающих антиген молекул (см. также патенты US №6300064, 6815540 и US №20040132028).
Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к участку антигена, с которым специфически связывается иммуноглробулин или антитело (например, в ALK аминокислотные остатки 391-406 человеческого AIk-I (см., например, SEQ ID NO:1). Эпитоп обычно включает, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Термин «специфическое связывание», «избирательное связывание», «избирательно связывает» относится к связыванию антитела с эпитопом определенного антигена. Обычно антитело связывается со сродством (KD) меньше примерно 10-7 М, например меньше примерно 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или еще меньше.
Термин «KD» относится к константе равновесия реакции диссоциации конкретного взаимодействия антигена с антителом. Обычно антитела согласно изобретению связываются с ALK с константами диссоциации (KD), составляющими меньше примерно 10-7 М, например меньше примерно 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или еще меньше, измеренными, например, с помощью техники поверхностного плазмонового резонанса (SPR) с установкой BIACORE.
Термины «нейтрализует ALK», «ингибирует ALK» и «блокирует ALK» применяются взаимозаменяемо по отношению к способности антител согласно изобретению предотвращать взаимодействие ALK с одним или более лигандом мишенью и, например, запускать передачу сигнала.
Термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной», когда она находится в функциональном взаимодействии с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или усилитель являются оперативно связанными с кодирующей последовательностью, если они воздействуют на транскрипцию этой последовательности.
Для нуклеиновых кислот термин «значительная гомология» указывает, что две нуклеиновые кислоты или их определенные последовательности при оптимальном наложении и сравнении проявляют идентичность с учетом необходимых вставок или делеций нуклеотидов, по меньшей мере, примерно 80% нуклеотидов, обычно, по меньшей мере, примерно от 90% до 95% нуклеотидов и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно от 98% до 99,5% нуклеотидов. Альтернативно, значительная гомология существует, когда сегменты гибридизуются в условиях избирательной гибридизации с комплементарной цепочкой. Такие условия гибридизации известны в данной области техники и описаны, например, в Sambrook et al. infra.
Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений в последовательностях, принимая в расчет число промежутков (разрывов) и длину каждого промежутка, которые надо внести для оптимального наложения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно проводить с помощью математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже.
Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определять с помощью программы GAP в составе программного пакета GCG с применением NWSgapdna, CMP матрицы при вкладе промежутков 40, 50, 60, 70 или 80 и длине промежутка 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определять с помощью алгоритма Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), включенного в программу ALIGN (version 2.0), с применением РАМ120 таблицы весов остатков, штрафа за длину промежутка 12 и штрафа за промежуток 4. Дополнительно, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), включенного в программу GAP программного пакета GCG, с применением матрицы Blossum 62 или матрицы РАМ250, веса промежутка 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины промежутка 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Последовательности нуклеиновой кислоты и белка согласно настоящему изобретению можно далее применять как «последовательности запроса» при проведении поиска в общественных базах данных, например, чтобы идентифицировать родственные последовательности. Такой поиск можно проводить с помощью программ NBLAST и XBLAST (version 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиск нуклеотидных последовательностей согласно BLAST можно проводить с помощью программы NBLAST при счете очков = 100, длине слова = 12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидной последовательности изобретения. Поиск белков согласно BLAST можно проводить с помощью программы XBLAST при счете очков = 50, длине слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковой молекуле по изобретению. Для получения наложения с разрывами с целью сравнения можно применять Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST можно пользоваться параметрами по умолчанию для соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).
Настоящее изобретение также охватывает «консервативные модификации последовательностей» для последовательностей с SEQ ID NO согласно настоящему изобретению, т.е. такие модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, которые не отражаются на связывании антигена антителом, кодируемым нуклеотидной последовательностью или содержащим аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации последовательностей включают замены, вставки и делеции нуклеотидов и аминокислотных остатков. Например, модификации можно вносить с помощью стандартных техник, известных в данной области техники, например сайт-направленного мутагенеза и мутагенеза, опосредованного ПЦР. Консервативные замещения аминокислот включают такие, при которых аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями определены в данной области техники. Такие семейства включают аминокислотные остатки с основными свойствами боковых цепей (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными свойствами боковых цепей (например, аспарагиновая и глутаминовая кислоты), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Так, предсказанные несущественные аминокислотные остатки в человеческих антителах против ALK предпочтительно заменяют другими аминокислотными остатками из того же семейства по свойствам боковых цепей. Способы идентификации консервативных замещений нуклеотидов и аминокислот, не приводящих к нарушению связывания антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Brummell et al. Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
Альтернативно в другом осуществлении мутации вводят случайным образом по всей или в части последовательности, кодирующей антитело против ALK, например, с помощью насыщающего мутагенеза (saturation mutagenesis) и получившиеся модифицированные антитела против ALK подвергают скринингу по активности связывания. «Консенсусной последовательностью» является последовательность, образованная из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей (см., например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). В семействе белков каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотным остатком, чаще всего встречающимся в этом положении в данном семействе. Если два аминокислотных остатка встречаются с равной частотой, каждый из них можно включить в консенсусную последовательность.
Со ссылкой на таблицы и фигуры, предоставленные здесь, консенсусную последовательность CDR вариабельных районов тяжелой/легкой цепи антитела можно получить путем оптимального наложения аминокислотных последовательностей CDR вариабельных районов антител, обладающих реактивностью по отношению к эпитопу 390-406 человеческого белка ALK-1.
Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является «плазмида», что относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие начало репликации бактериального типа, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки хозяина при поступлении в клетку хозяина и поэтому реплицироваться вместе с геномом хозяина.
Термин «клетка хозяина» относится к клетке, в которую введен экспрессирующий вектор. Клетки хозяина могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, способные к трансформации, включают членов семейства энтеробактерий, например штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, например Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие животные клетки хозяина включают линии СНО (линия клеток яичников китайского хомяка) и NSO клетки.
Термин «лечение» относится к терапевтическим или превентивным мерам, описанным здесь. Способы «лечения» включают введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, антитела согласно настоящему изобретению, например субъекту, имеющему опосредованное ALK нарушение, или субъекту, который в конечном счете может получить такое нарушение, для предотвращения, лечения, замедления, уменьшения тяжести нарушения, или для облегчения одного или более симптома нарушения или повторного нарушения, или для продления жизни субъекта за пределы ожидаемого в отсутствие такого лечения.
Термин «опосредованное ALK нарушение» относится к состоянию болезни и/или симптомам, связанным с опосредованным ALK раком или опухолями. В основном, термин «опосредованное ALK нарушение» относится к любому нарушению, наступление, развитие или течение симптомов которого требует участия ALK. Примеры опосредованного ALK нарушения включают, не ограничиваясь этим, в частности, глиобластому.
Термин «эффективная доза» относится к количеству, достаточному для достижения или, по меньшей мере, для частичного достижения необходимого действия. Термин «терапевтически эффективная доза» определяется как количество, необходимое для излечения или, по меньшей мере, частичного замедления заболевания и его осложнений у больного, уже страдающего от заболевания. Количества, эффективные для такого применения, зависят от тяжести заболевания, которое лечат, и общего состояния иммунной системы больного.
Термин «субъект» относится к любому человеческому существу или животному. Например, способы и композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения субъекта, больного раком, например глиобластомой.
Если не указано обратное, все технические и научные термины, применяемые здесь, имеют общепринятое значение, понятное любому работающему в данной области техники, к которой относится изобретение. Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь, можно применять на практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет направляющим. Дополнительно, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не ограничивают область притязаний изобретения.
Различные аспекты изобретения описаны более детально в последующих разделах. Следует понимать, что различные осуществления, предпочтения и интервалы можно комбинировать по необходимости. Дополнительно, в зависимости от конкретного осуществления избранные определения, осуществления или интервалы не могут применяться.
Настоящее изобретение представляет в первом аспекте антитело, связывающее человеческий белок ALK, где упомянутое антитело включает CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности SEQ. ID NO:2. Предпочтительно идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 60%, 70%, 75%, 80% или более предпочтительно, по меньшей мере, 90%. Наиболее предпочтительно CDR3 имеет точно такую последовательность, как SEQ ID NO:2.
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело специфически связывается с человеческим белком ALK, т.е. оно не связывается с мышиным белком ALK, у которого участок связывания PTN отличается всего на два аминокислотных остатка от участка связывания PTN (SEQ ID NO:1) человеческого белка ALK. Изолейцин в положении 3 белка человека заменен валином и аспартат заменен аланином в соответствующей последовательности мышиного белка.
Антитело согласно настоящему изобретению может быть полноцепочечным антителом, а также фрагментом антитела, например scFv или Fab фрагментом. Связывающие антиген фрагменты хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно применяют scFv антитело.
Тяжелая цепь и легкая цепь включают каркасные последовательности, каждая включает три CDR района, CDR1, CDR2 и CDR3, которые преимущественно вовлечены в связывание антигена. Антитело согласно настоящему изобретению включает VH домен типа Н3 и VL домен типа X.
Каркасы VH и VL антитела согласно настоящему изобретению являются стабильными и растворимыми, так что они функциональны в восстановительной среде внутри клетки. Предпочтительно это каркас 4,4, который был выделен ранее с помощью дрожжевой системы скрининга, называемой системой с контролем качества "Quality control system" (Auf der Maur et al. 2001; Auf der Maur et al. 2004). Последовательность каркаса можно узнать, например, из SEQ ID NO:20 (см. ниже), где каркасные части представлены неподчеркнутыми и прямыми литерами, тогда как последовательности CDR подчеркнуты, а последовательность линкера показана курсивом.
Антитело согласно настоящему изобретению способно связываться с пептидом из 16 аминокислотных остатков, представляющим эпитоп ALK, имеющим последовательность, которая, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно на 80%, 85%, 90%, 95% или наиболее предпочтительно на 100% идентична последовательности SEQ ID NO:1. Эта последовательность также называется участком связывания PTN и является уникальной последовательностью во всем геноме человека. Соответствующая последовательность у мыши отличается по двум из 16 аминокислотных остатков, т.е. имеет V в положении 3 и А в положении 7 вместо I и D соответственно. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению связывается с человеческим, но не с мышиным ALK, т.е. является специфичным для белка человека. Эпитоп ALK, включающий примерно остатки 391-406 или состоящий из этих остатков, уникальным образом подходит для отбора антител или связывающего антиген фрагмента, которые могут специфически связывать ALK и блокировать или ингибировать опосредованную ALK активность. Этот эпитоп также необходим для скрининга или выработки антител, специфически блокирующих активность ALK. Так, этот эпитоп, особенно эпитоп, включающий примерно остатки 391-406 или состоящий примерно из этих остатков, уникальным образом подходит для применения в качестве активного иммунотерапевтического агента или вакцины, как описано ниже.
Антитело согласно настоящему изобретению обладает сродством к пептиду эпитопа ALK с KD 30 нМ или менее, предпочтительно 10 нМ или менее, наиболее предпочтительно ниже 3 нМ.
В другом осуществлении настоящего изобретения антитело включает CDR3 вариабельного района легкой цепи с последовательностью, составляющей, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности SEQ ID NO:3. Предпочтительно идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%. Наиболее предпочтительно последовательность CDR3 идентична SEQ ID NO:3. Снова это антитело связывает пептид эпитопа ALK, имеющий последовательность, которая, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно на 80%, 85%, 90%, 95% или наиболее предпочтительно на 100% идентична последовательности SEQ ID NO:1. Также антитело обладает сродством к пептиду эпитопа ALK с KD менее 10 нМ, предпочтительно менее 7 нМ.
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело включает последовательность VH SEQ. ID. NO:4 и последовательность VL SEQ ID NO:5. Дополнительно, оно может включать, по меньшей мере, одну мутацию, по меньшей мере, в одном из CDR, приводящую к повышенному сродству, характеризуемому значением KD менее примерно 3 нМ. Упомянутая, по меньшей мере, одна мутация предпочтительно находится в CDR1 или CDR2 VH и/или VL, наиболее предпочтительно в CDR2 VH.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело включает CDR2 вариабельного района тяжелой цепи, включающий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO.7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12 или SEQ. ID. NO:13. Предпочтительно перед этими определенными последовательностями расположены аминокислотные остатки AI и за ними следует последовательность SEQ. ID. NO:17, так что определяется весь CDR2 целиком.
Предпочтительное антитело согласно настоящему изобретению включает последовательность VH SEQ. ID. NO:4 и VL SEQ. ID. NO:5. В антителах scFv структура домена может быть следующей NH2-VL-линкер-VH-COOH или NH2-VH-линкер-VL-COOH, предпочтительно линкер имеет последовательность SEQ. ID. NO:16. Альтернативно, вариабельные районы, представленные последовательностями SEQ. ID. NO:4 и 5, могут быть сконструированы в полноцепочечное антитело, например IgG или IgM. Константные районы, необходимые для комбинирования с вариабельными районами согласно изобретению, известны в данной области техники.
В область притязаний настоящего изобретения входит применение антитела или производного антитела в качестве лекарства или в качестве диагностического подхода. Предпочтительно рассматривается получение лекарства для лечения рака или опухолей. Для этой цели антитело можно пометить радиоактивной меткой с помощью радиоактивного изотопа или радиоактивного металла. Это особенно ценно для направленного воздействия на опухоль, для получения изображения и в исследованиях биологического распределения. Также техника рекомбинантных ДНК делает возможным генетическое соединение кодирующих районов вариабельных V генов с модифицированными доменами токсина. Например, составной белок scFv-токсин, где scFv является специфичным для белка маркера опухоли, может направить токсин на опухоль, где токсин проявляет свои цитотоксические свойства. Такая направленная терапия приводит к избирательной концентрации цитотоксических агентов или радиоактивных изотопов в опухолях и должна уменьшать их токсичность для нормальных тканей.
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело применяют для лечения рака или опухолей, предпочтительно нейробластомы, глиобластомы, рабдомиосаркомы, карциномы груди, меланомы, рака поджелудочной железы, неходжкинской лимфомы В-клеток, карциномы щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы легких, ретинобластомы, саркомы Эвига, рака простаты, рака кишечника или рака поджелудочной железы, предпочтительно глиобластомы, нейробластомы и рабдомиосаркомы. Экспрессия ALK и белка детектируется во многих опухолях мягких тканей (Li et al., 2004). Полноцепочечный ALK обнаружен в этих опухолях человека. Дополнительно, антитело предпочтительно применяют для местной терапии. Наиболее предпочтительной является местная терапия глиобластомы.
Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление последовательности ДНК, кодирующей антитело согласно настоящему изобретению. Подходящим прокариотическим экспрессирующим вектором для ESBA512 (SEQ. ID.No:19) является pTFT74 (последовательность SEQ. ID. No:90, включающая последовательность, кодирующую ESBA512). Здесь последовательность, кодирующая ESBA512, находится под контролем промотора Т7, и продукт рекомбинантного гена обычно очищают над тельцами включения. Другим предпочтительным прокариотическим экспрессирующим вектором является рАК-400, где к последовательности ESBA512 присоединен гистидиновый таг для упрощения очистки (см. последовательность SEQ. ID. NO:89, включающую последовательность, кодирующую ESBA512). Продукт гена секретируется клетками хозяина в периплазму.
Дополнительно, предоставлены экспрессирующий вектор, включающий упомянутую последовательность ДНК, и подходящие клетки хозяина, трансформированные упомянутым экспрессирующим вектором. Предпочтительно упомянутыми клетками хозяина являются клетки E.coli.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является получение антител согласно настоящему изобретению, включающее выращивание клеток хозяина, трансформированных экспрессирующим вектором для получения упомянутого антитела, в условиях, которые позволяют синтез упомянутого антитела и выделение его из упомянутой культуры.
Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление эпитопа ALK, включающего или состоящего, в основном, из остатков 391-406 последовательности SEQ. ID. NO:1. Упомянутый эпитоп необходим для идентификации, скрининга или выработки антител против ALK или их фрагментов. Предпочтительно антитело или его связывающий антиген фрагмент способны специфически связываться с остатками 391-406 (SEQ. ID. NO:1) выделенного белка ALK или его фрагмента. Более предпочтительно антитело является одноцепочечным антителом (scFv), Fab фрагментом, IgG или IgM.
В дополнительном аспекте предоставлена ALK вакцина, включающая выделенный белок ALK или его фрагмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую эпитоп ALK. Предпочтительно вакцина включает остатки 391-406 выделенного белка ALK. Упомянутую вакцину объединяют в композиции вместе с носителем, вспомогательным веществом и/или гаптеном для усиления иммунного ответа.
Последовательности согласно настоящему изобретению следующие:
Нуклеотидная последовательность ESBA512, районы CDR подчеркнуты, последовательность линкера показана курсивом.
Изобретение ниже описано с помощью примеров.
ПРИМЕРЫ
Материалы и способы
В основном, при практическом выполнении настоящего изобретения применяются, если не указано обратное, общепринятые технические подходы химии, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, иммунологии (особенно, например, техники работы с антителами) и стандартные техники получения полипептидов. См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., IrI Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C. S. H. L. Press, Pub. (1999) и Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
Пример 1. Скрининг для идентификации scFv, связывающих ALK
В результате многочисленных структурных исследований взаимодействия антигена с антителом обнаружено, что остатки в определяющем комплементарность районе 3 тяжелой цепи (CDR-H3) обычно вносят вклад в наиболее значимые контакты с антигеном (Chothia and Lesk, 1987; Chothia et al., 1985; Padlan, 1994). Авторы применили свою недавно описанную технику скрининга взаимодействия антигена с антителом с помощью дрожжевого двойного гибрида для прямого выделения связывающих антиген scFv путем скрининга четырех библиотек scFv с рандомизованными синтетическими последовательностями CDR-H3 (Auf der Maur et al., 2002). Четыре библиотеки основаны на четырех стабильных каркасах scFv человека, в которых 7 аминокислот в третьей петле CDR вариабельного района тяжелой цепи (VH-CDR3) подвергнуты рандомизации. Рандомизованные части получают с помощью стандартной техники ПЦР. Библиотеки scFv подвергают скринингу с применением пептида из 16 аминокислотных остатков, полученного из внеклеточного домена киназы анапластической лимфомы рецептора тирозинкиназы человека (ALK) с помощью дрожжевой системы скрининга, называемой «контроль качества» "Quality Control" (Auf der Maur et al., 2001; Auf der Maur et al., 2004). Вкратце, технология "Quality Control" является независимой от антигена системой отбора в пределах организма для идентификации в природном наборе вариабельных районов человеческих легких цепей (VL) и вариабельных районов тяжелых цепей (VH) таких, которые могут дать комбинации VL и VH с нужными биофизическими свойствами, такими как стабильность, растворимость и выход экспрессии. Из одной из четырех библиотек scFv изолирован один многообещающий специфический связыватель после первого круга скрининга. Этот конкретный scFv получен из библиотеки каркаса FW4.4. FW4.4 (SEQ. ID. NO:20) состоит из VL домена (λ1), связанного с помощью классического гибкого глицинсеринового линкера (GGGGS)4 с доменом VH3. Последовательность CDR3 VH FW4.4 включает 13 аминокислотных остатков (DAGIAVAGTGFDY; SEQ. ID. NO:18). Для конструирования библиотеки центральную часть CDR3 VH (DAXXXXXXXGFDY) рандомизуют с помощью стандартных способов ПЦР-клонирования с применением вырожденных олигонуклеотидов. Последние два остатка (Асп и Тир) сохраняют постоянными, поскольку их важность для структуры показана во многих случаях (Chothia and Lesk, 1987). Остальные аминокислотные остатки не модифицируют, чтобы удерживать многообразие библиотеки в пределах контролируемых размеров. Библиотеку scFv клонируют в дрожжевой экспрессирующий вектор (pLib1) в виде добавления с С-конца к домену транскрипционной активации Gal4 (Auf der Maur et al., 2002).
Связывающий лиганд домен (LBD) человеческого ALK выбран в качестве антигена для скрининга взаимодействия (Stoica et al., 2001). Этот пептид из 16 аминокислотных остатков клонируют в другой дрожжевой экспрессирующий вектор (pBait1) в виде добавления на С-конце к связывающему ДНК белку LexA.
Дрожжевой репортерный штамм YDE173 (Auf der Maur et al., 2002), содержащий стабильно встроенные репортерные гены HIS3 и lacZ под контролем шести участков связывания LexA трансформируют вектором с приманкой, экспрессирующим LBD ALK, присоединенный к LexA, вместе с библиотекой рандомизованных CDR-H3 scFv, присоединенных к домену активации Gal4. Трансформированные клетки отбирают на чашках, не содержащих гистидин и содержащих 2,5 мМ 3-аминотриазола (3-АТ), являющегося конкурентным ингибитором продукта гена HIS3. Растущие колонии отбирают за период времени 6 дней и выделяют плазмиды библиотеки. Тот же репортерный штамм трансформируют спасательными плазмидами (rescue plasmid) для подтверждения зависимой от антигена активации гена. Количественный жидкостной анализ β-галакттозидазы проводят для измерения силы связывания между LBD ALK, т.е. пептидом из 16 аминокислотных остатков, и отобранными scFv. Молекулы scFv с наиболее высокой активацией репортерного гена проявляют также наилучшее сродство (около 31 нМ) к пептиду LBD ALK в экспериментах с применением ELISA (данные не приведены).
Последовательности других CDR3 VH, идентифицированные как вносящие вклад в связывание ALK, приведены в таблице 1а ниже.
Пример 2. Созревание сродства
Для получения scFv с повышенным сродством этот первичный связыватель подвергают дальнейшему созреванию сродства путем мутагенеза и второго цикла скрининга в дрожжевой системе. Для проведения созревания сродства уровень экспрессии составного белка LexA с LBD ALK уменьшают, чтобы понизить активацию репортерного гена, запускаемую взаимодействием первичного связывателя с пептидом LBD ALK. Сильный промотор вектора pBait1 заменяют укороченным и таким образом менее активным вариантом промотора ADH (алкогольдегадрогеназы), получая вектор pBait3. Такого понижения уровня экспрессии приманки в присутствии первичного связывателя достаточно для ингибирования роста на чашках без гистидина, содержащих 5 мМ 3-АТ. Мутагенез первичного связывателя с целью созревания сродства проводят путем рандомизации частей CDR3 в вариабельном районе легкой цепи. Ее проводят прямо в дрожжах путем гомологичной рекомбинации (Schaerer-Brodbeck and Barberis, 2004). Последовательность CDR3 VL FW4.4 включает 11 аминокислотных остатков (SEQ. ID. NO:14: GTWDSSLSGW). Первые два положения частично рандомизуют, так что первая позиция кодирует GIy, Ala или Gln и вторая позиция кодирует Thr, Ser или Ala. В положениях от 5 до 8 внутри CDR3 VL допускается любой аминокислотный остаток. Оставшиеся положения поддерживают постоянными. Рандомизацию проводят в помощью ПЦР. Получившийся продукт ПЦР имеет размер 356 пар оснований и включает рандомизованную кассету CDR, обрамленную каркасными последовательностями из 267 пар оснований выше нее и 27 пар оснований ниже. Этот продукт является так называемым донорным фрагментом ПЦР, несущим гомологии вектору мишени. Вектор мишени является дрожжевой плазмидой (pLib1), кодирующей первичный связыватель, присоединенный к домену активации Gal4. Для улучшения эффективности гомологичной рекомбинации и исключения ложных положительных сигналов при последующем скрининге CDR-L3 вектора мишени слегка модифицируют. Вводят уникальный участок рестрикции Sac в середину CDR3 VL, что ведет к сдвигу рамки считывания в части, кодирующей scFv составного белка, и приводит к образованию укороченного белка, неспособного связываться с LBD ALK. Дополнительно, участок Sac позволяет линеаризовать вектор мишени, что повышает эффективность рекомбинации у дрожжей.
Скрининг запускают предварительно трансформированным репортерным дрожжевым штаммом YDE173 с плазмидой (pBait3), экспрессирующей составной белок LexA-LBD ALK под контролем укороченного промотора ADH. Эти предварительно трансформированные дрожжевые клетки снова делают компетентными и трансформируют одновременно линеаризованным вектором мишени и донорным фрагментом ПЦР, несущим гомологии выше и ниже CDR3 VL. При гомологичной рекомбинации между продуктом ПЦР и вектором мишени новая последовательность CDR3 VL интегрируется в соответствующий участок вектора мишени. В результате этого события изначальный CDR3 VL заменяется на рандомизованный CDR3 VL. Это позволяет провести реконструкцию кольцевой плазмиды, экспрессирующей полностью функциональный составной белок с новой последовательностью CDR3 VL, который активирует экспрессию репортерного гена и позволяет рост на чашках с селективной средой при взаимодействии с пептидом LBD ALK.
В общей сложности 119 клонов вырастает на чашках с селективной средой за период времени наблюдения из 6 дней. Эти клоны отбирают, выделяют плазмидные библиотеки и повторно трансформируют тот же дрожжевой репортерный штамм. Проводят количественный жидкостной анализ β-галактозидазы для измерения силы связывания между LBD ALK (антиген) и scFv с созревшим сродством. 20 клонов с наивысшей активацией lacZ тестируют также с помощью ELISA с применением пептида LBD ALK. Наилучший кандидат характеризуется KD приблизительно 7 нМ (фигура 3) и называется ESBA521.
Последовательности других CDR3 VL, идентифицированные как вносящие вклад в связывание ALK, представлены в таблице 1с.
Пример 3. scFv ESBA521 специфически связывается с трансмембранной формой человеческого ALK
Для тестирования того, является ли вновь идентифицированный scFv способным узнавать также трансмембранный белок ALK человека на поверхности живых клеток, проводят эксперименты по иммуноокрашиванию клеток HELA, трансфицированных переходным образом. ESBA521 реагирует с белком ALK по способу сходному с реакцией поликлональных антител (Фиг.4). В контрольном эксперименте показано, что каркас 4.4 scFv не взаимодействует с человеческим ALK. Неожиданно оказалось, что ESBA521 связывается только с человеческим белком ALK, но не связывается с соответствующим белком мыши, хотя последовательность антигенного пептида мыши отличается от последовательности человеческого пептида только по двум положениям. В противоположность этому поликлональное антитело против ALK узнает оба белка, человеческий и мышиный. Поэтому связывание ESBA521 является специфическим для человеческого белка ALK на клеточной поверхности.
Пример 4. Выделение улучшенных связывателей с помощью ПЦР-мутагенеза CDR2 VH
Для дальнейшего улучшения связывания антигена применяют ESBA521 в качестве исходного scFv в дополнительном цикле созревания сродства с применением того же подхода с двухгибридной системой, как описано для первого круга созревания сродства, за исключением того, что в этом случае мутагенезу с помощью ПЦР подвергают CDR2 VH и трансформируют дрожжи реципиент, где гомологичную рекомбинацию CDR2 проводят по аналогичному способу. Снова в CDR2 вводят участок рестрикции для возможности линеаризации плазмиды мишени. Мутации, внесенные в CDR2, приведены в таблице 2.
Среди изолированных scFv, полученных после этой процедуры, у семи оказалось значительно улучшенное сродство с KD в интервале 2-3 нМ (фиг.5), где наилучшим является мутант 28.11.
Пример 5. Предотвращение роста опухоли при введении антител против ALK
Предшественники антитела ESBA521 отобраны на связывание аминокислотных остатков 391-406 ALK, включающих аминокислоты (396-406), которые известны как связывающие плейотрофин (Stoica 2001). ESBA521 получен путем рандомизации дополнительных аминокислотных остатков в CDR его предшественника и отбора связывателей, связывающихся с аминокислотной последовательностью 391-406, находящейся в своем природном окружении внеклеточного домена (BCD) ALK. Эти процедуры приводят к получению антитела, связывающего ECD ALK с высоким сродством по тому же участку, где связывается PTN. По нашим данным, это первое моноклональное антитело, специфически направленное на PTN-связывающий участок ALK. Соответственно, предсказано, что ESBA521 обладает высоким сродством к ECD ALK и эффективно конкурирует с плейотрофином (PTN) и мидкином (МК) за связывание с рецептором ALK и таким образом антитело ESBA521 подходит для ингибирования связывания обоих лигандов, МК и PTN, с белком ALK.
Поскольку ALK и его лиганды вовлечены в неоплазию, инвазию опухолей и ангиогенез, ингибирование взаимодействия между ALK и его природными лигандами нарушает опосредованный ALK генез опухолей.
Действие ESBA521 на специфическую опухоль можно определить с помощью двух следующих анализов, описанных ниже.
В первом анализе проводят эксперименты с ксенотрансплантатом, поставленные для определения роли ALK как фактора, лимитирующего скорость роста опухоли (Powers 2002). Вкратце, получают суспензию клеток U87MG с концентрацией 20 миллионов клеток на мл среды, дополненной 10% сывороткой плода коровы. Их вводят путем инъекции мышам NU/NU и измеряют возникающие опухоли. Вводят тестируемые антитела, предпочтительно полноцепочечные антитела, более предпочтительно пегилированные антитела, и измеряют рост опухолей.
Хотя показаны и описаны присутствующие предпочтительные осуществления изобретения, следует понимать, что изобретение не ограничивается ими, но может осуществляться и применяться разными способами в рамках области притязаний приложенной формулы изобретения.
Claims (32)
1. Антитело, связывающее белок киназы анапластической лимфомы (ALK) человека, включающее легкую цепь вариабельного района и тяжелую цепь вариабельного района, причем каждый вариабельный район содержит три CDR и 4 каркасных участка в порядке FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4, где
(i) последовательность CDR3 вариабельного района тяжелой цепи имеет, по меньшей мере, 60% идентичность с SEQ ID NO:2; и
(ii) последовательность CDR3 вариабельного района легкой цепи имеет, по меньшей мере, 50% идентичность с SEQ ID NO:3,
которое связывается с эпитопом пептида, являющимся фрагментом, по существу, состоящим из SEQ ID NO:91, который охватывает аминокислотные остатки 388-409 человеческого ALK белка.
(i) последовательность CDR3 вариабельного района тяжелой цепи имеет, по меньшей мере, 60% идентичность с SEQ ID NO:2; и
(ii) последовательность CDR3 вариабельного района легкой цепи имеет, по меньшей мере, 50% идентичность с SEQ ID NO:3,
которое связывается с эпитопом пептида, являющимся фрагментом, по существу, состоящим из SEQ ID NO:91, который охватывает аминокислотные остатки 388-409 человеческого ALK белка.
2. Антитело по п.1, у которого его сродство к пептиду эпитопа ALK характеризуется KD 30 нМ или ниже, предпочтительно 10 нМ или ниже, наиболее предпочтительно ниже 3 нМ.
3. Антитело по п.1, где связывание белка ALK человека является специфическим.
4. Антитело по п.1, являющееся фрагментом антитела, scFv антителом или Fab фрагментом.
5. Антитело по п.1, в котором каркасные районы VH и VL являются стабильными и растворимыми, так чтобы сохранять функциональность в восстановительном окружении внутри клетки.
6. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью, проявляющей, по меньшей мере, 70%, 75%, 85% или более предпочтительно, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности SEQ ID NO:2.
7. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:2.
8. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района легкой цепи с последовательностью, проявляющей, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 70%, 75%, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности SEQ ID NO:3.
9. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:3.
10. Антитело по любому из предшествующих пунктов, включающее
последовательность вариабельного района тяжелой цепи, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичность с SEQ ID NO:4, где последовательность вариабельного района тяжелой цепи CDR3 имеет, по меньшей мере, 60% идентичность с SEQ ID NO:2; и
последовательность вариабельного района легкой цепи, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичность с SEQ ID NO:5, где последовательностью вариабельного района легкой цепи CDR3, имеет, по меньшей мере, 70% идентичность с SEQ ID NO:3.
последовательность вариабельного района тяжелой цепи, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичность с SEQ ID NO:4, где последовательность вариабельного района тяжелой цепи CDR3 имеет, по меньшей мере, 60% идентичность с SEQ ID NO:2; и
последовательность вариабельного района легкой цепи, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичность с SEQ ID NO:5, где последовательностью вариабельного района легкой цепи CDR3, имеет, по меньшей мере, 70% идентичность с SEQ ID NO:3.
11. Антитело по п.10, где вариабельная цепь района тяжелой цепи CDR имеет, по меньшей мере, 80% идентичность с CDR SEQ ID NO:19, и где
этот вариабельный район легкой цепи CDRs, является, по меньшей мере, на 80% идентичным с CDR SEQ ID NO:19.
этот вариабельный район легкой цепи CDRs, является, по меньшей мере, на 80% идентичным с CDR SEQ ID NO:19.
12. Антитело по п.1, включающее каркасный район SEQ ID NO:20.
13. Антитело по п.1, содержащее VH последовательности SEQ ID NO:4 и VL последовательности SEQ ID NO:5.
14. Антитело по п.13, включающее, по меньшей мере, одну мутацию, по меньшей мере, в одном из CDR, приводящую к более высокому сродству, характеризуемому KD менее приблизительно 3 нМ.
15. Антитело по п.14, отличающееся тем, что упомянутая мутация или упомянутые мутации находятся в CDR1 или CDR2 VH и/или VL.
16. Антитело по п.14, отличающееся тем, что упомянутая мутация находится в CDR2 VH.
17. Антитело по п.1, включающее CDR2 вариабельного района тяжелой цепи, включающий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13.
18. Антитело по п.17, где упомянутым определенным последовательностям CDR2 предшествуют аминокислотные остатки AI и за которыми следуют последовательности SEQ ID NO:17.
19. Антитело по п.5, содержащее структуру NH2-VL-линкер-VH-СООН или NH2-VH-линкер-VL-COOH, где линкер имеет последовательность SEQ ID NO:16.
20. Антитело, охарактеризованное в п.1, которое помечено с помощью радиоактивной метки или с помощью токсина.
21. Антитело по п.1, применяемое в качестве лекарственного средства для лечения рака или опухоли.
22. Антитело по п.1, применяемое в качестве диагностического инструмента для диагностики рака или опухоли.
23. Применение антитела по любому из предшествующих пунктов для производства лекарственного средства для лечения рака или опухолей.
24. Применение по п.23, при котором лекарственное средство необходимо для ингибирования связывания МК и/или PTN с ALK или опосредованной ALK передачи сигнала.
25. Применение по п.23 или 24, при котором лекарственное средство является комбинированным, пригодным для введения упомянутого антитела в комбинации с противораковым агентом, например метотрексатом.
26. Применение по п.25, при котором лечение является лечением нейробластомы, глиобластомы, рабдомиосаркомы, карциномы груди, меланомы, рака поджелудочной железы, неходжкинской лимфомы В-клеток, карциномы щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы легких, ретинобластомы, саркомы Эвига, рака простаты, рака кишечника, рака поджелудочной железы, липомы, липосаркомы, фибросаркомы, в частности глиобластомы, нейробластомы и рабдомиосаркомы.
27. Последовательность ДНК, кодирующая антитело по любому из пп.1-19.
28. Экспрессионный вектор, включающий последовательность ДНК по п.27.
29. Клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором по п.28.
30. Клетка-хозяин по п.29, представляющая собой клетку E.COLI.
31. Способ получения антитела по пп.1-19, включающий культивирование клеток-хозяин по п.29 в условиях, позволяющих синтез упомянутого антитела и извлечение его из упомянутой культуры.
32. Антитело по любому из пп.1-10, которое связывается с эпитопом, являющимся фрагментом, включающим или в основном состоящим из SEQ ID NO:1.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US79583106P | 2006-04-28 | 2006-04-28 | |
US60/795,831 | 2006-04-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008146922A RU2008146922A (ru) | 2010-06-10 |
RU2460540C2 true RU2460540C2 (ru) | 2012-09-10 |
Family
ID=38515389
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008146922/10A RU2460540C2 (ru) | 2006-04-28 | 2007-04-27 | Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk) |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7902340B2 (ru) |
EP (2) | EP2604627A1 (ru) |
JP (2) | JP5431920B2 (ru) |
KR (1) | KR101457228B1 (ru) |
CN (1) | CN101443361B (ru) |
AU (1) | AU2007246144B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0710971A2 (ru) |
CA (1) | CA2650822C (ru) |
DK (1) | DK2013236T3 (ru) |
ES (1) | ES2547248T3 (ru) |
HK (1) | HK1124619A1 (ru) |
IL (1) | IL194752A0 (ru) |
MX (1) | MX2008013705A (ru) |
NZ (1) | NZ572248A (ru) |
PL (1) | PL2013236T3 (ru) |
RU (1) | RU2460540C2 (ru) |
WO (1) | WO2007124610A1 (ru) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2460540C2 (ru) * | 2006-04-28 | 2012-09-10 | Деленекс Терапьютикс Аг | Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk) |
WO2008131575A2 (en) * | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Esbatech Ag | Anti-alk antibodies suitable for treating metastatic cancers or tumors |
WO2009103061A2 (en) * | 2008-02-15 | 2009-08-20 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Methods and compositions for identifying, diagnosing, and treating neuroblastoma |
US20110206691A1 (en) * | 2008-02-15 | 2011-08-25 | Mosse Yael P | Methods and Compositions for Treating Neuroblastoma |
EP3444274B1 (en) | 2008-06-25 | 2020-12-23 | Novartis AG | Stable and soluble antibodies inhibiting tnf |
CN104004094B (zh) | 2008-06-25 | 2017-09-22 | 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 | 使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化 |
UY33679A (es) | 2010-10-22 | 2012-03-30 | Esbatech | Anticuerpos estables y solubles |
CA2843158A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-03-07 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Tandem fc bispecific antibodies |
WO2013067492A1 (en) * | 2011-11-03 | 2013-05-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Isolated b7-h4 specific compositions and methods of use thereof |
CN105705519A (zh) | 2013-03-06 | 2016-06-22 | 梅里麦克制药股份有限公司 | 抗C-MET串联Fc双特异性抗体 |
CN104861069B (zh) * | 2014-02-21 | 2018-12-18 | 无锡傲锐东源生物科技有限公司 | 针对间变性淋巴瘤激酶的单克隆抗体1a4及其用途 |
WO2015184231A2 (en) * | 2014-05-30 | 2015-12-03 | Kolltan Pharmaceuticals, Inc. | Regulators of anaplastic lymphoma kinase and uses thereof |
EP3341021A4 (en) * | 2015-08-27 | 2019-03-13 | Celldex Therapeutics, Inc. | ANTI-ALK ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF |
CA2940470C (en) | 2015-09-18 | 2019-08-20 | Signpath Pharma Inc. | Treatment for glioblastoma |
CN114470192A (zh) * | 2015-10-13 | 2022-05-13 | 优瑞科生物技术公司 | 对人类cd19具有专一性的抗体药剂和其用途 |
CN115927191A (zh) | 2015-10-23 | 2023-04-07 | 优瑞科生物技术公司 | 抗体/t细胞受体嵌合构建体及其用途 |
WO2017147408A1 (en) * | 2016-02-25 | 2017-08-31 | The Regents Of The University Of California | Methods for the treatment of hematologic cancer |
KR20200014294A (ko) | 2017-04-26 | 2020-02-10 | 유레카 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 키메라 항체/t-세포 수용체 구축물 및 그의 용도 |
AU2019216761A1 (en) * | 2018-02-09 | 2020-09-03 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for treating heterotopic ossification |
IT201800009282A1 (it) * | 2018-10-09 | 2020-04-09 | Metis Prec Medicine Sb Srl | Nuovo agente terapeutico per il trattamento di un tumore e/o metastasi |
CN113960313B (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-12 | 上海思路迪医学检验所有限公司 | 一种外泌体alk融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US21505A (en) * | 1858-09-14 | Improvement in bullet-machines | ||
US6696548B2 (en) * | 1993-12-03 | 2004-02-24 | St. Jude Children's Research Hospital | Antibodies for recognition of alk protein tyrosine/kinase receptor |
US5529925A (en) | 1993-12-03 | 1996-06-25 | St. Jude Children's Research Hospital | Nucleic acid sequences and fusion proteins present in human t(2;5) lymphoma |
JP4436457B2 (ja) | 1995-08-18 | 2010-03-24 | モルフォシス アイピー ゲーエムベーハー | 蛋白質/(ポリ)ペプチドライブラリー |
CA2267620A1 (en) | 1996-07-16 | 1998-01-22 | Andreas Pluckthun | Immunoglobulin superfamily domains and fragments with increased solubility |
JPH1116250A (ja) | 1997-06-20 | 1999-01-22 | Pioneer Electron Corp | 情報再生システム |
US7258986B2 (en) * | 1999-12-28 | 2007-08-21 | Esbatech Ag | Intrabodies with defined framework that is stable in a reducing environment and applications thereof |
EP1305337B1 (en) | 2000-06-14 | 2010-03-10 | Georgetown University | Pleiotrophin growth factor receptor alk for the treatment of proliferative, vascular and neurological disorders |
DE60140474D1 (de) | 2000-09-08 | 2009-12-24 | Univ Zuerich | Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten |
CN105175535A (zh) * | 2002-05-22 | 2015-12-23 | 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 | 在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其鉴定方法 |
US7888485B2 (en) | 2003-03-26 | 2011-02-15 | Georgetown University | Anti-pleiotrophin antibodies and methods of use thereof |
WO2006020684A2 (en) | 2004-08-10 | 2006-02-23 | Institute For Multiple Myeloma And Bone Cancer Research | Methods of regulating differentiation and treating of multiple myeloma |
RU2460540C2 (ru) * | 2006-04-28 | 2012-09-10 | Деленекс Терапьютикс Аг | Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk) |
-
2007
- 2007-04-27 RU RU2008146922/10A patent/RU2460540C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-04-27 MX MX2008013705A patent/MX2008013705A/es active IP Right Grant
- 2007-04-27 CA CA2650822A patent/CA2650822C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-04-27 WO PCT/CH2007/000202 patent/WO2007124610A1/en active Application Filing
- 2007-04-27 CN CN200780017546.6A patent/CN101443361B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-04-27 AU AU2007246144A patent/AU2007246144B2/en not_active Ceased
- 2007-04-27 PL PL07720099T patent/PL2013236T3/pl unknown
- 2007-04-27 NZ NZ572248A patent/NZ572248A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-04-27 KR KR1020087026220A patent/KR101457228B1/ko active IP Right Grant
- 2007-04-27 US US11/796,549 patent/US7902340B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-04-27 DK DK07720099.6T patent/DK2013236T3/en active
- 2007-04-27 EP EP13000844.4A patent/EP2604627A1/en not_active Withdrawn
- 2007-04-27 BR BRPI0710971-7A patent/BRPI0710971A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-04-27 JP JP2009506889A patent/JP5431920B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-04-27 EP EP07720099.6A patent/EP2013236B1/en active Active
- 2007-04-27 ES ES07720099.6T patent/ES2547248T3/es active Active
-
2008
- 2008-10-22 IL IL194752A patent/IL194752A0/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-02-10 HK HK09101197.0A patent/HK1124619A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-01-31 US US13/017,925 patent/US8945563B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-05-28 JP JP2013112192A patent/JP5911821B2/ja active Active
-
2014
- 2014-12-16 US US14/571,433 patent/US9512411B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
STOICA GE et al. "Identification of anaplastic lymphoma kinase as a receptor for the growth factor pleiotrophin". J Biol Chem. 2001 May 18; 276(20), с.16772-16779. STOICA GE et al. "Midkine binds to anaplastic lymphoma kinase (ALK) and acts as a growth factor for different cell types". J Biol Chem. 2002 Sep 27; 277(39), с.35990-35998. AUF DER MAUR A, et al. "Antigen-independent selection of intracellular stable antibody frameworks". Methods. 2004 Oct; 34(2), с.215-224. * |
РОЙТ А. и др. Иммунология. - М.: Мир, 2000, с.97-112. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ572248A (en) | 2011-08-26 |
US8945563B2 (en) | 2015-02-03 |
US20110159008A1 (en) | 2011-06-30 |
PL2013236T3 (pl) | 2015-12-31 |
EP2604627A1 (en) | 2013-06-19 |
JP2013226144A (ja) | 2013-11-07 |
CN101443361A (zh) | 2009-05-27 |
JP5431920B2 (ja) | 2014-03-05 |
ES2547248T3 (es) | 2015-10-02 |
KR20080113261A (ko) | 2008-12-29 |
IL194752A0 (en) | 2011-08-01 |
JP2009535021A (ja) | 2009-10-01 |
MX2008013705A (es) | 2008-11-06 |
CA2650822A1 (en) | 2007-11-08 |
US9512411B2 (en) | 2016-12-06 |
AU2007246144B2 (en) | 2012-12-06 |
BRPI0710971A2 (pt) | 2011-05-31 |
CN101443361B (zh) | 2015-08-19 |
AU2007246144A1 (en) | 2007-11-08 |
WO2007124610A1 (en) | 2007-11-08 |
DK2013236T3 (en) | 2015-09-21 |
EP2013236B1 (en) | 2015-06-17 |
KR101457228B1 (ko) | 2014-11-04 |
CA2650822C (en) | 2017-03-14 |
JP5911821B2 (ja) | 2016-04-27 |
HK1124619A1 (en) | 2009-07-17 |
US20150203829A1 (en) | 2015-07-23 |
US7902340B2 (en) | 2011-03-08 |
US20080118512A1 (en) | 2008-05-22 |
EP2013236A1 (en) | 2009-01-14 |
RU2008146922A (ru) | 2010-06-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2460540C2 (ru) | Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk) | |
TWI744242B (zh) | Egfrviii及cd3抗體構築體 | |
JP7011574B2 (ja) | Flt3及びcd3に対する抗体構築物 | |
US11359021B2 (en) | PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
PH12015500767B1 (en) | Antibodies recognizing alpha-synuclein | |
KR20050049470A (ko) | 항 수초 관련 당단백질 항체 | |
MX2011000233A (es) | Agentes de union del receptor notch1 y metodos para su uso. | |
JP2006524036A (ja) | 腫瘍壊死因子αを標的とする単一ドメイン抗体およびその使用 | |
TW201106971A (en) | Antigen-binding proteins | |
CN113056486A (zh) | 改善的抗flt3抗原结合蛋白 | |
JP2022512672A (ja) | アントラサイクリンを含む結合タンパク質-毒素融合体、および免疫腫瘍学的適用におけるその使用 | |
KR20150013935A (ko) | 트랜스포터에 대한 항체 및 이의 용도 | |
JP2022514786A (ja) | Muc18に特異的な抗体 | |
WO2008131575A2 (en) | Anti-alk antibodies suitable for treating metastatic cancers or tumors | |
US20130243774A1 (en) | Notch1 binding agents and methods of use thereof | |
EP4230652A1 (en) | Anti-oscar antibody for preventing or treating osteoarthritis | |
AU2012244351B2 (en) | Antibodies binding to the extracellular domain of the Receptor Tyrosine Kinase ALK | |
KR101854529B1 (ko) | 인간 및 마우스 Sema3A에 교차결합하는 항체 및 그의 용도 | |
WO2015138411A1 (en) | Anti-fibulin-3 antibodies and uses thereof | |
CA3070085A1 (en) | Antibodies to amyloid beta | |
CN113166264B (zh) | 一种分离的抗原结合蛋白及其用途 | |
CA3232234A1 (en) | Novel wnt agonist antibodies and therapeutic uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200428 |